CN1896092A - 赖氨酸七叶皂苷及其制备方法和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及赖氨酸七叶皂苷化合物的制备、制备方法、用途及其组合物的优选。该类药物组合物含有β－七叶皂苷赖氨酸盐、异七叶皂苷赖氨酸盐或其二者的混合物(即赖氨酸总七叶皂苷)和/或药学上可以接受的载体。本发明的赖氨酸七叶皂苷较临床使用的七叶皂苷钠具有更好的抗炎、抗渗出活性，其治疗指数约是七叶皂苷钠2～5倍，且成倍提高对脑水肿的抑制率；而具有更低毒性，对肌肉仅有轻微刺激作用，不会引起血管静脉炎。赖氨酸七叶皂苷不仅提高了用药安全性，并具有改善血液循环和增加静脉张力的作用。

Description

赖氨酸七叶皂苷及其制备方法和其用途
技术领域
本发明涉及一种低毒性和低刺激性的七叶皂苷赖氨酸盐，及其制备方法和其用途。
背景技术
七叶皂苷钠是从七叶树科七叶树属植物种子提取得到的总皂苷的钠盐。总七叶皂苷(Totalescin)钠应用于临床，含有4种主要成分，我国国家标准按液相色谱出峰先后，依次命名为七叶皂苷A(即日本方面escin Ia)，七叶皂苷B(escin Ib)、七叶皂苷C(isoescin Ia)和七叶皂苷D(isoescin Ia)。七叶皂苷A和B是β-型七叶皂苷，它们的结构基本相同，但与C21-羟基成酯的有机酸不同，是互为正反异构体的巴豆油酸或当归酸，因而七叶皂苷A和B可合并用结构式(1)来表示。七叶皂苷C和D分别是七叶皂苷A和B的C21-羟基上乙酸酯转位至C28-羟基的异构体；七叶皂苷C和D也互为异构体，是Crypto-型(异型)七叶皂苷，可合并用结构(2)来表示。
Figure A20051010558500051
Figure A20051010558500061
总七叶皂苷是同时含有β-七叶皂苷和异七叶皂苷的物质，具有抗炎抗渗出和改善血液循环的作用，已广泛用于治疗各种原因引起的脑水肿，创伤性水肿，静脉回流障碍和烧伤等。但因七叶皂苷钠对肌肉和黏膜刺激作用极强，不能用于肌肉注射，静脉反复给药时，也易引起静脉炎，又因LD50比较小，Ti(相对治疗指数)仅为5左右，治疗剂量和中毒剂量比较接近，限制了该药在临床上应用。文献CN1575797A公开了使用七叶皂苷治疗手术后肠功能恢复。文献CN1548052A公开了使用七叶皂苷治疗肺部急性炎症和水肿。
在此基础上，又有多篇文献公开了对七叶皂苷化合物的结构修饰和通过异构体成分的组合应用。日本特开平10-17591公开了β-七叶皂苷的抗炎应用。CN1073573C在此基础上从β-七叶皂苷中分离出了具有低毒性的两个在糖基上异构化的单一化合物。CN1156278C公开了含有β-七叶皂苷和异-七叶皂苷异构体。CN1376675A公开了通过在七叶皂苷的基础上，用精氨酸盐与七叶皂苷成盐后以解决化合物溶解性和降低其血管痉挛的毒性。
文献(Arzneim-Forsch 20(2)209～215，1970)用实验表明β-七叶皂苷在向异七叶皂苷异构化过程中，一方面活性降低，其毒性也按比例降低，当β-型和异型七叶皂苷的浓度比到达6∶4～5∶5范围时(即α-七叶皂苷)，该混合物对大鼠蛋清所致脚爪肿有与β-七叶皂苷相等的治疗指数；对烧伤肿胀，则比β-七叶皂苷高近1倍，文献因此认为两类皂苷共存时活性有叠加作用。
目前仍缺乏一种能在保证七叶皂苷活性的基础上，生产更低毒性和刺激性更小化合物的解决方法。
发明内容
我们将七叶皂苷与赖氨酸成盐以减轻七叶皂苷毒性和刺激性，提供了结构式(I)和结构式(II)的化合物。
本发明一方面提供了一种结构式(I)所示的赖氨酸β-七叶皂苷化合物以及结构式(II)所示的赖氨酸异七叶皂苷化合物。
Figure A20051010558500071
Figure A20051010558500081
本发明同时利用β-七叶皂苷和异-七叶皂苷共存时的叠加作用，制得赖氨酸β-七叶皂苷和赖氨酸异七叶皂苷的混合物，又称赖氨酸总七叶皂苷。为了降低毒性和提高药物活性，可将赖氨酸总七叶皂苷中的赖氨酸β-七叶皂苷与赖氨酸异七叶皂苷的重量比控制在3-9∶7-1，优选重量比为5-8∶5-2，更优选为5∶5～6∶4，最好为6∶4。
可通过以下方法制备获得赖氨酸β-七叶皂苷、赖氨酸异七叶皂苷和赖氨酸总七叶皂苷。所述方法包括以下步骤：
1)将β-七叶皂苷、异七叶皂苷或总七叶皂苷溶解；所述溶解过程是指：将β-七叶皂苷、异七叶皂苷或总七叶皂苷粉末中加入蒸馏水，再加入L-赖氨酸至溶液澄清。
2)用L-赖氨酸溶液调节pH值至5.0～7.5，优选pH为5.0～7.0，更优选pH为5.0～6.0，最优选pH为5.5左右，再加入乙醇，使溶液的含醇量达到至少70％，优选达到至少80％。
3)将步骤2)所得到醇溶液进行浓缩。可根据赖氨酸七叶皂苷的理化性质来选择浓缩温度，其浓缩的温度不宜过高，温度过高易导致形成的盐分解。因此，可选择条件温和的工艺方法进行浓缩，例如真空干燥浓缩方法，以容易实现在较低的温度下或在较短时间内完成浓缩。较好的浓缩温度控制在50℃以下，最好控制在40℃以下。在浓缩后的样品中加入无水乙醇得到混合物，处理该混合物得到七叶皂苷的赖氨酸盐。所述处理过程可通过本领域常规的方法得到其固体盐，例如，降低温度冷藏放置析出固体盐、加入晶种结晶或冷冻干燥获得赖氨酸盐粉末等。
比较七叶皂苷钠与赖氨酸七叶皂苷的药理毒理作用，七叶皂苷赖氨酸盐不仅能增加化合物的抗炎抗渗出活性，且能降低化合物的毒性和刺激性，使其治疗指数得到显著提高。因此，本发明同时提供了赖氨酸β-七叶皂苷、赖氨酸异七叶皂苷和/或赖氨酸总七叶皂苷在制备药物中的用途；所述药物具有低刺激、高治疗指数的特性，并具有抗炎、抗渗出和改善血液循环的疗效，例如可用于治疗脑水肿、创伤性水肿、静脉回流障碍、烧伤、手术后肠功能恢复、肺部急性炎症或水肿。本发明通过使用赖氨酸成盐降低其刺激性和毒副作用，因而，还可将其制备成软膏、喷雾剂或凝胶剂等制剂，并可用以处理外伤伤口。
本发明进一步提供一种药物组合物，所述的药物组合物含有赖氨酸β-七叶皂苷、赖氨酸异七叶皂苷和/或赖氨酸总七叶皂苷和药物载体，所述的药物载体选自谷胱甘肽、盐酸赖氨酸、人白蛋白或甘露醇中的一种或几种，优选药物载体为谷胱甘肽或盐酸赖氨酸；优选β-七叶皂苷、赖氨酸异七叶皂苷和/或赖氨酸总七叶皂苷与药物载体的重量比为3～10∶1，更优选重量比为6∶1。β-七叶皂苷、赖氨酸异七叶皂苷和/或赖氨酸总七叶皂苷与药物载体的联合应用，不仅可降低化合物的毒性，且药物载体能提高血脑屏障通透性，很好携带化合物透过血脑屏障，使药物进入脑内，以用于治疗脑部炎症、脑部渗出或脑水肿。
本发明的另一方面是提供一种药物组合物，含有赖氨酸β-七叶皂苷、赖氨酸异七叶皂苷和赖氨酸总七叶皂苷和药学上可接受的载体。该药物的剂型可根据本领域公知的制备药物剂型的方法制备。本发明进一步涉及适用于肠内(例如口服或直肠给药)、局部和肠胃外给药、或通过吸入喷雾向哺乳动物(包括人)给药的药物组合物，例如口服、注射、植入、外用等形式。其中口服包括片剂、胶囊剂、丸剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂等形式。注射剂包括注射液、注射用无菌粉末或无菌块状物、注射用浓溶液。特别是由于降低了药物刺激性，使不适宜直接作用于外伤伤口的七叶皂苷可直接用于外伤伤口，用于治疗外伤创伤性伤口炎症、渗出、水肿等功效，因此，本发明所提供的药物制剂还可制成常规的外用制剂，例如喷雾剂、膜剂、凝胶剂、贴剂等制剂形式。
本发明所述的药物剂量或重量比均按照相应的七叶皂苷作为计量标准进行纵向比较而得，如将总七叶皂苷或其盐进行比较时，就以总七叶皂苷为计量标准；如将β-七叶皂苷或其盐进行比较时，就以β-七叶皂苷为计量标准；如将异七叶皂苷或其盐进行比较时，就以异七叶皂苷为计量标准。
具体实施方式
以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。
实施例1β-七叶皂苷和异-七叶皂苷的制备
1.胆固醇沉淀法
娑罗子细粉，用5倍量、浓度为50％～70v/v％稀乙醇搅拌提取三次，每次4小时，收集合并提取液，真空回收乙醇至一定体积，用高效液相色谱法测定提取浓缩液中β-七叶皂苷含量，然后以β-七叶皂苷∶胆固醇1∶1.2比例，在搅拌下加入胆固醇，加完后再搅拌2小时，放置过夜，次日收集胆固醇沉淀物，用水洗至无色，用离心机滤集并经60℃烘干。沉淀物干后用氯仿或甲苯处理，使胆固醇溶入溶剂中，而七叶皂苷的盐(钠、钾盐)仍以固态形式存在。挥去残留溶剂后，用水溶解，通过氢型阳离子交换树脂柱，得乳白色胶体液，按溶液体积加入0.5％醋酸，冷藏，析出结晶，滤集后，用少量冷蒸溜水洗去醋酸，得以结构式(1)表示的β-七叶皂苷结晶，经多批不同原料试验收率为0.8～1.3％，其含量为90～95％。如将其再用快速液相色谱按2法条件制备分离，可得以结构式(1)表示的β-七叶皂苷的纯品，其含量为99.1％，理化特征见2法。
滤去胆固醇沉淀物的溶液，和滤除β-七叶皂苷后溶液合并，通过D101大孔吸附树脂柱，用水洗去醋酸、无机盐、色素后，用乙醇洗脱真空回收乙醇，冷藏，析出结晶，得率为0.2～0.7％，含量为88～93％。如将其再用快速液相色谱按2法条件制备分离得以结构式(2)表示的异七叶皂苷纯品，其含量为98.8％，理化特征见2法。
2.液相色谱法
流动相为甲醇-1％醋酸水液(7∶3)，将总七叶皂苷钠溶于流动相中，上反相ODS柱，用流动相进行高效液相色谱或快速液相色谱的制备分离。按七叶皂苷钠国家标准所述顺序依次截取七叶皂苷A和七叶皂苷B部位，以及七叶皂苷C和七叶皂苷D部位。前者含有以结构式(1)表示的β-七叶皂苷，后者含有以结构式(2)表示的异七叶皂苷。取两个部位收集液，分别真空蒸溜，除去甲醇。
将β-七叶皂苷部位浓缩液在冷处放置，析出结晶，滤集，用蒸溜水洗涤，40℃真空干燥，得β-七叶皂苷。其理化特征如下：
mp.223～225℃
FAB-MS(m/z)1153(M+Na)+
13C-NMR(δ/ppm)：91.2(C3)，122.6(C12)，142.8(C13)，79.2(C21)，74.5(C22)，64.0(C28)；171.8(C6′)，171.0(C1″″)。
1H-NMR(δ/ppm)：5.38(H-12)，4.42(H-16β)，2.97(H-18)，6.49(H-21)，6.13(H-22)
将异七叶皂苷部位浓缩液进行D101大孔吸附树脂柱层析，吸附后，用蒸溜洗涤树脂柱，除去醋酸或醋酸钠后，用乙醇洗脱，洗脱液在50℃以下真空蒸去乙醇，得异七叶皂苷。其理化特征如下：
mp.217～219℃
FAB-MS(m/z)：1153(M+Na)+
13C-NMR(δ/ppm)：91.2(C3)，122.8(C12)，142.8(C13)，81.6(C21)，71.5(C22)，66.5(C28)；171.8(C6′)，170.6(C1)。
1H-NMR(δ/ppm)：2.82(H-18)，4.47(H-22)，4.72(H-16β)，5.44(H-12)。
实施例2赖氨酸β-七叶皂苷和赖氨酸异-七叶皂苷的制备
(1)赖氨酸β-七叶皂苷的制备
将β-七叶皂苷结晶磨细，取细粉56.55g(0.05mol)，蒸溜水500ml，置1000ml三颈瓶中，在搅拌下缓缓加入L-赖氨酸溶液[50ml蒸溜水中含7.31g L-赖氨酸(0.05mol)]，β-七叶皂苷完全溶解后，用剩余赖氨酸溶液调节溶液pH至5.5～7.5(总消耗L-赖氨酸0.049mol)，然后将溶液加无水乙醇，使含醇量达80％，在50℃以下真空浓缩至约100ml，再加无水醇500ml，再真空浓缩成200ml，冷藏，得赖氨酸β-七叶皂苷57.95g，得率为90.7％，含量经液相色谱测定为99.5％。理化特征：
mp.217～219.5℃
13C-NMR(δ/ppm)：91.2(C3)，122.5(C12)，142.8(C13)，79.1(C21)，74.3(C22)，64.2(C28)，171.2(C6′)(以上是皂苷部分)。175.4是赖氨酸的羧基碳的化学位移。
(2)赖氨酸异七叶皂苷的制备
取异七叶皂苷56.55g(0.05mol)，蒸溜水200ml置500ml三颈瓶中，在搅拌下缓缓滴入L-赖氨酸溶液[50ml蒸溜水中含有7.31gL-赖氨酸(0.05mol)]，溶液澄清后，用剩余的L-赖氨酸溶液调节pH至5.5～7.5(约需L-赖氨酸0.049mol)加无水乙醇，使含醇量达约90％，在50℃以下温度，真空浓缩至约50ml，加无水乙醇300ml，冷藏，得赖氨酸异七叶皂苷49.84g，收率为78.1％，经用液相色谱测定，含量为98.9％。其理化特征如下：
mp.209～213℃
13C-NMR(δ/ppm)：91.2(C3)，122.6(C12)，142.7(C13)，81.6(C21)，71.6(C22)，66.6(C28)，171.8(C6′)，170.6(C1)，以上是皂苷部分。175.4是赖氨酸羧基碳的化学位移。
(3)赖氨酸总七叶皂苷的制备
取总七叶皂苷钠115.2g(0.1mol)，配成1∶10的蒸溜水溶液，通过氢型阳离交换柱后，得到游离的七叶皂苷乳浊液，用蒸溜水洗净树脂柱，洗液合并于原乳浊液中，在搅拌下，将L赖氨酸缓缓加入，使pH至5.5～7.5，约需消耗赖氨酸14.3g(0.098mol)，反应完毕后，将溶液滤过，滤液加无水乙醇使含醇量达80％，在50℃真空浓缩成约300ml，再加无水乙醇800ml后真空浓缩成500ml，冷藏，得类白色赖氨酸总七叶皂苷118.5g，得率按理论量计算为92.7％。成品含量为98.5％，mp.为215～217℃。
(4)用冻干法制备赖氨酸β-七叶皂苷和赖氨酸总七叶皂苷
取β-七叶皂苷(或总七叶皂苷)113.1g(0.1mol)，蒸溜水1000ml，置反应瓶中，在搅拌下，缓缓加入L-赖氨酸溶液[50ml蒸溜水中含L-赖氨酸14.62g(0.1mol)]使β-七叶皂苷(或总七叶皂苷)完全溶解成澄清溶液后，调节pH至5.5～7.5，冷冻干燥后，得类白色赖氨酸β-七叶皂苷(或赖氨酸总七叶皂苷120.1g)粉末121.4g，收率为95.1％(或赖氨酸总七叶皂苷收率93.8％)。冷冻曲线如下：-45℃预冻6小时；-45℃抽真空2小时；-35℃抽真空2小时；-20℃抽真空2小时；-10℃抽真空4小时；-5℃抽真空4小时；0℃抽真空4小时；10℃抽真空2小时；20℃抽真空2小时；30℃抽真空1小时；40℃抽真空1小时。
(5)用喷雾干燥法制备赖氨酸β-七叶皂苷和赖氨酸总七叶皂苷
按冻干法(4)的方法配制赖氨酸β-七叶皂苷溶液或赖氨酸总七叶皂苷溶液(比重在1.1以上)，将溶液进行喷雾干燥，预热器温度为280℃，干燥室温度为120℃。
实施例3
赖氨酸总七叶皂苷                        10mg
注射用水                                适量
将赖氨酸总七叶皂苷用注射用水溶解，按冻干粉针剂的常规工艺冻干即得。
实施例4
赖氨酸β-七叶皂苷                    10mg
注射用水                             适量
采用实施例1的方法制成冻干粉针剂。
实施例5
赖氨酸β-七叶皂苷                    9mg
赖氨酸异七叶皂苷                     1mg
注射用水                             适量
采用实施例1的方法制成冻干粉针剂。
实施例6
赖氨酸β-七叶皂苷                    6mg
赖氨酸异七叶皂苷                     4mg
注射用水                             适量
采用实施例1的方法制成冻干粉针剂。
实施例7
赖氨酸总七叶皂苷                     10mg
盐酸赖氨酸                           30mg(或60或100mg)
注射用水                             适量
采用实施例1的方法制成冻干粉针剂。
实施例8
赖氨酸总七叶皂苷                     10mg
谷胱苷肽                             30mg(或100mg)
注射用水                             适量
采用实施例1的方法制成冻干粉针剂。
实施例9
赖氨酸总七叶皂苷                        10mg
生理盐水                                2ml
采用常规注射液制备方法制成。
实施例10
赖氨酸β-七叶皂苷                       7mg
赖氨酸异七叶皂苷                        3mg
谷胱苷肽                                50mg
生理盐水                                2ml
采用常规注射液制备方法制成。
实施例11
赖氨酸总七叶皂苷或赖氨酸β-七叶皂苷     20mg(或10mg)
淀粉                                    50mg(或20mg)
硬脂酸镁                                5mg
实施例12
赖氨酸总七叶皂苷或赖氨酸异七叶皂苷      10mg
0.9％生理盐水                           1000ml
按滴眼剂常规生产工艺配成滴眼液。
实施例13
赖氨酸总七叶皂苷或赖氨酸β-七叶皂苷     10g
凝胶赋形剂                              适量
制成                                    1000g
将上述活性成分，加入凝胶赋形剂，制备得到其凝胶剂。
以下通过药理活性测试试验来验证本发明化合物的优异抗炎活性和较低毒性。
试验例1.抗炎活性的比较测定
试验动物25～30g健康雄性昆明小鼠。
给药途径  静脉注射0.4ml。
溶剂  生理盐水溶液。
剂量与分组  每个样品按等比级数分成4个剂量组，剂量范围为0.125～1.00mg·kg-1或0.075～0.60mg·kg-1，本发明所述的药物剂量均按照相应的七叶皂苷作为计量标准进行纵向比较，并设等体积生理盐水作为空白对照组。
试验方法  每组10只或12只小鼠，分别注射不同剂量的药物溶液或生理盐水，30分钟后，每鼠右耳涂抹二甲苯0.06ml，再过2小时后，依次处死小鼠，用9.00mm打孔器打下双耳圆片，称重，求出各鼠的肿胀度(右耳减去左耳重)，结果如表1～表6。
(1)总七叶皂苷钠与赖氨酸总七叶皂苷钠的抗炎活性比较，参见表1和表2。
                        表1总七叶皂苷钠的抗炎活性
  剂量(escin计)(mg·kg-1)   动物数(n)   肿胀值[X±S(mg)]   抑制率(％)   ED50(p＝0.95)(mg·kg-1)
  1.000.500.250.1250.4ml NS.   1010101010   8.2±3.6210.31±4.5412.24±4.6714.94±4.2318.16±4.82   54.8***43.2**32.6*17.7△/ 0.74(0.88～0.62)
备注：与空白对照组比较，△示P＞0.05  *示P＜0.05  **示P＜0.01  ***示P＜0.001。
                        表2赖氨酸总七叶皂苷抗炎活性
  剂量(escin计)(mg·kg-1)   动物数(n)   肿胀值[X±S(mg)]   抑制率(％)   ED50(p＝0.95)(mg·kg-1)
  1.000.500.250.1250.4ml NS.   1212121212   8.14±3.2511.82±2.9514.29±2.6916.20±1.9221.21±2.49   61.6***44.3***32.6***23.6***/ 0.54(0.82～0.44)
备注：与空白对照组比较△示p＞0.05；*示p＜0.05，**示p＜0.01；***示p＜0.001。
(2)β-七叶皂苷钠与赖氨酸β-七叶皂苷的抗炎活性比较，参见表3和表4。
                            表3β-七叶皂苷钠的抗炎活性
  剂量(β-七叶皂苷计)(mg·kg-1)   动物数(n)   肿胀值(X±S，mg)   抑制率(％)   ED50(p＝0.95)(mg·kg-1)
  0.600.300.150.0750.4ml NS   1010101010   9.25±3.0112.78±2.8315.75±2.5917.18±1.8820.91±2.31   55.8**38.8**24.7**17.8*/ 0.497(0.69～0.36)
                        表4赖氨酸β-七叶皂苷的抗炎活性
  剂量(β-七叶皂苷计)(mg.kg-1)   动物数(n)   肿胀值(X±S，mg)   抑制率(％)   ED50(p＝0.95)(mg·kg-1)
  0.600.300.150.0750.4ml NS   1010101010   8.02±2.2511.71±2.3114.14±2.3916.12±2.0121.12±1.96   62.0***44.6***33.0**23.7**/ 0.35(0.56～0.21)
备注：与空白对照相比，*示P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
(3)异七叶皂苷钠与赖氨酸异七叶皂苷的抗炎活性比较，参见表5和表6。
            表5异七叶皂苷钠的抗炎活性(剂量以异七叶皂苷计)
  剂量(mg·kg-1)   动物数(n)   肿胀值(X±S，mg)   抑制率(％)   ED50(mg·kg-1)
  248160.4ml NS   1010101010   16.02±2.12*14.13±1.91**10.21±1.87***8.16±2.01***20.86±1.85   23.2032.2651.0560.88/ 8.70
                表6赖氨酸异七叶皂苷的抗炎活性(剂量以异七叶皂苷计)
  剂量(mg·kg-1)   动物数(n)   肿胀值(X±S，mg)   抑制率(％)   ED50(mg·kg-1)
1.53.06.01200.4ml NS 1010101010 15.28±2.21*12.62±2.31**10.02±1.98***7.59±2.33***19.92±1.93 23.3236.6449.7061.89/ 6.18
备注：*示P＜0.05  **示P＜0.01  ***示P＜0.001
结论：从抗炎试验的三对比较结果来看，赖氨酸盐与钠盐比较，可以提高七叶皂苷活性约30％左右，这为降低七叶皂苷用药剂量提供了空间，有利于减少副作用。
试验例2.谷胱甘肽对赖氨酸总七叶皂苷抗炎活性的提高
将谷胱甘肽∶赖氨酸总七叶皂苷的重量比为1∶1进行混合，将混合后的药物按试验例1中测定抗炎活性的方法进行抗炎活性的测定。
表7谷胱甘肽对赖氨酸总七叶皂苷抗炎活性的影响
  剂量(七叶皂苷计)(mg·kg-1)   动物数(n)   肿胀值(X±S，mg)   抑制率(％)   ED50(p＝0.95)(mg·kg-1)
  0.9000.4500.2250.1120.4ml NS   1010101010   ***6.20±1.89**9.01±1.42**9.52±2.12*12.01±3.7215.42±2.96   59.841.638.322.1/ 0.5(0.89～0.41)
备注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
结论：谷胱甘肽与赖氨酸总七叶皂苷联合用药，可将赖氨酸总七叶皂苷抗炎活性的ED50由0.54降为0.5，从而表现谷胱甘肽与赖氨酸总七叶皂苷联合用药间的协同作用。
试验例3  抗渗出试验
试验动物  23～26g健康昆明小鼠，雌雄各半。
给药途径  静脉注射药物的生理盐水溶液。
给药剂量  0.8-1.5mg·kg-1(以相应的七叶皂苷作为计量标准进行纵向比较)
试验方法  静脉注射药物溶液或生理盐水各0.4ml，1小时后，静脉注射1％伊文思芏生理盐水溶液，同时腹膜内注射1％醋酸溶液0.2ml，20分钟后依次处死小鼠，剪开腹腔，用生理盐水6ml，分次洗涤腹腔，将洗涤液合并，加生理盐水10ml，离心3000rpm×20分钟，取上清液，在590nm处测定吸光度值，结果参见表8。
                    表8各种七叶皂苷组合物的抗渗出试验结果
组别   剂量(mg·kg-1)   动物数(n) 吸光度   抑制率(％)
  总七叶皂苷钠赖氨酸总七叶皂苷   1.51.2   1010   0.2057±0.055**0.1995±0.038**   40.342.1
  谷胱苷肽∶赖氨酸总七叶皂苷(3∶1)赖氨酸β-七叶皂苷谷胱苷肽∶赖氨酸β-七叶皂苷(3∶1)空白对照 1.01.00.8同体积生理盐水 10101010 0.1938±0.042**0.1765±0.052**0.1674±0.046**0.3446±0.086 43.848.751.4/
备注：**与对照组比较P＜0.01
结论：谷胱甘肽作为药物载体与赖氨酸总七叶皂苷或赖氨酸β-七叶皂苷共用，可显著提高其抗渗出活性与抗炎活性，可提高20％左右。
试验例4赖氨酸七叶皂苷对实验性大鼠脑缺血保护作用
试验动物  150～200g健康Wistar大鼠。
给药途径  股静脉注射
给药剂量  以总七叶皂苷计算，剂量为1mg·kg-1，其中Esc-Lys表示赖氨酸总七叶皂苷，Lys.HCl表示盐酸赖氨酸。
试验方法  动物分3组，每组10只。其中一组为脑缺血模型组，一组为治疗组，另一组为假手术对照组。手术前，动物先腹腔注射乌拉坦麻醉(1mg·kg-1)。在双侧颈动脉结扎前5分钟由股静脉注射给药。结扎3小时后将动物处死，断头取脑称重，然后在110℃烘至恒重。按照下述公式计算脑指数和脑含水量：
脑指数＝湿脑重×100/体重；
脑含水量＝(湿重-干重)×100/湿重。
表9赖氨酸总七叶皂苷加3倍量盐酸赖氨酸的组合物对脑缺血保护作用
  组别   剂量  动物数(n)   脑含水量(％)   脑指数
  假手术对照脑缺血模型组总七叶皂苷钠组Esc-Lys∶Lys.HCl(3∶1)   N.SN.S1mg·kg-11mg·kg-1  10101010   74.0±1.680.1±2.2△△77.5±2.2*75.10±1.9**   0.801±0.0310.890±0.034△△0.855±0.036*0.820±0.040**
注：与假手术对照比较：△△P＜0.01，与脑缺血组比较：*P＜0.01  **P＜0.01
结论：盐酸赖氨酸作为药物载体与赖氨酸总七叶皂苷联合用药，可提高药物对脑水肿的抑制率。总七叶皂苷钠对脑水肿的抑制率为42.6％，而赖氨酸总七叶皂苷的脑水肿抑制率为82.0％。
试验例5急性毒性试验
试验剂量  选用4～6个剂量组，组间剂距由预试验结果决定。
给药途径  静脉给药。
试验方法  将动物按体重随机分成5～6个组，每组10～20只，雌雄各半。给药后，观察动物反应情况，记录7天内各组的动物死亡数。结果参见表10-18。
                        表10总七叶皂苷钠的LD50
  剂量(mg·kg-1)   对数剂量(X)   动物数(n)   死亡数(r)   死亡率(％)   概率单位(Y)
  2.052.563.204.005.006.25   0.3120.4080.5050.6020.6990.796   151515151515   1236914   61320406093   3.453.874.164.755.256.48
A＝1.41 B＝5.74 r＝0.9659
Y＝1.41+5.74X
LD50＝4.20mg·kg-1(3.8～4.7mg·kg-1，P＝0.95)
                        表11赖氨酸总七叶皂苷的LD50
  剂量(mg·kg-1)   对数剂量   动物数(n)   死亡数(r)   死亡率(％)   概率单位(Y)
  10.007.004.903.432.40   1.0000.8450.6900.5350.380   1818181818   139631   725033175.5   5.585.004.564.053.45
A＝2.21 B＝3.36 r＝0.9987 Y＝3.36X+2.21
LD50＝6.76mg·kg-1(8.26～5.43mg·kg-1，P＝0.95
                        表12赖氨酸β-七叶皂苷的LD50
  剂量(mg·kg-1)   对数剂量(x)   动物数(n)   死亡数(r)   死亡率(％)   概率单位(Y)
  10.007.004.903.432.40   1.0000.8450.6900.5350.380   1616161616   129631   755638196   5.675.154.694.123.45
A＝2.20 B＝3.50 r＝0.9973 Y＝3.50X+2.20
LD50＝6.27mg·kg-1(5.06～7.83mg·kg-1，P＝0.95)
                                表13β-七叶皂苷钠的LD50
  剂量(mg·kg-1)   对数剂量(x)   动物数(n)   死亡数(r)   死亡率(％)   概率单位(Y)
  5.003.502.451.72   0.6990.5440.3890.234   16161616   12975   75564431   5.675.154.854.50
A＝3.90 B＝2.46 r＝0.9925 Y＝2.46X+3.90
LD50＝2.81mg·kg-1(2.99～2.65mg·kg-1，P＝0.95)
                                表14异七叶皂苷的LD50
  剂量(mg·kg-1)   对数剂量(x)   动物数(n)   死亡数(r)   死亡率(％)   概率单位(Y)
  45.0036.0028.8023.0418.43   1.6531.5561.4591.3621.266   1818181818   1713831   947244165   6.555.584.854.013.36
A＝-7.1 B＝8.21 r＝0.9980
LD50＝30.04mg·kg-1(27.40～32.94mg·kg-1，P＝0.95)
                            表15赖氨酸异七叶皂苷的LD50
  剂量(mg·kg-1)   对数剂量(x)   动物数(n)   死亡数(r)   死亡率(％)   概率单位(Y)
  45.0036.0028.8023.0418.43   1.6531.5561.4591.3621.266   1818181818   139531   725027175   5.585.004.394.053.36
A＝-3.60 B＝5.56 r＝0.9960
LD50＝35.75mg·kg-1(31.17～41.02mg·kg-1，P＝0.95)
                    表16以谷胱苷肽为载体的赖氨酸总七叶皂苷的LD50
组别   剂量(mg·kg-1) 对数剂量   动物数(n)   死亡数(r)   死亡率(％)   LD50(mg·kg-1)P＝0.95
谷胱苷肽∶赖氨酸总七叶皂苷(10∶1)   42.0029.4020.5814.4110.08   1.6231.4681.3131.1591.003   1010101010   107763   10070706030 14.22(15.36～12.88mg·kg-1)
谷胱苷肽∶赖氨酸总七叶皂苷(3∶1)   10.008.006.405.124.10   1.0000.9030.8060.7090.613   1212121212   107531   835842258 7.00mg·kg-1(8.21～6.01mg·kg-1)
            表17赖氨酸总七叶皂苷与盐酸赖氨酸的重量比为(1∶3)的LD50
  剂量(mg·kg-1)   对数剂量(X)   动物数(n)   动物死亡数(r)   死亡率(％)(p) 概率(Y)
  10.007.505.364.223.17   1.0000.8750.7500.6260.500   1212121212   97421   755833178   5.675.204.564.053.59
A＝1.42 B＝4.25 r＝0.9984 y＝4.25X+1.42
LD50为6.93mg·kg-1(8.53～5.65mg·kg-1 p＝0.95)
                    表18测得的LD50、ED50以及最小有效量综合情况
盐类名 成分名称   最小有效量(mg·kg-1)   ED50(mg·kg-1)   LD50(mg·kg-1)   治疗指数Ti(LD50/ED50)
钠盐赖氨酸盐   总七叶皂苷B-七叶皂苷异七叶皂苷总七叶皂苷B-七叶皂苷   0.125～0.25≤0.25--≤0.125≤0.075   0.740.58.70.540.35   4.22.8130.046.766.27   5.75.63.4513.517.9
  异七叶皂苷 --   6.18   35.75   5.78
从表18可以看出，赖氨酸盐不仅能提高化合物的LD50，降低其毒性，而且还能提高活性和疗效，降低最小有效量和半数有效量(ED50)，大大提高化合物的相对治疗指数(LD50/ED50)，并能提高七叶皂苷类药物的安全性能。此外，异七叶皂苷的LD50虽然是β-七叶皂苷的近10倍，但由于它的活性低，ED50大，所以治疗指数并不比β-七叶皂苷高，如果异七叶皂苷用作药物来治疗，剂量小时无效，剂量大时照样有副作用。从治疗指数来看，通过七叶皂苷与赖氨酸成盐后，总七叶皂苷或β-七叶皂苷的治疗指数均比相应的钠盐分别提高2.4或3.2倍，而相应异七叶皂苷则比相应的钠盐提高1.7倍。
根据现有技术中的记载，β-七叶皂苷和异七叶皂苷在一定比例下具有较好的效果。因此，我们这次实验用的赖氨酸总七叶皂苷钠含β-七叶皂苷62％，异七叶皂苷38％，即二者的重量比在6∶4范畴，其活性确有叠加作用，故赖氨酸总七叶皂苷和赖氨酸β-七叶皂苷有相近的治疗指数。因此，我们认为赖氨酸总七叶皂苷也是值得开发的一类新型药物。
谷胱甘肽与赖氨酸总七叶皂苷(10∶1)联用时，可以使LD50提高到14.2mg·kg-1，而其抗炎活性的ED50是0.5mg·kg-1，Ti为28.4。可见，谷胱甘肽作为载体是降低七叶皂苷毒性的有效手段。
试验例5肌肉刺激性试验
试验动物  2kg以上健康家兔。
给药途径  肌肉注射1ml溶液。
给药剂量  ①七叶皂苷钠的5mg·ml-1溶液1ml；
          ②赖氨酸总七叶皂苷或赖氨酸β-七叶皂苷的5.5mg·ml-1溶液1ml；
          ③谷胱苷肽或盐酸赖氨酸5.5mg·kg-1与赖氨酸总七叶皂苷或赖氨酸七叶皂苷的组合物，不计谷胱苷肽或盐酸赖氨酸重量，其剂量同②。
试验方法  每个品种，取家兔4只，按上述剂量注射于家兔四股头肌，48小时后，处死动物，解剖取出加股头肌，纵向切开，观察注射局部的刺激程度，并按下表换算或相应的反应级数。
  反应级   刺激反应
  012345   无明显变化轻度充血，其范围在0.5×1.0厘米以下中度充血，其范围在0.5×1.0厘米以上重度充血，伴有肌肉变性出现坏死，有褐色变性出现广泛坏死
                        表19肌肉刺激性试验结果
  品名(注射部位总固体)   股四头肌刺激反应(测量单位cm)   反应级数   股四头肌刺激反应(测量单位：cm)   反应级数   反应级数和
  总七叶皂苷钠(5mg)   ①重度充血4.7×4.8②重度充血4.0×4.7   33   ③重度充血4.4×4.9④重度充血4.4×4.7   33 12
  赖氨酸总七叶皂苷(5.5mg)   ①轻度充血0.56×0.9②轻度充血2.0×0.15   11   ③中度充血1.8×0.44④轻度充血1.46×0.3   21 5
  赖氨酸七叶皂苷∶盐酸赖氨酸(1∶3)(20mg)   ①轻度充血0.3×0.4②轻度充血1.0×0.5   11   ③中度充血0.5×1.2④无充血   20 4
  B-七叶皂苷钠(5mg)   ①有褐色变性②出现坏死   44   出现坏死有褐色变性   44 16
  赖氨酸七叶皂苷(5.5mg)   ①轻度充血0.5×1.0②轻度充血0.6×1.2   22   ③轻度充血0.5×1.0④轻度充血0.6×0.9   12 6
赖氨酸总七叶皂苷∶谷胱甘肽(1∶3)(20mg) ①中度充血4.4×0.52②中度充血2.6×0.95 22   ③中度充血3.2×0.49④中度充血3.11×1.06 22 8
结论：从对肌肉刺激性来看，七叶皂苷与赖氨酸成盐后，其肌肉刺激性有显著降低，并可见赖氨酸总七叶皂苷或赖酸酸七叶皂苷与盐酸赖氨酸的组合物的刺激反应总级分别为5和4，为轻度充血，可供肌肉注射用，这是很大的突破；而赖氨酸β-七叶皂苷的刺激反应也比其相应钠盐显著减轻，刺激反应总级是6，适用于静脉给药。
试验例6静脉血管刺激性测试
试验动物  2公斤重家兔。
给药途径  静脉给药。
给药剂量  每兔5mg，连续注射3天。
试验方法  家兔12只，分成四组，每组3只。
△第一组从一侧耳缘静脉缓慢注射赖氨酸总七叶皂苷1ml：5mg。
△第二组从一侧耳缘静脉缓缓注射七叶皂苷钠1ml：5mg。
△第三组从一侧耳缘静脉注射生理盐水1ml。
△第四组从一侧耳缘静脉缓缓注射赖氨酸β-七叶皂苷1ml：5mg。
每组连续三天，每天都从同一耳缘静脉注射。第四天将动物处死，剪下给药耳，观察对耳朵的刺激反应，并做病理切片检查。
结果：△第一组和△第四组的三只动物的耳朵均未见明显的刺激反应，病理切片观察结果基本与生理盐水组相似，未见变性、坏死及明显病理异常。
△第二组三只动物出现严重充血水肿，大部份注射部位显紫褐色，病理切片表明有严重变性，坏死和血栓形成。
△第三组三只动物的耳朵均未见有明显刺激反应。病理切片显示血管及血管周围的细胞基本正常，未见病理异常的情况。
结论：赖氨酸总七叶皂苷或赖氨酸β-七叶皂苷对静脉血管几无刺激作用。
试验例7增加静脉张力的测试试验
试验动物  狗大隐静脉条。
给药途径  离体给药试验。
试验方法  成熟健康狗，苯巴比妥30mg·kg-1体重静脉麻醉后，仔细分离狗隐静脉，剪取近心端静脉条约2cm长，小心分离其周围筋膜及结缔组织，制备成螺旋静脉条，固定于新鲜配制的克-郭氏液的10ml离体器官浴槽中，控温37℃±1℃并通入95％O2和5％CO2混合气体。静脉条经张力换能器与平衡记录仪相联，且实验开始前，给静脉加-50mg的前负荷。药物对静脉条张力的影响作用以对10-5mol/L去甲肾上腺素(NA)反应的百分数进行表达：即以1.0×10-5mol/L的NA引起的静脉条收缩时的张力变化最大效应为100，不同药物浓度作用下，静脉条张力变化与之进行比较，计算出各剂量组作用下静脉收缩张力变化的百分数。每次给药须在上一剂量反应完全后再加入。总七叶皂苷钠与赖氨酸总七叶皂苷对比试验的结果见表20。
        表20赖氨酸总七叶皂苷与总七叶皂苷钠增加静脉张力的比较
  剂量10-5g/ml 例数   犬大隐静脉条张力增加(％)
  总七叶皂苷钠   赖氨酸总七叶皂苷
  5.09.016.229.252.5   55555   8.315±9.30513.016±8.67820.913±6.95634.889±9.00342.158±7.681   7.9987±8.36412.8865±7.41219.8983±7.03135.023±10.62543.012±6.983
结论：赖氨酸总七叶皂苷具有增加静脉张力的作用，其作用强度与总七叶皂苷钠的基本相同。改善血液循环是七叶皂苷的重要生理活性，而增加静脉张力是七叶皂苷改善血液循环重要动力，所以本实验表明用赖氨酸盐化七叶皂苷并没有影响七叶皂苷改善血液循环的作用。
试验例8赖氨酸七叶皂苷盐对兔眼的刺激性试验
试验药品  赖氨酸总七叶皂苷、赖氨酸β-七叶皂苷和总七叶皂苷钠。
被试药品的浓度与剂量：本发明所述的药物剂量均按照相应的七叶皂苷作为计量标准进行纵向比较，以灭菌生理盐水为溶剂，溶液浓度为0.2w/w％溶液。对每只眼分别给药0.1ml。
受试动物：2公斤重健康家兔。
给药途径：眼内给药。
试验方法给药前用放大镜检查每只家兔的眼球，应确证试验前无炎症，无角膜缺陷，无结膜损伤。然后将家兔分成赖氨酸总七叶皂苷组，赖氨酸β-七叶皂苷和总七叶皂苷钠组，每组两只家兔。均在左眼滴入药液，右眼滴入灭菌生理盐水作为对照。兔眼滴入药液后，让兔子被动闭合10秒钟，观察1，24，48，72小时后兔眼的刺激反应。
根据卫生部药政局颁发的《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》的眼刺激性试验方法判断标准进行判断，1小时后的结果见表21。表21所列结果均系兔子左眼给药1小时后表现的刺激反应，而其滴生理盐水的右眼均无刺激反应。24小时后，其左眼均恢复正常。
表21赖氨酸七叶皂苷盐对兔眼的刺激性试验结果(给药1小时后的观察结果)
Figure A20051010558500261
结论：0.2％赖氨酸总七叶皂苷和0.2％赖氨酸β-七叶皂苷对兔眼球有轻度刺激作用；0.2％总七叶皂苷钠对兔眼球有中度刺激作用。
试验例9谷胱甘肽与赖氨酸总七叶皂苷的不同重量比的组合物的抗炎活性研究结果及其对肌肉的刺激性作用
选用试验例1的抗炎活性测定法和试验例5的肌肉刺激性方法，研究获得谷胱甘肽与赖氨酸总七叶皂苷的不同重量比的组合物抗炎活性研究结果及其对肌肉的刺激性作用结果，参见表22。
表22谷胱甘肽和赖氨酸总七七叶苷的不同比值组合物的抗炎活性比较
  谷胱甘肽∶赖氨酸七叶皂苷   剂量(以Escin计)   动物数(n)   肿胀值(X±S，mg)   抑制率(％)
  10∶16∶13∶10.4ml NS. 0.45mg·kg-1   10101010  **12.31±1.92**12.19±1.83**12.89±2.0520.56±1.88   40.140.737.3/
**示P＜0.01
结论：谷胱甘肽与赖氨酸总七叶苷重量比为10∶1和6∶1的组合物的抗炎活性没有显著性差异，但10∶1和6∶1的抗炎活性略优于3∶1。
表23谷胱甘肽和赖氨酸总七叶皂苷不同比值组合物的刺激性比较
  谷胱甘肽∶赖氨酸总七叶皂苷(总固体物) 剂量(Escin计)mg·kg-1 股四头肌刺激反应(测量单位：cm) 反应级数 股四头肌刺激反应(测量单位：cm) 反应级数   总反应级数
  10∶1(55mg) 5   ①重度充血4.5×4.2②重度充血3.4×1.49   33   ①中度充血2.4×0.96②中度充血2.9×0.56   22 10
  6∶1(35mg) 5   ①中度充血1.85×0.5②中度充血2.78×0.48   22   ①中度充血1.1×0.52②中度充血3.2×1.12   22 8
  3∶1(20mg) 5   ①中度充血4.4×0.52②中度充血2.6×0.95   22   ①中度充血2.4×0.96②中度充血2.9×0.56   22 8
结论：谷胱甘肽与赖氨酸总七叶苷重量比为6∶1和3∶1的组合物对肌肉的刺激性较低，且低于10∶1的组合物。
试验例10赖氨酸总七叶皂苷与盐酸赖氨酸的不同组合比对大鼠脑缺血保护作用试验方法同试验例3，结果见表24。
表24赖氨酸总七叶皂苷∶盐酸赖氨酸的不同组合比对大鼠脑缺血保护作用
组别  剂量(以escin计，iv)   动物数(n)   脑含水量(％)   抑制率(％)
  假手术对照组脑缺血模型1∶31∶61∶10  NS.同体积NS.同体积0.5mg.kg-10.5mg.kg-10.5mg.kg-1   1010101010   74.00±1.6080.10±2.2077.81±1.9076.96±1.8077.00±2.00   //37.551.450.8
结论：脑缺血模型组与假手术组的大鼠脑含水量有显著性差异(P＜0.01)，说明模型成立。各给药组大鼠的脑含水量与脑缺血模型组比较均有显著性差异(P＜0.01)，说明上述各组合物均对缺血性脑水肿有治疗作用。而1∶6组与1∶10组无显著性差异(P＞0.05)，1∶6组、1∶10组与1∶3组比较也有显著性差异(P＜0.01)。考虑到肌肉注射给药时的刺激性不仅与药物性质有关，还与注射剂含固体量有关，1∶10组合物的固体量大于1∶6，所以优选1∶6组合物。
试验例11赖氨酸七叶皂苷与精氨酸七叶皂苷的活性、刺激性和毒性的比较
按照CN137665A公开的方法制备得到精氨酸β-七叶皂苷、精氨酸异七叶皂苷和精氨酸总七叶皂苷。
抗炎活性测定方法同试验例1；静脉血管刺激性用的测定方法同试验例6；LD50测定的测定方法同试验例5。
1.精氨酸七叶皂苷的抗炎活性测定结果
                        表25精氨酸总七叶皂苷的抗炎活性测定
  剂量(mg.kg-1)(以总七叶皂苷计)   动物数(n)   肿胀值X±S(mg)   抑制率(％)   ED50(p＝0.95)mg.kg-1
  0.8700.4350.2180.109空白对照组(NS.)   1212121212   8.26±3.7611.30±2.9912.42±3.0416.22±3.0118.39±2.34   55***38.6***32.5***11.8*/ 0.68(1.08～0.56)
注：与空白组对比，*示p＞0.05  ***示p＜0.001
                            表26精氨酸β-七叶皂苷的抗炎恬性
  剂量(mg.kg-1，以皂苷计)   动物数(n)   肿胀值X±S(mg)   抑制率(％)   ED50(p＝0.95)mg.kg-1
  0.8700.4350.2180.109空白对照组NS、0.5ml   1212121212   8.06±3.6911.18±2.8912.29±3.0215.06±3.0419.19±2.16   57.99**41.70**35.90**21.50**/ 0.59(0.99～0.46)
注：与空白组比较**示P＜0.01
                            表27精氨酸异七叶皂苷的抗炎活性
  剂量(mg.kg-1，以皂苷计)   动物数(n)   肿胀值(X±S，mg)   抑制率(％)   ED50(p＝0.95)(mg.kg-1)
  0.8700.4350.2180.109空白对照组NS、0.5ml   1212121212   7.46±3.019.05±2.7212.98±2.5614.61±2.8319.76±2.23   62.2**54.2**34.3**26.0**/ 6.73(10.2～5.5)
注：**示与空白对照组比较，p＜0.01。
2、精氨酸总七叶皂苷与赖氨酸总七叶皂苷对静脉血管刺激作用的对比试验结果试验动物2公斤重健康家兔
给药途径  静脉给药
给药剂量  每兔5mg(以总七叶皂计)，连续注射3天。
试验方法  家兔9只，分成3组，每组3只。
△第一组  从一侧耳缘静脉注射赖氨酸总七叶皂苷溶液1ml，溶液中含总七叶皂苷5mg。
△第二组  从一侧耳缘静脉注射精氨酸总七叶皂苷溶液1ml，溶液中含总七叶皂苷5mg。
△第三组  从一侧耳缘注射生理盐水1ml。每组连续三天，每天都从同一耳缘注射，第四天将动物处死，剪下给药耳，观察对耳朵刺激反应，并做病理切片检查。
结果
△第一组为赖氨酸总七叶皂苷注射组，三只动物耳缘静脉均未见明显的刺激反应，病理切片观察结果基本与生理盐水组相似，未见变性、坏死及明显病理异常。
△第二组为精氨酸总七叶皂苷注射组，三只家兔耳缘静脉明显充血，周围红肿，耳根水肿，病理切片表明有严重变性和坏死情况。
△第三组为注射生理盐水组，三只家兔耳缘静脉均未见有明显刺激反应。病理切片显示血管及血管周围的细胞基本正常，未见病理异常情况。
结论  赖氨酸总七叶皂苷的血管刺激作用明显轻于精氨酸总七叶皂苷。
3、精氨酸七叶皂苷的LD50测定结果
                        表28精氨酸总七叶皂苷的LD50测定结果
  剂量(mg.kg-1)(以总七叶皂苷计)   对数剂量(x)   动物数(n)   死亡数(r)   死亡率(％)   概率单位(y)
  15.0010.507.355.143.60   1.1761.0210.8660.7110.556   1010101010   87642   8070604020   5.845.525.254.754.16
Y＝2.36X+2.83；LD50＝6.68(4.75～9.39mg.kg-1，p＝0.95)
                    表29精氨酸β-七叶皂苷的LD50测定结果
 剂量(mg.kg-1)(以β-七叶皂苷计)   对数剂量(x)   动物数(n)   死亡数(r)   死亡率(％)   概率单位(y)
  15.0010.507.355.143.60   1.1761.0210.8660.7110.556   1010101010   98742   9080704020   6.285.845.524.754.16
Y＝4.10X+1.78；LD50＝6.11mg.kg-1(7.73～4.82mg.kg-1，p＝0.95)
                        表30精氨酸异七叶皂苷的LD50
  剂量mg.kg-1(以异七叶皂苷计)   对数剂量(x)   动物数(n)   死亡数(r)   死亡率(％)   概率单位(y)
  45.0036.0028.8023.0418.43   1.6531.5561.4591.3621.266   1010101010   97531   9070503010   6.285.525.004.483.72
Y＝5.75-3.35X LD50＝28.37mg.kg-1(33.35～24.13mg.kg-1)
4、七叶皂苷赖氨酸盐与精氨酸药理、毒理比较
                    表31赖氨酸七叶皂苷盐与精氨酸七叶皂苷盐的比较
  皂苷及其盐名称 剂量计算方法   抗炎活性(ED50mg.kg-1)   LD50mg.kg-1   相对治疗指数(Ti)   作用(注射1ml对静脉血管刺激含5mg)
  皂苷名称   盐的名称
  总七叶皂苷   赖氨酸盐   以总七叶皂苷计   0.54   6.76   13.50   几乎无刺激作用
  精氨酸盐   0.68   6.68   9.82   有严重刺激反应
B-七叶皂苷   赖氨酸盐   以β-七叶皂苷计   0.35   6.27   17.90   几乎无刺激作用
  精氨酸盐 0.59 6.11 10.36
异七叶皂苷   赖氨酸盐   以异七叶皂苷计   6.18   35.75   5.78
  精氨酸盐 6.73 28.37 4.21
可见，赖氨酸七叶皂苷盐与精氨酸七叶皂苷盐有相类似的LD50，而赖氨酸盐抗炎活性明显高于精氨酸盐，且赖氨酸盐的相对治疗指数显著大于精氨酸盐，而精氨酸盐七叶皂苷的血管刺激反应显著大于其赖氨酸盐，故赖氨酸七叶皂苷盐更为安全有效。可能由于精氨酸在NO合成酶作用下释放NO，使机体的血管扩张，可降低高血压患者的血压，解除冠心病患者的心肌痉挛和心血管的痉孪等治疗作用。但NO会抑制线粒体产生能量，从而导致细胞死亡(福建医科大学学报，2003，37(1)：23～25；PediatrRes 1995，38(4)：652～656)，在其它疾病的病理过程中起着负面影响，如NO在脑缺血发病过程中以及心肌缺血和脑组织缺血再灌注过程中，可损伤组织和细胞(Strke1993，24(8)，1709～1716；中国医院药学杂志，2005，25(6)：485～487)。另外，NO具氧自由基性质，本身有致炎作用。
综上所述：赖氨酸总七叶皂苷和赖氨酸β-七叶皂苷均是具有高治疗指数，低肌肉刺激、无血管刺激的优良药物。它们保持了七叶皂苷所有有用的药理性质。而当用谷胱甘肽为载体时，可进一步提高赖氨酸总七叶皂苷的LD50，降低其毒性，并使治疗指数扩大到28.4。当用盐酸赖氨酸为载体时，可提高赖氨酸总七叶皂苷对脑水肿的抑制率由42.6％提高到82.0％。而赖氨酸盐的抗炎抗渗出活性明显优于精氨酸盐，而血管刺激反应显著低于精氨酸盐，赖氨酸七叶皂苷更为安全有效的药物。

Claims (24)

1、一种赖氨酸β-七叶皂甙化合物，所述化合物具有下面结构式(I)所示的结构，
Figure A2005101055850002C1
2、一种赖氨酸异七叶皂甙化合物，所述化合物具有下面结构式(II)所示的结构，
3、一种赖氨酸总七叶皂甙，所述的赖氨酸总七叶皂甙主要由权利要求1所述的赖氨酸β-七叶皂甙和权利要求2所述的赖氨酸异七叶皂甙组成。
4、如权利要求3所述的赖氨酸总七叶皂甙，其中所述的赖氨酸总七叶皂甙中赖氨酸β-七叶皂甙和赖氨酸异七叶皂甙的重量比为3-9∶7-1，较好的为5-8∶5-2，优选5∶5～6∶4，特别优选为6∶4。
5、一种制备赖氨酸七叶皂甙的方法，包括以下步骤：
1)将原料β-七叶皂甙、异七叶皂甙或总七叶皂甙溶解，优选溶解过程为：
在β-七叶皂甙、异七叶皂甙或总七叶皂甙粉末中加入蒸馏水，再加入L-赖氨酸至溶液澄清；
2)用L-赖氨酸溶液调节pH值至5.0～7.5后，加入乙醇至溶液的含醇量达到至少70％，优选达到至少80％；
3)将步骤2)所得到的产物进行浓缩，在浓缩液中加入无水乙醇得到混合物，处理该混合物得到七叶皂甙的赖氨酸盐。
6、如权利要求5所述的制备方法，其中步骤2)中用L-赖氨酸溶液调节pH值至5.0～7.0，优选为5.0～6.0，特别是约5.5。
7、如权利要求5所述的制备方法，其中步骤3)中通过真空干燥的方法进行浓缩。
8、如权利要求5或7所述的制备方法，其中步骤3)中浓缩的温度条件控制在50℃以下，优选40℃以下。
9、如权利要求5所述的制备方法，其中步骤3)中处理该混合物的方法为冷藏放置析晶、冷冻干燥或喷雾干燥直接得到赖氨酸盐的粉末。
10、权利要求1-2中任意一项所述化合物在制备药物中的用途。
11、权利要求3-4中任意一项所述赖氨酸总七叶皂甙在制备药物中的用途。
12、如权利要求10或11所述的用途，其中所述药物是一种低刺激、高治疗指数的抗炎抗渗出改善血液循环的药物。
13、如权利要求10或11所述的用途，其中所述药物用于治疗脑水肿，创伤性水肿，静脉回流障碍、烧伤、手术后肠功能恢复、肺部急性炎症或水肿。
14、如权利要求10或11所述的用途，其中所述药物用于治疗、处理外伤的伤口。
15、如权利要求10或11所述的用途，其中所述药物中含有谷胱甘肽、盐酸赖氨酸、人白蛋白或甘露醇中的一种或几种作为药物载体。
16、如权利要求15所述的用途，其中所述药物载体为谷胱甘肽或盐酸赖氨酸。
17、如权利要求16所述的用途，其特征在于：所述谷胱甘肽或盐酸赖氨酸与β-七叶皂苷赖氨酸盐、异七叶皂苷赖氨酸盐或赖氨酸总七叶皂苷的的重量比为3～10∶1，优选6∶1。
18、一种药物组合物，其中含有权利要求1或2中任意一项所述的化合物和药学上可接受的载体。
19、一种药物组合物，其中含有权利要求3-4中任意一项所述的赖氨酸总七叶皂甙和药学上可接受的载体。
20、如权利要求18或19所述的药物组合物，其中所述组合物中含有谷胱甘肽、盐酸赖氨酸、人白蛋白或甘露醇中的一种或几种作为药物载体。
21、如权利要求20所述的药物组合物，其中所述组合物中含有谷胱甘肽或盐酸赖氨酸作为药物载体。
22、如权利要求21所述的药物组合物，其特征在于：所述谷胱甘肽或盐酸赖氨酸与β-七叶皂苷赖氨酸盐、异七叶皂苷赖氨酸盐或赖氨酸总七叶皂苷的重量比为3～10∶1，优选为6∶1。
23、如权利要求18或19所述的药物组合物，其中所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂或注射剂。
24、如权利要求18或19所述的药物组合物，其中所述药物组合物的剂型为外用制剂，优选为喷雾剂、膜剂、凝胶剂或贴剂。
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