CN111675679A - 一种高效分离纯化10-脱乙酰基紫杉醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效分离纯化10‑脱乙酰基紫杉醇的方法，该方法以含有10‑脱乙酰基紫杉醇的混合物为原料，通过两次柱层析加两次重结晶，即可获得含量≥99%的10‑脱乙酰基紫杉醇成品；本发明方法简单易操作、生产周期短，成本低，纯化效率高，适于工业化应用和市场推广。
Description
技术领域
本发明属于天然有机化合物的分离纯化领域，具体为一种从含有10-脱乙酰基紫杉醇的原料中高效分离提纯10-脱乙酰基紫杉醇的工业化生产方法。
背景技术
10-脱乙酰基紫杉醇（10-DAT），白色粉末，可溶于甲醇、乙醇、DMSO等有机溶剂。10-脱乙酰基紫杉醇主要存在于红豆杉枝叶、根皮中，是天然紫杉醇浸提过程中的附属产物，其含量同紫杉醇的含量相近，常作为合成紫杉醇的前体原料，也是半合成紫杉醇的主要原料之一。
紫杉醇自1992年经美国食品药品管理局（FDA）批准上市后，早已成为国际公认的抗肿瘤药物，市场需求量与日俱增。以往紫杉醇的主要来源是天然红豆杉的树皮，而红豆杉植物是国家珍稀保护植物，天然红豆杉资源有限，国家严禁采撷天然红豆杉作为紫杉醇的植提原料，天然紫杉醇的生产受限，无法满足市场需求。目前，大规模人工栽培红豆杉的枝叶正成为天然紫杉醇提取原料，但含量极小，提取成本高，仍无法满足医疗也及药业的供应需求。
10-脱乙酰基紫杉醇纯化现有技术或传统方法中存在如下问题： 1、目前，关于分离纯化10-脱乙酰基紫醇（10-DAT）报道及运用较少，大多数的10-脱乙酰基紫杉醇在提取紫杉醇的过程中被当作废料处理，未能实现紫杉醇副产物10-脱乙酰基紫醇有效利用与开发；2、部分文献报道的从红豆杉枝叶中提取10-脱乙酰基紫醇的方法，存在收率低、生产周期长、生产成本高、不适于工业化生产等问题；3、现有技术尽管采用了多种纯化方式的融合加成，仍无法分离提纯得到高纯度的10-脱乙酰基紫杉醇。
发明内容
针对现有方法在工业化生产中应用中存在的问题，本发明提供了一种高效分离纯化10-脱乙酰基紫杉醇的适合工业化生产的方法，该方法以含有10-脱乙酰基紫杉醇的混合物为原料，通过两次柱层析加两次重结晶，即可得到含量大于99%的10-脱乙酰基紫杉醇成品；本发明方法简单易操作、生产周期短，成本低，得率高，适于工业化应用和市场推广。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
1、以含有10-脱乙酰基紫杉醇的混合物为纯化原料,将该原料进行干燥处理后，采用湿法上样或者干法上样的方式，将纯化原料上样至硅胶柱中层析分离，先用二氯甲烷或者氯仿洗脱，待洗脱液中出现10-脱乙酰基紫杉醇时，洗脱液改为由氯仿、二氯甲烷中的一种与异丙醇、正丁醇中的一种配置的混合液进行洗脱，收集含有10-脱乙酰基紫杉醇的洗脱液，浓缩抽干得10-脱乙酰基紫杉醇初品；
所述氯仿:异丙醇的体积比=23～28:1，氯仿:正丁醇的体积比=18～22:1，二氯甲烷:异丙醇的体积比=13～17:1，二氯甲烷:正丁醇的体积比=10～15:1；
所述含有10-脱乙酰基紫杉醇的纯化原料中10-脱乙酰基紫杉醇的质量百分比含量为1～30%；
所述上样的纯化原料的干基质量与硅胶的质量之比为1:5～9；
所述硅胶为200～300目的工业级硅胶；
2、10-脱乙酰基紫杉醇初品用乙腈溶解、过滤，滤液旋蒸浓缩至一定体积后，添加正己烷，搅拌混匀后结晶，过滤得到的晶体和滤液，滤液浓缩抽干后返回步骤1硅胶柱中进行再洗脱分离；
3、将步骤2中得到的经干燥处理后的晶体用二氯甲烷溶解后上样至硅胶柱中进行层析分离，用二氯甲烷-异戊醇混合液洗脱分离，收集富含10-脱乙酰基紫杉醇的洗脱液，浓缩干燥，得10-脱乙酰基紫杉醇半成品；
所述柱层析中上样样品的干基质量与硅胶质量之比为1:20～40；
所述二氯甲烷-异戊醇混合液二氯甲烷和异戊醇按体积比25～30:1的比例混合而得；
所述硅胶为200～300目的工业级硅胶；
4、将步骤3的10-脱乙酰基紫杉醇半成品用工业级重蒸乙腈溶解后过滤，滤渣废置，滤液浓缩至晶体析出时，静置自然结晶，晶体用工业级重蒸乙腈重复结晶一次，即得10-脱乙酰基紫杉醇成品，其10-脱乙酰基紫杉醇的含量≥99%。
本发明相对于现有技术的优点和技术效果：
1、本发明选择常用有机溶剂及原辅料，纯化成本低，纯化效率高；
2、本发明通过两次柱层析加两次重结晶便可得10-脱乙酰基紫杉醇含量≥99%的成品，生产周期短；
3、本发明方法简单易操作，成本低，得率高，适于工业化应用和市场推广。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
实施例1：本高效分离纯化10-脱乙酰基紫杉醇的方法，具体操作如下：
（1）干燥的10-脱乙酰基紫杉醇含量为3.46%的207g 10-脱乙酰基紫杉醇原料，用二氯甲烷溶解后加硅胶制备料胶，将制备好的料胶上样至硅胶柱（200～300目）中层析分离，其中原料的干基质量与硅胶的质量之比为1:6，用二氯甲烷洗脱4个柱体积后用二氯甲烷-正丁醇混合液（二氯甲烷与正丁醇的体积比为13:1）继续洗脱；收集含有10-脱乙酰基紫杉醇的洗脱液25.3L，经浓缩抽干得10-脱乙酰基紫杉醇初品28.3g，经检测10-脱乙酰基含量为23.18%，收率为91.62%；
（2）将步骤（1）得到的28.3g 10-脱乙酰基紫杉醇初品用100mL工业级乙腈溶解过滤，滤渣废置，滤液经旋转蒸发仪在65℃下浓缩至体积为40mL左右时停止浓缩，取60mL工业级正己烷加入浓缩的滤液中，边加边搅拌，待有晶体析出时，静置自然结晶2h后用波沙漏斗减压抽滤；过滤所得晶体经干燥后为10g，经检测10-脱乙酰基紫杉醇含量为54.63%，收率为83.23%；
（3）将步骤（2）得到的10g晶体用二氯甲烷在45℃下溶解后上样至硅胶柱（200～300目的工业级硅胶）中，硅胶柱的硅胶量为250g，用二氯甲烷-异戊醇混合液（二氯甲烷和异戊醇按体积比25:1）洗脱，收集得到富含10-脱乙酰基紫杉醇的洗脱液3500mL，经旋蒸浓缩抽干得10-脱乙酰基紫杉醇半成品5.4g，经检测10-脱乙酰基紫杉醇含量为88.97%，收率为87.91%；
（4）按质量体积比1:15的比例，在步骤（5）得到的5.4g 10-脱乙酰基紫杉醇半成品中加81mL经一次重蒸的工业级乙腈溶解，溶解温度为50℃；过滤，滤液浓缩至晶体大量析出时停止浓缩，静置结晶4h；减压抽滤，所得晶体用工业级重蒸乙腈重结晶一遍，减压抽滤，晶体用旋转蒸发仪干燥8h，得到晶体3.52g，经检测10-脱乙酰基紫杉醇含量为99.58%，成品收率为48.89%。
实施例2：本高效分离纯化10-脱乙酰基紫杉醇的方法，具体操作如下：
（1）将干燥的10-脱乙酰基紫杉醇含量为5%的70g 10-脱乙酰基紫杉醇原料，用氯仿溶解后加硅胶制备料胶，将制备好的料胶上样至硅胶（200～300目）柱中层析分离，原料的干基质量与硅胶的质量之比为1:7，用氯仿洗脱4个柱体积后，用氯仿-正丁醇混合液（氯仿与正丁醇的体积比为20:1）继续洗脱，收集含有10-脱乙酰基紫杉醇的洗脱液2200mL，经浓缩抽干得10-脱乙酰基紫杉醇初品11.7 g，经检测10-脱乙酰基含量为27.95%，收率为93.42%；
（2）将步骤得（1）的11.7g 10-脱乙酰基紫杉醇初品用50mL工业级乙腈溶解过滤，滤渣废置，滤液经旋转蒸发仪在65℃的温度条件下浓缩至体积为18mL左右时停止浓缩，取40mL工业级正己烷加入浓缩的滤液中，边加边搅拌，待有晶体析出时，静置自然结晶2h后用波沙漏斗过滤；过滤所得晶体经干燥后为3.89g，经检测10-脱乙酰基紫杉醇含量为67.85%，收率为80.73%；
（3）将步骤（2）得到的3.89g晶体用二氯甲烷在45℃下溶解后，上样至按干基与硅胶质量比为1:20装填的硅胶（200～300目的工业级硅胶）柱中，用二氯甲烷-异戊醇混合液（二氯甲烷和异戊醇按体积比30:1）洗脱，收集得到富含10-脱乙酰基紫杉醇的洗脱液980mL，经旋蒸浓缩抽干得10-脱乙酰基紫杉醇半成品2.54g，经检测10-脱乙酰基紫杉醇含量为90.51%，收率为87.12%；
（4）按质量体积比1:20的比例，在步骤（2）2.54g 10-脱乙酰基紫杉醇半成品中加51mL经一次重蒸后的工业级乙腈溶解，溶解温度为50℃；过滤，滤液浓缩至晶体大量析出时停止浓缩，静置结晶2h，减压抽滤，所得晶体用工业级重蒸乙腈重结晶一遍，减压抽滤，晶体用旋转蒸发仪干燥8h，得到晶体1.61g，经检测10-脱乙酰基紫杉醇含量为99.78%，成品收率为45.89%。
实施例3：本高效分离纯化10-脱乙酰基紫杉醇的生产方法，具体操作如下：
（1）将干燥的10-脱乙酰基紫杉醇含量为3.46%的1128g 10-脱乙酰基紫杉醇原料，用氯仿溶解后加硅胶制备料胶，将制备好的料胶上样至硅胶（200～300目）柱中层析分离，原料的干基质量与硅胶的质量之比为1:8；用氯仿洗脱4个柱体积后用氯仿-异丙醇混合液（氯仿与异丙醇体积比为25:1）继续洗脱；收集含有10-脱乙酰基紫杉醇的洗脱液98L，经浓缩抽干得10-脱乙酰基紫杉醇初品106g，经检测10-脱乙酰基含量为36.08%，收率为97.98%；
（2）将步骤（1）得到的106g 10-脱乙酰基紫杉醇初品用1100mL工业级乙腈溶解过滤，滤渣废置，滤液经旋转蒸发仪在65℃下浓缩至滤液体积为200mL左右时停止浓缩，取300mL工业级正己烷加入浓缩的滤液中，边加边搅拌，待有晶体析出时，静置自然结晶3h后用波沙漏斗减压抽滤；减压抽滤所得晶体经干燥后为63.4g，经检测10-脱乙酰基紫杉醇含量为52.83%，收率为87.58%；
（3）将步骤（2）得到的63.4g晶体用二氯甲烷在45℃的温度条件下溶解后，上样至按干基与硅胶质量比1:30装填的硅胶（200～300目）柱中，用二氯甲烷-异戊醇混合液（体积比28:1）洗脱，收集得到富含10-脱乙酰基紫杉醇的洗脱液19.5L，经旋蒸浓缩抽干得10-脱乙酰基紫杉醇半成品36g，经检测10-脱乙酰基紫杉醇含量为89.32%，收率为96.03%；
（4）按质量体积比1:15的比例，在步骤（3）得到的36g 10-脱乙酰基紫杉醇半成品中加入540mL经一次重蒸后的工业级乙腈溶解，溶解温度为50℃；过滤，滤液浓缩至晶体大量析出时停止浓缩，静置结晶4h，减压抽滤，所得晶体用工业级重蒸乙腈继续重结晶一遍，减压抽滤，晶体用旋转蒸发仪干燥12h，得到晶体25.15g，经检测10-脱乙酰基紫杉醇含量为99.93%，成品收率为64.39%。
实施例4：本高效分离纯化10-脱乙酰基紫杉醇的生产方法，具体操作如下：
（1）以经干燥的10-脱乙酰基紫杉醇含量为7.25%的6300g紫杉烷类天然提取化合物为原料，用氯仿溶解后加硅胶制备料胶，将制备好的料胶上样至硅胶柱中层析分离，原料干基与硅胶（200～300目）的质量之比为1: 9，用氯仿洗脱4个柱体积后，用氯仿-异丙醇混合液（氯仿与异丙醇的体积比为23:1）继续洗脱；收集含有10-脱乙酰基紫杉醇的洗脱液535L，经浓缩抽干得10-脱乙酰基紫杉醇初品1163g，经检测10-脱乙酰基含量为38.49%，收率为98%；
（2）将步骤（1）得到的1163g 10-脱乙酰基紫杉醇初品用5000mL工业级乙腈溶解过滤，滤渣废置，滤液经旋转蒸发仪在65℃的温度条件下浓缩至滤液体积为2000mL左右时停止浓缩，取3000mL工业级正己烷加入浓缩的滤液中，边加边搅拌，待有晶体析出时，静置自然结晶4h后用波沙漏斗减压抽滤，过滤所得晶体经干燥后为595g，经检测10-脱乙酰基紫杉醇含量为63.75%，收率为84.74%；
（3）将步骤（2）得到的595g晶体用二氯甲烷在45℃的温度条件下溶解后上样至硅胶柱中，硅胶柱的硅胶（200～300目）量为11900g，用二氯甲烷-异戊醇混合液（体积比30:1）洗脱，收集得到富含10-脱乙酰基紫杉醇的洗脱液175L，经旋蒸浓缩抽干得10-脱乙酰基紫杉醇半成品377.8g，经检测10-脱乙酰基紫杉醇含量为92.38%，收率为92.01%；
（4）按质量体积比1:20的比例，在步骤（3）得到的377.8g 10-脱乙酰基紫杉醇半成品中加入7556mL经重蒸后的工业级乙腈溶解，溶解温度为50℃；过滤，滤液浓缩至晶体大量析出时停止浓缩，静置结晶8h，减压抽滤，所得晶体继续重结晶一遍，减压抽滤，晶体用旋转蒸发仪干燥12h，得到晶体265.5g，经检测10-脱乙酰基紫杉醇含量为99.85%，成品收率为58.04%。
Claims (8)
1.一种高效分离纯化10-脱乙酰基紫杉醇的方法，其特征在于，按以下步骤进行：
（1）以含有10-脱乙酰基紫杉醇的混合物为纯化原料，经干燥后上样至硅胶柱中进行层析分离，洗脱收集含有10-脱乙酰基紫杉醇的洗脱液，浓缩抽干得10-脱乙酰基紫杉醇初品；
（2）将步骤（1）10-脱乙酰基紫杉醇初品用乙腈溶解、过滤，滤液旋蒸浓缩，在浓缩物中添加正己烷，搅拌混匀后结晶，过滤得到的晶体和滤液，滤液浓缩抽干后返回步骤（1）的硅胶柱中层析分离，晶体干燥；
（3）将步骤（2）晶体用二氯甲烷溶解后上样至硅胶柱中进行层析分离，洗脱收集富含10-脱乙酰基紫杉醇的洗脱液，浓缩干燥，得10-脱乙酰基紫杉醇半成品；
（4）将步骤（3）10-脱乙酰基紫杉醇半成品用乙腈溶解后过滤，滤液浓缩结晶，晶体用乙腈重复结晶一次，即得10-脱乙酰基紫杉醇成品，10-脱乙酰基紫杉醇的含量≥99%。
2.根据权利要求1所述的高效分离纯化10-脱乙酰基紫杉醇的方法，其特征在于：含有10-脱乙酰基紫杉醇的纯化原料中10-脱乙酰基紫杉醇的质量百分比含量为1～30%。
3.根据权利要求1所述的高效分离纯化10-脱乙酰基紫杉醇的方法，其特征在于：上样的纯化原料的干基质量与硅胶的质量之比为1:5～9。
4.根据权利要求1所述的高效分离纯化10-脱乙酰基紫杉醇的方法，其特征在于：步骤（1）洗脱时，先采用二氯甲烷或者氯仿洗脱至洗脱液中出现10-脱乙酰基紫杉醇，然后改用二氯甲烷、氯仿中的一种与异丙醇、正丁醇中的一种配制的混合液进行洗脱，其中氯仿:异丙醇的体积比=23～28:1，氯仿:正丁醇的体积比=18～22:1，二氯甲烷:异丙醇的体积比=13～17:1，二氯甲烷:正丁醇的体积比=10～15:1。
5.根据权利要求1所述的高效分离纯化10-脱乙酰基紫杉醇的方法，其特征在于：步骤（3）层析分离时使用的洗脱液是由二氯甲烷和异戊醇按体积比25～30:1的比例混合制得。
6.根据权利要求1所述的高效分离纯化10-脱乙酰基紫杉醇的方法，其特征在于：步骤（3）柱层析中上样样品的干基质量与硅胶质量之比为1:20～40。
7.根据权利要求1所述的高效分离纯化10-脱乙酰基紫杉醇的方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（3）中使用的硅胶为200～300目的工业级硅胶。
8.根据权利要求1所述的高效分离纯化10-脱乙酰基紫杉醇的方法，其特征在于：步骤（4）中乙腈为经过重蒸一次的工业级乙腈。
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