CZ200070A3 - Izolace a čištění paclitaxelu a dalších příbuzných taxanů průmyslovou preparativní nízkotlakou chromatografií na polymerních kolonách - Google Patents

Abstract

Způsob získávání analogů taxanů ze zdroje obsahujícího analogy taxanů s vysokým výtěžkem a o vysoké čistotě. K dělení analogů tento způsob využívá polymerních membrán za použití nízkého tlaku, avšak bez použití složitých a nákladných kroků využívaných postupů dělení a čištění.

Description

Izolace a čištění paclitaxelu a dalších příbuzných taxanú průmyslovou preparativní nízkotlakou chromatografií na polymerních kolonách

Oblast techniky

Předložený vynález se týká separační techniky a zvláště technik k separaci paclitaxelu a příbuzných taxanů.

Dosavadní stav techniky

Paclitaxel je velmi dobře známá terapeutická látka k léčbě různých metastatických nádorů. Byl schválen FDA a HPB k léčbě nádorů vaječníků a prsů.

Sloučenina je přírodním produktem primárně extrahovaným z kůry pacifického tisu Taxus brevifolia, ale je také zjištěn v T. baccata, T. walichiana, T. yunnanensis a T. canadensis.

Koncentrace paclitaxelu v různých surovinách je obvykle nízká, například v kůře pacifického tisu řádu mezi 0,0004 a 0,01 % (hmotn./hmotn.). Tak nízká koncentrace je pro extrakci a čištění sloučeniny na farmaceutickou čistotu ze suroviny velkým problémem a tudíž nepraktická pro komerční měřítko. K čištění paclitaxelu ze surového extraktu suroviny byly vyvinuty různé techniky běžné fázové chromatografie a reverzní fázové chromatografie, rovněž tak jako nízko a vysokotlaké kolonové chromatografické techniky.

Úspěch nízkotlaké chromatografie velmi závisí na vlastnostech kolony. S použitím silikagelu a oxidu hlinitého, které jsou klasickými nosiči stacionární fáze v patřičném systému, jsou spojeny různé problémy. Vytvářejí stabilní stacionární fázi s většinou rozpouštědlových systémů, avšak jsou silnými absorbenty a mohou se podílet na separačním postupu do té míry, že ovlivní chromatografické chování a regeneraci vzorků.

K detekci a izolaci paclitaxelu z různých druhů Taxus byly na analytickém a preparativním základě vyvinuty chromatografické metody. Tyto izolační postupy se provádějí hlavně v malém laboratorním měřítku a trpí malou selektivitou a špatnou • · • · · · · • · · · · · • ·· · · · · • · · · · ····· • · · · · · ···· ·· ·· ·

- 2 regenerací a vysokými výrobními náklady, takže poukazují na vážnou a nesplněnou potřebu vytvoření ekonomické a snadno proveditelné metody separace hodnotné protinádorové sloučeniny paclitaxelu od svých blízkých analogů cephalomaninu, rovněž tak jako dalších příbuzných taxanů.

Předchozí metody popisují pro separaci paclitaxelu a jeho příbuzných taxanů využití různých typů chromatografických technik, včetně normální fázové a reverzní fázové chromatografie na koloně se silikagelem nebo chemicky vázané stacionární fázi na silikagelu. Předchozí metody končí s malým výtěžkem, mají vysoké výrobní náklady nebo mají mnoho oddělených kroků, které je obtížné převést do průmyslového měřítka.

Charakteristický dosavadní postup je popsán v americkém patentu č. 5,620,875 přiznaném 15. dubna 1997 Hoffmanovi.et al. Dokument poučuje o separaci paclitaxelu a dalších taxanů vícestupňovou extrakcí hexanem a vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC). Postup je pracný a dává pouze malé výtěžky požadované sloučeniny.

V americkém patentu č. 5,670,673 přiznaném 23.září 1997 Raovi je popsána izolace a čištění taxolu a jeho analogů. Postup obsahuje využití reverzní fázové kapalinové chromatografie na adsorbentu C18 s eluováním adsorbovaných analogů. I když jde o záslužný postup, má tato technika svá omezení v produktivitě a čistotě získaných sloučenin.

Předložený vynález podává jednoduchý způsob separace založený na koloně s polymerem postrádající omezení stávající metodologie.

Shrnutí vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je zajištění jednoduchého a méně nákladného způsobu a ekonomické izolace a čištění důležitých taxanů jako je 13-acetyl-9-dihydrobaccatin III, 10-deacetylbaccatin III, cephalomanin a paclitaxel.

Běžné způsoby izolace taxanů včetně paclitaxelu, 13-acetyl-9-dihydrobaccatinu III, a baccatinu III obsahují obecně kroky extrakce taxanů ze suroviny alkoholickým rozpouštědlem, oddělení tuku z extraktu a separaci a čištění jednotlivých taxanů chromatograficky.

• · « · ···· ··· · · · · ··· · · · · · · · ♦ • · · · · · ···· · · · · · • · · · · · · · · · ······ ·· · ·· ··

- 3 Jedním z předmětů předloženého vynálezu je zajištění způsobu izolace a čištění analogů taxanu ze zdroje obsahujícícho taxany sestávajícím z:

extrakce zdroje taxanů v organickém extrakčním činidle;

impregnace pracovního absorbčního media extrakčním činidlem a naplnění media do kolony a kolony obsahující absorbční činidlo;

v prvním stupni eluování směsí organických rozpouštědel za tlaku mezi 10 a 20 psi k získání frakcí obsahujících sloučeniny taxanů;

krystalizace frakcí k získání pevných sloučenin taxanů a matečného louhu; koncentrace matečního louhu; a ve druhém stupni eluování matečného louhu polární rozpouštědlovou směsí přes polymer k získání alespoň druhé taxanové sloučeniny.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu izolace a čištění taxanů ze zdroje obsahujícího taxany, sestávajícím ze:

zajištění zdroje taxanů;

extrakce taxanů ze zdroje do organického extrakčního činidla k získání organické vrstvy obsahující sloučeniny taxanů;

úpravy nosiče organickou vrstvou;

zajištění nízkotlaké kolony obsahující absorbční činidlo;

v prvním stupni eluování organickým rozpouštědlem kolonou k eluování přečištěných frakcí taxanů;

krystalizace taxanových frakcí k získání prvního taxanového analoga a matečného louhu;

v druhém stupni eluování matečného louhu přes polymerní materiál na chromatografické koloně k vyčištění a eluování alespoň druhého analoga taxanu a třetího třetího analoga taxanu;

odebrání separovaných analogů taxanu.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je zajištění způsobu izolace a čištění taxanů ze zdroje obsahujícího taxany, sestávajícím ze:

zajištění zdroje taxanů;

extrakce taxanů ze zdroje do organického extrakčního media k získání organické vrstvy obsahující sloučeniny taxanů;

úpravy nosiče organickou vrstvou;

• ·

- 4 zajištění nízkotlaké kolony obsahující absorbční činidlo;

v prvním stupni eluování organickým rozpouštědlem kolonou při tlaku mezi 10 a 20 psi k eluování přečištěných frakcí taxanů a odstranění nečistot flavonoidů a lignanů;

krystalizace taxanových frakcí k získání prvního taxanového analoga a matečného louhu;

v druhém stupni eluování matečného louhu polymerním materiálem na chromatografické koloně plněné polystyrenem DVB za tlaku 30 psi, k vyčištění a eluování alespoň druhého analoga taxanu a třetího analoga taxanu;

ve třetím stupni eluování druhého analoga taxanu a třetího analoga taxanu normální kolonou se silikagelem k přečištění druhého analoga taxanu a třetího analoga taxanu; a odebrání separovaných analogů taxanu.

Příklady provedení

Počátečním zdrojem taxanů byl rostlinný materiál Taxus canadensis, který je ve východní Kanadě hojný. Byly použity větvičky a jehličí Taxus canadensis nebo jejich směs. Materiál může být čerstvý nebo sušený.

Surovina byla rozmělněna a extrahována methanolem při 60°C po dobu 5 hodin a zfiltrováno. Methanolový extrakt byl smísen s aktivním uhlím a ponecháno stát při laboratorní teplotě po dobu jedné hodiny. Potom bylo zfiltrováno. Filtrát byl zkoncentrován na přibližně 15 % původního objemu odpařením. Ke koncentrátu byla přidána směs vody a dichlormethanu v poměru 1 : 1 (obj./obj.) a získána frakce obohacená paclitaxelem (organická vrstva).

Organická vrstva byla zkoncentrována na menší objem a impregnováno na nosný materiál, v tomto případě byl nosným materiálem Celíte 545.

Impregnovaný materiál byl naplněn na čelo průmyslové preparační kolony, například kolony 150 mm x 1500 mm naplněné absorbentem AI2O3. Kolona byla eluována směsí hexanu a acetonu (při startu 100:0, na konci 45:55) za tlaku mezi 10 psi a 20 psi. Frakce obsahující taxany byly odebírány a analyzovány tenkovrstvou chtomatografií (TLC) a podle výsledků TLC slučovány.

• · • · · · » · · « • ··

- 5 Spojené frakce byly za vakua zkoncentrovány a výsledný materiál rozpuštěn v methanolu a ponecháno při laboratorní teplotě přes noc. Vytvořené krystaly byly odfiltrovány a promyty methanolem a potom překrystalizováno z acetonu. 13-acetyl9-dihydrobaccatin III byl získán jako bílé krystalky.

Matečný louh byl zkoncentrován k suchu a zbytek rozpuštěn v acetonu. Acetonový roztok byl smísen s polymerem (Dowex™ resin, polystyren-DVB). Směs byla za vakua odpařena k suchu k odstranění acetonu. Výsledný prášek byl podroben nízkotlaké chromatografii. Průmyslová chromatografická kolona (150 mm x 1500 mm) byla naplněna Dowexem™ a eluováno směsí acetonu s vodou (45:55, obj./obj.) při průtoku 150 ml.min'¹ při provozním tlaku 30 psi. Byly odebírány frakce každá o objemu přibližně 2 I a sledovány TLC a HPLC. Frakce, které obsahovaly baccatin III a 10-deacetylbaccatin III byly spojeny a za vakua odpařeny k odstranění podstatné části organického rozpouštědla, potom zředěny vodou a extrahováno CH2CI2. Extrakty byly potom zkoncentrovány k suchu a výsledný zbytek rozpuštěn v EtOAc a přečištěn na koloně se silikagelem s normální fází rozpouštědlovým systémem hexan a EtOAc (při startu 5:5, konec 35:65). Baccatin III a 10-deacetylbaccatin III byly nakonec získány jako bílý prášek o čistotě vyšší než 98 %.

Frakce, které obsahovaly paclitaxel a cephalomanin byly spojeny a za vakua odpařeny k odstranění veškerého acetonu, potom roztřepány mezi vodu a CH₂CI₂. Organická vrstva byla oddělena a za vakua odpařeno do sucha. Zbytek byl rozpuštěn v methanolu. K methanolovému roztoku bylo přidáno přibližně 30 % (hmotn./obj.) vody a směs zahřívána na 60°C po dobu 5 minut, a potom ponecháno přes noc při laboratorní teplotě. Surová krystalická tuhá látka z methanolového roztoku byla odfiltrována a za vakua vysušena mezi 70°C a 75°C. Tuhá látka byla analyzována HPLC. Sestávala přibližně ze 70 % paclitaxelu a 25 % cephalomaninu a některých dalších taxanů.

Surový paclitaxel lze zpracovat jedním ze tří alternativních postupů. Při první možnosti se rozpustí v acetonu a přečistí reverzní fázovou sloupcovou chromatografii. Kolona byla naplněna polymerem (Diaion resin, HP2MG) a eluováno směsí acetonitrilu s vodou (45 : 55). Paclitaxel byl získán jako bílé krystalky o čistotě vyšší než 99 %. Cephalomanin byl získán jako bílý prášek o čistotě vyšší než 98 %.

·· 9· 9 99 99 • · · · ··· ····

9 9 · 9 9 9 · «9 ♦

9 9 9 9 9 ···· · φ 99 9

99 99 9 9999

999999 99 9 99 «9

- 6 U druhého alternativního způsobu zpracování bylo přečištění paclitaxelu a cephalomaninu provedeno chemickou reakcí a potom přečištěno reverzní fázovou chromatografií na zakotveném silikagelu. Směs surového paclitaxelu a cephalomaninu byla rozpuštěna v CH2CI2 nebo CHCI3 (1:10, hmotn./obj.) a ponecháno reagovat s 10 ekvivalenty bromu po dobu přibližně 40 minut v baňce s kulatým dnem, která byla umístěna v ledové lázni (mezi 0°C a 5°C). Výsledná směs paclitaxelu a 2“,3“-bromcephalomaninu byla ihned oddělena na koloně reverzní fázovou chromatografií (C-is nebo fenyl), s použitím elučního činidla CH3CN:H₂O (45:55). Paclitaxel byl získán jako bílé krystalky o čistotě vyšší než 99 %. 2“,3“bromcephalomanin byl získán jako směs diastereoizomerů, které byly ponechány za laboratorní teploty reagovat s aktivovaným zinkem v kyselině octové a potom přečištěno kolonou flash chromatografií k získání cephalomaninu o čistotě vyšší než 95 %.

Při třetí alternativě byl paclitaxel a bromcephalomanin čištěn na koloně se silikagelem s normální fází. Systém elučních činidel může tvořit hexan a EtOAc (na startu 6:4, na konci 4:6), nebo CH2CI2: Me₂CO (na startu 8 : 2, konec 65 : 35) nebo CH2CÍ2: EtOAc (na startu 75 : 25, konec 6 : 4). Tímto způsobem byl získán paclitaxel jako bílé krystalky o čistotě přesahující 99 % s cephalomaninem přítomným v množství menším než 0,2 %.

Při diskusi o vynálezu bude pro lepší porozumění vynálezu postupováno formou příkladů.

Příklad 1

Přibližně 200 kg suchého jehličí a větviček Taxus canadensis bylo v průmyslovém vícefunkčním extraktoru extrahováno 1000 litry methanolu při 60°C po dobu pěti hodin a potom zfiltrováno. Surové materiály byly extrahovány 700 litry methanolu při teplotě mezi 55°C a 60°C po dobu dalších pěti hodin a zfiltrováno. Filtráty byly spojen a smíseny s 10 kilogramy aktivního uhlí (5 % hmotn./hmotn.) a za laboratorní teploty ponecháno jednu hodinu, potom zfiltrováno k odstranění aktivního uhlí. Potom byl filtrát ve vakuu zkoncentrován na přibližně 100 litrů a potom přidána směs 300 litrů vody a dichlormethanu (1:1). Organická vrstva byla oddělena a vodný roztok extrahován ještě dvakrát 200 litry dichlormethanu. Roztoky dichlormethanu byly spojeny a ve vakuu odpařeno do kašovité formy, potom zředěno 20 litry acetonu.

• · · · · ·· · · « · · · · « * * «· · · · · *··« • « · ······· · · · • ··· · · · · ·· ·· · ·· «·

- 7 Acetonový roztok byl impregnován na 20 kg Celitu 545. Impregnovaný materiál byl vysušen vzduchem a potom naplněn na čelo průmyslových chromatografických kolon (rozměry: 150 x 15 cm). Každá kolona byla naplněna 15 kg absorbentu oxidu hlinitého (AI2O3). Rozumí se, že rozměry kolon nejsou rozhodující, pokud jsou dodtatečně veliké, aby v nich mohlo být dostatečné množství AI₂O₃ potřebné k separaci. Použití oxidu hlinitého je účinné pro absorbování flavonoidů a lignanů, které se současně extrahují ze zdrojového materiálu. Tyje také obtížné odstranit a v konečné čistotě produktu paclitaxelu se stávají problémem.

Kolony byly eluovány rozpouštědlovým systémem hexanu s acetonem (na startu 100 : 0, konec 45 : 55) za tlaku mezi 10 a 15 psi při průtoku přibližně 150 ml.min'¹.

Byly odebírány frakce obsahující taxany a slučovány podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě (TLC) a zkoncentrovány za vakua k odstranění veškerého rozpouštědla. Výsledný materiál byl rozpuštěn v methanolu a přes noc ponecháno při laboratorní teplotě k získání jehličkovitých krystalů. Krystaly byly odfiltrovány a zrekrystalizovány z acetonu za získání dalších jehličkovitých krystalů identifikovaných jako 13-acetyl-9-dihydrobaccatin III o čistotě vyšší než 96 % (výtěžek 148 gramů, 0,074 % vzhledem k surovině).

Matečný louh z krystalizace 13-acetyl-9-dihydrobaccatinu III byl ve vakuu zkoncentrován do sucha. Zbytek byl rozpuštěn ve třech litrech acetonu. Acetonový roztok byl smísen s 1,5 kg polystyren-divinylbenzenového kopolymeru. Směs byla odpařena k odstranění rozpouštědla a výsledný prášek naplněn do čela nízkotlaké průmyslové chromatografické kolony naplněné polystyren-divinylbenzenovým kopolymerem a eluováno 45 % acetonem ve vodě při průtoku 150 ml.min'¹ při provozním tlaku 30 psi.

Byly odebírány 2 litrové frakce, které byly sledovány TLC a HPLC.

Frakce, které obsahovaly paclitaxel a cephalomanin byly slučovány a za vakua odpařeny k odstranění většiny acetonu, potom zředěny deionizovanou vodou a třikrát extrahovány po 2,5 litry dichlormethanu. Organická vrstva byla zkoncentrována ve vakuu do sucha a zbytek rozpuštěn v jednom litru methanolu.

K methanolovému roztoku bylo přidáno přibližně 30 % (hmotn./obj.) vody a směs zahřívána na 60°C po dobu několika minut a potom ponechána při laboratotní teplotě

- 8 ·· ·· fefefe ·· ·· • · · · ··· · * φ · • fefe · · · · · · · · • · · · fe · fefe·· · · · · · ······ · · · · fefe···· fefe · fefe fefe přes noc. Surová krystalická tuhá látka z methanolového roztoku byla odfiltrována a ve vakuové sušárně vysušena mezi 70°C a 75°C. Tuhá látka obsahovala přibližně 70 % paclitaxelu a 25 % cephalomaninu při výtěžku 31 gramů.

Surový paclitaxel (30 g) byl rozpuštěn ve 200 ml acetonitrilu a zředěn 250 ml deionizované vody a přečerpán do čela nízkotlaké chromatografické kolony (rozměry: 10 x 150 cm) naplněné polymerem (Diaion, makroporézní polymetakrylátová pryskyřice). Po přečerpání vzorku byla kolona eluována stupňovaným gradientem 35, 40, 45 a 50 % acetonitrilu ve vodě. Změny rozpouštědla byly sledovány podle výsledků TLC a HPLC frakcí.

Odebírány byly frakce přibližně po 1 litru a sledovány TLC a HPLC analýzou. Průtok byl 75 ml.min'¹. Frakce z kolony, které obsahovaly paclitaxel nebo cephalomanin byly individuálně spojeny. Dva spojené roztoky byly ponechány stát při teplotě přibližně 5°C až do vykrystalizování jednotlivých sloučenin.

Krystaly byly zvlášť odfiltrovány a obě látky zrekrystalizovány ze 65°C methanolu ve vodě.

Paclitaxel byl získán jako bílé jehličkovité krystaly o čistotě vyšší než 99 % s výtěžkem 18,5 g (0,009 %).

Cephalomanin byl získán jako bílé jehličkovité krystaly o čistotě vyšší než 98 % s výtěžkem 6,5 g (0,003 %).

Frakce obsahující baccatin III a 10-deacetylbaccatin III z předešlého stupně byly spojeny a za vakua odpařeny k odstranění podstatné části acetonu, potom roztřepány mezi tři litry vody a dichlormethanu (1:1, obj./obj.). Organická vrstva byla zkoncentrována k suchu a zbytek podroben normální fázové chromatografií. Rozměry použité kolony byly 4“ x 4’, naplněná byla silikagelem (200 - 300 mesh). Elučním činidlem byl hexan s ethylacetátem se stupňovým gradientem (na startu 50 : 50, konec 35 : 65). Odebírány byly frakce po 1000 ml a každá sledována TLC.

Frakce obsahující baccatin III nebo 10-deacetylbaccatin III byly odebírány odděleně a slučovány podle výsledků TLC, a potom zkoncentrovány do sucha.

- 9 ΦΦ ·· ·· · φφ ·· φφφφ φ · φ · ♦ ♦ · φ φφ φφφφ ΦΦΦ· • φ φφφ φ φφφφ φ φ · φ φ φφφφφφ φφφφ φφφφφφ φφ φ φφ φφ

Část obsahující baccatin III byla rozpuštěna ve 200 ml methanolu a přes noc uložena v chladničce. Vytvořené bílé krystaly byly odfiltrovány a zrekrystalizovány z methanolu za získání baccatinu III jako bílých krystalů s výtěžkem 7,5 g (0,003 %). Surový 10-deacetylbaccatin III byl rozpuštěn ve 150 ml acetonu a potom zředěn 150 ml hexanu. Směs byla ponechána přes noc při laboratorní teplotě. Vytvořené bílé krystaly byly odfiltrovány a zrekrystalizovány ze stejného rozpouštědla za získání 10deacetylbaccatinu III jako bílé krystaly. Výtěžek byl 15 g (0,007 %).

Příklad 2

Za použití podobné aparatury a metodiky jako v příkladu 1 byl získán surový paclitacel. Surový paclitacel byl rozpuštěn ve 300 ml dichlormethanu, který byl přidán do 1000 ml tříhrdlé baňky s kulatým dnem. Baňka byla znovu umístěna v ledové lázni a roztok míchán magnetickým míchadlem. Po dosažení teploty přibližně 5°C byl pomalu za míchání přidáván roztok bromu (10 ekvivalentů) v dichlormethanu (1:1, obj./obj.). Poměr cephalomaninu ku bromu byl 1 ku 10 molům.

Bromace byla sledována TLC analýzou mezi pěti a 10 minutami. Reakční směs byla potom zředěna 300 ml dichlormethanu a po ukončení reakce převedena do dělicí nálevky (čas potřebný k ukončení reakce se pohyboval mezi 40 a 50 minutami). K reakční směsi bylo k absorbci nadbytku bromu přidáno 350 ml 10 % vodného roztoku thiosíranu sodného (Na2S₂O3). Dichlormethanová vrstva byla oddělena a promyta vodou a solankou a potom za vakua zkoncentrována do sucha. Byl získán světle hnědý prášek.

99

99 99 99 9

9 9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 • 9 999 9999

9 9 9 9 9 • 999 99 99 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9 • 9 9 9

9 9 ·

Příklad 3

Surový materiál (10 g) z Příkladu 2 byl rozpuštěn ve 120 ml acetonitrilu zředěného 150 ml deionizované vody. Roztok byl přečerpán do čela chromatografické kolony s reverzní fází (5 x 100 cm) naplněné silikagelem se zakotveným Cw .

Kolona byla eluována směsí acetonitrilu a vody (45 : 55) při pracovním tlaku mezi 30 a 40 psi. Průtok by 30 ml.min'¹. Odebírané frakce (po 250 ml) byly sledovány TLC a podle výdledků slučovány.

Frakce obsahující paclitaxel byly přes noc vymrazovány; vytvořené krystaly byly odfiltrovány a zrekrystalizovány ze 70 % methanolu. Paclitaxel byl získán jako bílé jehlicové krystaly o čistotě vyšší než 99 % s výtěžkem 6,1 g.

Frakce obsahující 2“,3“-bromcephalomanin rozdělený mezi vodou a dichlormethanem byly spojeny. Organická vrstva byla odebrána a za vakua odpařena k suchu. Zbytek byl rozpuštěn ve 150 ml methanolu a zředěno 50 ml vody k získání jehlicovitých krystalů. Našedé krystaly byly zrekrystalizovány ze směsi methanolu a vody a získán 2“,3“-bromcephalomanin jako bílé krystaly.

Dva gramy 2“,3“-bromcephalomaninu byly rozpuštěny ve 30 ml AcOH a byl přidán čerstvě aktivovaný zinek (2 g). Směs byla za laboratorní teploty míchána po dobu tří hodin a průběh reakce sledován TLC. Poté, co TLC analýza ukázala ukončení reakce, byla směs roztřepána mezi dichlormethan a 10 % NaHCO₃ (300 ml, 2:1). Organická vrstva byla promyta vodou a zkoncentrována k suchu. Surový produkt byl přečištěn flash chromatografií a získán cephalomanin jako bílý prášek.

Příklad 4

Surový materiál (10 g) z Příkladu 2 byl rozpuštěn ve 120 ml dichlormethanu. Organická vrstva byla zkoncentrována k suchu a zbytek byl podroben normální fázové chromatografií. Rozměry kolony byly 4 x 4’ a byla naplněna silikagelem (mezi 200 a 300 mesh). U elučního činidla se stupňoval gradient dichlormethanu ku ethylacetátu (na startu 75 : 25, konec 6 : 4) pro dělení paclitaxelu a pro 2“,3“bromcephalomanin byl použit systém hexanu s ethylacetátem (na startu 6:4 , konec ···· ··

- 11 • 4 · · • 4 4 4 4

9 9949 · 4 9 9 4

4 9 9 9 4 4

4 94 44

4:6), ale je možno použít i systém dichlormethanu s acetonem (na startu 8:2, konec 65:35). Byly odebírány frakce po 500 ml a sledovány TLC.

Frakce obsahující paclitaxel a 2“,3“-bromcephalomanin byly odebírány odděleně a slučovány podle výsledků TLC a potom zkoncentrovány do sucha.

Frakce s paclitaxelem byla rozpuštěna ve 100 ml methanolu zředěného 35 ml vody a vymrazeno. Vytvořené bílé krystaly byly odfiltrovány, zrekrystalizovány ze směsi methanolu s vodou a získán paclitaxel (5,5 g) jako bílé krystaly.

Surový 2“,3“-bromcephalomanin byl rozpuštěn v 50 ml acetonu a potom zředěn 50 ml hexanu. Směs byla ponechána přes noc při laboratorní teplotě. Vytvořené bílé krystaly byly odfiltrovány, zrekrystalizovány ze stejného rozpouštědla a získán 2“,3“bromcephalomanin jako bílé krystaly.

Následující příklady znázorňují sloučeniny ve strukturních vzorcích.

o

Paclitaxel

- 12 12 ·· 00 00 0 00 00 • 000 000 0 0 0 0 • 00 0 0 0 0 0000 • · * · 0 0 0000 0 0 0 0 0 • 00 00 0 0000 0000 00 00 0 00 0·

Baccatín III = R =

O

CH₃

10-deacetylbaccatin IV = R=H

- 13 • 4 44 ·♦ · ·· ·· • 4·· · 4 4 444·

44 4 · 4 4 444· • 4 4 4 4 4 44*· · 4 4 4 · • 44 44 4 4 444

4·4·44 44 · · * 44

13-acetyl-9-dihydrobaccatin III

Tak, jak byla v předchozím jednotlivá řešení popsána, vynález neomezují a odborníci mohou provést velký počet úprav, pokud se neodchýlí od ducha, povahy a rozsahu nárokovaného a popsaného vynálezu.

Claims (20)

1. Patentové nároky

   1. Způsob izolace a čištění analogů taxanů ze zdroje obsahující taxany vyznačující se tím, že sestává z:

   extrakce zdroje taxanu v organickém extrakčním činidle;

   impregnace pracovního absorbčního media jmenovaným extrakčním činidlem a naplnění jmenovaného media do kolony, kde jmenovaná kolona obsahuje absorbční činidlo;

   v prvním stupni eluování směsí organických rozpouštědel za tlaku mezi 10 a 20 psi k získání frakcí obsahujících sloučeniny taxanů;

   krystalizace jmenovaných frakcí k získání tuhých sloučenin taxanů a matečného louhu;

   koncentrace matečného louhu; a ve druhém stupni eluování matečného louhu polární rozpouštědlovou směsí přes polymer k získání alespoň druhé taxanové sloučeniny.
2. 2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že obsahuje dále krok odstranění lignanových a flavonoidových nečistot ze jmenovaného prvního kroku.
3. 3. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že jmenovaným zdrojem taxanů jsou rostlinné zdroje.
4. 4. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že jmenovaný rostlinný zdroj se vybírá ze členů skupiny sestávající z Taxus brevifolia, Taxus baccata, Taxus walichiana, Taxus yunnanensis a Taxus canadensis.
5. 5. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že jmenované taxany obsahují alespoň 13-acetyl-9-dihydrobaccatin III, 10-deacetylbaccatin III, baccatin III, cephalomanin a paclitaxel.
6. 6. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že jmenované organické extrakční činidlo tvoří dichlormethan.
7. 7. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že jmenované slabé absorbční medium tvoří Cellite 545.
8. 8. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že jmenované absorbční činidlo tvoří oxid hlinitý.

   4 4 4

   4 ·

   49 94 • 4 4 9

   4 44 • 9 9

   4 4 4 •494 44

   4 4 9 4

   4 4 4 9
9. 9 4 4 4

   4 4 4 4

   - 15 4 9 9

   4 9 4 9

   4 4 9444

   4 4 4

   9. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že jmenovanou směs rozpouštědel prvního kroku tvoří hexan a aceton.
10. 10. Způsob izolace a čištění taxanů ze zdroje obsahujícího taxany sestávající ze: zajištění zdroje taxanů;

    extrakce jmenovaných taxanů ze jmenovaného zdroje do organického extrakčního media k získání organické vrstvy obsahující sloučeniny taxanů;

    impregnace nosiče jmenovanou organickou vrstvou; zajištění nízkotlaké kolony obsahující absorbční činidlo;

    v prvním stupni eluování organickým rozpouštědlem jmenovanou kolonou k eluování přečištěných frakcí taxanů;

    krystalizace jmenovaných taxanových frakcí k získání prvního taxanového analoga a matečného louhu;

    v druhém stupni eluování jmenovaného matečného louhu polymerním materiálem na chromatografické koloně k čištění a eluování alespoň druhého analoga taxanu a třetího analoga taxanu; a odebírání oddělených analogů taxanu.
11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že dále obsahuje krok odstranění lignanových a flavonoidových nečistot ze jmenovaného prvního kroku.
12. 12. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že dále obsahuje krok rozemílání jmenovaného zdroje taxanů a jejich extrakci methanolem.
13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že dále obsahuje krok míšení extraktu s aktivním uhlím, filtraci a odpaření k vytvoření koncentrátu.
14. 14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že jmenovaný nosný materiál tvoří

    Cellite 545.
15. 15. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že jmenované organické rozpouštědlo tvoří směs acetonu a hexanu.
16. 16. Způsob podle nároku 15 vyznačující se tím, že jmenované organické rozpouštědlo prochází jmenovanou kolonou za tlaku mezi 10 a 20 psi.

    - 16 9« 99 9· · 99 99

    9999 999 9999

    9 9« 9999 9999 • · 999 9 9·9» 99 99 9

    9 99 99 9 9999 • 99999 99 9 99 99
17. 17. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že obsahuje dále krok odebírání a analyzování jmenovaných frakcí taxanů chromatografií na tenké vrstvě.
18. 18. Způsob izolace a čištění taxanů ze zdroje obsahujícího taxany sestávající ze: zajištění zdroje jmenovaných taxanů;

    extrakce jmenovaných taxanů ze zdroje do organického extrakčního media k získání organické vrstvy obsahující sloučeniny taxanů;

    impregnace nosiče jmenovanou organickou vrstvou; zajištění nízkotlaké kolony obsahující absorbční činidlo;

    v prvním stupni eluování organickým rozpouštědlem jmenovanou kolonou při tlaku mezi 10 a 20 psi k eluování přečištěných frakcí taxanů a odstranění nečistot flavonoidů a lignanů;

    krystalizace jmenovaných taxanových frakcí k získání prvního taxanového analoga a matečného louhu;

    v druhém stupni eluování jmenovaného matečného louhu polymerním materiálem na chromatografické koloně plněné polystyrenem DVB za tlaku 30 psi, k čištění a eluování alespoň druhého analoga taxanů a třetího analoga taxanů;

    ve třetím stupni eluování jmenovaného druhého analoga taxanů a jmenovaného třetího analoga taxanů normální kolonou se silikagelem k přečištění druhého jmenovaného analoga taxanů a třetího jmenovaného analoga taxanů; a odebírání rozdělených analogů taxanů.
19. 19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že jmenovaným druhým analogem taxanů je baccatin III a třetím jmenovaným analogem taxanů je 10deacetylbaccatin III.
20. 20. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že jmenované analogy mají čistotu nejméně 98 %.