KR102372632B1 - 초음파 캐비테이션 버블 또는 가스 버블을 이용한 파클리탁셀의 흡착방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 초음파 캐비테이션 버블 또는 가스 버블을 이용한 파클리탁셀의 흡착방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 파클리탁셀의 정제 시 흡착단계에서 파클리탁셀을 포함하는 시료를 비극성 유기용매에 용해시킨 후 흡착제를 첨가하고, 용액에 초음파 캐비케이션 버블 또는 가스 버블 처리하여 파클리탁셀의 흡착량을 증가시키거나, 파클리탁셀의 흡착량 증가와 함께 율속 단계 없이 빠른 시간 내에 파클리탁셀을 신속하게 흡착시킬 수 있는 방법 및 상기 흡착방법을 포함하는파클리탁셀 정제방법에 관한 것이다.

Description

초음파 캐비테이션 버블 또는 가스 버블을 이용한 파클리탁셀의 흡착방법 {Adsorption method of paclitaxel using ultrasonic cavitation bubbles or gas bubbles}

본 발명은 초음파 캐비테이션 버블 또는 가스 버블을 이용한 파클리탁셀의 흡착방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 파클리탁셀의 정제 시 흡착단계에서 파클리탁셀을 포함하는 시료를 비극성 유기용매에 용해시킨 후 흡착제를 첨가하고, 용액에 초음파 캐비케이션 버블 또는 가스 버블 처리하여 파클리탁셀의 흡착량을 증가시키거나, 파클리탁셀의 흡착량 증가와 함께 율속 단계 없이 빠른 시간 내에 파클리탁셀을 신속하게 흡착시킬 수 있는 방법 및 상기 흡착방법을 포함하는 파클리탁셀 정제방법에 관한 것이다.

파클리탁셀은 주목의 표피에서 발견된 디테르페노이드 계열의 항암물질[Wani, M. C., H. L. Taylor, M. E. Wall, P. Coggon and A. T. McPhail (1971), Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of taxol, a nobel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia, J. Am. Chem. Soc, 93, 2325-2327.]로 전이성 난소암, 유방암, 카포시 종양, 폐암 등의 치료에 가장 많이 이용되고 있다[Kim JH (2006), Paclitaxel : recovery and purification in commercialization step, Kor. J. Biotechnol. Bioeng, 21, 1-10.]. 주요 생산방법에는 파클리탁셀을 주목나무의 잎에서 직접 추출하는 직접추출법[Rao, K. V., Hanuman, J. B., Alvarez, C., Stoy, M., Juchum, J., Davies, R. M. and Baxley, R. (1995), A , New large-scale process for taxol and related taxanes from Taxus brevifolia, Pharm. Res., 12, 1003-1010.], 주목나무의 잎에서 전구체(baccatin III, 10-deacetylbaccatin III, 13-dehydroxybaccatin III, 10-deacetylpaclitaxel 등)를 얻어 곁사슬(side chain)을 화학적으로 결합하는 반합성법[Baloglu E, Kingston DG (1999), A new semisynthesis of paclitaxel from baccatin III J Nat Prod, 62, 1068-1071.], 주목나무에서 캘러스(callus)를 유도하여 생물 반응기 내에서 식물세포를 배양해서 얻는 식물세포배양법이 있다[Choi, H. K., T. L. Adams, R. W. Stahlhut, S. I. Kim, J. H. Yun, B. K. Song, J. H. Kim, S. S. Hong, and H. S. Lee (1999), Method for mass production of taxol by semi-continuous culture with Taxus chinensis cell culture, U.S. Patent., 5,871,979; Choi, H. K., S. J. Son, G. H. Na, S. S. Hong, Y. S. Park, and J. Y. Song (2002), Mass production of paclitaxel by plant cell culture, Korean J. Plant Biotechnol., 29, 59-62.]. 이중 직접추출법과 반합성법은 원료의 안정적 공급과 분리/정제의 복잡성으로 대량생산에 어려움이 있고, 환경보호수로 지정되어 있는 주목나무의 보호에 적합하지 않은 방법이다. 그러나 식물 세포 배양은 기후나 환경 등에 제한을 받지 않고 생물반응기 내에서 필요한 만큼의 파클리탁셀을 안정적으로 생산할 수 있어 파클리탁셀을 대량으로 생산할 수 있는 방법이다[Oh HJ, Jang HR, Jung KY (2013), Evaluation of surface area of mesoporous silica adsorbents for separation and purification of paclitaxel, Microporous and Mesoporous Materials, 180, 109-113.].

바이오매스로부터 파클리탁셀의 분리/정제는 바이오매스 추출(유기용매 추출), 액-액 추출, 흡착제 처리, 핵산 침전, 분별 침전, 크로마토그래피 등으로 이루어져 있다. 이 중 흡착제 처리는 식물세포(바이오매스) 유래 타르 및 왁스 성분뿐만 아니라 파클리탁셀 전구체들을 효율적으로 제거할 수 있는 방법이다. 또한 흡착제에는 실로퓨트(sylopute), 활성탄(activated carbon), 활성백토(active clay) 등 다양한 종류가 있지만, 그 중 실로퓨트는 파클리탁셀을 높은 수율로 얻을 수 있을 뿐만 아니라 흡착제 처리를 한 이후 여과 속도 측면에서도 매우 우수하다[Lee, C. G. and Kim, J. H (2016), "Separation Behavior of Paclitaxel and Its Semi-Synthetic Precursor 10-Deacetylpaclitaxel from Plant Cell Cultures", Korean J. Chem. Eng., 54, 89-93; Pyo, S. H., Song, B. K., Ju, C. H., Han, B. H. and Choi, H. J. (2005), "Effects of Absorbent Treatment on the Purification of Paclitaxel from Cell Cultures of Taxus chinensis and Yew tree", Process Biochem., 40, 1113-1117.].

기존 문헌들에서는 파클리탁셀의 분리/정제를 위한 흡착 공정의 주요 변수의 영향 및 최적화에 대한 정성적 연구에만 집중되어 있으며, 바이오매스 유래 파클리탁셀 정제를 위한 더 효율적인 흡착방법 개발에 대한 연구는 매우 미미한 실정이다.

따라서, 본 발명자들은 택서스 치넨시스 (Taxus chinensis) 유래 파클리탁셀의 정제를 위하여 초음파 캐비테이션 버블(ultrasonic cavitation bubbles) 또는 가스 버블(gas bubbles)을 이용한 새로운 개념의 흡착방법을 제시함으로써 기존의 전통적인 흡착 공정에 비해 흡착량을 증가시킬 수 있는 방법을 개발하고자 하였다. 더 나아가 전통적인 흡착 과정에서 흔히 발생하는 입자 내 확산 제한에 의한 율속 단계(rate-limiting step)를 획기적으로 극복할 수 있는 방법을 제시하고자 하였다.

본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 파클리탁셀 정제 시 흡착단계에서 파클리탁셀의 흡착량을 증가시키거나, 파클리탁셀의 흡착량 증가와 함께 율속 단계 없이 빠른 시간 내에 파클리탁셀을 신속하게 흡착시키기 위한 방법 및 이러한 흡착방법을 이용하여 결과적으로 파클리탁셀의 순도 및 수율을 높일 수 있는 파클리탁셀의 정제방법을 제공하는데 목적이 있다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 초음파 캐비테이션 버블 또는 가스 버블을 처리하여 수행되는 파클리탁셀의 흡착방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 파클리탁셀의 흡착방법은 파클리탁셀을 포함하는 시료를 비극성 유기용매에 용해시킨 후 흡착제를 첨가하고, 초음파 캐비테이션 버블 또는 가스 버블을 처리하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 비극성 유기용매는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 흡착방법은 교반 하에 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 교반 시 교반 속도는 180 rpm 이상일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 초음파 캐비테이션 버블은 20 내지 50 kHz의 주파수에서 50 W 내지 400 W의 초음파 파워로 초음파를 처리하여 발생될 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 초음파 처리는 1분 이상 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 흡착방법에서 초음파 캐비테이션 버블의 처리 시 율속 단계인 흡착제 입자 내 확산이 제거될 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 가스 버블은 1.00L/분 내지 10.00L/분의 가스 유량을 주입하여 발생될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 가스 버블은 15분 이하의 시간 동안 처리될 수 있다.

본 발명은 또한, 전술한 파클리탁셀의 흡착방법을 포함하는 파클리탁셀의 정제방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 a) 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 단계; b) 유기용매 추출을 수행하는 단계; c) 액체-액체 추출을 수행하는 단계; d) 헥산 침전을 수행하는 단계; e) 분별 침전을 수행하는 단계; 및 f) 전술한 파클리탁셀의 흡착방법을 수행하는 단계;를 포함하는 파클리탁셀의 정제방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 a) 단계의 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각(cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 파클리탁셀 흡착방법 및 이를 포함하는 파클리탁셀 정제방법은 흡착단계에서 초음파 캐비테이션 버블 또는 가스 버블을 처리함으로써, 종래의 전통적인 파클라탁셀 흡착방법에 비해 파클리탁셀의 흡착량을 증가시키거나, 파클리탁셀의 흡착량 증가와 함께 입자내 확산 제한을 해소하여 율속 단계 없이 빠른 시간 내에 파클리탁셀을 신속하게 흡착시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 파클리탁셀 흡착방법을 이용하여 파클리탁셀을 분리 및 정제하는 경우, 최종적으로 수득되는 파클리탁셀의 순도 및 수율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 흡착 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있어 전체적인 파클리탁셀의 분리 및 정제 공정이 효율성이 극대화될 수 있다.

도 1의 (A) 내지 (C)는 각각 파클리탁셀의 전처리(pre-purification)를 위한 전통적 흡착(A), 초음파 캐비테이션 버블을 이용한 흡착(B) 및 가스 버블을 이용한 흡착(C)의 개략도를 나타낸 것이다.
도 2는 혼합 하(~180 rpm)에 초음파 캐비테이션 버블을 이용한 파클리탁셀 흡착방법을 수행하여 흡착 시간 경과에 따른 파클리탁셀의 흡착량을 분석한 그래프이다.
도 3의 (A)는 전통적 흡착의 입자 내 확산 모델을 나타낸 것이고, (B)는 혼합 하(~180 rpm)에서 초음파 매개 흡착의 입자 내 확산 모델을 나타낸 것이다.
도 4는 혼합 부재 하에 초음파를 이용한 파클리탁셀 흡착방법을 수행하여 흡착 시간 경과에 따른 파클리탁셀의 흡착량을 분석한 그래프이다.
도 5는 혼합 부재 시 초음파 매개 흡착의 입자 내 확산 모델을 나타낸 것이다.
도 6은 가스 버블 또는 탈기된 용액(메틸렌 클로라이드)을 이용한 파클리탁셀 흡착방법을 수행하여 흡착 시간 경과에 따른 파클리탁셀의 흡착량을 분석한 그래프이다.
도 7은 가스 버블 또는 탈기된 용액(메틸렌 클로라이드)을 이용한 파클리탁셀 흡착의 입자 내 확산 모델을 나타낸 것이다.
도 8의 (A) 내지 (C)는 각각 초음파 캐비테이션 버블을 이용한 흡착(A), 가스 버블을 이용한 흡착(B) 및 탈기된 용액을 이용한 초음파 매개 흡착(C)에서 버블 클라우드(cloud)의 이미지를 나타낸 것이다.

상술한 바와 같이, 현재까지 파클리탁셀의 분리/정제를 위한 흡착 공정에 대한 연구는 흡착 공정의 주요 변수의 영향 및 최적화에 대한 정성적 연구에만 집중되어 왔고, 바이오매스 유래 파클리탁셀 정제를 위한 더 효율적인 흡착방법 개발에 대한 연구는 매우 미미한 실정이었다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 택서스 치넨시스 (Taxus chinensis) 유래 파클리탁셀의 정제를 위해 초음파 캐비테이션 버블(ultrasonic cavitation bubbles) 또는 가스 버블(gas bubbles)을 이용하여 새로운 개념의 흡착방법을 제시함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명에 따른 파클리탁셀 흡착방법은 기존의 전통적인 흡착 공정에 비해 파클리탁셀의 흡착량을 증가시키거나, 파클리탁셀의 흡착량 증가와 함께 흡착제의 입자내 확산 제한 해소로 율속 단계 없이 빠른 시간 내에 파클리탁셀을 신속하게 흡착시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 파클리탁셀 흡착방법을 이용하여 파클리탁셀을 분리 및 정제하는 경우, 최종적으로 수득되는 파클리탁셀의 순도 및 수율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 흡착 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있어 전체적인 파클리탁셀의 분리 및 정제 공정이 효율성이 극대화될 수 있다.

이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는, A 및 B"를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

본 발명은 초음파 캐비테이션 버블 또는 가스 버블을 처리하여 수행되는 파클리탁셀의 흡착방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 파클리탁셀 흡착방법은 파클리탁셀을 포함하는 시료를 비극성 유기용매에 용해시킨 후 흡착제를 첨가하고, 초음파 캐비테이션 버블 또는 가스 버블을 처리하여 수행될 수 있다.

본 발명의 파클리탁셀 흡착방법에 있어서, 상기 비극성 유기용매는 흡착제 처리를 위하여 시료(즉, 미가공 파클리탁셀(crude paclitaxel))를 용해하기 위해 사용된다. 본 발명에서 사용되는 비극성 유기용매는 예를 들어, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 메틸렌 클로라이드를 사용할 수 있다.

본 발명의 파클리탁셀 흡착방법에 있어서, 상기 흡착제는 상용흡착제인 활성 백토(active clay), 활성탄(activated carbon) 차콜(charcoal) 또는 실로퓨트(sylopute) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 실로퓨트를 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일실시예에서는 도 1의 (A)에 나타낸 종래의 전통적인 흡착 공정(대조군) 및 도 1의 (B)에 나타낸 혼합 하에 초음파 캐비테이션 버블을 이용한 흡착 공정에 따른 파클리탁셀의 흡착량, 흡착 시간 경과에 따른 흡착량의 변화 및 율속 단계를 확인하였다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, 동일한 흡착 시간 동안 종래의 전통적인 흡착 공정 비해 초음파 캐비테이션 버블을 이용한 흡착 공정에서 파클리탁셀의 흡착량이 약 27% 내지 44%까지 증가하였으며, 초음파 파워가 증가할수록 파클리탁셀 흡착량의 증가폭이 상승하였다. 그러나, 초음파 캐비테이션 버블을 이용한 흡착 공정의 경우, 흡착 시간 경과에 따른 흡착량은 거의 변화가 없었으며, 1분 내로 대부분의 파클리탁셀이 흡착제로 빠르게 흡착되어 전통적인 흡착 공정에 비해 짧은 시간 동안 다량의 파클리탁셀을 효과적으로 흡착시킬 수 있었다.

또한, 회분식 흡착 실험 결과를 토대로 흡착 공정의 율속 단계(rate-limiting step)를 확인하기 위해서 입자 내 확산 모델(Intraparticle diffusion model)에 의해

와

를 도식화하였다. 일반적으로 흡착 공정에서 입자 내 확산 모델식은 세 영역의 다중 선형(가파른 부분, 완만한 부분, 평형한 부분)으로 구분된다. 먼저 가파른 부분은 순간적 흡착(instantaneous adsorption) 또는 외부 표면 흡착(external surface adsorption)으로 파클리탁셀이 용액을 통해 실로퓨트의 외부 경계층으로 이동하는 부분이고, 완만한 부분은 점진적 흡착(gradual adsorption)으로 파클리탁셀이 입자 내로 확산되는 부분이며, 마지막으로 평형한 부분은 실로퓨트의 파클리탁셀 흡착이 거의 평형에 도달하여 용액 내 남은 파클리탁셀의 양이 적어 입자 내 확산속도가 느려지기 시작하는 부분이다.

도 3의 (A)에서 확인되는 바와 같이 전통적인 흡착 공정은 그래프 상에서 완만한 부분과 평형을 이루는 부분의 두 단계가 나타났고, 입자 내 확산이 율속 단계로 확인되었다. 반면, 초음파 매개 흡착 공정은 도 3의 (B)에서 확인되는 바와 같이 그래프 상에서 평형을 이루는 부분만 나타나, 외부 표면 흡착(external surface adsorption)과 입자 내 확산(intraparticle diffusion)에 제한 없이 흡착(율속 단계 미존재)이 이루어짐을 알 수 있었다. 이러한 현상은 초음파 매개 흡착에서 초음파 캐비테이션 버블의 붕괴에 의한 충격파/마이크로젯(shock waves/microjets)으로 물질 전달이 더 촉진되기 때문인 것으로 판단된다.

결과적으로, 초음파 매개 흡착 공정은 입자 내 확산 제한이 해소되어 율속 단계 없이 짧은 시간 동안 다량의 파클리탁셀을 효과적으로 흡착시킬 수 있음을 알 수 있다.

추가로, 본 발명자들은 초음파 매개 흡착 과정에서, 혼합 유무에 따른 파클리탁셀의 흡착량, 흡착 시간 경과에 따른 흡착량의 변화 및 율속 단계를 확인하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 혼합 없이 초음파 매개 흡착 공정을 수행한 경우에도 혼합 하에 초음파 매개 흡착 공정을 수행한 경우와 마찬가지로 종래의 전통적인 흡착 공정 비해 파클리탁셀의 흡착량이 증가하였고, 초음파 파워가 증가할수록 파클리탁셀 흡착량의 증가폭이 상승하였다. 흡착 시간 경과에 따른 흡착량 또한 거의 변화가 없었으며, 1분 내로 대부분의 파클리탁셀이 흡착제로 빠르게 흡착되어 전통적인 흡착 공정에 비해 짧은 시간 동안 다량의 파클리탁셀을 효과적으로 흡착시킬 수 있었다. 그러나, 혼합 없이 초음파 매개 흡착 공정을 수행한 경우, 혼합 하에 초음파 매개 흡착 공정을 수행한 경우에 비해 약 8% 내지 12% 정도 흡착량이 감소함을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 파클리탁셀 흡착방법에 있어서, 초음파 캐비테이션 버블이 처리되는 경우, 파클리탁셀의 흡착량을 보다 증가시기키 위해 혼합 하에 수행될 수 있다. 구체적으로, 파클리탁셀을 포함하는 시료를 비극성 유기용매에 용해시킨 후 흡착제를 첨가하고, 용매에 초음파 캐비테이션 버블을 처리하는 전체 과정 동안 혼합이 이루어진다. 이때, 상기 혼합은 교반을 통해 이루어질 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 교반을 통해 혼합이 이루어지는 경우, 교반 속도는 180 rpm 이상일 수 있으나, 파클리탁셀을 포함하는 시료가 대략 1분 내로 흡착제에 흡착될 수 있는 정도의 교반 속도라면 제한 없이 적용될 수 있다.

본 발명의 파클리탁셀 흡착방법에 있어서, 초음파 캐비테이션 버블은 20 내지 50 kHz의 주파수에서 50 W 내지 400 W의 초음파 파워로 초음파를 처리하여 발생될 수 있다.

만일, 50 W 미만의 파워로 초음파가 처리되는 경우, 처리 효율 감소 문제가 발생할 수 있고, 400 W를 초과하는 파워로 초음파가 처리되는 경우, 파클리탁셀 분해 문제가 발생할 수 있으므로, 상기 범위 내의 파워로 초음파를 처리하는 것이 바람직하다.

본 발명의 파클리탁셀 흡착방법에 있어서, 초음파 처리는 1분 이상 수행되는 것이 바람직하다. 전술한 바와 같이, 초음파 캐비테이션 버블을 이용한 파클리탁셀 흡착방법은 1분 이내로 대부분의 파클리탁셀이 흡착제에 흡착되므로, 대략 1분 정도의 초음파 캐비테이션 버블의 처리로 흡착이 완료될 수 있다. 다만, 파클리탁셀을 최대량으로 흡착시키기 위해 10분까지 초음파 캐비테이션 버블이 처리될 수 있으나, 10분을 초과하는 경우 시간 경과에 따른 파클리탁셀 흡착량이 극미하거나, 흡착량이 증가하지 않아 흡착 공정의 효율이 떨어질 수 있으므로, 10분을 초과하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 구체적인 다른 일실시예에서는 도 1의 (A)에 나타낸 종래의 전통적인 흡착 공정(대조군) 및 도 1의 (C)에 나타낸 가스 버블을 이용한 흡착 공정에 따른 파클리탁셀의 흡착량, 흡착 시간 경과에 따른 흡착량의 변화 및 율속 단계를 확인하였다.

도 6에서 확인되는 바와 같이, 동일한 흡착 시간 동안 종래의 전통적인 흡착 공정 비해 가스 버블을 이용한 흡착 공정에서 파클리탁셀의 흡착량이 약 5% 내지 20%까지 증가하였고, 모든 유량에서 약 7분 내외의 시간까지는 시간 경과에 따라 흡착량이 증가하는 경향을 보였으나, 7분 이후에는 거의 변화가 없었다.

또한, 회분식 흡착 실험 결과를 토대로 흡착 공정의 율속 단계(rate-limiting step)를 확인하기 위해서 입자 내 확산 모델에 의해

와

를 도식화하였다.

도 7에서 확인되는 바와 같이 가스 버블을 이용한 흡착 공정은 전통적인 흡착 공정과 마찬가지로 그래프 상에서 완만한 부분과 평형을 이루는 부분의 두 단계가 나타났으며, 이는 입자 내 확산이 율속 단계임을 의미한다. 이러한 결과로부터 가스 버블을 이용한 흡착방법은 파클리탁셀의 흡착량 증가에 영향을 미치지만, 입자 내 확산 개선에는 영향을 미치지 못한다는 것을 알 수 있다.

가스 버블을 이용한 흡착방법이 초음파 캐비테이션 버블을 이용한 흡착방법과 달리 입자 내 확산 개선에 영향을 미치지 못하는 이유는, 가스 버블에서의 버블은 단지 팽창(expansion)만 하게 되고 버블 파열(bubble collapse)이 일어나지 않아 충격파(shock waves)/마이크로젯(microjets)이 발생하지 않기 때문인 것으로 판단된다.

추가로, 본 발명자들은 흡착 과정에서 버블의 역할을 규명하기 위해 탈기된 메틸렌 클로라이드 용액으로 초음파 매개 흡착을 수행하여, 버블 유무에 따른 파클리탁셀의 흡착량, 흡착 시간 경과에 따른 흡착량의 변화 및 율속 단계를 확인하였다.

도 6에서 확인되는 바와 같이, 탈기된 메틸렌 클로라이드 용액으로 초음파 매개 흡착을 수행하는 경우, 흡착 시간이 경과함에 따라 파클리탁셀의 흡착량이 증가하였으나, 전통적인 흡착 공정보다 약 30% 정도 평형 흡착량이 감소하였다.

또한, 회분식 흡착 실험 결과를 토대로 흡착 공정의 율속 단계를 확인하기 위해서 입자 내 확산 모델에 의해

와

를 도식화하였다. 도 7에서 확인되는 바와 같이 전통적인 흡착 공정과 마찬가지로 그래프 상에서 완만한 부분과 평형을 이루는 두 단계가 확인되었고, 이는 흡착 과정에서 입자 내 확산이 율속 단계임을 의미한다.

본 발명의 파클리탁셀 흡착방법에 있어서, 상기 가스 버블은 1.00L/분 내지 10.00L/분의 가스 유량을 주입하여 발생될 수 있다. 만일, 1.00L/분 미만의 가스 유량이 주입되는 경우, 충분한 가스 버블이 생성되지 않아 파클리탁셀의 흡착량이 감소할 수 있고, 10.00L/분을 초과하여 가스 유량이 주입되는 경우, 조업 상의 문제뿐만 아니라 유량 증가에 따른 파클리탁셀 흡착량의 증가 효과가 미미하여, 흡착 공정의 효율이 떨어질 수 있다.

본 발명의 파클리탁셀 흡착방법에 있어서, 가스 버블은 15분 이하의 시간 동안 주입되는 것이 바람직하다. 전술한 바와 같이, 가스 버블을 이용한 파클리탁셀 흡착방법은 7분 이내로 대부분의 파클리탁셀이 흡착제에 흡착되므로, 대략 7분 내외의 가스 버블 처리로 흡착이 완료될 수 있다. 다만, 파클리탁셀을 최대량으로 흡착시키기 위해 15분까지 가스 버블이 처리될 수 있으나, 15분을 초과하는 경우 시간 경과에 따른 파클리탁셀 흡착량이 극미하거나, 흡착량이 증가하지 않아 흡착 공정의 효율이 떨어질 수 있으므로, 15분을 초과하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 파클리탁셀 흡착방법에 있어서, 가스 버블이 처리되는 경우에도, 파클리탁셀의 흡착량을 보다 증가시기키 위해 혼합 하에 수행될 수 있다. 구체적으로, 파클리탁셀을 포함하는 시료를 비극성 유기용매에 용해시킨 후 흡착제를 첨가하고, 용매에 가스 버블을 처리하는 전체 과정 동안 혼합이 이루어진다. 이때, 상기 혼합은 교반을 통해 이루어질 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 교반을 통해 혼합이 이루어지는 경우, 교반 속도는 180 rpm 이상일 수 있으나, 파클리탁셀을 포함하는 시료가 대략 7분 내외로 흡착제에 흡착될 수 있는 정도의 교반 속도라면 제한 없이 적용될 수 있다.

본 발명의 파클리탁셀 흡착방법에 있어서, 상기 가스 버블은 기포발생기를 이용하여 용액에 주입할 수 있다. 예를 들어, 기포발생기의 산소 토출구에 에어 호스 (hose), 튜브 (tube) 또는 관 (pipe) 등을 연결하여 가스 버블을 주입할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

주입되는 가스 버블의 직경은 0.5 내지 5.0mm일 수 있으나, 버블이 형성될 수 있는 크기의 직경이라면 제한 없이 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 전술한 파클리탁셀 흡착방법을 포함하는 파클리탁셀의 정제방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 파클리탁셀의 정제방법을 제공한다:

a) 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 단계;

b) 유기용매 추출을 수행하는 단계;

c) 액체-액체 추출을 수행하는 단계;

d) 헥산 침전을 수행하는 단계;

e) 분별 침전을 수행하는 단계; 및

f) 전술한 파클리탁셀의 흡착방법을 수행하는 단계.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 a) 단계의 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 수득한 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각(cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군 중에서 선택한 1종 이상을 포함할 수 있다.

또한, 상기 택서스속 식물체는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 또는 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 바이오매스를 수득하는 단계는 통상적으로 식물세포배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 b) 단계의 유기용매 추출은 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용하는 유기용매를 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C1 내지 C4의 알코올을 포함할 수 있다.

상기 유기용매의 구체적인 예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 메틸렌 클로라이드에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바이오매스로부터 파클리탁셀을 가급적 많이 회수할 수 있는 유기용매로 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다.

나아가, 상기 유기용매 추출의 조건은 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하는 방법에서 사용할 수 있는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 20 내지 45℃에서 30분 내지 2시간 동안 수행할 수 있다.

만약, 20℃미만의 온도로 처리할 경우, 낮은 온도로 인해 파클리탁셀의 추출 효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있으며, 45℃를 초과하는 온도로 처리할 경우, 높은 온도로 인해 파클리탁셀이 분해되는 문제가 발생할 수 있다.

만약, 30분 미만으로 처리할 경우, 바이오매스 내의 파클리탁셀이 모두 추출되지 않아 파클리탁셀의 추출효율이 낮아지는 문제가 발생할 수 있으며, 2시간을 초과하는 시간으로 처리할 경우, 과도한 조업 시간으로 경제적인 문제가 발생할 수 있다.

더불어, 상기 용매 추출은 1회 내지 수회 반복 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2회 이상, 더욱 바람직하게는 3회 내지 5회 반복 수행할 수 있고, 이후 수득된 추출액은 감압상태 하에서 농축한 뒤 건조하여 액체-액체 추출단계에 사용할 수 있다.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 c) 단계의 액체-액체 추출은 통상적으로 비극성 유기용매와 극성 유기용매의 상분리를 이용하여 파클리탁셀에 함유되어 있는 극성 불순물을 제거하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다.

예를 들어, 상기 비극성 유기용매는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군 중에서 선택한 1종 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 극성 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

또한, 상기 액체-액체 추출은 1회 내지 수회 반복 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2회 이상, 더욱 바람직하게는 3회 내지 5회 반복 수행할 수 있다.

나아가, 만약 극성 유기용매가 C1 내지 C4의 알코올인 경우, 비극성 유기용매로 메틸렌 클로라이드를 사용하는 것이 바람직하고, 메틸렌 클로라이드는 알코올 농축액의 20 내지 30 %(v/v)로 바람직하게 사용될 수 있으며, 과도한 메틸렌 클로라이드의 사용은 후속 공정에 많은 부담을 초래하게 된다.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 d) 단계의 헥산 침전은 c) 단계에서 수득한 조추출물(농축된 메틸렌 클로라이드 용액)에 헥산을 첨가함으로써 파클리탁셀보다 비극성인 물질을 제거할 수 있다.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 e) 단계의 분별 침전은 헥산 침천을 거친 파클리탁셀을 포함하는 미가공의 시료를 수용성 유기용매와 혼합하고 물을 첨가하는 것으로 수행된다.

시료를 수용성 유기용매에 용해하는 것은 수용성 유기용매에 시료를 균일하게 분산할 수 있는 함량으로 용해하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 수용성 유기용매에 순수 파클리탁셀의 함량이 0.1% 내지 1%(w/v)가 되도록 용해시킬 수 있다.

상기 수용성 유기용매는 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용하는 유기용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C1 내지 C4의 알콜 및 메틸렌 클로라이드로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메탄올을 포함할 수 있다.

그 다음으로, 시료를 수용성 유기용매에 용해시킨 다음 수용성 유기 용매와 물의 부피비가 50:50 내지 20:80이 될 때까지 물을 첨가하여 분별 침전을 수행한다. 이때, 물은 증류수를 사용할 수 있고, 교반 하에 한 방울씩 떨어뜨려 첨가하는 것이 바람직하다.

교반 속도는 100 내지 300rpm으로 이루어질 수 있다. 만약, 100rpm 미만의 속도로 교반할 경우, 교반으로 인해 수득할 수 있는 이점인 파클리탁셀 침전 속도가 느려 파클리탁셀 침전 시간이 증가하는 문제가 발생할 수 있으며, 300rpm을 초과하는 속도로 교반할 경우, 과도한 혼합으로 조업효율이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.

상기 물의 첨가량은 수용성 유기용매와 물의 부피비가 50:50 내지 20:80으로 혼합할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 수용성 유기용매와 물의 부피비가 47:53 내지 35:65로 혼합할 수 있다.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, a) 내지 e) 단계는 전술한 내용에 제한되지 않고, 각 단계에서 파클리탁셀의 수율 및 순도를 높이기 위해 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 적용하여 수행될 수 있다.

더불어, 본 발명은 상술한 바와 같은 파클리탁셀의 정제방법으로 정제한 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 통상적으로 파클리탁셀을 포함할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 항암제, 류마티스 관절염 치료제 또는 알츠하이머 치료제일 수 있다.

상기 항암제는 악성종양의 치료를 위하여 사용되는 화학요법제의 총칭으로, 대부분의 항암제는 암세포의 각종 대사경로에 개입하여 주로 헥산의 합성을 억제하거나 항암활성을 나타내는 약제이다. 정상세포를 손상하지 않고 종양세포만을 저해하는 것은 어렵기 때문에 작용 메커니즘이 여러 가지로 다른 각양각색의 약제가 많은 기업에 의하여 연구되어 왔다. 의약품에 관련된 생물공학의 응용 중 가장 주력하고 있는 분야이다. 현재 판매되고 있는 항암제는 작용 메커니즘에 따라 면역을 부활화하는 것, 대사길항작용이 있는 것, 종양세포를 직접 살상하는 항생물질의 세 가지 종류로 대별된다.

본 발명에 따른 정제방법으로 정제한 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 파클리탁셀에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등 이 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발 명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

파클리탁셀 시료 준비

본 실시예에 사용된 파클리탁셀은 문헌 [Gamborg, O. L., Miller, R. A. and Ojima, K. (1986)., Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells, Exp Cell Res., 50, 151-158; Choi, H. K., Son, S. J., Na, G. H., Hong, S. S., Park, Y. S. and Song, J. Y. (2002), Mass production of paclitaxel by plant cell culture, Korean J. Plant Biotechnol., 29, 59-62.]을 참조하여 식물세포 택서스 치넨시스(Taxus chinensis)의 잎으로부터 유도된 세포주(cell line)를 현탁 배양(24 ℃, 150 rpm, 암조건)하여 얻었다. 식물세포배양 후 배양액으로부터 데칸터 (Westfalia, CA150 Claritying Decanter)와 고속원심분리기(α-Laval, BTPX205GD-35CDEEP)를 이용하여 바이오매스(식물세포)를 회수하였다. 문헌 [Pyo, S. H., Park, H. B., Song, B. K., Han, B. H. and Kim, J. H. (2004), "A Large-Scale Purification of Paclitaxel from Cell Cultures of Taxus chinensis", Process Biochem., 39, 1985-1991.]에 기재된 바와 같이, 바이오매스 추출, 액-액 추출, 헥산 및 분별 침전 후 실리카- 및 ODS (C₁₈)-액체 크로마토그래피를 거쳐 파클리탁셀(순도: 90%)를 얻었다.

초음파 캐비테이션 버블을 이용한 흡착방법

2-1. 흡착 공정

전통적 흡착 공정 및 초음파 캐비테이션 버블(ultrasonic cavitation bubbles)을 이용한 흡착방법의 개략도를 각각 도 1의 (a) 및 (b)에 나타내었다. 대조군(전통적 흡착 공정)은 25℃ 항온조에서 180 rpm으로 교반 하에 실시예 1에서 수득된 파클리탁셀 6,500 ppm을 비극성 유기용매인 메틸렌 클로라이드(methylene chloride) 1 ml에 용해시킨 다음, 흡착제로 실로퓨트(sylopute) 10 g/L를 첨가하는 방식으로 수행하였다.

초음파 캐비테이션 버블(ultrasonic cavitation bubbles)을 이용한 흡착 공정의 경우, 25℃ 항온조에서 180 rpm으로 교반 하에 파클리탁셀 6,500 ppm을 메틸렌 클로라이드에 용해시킨 후 실로퓨트를 첨가하고 초음파 세척기 (UC-10, Jeiotech, Korea)를 이용하여 초음파 캐비테이션 버블을 처리하여 수행하였다. 흡착 양상을 확인하기 위하여 동일한 용액에 초음파 파워를 각각 80, 180, 250 W로 변화시켜주며 흡착 실험을 수행하였다.

흡착 실험이 완료된 용액을 진공오븐(UP-2000, EYELA, Japan)에서 24시간동안 40℃로 건조한 후, HPLC를 이용하여 파클리탁셀의 흡착량을 분석하였다. 각 흡착 공정에 따른 파클리탁셀의 함량을 분석하기 위해, HPLC (High performance liquid chromatography) 시스템(Waters, USA)과 Capell Pak C₁₈ (250 × 4.6 mm, Shiseido, Japan) 컬럼을 이용하였다. 이동상으로는 아세토니트릴과 증류수의 혼합용액(65/35~35/65, v/v, 구배모드)을 1.0 ㎖/분의 유량으로 사용하였다. 시료의 주입량은 20 ㎕로 UV를 이용하여 227 nm에서 검출하였다. 표준 시료는 Sigma-Aldrich 제품(순도: 95%)을 이용하였고, 표준정량곡선을 사용하여 HPLC 분석을 하였다.

2-2. 초음파 캐비테이션 버블을 이용한 흡착방법에 따른 파클리탁셀 함량 확인

도 2에 나타난 바와 같이, 대조군(control)인 전통적 흡착 공정의 경우 흡착 시간이 경과함에 따라 흡착량이 증가하였으며, 최대 ~300 mg/g 정도였다. 다음으로 25℃, 교반(~180 rpm)하에서 파클리탁셀(순도: 90%)과 흡착제 실로퓨트를 메틸렌 클로라이드에 녹인 후 초음파 세척기의 세기를 80, 180, 250 W로 변화시키면서 초음파 매개 흡착을 수행한 경우, 흡착 시간에 따른 파클리탁셀의 흡착량을 조사하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 초음파 파워 80 W의 경우 흡착 1, 4, 7 및 10분에서 흡착량이 각각 374.4516, 375.4926, 378.4158 및 381.9641 mg/g이었고, 180 W의 경우 흡착 1, 4, 7 및 10분에서 각각 402.5164, 404.9987, 405.1136 및 407.9849 mg/g이었으며, 250 W의 경우 흡착 1, 4, 7 및 10분에서 각각 426.3749, 427.4158, 430.154 및 431.5148 mg/g이었다.

즉, 흡착 시간 경과에 따른 흡착량의 변화가 거의 없었으며, 흡착 초기인 1분 내에 빠르게 흡착이 일어남을 알 수 있었다. 또한, 초음파 파워가 증가할수록 흡착량도 증가하였으며, 대조군 대비 27% (80W), 36% (180 W), 44% (250 W) 증가하여 초음파 파워가 증가할수록 증가폭이 커짐을 알 수 있었다.

2-3. 초음파 캐비테이션 버블을 이용한 흡착방법의 율속 단계 확인

회분식 흡착 실험 결과를 토대로 흡착 공정의 율속 단계(rate-limiting step)를 확인하기 위해서 입자 내 확산 모델(intraparticle diffusion model)에 의해

와

를 도식화하여 도 3에 나타내었다.

일반적으로 흡착공정에서 입자 내 확산 모델식은 세 영역의 다중 선형(가파른 부분, 완만한 부분, 평형한 부분)으로 구분된다. 먼저 가파른 부분은 순간적 흡착(instantaneous adsorption) 또는 외부 표면 흡착(external surface adsorption)으로 파클리탁셀이 용액을 통해 실로퓨트의 외부 경계층으로 이동하는 부분이고, 완만한 부분은 점진적 흡착(gradual adsorption)으로 파클리탁셀이 입자 내로 확산되는 부분이며, 마지막으로 평형한 부분은 실로퓨트의 파클리탁셀 흡착이 거의 평형에 도달하여 용액 내 남은 파클리탁셀 양이 적어 입자 내 확산속도가 느려지기 시작하는 부분이다.

도 3의 (A)에 나타난 바와 같이, 대조군(전통적 흡착 공정)의 경우 완만한 부분과 평형을 이루는 두 단계가 확인되는 반면, 초음파 매개 흡착의 경우에는 도 3의 (B)에 나타난 바와 같이 평형을 이루는 부분만이 확인되었다. 즉, 대조군의 경우에는 입자 내 확산이 율속 단계로 확인되는 반면, 초음파 매개 흡착의 경우에는 외부 표면 흡착(external surface adsorption)과 입자 내 확산에 제한 없이 흡착(율속 단계 미존재)이 이루어짐을 알 수 있었다. 결과적으로 흡착 과정에 초음파를 도입함으로 기존 흡착 공정에 비해 흡착량을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 율속 단계(입자 내 확산)를 효과적으로 제거할 수 있었다.

초음파 캐비테이션 버블을 이용한 흡착방법에서 혼합(교반) 유무에 따른 파클리탁셀 함량 비교

3-1. 혼합 없이 초음파 캐비테이션 버블을 이용한 흡착방법에 따른 파클리탁셀 함량 확인

혼합(mixing) 없이 초음파만 이용하여 흡착시켰을 때의 흡착 양상을 알아보기 위해, 실시예 2와 동일하게 초음파 캐비테이션 흡착방법을 수행하되, 파클리탁셀을 메틸렌 클로라이드에 녹인 후 실로퓨트를 첨가하여 혼합하지 않은 상태에서 초음파 파워를 80, 180, 250 W로 변화시키면서 흡착 시간에 따른 파클리탁셀의 흡착량을 조사하였다.

도 4에서 확인되는 바와 같이, 80 W의 경우 1, 4, 7 및 10분에서 흡착량이 각각 335.4168, 336.5418, 338.9748 및 342.6148 mg/g이었고, 180 W의 경우 1, 4, 7 및 10분에서 365.4158, 368.6498, 369.0715 및 373.4158 mg/g이었으며, 250 W의 경우 1, 4, 7 및 10분에서 375.1145, 375.2140, 377.5030 및 379.5168 mg/g이었다. 흡착 시간 경과에 따른 흡착량의 변화는 거의 없었으며, 흡착 초기인 1분 내에 빠르게 흡착이 일어남을 알 수 있었다. 또한, 초음파 파워가 증가할수록 흡착량도 증가하였다. 혼합(~180 rpm)이 있는 경우와 비교하면, 초음파 파워 80-250 W에서 흡착량이 대략 8-12% 정도 감소하였다.

3-2. 혼합 없이 초음파 캐비테이션 버블을 이용한 흡착방법의 율속 단계 확인

혼합이 없을 경우에도, 회분식 흡착 실험 결과를 토대로 흡착 공정의 율속 단계를 확인하기 위해서 입자 내 확산 모델(intraparticle diffusion model)에 의해

와

를 도식화하여 도 5에 나타내었다. 도 5에서 확인되는 바와 같이 외부 표면 흡착(external surface adsorption)과 입자 내 확산에 제한 없이(율속 단계 없이) 흡착이 이루어짐을 알 수 있었다. 결국, 율속 단계의 제거는 흡착 과정에서의 혼합이 아닌 초음파가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

가스 버블을 이용한 흡착방법

가스 버블(gas bubbles)을 이용한 흡착방법의 개략도를 도 1의 (c)에 나타내었다. 대조군인 전통적 흡착 공정은 실시예 2-1과 동일하게 수행하였고, 가스 버블(gas bubbles)을 이용한 흡착 공정의 경우, 대조군과 동일한 용액에 기포 발생기(SH-A2, Amazonpet, Korea)를 이용하여 가스 유량을 1.15, 4.52, 9.41 L/분으로 변화시켜 흡착 실험을 수행하였다. 파클리탁셀 함량 분석은 실시예 2와 동일하게 수행하였다.

4-1. 가스 버블을 이용한 흡착방법에 따른 파클리탁셀 함량 확인

가스 버블을 도입하여 흡착 실험을 수행한 후, 흡착 시간에 따른 파클리탁셀의 흡착량을 조사하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 가스 유량이 1.15 L/분일 때 1, 4, 7, 10 및 15분에서 흡착량은 각각 261.9258, 293.4158, 314.5148, 315.9987 및 316.7839 mg/g이었고, 가스 유량이 4.52 L/분일 때 1, 4, 7, 10 및 15분에서 흡착량은 각각 288.0707, 320.4881, 342.1458, 343.6887 및 344.2849 mg/g이었으며, 가스 유량이 9.41 L/분일 때 1, 4, 7, 10 및 15분에서 흡착량은 각각 301.2266, 340.4158, 356.7489, 357.9998 및 358.1456 mg/g이었다. 대조군(전통적 흡착 공정)에 비해서 모든 유량에서 흡착량이 5-20% 정도 증가함을 확인할 수 있었다.

4-2. 가스 버블을 이용한 흡착방법의 율속 단계 확인

회분식 흡착 실험 결과를 토대로 흡착 공정의 율속 단계를 확인하기 위해서 입자 내 확산 모델(intraparticle diffusion model)에 의해

와

를 도식화하여 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 가스 버블을 이용한 흡착방법은 대조군(전통적 흡착 공정)의 경우와 마찬가지로 완만한 부분과 평형을 이루는 두 단계가 확인되는데, 이는 대조군의 경우와 같이 흡착 과정에서 입자 내 확산(intraparticle diffusion)이 율속 단계임을 의미한다.

초음파 캐비테이션 버블의 유무에 따른 파클리탁셀 함량 비교

초음파 캐비테이션 버블의 유무에 따른 영향을 조사하기 위하여, 흡착에 사용되는 용매인 메틸렌 클로라이드를 40 kHz 초음파 세척기에 넣은 후 흡입기 (A-3S, Tokyo Rikakikai Co., Japan)를 이용하여 진공을 걸어 4시간 동안 탈기(용해된 공기를 제거함)한 후, 이 용매를 이용하여 초음파 파워 250 W로 초음파 매개 흡착을 수행하였다.

5-1. 탈기된 용액으로 초음파 케비테이션 버블을 이용한 흡착방법에 따른 파클리탁셀 함량 확인

도 6에 나타난 바와 같이 흡착 1, 4, 7, 10 및 15분일 때 흡착량은 각각 150.5178, 179.8740, 202.7402, 207.6948 및 208.9143 mg/g으로 대조군보다 대략 30% 정도 평형 흡착량이 감소함을 확인할 수 있었다.

5-2. 탈기된 용액으로 초음파 케비테이션 버블을 이용한 흡착방법의 율속 단계 확인

탈기된 용액(degassed solution)을 이용하여 초음파 흡착을 수행한 경우, 회분식 흡착 실험 결과를 토대로 흡착 공정의 율속 단계(rate-limiting step)를 확인하기 위해서 입자 내 확산 모델(intraparticle diffusion model)에 의해

와

를 도식화하여 도 7에 나타내었다. 대조군(전통적 흡착 공정)의 경우와 마찬가지로 완만한 부분과 평형을 이루는 두 단계가 확인되는데, 이는 대조군의 경우와 같이 흡착 과정에서 입자 내 확산(intraparticle diffusion)이 율속 단계임을 의미한다. 이러한 결과로부터 가스 버블은 흡착량 증가에 영향을 미치지만 입자 내 확산(intraparticle diffusion) 개선에는 영향을 미치지 못함을 알 수 있었다.

이러한 결과는, 초음파 매개 흡착(ultrasound-assisted adsorption)의 경우 초음파 캐비테이션 버블의 붕괴(collapse)에 의한 충격파/마이크로젯(shock waves/microjets)으로 물질전달(mass transfer)이 더 촉진되기 때문인 것으로 판단된다. 반면 가스 버블은 캐비테이션 버블과 달리 버블이 단지 팽창(expansion)만 하게 되고 버블 파열이 일어나지 않아 충격파/마이크로젯이 발생하지 않는다. 결과적으로, 초음파 매개 흡착(ultrasound-assisted adsorption)의 경우에는 캐비테이션 버블로 흡착량 증가뿐만 아니라 입자 내 확산을 촉진하여 율속 단계를 없앨 수 있는 반면 가스 버블의 경우에는 흡착량 증가만이 가능하였다.

도 8의 (A) 내지 (C)는 각각 초음파 매개 흡착, 가스 버블을 이용한 흡착 및 탈기된 용액을 이용한 흡착 과정에서의 버블 이미지를 나타낸 것으로, 특히 탈기된 용액을 이용한 흡착 과정에서는 초음파 캐비테이션 버블이 전혀 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다.

Claims (13)

1. 파클리탁셀을 포함하는 시료를 비극성 유기용매에 용해시킨 후 흡착제를 첨가하고 초음파 캐비테이션 버블 또는 가스 버블을 처리하여 수행되는 파클리탁셀의 흡착방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 비극성 유기용매는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 파클리탁셀의 흡착방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 흡착방법은 교반 하에 수행되는 것을 특징으로 하는, 파클리탁셀의 흡착방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 교반 시 교반 속도는 180 rpm 이상인 것을 특징으로 하는, 파클리탁셀의 흡착방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 초음파 캐비테이션 버블은 20 내지 50 kHz의 주파수에서 50 W 내지 400 W의 초음파 파워로 초음파를 처리하여 발생되는 것을 특징으로 하는, 파클리탁셀의 흡착방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 초음파 처리는 1분 이상 수행되는 것을 특징으로 하는, 파클리탁셀의 흡착방법.
8. 제1항에 있어서, 초음파 캐비테이션 버블의 처리 시 율속 단계인 흡착제 입자 내 확산이 제거되는 것을 특징으로 하는, 파클리탁셀의 흡착방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 가스 버블은 1.00L/분 내지 10.00L/분의 가스 유량을 주입하여 발생되는 것을 특징으로 하는, 파클리탁셀의 흡착방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 가스 버블은 15분 이하의 시간 동안 주입되는 것을 특징으로 하는, 파클리탁셀의 흡착방법.
11. 제1항 및 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 파클리탁셀의 흡착방법을 포함하는, 파클리탁셀의 정제방법.
12. a) 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 단계;
    b) 유기용매 추출을 수행하는 단계;
    c) 액체-액체 추출을 수행하는 단계;
    d) 헥산 침전을 수행하는 단계;
    e) 분별 침전을 수행하는 단계; 및
    f) 제1항 및 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 파클리탁셀의 흡착방법을 수행하는 단계;를 포함하는 파클리탁셀의 정제방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 a) 단계의 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각(cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀 정제방법.

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