CN1205197C - 使用超临界流体由原料制备紫杉醇的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

描述了分离具有高纯度的紫杉醇及其衍生物的方法。该方法包括超临界流体和助溶剂萃取步骤、液-液分离步骤和柱色谱步骤。还描述了使该方法的步骤联机进行的分离紫杉醇及其衍生物的设备。

Description

使用超临界流体由原料制备紫杉醇的方法和设备
                     发明领域
本发明涉及从含有紫杉醇及其衍生物的原料中萃取并纯化它们的方法和设备。具体地说，这些方法和设备可用于从红豆杉树的针叶和其它部分中分离紫杉醇及其衍生物。
                     发明背景
已在植物、微生物和海洋生物体的有机溶剂萃取物中分离并鉴定了许多在治疗疾病中呈现治疗活性的化合物。已证实具有特别好的生理活性的一些化合物已用作化疗或抗HIV药。然而，这些化合物的治疗实用性的研究受到待筛选的天然源太多且常规萃取技术的效率低的阻碍。
这些有用化合物的实例包括得自长春花的植物生物碱及其半合成物长春花碱和长春新碱，以及紫杉醇(NSC 125973)，即一种得自短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的二萜生物碱植物产品。
紫杉醇
紫杉醇是一类抑制真核生物有丝分裂的药物。它促进微管蛋白聚合并稳定胞内微管的结构以产生抗癌效果(参见，Schiff，P.B.等，Nature277，665-667(1979))。
在二十世纪六十年代，由美国国家癌协会(NCI)组织的植物筛选计划使得发现了紫杉醇。在短叶红豆杉树(Taxus brevifolia)树皮的粗提取物中首先发现了细胞毒素活性之后，在1966年分离出了该活性化合物。在1967年将其命名为紫杉醇，并且其分子结构于1971由Wani等表征(Wani，M.C.等，J.Am.Chem.Soc.，93：2325，1971)。Horwitzi等(1979)阐明了其活性机理(Horwitz，F.B.等，Nature，1979，277，665和Eric K.Rowinsky等，J.National Can.Inst.，82，11247(1990))。根据NCI的报道，对常规抗癌药都没有反应的卵巢癌、乳房癌或肺癌患者对紫杉醇的反应率分别是30％、50％和20％(David，G.等，J.Nat.Prod.，53，1(1990))。
紫杉醇作为抗癌药批准销售始于1992年，此时美国食品和药品管理局(FDA)和HPB(加拿大)许可使用紫杉醇治疗卵巢癌。在1994年，FDA批准可以使用紫杉醇治疗乳房癌和卡波济氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)。接着，在1997年FDA批准可以使用紫杉醇治疗非小细胞肺癌(NSCLC)并于1997年将紫杉醇扩展用于早期乳房癌。此外，研究报告显示紫杉醇对其它类型的癌症具有优异的效果(Spencer，C.M.和Faulds，D.，Drug.48，794-847(1994))。
紫杉醇的常规制备
常规萃取方法是以4个主要步骤进行的。首先，将来自萃取操作的己烷∶丙酮混合物以70/30的己烷∶丙酮混合物比例，在硅酸镁载体(Florisil)柱上以色谱分离含紫杉醇的馏分。然后将所述紫杉醇馏分浓缩至干。该步骤可以重复多至9次。其次，将紫杉醇浓缩物在甲醇∶水混合物中结晶，然后在丙酮∶己烷混合物中重结晶得到纯度为85-95％的紫杉醇。第三，将所述紫杉醇在充有含2.5％异丙醇或2.5％正丁醇的二氯甲烷的硅胶色谱柱上色谱分离，获得纯度约为98％的紫杉醇。第四，将该紫杉醇溶于丙酮中，将溶液过滤，并在丙酮∶己烷混合物中将紫杉醇重结晶。这种有机相萃取和色谱纯化法获得纯度为99％的紫杉醇，它约为粉碎树皮的0.014％(J.Liquid Chromatography，12(11)：2117-2132(1989)；WO 92/07842)。
通过该技术生产紫杉醇受以下因素的制约：(i)萃取和纯化步骤耗时长；(ii)在苛刻环境中停留的时间长和(iii)综合产量低。而且，短叶红豆杉树皮通常取自成龄树(树龄100-200年)。因此树皮供应受到限制。
为了克服这些问题已进行了许多研究，并且提供了获得紫杉醇的替代途径。其中的一些途径包括完全化学合成和细胞培养合成。在1994年报道了几种完全化学合成法。然而，这些方法由于复杂而难以工业化。该问题源自紫杉醇具有几个不对称碳原子并且结构复杂的事实。由于细胞生长速度慢并且细胞容易变为褐色，因此通过细胞培养生产紫杉醇在工业化方面也遇到了一些困难(美国专利No.5,019,504，1991年5月28日公布)。
红豆杉树可以分为以下几种：穗花杉属、澳洲杉属(Austrotaxus)、三尖杉属、白豆杉属、红豆杉属、榧树属。其中，红豆杉属包括，例如短叶红豆杉、欧洲红豆杉、杂种红豆杉、西藏红豆杉、加拿大红豆杉、东北红豆杉等，它们通常被认为是提取紫杉醇及其衍生物的合适物源。
红豆杉树，例如东北红豆杉，在其针叶中具有高的紫杉醇含量，种植地域广泛并且易于在农场栽培。然而，这些树具有高含量的蜡和非极性组分，使得难以从其中分离出紫杉醇。树皮的有机溶剂萃取物中紫杉醇的总量为25％，但是杂质含量非常高，为35-42％。为了容易地从东北红豆杉中分离出紫杉醇，人们必需首先开发出选择性除去例如蜡和叶绿素等物质的技术。
本文中的术语“杂质”是指除紫杉醇及其衍生物之外的得自植物萃取物中的所有组分。
已提出使用超临界流体萃取紫杉醇以改善萃取。术语“超临界流体”是指在其临界压力和其临界温度之上的流体。超临界流体既有能够渗透任何物质的气体性能，又有能够将物质溶于其组分中的液体性能。此外，它具有通过调整系统压力和温度以连续方式很大程度地改变密度的优点。该优点与其溶解能力的简单控制有关。同样地，使用超临界流体作为食品工业和医疗用品领域的有机溶剂的代用品。
而且，超临界流体不萃取叶绿素(M.T.Tena等AnalyticalChemistry，第69卷，第3期，521(1997))。尤其是，超临界二氧化碳有益地从植物中萃取所需组分，但不萃取叶绿素。
韩国专利中请号1994-7829、1994-36099、1995-703845、1996-19486和1996-0055302描述了用超临界二氧化碳从植物中萃取紫杉醇的方法。
具体地说，韩国专利申请号1994-7829公开了一种连续地分离和纯化高纯度的紫杉醇的方法和设备，其中以逆流方式实现超临界流体萃取。该发明还使用了助溶剂。
韩国专利申请号1994-36099公开了在超临界二氧化碳萃取之前使用正己烷除去非极性物质。即，它提出了一种有机溶剂萃取和超临界二氧化碳萃取结合的方法。
韩国专利申请号1995-703845是一种从观赏植物红豆杉的针叶中萃取紫杉醇的方法，包括步骤：(a)通过使所述针叶被超临界流体处理而脱蜡，(b)使所述脱蜡的针叶经受超临界流体和助溶剂，和(c)通过柱色谱法分离紫杉醇。然而，这种方法具有一些问题，例如脱蜡步骤中紫杉醇损失的危险和所用助溶剂的不完全的萃取能力。
韩国专利申请号1996-55302和1996-19486公开了与上述方法类似的萃取方法。
因此，常规超临界萃取技术对于紫杉醇的萃取不是最佳的。
在植物中紫杉醇通过弱化学键与细胞壁相连。根据所用溶剂的性能，可以部分地从植物中萃取出紫杉醇。超临界二氧化碳使植物膨胀，这样使得所需物质易于被萃取，而其极性使得高极性和化学键连接的物质(例如紫杉醇)的萃取难以进行(M.D.Luque de Castro等AnalyticalSupercritical Fluid Extraction，Springer-Verlag，Berlin，第188页(1994)、Y.Kim等J.Chromatographic Science，第37卷，457(1999))。
同样，有机溶剂不能容易地渗透到植物中并且限制了其萃取紫杉醇的能力。
                        发明概述
本发明提供了一种制备紫杉醇及其衍生物的新方法，包括超临界流体萃取步骤、有机溶剂萃取步骤和色谱步骤(例如多柱色谱步骤)。本发明通过在第一步采用对于萃取紫杉醇最佳的助溶剂，克服了常规超临界流体萃取的局限性。
一方面，本发明特征在于一种从原料中分离紫杉醇或其衍生物的方法。该方法包括(a)用某种超临界流体(例如超临界二氧化碳)和助溶剂萃取原料获得一萃取物；(b)用有机溶剂液-液分离所述萃取物得到一溶剂层；和c)通过柱色谱法从所述溶剂层中分离出紫杉醇或其衍生物。这些步骤可以连续或非连续方式进行。超临界流体与助溶剂的比例可以为75∶25-85∶15。
助溶剂用于从原料基质中释放紫杉醇及其衍生物。优选所述助溶剂在其化学结构中具有羟基。例如，助溶剂可以是水与至少一种醇(例如甲醇或乙醇)的混合物。实例证明有包括水和醇，例如甲醇和乙醇的助溶剂。可以同时使用至少一种助溶剂。优选使用水和醇的混合物。水与醇的体积比优选为30∶70-5∶95，并且更优选为20∶80。而且，其它溶剂，例如醋酸和三乙胺，可以加入到所述助溶剂中，例如至1％(v/v)。醋酸使超临界流体和助溶剂酸化，并且三乙胺使超临界流体和助溶剂碱化。在下面的实施例1中进一步描述了助溶剂的选择标准。水与至少一种醇的体积比可以是30∶70-5∶95(例如20∶80)。
在本发明的步骤(a)中，超临界流体的的优选条件是温度为60-100℃并且压力为3×107-4×107帕(300-400bar)。更优选，温度是75-85℃，压力是3.3×107帕-3.7×107帕(330-370bar)。最优选选择约80℃和约3.5×107帕(350bar)。超临界流体的流速优选是30-50千克/小时(kg/hr)。超临界流体萃取步骤也可以在超临界流体的温度为75-85℃，压力为3.3×107-3.7×107帕(330-370bar)，流速为30-50kg/hr下进行。
在步骤(b)中，有机溶剂的优选实例包括正己烷。正己烷可以与步骤(a)的助溶剂(优选醇)组合，然后与醇一起参与液-液分离。优选正丁烷的加入量与助溶剂的加入量相当。即，正己烷与助溶剂(优选醇)的体积比是1∶1。可以将步骤(b)重复1-3次。萃取和液-液分离步骤可以连续或非连续地进行。
步骤(c)可以包括多柱色谱步骤。每个柱色谱步骤可以连续或非连续地进行。可以使用的树脂的实例包括硅胶、反相C-18(RP-18)、交联葡聚糖(Sephadex)和五氟苯基树脂。多个柱各自包括一个柱树脂。例如，可以使用硅胶、RP-18和交联葡聚糖树脂。可以使用包括五氟苯基树脂的柱作为使用多个柱时的最后柱。
在硅胶柱色谱法中，硅胶可以10倍萃取物重量的量使用，并且可以使用氯仿∶甲醇(例如1∶0→0∶1v/v)的阶式梯度系统作为洗脱剂。优选可以获得含有紫杉醇及其衍生物的部分。选择性地或另外，硅胶可以33倍施加到柱上的萃取物重量的量使用，并且可以用二氯甲烷∶甲醇(例如85∶15v/v)进行洗脱。
反相C-18树脂的量可以是施加到柱上的萃取物重量的10倍，并且可以使用甲醇作为洗脱剂。含有浆果赤霉素III的部分可以从反相C-18树脂被洗脱出来。
交联葡聚糖树脂的量可以是施加到柱上的萃取物重量的65倍，并且可以使用甲醇作为洗脱剂。从交联葡聚糖树脂可以洗脱出三尖杉宁。
在交联葡聚糖柱色谱法中，交联葡聚糖树脂可以65倍的萃取物重量的量使用，并且可以使用甲醇作为洗脱剂。优选通过洗脱可以获得含三尖杉宁的部分。
在本发明的一个实施方式中，用于步骤(c)的最后柱可以包括五氟苯基树脂。五氟苯基树脂的量可以是施加到柱上的萃取物重量的133倍。可以使用乙腈∶水梯度系统作为洗脱剂。在色谱分离过程中乙腈含量可以从60％到90％变化(例如，在头40分钟从60％到80％变化，然后在另外的10分钟内进一步增加到90％)。
该方法还可以包括将分离的紫杉醇及其衍生物重结晶(例如增加产品纯度)。可以使用水∶乙醇(1∶1v/v)的溶液。
可用于本发明方法的原料是含紫杉醇或其衍生物的植物。最适宜的植物是红豆杉属种的，例如短叶红豆杉、欧洲红豆杉、杂种红豆杉、西藏红豆杉和加拿大红豆杉、东北红豆杉，但不限于此。在这些红豆杉属种中，特别优选东北红豆杉。同样，可以从整株植物或者从单独部分如木质、茎、树皮、根、叶(针叶)、种子或其混合物中提取紫杉醇及其衍生物。该物质可以干燥。优选使用树皮或针叶。
本发明还有特征是一种从原料中分离紫杉醇及其衍生物的设备。所述设备包括超临界流体的储器、原料可以加入其中的萃取器、将超临界流体与萃取混合物分离的分离容器、液-液分离器、和至少一个柱色谱器，都是联机放置(例如都在单一生产线内)。所述设备还可以包括至少一个分离容器，它将超临界流体与萃取混合物以连续形式分离。所述设备使除转移到柱色谱中的溶剂之外的液-液分离器中所用的溶剂全部地回收并循环。
在本发明的一个优选实施方式中，所述设备包括至少一个分离容器，它将超临界流体与萃取混合物以连续的方式分离。
在本发明的另一优选实施方式中，设备使除转移到柱色谱中的溶剂之外的液-液分离器中所用的溶剂全部地回收并循环。这种设备的一个优选实施方式描述于图1中，它举例说明了在液-液分离器中正己烷和醇混合物的应用。
通过本发明获得了以下有益效果。
通过将超临界流体萃取和有机溶剂分离组合本发明可以提供一种简单地萃取和分离紫杉醇及其衍生物的方法，并且可以避免常规紫杉醇提取方法中的复杂的萃取步骤。
从以下两个方面本发明可以提供一些紫杉醇萃取用的最佳助溶剂：(i)溶解紫杉醇及其衍生物的能力和(ii)从原料基质释放紫杉醇及其衍生物的能力。结果，本发明提供了一种效率提高的紫杉醇的萃取方法。
本发明还提供了改善萃取紫杉醇的超临界流体与助溶剂之间的特定条件。而且，本发明描述了一种显示萃取期间助溶剂作用机理的纤维素纸-紫杉醇模型。本发明人由该模型推断，水可用作助溶剂。试验结果显示，水和醇的助溶剂混合物增加了萃取产量，从而支持了水可用作助溶剂的结论(参见本文后面的实施例)。
本发明方法的紫杉醇的产量比常规甲醇萃取方法的增加2倍。与甲醇萃取法相比，与萃取物中所含紫杉醇的绝对量有关的“萃取选择性”增加5.5倍。
本发明还提供了一种包括5个柱的色谱装置，这使得与常规方法相比简化了纯化。同样，所用的所有这些树脂被证实是可循环利用的。
                     附图简述
图是根据本发明制备紫杉醇及其衍生物的设备的示意图。该设备使得都超临界流体萃取步骤、有机溶剂分离步骤和柱色谱步骤都联机实施。
图2是本发明的超临界流体萃取设备的示意图。
图3是描述从红豆杉叶萃取的紫杉醇产量的图。紫杉醇产量取决于水-甲醇或水-乙醇的助溶剂混合物的组成比。
图4是描述从红豆杉叶萃取的紫杉醇产量的图。紫杉醇产量取决于水-甲醇或水-乙醇的助溶剂混合物的组成比。
图5是描述来自所用超临界流体和助溶剂是超临界二氧化碳∶乙醇∶水(体积比为80∶16∶4)并且在超临界流体的温度为80℃，压力为3.5×107帕(350bar)且流速为40kg/hr的条件下进行萃取的试验的紫杉醇萃取产量的图。使用东北红豆杉作为原料。
图6是描述得自所用超临界流体和助溶剂是超临界二氧化碳∶乙醇∶水(80∶16∶4v/v/v)的试验的萃取产量的图。在超临界流体的温度为80℃、压力为3.5×107帕且流速为40kg/hr的条件下进行试验。使用东北红豆杉作为原料。
图7是得自红豆杉叶的紫杉醇萃取物的高效液相色谱(HPLC)。图7(a)是从甲醇萃取获得的HPLC色谱并且图7(b)是从超临界流体萃取获得的HPLC色谱。
图8显示了经过超临界流体萃取和柱纯化的萃取物的HPLC。图8(a)显示了得自反相C-18(RP-18)树脂柱色谱的结果。图8(b)显示了最终获得的紫杉醇的HPLC分析。
图中每一数字代表以下设备：
10：二氧化碳汽缸           11：二氧化碳增压泵
12：CO2加料/排放阀       13：CO2/助溶剂混合器
14：主要溶剂加料/排放阀    20：助溶剂瓶
21：助溶剂增压泵           22：助溶剂加料/排放阀
30：歧管                   31：排气阀
40：等温萃取器             41：萃取室
50：等温限定器箱
51：限定器                 60：收集箱
61：收集小瓶               100：二氧化碳储器
110：二氧化碳增压泵                120：冷却CO2的热交换器
130：加热CO2的热交换器           140：液化CO2的热交换器
200：助溶剂混合储器                210：助溶剂增压泵
220：助溶剂的热交换器              300：萃取器
301：背压调节器                    400：第一分离容器
401：液相控制阀                    402：背压调节器
410：加热/冷却用的热交换器         500：第二分离容器
501：液相控制阀                    502：背压调节器
510：压迫CO2的增压器             600：醇储器
610：醇蒸发器                      620：醇循环泵
630：冷却用热交换器                700：己烷储器
710：己烷蒸发器                    720：己烷循环泵
730：冷却用热交换器                800：醇与己烷的混合器
810：液-液分离器                   820：浓缩器
900：多柱色谱装置
                    发明详述
下面参照附图详细地描述本发明制备紫杉醇及其衍生物的方法。
本发明方法的实施方式可以用图1和2所述的超临界流体萃取设备进行。对大批量原料而言，可以将图1的设备用于步骤(a)。图2的设备可用于处理少量的原料。
即使在图1和2的设备中都描述了使用超临界CO2作为超临界流体，但是应认为并理解的是，这仅仅是为了方便描述起见，本发明的超临界流体并不限于CO2。
参照图2详细描述本发明。图2中所述的设备的一个实例是703型超临界流体萃取器(DIONEX，美国)。这种设备用于本文并且包括CO2增压器、助溶剂混合器和增压器、等温萃取器、等温限定器箱和收集箱。
该设备可以如下方式操作：
将萃取室41充满干燥且磨碎的原料，例如干燥且磨碎的红豆杉树针叶。将二氧化碳从CO2汽缸10转移到CO2增压泵11，然后在其中加压。为了便于增压泵操作可以使用液体CO2。助溶剂瓶20预先充满一种助溶剂或者以特定比含有两种溶剂的混合物。用助溶剂增压泵22将助溶剂加压至所需压力。当将CO2和助溶剂加压至所需压力时，打开阀12和22以便所述CO2和助溶剂可以流入混合器13。阀12和22分别控制所述CO2和助溶剂的移动，并且混合器13将CO2与助溶剂混合。混合之后，通过阀14和歧管30将CO2和助溶剂从混合器13转移到萃取室41。阀14用作控制CO2和助溶剂移动的开关。在加入CO2和助溶剂之前，凭借等温萃取器40将萃取室41和歧管30调定并保持在恒定温度。在通过歧管30时CO2和助溶剂保持在一恒定温度。接着，在萃取器41中，随着CO2和助溶剂的进入开始原料的萃取。萃取期间，通过增压泵11和21将CO2和助溶剂的流速保持恒定，同时通过储器51控制流速最高值。在萃取室41中萃取之后，通过储器51将所得含有CO2和助溶剂的萃取物转移到收集箱60。此时，萃取物经受可以使温度降低的压力降。这种温度降低能够导致储器51堵塞。然而，等温限定器箱50防止了温度降低和储器51的堵塞。
通过储器51的萃取物经受压力降，由此CO2蒸发并以气体排出。将剩余助溶剂和萃取物收集到收集小瓶61中。
收集小瓶61中的助溶剂和萃取物经受真空蒸发以除去所有溶剂组分。获得含有紫杉醇的萃取物，将其溶于少量甲醇中并进行定量分析用的HPLC分析。在此之前，可以将红豆杉的甲醇萃取物通过一过滤器，如沃特斯(Waters)(美国马萨诸塞州米尔福德市)的C18 sep-pak过滤，以便提高定量分析的准确性。
本发明人用于本试验的HPLC系统是HP-1090M，可从惠普公司(美国)获得，其中包括一个可在228nm下定量检测紫杉醇的紫外线检测器，和一个与Curosil PFP(30×4.6mm，Phenomenex公司，美国加州托兰斯市)保护柱固定在一起的Curosil PFP HPLC柱(250×4.6mm，5μm)。所述Curosil PFP HPLC柱仅用于紫杉醇分析。所用的含有乙腈和水的移动相以梯度方式变化，其中在头40分钟乙腈的体积比从早先的25％增加到65％，接着在其后的10分钟内增加到80％。
用作标准的紫杉醇及其衍生物从Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯市)获得，它们是半合成紫杉醇(semi-synthetic paclitaxel)(非细胞培养)(Taxol)、浆果赤霉素III、得自欧洲红豆杉的10-去乙酰基-浆果赤霉素III、9-二氢-13-乙酰基浆果赤霉素III)和三尖杉宁(cephalomannine)。
所用HPLC级洗脱剂包括甲醇、氯仿、正己烷、乙腈和去离子水；所有这些都得自J.T Baker(美国新泽西州Philipsburg市)。也使用试剂级洗脱剂如得自DAI-JUNG Chemical Co.(韩国仁川)的甲醇、氯仿和二氯甲烷。
在步骤(a)中，CO2与助溶剂的优选比例是70∶30-90∶10。当使用醇和水的混合物作为助溶剂时，醇占最小50％-最大100％v/v。所述醇涉及控制超临界二氧化碳的极性并且水负责破坏紫杉醇与植物的弱化学键。
为了处理大批量的原料，可以将图1的超临界CO2萃取设备用于本发明的方法中。
本发明也可以用图1的设备如下所述进行。
步骤(a)
将填充有原料的吊篮插入萃取器300中，迫使储器100中所盛的液体CO2流过热交换器120。储器100中的CO2以液体存在。热交换器120将CO2冷却以便CO2可以保持为液态。凭借热交换器120的这种作用，可以避免CO2增压泵110产生气穴现象，尽管CO2可能发生的蒸发也能导致该现象的发生。接下来通过增压泵将CO2压缩并通过热交换器130加热CO2来使之发生相转变而成为超临界流体状态。在第一阶段，连续地将CO2加入到萃取器300中直到萃取器300中的CO2的压力与储器100中的相同。萃取器300中的CO2的压力也通过背压调节器301控制。当CO2向萃取器300中的加入结束时，CO2增压泵110开始操作并升高CO2的压力。与此操作的同时，储器210中的助溶剂(或以某一比例混合的助溶剂)通过增压器210增压。压力升高的助溶剂经过热交换器220(用作助溶剂的加热器)加热至所需萃取温度。助溶剂然后与超临界CO2一起流入萃取器300。在萃取器300的温度和压力调整至所需条件之后开始原料的萃取。萃取器300中的压力通过背压调节器301加以控制。当超临界流体和助溶剂通过萃取器300时，其流速分别受增压泵110和210的调节。从萃取器300出来的超临界流体和助溶剂将含有从原料中萃取的紫杉醇及其衍生物，然后将它们流入第一分离容器400。第一分离容器400选择性地蒸发含有紫杉醇及其衍生物的流体和助溶剂的混合物中的超临界流体。将存在的CO2气体回收到储器100中。背压调节器403控制第一分离容器400中的CO2的压力以迫使CO2气体送到储器100。在回收操作期间，热交换器140将CO2气体转变成液体CO2。在第一分离容器400中，连续地收集溶解有紫杉醇及其衍生物(即萃取物)的剩余CO2和助溶剂直到它们达到一定的液面。然后通过热交换器410和控制阀401迫使这些萃取物移入第二分离容器500中。控制阀401调节第一分离容器400中液面。热交换器410将萃取物的温度控制为恒定，在这种情况下助溶剂不应被蒸发。
第二分离容器500将液体CO2完全蒸发并且蒸发的CO2回收到储器100用于循环。背压调节器502控制第二分离容器500的压力。从第二分离容器出来的蒸发的CO2通过增压器510加压，然后与来自第一分离容器的CO2一起经过热交换器140回收到储器100中。
第二分离容器中的液面受控制阀501的控制。如果萃取物(即，来自原料的助溶剂和紫杉醇萃取物)达到一定液位时，液位之上的萃取物被收集到醇蒸发器610中。这种收集步骤是连续进行的。
在完成步骤(a)的操作之后，将留在萃取器300以及第一和第二分离容器400和500中的CO2通过背压调节器502和增压器510回收。完成超临界流体萃取步骤之后，留在醇储器600中的萃取物(若有的话)用醇循环泵602(图中未显示)供应的醇洗涤。将洗涤物收集到醇储器610中。洗涤操作之后，分离容器中的剩余的CO2必需如上所述回收。
该设备的特征在于超临界流体(例如CO2)循环。该设备的特征还在于使用控制阀调节分离容器的液面(例如400和500)。阀与背压调节器(例如402和502)合作用于降低分离容器的总含量。背压调节器可以解决分离容器的容量有限的问题。
步骤(b)
该步骤是以助溶剂和含紫杉醇(或者含紫杉醇衍生物)的萃取物的混合物开始的。它可以与步骤(a)同时进行。步骤(b)的作用是通过液-液分离从混合物中除去杂质以减少经受步骤(c)的混合物的量。优选可以将正己烷和醇的混合物用于液-液分离。在下面，步骤(b)描述了使用正己烷和醇的混合物作为有机溶剂。
从步骤(a)转移到步骤(b)的含紫杉醇的萃取物的重量为原料的7％(w/w)，并且以萃取物重量为基础计，萃取物中紫杉醇的含量是0.55％。
紫杉醇含量(％w/w)与“萃取选择性”有关。术语“萃取选择性”显示了从超临界流体(或有机溶剂)萃取步骤获得的萃取物中所含的紫杉醇的绝对量。假如在任何原料中的紫杉醇的含量相同并且其中所含的所有紫杉醇都能够萃取，萃取物的量越大，萃取选择性的越低。同样，较少量的萃取物就意味着较高的萃取选择性。即，概念“萃取选择性”与除去的杂质量相反。当萃取物经受柱色谱时，较高的萃取选择性更有益于节约使用树脂。较高的萃取选择性需要使用少量的树脂。
为了提高本文的萃取选择性，将步骤(b)用于本发明。优选将正己烷与醇一起使用以提高这一步的选择性。
在步骤(b)中，醇储器600、醇蒸发器610、己烷储器700、己烷蒸发器710、醇/己烷混合器800(包括一搅拌器)、液-液分离器810(在醇层和己烷层之间将萃取物分开)和浓缩器820。浓缩器820将含紫杉醇的萃取物和助溶剂的混合物蒸发并浓缩。
步骤(b)是由来自洗涤醇储器600的醇洗涤物开始的，如上所述，除了所述混合物之外。醇蒸发器610保持在助溶剂和醇可以蒸发的温度之上。醇循环泵620将液体甲醇加入到蒸发器中以将这些溶剂浓缩。将浓缩物以1-5升的量转移到醇/己烷混合器800中。蒸发的物料从醇蒸发器610的上面溢出，通过热交换器630冷凝并流入醇储器中。该步骤可以重复1次或2次以便完全除去可能仍然留在蒸发器610和转移路径中的所有萃取的组分。
接下来，将正己烷从己烷储器700加入混合器800中的含萃取物的醇中。在己烷循环泵720的控制下以与醇的流量相同的量进行正己烷的加入。混合器800包括搅拌器，这促使醇与正己烷充分接触。混合的结果使得可溶于己烷的物质如蜡从醇中移到己烷中。然后将所有混合物转移到液-液分离器810中并在醇和己烷层之间分开。接着将己烷层转移到己烷蒸发器710，同时将醇层转移到冷凝器820。或者，液-液分离器810中的醇可以被再次送回混合器800以再次进行己烷萃取(图中未显示)。该步骤可以重复1次或2次。
己烷蒸发器710的操作与上面所述的醇蒸发器610的操作相似。己烷蒸发之后的剩余萃取物(若有的话)可以单独贮存，然后进行活性组分的分离。
加入到浓缩器820中的醇层经受醇蒸发。将蒸发的醇回收到醇储器600(图中未显示)。将浓缩的层层转移到步骤(c)。
步骤(b)的特征是简单且显著地减少了接下来经受柱色谱步骤(c)的萃取物中杂质的量。通过柱色谱技术纯化通常需要大量溶剂和长的操作时间。为了避免这些问题，正如本发明中的，减少待处理的物料量是非常重要的。
根据本发明，在步骤(a)中原料的重量减少约30％。从步骤(a)获得的萃取物的量是原料的约5-7％(w/w)。与此同时，紫杉醇含量从原料中的约0.55％增加到萃取物中的0.82％。在萃取选择性方面也获得约30％的增加。
由步骤(a)和(b)的组合获得的萃取物的重量为原料的约3.5％-5％(w/w)。当进行常规甲醇萃取时，萃取物的重量通常为原料的约15％(w/w)。因此，本发明的萃取选择性比常规甲醇萃取的高约3-4.2倍。常规有机溶剂萃取，例如甲醇萃取，存在的缺陷是除了所需物质之外有大量通过有机溶剂从原料萃取的叶绿素。因此，如果将本发明的己烷分离步骤用于常规有机溶剂萃取，需要大量的己烷。本发明通过使用步骤(b)避免了这种问题。
步骤(c)
用于步骤(c)的多柱色谱装置可以包括至少2种柱树脂(例如2、3、4或更多的柱树脂)。优选步骤(c)可以分成5个纯化过程。
优选用于每一柱的树脂可以包括硅胶G(Typ 60，TLC；Merck公司，德国达姆施塔特市)、RP-18(40-63μm；Pharmacia Biotech公司，瑞典乌普萨拉市)、交联葡聚糖LH-20(Pharmacia Biotech公司，瑞典乌普萨拉市)、LiChroprep Si 60(40-63μm Merck公司)、LiChroprep RP-18(Merck公司)和Curosil-PFP(五氟苯基)(Phenomenex公司，美国加州托兰斯市)。
步骤(c)的操作的一个优选实例描述如下：
(1)第一次纯化：硅胶柱色谱
得自步骤(b)的所得萃取物(优选浓缩的醇层)经过硅胶柱色谱。硅胶可以萃取物重量的10倍的量使用(例如，10g/1g萃取物)。所用移动相可以是氯仿∶甲醇(1∶0→0∶1v/v)阶式梯度系统。洗脱剂可以5ml/g萃取物分馏。移动相在馏分25从100％氯仿到100％甲醇变化。紫杉醇及其衍生物可以在馏分45-52获得。
术语“阶式梯度”是指一移动相在某一点，而不是连续地迅速被另一移动相代替的梯度系统。氯仿∶甲醇(1∶0→0∶1(v/v))的阶式梯度是指在所需时间点或者所需量的洗脱剂通过时作为移动相的100％氯仿用100％甲醇替代。
(2)第2次纯化：RP-18柱色谱
来自上面第一次纯化的所得物可以经过RP-18柱色谱。树脂可以所用样品重量的10倍的量填充到柱中(例如10g/1g所用样品)。所用移动相是甲醇。所得洗脱剂可以2ml/1g所用样品分馏。紫杉醇及其衍生物可以在馏分7-10获得。
(3)第3次纯化：硅胶柱色谱
这里可以使用填充有硅胶(40-63μm)的LiChroprep Si 60柱，并且树脂可以所用样品重量的33倍的量使用(例如33g/1g所用样品)。可以使用二氯甲烷∶甲醇(85∶15v/v)溶液作为移动相。所得洗脱剂可以33ml/1g所用样品分馏。在馏分7-10中检测紫杉醇及其衍生物。
(4)第4次纯化：交联葡聚糖LH-20色谱
交联葡聚糖LH-20以所用样品重量的55倍的量填充(例如55g/1g所用样品)。所得洗脱剂分馏成120ml甲醇/1g加入的物料。在馏分15-18检测紫杉醇及其衍生物。
(5)第5次纯化：LH-20色谱
使用Curosil PFP柱。树脂以待处理的样品重量的133倍的量使用(例如133g/1g所用样品)。作为移动相，使用乙腈-水梯度系统，其中在40分钟内乙腈含量从60％到80％变化，然后在另外10分钟内增加至90％。停留14.0分钟后可以得到紫杉醇及其衍生物。
以与上述相同的方式进行下面的实施例9。
本发明将通过以下实施例进一步地描述，但不打算以任何方式限制本发明的范围。
本发明将通过以下实施例进一步地描述，但是这些实施例不应被解释为对本发明范围的限制。
                             实施例
这些实施例和对比实施例中所用的原料是东北红豆杉的叶、茎和根，该东北红豆杉取自韩国药学院医用草药园(Medicinal Herb Garden，College of Pharmacy，Ilsan，Kyungi-Do，Korea)。
将东北红豆杉的叶、茎和根在真空干燥炉中于50℃下干燥72小时，然后用研磨器研磨至低于0.7mm的大小。将所得物料用作比较本发明效果用的以下实施例和有机溶剂萃取中的原料。为了精确比较，将随机选择物料。
东北红豆杉的紫杉醇含量比短叶红豆杉的树皮(紫杉醇的现有原料，正如人们从使用常规有机溶剂萃取的以下对比实施例中可以看到的)中的紫杉醇含量高2-4倍。
对比实施例
使用有机溶剂萃取的紫杉醇及其衍生物的量
为了比较本发明和常规有机溶剂萃取技术中获得的紫杉醇及其衍生物的量，进行了本试验。
测定通过甲醇萃取的从东北红豆杉的叶、茎和根获得的紫杉醇及其衍生物的量。所用原料与下面给出的实施例中的相同。将原料加入到甲醇(100ml)中，在超声波下萃取3小时，然后在减压下浓缩。将浓缩的萃取物再溶于1ml甲醇中。将所得溶液回到Sep-pak(预先分别用10ml甲醇、水及其混合物(甲醇∶水＝55∶45v/v)洗涤过)。该Sep-pak用2ml的甲醇∶水(55∶45，v/v)、6ml的甲醇∶水(80∶20，v/v)和2ml的甲醇洗提。在减压下将混合的6ml甲醇∶水(80∶20，v/v)馏分浓缩，然后再溶于1ml甲醇中。为了便于高压液相色谱(HPLC)分析，将溶解的部分通过直径为13mm且孔径为0.45μm的PVDF膜过滤器(美国威斯康星州Lida Kenosha市)过滤。滤液用作HPLC分析的样品以测定样品中紫杉醇及其衍生物的含量。结果，在东北红豆杉中，叶中有0.048％(0.48mg/g)的紫杉醇，茎中有0.013％(0.13mg/g)，根中有0.019％(0.19mg/g)。
实施例1-助溶剂类型对紫杉醇在超临界二氧化碳-助溶剂中的溶解度
的影响：本实施例涉及能够提高紫杉醇溶解度的助溶剂的选择。
与甲醇、乙醇、水、或助溶剂的组合和1％(v)辅助溶剂如醋酸或三乙胺一起在超临界CO2中测定紫杉醇的溶解度。醋酸使超临界CO2和助溶剂酸化，并且三乙胺使超临界CO2和助溶剂碱化。结果示于下表1。
                            表1
紫杉醇在超临界CO2、助溶剂或它们二者中于80℃、350bar下的溶解度(溶解度＝紫杉醇的重量/CO2的体积，μg/ml)。
如表1所示，与仅在CO2中的紫杉醇溶解度比较(注意在80℃和350bar的压力下从纯超临界流体萃取获得13μg/ml的紫杉醇溶解度)，当与这些助溶剂(1％，v/v)混合时，无论助溶剂的类型如何，在超临界CO2中的紫杉醇的溶解度降低。然而，当除水或水与其它溶剂的混合物之外的大于5％(v/v)的助溶剂加入到超临界CO2的情况下紫杉醇的溶解度增加至少3倍。特别是，甲醇比乙醇和水呈现更好的提高紫杉醇溶解度的能力。同样，当使用10％(v/v)甲醇时，溶解度最高，即，比纯CO2中的溶解度高25倍。据信甲醇增加紫杉醇溶解度是由于甲醇足够溶解紫杉醇的良好能力引起的。
而且，紫杉醇在超临界CO2和甲醇的组合系统中的溶解度与加入的甲醇的体积比成比例地增加。同样，乙醇也增加紫杉醇的溶解度。因此，以上面的结果为基础，选择醇组分作为本发明的主要助溶剂。
水不以加入的水的量成比例地增加紫杉醇的溶解度。与使用纯超临界CO2相比其溶解度略有降低。
实施例2-原料基质对紫杉醇萃取和助溶剂的选择的影响：除了萃取溶剂的溶解能力之外，认为紫杉醇天然存在的基质环境影响紫杉醇萃取的效率。必需打破紫杉醇与原料基质的相互作用(如果存在的话)。为此，在萃取步骤中可以使用合适的助溶剂。如果在用超临界CO2萃取原料之前通过这些助溶剂从原料基质中将紫杉醇释放，那么可以提高萃取效率。
实施例2涉及适用于避免基质对紫杉醇萃取和从基质中释放紫杉醇及其衍生物的可能影响的助溶剂的选择。
为此，设计一纤维素纸-紫杉醇模型。如果紫杉醇与纤维素纸不相互作用，那么可以仅以溶解紫杉醇及其衍生物的能力为基础选择助溶剂。然而，如果紫杉醇与纤维素纸相互作用，可以其破坏紫杉醇和纤维素纸的相互作用的能力及其溶解能力选择助溶剂。
将紫杉醇吸收到纤维素纸中并用纯超临界CO2或超临界CO2与各种助溶剂的组合萃取。测定紫杉醇的吸收回收率并示于下表2。
研究了红豆杉树基质对超临界流体中的紫杉醇萃取效率的影响。首先，将1g过滤纸片(Advantec No.2，Toyo株式会社，日本东京)切割成1.0cm大小，并放入一烧杯中。然后，向烧杯中加入给定量的紫杉醇的甲醇溶液(0.2mg/ml)并在真空炉中干燥24小时以用于本试验。萃取体积是温度为80℃并且压力为3.5×107帕(350bar)。而且，超临界CO2的流速是40kg/hr，限定器50的温度是160℃。甲醇、乙醇或水以1-10％体积作为助溶剂使用。此外，制备包括比例分别为2∶8、5∶5和8∶2(v/v)的水-甲醇或水-乙醇的助溶剂混合物并以20％体积加入到超临界CO2中以用于本试验。
根据上述方法，测定纯CO2的紫杉醇的百分比吸收回收率(％)为0.46％wt。
术语“百分比吸收回收率”是指以过滤纸片上吸收的紫杉醇的重量为基础从超临界萃取获得的紫杉醇的重量分数。例如，如果在过滤纸片上吸收1mg紫杉醇并且萃取的紫杉醇的重量是0.5mg，那么百分比吸收回收率是50％。
                               表2
在80℃的温度和3.5×107帕(350bar)的压力下以向超临界CO2中不同地加入甲醇、乙醇和水为基础的纤维素纸上吸收的紫杉醇的百分比吸收回收率
    助溶剂的添加比例助溶剂     1％     5％     10％
    甲醇     2.0％     12.3％     17.0％
    乙醇     3.5％     10.7％     15.3％
    水     5.2％     64.0％     81.0％
*百分比吸收回收率＝(在纤维素纸上吸收的紫杉醇的重量/通过萃取获得的紫杉醇的重量)×100
如表2所示，水最有效地将紫杉醇从纤维素纸中释放。通常已知水不适宜用作超临界流体萃取中的助溶剂。然而，表2中的数据说明，尽管水溶解紫杉醇的能力差，但是就紫杉醇和周围基质的相互作用而言水作为助溶剂可以提供益处。
实施例3-使用纯超临界CO2的紫杉醇的百分比萃取回收率(％)：将从东北红豆杉中纯超临界CO2萃取(即，没有如何助溶剂)紫杉醇与上面对比实施例中所述的甲醇萃取比较。在80℃和3.5×107帕(350bar)的压力下进行超临界CO2萃取以测定紫杉醇产量。发现在叶中有0.024％(0.24mg/g)紫杉醇，在茎中有0.0047％(0.13mg/g)，在根中有0.0022％(0.022mg/g)。
将上面的结果与上面的对比实施例的比较并显示为下表3的百分比萃取回收率(即，用超临界CO2获得的紫杉醇的重量/1g用甲醇萃取获得的紫杉醇)×100)。例如，如果用甲醇萃取获得1mg紫杉醇并且萃取的紫杉醇的重量为0.5mg，那么百分比吸收回收率是50％。
                                表3
与甲醇萃取相比在80℃的温度和3.5×107帕(350bar)的压力下从东北红豆杉的不同部分通过纯超临界CO2萃取的紫杉醇的百分比萃取回收率
    东北红豆杉     叶     茎的皮     根
    百分比萃取回收率     62.0％     36.3％     12.1％
*百分比萃取回收率＝(通过超临界CO2萃取获得的紫杉醇的重量/通过甲醇萃取获得的紫杉醇的重量)×100
如表3所示，通过纯超临界CO2萃取的回收率比通过对比实施例的甲醇萃取的低。
实施例4-使用超临界CO2-助溶剂从原料的百分比萃取回收率：与常规有机溶剂萃取和纯超临界流体萃取比较，可以从实施例1-3的结果和发现推断，使用助溶剂可以提高紫杉醇产量和超临界流体萃取方法中的百分比萃取回收率(％)。
在实施例4中，测定紫杉醇在甲醇、乙醇和水作为助溶剂的超临界CO2中的萃取效率并以百分比萃取回收率表示。所得数据示于下表4中。
                              表4
在80℃的温度和3.5×107帕(350bar)的压力下使用甲醇、乙醇和水作为助溶剂的不同超临界CO2萃取中紫杉醇的百分比萃取回收率
          助溶剂的添加比例助溶剂 1％ 5％ 10％
    东北红豆杉的叶     甲醇     51％     98％     143％
    乙醇     110％     102％     128％
    水     72％     73％     107％
    东北红豆杉的茎的皮     甲醇     68％     71％     126％
    乙醇     56％     60％     113％
    水     28％     91％     102％
    东北红豆杉的根     甲醇     65％     61％     68％
    乙醇     71％     66％     100％
    水     16％     52％     64％
*百分比萃取回收率＝(通过超临界萃取获得的紫杉醇的重量/通过甲醇萃取获得的紫杉醇的重量)×100
在萃取叶时，每种助溶剂以10％体积加入并且与上面实施例2中所述的常规甲醇萃取相比紫杉醇的百分比萃取回收率增加143％。尤其是加入1％体积的乙醇使得百分比萃取回收率增加110％。应注意的是，这些试验中所有助溶剂都大大提高了紫杉醇的百分比萃取回收率，而上面实施例2的纤维素纸-紫杉醇模型显示除水之外，没有助溶剂呈现百分比萃取回收率增加40％或更多。就此而言，注意术语“百分比萃取回收率”与实施例2的“百分比吸收回收率”有关。因此，据信紫杉醇吸收到红豆杉树的周围基质上，但是并不以同样强地吸收到实施例2中的纤维素纸上。因此，通过含羟基的溶剂(与超临界CO2相比具有更强的离去力)可以大大提高萃取效率。
在上表4中，百分比萃取回收率的值为100％或更多，这意味着通过常规甲醇萃取没有充分地从红豆杉树中将紫杉醇萃取出来。
在加入10％甲醇、乙醇或水的试验中测定茎的皮中的百分比萃取回收率大于100％。尽管在根中的超临界流体萃取效率比叶和皮中的低，但是加入10％乙醇的百分比萃取回收率是100％。
与实施例3的纯超临界CO2相比，当使用水作为助溶剂时，加入5％或10％水显著地增加了回收率，而加入1％水略有降低。正如实施例3中解释的，这显然是由于水不增加紫杉醇在超临界流体中的溶解度，但是在加速紫杉醇从周围基质的释放以提高紫杉醇萃取产量方面发挥了作用。这可以对加入少量水(即，1％)为什么不能增加回收率提供了一定的解释。即，少量水既不能增加紫杉醇的溶解度也不能影响紫杉醇从原料基质的释放。
实施例5-通过超临界CO2-助溶剂萃取的紫杉醇的萃取选择性和百分比萃取选择性：在本实施例中，使用常规甲醇萃取和本发明的超临界流体-助溶剂萃取测定紫杉醇相对其它杂质的萃取选择性。同样，以所得的紫杉醇的萃取选择性为基础确定百分比萃取选择性。
术语“萃取物”是指从包括紫杉醇的原料中萃取的所有组分。由于接下来的分离和纯化步骤直接受到所得萃取物中紫杉醇的含量的影响，因此如果能够不含其它杂质地选择性地萃取紫杉醇的话，这将是优选的。
术语“萃取选择性”定义为完成所有步骤之后最后获得的紫杉醇的重量除以萃取物的总重量。萃取选择性越高说明从萃取方法中获得的萃取物中的紫杉醇的含量水平越高。
本发明中的术语“百分比萃取选择性”定义如下：
百分比萃取选择性＝(超临界流体萃取的萃取选择性)/(常规甲醇萃取的萃取选择性)×100
在本实施例中，在具有最好萃取产量的东北红豆杉的部位，即叶中测定萃取选择性，如实施例4的结果所示。将所得百分比萃取选择性与对比实施例的甲醇萃取的进行比较。结果示于下表5。
                               表5
在80℃的温度和3.5×107帕(350bar)的压力下超临界CO2-助溶剂萃取时来自东北红豆杉的叶的萃取物的萃取选择性和百分比萃取选择性
   常规甲醇萃取              超临界CO2-助溶剂萃取
                 加入的助溶剂
  甲醇(10％)   乙醇(10％)     水(10％)
  萃取选择性     0.11％     0.42％     0.61％     0.62％
百分比萃取选择性     100％     381％     555％     564％
如表4所示，当将甲醇、乙醇或水以10％体积加入到超临界CO2中时，叶中紫杉醇的％萃取选择性增加400-600％。这些数据说明，根据本发明，分离的紫杉醇的量比甲醇萃取中的线性地增加约4-6倍。
实施例6-建立超临界萃取条件的助溶剂组分比：在本实施例中，当使用水和醇作为助溶剂时，测定超临界流体萃取的产量并将结果示于下表6。
                             表6
根据助溶剂的不同组成在东北红豆杉中萃取(80℃，3.5×107帕(350bar))的紫杉醇的产量
    萃取方法     萃取的红豆杉的产量
    甲醇萃取     200μg/g
    超临界流体萃取：助溶剂的组成(％，v/v)
    CO2     甲醇     乙醇     水
    100     -     -     -     54μg/g
    90     10     -     -     72μg/g
    80     20     -     -     189μg/g
    90     -     -     10     25μg/g
    80     -     -     20     98μg/g
    90     -     10     -     119μg/g
    80     -     20     -     158μg/g
    90     5     -     5     208μg/g
    80     10     -     10     203μg/g
    90     -     5     5     242μg/g
    80     -     10     10     336μg/g
如表6所示，甲醇、乙醇或水比水和甲醇或乙醇的组合(1∶1v/v)使得萃取效率提高得更多。特别是当以1∶1体积含有水和乙醇的助溶剂混合物以20％体积加入到CO2中时，与甲醇萃取相比萃取的紫杉醇含量增加150％或更多。
实施例7-水与醇的组成比对通过超临界流体萃取的萃取产量的影响：当使用水和醇的混合物作为助溶剂时，为了确定最佳配比，研究了水与醇的组成比与萃取产量的关系。将甲醇或乙醇用作本试验的醇。
水与甲醇或乙醇的混合比从2∶8增加到8∶2，并将每一混合助溶剂以20％体积加入到超临界CO2中。然后测定紫杉醇产量的变化。结果示于图3。如图3所示，当将水∶醇为2∶8的混合物以20％体积加入到超临界CO2中时，获得萃取的最高产量。
原料是东北红豆杉的叶，采于1999年10月。用采于1998年8月的叶进行另一与如上所述相似的试验。同样，水∶醇以2∶8体积比的助溶剂混合物提供了最高产量。结果示于图4。
实施例8-使用超临界萃取法萃取紫杉醇：用本发明的超临界流体萃取法萃取紫杉醇。萃取条件确定如下：超临界CO2-乙醇-水＝80∶16∶4；超临界流体的流速是40-80kg/hr；温度为80℃且压力为3.5×107帕(350bar)。该条件是以上面实施例1-7的结果为基础设定的。在总共6小时内以20分钟的间隔获取测定产量用的样品。
紫杉醇产量和萃取物产量分别示于图5和6。如图5和6所示，从萃取开始的1小时内没有萃取到紫杉醇。这是由于助溶剂与原料充分接触需要一段时间并且超临界CO2和助溶剂通过萃取器花费一段时间。例如，如果超临界流体以40kg/hr的流速通过萃取器，那么助溶剂从萃取器的底部通过到其上部花费约10分钟。而且，超临界流体的流动也受其角度的影响。液体的移动可能受到与其方向垂直放置的任何障碍物的阻碍。
实施例9-通过液-液分离增加超临界流体萃取物的萃取选择性：在本实施例中，将己烷用于从超临界流体萃取获得的萃取物的液-液分离中。在液-液分离之前萃取物中的紫杉醇的含量是0.55％，在液-液分离之后增加到0.82％。这说明使用己烷通过液-液分离可以将除紫杉醇之外的33％的杂质除去。
实施例10-甲醇萃取物和超临界流体萃取物的HPLC分析：实施例9中经过液-液分离的萃取物通过HPLC分析以测定紫杉醇及其衍生物的含量。其结果与甲醇萃取物的结果一起示于图7。
如图7所示，每一峰代表①紫杉醇峰、②三尖杉宁、③浆果赤霉素III和④10-二乙酰浆果赤霉素III。使用萃取物和标准样品以混合物(每个量相等)采用共注射法进行峰的鉴定。
在图7和8中看到，与超临界流体萃取物比较(图7b)，在停留时间的早期甲醇萃取物(图7a)产生许多杂质峰，它们必需除去。这显示根据本发明分离和纯化步骤更简单。
实施例11-使用色谱法制备紫杉醇及其衍生物：在本实施例中，通过柱色谱法由实施例9的萃取物制备了纯度高的紫杉醇。
首先，将萃取物经过硅胶色谱。结果，萃取物中的紫杉醇的含量增加到1.58％。硅胶在用甲醇和氯仿洗涤之后可以重新使用。在第一次纯化步骤中除去了规则结构酸的峰。
接下来，使用RP-18树脂对纯化过的产物进行第二次纯化步骤。通过HPLC分析证实萃取物中紫杉醇含量增加至15％。HPLC分析的结果示于图8a。RP-18树脂在用异丙醇冲洗掉非极性物料并用甲醇洗涤之后可以重新使用。
使用硅胶柱将第二次纯化过的产物再次经过第三次纯化步骤。结果，萃取物中的紫杉醇含量增加至43％，并且由HPLC分析显示浆果赤霉素III的峰消失。因此，由这一步可以获得浆果赤霉素III。通过与第一次纯化步骤相似的过程可以使硅胶重新使用。
使用LH-20过滤器对第三次纯化过的产物经过第四次纯化步骤。结果，紫杉醇含量增加至84％，并且停留时间与紫杉醇相近的三尖杉宁(cephaloman)被除去。
最后，使用RFP HPLC柱(Phenomenex公司)将第四次纯化过的产物经过第五次纯化。所述纯化过的产物用水∶甲醇(1∶1，v/v)重结晶得到纯度为99％的紫杉醇。所得紫杉醇的HPLC分析示于图8b。
正如前面所解释的，根据本发明，可以制备高纯度的紫杉醇并且获得紫杉醇衍生物的馏分。

Claims (25)

1、一种从原料中分离紫杉醇或其衍生物的方法，所述方法包括：
(a)用超临界流体和助溶剂萃取所述原料以获得一萃取物，
其中所述助溶剂是水与甲醇和/或乙醇的混合物；
(b)用有机溶剂将所述萃取物液-液分离以获得一溶剂层；和
(c)通过柱色谱从所述溶剂层中分离出紫杉醇或其所述衍生物，该衍生物选自三尖杉宁、浆果赤霉素III、10-二乙酰浆果赤霉素III或它们的混合物。
2、权利要求1的方法，其中所述超临界流体是超临界二氧化碳。
3、权利要求1的方法，其中所述超临界流体与所述助溶剂的体积之比是75∶25-85∶15。
4、权利要求1的方法，其中水与醇的体积比是30∶70-5∶95。
5、权利要求4的方法，其中所述体积比是20∶80。
6、权利要求1的方法，其中所述超临界流体萃取步骤是在60-100℃的温度和3×107-4×107帕的压力下进行的。
7、权利要求6的方法，其中所述温度是80℃并且所述压力是3.5×107帕。
8、权利要求1的方法，其中所述超临界流体萃取步骤是所述超临界流体的温度为75-85℃、压力为3.3×107-3.7×107帕且流速为30-50千克/小时下进行的。
9、权利要求1的方法，其中所述有机溶剂包括正己烷。
10、权利要求9的方法，其中正己烷与所述助溶剂的体积比是1∶1并且所述所述液-液分离步骤进行1-3次。
11、权利要求1的方法，其中所述萃取和所述液-液分离步骤是连续或非连续地进行的。
12、权利要求1的方法，其中柱色谱包括使用多个柱分离紫杉醇或所述衍生物，其中所述多个柱各自包括一柱树脂，所述衍生物选自三尖杉宁、浆果赤霉素III、10-二乙酰浆果赤霉素III或它们的混合物。
13、权利要求12的方法，其中柱色谱是连续或非连续地进行的。
14、权利要求12的方法，其中所述柱树脂包括硅胶、反相C-18或交联葡聚糖柱树脂。
15、权利要求12的方法，其中含有五氟苯基树脂的柱是所述多个柱的最后柱。
16、权利要求14的方法，其中所述硅胶树脂的量是施加到所述柱上的萃取物重量的10倍并且使用氯仿∶甲醇的阶式梯度系统作为洗脱剂。
17、权利要求16的方法，其中从所述硅胶树脂洗脱紫杉醇和所述衍生物，该衍生物选自三尖杉宁、浆果赤霉素III、10-二乙酰浆果赤霉素III或它们的混合物。
18、权利要求14的方法，其中所述反相C-18树脂的量是施加到所述柱上的萃取物重量的10倍，并且使用甲醇作为洗脱剂。
19、权利要求18的方法，其中由所述反相C-18树脂洗脱浆果赤霉素III。
20、权利要求14的方法，其中所述硅胶树脂的量是施加到所述柱上的萃取物重量的33倍，并且其中使用二氯甲烷∶甲醇溶液作为洗脱剂。
21、权利要求14的方法，其中所述交联葡聚糖树脂的量是施加到所述柱上的萃取物重量的65倍，并且其中使用甲醇作为洗脱剂。
22、权利要求21的方法，其中从所述交联葡聚糖树脂洗脱三尖杉宁。
23、权利要求15的方法，其中所述五氟苯基树脂的量是施加到所述柱上的萃取物重量的133倍，并且其中使用乙腈∶水梯度系统作为洗脱剂。
24、权利要求23的方法，其中所述乙腈含量从60％到90％变化。
25、权利要求12的方法，其中所述方法还包括将所述分离的紫杉醇及其衍生物重结晶，所述衍生物选自三尖杉宁、浆果赤霉素III、10-二乙酰浆果赤霉素III或它们的混合物。
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