JP2008049243A - 疎水性化合物の起泡による分離法 - Google Patents

Abstract

【課題】
微生物や動植物の細胞培養液、および酵素反応液等の水性媒体中に溶解または分散している疎水性代謝産物を、有機溶媒による抽出のような煩雑な操作を取る事なく簡単に分離できる方法を提供する。
【解決手段】
目的の疎水性代謝産物を含む水性媒体と気泡を接触させ、界面での疎水性相互作用によって該疎水性産生物を気泡に捕集した後、気泡を系外に分離する。これによって、従来、大掛かりに行う必要があった抽出溶媒の蒸留回収、および精製操作を簡素化し、生産コストおよび生産に伴う環境負荷を大幅に低減することが可能となる。
【選択図】なし

Description

本発明は、水性媒体中で生体反応を利用して産生させた疎水性化合物を、気泡を用いる事によって該水性媒体から分離する方法に関するもので、従来のバイオ生産プロセスを簡略化するために好適に用いる事が出来る。

従来から、泡の持つ溶解または分散物質を濃縮する性質を活かして、一般的な起泡、即ち気泡を発生させる事による浮遊選別法（例えば、特許文献１参照）、泡沫分離法（例えば、特許文献２参照）、または加圧浮上法（例えば、非特許文献１参照）等が開発され、パルプやその他の汚濁液中の懸濁物質や浮遊物質を除去する廃水処理、トナーの分離、鉱山に於ける金属精錬や微粉炭の分離等を目的として実施されている。この様な泡の界面近傍に疎水性物質が濃縮される性質は、原理的には、疎水性相互作用、即ち、疎水性物質が水溶液の持つ電気的な相互作用を嫌い、親水基から遠ざかろうとして水媒体と気泡の気液界面に集まる性質に基づくものである（例えば、非特許文献２、非特許文献３参照）。

近年、バイオ生産技術の重要性が認識されて久しいが、バイオ工業に於いて目的生産物の回収分離に気泡を利用した生産プロセスは殆ど見あたらないのが実状である。強いて挙げれば、アミノ酸回収に於けるイオン交換樹脂の替わりに気泡を利用する試み（例えば、非特許文献４参照）等が僅かに見られるだけである。

従来、疎水性物質を含むバイオ的な有用物質の生産では、目的物質を培養液から分離する際には、有機溶媒を利用する抽出法が一般的に用いられている。例えば、イチイ（Taxus cuspidata）細胞によるパクリタキセルの生産では、有機溶媒を用いてパクリタキセルを抽出し、さらに精製を行う必要がある。しかし、有機溶媒を大量に使用するため、その回収コストは無視出来るものでは無い。また、抽出または逆抽出等の手間によるプロセスの煩雑化や有機溶媒が環境へ漏出した場合の汚染も懸念される。

特開昭５１−９６７０２号公報 特開２００１−１７０６１７号公報 「造水技術ハンドブック」、（財）造水促進センター（１９９３年５月１０日発行） 化学工学便覧 第６版 ６１１頁（丸善（株）発行） ながれ ２３（２００４）７−１５． 化学工学会第３０回秋季大会要旨集（１９９７年、Ｌ１１３）

本発明の目的は、微生物を含む生体細胞が産生する有用な代謝産物の生産プロセスまたは酵素を用いる反応プロセスに於いて、培養液や酵素反応液等の水性媒体、即ち、水または水を含む媒体中に溶解または分散している有用な疎水性代謝産生物等を、有機溶媒による抽出操作を行う事なく或いは抽出の負荷を大きく低減し、簡単に分離できる方法の確立、並びに従来の有機溶媒を用いた分離法で必要な抽出・逆抽出の工程を省略或いは最小限に抑えプロセス及び装置の複雑化を避け、廃液処理等の環境負荷が小さい簡便な製造手段を提供する事にある。

本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、イチイの細胞培養により生産される微量のパクリタキセルを含む培養液から、気泡との疎水性相互作用を利用して当該培養液外に分離出来る事を知った。これによって、有機溶媒による抽出および従来技術では不可欠であった溶媒の回収工程や後段の煩雑な複数の精製工程が不要或いは精製工程が最小限で済むために生産プロセスの大きな簡略化が出来る事、また有機溶媒を使用しない或いは最小限の使用で済むため、生産コストおよび生産に伴う環境負荷を低減できる事を知った。

さらには、微生物、動物細胞、植物細胞の培養液や酵素反応液等の水性媒体に溶解または分散している有機化合物の分離に広く応用可能な事、特に、生産装置を培養系または酵素反応系と起泡系に分けた上、両者を組合せる事で培養時の生産物阻害を防ぎ得る事、酵素反応の平衡をずらす事が出来るので平衡反応率以上の収率が期待出来る事、また、イチイ細胞によるパクリタキセルの生産のみならず、例えば、クズ（Pueraria lobata）細胞によって産生されたイソフラボン、微生物または酵素によって産生された、ステロイド化合物やピロロキノリンキノン（PQQ）の様な補酵素類等の多種多様なバイオ生産物の分離に応用可能である事を知り、本発明に到達した。

即ち、本発明は、以下の（１）から（６）に示す、気泡を利用した水性媒体から疎水性物質を分離する方法に関するものである。
（１）水性媒体中で行う生体反応によって産生する疎水性化合物を分離する方法に於いて、気泡と水性媒体を接触させて水性媒体中に含まれる疎水性化合物を気泡界面に捕集した後、該気泡を水性媒体から分離する事を特徴とする疎水性化合物の分離方法。
（２）生体反応が、微生物、動物細胞、植物細胞、または酵素を利用したものである、（１）に記載の疎水性化合物の分離方法。
（３）水性媒体中に気体を吹き込む事によって発生させた気泡を用いるものである、（１）または（２）に記載の疎水性化合物の分離方法。
（４）気泡が水性媒体外で発生させたものであり、かつ気泡と水性媒体との接触を生体反応系外で行う（１）または（２）に記載の疎水性化合物の分離方法。
（５）気泡として、ミリバブル、マイクロバブルまたはナノバブルを用いる（１）から（４）の何れか一項に記載の疎水性化合物の分離方法。
（６）疎水性化合物がイチイ（Taxus cuspidata）の植物細胞培養によって産生されるパクリタキセルである、（１）から（５）の何れか一項に記載の疎水性化合物の分離方法。

本発明により、多様なバイオ生産プロセスに於いて有機溶媒を用いる事無く空気等の安価かつ使用も容易な気体を用いて起泡させ、得られた気泡と接触させることによって有用な疎水性バイオ生産物を培養液または酵素反応液から分離出来る。また、分離プロセスの簡略化、有機溶媒による環境汚染のリスク回避が期待でき、さらに、生産物が系外に移行するため生産物阻害や反応平衡に基づく限界を超えて反応を進行させる効果も期待出来る。

本発明は、水性媒体を用いる微生物培養や動植物の細胞培養、または酵素反応に於いて、
水性媒体中に溶解、分散する生産物、特に目的生産物が疎水性物質である場合に好適である。気泡に対する当該疎水性物質の捕集量は、気泡表面積の大きさに依存する事から、水性媒体中に少量含まれる希少価値の高い疎水性物質の分離生産に適用すれば、有機溶媒による多段の精製工程を省略して効率的な生産プロセスを構築する事が出来る。

本発明は、水性媒体を用いる発酵培養、細胞培養、酵素反応に於いて広く適用出来るため、対象となる目的物は多岐にわたる。例えば、タンパク質、多糖類、複合多糖類、アラキドン酸やＤＨＡ等の脂肪酸、カロチノイドやアスタキサンチン等のカロチン類、ヒノキチオール等のテルペン類、エピガロカテキンやテオフラビン等のポリフェノール類、アシタバ由来のカルコンやイソフラボン等のフラボノイド類、ステロイド配糖体やトリテルペン配糖体等のサポニン類、パクリタキセル（タキソール）等の抗ガン剤、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）等のビタミン類、またはその他生薬成分等が挙げられ、その中でも特に細胞外に産生される疎水性物質が好ましい例として挙げられる。

当該目的物質を生産する手段としては、微生物による発酵生産系や動植物細胞を用いた組織培養系、または酵素触媒を用いる水性媒体での加水分解反応、エステル交換反応、エステル化反応系等である。前記した当該生産系は、通常、微生物発酵槽や細胞培養槽、培地調整槽、菌体分離器、イオン交換塔、乾燥器等からなる典型的なバイオリアクターシステムで行う事が出来る。

発酵生産の場合、種々のミネラルや添加物を含む、いわゆる液体培地や有機化合物を含む事のある水溶液中で当該物質の生産を行う事が一般的である。当該生産時の反応条件を一概に規定する事は多岐に渡るため困難であるが、一般的な培養手順に従う。より具体的には、炭素源としてグルコース、フルクトース等の単糖類、シュークロース等の二糖類、デンプン、コーンスターチ等の多糖類、廃糖蜜やパルプ廃液、オリーブ油やパラフィン等の油脂類、メタノールやエタノール等のアルコール類、酢酸等の有機酸類、アセトン等のケトン類の様な微生物や動植物細胞が資化できるものであればよい。窒素源として尿素、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、トリプトン、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、麦芽エキス等の無機または有機体窒素源を、また燐酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等の無機塩類を用いる。
培養条件は、対象とする生物種によっても異なるが、培養液の初期ｐＨは３から１０、温度は１０から５０℃で、必要に応じ通気撹拌しつつバッチまたは連続下に培養を行う。

酵素反応の場合も、発酵生産の場合と同様な装置を用いて実施する事が出来る。当該反応における水性媒体は水または水を含む媒体が好ましく、反応の種類に応じ至適な組成の緩衝液を選択して使用すればよい。また、連続的に酵素反応を行う様な場合は、酵素と水性媒体の分離をし易くするため、ビーズ等の担体に担持させた固定化酵素を利用するのが好ましい。なお、酵素の反応速度を上げるため、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｕ等の金属イオンや界面活性剤、有機溶媒等を用いてもよい。

本発明では、細胞培養または酵素反応終了後、目的産物を分離するため、同一培養槽（反応槽）に空気を吹き込む事が最も簡便な手段である。なお、通気撹拌しながら好気的に培養する系では、通気によって生じた気泡を目的産物の分離に併用する事も出来る。
気泡のサイズは、その気液接触面積の大きさが目的生産物の捕集量を左右する事からサイズは小さい方が好ましく、例えば最近その安定的な発生が可能となったミリサイズ、マイクロサイズまたはナノサイズの気泡を用いる事が出来る。気泡への捕集効率を上げるために界面活性剤を系に添加しても良く、当然ながら必要に応じて空気以外の窒素等の気体を導入しても良い。なお、上記した通気量、気泡サイズ、温度等の条件は一概に規定する事は難しく、最適な条件を予め決定した上でそれに従い実施する必要がある。

細胞培養または酵素反応を同一培養槽（反応槽）内で続けると生産物による反応物阻害（プロダクトインヒビション）を生じる事がある。この様な場合、起泡を別装置で行い、培養槽（反応槽）より抜き出した液を当該装置に移送し、発生した気泡と接触させる事が好ましい。気泡に捕集された生産物は、堰を溢れさせる等の手段によって系外に分離すれば生産阻害や平衡反応率以上に反応を進行させる事が出来る。

本発明を、植物細胞培養によるイチイ（Taxus cuspidata）カルスからのパクリタキセルの生産に適用した場合についてさらに説明する。通常、パクリタキセルの生産はバッチまたは連続によるカルス培養工程、カルス細胞を培養液から分ける分離工程、分離培養細胞の破砕工程、有機溶剤による抽出工程、廃細胞の分離工程、溶剤濃縮工程、精製工程、および分離工程で得られた培養液からパクリタキセルを抽出し濃縮する工程等からなり、かなり複雑なプロセスとなる（図１参照）。
本発明では、基本的に、培養、気泡分離、洗浄、および乾燥工程のみで良く、従来のパクリタキセル生産工程で使用される溶剤抽出、濃縮、および分離に係わる煩雑な工程操作が不要となりプロセスの大幅な簡略化が可能となる（図２，３参照）。またこの様にして得られたパクリタキセルは、通常、充分な化学純度を有するが、必要に応じさらに精製を行い医薬用途に使用可能な高純度なものとする事が好ましい。

本発明を、さらに詳細に実施例および比較例をもって説明する。当然ながら本発明は、これらの例のみに限定されるものではない。

実施例１
パクリタキセルの気泡による分離（無細胞系）
図４に示すように、外部ガラス容器（容量６５０ｍＬ）の中に、内部ガラス容器（容量１５０ｍＬ）を設置し、さらにこの内部ガラス容器の中に、気泡を発生させるためのガラス製ボールフィルターと細胞を保持するためのセルロース製多孔質バッグを設置した。
内部ガラス容器にパクリタキセルを０．４ｍｇ／Ｌの濃度で溶解させたＢ５培地（カサミノ酸３ｇ／Ｌ，α−ナフタレン酢酸２ｍｇ／Ｌを含む）１２０ｍＬを入れ、２５℃の温度条件下で除菌フィルターを通過させた空気を毎分０から５００ｍＬの範囲で６時間通気し内部ガラス容器から溢流する泡沫を採取することによってパクリタキセルを系外に分離し、ジクロロメタンで抽出することによりパクリタキセルを回収した。その際、外部容器の壁、ゴム栓、内部容器の外壁などをジクロロメタンで洗浄し回収パクリタキセルに加えた。また、内部ガラス容器中のＢ５培地中に残存するパクリタキセルもジクロロメタンを用いて抽出回収した。このようにして、通気量および通気時間とパクリタキセルの回収率との関係を求めたところ、Ｂ５培地中の残存パクリタキセル量は時間と共に減少し、２時間の通気で初期のパクリタキセル量の５０％以上が、６時間で７４％以上が気泡によって除去分離された（表１）。
なお、Ｂ５培地中のパクリタキセルは、サンプリングした培地にジクロロメタンを１対１の割合で添加し攪拌した後、氷冷下で静置し分離したジクロロメタン相を採取する方法を取った。この操作を３回繰り返し、得られた全量のジクロロメタンを遠心エバポレーターで濃縮した後、メタノール１２５μＬで溶解し、ＨＰＬＣで分析した。また、ＨＰＬＣの移動相はメタノール：水：アセトニトリル＝２０：５６：２４、固定相はシアノプロピル基を有するシリカゲルを用いた。

比較例１
通気しない場合（無細胞系）
培地に対する空気の吹き込みを行わなかった事以外は実施例１と同様に操作した。培地中に含まれていたパクリタキセル濃度に変化は見られず、パクリタキセルの分離に気泡を用いた方法が非常に有効である事が示された（表１）。

表１．培地中のパクリタキセル残存率（％）および６時間後の回収率（％）
通気 空気吹き込み量（ｍＬ／分)
時間 （０） （５０） （１００） （２００） （４００） （５００）
０時間 １００ １００ １００ １００ １００ １００
１時間 １００ ５０ ５０ ３５ ３３ ２５
２時間 １００ ４０ ４４ ２０ ３２ ２３
４時間 １００ ３２ ３１ ２３ ２６ １５
６時間 １００ ２６ ２４ ２０ １２ １０
回収率 ０ ７４ ７６ ８０ ８８ ９０

実施例２
気泡分離しながら培養した場合のパクリタキセル生産量
図５に示す装置を用い、内部ガラス容器（容量６５０ｍＬ）内に設置したセルロース製多孔質バッグにＢ５培地（１２０ｍＬ）とイチイ（Taxus cuspidata）の細胞１．２ｇを入れ、２５℃で通気量を毎分５０ｍｌとして１４日間培養した。通気することによって溢流した泡沫中のパクリタキセル濃度および培地（０．２５ｍＬ）を経時的にサンプリングしてパクリタキセル量を測定した（表２）。

表２．気泡分離しながら培養した場合のパクリタキセル生産量の経日変化
培養日数 ０ ３ ７ １０ １４
生産量（μｇ） ０ ３ ４ ５ ９

比較例3
気泡分離しないで培養した場合のパクリタキセル生産量
起泡分離操作に替えて振とう培養した場合以外は実施例２と同様にして培養しパクリタキセルの生産量を経日的に測定した。気泡分離しなかった場合のパクリタキセルの生産量は著しく低く気泡分離による生産物の系外への移動によって生産量を著増できる事が示された（表３）。

表３．気泡分離しないで培養した場合のパクリタキセル生産量の経日変化
培養日数 ０ ３ ７ １０ １４
生産量（μｇ） ０ ２．４ ２．３ ４ ４

本発明は、バイオ生産物の効果的な分離法およびバイオ生産プロセスの簡略化に広く適用出来る。

有機溶媒抽出分離法による従来のバイオ生産プロセスを示す。 起泡分離によるバイオ生産プロセス（培養、分離は同一槽）を示す。 起泡分離によるバイオ生産プロセス（培養、分離は別装置）を示す。 無細胞系に於ける起泡分離 細胞培養系に於ける起泡分離

Claims (6)

1. 水性媒体中で行う生体反応によって産生する疎水性化合物を分離する方法に於いて、気泡と水性媒体を接触させて水性媒体中に含まれる疎水性化合物を気泡界面に捕集した後、該気泡を水性媒体から分離する事を特徴とする疎水性化合物の分離方法。
2. 生体反応が、微生物、動物細胞、植物細胞、または酵素を利用したものである、請求項１に記載の疎水性化合物の分離方法。
3. 水性媒体中に気体を吹き込む事によって発生させた気泡を用いるものである、請求項１または２に記載の疎水性化合物の分離方法。
4. 気泡が水性媒体外で発生させたものであり、かつ気泡と水性媒体との接触を生体反応系外で行う請求項１または２に記載の疎水性化合物の分離方法。
5. 気泡として、ミリバブル、マイクロバブルまたはナノバブルを用いる請求項１から４の何れか一項に記載の疎水性化合物の分離方法。
6. 疎水性化合物がイチイ（Taxus cuspidata）の植物細胞培養によって産生されるパクリタキセルである、請求項１から５の何れか一項に記載の疎水性化合物の分離方法。

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