CN1276927C - 维生素d衍生物结晶及其制备方法 - Google Patents

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CN1276927C CNB2004100926177A CN200410092617A CN1276927C CN 1276927 C CN1276927 C CN 1276927C CN B2004100926177 A CNB2004100926177 A CN B2004100926177A CN 200410092617 A CN200410092617 A CN 200410092617A CN 1276927 C CN1276927 C CN 1276927C
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Abstract

本发明提供了下列式(I)所示化合物的结晶；经反相色谱法纯化维生素D衍生物的粗产物或初步纯化的产物，然后将纯化的衍生物于有机溶剂中析晶获得的维生素D衍生物结晶；维生素D衍生物合成过程中形成的作为副产物的新的化合物；以及维生素D衍生物或其前体的纯化方法。本发明所述方法使得以批量并且稳定地提供高纯度维生素D衍生物，特别是ED-71成为可能。

Description

维生素D衍生物结晶及其制备方法
本申请是申请日为1997年6月16日的中国专利申请97196017.8的分案申请。
技术领域
本发明涉及新的维生素D衍生物结晶，更具体地讲，本发明涉及通过反相色谱法纯化维生素D衍生物，然后将纯化的衍生物于有机溶剂中结晶获得的新的维生素D衍生物结晶。本发明还涉及维生素D衍生物的纯化方法，该方法包括结晶步骤。
背景技术
已知各种维生素D衍生物具有生理活性。例如JP 6-23185B/1994公开了可用作钙代谢障碍引起的疾病的治疗剂或者用作抗肿瘤剂的下列通式表示的1α-羟基维生素D3衍生物：
Figure C20041009261700041
其中R1表示氨基或式OR’，其中R’表示未被取代或被羟基、卤原子、氰基或酰氨基取代的具有1-7个碳原子的低级烷基，而R2表示氢原子或羟基。
作为包括在上述通式中的一种化合物，1α，25-二羟基-2β-(3-羟基丙氧基)维生素D3(也称作ED-71)是具有骨形成作用并因此可用作骨质疏松症治疗剂的维生素D衍生物的一种活性形式。
一旦此类维生素D衍生物成为治疗剂，就应当是高纯度的并且能够以批量并稳定地提供。因此，就需要建立一种维生素D衍生物的生产方法。
特别是，现在仅能以非晶形形式获得ED-71并且还没有以结晶形式分离ED-71的报导。
本发明详述
本发明的一个目的是建立一种制备高纯度维生素D衍生物，特别是ED-71的方法，该方法使得以批量并稳定地提供所述产物成为可能。
本发明的另一个目的是提供一种维生素D衍生物结晶，其可以通过纯化维生素D衍生物粗产物或初步纯化的产物获得。
本发明的另一个目的是提供一种维生素D衍生物的纯化方法，该方法包括结晶步骤。
本发明的另一个目的是提供一种纯化ED-71前体化合物的方法，该方法包括结晶步骤，并且本发明还提供了由所述方法获得的纯的前体化合物。
本发明还有一个目的是提供在维生素D衍生物合成和纯化过程中二次生成的新化合物。
我们已对由前维生素D衍生物(前体)合成和纯化ED-71过程中出现的下列问题进行了深入研究：(1)前体中的杂质对HPLC制备纯化ED-71的影响；(2)ED-71及其前维生素D衍生物(前体)对热、光和氧的稳定性；(3)对即使在十分小的剂量下仍具有较高生理活性的ED-71的处理；以及(4)通过结晶纯化ED-71的可能性。研究结果表明，我们已经发现通过下述方法可以以克水平获得ED-71结晶，即将所述前体于甲醇中重结晶，于低温下将重结晶的前体进行光反应，然后进行热异构化反应，经反相HPLC纯化所述异构化产物，浓缩洗脱液，然后残余物于乙酸乙酯中析晶并完成本发明。另外，我们已经测定了所述前体中原来含有的或者在所述光反应中形成的副产物的结构并且发现它们中的某些化合物是新的。
本发明一方面提供了下列式(I)所示化合物的结晶：
Figure C20041009261700061
本发明另一方面提供了经反相色谱法纯化维生素D衍生物的粗产物或初步纯化的产物，然后将纯化的衍生物于有机溶剂中析晶获得的维生素D衍生物结晶。
本发明另一方面提供了一种维生素D衍生物的纯化方法，该方法包括将所述维生素D衍生物进行反相色谱纯化。
本发明另一方面提供了一种维生素D衍生物的纯化方法，该方法包括将所述维生素D衍生物于有机溶剂中析晶。
本发明另一方面提供了一种维生素D衍生物的纯化方法，该方法包括经反相色谱法纯化维生素D衍生物的粗产物或初步纯化的产物，然后将纯化的衍生物于有机溶剂中析晶。
本发明另一方面提供了一种下列式(II)所示化合物的纯化方法：
Figure C20041009261700062
该方法包括将式(II)所示化合物的粗产物或初步纯化的产物于醇中重结晶。
本发明另一方面提供了下列式(II)所示化合物的纯化产物：
Figure C20041009261700063
该产物通过将式(II)所示化合物的粗产物或初步纯化的产物于醇中重结晶获得。
本发明另一方面提供了一种下列式(I)所示维生素D衍生物的纯化产物的制备方法：
该方法包括将下列式(II)所示化合物的粗产物或初步纯化的产物于醇中重结晶，
将重结晶的式(II)化合物进行紫外光照射，然后进行热异构化反应，得到式(I)所示维生素D衍生物，经反相色谱法纯化式(I)维生素D衍生物的粗产物或初步纯化的产物，并将所述式(I)维生素D衍生物于有机溶剂中析晶。
本发明另一方面提供了下列式(III)所示化合物：
和下列式(IV)所示化合物：
Figure C20041009261700082
这些化合物包含在紫外光照射以及随后进行的所述ED-71前体热异构化反应获得的反应混合物中。
附图简要说明
图1是说明ED-71结晶结构的分子结构投影图。
图2是说明ED-71结晶结构的分子结构立体图形。
图3是说明其中关注氢键的ED-71结晶结构的分子结构投影图(1)。
图4是说明其中关注氢键的ED-71结晶结构的分子结构投影图(2)。
本发明优选实施方案
本文所用术语“维生素D衍生物”是指具有下列式(V)部分结构的化合物：
所述维生素D衍生物优选地是下列式(VIA)、(VIB)和(VIC)所示化合物：
其中
R1表示(1)氨基；
(2)-OR5，其中R5是低级烷基、低级链烯基或低级链炔基，其中每一个基团可以被羟基、卤原子、氰基、氨基、酰氨基或低级烷氧基取代；或者
(3)低级烷基、低级链烯基或低级链炔基，其中每一个基团可以被羟基、卤原子、氰基、氨基、酰氨基或低级烷氧基取代；
R2、R3和R4分别表示具有1-10个碳原子的烷基、具有2-10个碳原子的链烯基或者具有2-10个碳原子的链炔基，其中每一个基团可以被一个或多个羟基取代；和
A表示硫或氧原子。
在上述取代基定义中，术语“低级”是指所述术语限定的所述基团的碳原子数，例如1-7个碳原子的烷基，分别为2-7个碳原子的链烯基和链炔基，以及1-7个碳原子的烷氧基。
所述维生素D衍生物更优选地是1α-羟基维生素D3、1α，25-二羟基维生素D3、24，25-二羟基维生素D3或者下列式(VIIA)或(VIIB)所示化合物：
其中n表示1-7的整数，或者下列式(VIIIA)或(VIIIB)所示化合物
Figure C20041009261700102
其中A表示硫或氧原子。
特别优选的维生素D衍生物是下列式(VIIA)所示化合物：
其中n表示1-7的整数。
所述最优选的维生素D衍生物是下列式(IX)所示化合物：
其也被称作ED-71。
本文所用术语“结晶”以其最宽含义使用，因此不仅限于结晶体形式、晶系等。
如上所述，作为本发明最优选维生素D衍生物的ED-71结晶并不受任何物理特性的限制。但它们特别优选地是具有下列特性：
(1)表观：目测或荧光显微镜检测为白色结晶粉末；
(2)溶解度：在1mg/ml浓度下乙醇中完全溶解；
(3)鉴定方法：IR或NMR法；
(4)熔点：用DSC测定，熔点为130℃或者更高；
(5)吸收系数：在40μg/ml乙醇浓度下在265nm下测定，ε＝16000或者更高；
(6)HPLC纯度：以在下列条件下记录的相对于HPLC总峰面积的ED-71峰面积为基准，纯度为97％或者会更高，所述条件为DIACHROMA ODS N-205μm 4.6×250mm，45％乙腈-水，流速为1ml/min，220nm，1mg/ml 10μl，4-90分钟。
本发明另一方面提供了可经反相色谱法纯化维生素D衍生物的粗产物或初步纯化的产物，然后将纯化的衍生物于有机溶剂中析晶获得的维生素D衍生物结晶，以及一种维生素D衍生物的纯化方法，该方法包括将维生素D衍生物进行反相色谱纯化和/或将纯化的维生素D衍生物于有机溶剂中析晶。
本文所用术语“粗产物或初步纯化的产物”是指由维生素D衍生物合成反应获得的、在合成反应后未经纯化或者立即经常规方法纯化并且通常为非晶形的维生素D衍生物产物。
本文所用术语“反相色谱法”是指其中固定相极性低于流动相的色谱体系。作为所述反相色谱法，优选的是高效液相色谱法(HPLC)。
为了有效地分离所述物质，有必要对洗脱剂、柱填充物和柱填充量进行适当选择。
所述洗脱剂的实例包括，但不仅限于，乙腈/水和乙腈/甲醇/水。用作上述洗脱剂的所述溶剂的混合比可根据下列因素而改变，例如所纯化的物质以及所用柱填充物，因此，对于具体应用中所述溶剂的最佳比可由本领域普通技术人员确定。乙腈/甲醇/水的比通常在20-60/0-40/0-80(重量份)范围内。
考虑到所述柱填充物与所纯化的物质以及所用柱子的相容性，可对柱填充物的粒径和孔径大小作出选择。
所述柱的填充量也可根据柱子的内径等而改变。但是例如，当于内径为50mm时，填充量可以是约25μg-10g，优选约25μg-3g。
对进行如上所述色谱纯化所得的流份应当进行处理，分离出所述流份中含有的溶解物，然后结晶。所述分离方法包括蒸发法、冷冻干燥法、萃取法和过滤法。根据所述物质的特性，技术人员可以由所述的这些分离方法中选择出一种或多种与所纯化的物质相适宜的方法。例如，由于蒸发法具有重现性并且ED-71不分解，因此蒸发法对于ED-71的纯化在操作上是有利的。
可用于维生素D衍生物析晶的有机溶剂优选是非质子传递有机溶剂。所述非质子传递有机溶剂的实例包括酯例如乙酸乙酯、酮例如丙酮、醚例如乙醚和二异丙基醚、乙腈以及它们的混合物，优选乙酸乙酯、丙酮、乙腈及其混合物。
结晶条件可以根据下列因素而改变，例如所纯化的物质以及所用溶剂，因此，对于某一具体应用的适宜条件可以由本领域普通技术人员确定。但通常，所述结晶可以在不高于30℃并且优选不高于-10℃温度下，用比粗维生素D衍生物多1-100倍并且优选5-10倍的溶剂进行。
本发明另一方面提供了一种下列式(II)所示化合物的纯化方法：
Figure C20041009261700131
该方法包括将所述化合物的粗产物或初步纯化的产物于醇中重结晶，以及用所述方法纯化式(II)化合物。
用于此重结晶中的所述醇为甲醇。
对于如上所述于醇中重结晶纯化的式(II)所示化合物的物理特性并没有任何意义的限定。但是，其特别优选地是具有下列特性：
(1)表观：目测或荧光显微镜检测为白色至黄色结晶粉末；
(2)溶解度：在2mg/ml浓度下乙醇中完全溶解(水溶液-白色至黄色)；
(3)鉴定方法：IR和NMR法；
(4)水含量：用100mg样品经费歇尔法测定，水含量为3.0％或者更低；
(5)吸收系数：在100μg/ml乙醇浓度下于282nm下测定，ε＝10000或者更高；
(6)HPLC纯度：以在下列条件下相对于记录的HPLC总峰面积以及HPLC中前体和unP4峰之间没有可观测到的峰时的式(II)所示化合物峰面积为基准，纯度为85％或者更高，所述条件为DIACHROMAODS N-205μm 4.6×250mm，55％乙腈-水，流速为1ml/min，220nm，1mg/ml 10μl，4-70分钟；和
(7)含量：在下列条件下用内标进行HPLC，含量为85％或者更高，所述条件为YMC填充物ODS A-3035μm 4.6×250mm，55％乙腈-水，流速为1ml/min，220nm。
下列实施例用于进一步阐明本发明，但对本发明保护范围不起限定作用。
                    实施例
实施例1：2β-(3’-羟基丙氧基)-5，7-二烯胆甾-1α，3β-三醇(前体型)的合成和纯化
Figure C20041009261700141
              环氧化物(1)                                   前体型(2)
将环氧化物(1)(1.00g，2.41mmol)、叔丁醇钾(0.75g，6.68mmol)和1，3-丙二醇(20ml)的混合物于室温下搅拌10分钟，然后，将反应混合物加热至内温95℃并于此温度下搅拌5小时。搅拌下，将反应混合物倾入到饱和氨水溶液(40ml)中。于室温(25-35℃)下搅拌10分钟后，在过滤器上收集形成的结晶并用蒸馏水(20ml)洗涤三次。将含水粗结晶产物(6.3g)在室温(27-22℃)下于乙腈(20ml)中搅拌1小时。在过滤器上收集结晶并用乙腈(5ml)洗涤两次，然后干燥，得到所述前体化合物(2)(0.96g，产率为81％)。
在通入氩气进行预处理之前，将如此获得的前体化合物(2)(29.0g)加热溶于甲醇(290ml)，然后将所得溶液趁热经Kiriyama滤纸(4号)过滤。冷却至室温后，向溶液中加入晶种以诱导结晶。进一步冷却至低于-10℃后，于过滤器上收集所生成的结晶并用29ml冷甲醇洗涤两次，然后，将所述结晶于室温真空下干燥，得到22.9g纯化的前体(回收率为79.1％，净回收率为92.1％)。所述纯化的前体的物理数据如下所示：
NMR(CD3OD)和IR(KBr)：表明是所述标题化合物；
TLC(CH2Cl2∶EtOH＝9∶1)：展开仅呈一个点(Rf 0.5)；
HPLC纯度(220nm)：98.7％；
含量：97.1％(内标法)；和
DSC：出峰时间(min)95.6℃和163.2℃，峰最大值120.2℃。
实施例2：(1R，2R)-1，25-二羟基-2-(3’-羟基丙氧基)-胆钙化甾醇；2β-(3’-羟基丙氧基)-(1α，3β，5Z，7E)-9.10-开环胆甾-5，7，10(19)-三烯-1，3，25-三醇(ED-71)的合成和纯化
在1L容器中，将实施例1所得纯化的前体(2)(6.02g)溶于THF(1L)并将溶液于氩气流中冷却条件(内温低于-13℃)下，经Vycor过滤器用具有高压汞蒸汽的400W灯UV光照射150分钟。令其升至室温后，将反应溶液由所述容器倾入2L茄形烧瓶中，所述容器用新制的THF(100ml)洗涤，将合并的溶液回流下加热180分钟。将反应混合物浓缩后，所得残余物溶于甲醇(80ml)，以形成供分离的样品。将经过计算并表示为所述前体的含有1.5g溶解物的20ml样品用泵加入到制备色谱柱上，所述色谱柱内径为50mm，长300mm并用由MitsubishiKakouki Co.市售获得的粒径为5μm的DIACHROMA ODS N-20装填。45％乙腈水溶液以60ml/min的流速通过所述色谱柱，洗脱液在220和305nm下用UV-光检测。开始进行色谱分离后约130-170分钟内，收集到约2.4L含ED-71的流份。此连续过程再重复三次，总共得到合并的ED-71流份约9L。然后，将合并的流份用10L旋转蒸发仪浓缩，将残余物溶于乙醇，将溶液再次蒸发至干。所得残余物再用乙酸乙酯(20ml)处理，溶液于室温下进行搅拌以沉淀出结晶，将悬浮液进一步冷却至低于-10℃并在此温度下搅拌15分钟。滤出结晶产物，用冷乙酸乙酯(6ml)洗涤三次并于室温真空下干燥过夜，得到ED-71(2.17g，产率为36.1％)。
HPLC纯度：99.8％(220nm)，99.9％(265nm)
UV(EtOH)：λmax 265.4nm(ε17100)
DSC：135.3℃(出峰(min))，122mJ/mg
残余溶剂         (GC方法)：1.24％(EtOAc)，0.24％(EtOH)
IR(cm-1)：3533，3417，3336，2943，2918，2862，1649，1470，1444，1416，1381，1377，1342，1232，1113，1078，1072，1045，999，974，957，955，924，910，895，868，833，796，764，663，634，594，472
实施例3：相关化合物的物理数据
分离在所述光和热异构化反应中形成的某些类似物并进行结构测定，然后进行表征鉴定。并且对实施例1和2所得ED-71及其前体进行更具体的表征鉴定。应注意的是，下列物理数据是经重结晶和类似方法进一步纯化所得样品的数据。
熔点未校正。IR谱用溴化钾压片法用JEOL JIR-6000测定。1H-NMR和13C-NMR谱用JEOL JNM-270EX测定。TMS用作1H-NMR内标，而CHCl3峰用作13C-NMR的标准峰。UV在室温下于乙醇中用HITACHI U-3210测定。
实施例1所得ED-71前体的物理数据：
1H-NMR(ppm)：0.63(3H，s)，0.96(3H，d，J20-21＝6.3Hz)，1.07(3H，s)，1.22(6H，s)，3.6-4.0(7H，m)，5.36-5.40(1H，m)，5.70-5.73(1H，m)
13C-NMR(ppm)：141.1，136.6，120.8，115.1，82.2，71.0，70.9，68.3.66.7.59.8，55.7，54.4，44.1，42.9，41.3，39.0，38.3，36.3，36.0，34.6，32.0，28.8，28.7，27.9，22.9，20.7，20.5，18.6，15.8，11.7
UV；λmax(ε)：294.2nm(6550)，282.2nm(11300)，271.9nm(10500)，204.7nm(2420)
IR(cm-1)：3385，2941，2872，1471，1468，1381，1379，1327，1138，1082，1080，1053
ED-71的物理数据：
1H-NMR(ppm)：6.37(1H，d；11.4Hz)，6.05(1H，d；11.4Hz)，5.50(1H，t；2.1Hz)，5.08(1H，t；2.1Hz)，4.32(1H，d；8.9Hz)，4.26(1H，m)，3.88-3.96(1H，m)，3.85(2H，t；5.7Hz)，3.69-3.77(1H，m)，3.27(1H，dd；9.0Hz，2.8Hz)，2.78-2.83(1H，m)，2.55(1H，dd；10.6Hz，4.0Hz)，2.42(1H，bd；13.6Hz)，1.8-2.1(5H，m)，1.22(6H，s)，1.2-1.7(11H，m)，0.94(3H，d；6.3Hz)，0.9-1.1(1H，m)，0.55(3H，s)
13C-NMR(ppm)：144.2，143.0，132.2，124.9，117.2，111.8，85.4，71.6，71.1，68.3，66.6，61.1，56.6，56.4，45.9，44.4，40.5，36.4，36.1，31.9，29.3，29.2，29.1，27.7，23.7，22.4，20.8，18.8，11.9
UV；λmax：265.4nm(ε17900)
m.p.：134.8-135.8℃(1℃/min)，
DSC：137℃(出峰(min)，115mJ/mg)，
TG/DTA：138℃(出峰(min)，熔融干重损失约1％，试验样品1.96mg)，
IR(cm-1)：3533，3417，3336，2943，2918，2862，1649，1470，1444，1416，1381，1377，1342，1232，1113，1078，1072，1045，999，974，957，955，924，910，895，868，833，796，764，663，634，594，472
下式所示ED-71的照射形成体：
Figure C20041009261700181
HPLC纯度：97.5％(220nm)
1H-NMR(ppm)：5.75(1H，d，J＝5.3Hz)，5.42-5.44(1H，m)，4.19(1H，q，J＝2.9Hz)，3.8-4.0(4H，m)，3.6-3.7(1H，m)，3.25(1H，dd，J＝2.6Hz，9.6Hz)，1.21(6H，s)，0.90(3H，d，J＝5.6Hz)，0.82(3H，s)，0.58(3H，s)
13C-NMR(ppm)：141.9，136.2，123.3，115.5，82.8，77.9，71.1，67.4，64.9，61.1，57.2，49.5，46.7，44.4，43.8，41.4，37.5，36.2，35.9，32.0，29.4，29.2，28.8，22.6，21.4，20.9，18.5，18.3，8.5
UV；λmax：273.5nm(ε9010)
IR(cm-1)：3437，3383，3309，3041，2960，2935，2872，2787，1657，1641，1470，1441，1375，1257，1205，1203，1167，1128，1097，1074，1039，1011，980，935，908，885，820，781，779，723，671，613
下式所示ED-71的快速形成体：
Figure C20041009261700191
HPLC纯度：97.6％(220nm)
1H-NMR(ppm)：6.65(1H，d，J＝16.1Hz)，6.10(1H，d，J＝16.1Hz)，5.73(1H，d，J＝2.8Hz)，4.21-4.25(2H，m)，3.70-3.90(4H，m)，3.45(1H，dd，J＝2.4Hz，6.0Hz)，1.91(3H，s)，1.22(6H，s)，0.98(3H，d，J＝6.5Hz)，0.69(3H，s)
13C-NMR(ppm)：138.1，130.9，129.5，127.8，126.0，124.5，83.1，72.4，71.1，68.5，65.3，61.1，54.0，50.0，44.4，42.8，36.4，36.0，35.9，31.9，31.4，29.4，29.2，28.7，25.1，24.3，20.8，18.7，15.1，11.2
UV；λmax：281.4nm(ε26100)
IR(cm-1)：3375，2945，2875，1664，1632，1612，1468，1429，1377，1215，1157，1095，1068，957，908，879，764，710，646
下式所示ED-71的前体：
Figure C20041009261700192
HPLC纯度：97.2％(220nm)
1H-NMR(ppm)：5.91，5.78(1H×2，d，J＝12Hz)，5.52(1H，d，J＝3.3Hz)，4.0-4.2(2H，m)，3.7-4.0(4H，m)，3.43(1H，dd)，1.76(3H，s)，1.22(6H，s)，0.96(3H，d，J＝6.6Hz)，0.70(3H，s)
UV；λmax：206nm(ε10300)
IR(cm-1)：3377，2949，2947，2872，1643，1470，1435，1406，1379，1377，1263，1215，1140，1119，1088，1063，1047，1032，1030，962，937，935，756，735，542
实施例4：ED-71的X-射线晶体结构分析
用选自所述样品粉末的结晶粉末进行ED-71X-射线衍射试验，部分样品粉末也可用于实施例3中。结果发现，所述结晶是正交晶系并含有P212121空间群，晶格常数为a＝10.352(2)，b＝34.058(2)和c＝8.231(1)，并且Z＝4。由此试验，得到2520反射数据。
结构分析如下所述进行。测定相中使用SHELXS86直接法，然后通过付里叶映象(Fourier mapping)测定每个非氢原子的位置。对于与碳键合的氢原子，它们中每个的位置可用所述碳原子的位置通过计算测定。对于与氧键合的氢原子，它们中每个的位置可以在测定了其他每个原子的位置后通过D映象测定。
在改进了所述非氢原子和与氧键合的氢原子位置的精确度以及最小二乘法对所述非氢原子各向异性温度因子以后，所述分析结果的可靠性因子共计3.9％。然而，由所述结果不能直接测定所述结晶的绝对结构，但通过进一步计算，ED-71的13、14、17和20位构象结果与胆甾醇的相应构象相同。
图1-4分别表明了在所述分析结果的基础上测定的ED-71的结构及其中的氢键。
参考实施例1：ED-71结晶化合物的稳定性
在10℃、25℃和40℃下，对非晶形和结晶ED-71化合物的稳定性进行试验。用HPLC定量试验以及吸收度和纯度测定，以对所述稳定性作出评价。所述纯度以HPLC中峰面积百分比表示(％P.A.R.)。所述试验用下述方法进行：
(1)稳定性试验
在带有螺丝帽的透明的10ml试管中分别精确称取所述非晶形和结晶样品约2mg.
所述试管用真空干燥器和手套箱用氩气清洗。此清洗过程不适用于下表中记作“1M(空气)”的试管。
将所述多组试管固定于恒温浴器中并于黑暗中静置，所述恒温浴器分别控制在上述温度下。1周(1W)或两周(2W)和1个月(1M)后，由所述恒温浴器中取出试管并进行下列试验和测定：
(2)HPLC定量试验
将5ml无水乙醇精确地加入到所述试管中，以形成样品溶液。将1ml所述样品溶液和1ml内标溶液精确地加入到另一试管中并将所得混合物用二氯甲烷稀释，至总体积为20ml。此稀释溶液记作溶液1。通过将2-氨基嘧啶溶于甲醇达到浓度为0.6mg/ml，制得所述内标溶液。
下一步，将1ml另一种用于定量试验的标准液(通过将ED-71结晶溶于无水乙醇达到浓度为0.4mg/ml制得)和1ml所述内标溶液精确地加入到另一试管中并将所得混合物用二氯甲烷稀释，至总体积为20ml。此稀释溶液记作溶液2.
分别用20μl溶液1和2进行HPLC。对于每种溶液，由所述HPLC数据测定ED-71峰与内标物峰的面积比。由溶液1面积比与溶液2面积比的比值测得所述样品中ED-71的含量。
将所述ED-71含量被上述处理之前相同样品中的ED-71含量除，测得耐受性(survivability)(％)。
所用HPLC的条件为：
色谱柱；YMC A-004SIL(4.6×300mm)
流动相；二氯甲烷/甲醇混合物(95/5)
流速；1ml/min
检测；UV 265nm。
(3)吸收度测定
将上述“HPLC定量试验”中制备的1ml样品溶液用无水乙醇稀释，达到总体积为10ml，然后将此稀释溶液在265nm下用紫外分光光度计进行吸收度检测。将所述吸收度转换成E1％值，其由朗伯比尔(Lambert-Beer)定律得到并可按下列等式转换：
              E1％＝A/cb
其中A是吸收度，c是浓度(g/100ml)，而b是经过试验溶液的光路长度(cm)，通常为1。
(4)纯度测定
(4-1)正相HPLC
将上述“HPLC定量试验”中制备的1ml样品溶液进行真空干燥，以除去所述溶剂(无水乙醇)。将残余物溶于1ml二氯甲烷，用25μl此溶液进行HPLC试验。
所用HPLC的条件为：
色谱柱；YMC A-004SIL(4.6×300mm)
流动相；二氯甲烷/甲醇混合物(96/4)
流速；1.8ml/min
检测；UV 265nm。
(4-2)反相HPLC
用上述“HPLC定量试验”中制备的25μl样品溶液进行HPLC。
所用HPLC的条件为：
色谱柱；Inertsil ODS-2(5×250mm)
流动相；乙腈/水混合物(55/45)
流速；1ml/min
检测；UV 265nm和220nm。
所述HPLC定量试验和纯度测定的数值是两轮的平均值。所得结果如下列表1-5所示。
表1：HPLC定量试验结果(耐受性％)
         10℃            25℃            40℃
  非晶形   晶形   非晶形   晶形   非晶形   晶形
  01W2W1M1M(空气)   10098.594.897.4   10096.897.095.0   10099.594.7   10099.498.8   10094.488.8   10099.5102.9
注：除1M(空气清洗)以外，所有样品用氩气清洗。
                                    表2：E1％
           10℃            25℃            40℃
  非晶形   晶形   非晶形   晶形   非晶形   晶形
  01W2W1M1M(空气)   327.5324.9320.5316.3   350.2343.8342.7341.7   327.5323.0316.9   350.2349.5341.6   327.5313.2304.0   350.2349.8348.7
注：除1M(空气清洗)以外，所有样品用氩气清洗。
表3：用正相HPCL测定纯度(265nm下P.A.R.％)
           10℃            25℃            40℃
  非晶形   晶形   非晶形   晶形   非晶形   晶形
  0ED-71前体其他峰 96.061.672.27 99.150.210.63 96.061.672.27 99.150.210.63 96.061.672.27 99.150.210.63
  1WED-71前体其他峰 95.971.882.14 99.560.140.30 94.472.533.00 99.550.140.31
  2WED-71前体其他峰 95.462.272.28 99.060.660.27 94.742.253.01 98.950.670.38 92.122.994.89 98.920.670.41
  1MED-71前体其他峰 94.582.333.09 98.910.650.44
  (空气)ED-71前体其他峰 95.262.312.42 98.880.660.46
注：除1M(空气清洗)以外，所有样品用氩气清洗。
表4：用反相HPLC测定纯度(265nm下P.A.R.％)
           10℃              25℃              40℃
  非晶形   晶形   非晶形   晶形   非晶形   晶形
  0ED-71前体其他峰 95.381.163.47 99.040.360.60 95.381.163.47 99.040.360.60 95.381.163.47 99.040.360.60
  1WED-71前体其他峰 94.781.273.95 99.350.280.38 92.471.985.55 99.400.290.31
  2WED-71前体其他峰 94.481.753.77 98.840.830.32 94.201.724.08 98.780.850.37 90.682.536.78 98.750.850.40
  1MED-71前体其他峰 93.051.885.07 98.770.860.37
  1M(空气)ED-71前体其他峰 94.111.824.07 98.720.860.42
注：除1M(空气清洗)以外，所有样品用氩气清洗。
                                            表5：220nm(％)
           10℃            25℃            40℃
  非晶形   晶形   非晶形   晶形   非晶形   晶形
  0ED-71前体其他峰 93.951.354.70 97.440.522.04 93.951.354.70 97.440.522.04 93.951.354.70 97.440.522.04
  1WED-71前体其他峰 93.371.505.13 98.170.441.40 90.002.297.71 98.180.471.35
  2WED-71前体其他峰 92.852.025.13 97.911.011.09 92.391.935.68 97.561.011.43 87.402.889.72 97.651.021.33
  1MED-71前体其他峰 92.852.025.13 97.441.051.51
  1M(空气)ED-71前体其他峰 92.072.045.88 97.091.091.82
注：除1M(空气清洗)以外，所有样品用氩气清洗。
由上表可以看出，在25℃和40℃下，所述结晶体比非晶体的稳定性至多高至2星期。
工业应用
本发明所述维生素D衍生物结晶是具有改善的纯度和稳定性以及稳定的产量的所述维生素D衍生物，并因此可用于制备含有所述维生素D衍生物的药物。而且，本发明所述维生素D衍生物的纯化方法使得以批量(克水平)并且稳定地提供高纯度维生素D衍生物成为可能。另外，分别作为ED-71和ED-71前体的快速形成体和照射形成体是新的化合物并可用于维生素D衍生物合成中所进行的试验或分析中。

Claims (7)

1.一种下列式(II)所示化合物的纯化方法：
Figure C2004100926170002C1
该方法包括将式(II)所示化合物的粗产物或初步纯化的产物于醇中重结晶，所得纯化产物经目测或荧光显微检测为白色至黄色结晶粉末；在2mg/ml浓度下在乙醇中完全溶解；经费歇尔法测定，水含量为3.0％或者更低；在100μg/ml乙醇浓度下于282nm下测定，吸收系数ε＝10000或者更高；HPLC测定纯度为85％或更高，内标法HPLC测定含量为85％或更高。
2.权利要求1所述方法，其中所述醇是甲醇。
3.下列式(II)所示化合物的纯化产物：
Figure C2004100926170002C2
该产物通过将式(II)所示化合物的粗产物或初步纯化的产物于醇中重结晶获得的，该纯化产物经目测或荧光显微检测为白色至黄色结晶粉末；在2mg/ml浓度下在乙醇中完全溶解；经费歇尔法测定，水含量为3.0％或者更低；在100μg/ml乙醇浓度下于282nm下测定，吸收系数ε＝10000或者更高；HPLC测定纯度为85％或更高，内标法HPLC测定含量为85％或更高。
4.权利要求3所述的纯化产物，其中所述醇是甲醇。
5.下列式(III)所示化合物：
6.下列式(IV)所示化合物：
Figure C2004100926170003C2
7.下列式所示化合物：
Figure C2004100926170003C3
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