CN1161389C

CN1161389C - 银杏叶聚戊烯醇和银杏叶提取物（gbe）的制备方法及其用途

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Publication number: CN1161389C
Application number: CNB011136960A
Authority: CN
Inventors: 王成章; 沈兆邦; 谭卫红; 郁青; 陈祥
Original assignee: Institute of Chemical Industry of Forest Products of CAF
Current assignee: Institute of Chemical Industry of Forest Products of CAF
Priority date: 2001-06-18
Filing date: 2001-06-18
Publication date: 2004-08-11
Anticipated expiration: 2021-06-18
Also published as: CN1392167A

Abstract

本发明提供了一种从银杏叶中制备银杏叶聚戊烯醇和银杏叶提取物(GBE)的方法。该方法通过亲脂性溶剂提取、皂化、萃取、沉淀和柱层析等工艺，制备50%-95%银杏叶聚戊烯醇油状物；同时通过亲水性溶剂对残渣叶提取、离心沉淀、树脂吸附、溶剂萃取和干燥等工艺，制备银杏叶提取物(GBE)干粉，其中黄酮甙＞24%，萜内酯＞6%，银杏酸＜5ppm。本发明提供的制备方法，可综合利用银杏叶原料，生产成本低，宜于规模型生产。按本发明制备的银杏叶聚戊烯醇具有抗肿瘤和辅助化疗的作用。

Description

银杏叶聚戊烯醇和银杏叶提取物(GBE)的制备方法及其用途

本发明涉及银杏叶聚戊烯醇和银杏叶提取物(GBE)的提取分离和制备方法以及银杏叶聚戊烯醇的用途。

银杏叶提取物(GBE)及其制剂中药用活性成分为黄酮甙和萜内酯，已广泛用于心脑血管和外周血管疾病的治疗和防治，国内外已有大量的专利报道。用银杏叶制备聚戊烯醇曾有日本专利报道。但以银杏叶为原料，先提取、制备聚戊烯醇，再从提取过的残渣中提取、制备含银杏萜内酯和黄酮甙的银杏叶提取物未见报道。

本发明的目的是提供一种以银杏叶为原料先以亲脂性溶剂提取、制备聚戊烯醇，再以提取后的银杏叶残渣为原料，用亲水性溶剂制备含银杏萜内酯和银杏黄酮甙的银杏叶提取物(GBE)的方法。本发明提供的制备方法，可同时生产银杏叶聚戊烯醇和银杏叶提取物(GBE)，也可单独生产银杏叶聚戊烯醇。

日本专利(JP昭58-201747和EP0166436A2)报道可用溶剂提取、柱层析分离、溶剂溶解分级、冷冻沉淀分离、分子精馏等方法制备银杏叶聚戊烯醇，从实施例看，主要是用银杏黄叶为原料，氯仿室温浸泡、硅胶柱分离制备聚戊烯醇乙酸酯、再经水解和硅胶柱分离，制备聚戊烯醇，产品得率仅有0.2％-0.3％。该方法工艺复杂，成本高，难以工业化生产；并且该方法旨在通过分离聚戊烯醇来合成多萜醇，从而对多萜醇及其磷酸酯(胺)进行相关药理研究和药物开发，但没有考虑银杏叶提取物(GBE)的加工，无法综合加工银杏叶的药用活性成分(如银杏叶黄酮甙、萜内酯和聚戊烯醇等)。

本发明方法采用的银杏叶为3-10年的银杏青叶，采集季节为8-9月，其聚戊烯醇的含量为0.8％以上，黄酮甙含量1.0％以上，萜内酯含量0.25％以上；单独制备银杏叶聚戊烯醇时，可采用3年以上树龄的银杏青叶，也可使用20年以上树龄的银杏黄叶，其聚戊烯醇含量为0.8％以上。制备的聚戊烯醇得率约0.3％-1.0％，银杏叶提取物(GBE)得率约2.0％-3.0％。

在本发明中，首先用亲脂性溶剂例如石油醚和正己烷提取银杏叶，然后用亲水性溶剂例如乙醇-水的混合溶剂提取剩下的银杏叶，依次提取分离银杏叶聚戊烯醇和银杏叶提取物。溶剂用量是银杏叶重量的5-15倍，热提取和冷浸提均可，优选热回流提取，真空浓缩回收溶剂，制备亲脂性溶剂抽提物软膏(见表1-2)和亲水性溶剂提取物。

在本发明制备聚戊烯醇的方法中，用无机强碱的水溶液例如NaOH-H₂O、KOH-H₂O或醇溶液(NaOH-EtOH/MeOH、KOH-EtOH/MeOH)，优选NaOH-H₂O和NaOH-EtOH。碱-水溶液的浓度为3％-50％，优选10％-30％，碱-醇溶液的浓度为5％-35％，优选10％-20％(见表3)。皂化后萃取用非极性溶剂为C₅-C₇的脂肪烷烃、石油醚(60℃-90℃)、乙醚等，优选石油醚(60℃-90℃)和正己烷。溶剂沉淀是用石油醚(60℃-90℃)、乙醚、乙酸乙酯、丙酮等中的一种或几种溶剂对萃取相进行溶解和沉淀，温度为-20℃-50℃。去除不溶物，制备聚戊烯醇粗制品，其聚戊烯醇含量为50％-75％。柱层析分离是用氧化铝、硅胶、硅藻土、活性炭、纤维素等中一种或几种介质为填料对聚戊烯醇粗制品进行分离，优选氧化铝、硅胶和活性炭；柱层析分离所用淋冼剂为C₅-C₇的脂肪烷烃、石油醚(60℃-90℃)、乙醚、丙酮中的一种或几种，可以单独淋洗也可二种混合溶液淋洗。再经浓缩、干燥制备聚戊烯醇精制品，其聚戊烯醇的含量为70％-95％(见表4)。

表1.亲脂性溶剂对不同叶源银杏叶的浸提结果

序投入计量软膏得率聚戊烯醇含量聚戊烯醇浸出率

叶源

号 (g) (％) (％) (％)

邳州苗叶

1 300 6.0 16.8 77.5

(3-5年)

2 邳州苗叶 15 6.2 16.1 76.8

(5-10年)

3 郯城苗叶 50 5.1 18.7 75.1

(3-5年)

4 郯城苗叶 300 5.0 18.2 71.7

(5-10年)

泰兴老树

5 500 4.4 12.0 75.4

叶(20年

以上)

从表1可知，选用的亲脂性溶剂对银杏叶中聚戊烯醇的浸出率均高于70％，但幼树叶中聚戊烯醇含量高，其浸膏中聚戊烯醇的含量也高于老树叶，同时根据我们以前的研究，银杏苗叶中萜内酯和黄酮苷等其它有效成分的含量都较老树叶高，为目前GBE生产用的主要原料。

因此本发明实施方案中，考虑银杏叶的综合利用，优选苗叶作为生产用叶，其聚戊烯醇＞0.8％，黄酮甙＞1.0％，萜内酯＞0.25％。

表2.不同浸提方式下亲脂性溶剂对聚戊烯醇浸提结果

序投料量浸膏得率聚戊烯醇含量浸出率

浸提方式浸提条件

号 (g) (％) (％) (％)

3-8hr

1 索氏提取 300 6.0 16.8 77.5

60～70℃

2hr-5hr

2 热回流 300 4.4 16.2 54.8

80℃

4hr-6hr

3 热回流 300 5.06 14.3 55.7

50℃

4天/1

4 室温冷泡 300 3.4 27.1 70.9

天

2天/1

5 室温冷泡 300 1.8 34.2 47.4

天

表3.亲脂性溶剂抽提物软膏的皂化和萃取结果

序软膏重量聚戊烯醇萃取物收率

叶源皂化方式

号 (g) (％)

1 邳州苗叶 15 NaOH-EtOH 38

泰兴老树

2 200 NaOH-EtOH 50.5

青叶

泰兴老树

3 140 NaOH-EtOH 56

黄叶

4 邳州苗叶 10 NaOH-H₂O 31

表4.聚戊烯醇精制产品

序号叶源产品得率(％) 聚戊烯醇含量(％)

1 邳州苗叶 0.7～1.0 ＞75

2 郯城苗叶 0.7～1.0 ＞75

3 邳州苗叶 0.8～1.3 50～70

4 泰兴老树叶 0.5～0.6 40～50

5 邳州苗叶 0.3～0.6 ＞90

在本发明制备银杏叶提取物的实施方案中，离心沉降是将亲水性溶剂提取的浓缩物(比重为1.10-1.20)用水稀释至原银杏叶重量的3-6倍进行离心，去除不溶物。树脂吸附是将离心沉降后的澄清液用大孔吸附树脂(D101、D201、D130、AB-8)和聚酰胺树脂等介质进行吸附和解附，优选D130、AB-8和聚酰胺等树脂，分离制备银杏叶提取物。解附所用的洗脱液用脂肪族低级醇和水的混合溶剂，醇与水的比例为10％-80％，优选乙醇；有机萃取是用极性较小或非极性溶剂对柱层析解附液进行萃取，萃取剂为C₅-C₇的脂肪烷烃、石油醚(60℃-90℃)、乙醚和氯仿等；极性较小溶剂是指乙酸乙酯、乙醚、丁醇和丁酮等。优选氯仿、正己烷、乙醚、乙酸乙酯等。目的是控制GBE产品中的有机酚酸小于5ppm。干燥是对萃取后的水层进行浓缩、真空干燥或喷雾干燥。产品为银杏叶提取物(GBE)，其中黄酮甙＞24％，萜内酯＞6％，银杏酸＜5ppm。

本发明的另一目的是提供按本发明制备的银杏叶聚戊烯醇，作为主要的生物活性成分，用于抗肿瘤和辅助化疗肿瘤制剂。

按本发明方法制备的银杏叶聚戊烯醇属桦木聚戊烯醇型，其化学结构如下：

ω-单元 trans-单元 cis-单元 α-单元

其中m＝2，n＝11-18，简写为ω-(trans)_m-(cis)_n-α。

本发明制备的聚戊烯醇制品以聚戊烯基单元数为17(C₈₅)、18(C₉₀)的聚戊烯醇为主，其中C₈₅为25-30％，C₉₀为30-40％，C₉₀和C₈₅之和约60-70％左右。不同链长聚戊烯醇的相对含量如下：

C₇₅：0-3％， C₈₀：5-10％， C₈₅：25-30％， C₉₀：30-40％，

C₉₅：15-20％， C₁₀₀：3-8％， C₁₀₅：3-5％， C₁₁₀：0-3％.

银杏叶聚戊烯醇与人体中多萜醇(Dolichol)结构和组成相似，在体内能代谢为多萜醇磷酸酯(Dolichyl phosphate)，参与细胞膜糖蛋白的生物合成。人体中多萜醇磷酸酯不足，将影响机体的免疫功能、细胞分裂和再生，并导致癌变。肿瘤病人的血、尿中多萜醇含量明显高于正常人。

在聚戊烯醇生物活性方面，拉脱维亚和俄罗斯报道了从欧洲赤松、云杉等针叶(RU2,053,992和GB2,310,138)分离制备的聚戊烯醇的毒药理研究结果，开发了聚戊烯醇制剂“ROPREN”，用于免疫功能调节。俄罗斯专利RU2005475还报道了利用西佰利亚云杉针叶聚戊烯醇合成聚戊烯醇磷酸酯，用于制备抗病毒药物。银杏叶聚戊烯醇组成和针叶聚戊烯醇有所不同，关于银杏叶聚戊烯醇的制剂和药效未见报道。

用本发明制备的聚戊烯醇进行的毒、药理研究表明，银杏叶聚戊烯醇无毒，其小鼠急性经口毒性试验结果表明，雌雄小鼠LD₅₀值大于21.5g/kg，属无毒级；对移植性肿瘤具有明显的抑制作用，与化疗常用药联合使用，可提高抑瘤率，可用作肿瘤的防治和辅助化疗药。

聚戊烯醇为脂溶性油状物，其剂型可为软胶囊、口服液、注射液、乳剂等，优选软胶囊和乳剂。

以下所述实施例，详细说明了本发明。

实例1

取干燥银杏叶5kg，加60kg石油醚(60℃-90℃)，热回流提取，时间4小时，第二次提取加30kg石油醚(60℃-90℃)，重复以上操作。合并提取液，50℃下减压回收尽溶剂，得石油醚(60℃-90℃)抽提物220g，加3L25％NaOH-EtOH溶液，70℃下反应3小时，回收尽乙醇，加水至3L，用石油醚和乙醚的混合溶液2L萃取，重复4次，合并萃取液，回收溶剂，得浓缩物75g；再分别用0.5L石油醚、乙醇和丙酮溶解，过滤去除不溶物，回收溶剂，得浓缩物48g，为聚戊烯醇粗品(50％-75％)。将粗品进行柱层析，取氧化铝0.2kg和硅胶0.5kg，分别用0.8L石油醚和乙醚及丙酮洗脱，将石油醚和乙醚洗脱液进行活性炭脱色，回收溶剂，浓缩物为淡棕色油状物，即为聚戊烯醇精制品30g(75％-95％)。

将石油醚提取后的银杏叶，加50kg50％乙醇水溶液，加热回流，温度为80-90℃，时间3小时，过滤，第二次提取加30kg50％乙醇水溶液，时间2小时，合并滤液，65℃下减压浓缩至比重为1.20，加水至30kg，离心沉淀，澄清液用5kgD130大孔树脂进行吸附，分别用15kg水、10kg20％乙醇-水、5kg70％乙醇-水洗脱，65℃下减压浓缩回收溶剂。将低浓度醇洗脱液浓缩至无醇味，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂为乙酸乙酯浓缩物；再将高浓度醇洗脱液的浓缩物和乙酸乙酯浓缩物合并，用3L氯仿和正己烷萃取3次，水层浓缩后进行喷雾干燥，产品为淡黄色粉末130g，即为银杏叶提取物(GBE)，其中黄酮甙＞24％，萜内酯＞6％，银杏酸＜5ppm。

实例2

取干燥银杏叶1kg，加10kg石油醚(60℃-90℃)，室温冷浸静泡3天，第二次加1kg石油醚(60℃-90℃)，重复以上操作。合并提取液，50℃下减压回收尽溶剂，得石油醚(60℃-90℃)抽提物30g，加0.2L35％NaOH-H₂O溶液，70℃下反应4小时，回收尽乙醇，加水至0.5L，用石油醚和乙醚的混溶液0.3L萃取，重复4次，合并萃取液，回收溶剂，得浓缩物11g；再分别用0.5L石油醚、乙醇和丙酮溶解，过滤去除不溶物，回收溶剂，得浓缩物7.6g，为聚戊烯醇粗品(50％-75％)。将粗品进行柱层析，取氧化铝50g和硅胶50g，分别用100ML石油醚和乙醚及丙酮洗脱，将石油醚和乙醚洗脱液进行活性炭脱色，回收溶剂，浓缩物为淡棕色油状物，即为聚戊烯醇精制品4g(75％-95％)。

将石油醚提取后的银杏叶渣转移到提取罐，加入45％乙醇水溶液8L，加热回流，温度为80-90℃，时间3小时，过滤，第二次提取加6L25％乙醇水溶液，时间2小时，合并滤液，65℃下减压浓缩至比重为1.20，加水至4L，离心沉淀，澄清液用1kgAB-8大孔树脂和0.5kg聚酰胺树脂吸附，分别用2L水、2L20％乙醇-水、1L70％乙醇-水洗脱，65℃下减压浓缩回收溶剂。将低浓度醇洗脱液浓缩至无醇味，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂为乙酸乙酯浓缩物；再将高浓度醇洗脱液的浓缩物和乙酸乙酯浓缩物合并，用0.5L氯仿和正己烷萃取3次，水层浓缩后进行喷雾干燥，产品为淡黄色粉末20g，即为银杏叶提取物(GBE)，其中黄酮甙＞24％，萜内酯＞6％，银杏酸＜5ppm。

实例3

取干燥银杏叶2kg，加正己烷20kg，在60℃-80℃温度下用索氏提取装置提取6-8小时，提取液50℃下减压回收尽溶剂，得正己烷抽提物105g，加1.2L15％KOH-EtOH溶液，70℃下反应2小时，冷却，用正己烷1L萃取，重复4次，合并萃取液，回收溶剂，得浓缩物44g；再分别用0.5L正己烷、乙醇和丙酮溶解，过滤去除不溶物，澄清液通过装有硅胶(0.5kg)的填充柱进行柱层析，用1L正己烷洗脱，洗脱液中加入0.2kg的活性炭，静置半小时，过滤，50℃下减压浓缩正己烷溶液，其浓缩物为淡黄色油状物12g，即为银杏叶聚戊烯醇精制品(75％-95％)。

剩下的叶渣，用于制备银杏叶提取物(GBE)，其方法同实例2。精制得60g浅黄色粉末，即为银杏叶提取物(GBE)，其中黄酮甙＞24％，萜内酯＞6％，银杏酸＜5ppm。

银杏叶聚戊烯醇的药效试验结果如下：

一.银杏叶聚戊烯醇抗移植性肿瘤的药效作用

1.1供试样品

银杏叶聚戊烯醇为橙黄色油状液体，聚戊烯醇活性成分的含量大于75％，生产批号991218，简写为GP-1。加少量吐温80，边研磨边加蒸馏水配制成所需浓度。

1.2材料

氟脲嘧啶(5-Fu)，南通制药厂生产，批号991018；盐酸阿霉素注射液(ADM)，深圳万乐药业有限公司制造，批号0001E2；环磷酰胺(CTX)，上海华联制药厂，批号000312；顺铂(PDD)，齐鲁制药厂，批号000201。以上试剂均以蒸馏水配制，4℃保存备用。

1.3受试动物

ICR小鼠雌雄各半，体重18-22克，由江苏省肿瘤防治研究所动物房提供，动物合格证号：苏动质字第97005号。

1.4小鼠移植性肿瘤模型

肝癌实体型Heps，肉瘤S₁₈₀，艾氏癌实体型EC，均由中国科学院上海药物研究所提供，由江苏省肿瘤防治研究所动物房传代保种。

1.5实验方法

取健康、肿瘤生长旺盛的荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，无菌条件下取出瘤块，制备成单细胞悬液，调节细胞浓度为1×10⁸/ml，接种于健康小鼠右前肢下，每只0.2毫升。接种后24小时随机分组，分对照组(给予相应溶媒)，给药组(给予不同剂量的GP-1)和阳性对照组(5-Fu或ADM)并开始分别灌胃给药(ig)，每日给药一次，连续8～10日，停药24小时后处死小鼠，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重，对照组平均瘤重1克以上可进行结果分析。按公式计算抑瘤率，t检验统计处理。抑瘤率≥30％以上判断为有一定的抗癌作用。

抑瘤率＝(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％

1.6结果

1.6.1银杏叶聚戊烯醇(GP-1)对小鼠移植性肝癌Heps的抑制作用

以80mg/Kg，40mg/Kg，20mg/Kg和10mg/Kg灌胃给药，结果如表5.

表5 GP-1对小鼠移植性肝癌Heps的抑制作用(n＝30)

分组药物剂量给药体重变化 (克) 瘤重(克) 抑瘤

mg/kg× 途径给药前给药后 x±S 率

d (％)

H₂O 25×8 ig 19.8±1.5 26.0±4.8 2.8±0.54

GP-1 80×8 ig 119.2±1.7 26.1±4.4 1.88±0.51^** 33.80

GP-1 40×8 ig 19.1±1.3 23.3±2.9 1.71±0.63^** 39.79

GP-1 20×8 ig 19.1±1.8 25.1±4.7 2.19±0.48^* 22.89

5-Fu 25×8 ig 19.1±1.8 25.1±4.7 1.04±0.19^** 61.94

H2O 25×8 ig 18.4±2.7 23.8±3.0 2.42±0.59

GP-1 40×8 ig 18.6±2.8 24.2±2.4 1.63±0.39^** 32.64

GP-1 20×8 ig 18.6±2.3 23.8±2.6 1.77±0.30^** 26.86

GP-1 10×8 ig 18.7±2.6 24.8±2.2 1.62±0.37^** 33.06

5-Fu 25×8 ig 18.2±0.83 19.6±2.2 0.81±0.21^** 66.53

平均值(n＝30)

H2O 25×8 ig 2.93±0.71

GP-1 40×8 ig 1.71±0.56^** 41.6

GP-1 20×8 ig 1.95±0.43^** 33.45

GP-1 10×8 ig 1.96±0.34^** 33.11

5-Fu 25×9 ig 1.21±0.33^** 58.70

H2O 25×9 ig 21.4±2.4 27.1±5.8 3.53±0.90

GP-1 40×9 ig 21.4±2.9 25.0±3.6 1.79±0.64^** 49.29

GP-1 20×9 ig 21.3±2.5 24.5±3.4 1.89±0.49^** 46.46

GP-1 10×9 ig 21.7±2.1 26.2±2.6 2.29±0.45^** 35.13

5-Fu 25×9 ig 21.8±2.2 24.2±2.1 1.77±0.49^** 49.86

^*p＜0.01 ^**p＜0.005

表5实验结果表明：GP-1对移植性肝癌Heps有较好的抑制作用，实验最高抑瘤率达49.29％。给药剂量为40.0mg/kg，20.0mg/kg和10.0mg/kg的三次实验平均抑瘤率分别为40.57％，32.07％和34.11％。从表5看，给药9天较给药8天的抑瘤率更高并呈明显的量效关系，提示用药时间增长，似可提高GP-1对移植性肝癌Heps的抑瘤效果。

1.6.2银杏叶聚戊烯醇(GP-1)对小鼠移植性肉瘤S₁₈₀的抑制作用

GP-1以40mg/Kg，20mg/Kg和10mg/Kg灌胃给药，对移植性肉瘤S₁₈₀的抑制作用见表6.

表6 GP-1对小鼠移植性肉瘤S₁₈₀的抑制作用(n＝10)

分组药物剂给药体重变化(克) 瘤重(克) 抑瘤率

量mg/kg 途径给药前给药后 x±S (％)

×d

H₂O 25×8 ig 19.2±2.2 29.3±2.2 2.02±0.96

GP-1 40×8 ig 19.7±1.6 30.0±2.6 1.2±0.45^** 37.13

GP-1 20×8 ig 19.4±1.4 30.1±3.0 1.28±0.21^* 36.63

GP-1 10×8 ig 19.0±2.0 29.2±2.4 1.08±0.28^* 46.53

5-Fu 25×8 ig 19.8±1.2 24.5±2.5 0.42±0.05^*** 79.21

H₂O 25×8 ig 20.1±3.8 29.9±4.8 2.85±0.59

GP-1 10×8 ig 20.0±3.4 27.4±2.0 1.13±0.52^*** 60.35

GP-1 40×8 ig 21.5±2.0 29.5±4.5 0.70±0.25^*** 60.89

5-Fu 25×8 ig 0.60±0.23^*** 66.48

平均值(n＝10)

H₂O 25×8 ig 2.02±0.96

GP-1 40×8 ig 1.27±0.45^** 37.13

GP-1 20×8 ig 1.28±0.21^* 36.63

GP-1 10×8 ig 1.08±0.28^* 46.53

5-Fu 25×8 0.79±0.28^** 60.81

^*p＜0.01 ^**p＜0.005 ^***p＜0.001

从表6.看三个实验剂量组的GP-1对移植性肉瘤S₁₈₀都有较强的抑制，40mg/Kg和20mg/kg剂量组平均抑瘤率相差不大，均为37％左右，而低剂量组10mg/kg平均抑瘤率可达46.53％，最高时可达60.89％，显示低剂量的抑瘤率更高。

1.6.3银杏叶聚戊烯醇(GP-1)对小鼠移植性艾氏癌EC的抑制作用

GP-1以40mg/Kg，20mg/Kg和10mg/Kg灌胃给药，对移植性艾氏癌EC抑制作用见表7.

表7 GP-1对小鼠移植性艾氏癌EC的抑制作用(n＝30)

分组药物剂量给药体重变化(克) 瘤重(克) 抑瘤

mg/kg×d 途径给药前给药后 x±S 率

(％)

H2O 25×8 ig 19.3±1.8 27.0±1.7 1.43±0.33

GP-1 40×8 ig 19.0±1.1 24.5±2.2 0.72±0.21^** 49.65

GP-1 20×8 ig 19.2±1.6 26.8±2.0 0.96±0.26^** 32.87

GP-1 10×8 ig 19.1±1.6 25.7±2.3 0.93±0.20^*** 34.96

5-Fu 25×8 ig 19.0±1.2 24.4±2.2 0.52±0.16^*** 63.64

平均值(n＝30)

H2O 25×8 ig 1.62±0.61

GP-1 40×8 ig 0.77±0.23^** 52.47

GP-1 20×8 ig 1.08±0.32^** 33.33

GP-1 10×8 ig 0.97±0.32^*** 40.12

5-Fu 25×8 ig 0.56±0.16^*** 65.43

^*p＜0.01 ^**p＜0.005 ^***p＜0.00 1

表7.实验结果表明GP-1对移植性艾氏癌EC抑制作用较强，40mg/Kg，20mg/Kg和10mg/Kg的平均抑瘤率为52.47％、33.33％、40.12％，但量效关系不明显，低剂量10mg/Kg抑瘤率高于20mg/Kg剂量抑瘤率，高剂量组40mg/Kg实验最高抑瘤率达52.47％(p＜0.005)。

上述实验结果表明银杏叶聚戊烯醇(GP-1)对移植性肿瘤Heps，S₁₈₀和EC都有较好的抑制效果，其最高抑瘤率分别为49.29％、60.89％和52.47％，且对S₁₈₀似较敏感。因此GP-1有较强的抗肿瘤作用。

二.银杏叶聚戊烯醇(GP-1)辅助化疗肿瘤作用

1.1受试样品、材料、受试动物、S₁₈₀瘤谱和实验方法见GP-1抗移植性肿瘤的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5。

2.2实验结果

选择临床常用化疗药如盐酸阿霉素(ADM)、环磷酰胺(CTX)和顺铂(PDD)对移植性肿瘤肉瘤S₁₈₀进行抑瘤实验，同时分别联合银杏叶聚戊烯醇(GP-1)对移植性肿瘤肉瘤S₁₈₀进行抑瘤实验，结果如表8。

表8 GP-1联合化疗药对移植性肿瘤肉瘤S₁₈₀的抑瘤作用(n＝10)

分组药物剂量给药瘤重(克) 抑瘤抑瘤提高

mg/kg×d 途径 x±S 率(％) 率(％)

H2O 25×8 ig 1.85±0.59

GP-1 10×8 ig 1.13±0.52^** 60.35

GP-1+ADM (20+1)×8 ig 0.65±0.26^*** 77.10 8.90

GP-1+ADM (10+1)×8 ig 1.04±0.30^*** 63.51

ADM 1×8 ig 0.83±0.35^*** 70.88

H2O 25×10 ig 2.09±0.38

GP-1 5×10 ig 1.30±0.37^*** 37.80

GP-1+CTX (5+25)×10 ig 0.63±0.11^*** 69.89 14.10

GP-1+PDD (5+1)×10 ig 0.83±0.18^*** 60.29 40.01

GP-1+5-Fu (5+25)×10 ig 0.90±0.23^*** 56.94 22.69

CTX 25×10 ig 0.81±0.22^*** 61.24

PDD 1×10 ig 1.19±0.22^*** 43.06

5-Fu 25×10 ig 1.12±0.33^*** 46.41

^*p＜0.01 ^**p＜0.005 ^***p＜0.001

从表8的结果可知，5mg/kg GP-1联合CTX、PDD、5-Fu明显提高对S₁₈₀的疗效(p＜0.001)，尤其是辅助PDD作用更加明显，可使1.0mg/kg PDD抑瘤率从43.06％提高到60.29％。同剂量的CTX、PDD、5-Fu对S₁₈₀抑瘤提高率分别为14.10％、40.01％、22.69％。GP-1与ADM联合化疗可提高ADM的疗效，20.0mg/kg的GP-1可使1.0mg/kg的ADM的抑瘤率从70.88％提高到77.10％(p＜0.001)。

因此，银杏叶聚戊烯醇对移植性肿瘤具有明显的辅助化疗作用。

Claims

1.银杏叶聚戊烯醇的制备方法，其特征是用亲脂性溶剂对银杏叶进行提取、皂化反应、溶剂萃取、沉淀分离和柱层析精制方法制备聚戊烯醇，聚戊烯醇的含量为50％～95％。

2.如权利要求1所述的方法，银杏叶聚戊烯醇具有的分子式为：

ω-单元 trans-单元 cis-单元 α-单元

其中n为11-18。

3.如权利要求1所述的方法，制备银杏叶聚戊烯醇和银杏叶提取物可用3-10年的银杏青叶，银杏叶中聚戊烯醇的含量为0.8％以上，黄酮含量1.0％以上，萜内酯含量0.25％以上；单独制备聚戊烯醇时，可用3年以上树龄的银杏青叶，也可使用20年以上树龄的银杏黄叶，聚戊烯醇含量为0.8％以上。

4.如权利要求1所述的方法，亲脂性溶剂为非极性溶剂，一般为C₅-C₇的脂肪烷烃或石油醚60℃-90℃，亲水性溶剂为极性较大的溶剂，一般为C₁-C₃的脂肪醇或丙酮与水混合溶剂。

5.如权利要求1所述的方法，皂化反应是对亲脂性溶剂抽提物软膏进行皂化，皂化剂为无机强碱的水溶液或醇溶液，碱-水溶液的浓度为3％-50％，碱-醇溶液的浓度为5％-35％，反应温度50℃-80℃，时间为0.5-5小时。

6.如权利要求1所述的方法，溶剂沉淀是用石油醚60℃-90℃、乙醚、乙酸乙酯、丙酮中的一种或几种溶剂对萃取相进行溶解和沉淀，温度为-20℃-50℃，去除不溶物，制备聚戊烯醇粗制品，其聚戊烯醇含量为50％-75％。

7.如权利要求1所述的方法，柱层析分离是用氧化铝、硅胶、硅藻土、活性炭、纤维素中一种或几种介质为填料对聚戊烯醇粗制品进行分离，淋冼剂为C₅-C₇的脂肪烷烃、石油醚60℃-90℃、乙醚、丙酮中的一种或几种，可以单独淋冼也可二种混合溶液淋洗，制备聚戊烯醇精制品，其聚戊烯醇的含量为70％-95％。

8.如权利要求1所述的方法，介质吸附是用大孔吸附树脂和聚酰胺介质中一种或几种进行吸附和解附，有机萃取是对解附液浓缩后进行有机溶剂萃取，所选有机溶剂是指C₅-C₇的脂肪烷烃、石油醚60℃-90℃、乙酸乙酯、乙醚和氯仿。

9.一种银杏叶提取物的制备方法，其特征是：对按照权利要求1所述方法提取了银杏叶聚戊烯醇后所剩下的银杏叶残渣，用亲水性溶剂进行提取、离心沉降、介质吸附、有机萃取和干燥，制备银杏叶提取物，其中银杏黄酮＞24％，萜内酯＞6％，银杏酸＜5ppm。