CN1148364C - 从天然原料提取和纯化紫杉醇的方法 - Google Patents

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Abstract

一种从天然紫杉烷原料提取和纯化紫杉醇的方法。该方法包括下列步骤：a)用有机溶剂从上述天然紫杉烷原料提取含紫杉醇的粗提物；b)将所述粗提物用碱或酸处理，通过沉淀得到生物质，分离所述生物质并将其干燥；c)通过除去其中含有的树脂和天然色素，脱去所分离的生物质的颜色，将所述生物质溶于丙酮后，往其中加入至少一种非极性溶剂直至获得富含紫杉醇的油相；d)用碱或酸处理上步回收的富含紫杉醇的油相中包含的生物质，通过沉淀获得另一种生物质，分离所述的另一种生物质并将其干燥；e)上步获得的分离的另一种生物质在挥发性溶剂中的溶液经色谱纯化至少一次，并使经色谱得到的纯化溶液进行至少一次的结晶。该方法包括有限的步骤，且经过滤和干燥后可得紫杉醇结晶混合物，由以下组成：约53%的纯度高于99%的结晶，约22%的纯度高于98%的结晶，和约23%的纯度高于92%的结晶。

Description

从天然原料提取和纯化紫杉醇的方法
发明领域
本发明涉及一种从天然原料提取和纯化紫杉醇的便捷方法。与现有技术中已有的方法相比，该方法特别经济，因为步骤少，纯化期间损失的量少。
现有技术
在美国，有关紫杉醇(也称为TaxolTM或PacitaxelineTM)的最早研究始于20世纪60年代，当时国立癌症研究所开展了选择具有抗癌症或抗肿瘤活性的植物提取物的项目。
自1960年到1981年，从35000种植物中提取和分离出110000种混合成分并对其进行了试验(Blume E.国家癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.)1991；83：1054-1056)。
红豆杉是所选择并进行试验的一类植物，Wani等首先从来源于美国西海岸(Oregon)的红豆杉树皮(短叶红豆杉(Taxus brevifolia)Nutt)中得到了提取物(Wani等，美国化学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)，1971；93：2325-2327)。这些树皮粗提物被证实对白血病细胞具有细胞毒性活性并对各种肿瘤具有抑制作用。
数年后，分离出该提取物的活性化合物。该活性化合物的通用名为紫杉醇，并经X射线晶体照相术和1H-NMR谱确定了其分子结构(Wani等，J.Am.Chem.Soc.1971；93：2325-2327)。
从那时开始，进行了针对紫杉醇对癌瘤的体外和体内作用的研究，得到的阳性结果表明该活性化合物是一种有前景的卵巢癌和乳腺癌治疗药物(Rowinski等，治疗药理学(Pharmacol.Ther.)1991；52：35-84)。食品和药品管理局(Food and Drug Administration)从1992年开始批准了紫杉醇用于治疗各种癌症的用途。
首先用于生产紫杉醇的红豆杉是短叶红豆杉(Taxus brevifolia)，但对发现于全球不同地区的种类也进行了试验。它们包括浆果红豆杉(Taxus baccata)、加拿大红豆杉(Taxus canadensis)、喜马拉雅红豆杉(Taxus wallichiana)、云南红豆杉(Taxus yunnanensis)、Taxusdensiformis、Taxus hicksii、Taxus wardii、东北红豆杉(Taxuscuspidata)、Taxus capitata、Taxus brownii(Miller等，有机化学杂志(J.Org.Chem.)1981；46：1469；Mclaughlin等，自然生殖杂志(J.Nat.Prod.)1981；44：321；Kingston等，J.Nat.Prod 1982；45：466；Senilh等，J.Nat.Prod.1984；47：131-137；Huang等，J.Nat.Prod.1986；49：665-669；Fett-Neto等，生物/技术(Bio/Technology)1992；10：1572-1575)。
所有这些种类都含有紫杉醇，但含量都非常有限-约为0.0004-0.008％(Kingston，Pharmacol.Ther.1991；52：1-34)。这种紫杉醇的低浓度使其提取和纯化成本非常高，因为需要时间并且通常要求采用重复色谱法。
各种红豆杉中紫杉醇的低浓度对环境产生巨大影响。要从短叶红豆杉树皮中提取1kg紫杉醇需要砍伐约3000棵生长的树木以得到10000kg树皮。所得量(1kg)的紫杉醇可用于治疗约500名患者，但癌症患者的数量高达数十万。重新种植树木将远不能满足人类所需的紫杉醇的需要，因为它们生长缓慢(Vidensek等，J.Nat.Prod.1990；53：1609-1610；keisey等，J.Nat.Prod.1992；55：912-917；Wheeier等，J.Nat.Prod.1992；55：432-440)。
已经提出了许多提取和纯化紫杉醇的方法。例如Wani等(Wani等，J.Am.Chem.Soc，1971；93：2325-2327)提出了从美国西海岸的红豆杉树皮中提取和纯化紫杉醇的方法，包括用乙醇处理树皮，然后数步色谱法纯化的步骤。
Miller等(1981)采用下列方法从喜马拉雅红豆杉中提取紫杉醇：
1)用植物提取并浓缩提取物；
2)通过分离水和己烷除去脂肪；
3)用二氯甲烷提取并浓缩；
4)在第一个硅胶柱上经色谱法的第一次纯化；
5)在第二个硅胶柱上经色谱色谱法的第二次纯化；
6)第一次逆流分布；
7)第二次逆流分布；
8)制备HPLC色谱。
Senilh等(1984)通过下列方法从浆果红豆杉的树皮中分离出紫杉醇(或TaxolTM A：0.0165％)、三尖杉宁碱(或TaxolTM B：0.0064％)和其它化合物：
1)用乙醇提取并浓缩；
2)分离水和二氯甲烷；
3)滤过色谱；
4)硅胶色谱；
5)氧化铝色谱；
6)中压二氧化硅柱色谱；
7)HPLC色谱。
其它类似方法，则需要在制备HPLC色谱后再进行两次或三次柱色谱处理。
Polysciences Inc.采用的另一个方法包括下列步骤：
1)用甲醇或乙醇处理干燥的树皮粉，将所得提取物浓缩以除去醇，
2)然后该浓缩物用二氯甲烷处理并将所得溶剂提取物浓缩得到粉末，
3)将该粉末溶于丙酮和轻石油(1∶1)的混合液中并过滤除去不溶性物质，
4)浓缩含有紫杉醇的有机相，将其溶于30％轻石油中并上Florisil柱上，
5)经过两次结晶纯化柱洗脱的紫杉醇级分，
6)将如此获得的紫杉醇结晶进行硅胶柱色谱，以分离紫杉醇与其它紫杉烷(taxanes)(相关类似物，三尖杉宁碱等)，
7)将上步获得的纯化紫杉醇结晶两次，和
8)使未分离的混合物和母液循环通过硅胶柱，以获得额外量的纯净紫杉醇。
当然，也还有其它从天然原料纯化紫杉醇的方法，例如下列文献中所述的：
Kingston等公开了从短叶红豆杉获得新紫杉烷的方法(J.Nat.Prod.1982；45：466-470)；和
Witherup等包括了从短叶红豆杉中分离紫杉醇及其相关化合物的方法(液相色谱杂志(J.Liq.Chrom.)1989；12：2117-2132)。
1994年授予Nair的美国专利5279949公开了一种使用观赏性红豆杉组织纯化紫杉醇的方法。在该专利方法包括：
1)用70％乙醇提取新鲜的针叶，
2)用木炭对提取物进行脱色并过滤，
3)浓缩过滤的提取物以除去大部分有机溶剂，
4)离心水性提取物以分离含紫杉醇的固体，
5)然后对固体进行第一次常压相二氧化硅色谱，
6)将所得的紫杉醇粗产物级分进行第二次低压二氧化硅色谱；和
7)以反向柱进行最终的纯化。
Pandey等的美国专利5654448公开了一种从短叶红豆杉树皮提取和纯化紫杉醇的方法。该方法包括：
1)用甲醇处理树皮三次，每次提取时间为5天，然后浓缩所得提取液；
2)分离甲醇浓缩物以获得二氯甲烷和水层，将二氯甲烷萃取液蒸发至干，该固体残余物含有约1.6-2.2％w/w的紫杉醇，
3)将该固体残余物溶于丙酮中并与同体积的己烷混合以除去极性杂质，将该混合物蒸发至约其1/3体积；
4)将丙酮/己烷残余物滴加到己烷(1.5L-3.0L残余物用10-15L己烷)，得到沉淀，将其过滤并在40℃下于高真空度(1mm-2mm)下干燥，得到约0.5-0.6kg的固体残余物；
5)将上步得到的固体残余物溶于0.5L丙酮-二氯甲烷中形成1∶9v/v混合物，然后用二氧化硅柱进行色谱；三尖杉宁碱和紫杉醇一同洗脱下来；将含紫杉醇和三尖杉宁碱的级分合并并旋转蒸发至干，该固体残余物是紫杉醇和三尖杉宁碱的混合物，含约36-40克紫杉醇(45-55％)；
6)将上步获得的混合物粗品(10g)进行化学改性以通过溴化分离紫杉醇和三尖杉宁碱；溴化反应后得到的固体残余物重13.2g；
7)将溴化的残余物溶于丙酮/二氯甲烷(1∶9v/v)并经二氧化硅柱色谱分离，合并含有紫杉醇的级分并蒸发至干；和
8)将上步获得的固体残余物溶于丙酮，用等体积的正己烷或者其它己烷使其结晶；用冷丙酮/己烷(1/1v/v)洗涤结晶，过滤并于40℃下真空干燥，如此获得的固体重4.84g，经HPLC色谱测定其含有＞97％w/w的紫杉醇。
Rao的美国专利5475120和5670673公开了一种分离紫杉醇的方法。该方法中：
1)将树皮、针叶、木质部、根部或它们的混合物用乙醇处理，减压下(＜35-40℃)浓缩所得提取物以除去大部分乙醇；
2)将该浓缩物分配到氯仿(或二氯甲烷、二氯乙烷或三氯乙烷)中，在减压下浓缩氯仿提取物形成稠浆，将该稠浆到入玻璃器皿中并在真空烤箱(＜40℃)中干燥，在使用树皮或木质部的情况下形成粉末，在使用针叶的情况下形成针状结晶(100kg木质部或树皮得到1.5-2.5kg提取物，100kg针叶获得2.4-4.8kg提取物)；
3)将氯仿固体提取物(2-2.5kg)溶于乙腈(5L)并加入水(5L)；然后用硅胶平衡该混合物(2-3L浆状物)；在搅拌该混合物的同时逐渐加入水(15L)；虹吸出澄清溶液，将浸渍了样品的硅胶浆转移到一不锈钢柱的顶部；将含紫杉醇和各种重要的紫杉醇类似物的级分放在通风橱中，使其在通风橱中缓慢蒸发溶剂；1-2天或形成结晶并使该过程持续8-10天；和
4)将所得的含低于5％三尖杉宁碱的结晶粗品用丙酮/轻石油混合物并使用木炭重结晶两次，由此获得41g纯净的紫杉醇，即产率为0.04％，该产物是用100kg树皮得到的；或者使该结晶粗品的氯仿通过二氧化硅或者Florisil短柱进行脱色。另一种除去三尖杉宁碱杂质的方法包括使用臭氧。用1-2％甲醇的氯仿混合溶液洗脱该柱，得到可通过浓缩或结晶回收的批量紫杉醇。产量与上面接近，为40g。HPLC色谱分析显示如此回收的紫杉醇含低于0.3％的三尖杉宁碱。
Liu的美国专利5969165公开了一种采用工业制备性低压色谱法从加拿大红豆杉中分离和纯化紫杉醇以及其它相关化合物的方法。
在该方法中，将加拿大红豆杉(200kg)的针叶和树枝用60℃的1000L甲醇提取5小时，然后过滤。该原料用55-60℃的700L甲醇再提取4小时并过滤。将滤液合并并与10kg活性炭(5％w/w)混合。过滤除去活性炭。然后将滤液浓缩为约100L。再加入300L水和二氯甲烷(1∶1)。收集有机层，水溶液用200L二氯甲烷萃取两次以上。将二氯甲烷溶液合并并蒸发形成浆状物，然后用20L丙酮稀释。
用丙酮溶液包被20kg Celite545，干燥后加载到三个工业制备性低压色谱柱(150times.15cm)上。每个柱填充15kg氧化铝吸附剂。柱在10-15psi低压下用包含己烷和丙酮的混合溶剂系统以约150ml/min的流速系统。
收集含紫杉烷的级分并将其合并，然后浓缩除去所有其它溶剂。将所得物质溶于甲醇并在室温下保持过夜，得到针状结晶。过滤结晶并用丙酮重结晶，得到白色结晶，经鉴定为13-乙酰基-9-二氢浆果赤霉素III。
将滤液浓缩至干。残余物溶于3L丙酮中。将该丙酮溶液与1.5kg聚苯乙烯-二乙烯基苯混合。蒸发除去溶剂，所得粉末加载到用聚苯乙烯-二乙烯基苯填充的工业制备性低压色谱柱的顶部，在低于30psi的操作压力下用45％丙酮的水溶液以150ml/min流速洗脱。
合并含有紫杉醇和三尖杉宁碱的级分并蒸发除去大部分丙酮，然后用去离子水稀释并用2.5L二氯甲烷提取三次。将有机层浓缩至干，残余物溶于1L甲醇中。
将大约30％(v/v)的水加到该甲醇溶液中并使该混合物在60℃温热数分钟，然后在室温保持过夜。滤出甲醇溶液中的结晶粗品并于70-75℃在真空烤箱中干燥。该固体包含约70％的紫杉醇和25％的三尖杉宁碱，200kg加拿大红豆杉的针叶和树枝的产率为31克。
将紫杉醇粗品溶于200ml乙腈并用250ml去离子水稀释并加载到色谱柱上。色谱柱装填聚合物树脂(Diaion，一种微孔聚甲基丙烯酸酯树脂)。该柱用35、40、45和50％的乙腈水溶液分步洗脱。
将所得的含紫杉醇或三尖杉宁碱的级分分别合并并保持于5℃下直至结晶。然后分别过滤紫杉醇和三尖杉宁碱结晶，并且二者都在65℃下用甲醇和水的混合液进行重结晶。
获得的紫杉醇为白色针状结晶，纯度＞99％，产率为18.5g(0.009％)。所得三尖杉宁碱的纯度＞98％，产率为6.5％(0.003％)。
本发明者审阅现有技术中公开的纯化紫杉醇的已知方法认为，要获得高纯度的紫杉醇，必须进行多步色谱分离和结晶纯化步骤。特别是，由于不同种类红豆杉中紫杉醇含量底下，导致很高的生产成本。再者，由于小规模色谱柱可纯化的生物质的量非常有限，并且纯化后得到的紫杉醇产率很低。
发明目的和概述
本发明的目的首先是提供一种方法，该方法使得：
-不同种类的红豆杉的树皮、针叶和/或树枝提取后更容易获得生物质(biomass)；
-提高了如此获得的和需经色谱纯化的生物质的量；
-减少了纯化步骤；
-提高了所得紫杉醇的量；以及最终
-使生产成本降低到更经济的水平。
本发明的另一个目的是提供一种高纯度的紫杉醇结晶混合物。
依据本发明，上述的第一个目的通过运用从含待提取紫杉醇的天然紫杉烷原料提取和纯化紫杉醇的方法实现，该方法包括下列步骤：
a)用有机溶剂从上述天然紫杉烷原料提取含紫杉醇的粗提物；
b)将所述粗提物在碱性或酸性介质中处理，以便通过沉淀得到生物质，分离所述生物质并将其干燥；
c)通过除去其中含有的树脂和天然色素，脱去如此分离的生物质的颜色(percolorizing)，将所述生物质溶于丙酮后，往其中加入至少一种非极性溶剂直至获得富含紫杉醇的油相；
d)当步骤(b)的处理已用碱性介质进行时，用酸性介质，或当步骤(b)的处理已用酸性介质进行时，用碱性介质处理上步回收的富含紫杉醇的油相中包含的生物质，以便通过沉淀获得另一种生物质，分离所述的另一种生物质并将其干燥；
e)上步获得的分离的另一种生物质在挥发性溶剂中的溶液经色谱纯化至少一次，并使经色谱得到的纯化溶液进行至少一次的结晶。
依据本发明，上述的第二个目的通过紫杉醇结晶混合物实现，该混合物通过上述方法获得，且经过滤和干燥该结晶其由以下组成：
-约53％的纯度高于99％的结晶，
-约22％的纯度高于98％的结晶，和
-约23％的纯度高于92％的结晶。
通过阅读下列非限制性说明，本发明，其优点和其减少实际操作的方式将得以更好的理解。
附图的简要说明
附图1a、1b和1c是说明本发明方法的流程图。
发明详述
在本发明范围和下列说明中，“脱色(percolorize)”是指通过加入与溶液混溶或不混溶的非极性溶剂而从所述溶液中除去树脂和色素。
如上所述，本发明的方法是用于从含有待提取的紫杉醇的天然原料中提取和纯化紫杉醇。
第1步-提取
方法的第1步包括用有机溶剂混合物从紫杉烷的天然原料(naturalsource)中提取含有紫杉醇及其类似物的粗提物(raw material)。
用作本发明方法原料的紫杉烷天然原料是红豆杉类植物。更具体地说，包括含有紫杉醇的任一松柏类植物的种。这类含紫杉醇的松柏类植物的种包括短叶红豆杉、欧洲红豆杉、加拿大红豆杉、喜马拉雅红豆杉、云南红豆杉(Taxus yunnanensis)、Taxus densiformis、Taxus hicksii、Taxus wardii、东北红豆杉、Taxus capitata或Taxus brownii。
本发明的方法具有可使用含紫杉醇的紫杉烷天然原料的任一部分的优点。优选用所选择的松柏类植物的树皮进行提取。或者，可使用所选择的松柏类植物的树枝和针叶同时进行提取。
优选将如此获得的提取物进行过滤以除去沉淀，并且在其中填充了热水(优选65-70℃)的双层壁的罐中进行滗析。在该罐中蒸馏溶剂直至获得非常粘稠的液体。然后回收提取物并将其溶于甲醇。
在该提取步骤中，使用的有机溶剂优选选自醇类、卤代烃类以及卤代醇和烃的混合物。这些溶剂的实例可例举甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷和甲醇与二氯甲烷或者三氯甲烷的混合物。
在使用卤代烃和醇的混合物的情况下，醇与卤代烃的体积比优选为9∶1～1∶9。该混合物的体积比更优选为约1∶1。
第2步-第一次沉淀
方法的第2步包括在碱性或酸性介质中处理粗提物，获得生物质沉淀。
在碱性介质中进行沉淀时，该介质优选由一种碱性盐，如乙酸钠、乙酸钾或者三(羟甲基)氨基甲烷(也称为TRIS)的溶液组成。
根据优选的实施方案，碱性介质由氢氧化钠溶液组成并且采用的氢氧化钠浓度为10毫摩尔-80毫摩尔/升溶液，更优选为20毫摩尔-50毫摩尔/升溶液。
碱性介质的pH通常为8.5-11，优选为9-10。
当在酸性介质中进行沉淀时，酸性介质由无机酸溶液或有机酸溶液组成。所述酸选自盐酸、乙酸和柠檬酸。酸溶液的浓度优选为10毫摩尔-50毫摩尔/升溶液，更优选为20毫摩尔-30毫摩尔/升溶液。
酸性介质的pH优选为2-4。
在各种情况下下，加到粗提物中以产生生物质沉淀的碱性或酸性溶液的体积为方法第1步所提取的粗提物体积的1-20倍。
当使用碱性溶液时，加到粗提物中的碱性溶液的体积等于粗提物体积的1-15倍。当使用酸性溶液时，加到粗提物中的酸性溶液的体积等于方法第1步获得的粗提物体积的1-10倍。
在这些条件下，形成的沉淀非常细而轻，因此过滤非常困难。事实上，通过低速离心(5000rpm)不能全部回收沉淀。需15000或者甚至20000rpm的转速才能有效从溶液中分离沉淀。
为解决该问题，有助于从所获得的生物质中分离沉淀，可在分离和干燥前加入氯化钠将生物质盐化，氯化钠的加入量为25-200克/升用于沉淀的酸性或碱性溶液。氯化钠的加入量优选为50-100，更优选为50-75克/升用于沉淀的酸性或碱性溶液。
用氯化钠盐化溶液可产生絮凝作用。而后，所得沉淀变重，更加凝聚且易于过滤或低速离心。
优选在剧烈搅拌下，将氯化钠快速加到溶液中。
根据本发明的另一个优选方案，该步沉淀出的生物质经过滤或离心与溶液分离，然后在室温空气中干燥或者真空干燥，优选通过通风或者冷冻干燥。
第3步-脱色(percolorization)
本发明方法的第3步包括脱去上步分离出的生物质的颜色。
具体地说，在该第3步中，通过往前步沉淀获得的生物质中加入第1步提取的粗提物的大约2倍体积的丙酮(在沉淀前)，使其重新形成溶液。
更优选的是，通过首先加入丙酮，然后加入水使生物质重新形成溶液。对于加入的每100体积的丙酮而言，水的加入量优选为2-10体积，更优选为5-7体积。
待溶解后，往所得的溶液中加入至少一种非极性溶剂以形成富含紫杉醇的油相。
用于该脱色步骤的非极性溶剂优选选自与丙酮混溶的烃，如己烷或庚烷。当使用己烷时，使用的己烷体积通常为丙酮溶液体积的3-4倍。
然后将如此得到的混合物转移到一个滗析瓶中，回收沉在瓶底部的含有紫杉醇和其它紫杉烷的油相。然后蒸发该油相并加入甲醇。
该第3步除去了松柏类植物原料中的大部分树脂和天然色素。
第4步-第二次沉淀
本发明方法的第4步包括用碱或酸处理包含在上步回收的富含紫杉醇的油相中生物质，通过沉淀获得另一种生物质，然后分离该另一种生物质并将其干燥。
更具体地说，在该第4步中，首先将上步获得的富含紫杉醇的油相蒸发至干，然后用甲醇使其形成溶液。
然后，当称为第2步的第一次沉淀步骤在酸性介质中进行时，在碱性介质中沉淀所得的甲醇溶液；或者当第一次沉淀步骤在酸性介质中进行时，在碱性介质中沉淀所得的甲醇溶液。该次沉淀的目的是获得沉淀形式的含紫杉醇的生物质。
根据本发明的一个优选实施方案，通过沉淀如此获得的生物质在分离和干燥前也通过往其中加入氯化钠进行盐化，加入的氯化钠浓度为30-200克/升用于沉淀的酸性或碱性溶液。加入的氯化钠浓度优选为50-100克/升用于沉淀的酸性或碱性溶液。
然后过滤包含在生物质中的沉淀并在室温空气中或者真空下干燥，或者冻干。
该步获得的沉淀非常细而轻，导致过滤非常困难。事实上，通过低速离心(例如5000rpm)只能部分回收沉淀。只有15000或者甚至20000rpm的转速才能使沉淀与溶液完全分离。因此适合再次往溶液中加入氯化钠以生产絮凝作用，使得沉淀变重，更加凝聚且易于过滤或低速离心。用于该步处理的氯化钠的浓度为25-200克/升溶液，更优选为50-75克/升溶液。在剧烈搅拌下，将氯化钠快速加到溶液中。
第5步-色谱法纯化
本发明方法的第5步和最后一步包括将上步得到的分离的另一种生物质在挥发性溶剂中的溶液用色谱法纯化至少一次；和将用色谱法获得的纯化溶液结晶至少一次。
为此，将第4步干燥后得到的沉淀溶于挥发性溶剂中，然后进行至少一步色谱纯化并使经色谱获得的纯化溶液结晶至少一次。但优选将第4步干燥后得到的沉淀进行数次色谱纯化和数次结晶，连续纯化和结晶的次数优选为三次。
这三次连续纯化和结晶将作为亚步骤A-F进行描述。
A-第一次色谱纯化
在第一次色谱纯化步骤中，将第4步获得的生物质溶于挥发性溶剂中。将所得溶液与硅胶混合并通风干燥，然后将包上了生物质的硅胶加载到装有同型硅胶的色谱柱上。在该柱中，生物质用含30-40％丙酮和60-70％己烷的洗脱混合液洗脱纯化。洗脱混合液优选含有约40％的丙酮和约60％的己烷。
用于溶解的挥发性溶剂优选是丙酮。然后过滤丙酮溶液，除去不溶性颗粒并与硅胶混合。然后将所得混合物在通风或真空下干燥。
将浸渍了紫杉醇及其类似物的硅胶加载到柱上，柱的高度优选为142cm，内径为76cm并且包含2.2-2.3kg硅胶。柱中的硅胶用丙酮和己烷(40-60％，体积/体积)组成的洗脱混合液洗脱和平衡。在0-30psi的压力下，以约100ml/分的流速用相同的溶剂混合液进行洗脱。
B-第二次色谱纯化
在第二次色谱纯化步骤中，优选将上步回收的富含紫杉醇的级分合并，然后蒸发干至获得残余物。
然后通过在挥发性溶剂中溶解制备该残余物的溶液。将如此获得的溶液在与上步相同的条件下进行再次纯化，得到富含紫杉醇的新级分。
根据一个优选的实施方案，将残余物溶于丙酮中，然后与硅胶混合并干燥。
将浸渍了紫杉醇及其类似物的硅胶加载到包含2.2-2.3kg硅胶的柱上(长142cm×内径7.6cm)。柱中的硅胶用丙酮和己烷(40-60％，体积/体积)组成的洗脱混合液洗脱和平衡。在0-30psi的压力下，以约100ml/分的流速用相同的溶剂混合液进行洗脱。
再次合并含紫杉醇(通常含40-60％的紫杉醇)的级分。
C-第一次结晶
在该步中，将前面经色谱纯化步骤获得的含紫杉醇的级分蒸发至干，然后加入丙酮再成溶液。调整丙酮的量，以使根据HPLC分析的对应于紫杉醇峰的溶液的吸光度为1.0-1.5 O.D.。然后用非极性溶剂使该混合物中所含的紫杉醇结晶，优选地在丙酮溶液中加入3-4倍体积的己烷使紫杉醇结晶。
结晶快速地形成。使该混合物在室温或者2-8℃下放置过夜，使其充分结晶。
D-第二次结晶
在该步中，过滤分离前步重结晶获得的结晶，并使其重新形成丙酮溶液，同时调整丙酮的体积，以使根据HPLC分析的对应于紫杉醇峰的溶液的吸光度为1.0-1.5 O.D.。
然后用非极性溶剂使该混合物中所含的紫杉醇结晶，优选地将3-4倍积的己烷加到该丙酮溶液中，使该溶液中的紫杉醇重结晶。
根据HPLC分析，该步获得的结晶紫杉醇的纯度高于80％。
E-第三次色谱纯化
在该步中，过滤前步获得的结晶，然后将其溶于挥发性溶剂中得到溶液，优选地用二氯甲烷溶解结晶。
将如此获得的溶液与硅胶混合后通风干燥。
将包有紫杉醇的硅胶加载到装有同种硅胶的色谱柱上。然后用有机溶剂基的洗脱混合液对紫杉醇进行第三次纯化。洗脱混合液优选含有95-98％的二氯甲烷和2-5％的异丙醇。
该步中，优选将结晶溶于二氯甲烷，与硅胶混合后干燥。将浸渍了紫杉醇的硅胶加载到装有1.5-1.6kg硅胶的色谱柱(长142cm×内径7.6cm)上。该硅胶柱用二氯甲烷和异丙醇(98-2％/体积)组成的溶剂洗脱和平衡。在0-30psi的压力下，以约50ml/分的流速用相同的溶剂混合液进行洗脱。
F-第三次结晶
该步中，根据其纯度合并前步经色谱回收的富含紫杉醇的级分，优选根据纯度+98～+99％以及90-98％。然后蒸发至干，将该残余物溶于醇、酮或醇-酮混合溶剂中获得另一种混合物，优选地溶于甲醇中形成溶液。
调整加入的甲醇体积，以使根据HPLC分析的对应于紫杉醇峰的吸光度为1.0-1.5 O.D.。
然后往甲醇溶液中加入每体积的溶液2-10倍体积的水，使紫杉醇进行第三次重结晶。优选每体积的甲醇溶液使用4-7倍体积的水。
在上面描述的最后的纯化和重结晶步骤中，使用的水优选是通过去离子化/或蒸馏得到的纯化水。
根据优选的一个实施方案，将冷却到2-4℃的7-10倍体积的纯水加到冷却在冰中的1体积的甲醇溶液中。而后，立即出现结晶。在2-4℃下整夜继续结晶过程。
将水加到甲醇溶液中的操作可在室温下进行。如此形成结晶的速度稍慢，但其在2-4℃过夜充分结晶。为获得细而松散的结晶，过滤结晶并通风或真空干燥。然后将结晶再悬浮于纯水中并在约-60℃冻干66-72小时。
所得紫杉烷级分用自动加样器(Waters 717 plus)、光电二极管阵列检测器(Waters 996)、多溶剂递送系统(Waters600E)和C18Nova-Pak柱(60埃，4微米(3.9×150mm))经HPLC色谱分析(Waters系统)。
注射5微升样品分离级分。当使用溶剂系统：乙腈-水-甲醇(自20∶50∶30至35∶35∶30)时，流动相的流速约为1ml/分。
在228nm检测化合物的峰，样品分析时间约为36分钟。
在色谱纯化步骤中用于溶解残余物的挥发性溶剂优选选自酮类(cetones)、C1-C3轻质醇类、乙酸乙酯、二氯甲烷和这些溶剂的混合物。
在步骤F结束时，紫杉醇在水中结晶、过滤并干燥后，获得紫杉醇结晶混合物。该紫杉醇结晶的混合物包含：
-53％纯度高于99％的结晶；
-22％纯度高于98％的结晶；和
-23％纯度高于92％的结晶。
下列实施例仅用于说明，而不应认为是对本发明范围的限制。
                          实施例1
提取
用去离子水洗涤50kg干燥的加拿大红豆杉的针叶和树枝后，在通风下干燥。将该原料粉碎并转移到布袋中。将该布袋放入盛有150L混合溶剂(二氯甲烷-甲醇：1∶1体积/体积)的不锈钢罐中。在室温下提取16小时。将提取液泵入过滤器中过滤到双层壁的罐中。借助在罐的双层壁中循环的70℃热水蒸馏溶剂直至获得非常粘稠的液体。
第一次沉淀
回收提取浓缩物并用2L甲醇稀释。往提取物中加入20mM NaOH溶液通过沉淀分离生物质。在提取物加到NaOH溶液中时形成非常细的沉淀。提取物与碱性溶液的体积比约为1∶15。
细微沉淀非常难以过滤。只有非常高速(15000-20000rpm)的离心才能回收生物质。因此，为使沉淀更加凝聚，以50g/L溶液的比例往该溶液中加入氯化钠。然后过滤沉淀或在20℃下以4200rpm的速度离心30分钟(J6MC Beckman离心机，4.2 JS转子)。应该清楚，可使用连续流动的离心机处理大量沉淀。
所得沉淀经空气或真空干燥或者冻干(冻干机-FTS系统)。沉淀的重量约为500-550g。为除去其中包含的不溶性颗粒，将该沉淀溶解于2L丙酮中并在0-2℃下以4200rpm离心30分钟。
脱色
然后，将1L丙酮溶液加到6L烧瓶中，通过在每次连续加入1L己烷后剧烈人工振摇使该溶液与4L己烷混合。使该混合物放置约10分钟，回收瓶底部的油相。
在实践中，可使用大的Becher或者足够大的罐一次性地处理丙酮溶液，可虹吸出己烷并将剩余的液体转移到一单独的烧瓶中以充分回收油相。
该步期间，弃去深色的己烷相。
第二次沉淀
然后将油相蒸发至干。残余物溶于2L甲醇中。通过将该甲醇溶液加到20mM HCl溶液中得到沉淀第二次分离生物质。加入提取液时形成非常细微的沉淀。提取液与酸性溶液的比例约为1∶5。该细微沉淀仍非常难以过滤。只有非常高速(15000-20000rpm)的离心才能回收生物质。因此，为使沉淀更加凝聚，再次往该溶液中加入氯化钠(50g/L溶液)。然后过滤沉淀或者在20℃下以4200rpm的速度离心30分钟(J6MCBeckman离心机，4.2 JS转子)。也可使用连续流动的离心机处理大量沉淀。
通过低压硅胶色谱的第一次纯化
将回收的沉淀经空气或真空干燥或者冻干。沉淀的重量约为240-260g。将该沉淀溶于0.5L丙酮并在0-2℃下于4200rpm离心30分钟，以除去其中含有的不溶性颗粒。然后将丙酮溶液与200-250g硅胶(230-400目，药用级，Silicycle，Quebec，Canada)混合。将浸渍了提取物的硅胶通风或者真空干燥。将干燥的硅胶加载到装有2.2kg硅胶(230-400目)的柱(142×7.6cm内径)上。硅胶用丙酮和己烷的混合液(40∶60％，体积/体积)洗脱和平衡。用Dynamax溶剂递送系统，用相同的溶剂进行洗脱。在10-30psi压力下，洗脱液流速约为100ml/分。混合溶剂的体积约为30L，并以1L溶剂每份分批收集各级分。HPLC分析表明所得的第17-25号的9份级分含有紫杉醇。
通过HPLC测得这些级分中的紫杉醇含量分别为11；24；32；40；38；33；29；14和9％。
值得指出的是含紫杉醇的级分在不同次的纯化之间可能偏离到其它级分。
通过低压硅胶色谱的第二次纯化
合并含紫杉醇的级分并蒸发至干。将残余物重新溶于100ml丙酮并将其与100g硅胶混合。将包被紫杉醇的硅胶在通风下空气或者真空干燥。将干燥的硅胶加载到装有2.2kg硅胶(230-400目)柱(142×7.6cm内径)上。硅胶用丙酮和己烷的混合液(40∶60％，体积/体积)洗脱和平衡。使用溶剂递送系统，用相同的溶剂进行洗脱。在10-30psi压力下，洗脱液流速约为100ml/分。混合溶剂的体积约为30L，以1L溶剂/级分分批收集级分。HPLC分析表明第22-26号的5份级分含有紫杉醇。通过HPLC测得这些级分中的紫杉醇含量分别为40；58；66；50和49％。这些含紫杉醇的级分可在不同次的纯化之间偏离到其它级分。
第一次结晶
合并含紫杉醇的级分并蒸发至干。将残余物再溶于800ml丙酮中。根据HPLC分析，调整丙酮的量以使对应于紫杉醇峰的溶液的吸光度为1.0-1.5 O.D.。往该丙酮溶液中加入3倍体积的己烷(2.4L)。随后形成结晶。使该混合物在2-8℃下保持过夜以使其充分结晶。
第二次结晶
过滤所得结晶并将其再溶于400ml丙酮中。往该丙酮溶液中加入3倍体积(2.4L)的己烷。随后形成结晶。使该混合物在2-8℃保持过夜以使其充分结晶。使结晶在空气或真空下干燥。
所得结晶的干重为约10g±0.2g。HPLC分析表明紫杉醇含量约为80％或高于80％。
通过低压硅胶色谱的第三次纯化
将结晶再次溶于75ml二氯甲烷中并将其溶于75g硅胶混合。使包含了提取物的硅胶经通风或者真空干燥。将干燥的硅胶加载到装有1.5kg硅胶(230-400目)的柱(142×7.6cm内径)上。硅胶用二氯甲烷和异丙醇的混合液(98∶2％，体积/体积)洗脱和平衡。使用Dynamax溶剂递送系统，用相同的溶剂进行洗脱。在10-30psi压力下，洗脱液流速约为50ml/分。混合溶剂的体积约为30L，并以1L溶剂每份收集各级分。HPLC分析表明所得的第11-22号的12份级分含有紫杉醇。通过HPLC测得这些级分中的紫杉醇含量分别为80；97；99.50；99.70；99.70；99.30；98.60；97.30；94；92；89和85％。同样，含紫杉醇的级分在不同次的纯化之间可偏离到其它级分。
第三次结晶
据其纯度合并含紫杉醇的级分并蒸发至干。将12-16号级分溶于100ml甲醇(HPLC级)，17-18号级分溶于45ml甲醇(HPLC级)，19-22号级分溶于75ml甲醇(HPLC级)。
1)将预先冷至2-8℃的700ml水(HPLC级)加到在冰中冷却的该甲醇溶液中(12-16号)。立即出现白色结晶。
2)将预先冷至2-8℃的300ml水(HPLC级)加到在冰中冷却的该甲醇溶液中(17-18号)。立即出现白色结晶。
3)将预先冷至2-8℃的500ml水(HPLC级)加到在冰中冷却的该甲醇溶液中(19-22号)。立即出现白色结晶。
分别过滤和用空气或真空干燥该结晶。结晶的干重和经HPLC分析的纯度如下：
12-16号级分：3.40g-纯度：99.30％
17-18号级分：1.40g-纯度：98.85％
19-22号级分：1.60g-纯度：92.70％
将纯度低于98％的结晶放在一边，并一起再次以与上述第三次纯化步骤相同的条件通过色谱进行纯化。再次纯化获得的纯度高于99％的结晶占结晶总量的约75％。
                        实施例2
实施例2中公开的方法类似于实施例1公开的方法，不同的是如下进行第一次和第二次沉淀步骤。
第一次沉淀
回收提取浓缩物并用2L甲醇稀释。将提取物加到20mM HCl溶液中通过沉淀分离生物质。提取物加入时形成非常细微的沉淀。提取物与酸性溶液的比例为约1∶10。该细微沉淀非常难过滤。只有高速(15000-20000rpm)离心才能回收生物质。因此，为使沉淀更加凝聚，以50g/L溶液的比率往该溶液中加入氯化钠。然后在20℃下以4200rpm的速度离心30分钟(J6MC Beckman离心机，4.2 JS转子)。
将回收的沉淀在空气或真空下干燥或者冻干。沉淀的重量为约500-520g。将该沉淀溶于2L丙酮中，过滤并在0-2℃下以4200rpm速度离心，除去其中包含的不溶性颗粒。
第二次沉淀
然后将油相蒸发至干。残余物溶于2L甲醇中。将该甲醇溶液加到20mM NaOH溶液中通过沉淀第二次分离生物质。提取物加入时形成非常细微的沉淀。提取物与碱性溶液的比例为约1∶5。该细微沉淀非常难过滤。只有高速(15000-20000rpm)离心才能回收生物质。因此，为使沉淀更加凝聚，以50g/L溶液的比率往该溶液中加入氯化钠。然后在20℃下以4200rpm的速度离心30分钟(J6MC Beckman离心机，4.2 JS转子)。
实施例2获得的紫杉醇的产率和纯度与实施例1相同。
上述实施例表明与现有技术已知的各种方法相比，本发明方法明显降低了紫杉醇的生产成本。这种成本降低的原因是由于可治疗用纯度的紫杉醇收率的提高以及显著地节省了不可回收产品(溶剂、硅胶…)和生产时间。除了上述优点外，本发明提供了一种非常简单、快速和容易的方法，该方法可以工业规模使用并且不受所处理生物质中紫杉醇的低含量的限制。

Claims (42)

1、从含有待提取的紫杉醇的天然紫杉烷原料提取和纯化紫杉醇的方法，所述方法包括下列步骤：
a)用有机溶剂从所述天然紫杉烷原料提取含紫杉醇的粗提物；
b)将所述粗提物在碱性或酸性介质中处理，以便通过沉淀得到生物质，分离所述生物质并将其干燥；
c)通过除去其中含有的树脂和天然色素，脱去如此分离的生物质的颜色，将所述生物质溶于丙酮后，往其中加入至少一种非极性溶剂直至获得富含紫杉醇的油相；
d)当步骤(b)的处理已用碱性介质进行时，用酸性介质，或当步骤(b)的处理已用酸性介质进行时，用碱性介质处理上步回收的富含紫杉醇的油相中包含的生物质，以便通过沉淀获得另一种生物质，分离所述的另一种生物质并将其干燥；
e)上步获得的分离的另一种生物质在挥发性溶剂中的溶液经色谱纯化至少一次，并使经色谱得到的纯化的溶液进行至少一次的结晶。
2、权利要求1的方法，特征在于含紫杉醇的天然紫杉烷原料包括选自下列的松柏类植物：短叶红豆杉、欧洲红豆杉、加拿大红豆杉、喜马拉雅红豆杉、云南红豆杉、Taxus densiformis、Taxus hicksii、Taxus wardii、东北红豆杉、Taxus capitata、Taxus brownii。
3、权利要求2的方法，特征在于在步骤(a)中，处理松柏类植物的所有各部分。
4、权利要求2的方法，特征在于在步骤(a)中，处理松柏类植物的树皮。
5、权利要求2的方法，特征在于在步骤(a)中，同时处理松柏类植物的树枝和针叶。
6、权利要求1或2的方法，特征在于在步骤(a)中，有机溶剂选自醇类、卤代烃以及醇类和卤代烃的混合物。
7、权利要求6的方法，特征在于在步骤(a)中，溶剂是甲醇和二氯甲烷的混合物或者甲醇和三氯甲烷的混合物。
8、权利要求6的方法，特征在于醇和卤代烃以9∶1～1∶9的体积比存在。
9、权利要求8的方法，特征在于醇与卤代烃的体积比为1∶1。
10、权利要求6的方法，特征在于在步骤(b)中，在选自下列的碱性盐溶液组成的碱性介质中沉淀生物质：乙酸钠、乙酸钾、氢氧化钠和三(羟甲基)氨基甲烷。
11、权利要求10的方法，特征在于：
-碱性盐是氢氧化钠；
-氢氧化钠的使用浓度为10mM-80mM/升溶液；和
-溶液的pH为8.5-11。
12、权利要求10和11任一项的方法，特征在于溶液的pH为9-10。
13、权利要求6的方法，特征在于在步骤(b)中，在由无机酸溶液或有机酸溶液构成的酸性介质中沉淀生物质。
14、权利要求13的方法，特征在于所述酸选自盐酸、乙酸和柠檬酸。
15、权利要求13的方法，特征在于所述溶液的酸浓度为10mM-50nM/升溶液。
16、权利要求15的方法，特征在于所述酸浓度为20mM-30mM/升溶液。
17、权利要求13的方法，特征在于溶液的pH为2-4。
18、权利要求6的方法，特征在于在步骤(b)中，使生物质沉淀的所述碱或酸溶液与步骤(a)中提取的粗提物的所说溶液的体积比为1-20。
19、权利要求18的方法，特征在于在沉淀的生物质分离和干燥前，通过往其中加入氯化钠使其盐化，氯化钠以25-200g/升用于沉淀的溶液的浓度加入。
20、权利要求19的方法，特征在于氯化钠以50-100g/升用于沉淀的溶液的浓度加入。
21、权利要求18的方法，特征在于沉淀的生物质经过滤或离心分离，然后经通风干燥或冻干。
22、权利要求6的方法，特征在于用于步骤(c)的所用的至少-种非极性溶剂选自己烷或庚烷。
23、权利要求6的方法，特征在于在步骤(c)中，通过加入2倍于步骤(a)提取的粗提物体积的丙酮使步骤(b)获得的干燥的生物质重新形成溶液。
24、权利要求6的方法，特征在于通过加入丙酮，然后加入水，使步骤(b)获得的干燥的生物质重新形成溶液。
25、权利要求24的方法，特征在于每100体积的加入的丙酮，加入2-10体积的水。
26、权利要求6的方法，特征在于在步骤(d)中：
-将步骤(c)获得的富含紫杉醇的油相蒸发至干并使其重新形成甲醇溶液；和
-然后，当步骤(b)所述第一次沉淀步骤在酸性介质中进行时，在碱性介质中沉淀所述甲醇溶液；或者当步骤(b)所述第一次沉淀步骤在碱性介质中进行时，在酸性介质中沉淀所述甲醇溶液；
-由此获得含紫杉醇的生物质，所述紫杉醇是沉淀形式的。
27、权利要求26的方法，特征在于在步骤(d)获得的生物质分离和干燥前，通过往其中加入氯化钠使其盐化，氯化钠以30-200g/升用于沉淀的溶液的浓度加入。
28、权利要求27的方法，特征在于氯化钠以50-100g/升用于沉淀的溶液的浓度加入。
29、权利要求6的方法，特征在于步骤(e)包括下列亚步骤：
e1)第一次色谱纯化，包括将步骤(d)分离的沉淀溶于挥发性溶剂中，制备所得溶液与硅胶的混合物，在包含硅胶的色谱柱上处理所述混合物并回收富含紫杉醇的级分；
e2)第二次色谱纯化，包括将上步回收的富含紫杉醇的级分蒸发干至获得残余物，通过在挥发性溶剂中溶解所述残余物制备混合物，将所述混合物在与上亚步骤相同的条件下进行再次纯化，得到其它富含紫杉醇的级分；
e3)第一次结晶，包括将上亚步骤获得的其它富含紫杉醇的级分蒸发干至获得残余物，制备所述残余物在丙酮中的混合物并用非极性溶剂使该混合物中所含的紫杉醇结晶；
e4)第二次结晶，包括在丙酮中溶解上亚步骤获得的紫杉醇结晶并在与上亚步骤相同的条件下使紫杉醇重结晶；
e5)第三次色谱纯化，包括将上亚步骤重结晶得到的结晶溶于挥发性溶剂中得到溶液，制备所述溶液与硅胶的混合物并经包含硅胶的色谱柱用洗脱溶剂处理该混合物，获得进一步的富含紫杉醇的级分；和
e6)第三次结晶，包括将上亚步骤获得的进一步的富含紫杉醇的级分蒸发干至获得残余物，将该残余物溶于醇、酮或醇-酮混合溶剂中获得另一种混合物，用水使所述另一种混合物中的紫杉醇结晶。
30、权利要求29的方法，特征在于在步骤(e1)中：
-使步骤(d)获得的生物质在挥发性溶剂中重新形成溶液；
-将如此获得的溶液与硅胶混合并在通风下干燥；
-将从该生物质中回收的硅胶加载到包含硅胶的色谱柱上；和
-用含30-40％丙酮和60-70％己烷的洗脱混合液纯化生物质。
31、权利要求30的方法，特征在于洗脱混合液含40％的丙酮和60％的己烷。
32、权利要求29的方法，特征在于在步骤(e2)中：
-重新组合通过步骤(e1)色谱获得的富含紫杉醇的级分，蒸发至干后重新在挥发性溶剂中形成溶液；
-将所得溶液与硅胶混合并在通风下干燥；
-将从该生物质中回收的硅胶加载到含硅胶的色谱柱上；和
-通过包含30-40％丙酮和60-70％己烷的有机溶剂混合物再次纯化紫杉醇。
33、权利要求32的方法，特征在于所述有机溶剂混合物包含40％的丙酮和60％的己烷。
34、权利要求29的方法，特征在于在步骤(e3)中：
-重新组合通过步骤(e2)经色谱获得的含紫杉醇的级分并将其蒸发至干，并使其重新形成丙酮溶液，同时调整丙酮的量，以使根据HPLC分析的对应于紫杉醇的峰的溶液的吸光度为1.0-1.5 O.D.；和
-然后将3-4倍体积的己烷加到该丙酮溶液中，使紫杉醇结晶。
35、权利要求29的方法，特征在于在步骤(e4)中：
-过滤分离步骤(e3)获得的结晶并使其重新形成丙酮溶液，调整丙酮的体积，以使根据HPLC分析的对应于紫杉醇的峰的溶液的吸光度为1.0-1.5 O.D.；和
-然后将3-4倍体积的己烷加到该丙酮溶液中，使紫杉醇结晶。
36、权利要求29的方法，特征在于在步骤(e5)中：
-过滤步骤(e4)获得的结晶并使其重新形成二氯甲烷溶液；
-将所得溶液与硅胶混合并在通风下干燥；
-将包有紫杉醇的硅胶加载到含硅胶的色谱柱上；和
-然后用有机溶剂基的洗脱混合液对紫杉醇进行第三次再纯化。
37、权利要求36的方法，特征在于洗脱混合液含有95-98％的二氯甲烷和2-5％的异丙醇。
38、权利要求29的方法，特征在于在步骤(e6)中：
-根据其纯度重新组合通过步骤(e5)经色谱获得的富含紫杉醇的级分并将其蒸发至干，并使其重新形成甲醇溶液，调整加入甲醇的体积，以使根据HPLC分析的对应于紫杉醇峰的溶液的吸光度为1.0-1.5 O.D.；和
-然后将2-10倍体积的水加到该甲醇溶液中，使紫杉醇进行第三次重结晶。
39、权利要求38的方法，特征在于将4-7倍体积的水加到所述甲醇溶液中，使紫杉醇进行第三次重结晶。
40、权利要求29的方法，特征在于步骤(e1)、(e2)和(e3)中使用的挥发性溶剂选自丙酮、C1-C3轻质醇类、乙酸乙酯、二氯甲烷和这些溶剂的混合物。
41、权利要求29的方法，特征在于，在步骤(e6)中，紫杉醇在水中结晶后，过滤获得紫杉醇混合物，然后干燥。
42、权利要求29的方法，特征在于在整个方法中使用的水是通过去离子和/或蒸馏纯化的。
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