KR100666652B1

KR100666652B1 - 식물 원료로부터 초임계 유체를 이용하여 탁솔을 제조하는방법

Info

Publication number: KR100666652B1
Application number: KR1020000009255A
Authority: KR
Inventors: 최영해; 김진웅; 유기풍; 노민정; 한주희
Original assignee: 한화석유화학 주식회사; 김진웅
Priority date: 2000-02-25
Filing date: 2000-02-25
Publication date: 2007-01-09
Also published as: DE60127820T2; ATE359280T1; KR20010084323A; DE60127820D1; WO2001062753A1; EP1261596A1; EP1261596B1; AU2001237736A1; CN1406235A; US6503396B2; EP1261596A4; CN1205197C; US20020000410A1

Abstract

본 발명은 초임계 유체 추출 기술을 이용하여 탁솔을 식물 원료로부터 추출제조하는 방법 및 그 방법으로 제조된 탁솔에 관한 것이다. 더욱 상세히는 고온 고압하의 초임계 상태에서 이산화탄소 또는 이산화탄소와 1개 이상의 공용매를 혼합시켜 식물 원료에서 탁솔을 추출하고 이를 다시 분리 정제시키는 방법 및 분리 정제시켜 제조된 탁솔에 관한 것이다.

초임계 추출, 탁솔, 이산화탄소, 공용매, 주목

Description

식물 원료로부터 초임계 유체를 이용하여 탁솔을 제조하는 방법{Method for preparing taxol using supercritical fluid from plant}

도 1은 본 발명의 초임계 추출 장치의 개략도이다.

도 2는 칼럼 크로마토그래피인 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 분리 후 HPLC 도면이다.

도 3은 RP-18 수지 칼럼 크로마토그래피로 분리한 도면이다.

도 4는 세파텍스 칼럼 크로마토그래피로 분리한 후 PFP 칼럼으로 최종 분리후 탁솔의 HPLC 도면이다.

도 5는 메탄올, 에탄올, 물을 각각 이산화탄소에 공용매로 첨가시 셀룰로오즈 페이퍼의 탁솔 회수율을 나타낸 도면이다.

도 6은 주목나무의 잎, 줄기 껍질, 뿌리 등에서 이산화탄소를 초임계 추출시 나타나는 탁솔의 회수율을 나타낸 도면이다.

도 7은 종래의 추출방법에 의한 선택도 및 본 발명의 초임계 추출 용매를 이산화탄소와 10% 메탄올, 10% 에탄올 및 10% 물을 공용매로 사용하여 추출한 경우 탁솔의 선택도를 나타낸 도면이다.

※ 도면부호 설명

10 : 항온조, 11 : 추출기, 12 : 시린지 펌프,

13 : 리스트릭터, 14 :수집 베셀, 15 : 공급 밸브,

16 :배출 밸브

본 발명은 초임계 유체 추출 기술을 이용하여 탁솔을 식물 원료로부터 추출 제조하는 방법 및 그 방법으로 제조된 탁솔에 관한 것이다. 더욱 상세히는 고온 고압하의 초임계 상태에서 이산화탄소 또는 이산화탄소와 1개 이상의 공용매를 혼합시켜 식물 원료에서 탁솔을 추출하고 이를 다시 분리 정제시키는 방법 및 분리 정제시켜 제조된 탁솔에 관한 것이다.

초임계 유체 추출기술(Supercritical Fluid Extraction Technology)은 임계 온도 및 임계 압력 이상의 유체를 사용하는 기술로 의약품, 식품가공 및 석유화학물질 정제 등의 추출, 정제관련 분야에서 기존의 공정을 대체할 수 있는 새로운 환경 친화적 청정기술로 주목받고 있다. 특히, 근자에 이르러 에너지 자원 가격의 상승, 전통적인 분리 공정이 지니는 환경폐해, 기체나 액체 공정으로 제조가 불가능한 특수 목적 신소재 수요의 신장 등의 이유로 선진 각국에서는 지난 30여 년간, 전통적인 공정으로 기체나 액체를 사용하는 개념을 탈피하여 초임계 유체 기술을 공정 유체로 사용하는 신공정 유체기술의 개발에 심혈을 기울여 오고 있다. 그 결과 공정 유체로서 초임계 유체를 사용하는 기술은 정밀화학, 에너지, 환경, 신소재 등 제반 산업에 급속도로 파급되면서 전통적인 다양한 분리기술을 초임계 유체 공정을 이용하는 신기술로 대체해가고 있다.

특히 다양한 초임계 유체 후보 중 이산화탄소를 사용할 경우에는 또 다른 장점이 있다. 이산화탄소는 자연에 무한량 존재할 뿐만 아니라 제철산업이나 석유화학산업에서 다량 발생하는 물질이다. 또한 이산화탄소는 무색, 무취, 인체에 무해하며 또한 화학적으로 매우 안정한 물질이다.

여기에 덧붙여 이산화탄소는 그 어떤 유체 보다 낮은 임계 온도(31.1 ℃)와 임계 압력(7.4 MPa)을 나타내 쉽게 초임계 조건으로 조정이 가능하여 환경 친화적 특성뿐만 아니라 효율적 에너지 사용면에서도 큰 장점을 갖는다. 더군다나 이 기술이 천연생리활성물질의 분리, 정제 분야에서 적용될 시에는 기존의 공정에서 발생하는 문제점, 즉 최종 산물 내에 잔류하는 유기용매에 의한 인체독성, 고비용, 폐기용매에 의한 환경공해, 목적성분의 변성 및 낮은 추출 선택성 등을 상당부분에서 해결 또는 보완할 수 있다.

초창기 초임계 유체 기술이 천연물 추출 정제에 주로 적용된 분야는 향신료(flavor), 향수(perfume), 지방산(fatty acid), 지질(lipid), 스테로이드(steroid) 등과 같이 비극성, 저가의 식품이나 향료 성분에 국한되었으나 최근 들어 이 기술에 관련된 여러 현상학적 특성 및 부가적 기술의 발전으로 극성, 소량, 고가의 천연의약품 추출 정제에 응용되기에 이르렀다.

산업전반에 걸쳐 모든 공정에서 환경에 대한 관심이 증가되는 현 상황에서 천연물 유효 성분을 추출, 정제하는 공정 또한 기존의 유기용매를 이용한 추출, 정제 공정이 갖는 여러 문제점, 즉 환경 및 인체 독성, 목적 성분에 대한 비선택성, 고비용 등을 해결할 수 있는 새로운 공정을 도입하기 위한 다각도의 시도가 국내외 에서 모색되고 있다.

초임계 유체(Supercritical Fluid)는 임계점(critical point) 즉, 임계 온도(critical temperature), 및 임계 압력(critical pressure) 이상에 존재하는 물질의 상태로, 기체와 액체의 중간 성격을 갖는 유체이다. 초임계 유체는 액체에 상응하는 밀도를 가지며 또한 기체에 해당하는 투과성을 나타낸다.

모든 순수 물질은 온도, 압력의 변화에 따라 기체 및 액체 고체 등의 상태 (phase)를 나타낸다. 기체 및 액체의 상전이 곡선인 증기압 곡선을 살펴보면 온도가 증가함에 따라 압력도 함께 증가하는 데 이는 새로운 평형점에 도달하기 위한 결과로써 증기압의 증가를 가져오고 결국 액상과 기상 사이의 밀도 차이가 감소된다. 이러한 액체와 기체의 밀도 차이가 임계점 이라는 곳에서 동일해져 구별할 수 없게 된다. 임계점 이상의 영역에서는 압력을 증가시켜도 액화현상이 일어나지 않고 또한 온도를 높여도 기화현상이 일어나지 않는다.

이러한 임계점 이상에서 기체와 액체의 중간 성격을 갖는 유체를 초임계 유체라 정의한다. 초임계 유체는 미세한 온도, 압력 변화에도 밀도가 크게 변하므로 용해력을 쉽게 조절할 수 있으며 또한 기체 및 액체와는 또 다른 고유의 특성을 갖추고 있다.

즉 용매와 용질 분자 사이의 상호작용에 관련된 용해(dissolution), 기질(matrix)로부터 용질을 분리해 내는 능력과 밀접한 연관성을 갖는 밀도(density) 등의 측면에서는 액체의 특성을 나타내며 기질 투과성과 관련이 있는 높은 확산도(diffusivity), 낮은 표면 장력(surface tension) 등은 기체의 성질을 나타낸다.

그러나 실제로는 초임계 상태를 유지하기 위한 임계온도 및 압력이 가능하면 낮은 물질을 초임계 유체를 추출 정제 분야에 사용하고 있다. 이산화탄소는 다른 물질에 비해 초임계 상태로 만들기 위한 임계 온도 및 압력이 낮고 또한 인체에 무해하며, 환경 친화적이고 비용면에서 저렴한 장점으로 인하여 추출, 정제 용매로 널리 사용되고 있다.

그러나 이산화탄소는 이러한 장점에도 불구하고 낮은 극성으로 말미암아 다양한 극성 천연물을 추출하기에는 많은 문제점을 내포한다. 따라서 이러한 문제점을 극복하기 위해 다양한 시도가 진행되었으며 대표적으로는 우선 이산화탄소 이외의 N₂O와 같은 다른 초임계 유체의 사용, 온도, 압력의 증가, 극성 공용매의 첨가 등이다. N₂O의 경우 임계온도 및 압력이 36.5 ℃와 70.6 bar로 이산화탄소와 마찬가지로 낮은 임계점을 나타내어 초임계 유체화시키는데 큰 어려움이 없다.

초임계 유체의 온도 증가는 압력과는 달리 유체의 밀도를 감소시킨다. 그러나 유체의 확산도, 목적 성분의 휘발성(volatility) 및 기질로부터의 탈착에는 긍정적 영향을 미친다.

초임계 유체의 조절 변수인 온도, 압력을 증가시키는 것은 경제적으로나 기술적으로 한계가 있으며, 상당수의 화합물들의 추출 효율에 대해서는 큰 영향을 나타내지 못한다. 따라서 낮은 극성이 문제가 되는 초임계 이산화탄소의 경우 용매의 극성을 높이기 위해 대부분 소량의 유기용매를 첨가하는 방법을 사용하고 있다.

일반적으로 시료내의 수분은 초임계 유체 추출 효율을 감소시킨다. 그러나 특별한 경우에 있어서는 시료의 수분 함량의 증가가 추출 효율을 상승시키는 결과를 가져온다.

초임계 이산화탄소의 온도, 압력 변화에 따른 세포독성 성분의 선택적 추출능력을 밝히는 연구에 대해서는 안젤리카 기가스(Angelica gigas) 및 안젤리카 아쿠티로바(Angelica acutiloba), 아라리아 코르다타(Aralia cordata), 스리로델라 폴리히자(Spirodela polyrhiza), 부플레우룸 팔카툼(Bupleurum falcatum), 아칸토판낙스 세씰리플로루스(Acanthopanax sessiliflorus)등의 약용식물의 초임계 이산화탄소 추출물에 대해 P388, A549, HL-60 세포주에 대한 세포독성이 측정된 바 있다.

그 결과 세포독성 물질의 선택적 추출을 위한 최적 초임계 이산화탄소 추출 조건은 식물 시료 및 대상 세포주에 따라 많은 차이를 나타낸다. 이러한 원인은 초임계 유체가 기체나 액체와는 달리 온도, 압력의 변화에 따라 같은 용매로도 용해력, 밀도, 유전상수(dielectric constant) 등의 인자들이 현격히 변화하여 각 조건에서 추출되는 성분이 서로 상이함에 기인하는 것으로 여겨진다.

한편 본 발명의 추출 유용 성분인 탁솔은 주목나무에서 추출 가능한 물질이다. 또한 주목(Taxus cuspidata Siebold et Zuccarini)은 한국, 일본, 중국의 해발 700∼2,500 m사이에 자생하는 주목과(Taxaceae)의 상록 교목으로 높이 17∼20m, 지름 1m 정도까지 성장하고, 수피는 홍갈색이며 얇게 띠 모양으로 벗겨진다. 소지는 붉은색이고, 겨울눈은 난형이다. 잎은 선형으로 길이 1.5∼2.5cm, 너비 3mm이며 끝은 갑자기 뾰족해진다. 수꽃은 갈색이고, 암꽃은 난형으로 녹색이며 5∼6월에 개화한다. 열매는 원형이고 적색이며, 육질의 종의는 종자를 일부만 둘러싸고, 종자는 난형이며 길이 4.5 mm로 3∼4 개의 능선이 있고 9∼10월에 성숙한다.

주목에는 알칼로이드(alkaloid) 성분으로 탁솔, 세팔롬아닌(cephalomanine), 10-디아세틸세팔롬아닌(10-deacetylcephalomanine), 박카틴 Ⅲ(baccatin Ⅲ), 10-디아세틸박카틴 Ⅲ(10-deacetylbaccatin Ⅲ) 등을 포함한다.

특히, 주목의 식물 성분 중 탁솔은 진핵생물의 유사분열(mitosis)을 억제하는 약물로써 유사분열시 튜불린(tubulin)의 중합(polymerization)을 증가시켜 안정화함으로써 항암 작용을 나타낸다. 이러한 탁솔의 기능은 기존의 유사분열 억제제로 알려진 콜히친(colchicine)과 빈카 알칼로이드[vinca alkaloid (vincristine, vinblastine)]이 마이크로튜블(microtuble)을 분해하는 작용을 나타내는 것과는 구별되는 특징을 나타낸다(Schiff et al., 1979). 현재 탁솔은 흑색종(malignant melanoma), 폐암[advanced non-small lung cancer (NSCLC), small cell lung cancer (SCLC)], 방광암(urothelial cancer), 자궁암(oesophageal cancer), 백혈병(non-Hodginkins lymphoma) 등에 탁월한 효과가 있는 것으로 보고되었다(Spencer and Faulds et al., 1994). 또한 탁솔은 단독 투여뿐만이 아니라 시스프라틴(cisplatin), 칼보플라틴(carboplatin), 에토포사이드(etoposide) 등과 함께 투여하여 NSCLC, SCLC 등에 큰 효과가 있다고 보고되었다. 임상적으로는 현재 미국 식의약품 안전청(US Food and Drug Administration)에 의해 난소암(ovarian cancer)에 사용되는 것이 허가되었다(Spencer and Faulds, 1994).

탁솔은 그 강력한 항암효과로 인하여 많은 연구자들에 의해 초임계 유체 기술의 대상 화합물로 연구 대상이 되었다. 그러나 현재까지 밝혀진 바에 의하면 초임계 이산화탄소에 의해서는 추출 효율이 기존의 유기용매에 비해 50% 이하인 것으로 밝혀졌다(Vandana et al., 1996). 이러한 문제점을 극복하기 위하여 Vandana 등은 이산화탄소 대신에 N₂O에 에탄올을 첨가한 초임계 유체를 사용하여 탁 솔의 추출 효율을 증가시켰다 (Vandana et al., 1996). 그러나 이산화탄소에 비해 N₂O는 대량 사용시 폭발성이 보고되었고 또한 추출 대상 물질 내의 유기산등과 반응하는 것으로 알려져 있어 그 사용이 제한되어 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 산업전반에 걸쳐 모든 공정에서 환경에 대한 관심이 증가되는 현 상황에서 탁솔을 추출, 정제하는 공정 또한 기존의 유기용매를 이용한 추출, 정제 공정이 갖는 여러 문제점, 즉 환경 및 인체 독성, 목적 성분에 대한 비선택성, 고비용 등을 해결할 수 있는 새로운 공정을 개발키 위해 초임계 유체 추출 방법을 도입하여 주목에서 탁솔을 추출하는 방법을 개발한 것이다.

본 발명은 주목을 초임계 추출 장치에서 70∼90℃의 온도 및 4000∼6000 PSI 압력으로 이산화탄소를 주용매로 하고, 1∼20%의 메탄올, 에탄올, 물 또는 이들의 혼합용매를 공용매로 혼합시켜 추출한 후, 수차례 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분리 여과시키고, 최종적으로 HPLC를 이용하여 탁솔을 분리하는 탁솔의 제조 방법 및 제조된 탁솔을 제공하는 것이다.

또한 이때 탁솔의 초임계 추출 온도는 75∼85℃임을 특징으로 하고, 압력은 4700∼5300 PSI임을 특징으로 한다.

또한 칼럼 크로마토그래피는 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 분리 후, RP-18 수지 칼럼크로마토그래피로 분리하고, 마지막으로 세파텍스 칼럼 크로마토그래피로 분리함을 특징으로 한다.

또한 최종 탁솔 분리를 위한 HPLC는 펜타플루오로페닐을 충진시킨 칼럼을 사용함을 특징으로 한다.

상기 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 분리시 용출액으로는 추출물 중량대비 1∼30배의 클로로포름과 메탄올 혼합 용액을 순차적으로 그라디언트시켜 혼합비를 조절한 용액을 사용하고, RP-18 수지 칼럼크로마토그래피 분리시 용출액으로는 추출물 중량대비 1∼30배의 메탄올을 사용하며, 마지막으로 세파텍스 칼럼 크로마토그래피 분리시 용출액으로는 메탄올을 사용함을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

주목(Taxus cuspidata Siebold et Zuccarini)는 1998년 8월 서울대학교 약학 대학 부설 약초원(Medicinal Herb Garden, College of Pharmacy, Ilsan, Kyunki-Do, Korea)에서 채취하였다. 주목은 35∼45℃ 진공 오븐에서 60∼80시간 동안 건조한 후 0.71 mm 이하로 세절한 후 추출하였다.

탁솔 표준물질은 Sigma Chemical Co.(St. Louis,MO,U.S.A.)에서 구입하였다.

순수 화합물의 초임계 유체 추출 효율에 미치는 기질의 영향을 확인하기 위하여 1g의 필터 페이퍼 디스크[filter paper disk (Advantec No. 2, Toyo Roshi Kaisha, Tokyo, Japan)]를 1.0 cm으로 세절한 후 추출조에 넣었다. 각각의 대상 화합물 용액 (0.2 mg/mL)을 필터 페이퍼 디스크가 있는 추출조에 떨어뜨린 후 35∼45℃ 진공 오븐에서 20∼28시간 동안 건조한 후 사용하였다.

초임계 유체 추출 기기는 두개의 Isco 260D syringe pump(Lincoln, NE, U.S.A.)가 연결된 Isco supercritical fluid extractor, model SFX 3560을 사용하였다. 사용된 초임계 유체 추출 장치의 모식도는 도 1에 나타내었다.

냉각된 이산화탄소가 탱크로부터 먼저 시린지 펌프(12)에 주입되고 다른 하나의 시린지 펌프(12)에는 미리 선택된 공용매가 채워졌다. 이산화탄소와 공용매는 T-믹서에 의해 섞이고 예열기를 통해 원하는 온도로 예열된 용매는 공급 밸브(15)를 통해 추출조(10 : 57 mm 20 mm, Isco)에 주입되었다. 주입된 용매는 용질과 접촉을 위하여 일정시간의 접촉 시간(static time)을 거쳐 추출하였다.

일정시간의 접촉 시간을 거친 후 배출 밸브(16)가 열린 후 추출물이 수집 베셀(14)에 포집되었다. 유속은 일정온도(80 ℃)로 가열된 리스트릭터(13)를 통해 조절되며 추출물은 해압시의 손실을 방지하기 위해 메탄올이 채워진 수집 베셀(14)에 모았다.

추출이 끝난 후에는 세척 밸브를 통해 이산화탄소로 리스트릭터(13)에 남아 있는 추출물을 수집 베셀(14)에 모으고 다시 리스트릭터에 연결된 용매 펌프에 의해 메탄올로 리스트릭터에서의 해압과정시 남아 있을 가능성이 있는 추출물을 씻어내었다.

추출 성분의 초임계 유체 내 용해도를 측정한 후 다시 화합물의 추출 효율에 미치는 기질과의 관계를 확인하기 위하여 1 g의 여과지에 흡착된 시료를 최적 용해도를 나타내는 초임계 유체 조건에서 추출하였다. 유속 및 리스트릭터의 온도는 각각 1.0 mL/min 및 80 ℃였다.

탁솔이 흡착된 여과지의 추출은 탁솔이 흡착된 여과지는 80 ℃, 34.0 MPa 에서 순수 이산화탄소 및 부피비1, 5, 10 % (v/v)의 메탄올, 물, 에탄올가 공용매로 첨가된 이산화탄소를 사용하여 추출하였다.

주목의 추출은 잎, 줄기껍질, 뿌리 각 100 mg을 추출조에 넣은 후 여과지 실험과 같은 조건에서 초임계 유체 추출하였다. 추출 시간대별 분획은 초임계 유체 추출 장치에 장착된 분획 수집기(fraction collector)로 일정 시간 동안 추출한 후 배출 밸브를 닫고 다시 다음 수집 베셀에 추출물을 포집하였다.

탁솔의 분석을 위해 HPLC를 사용하였으며, 검출기로 사용한 UV 측정기의 파장은 228 nm이었다. 시료 용액은 20 ㎕ loop를 통해 주입되었으며 탁솔의 분석을 위해 사용된 HPLC 칼럼은 Curosil PFP (30×4.6 mm, Phenomenex, Torrance, CA, U.S.A) 가드 칼럼이 장착된 Curosil PFP (250×4.6 mm, 5 mm)였다. 이동상은 아세토니트릴-물 혼합액을 그라디언트로 사용하였다. 아세토니트릴 함량을 40 분간25%에서 65%까지 증가시킨 후 다시 10분 동안 80%까지 높였다.

본 발명에 따른 칼럼 크로마토그래피인 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 분리 후, HPLC 데이터를 도 2에 나타내었다. 또한 RP-18 수지 칼럼크로마토그래피로 분리한 데이터를 도3에 나타내었다. 마지막으로 세파텍스 칼럼 크로마토그래피로 분리한 후 PFP 칼럼으로 최종 분리후 탁솔의 HPLC 데이터를 도 4에 나타내었다.

이하 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.

(실시예 1) 주목 (Taxus cuspidata)으로부터 초임계 유체 기술을 이용한 탁솔의 용해도 측정

초임계 유체 기술을 이용하여 탁솔을 주목 (Taxus cuspidata)의 잎, 줄기 껍질, 뿌리로부터 초임계 이산화탄소를 이용하여 추출하였다. 그러나 탁솔은 알칼로이드와 달리 탁솔 구조내의 질소가 아마이드로 존재하기 때문에 강한 염기성을 나타내지 않을 뿐만 아니라 주목내에서도 다른 여타의 알칼로이드와는 달리 액포(vacuole)가 아닌 세포벽에 존재한다.

본 발명에서는 기존에 많은 문제점을 나태내는 탁솔의 초임계 이산화탄소 추출 법을 개선 보완하여 상용화가 가능한 방법으로 개발하고자 하였으며 이를 위하여 탁솔의 초임계 유체 내에서의 용해도, 다양한 공용매가 용해도에 미치는 영향, 기질과의 흡착성 등의 결과를 바탕으로 주목의 다양한 부위로부터 탁솔을 초임계 이산화탄소로 추출 정제하고자 하였다.

이상의 결과로 탁솔의 용해도 측정시 유속은 1.0 mL/min (80 ℃, 34.0 MPa) 이하, 용질과 용매의 접촉 시간은 15분 이상을 유지하면 추출 시간 40 분까지는 용해도가 일정하게 측정될 수 있음이 확인되었다.

(실시예 2) 탁솔의 초임계 이산화탄소 용해도에 미치는 공용매의 영향

탁솔의 용해도를 증가시키기 위하여 본 발명에서는 초임계 이산화탄소에 첨가하는 공용매로써 메탄올, 에탄올, 물을 사용하여 용해도의 변화를 측정하였다. 각각의 공용매를 첨가한 이산화탄소에 대한 탁솔의 용해도는 표 1에 나타내었다.

%	메탄올(㎍/㎖)	에탄올(㎍/㎖)	물(㎍/㎖)
1	9.4(±1.8)	4.9(±0.85)	6.1(±1.3)
5	37(±2.5)	32(±0.78)	4.0(±0.47)
10	250(±18)	130(±17)	2.9(±0.21)

표 1에 나타난 바와 같이 탁솔의 용해도는 모든 공용매의 경우 1% 부피비율로 첨가하였을 때에는 순수 이산화탄소에 비해 용해도가 오히려 감소하였다. 그러나 물이 포함된 공용매를 제외한 모든 공용매에서는 5% 이상을 첨가하였을 때에는 3배이상 용해도가 증가하였다.

특히 순수 메탄올을 첨가하였을 때 탁솔의 용해도가 가장 높게 나타났으며 10% 비율로 첨가하였을 때에는 용해도가 순수 이산화탄소에 비해 25배 가까이 증가하였다. 물의 경우에 있어서는 대부분의 경우 첨가하는 양에 용해도가 비례하지 않았으며 오히려 순수 이산화탄소에 비해 용해도를 감소 시켰다.

(실시예 3) 기질로부터 탁솔 탈착에 미치는 공용매의 영향

초임계 이산화탄소에 공용매의 첨가는 단순한 용해도의 증가외에도 기질로부터 탈착을 높여 추출효율을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에서는 이러한 결과에 근거하여 탁솔을 셀룰로즈 페이퍼(cellulose paper)에 흡착시킨 후 순수 이산화탄소 및 각각의 공용매를 첨가한 이산화탄소로 추출하여 그 회수율을 비교하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

순수 이산화탄소로는 회수율이 0.46(0.12)%였다. 공용매를 첨가한 실험에서는 추출 수율면에서 물이 가장 효과적이었다. 탁솔 용해도 측정 결과에서는 메탄올이 비교된 어떤 공용매보다 효과적이었다. 그러나 셀룰로즈 페이퍼로부터 탈착 실험에서는 이러한 용해도 결과와는 달리 물이 가장 효과적이었다. 물을 공용매로 사용할 경우 낮은 용해도에도 불구하고 높은 추출 효율을 나타내는 이유는 물이 이산화탄소와 완전히 섞이지 않는 것에 기인하는 것으로 여겨진다.

즉, 물은 메탄올이나 에탄올과는 달리 실험조건인 80 ℃, 34.0 MPa에서 완전히 단일 용매로 존재하지 않으므로 이산화탄소에 섞이지 않은 물은 기질에 작용하여 경쟁적으로 탁솔을 방출하고 탈착된 탁솔이 비록 소량일지라도 기질 바깥에 존재하는 용매에 녹아 추출되는 것으로 생각된다.

(실시예 4) 주목 (T. cuspidata)의 잎, 줄기 및 뿌리로부터 초임계 이산화탄소를 이용한 탁솔의 추출

용해도 및 셀룰로즈 페이퍼로부터 탈착 결과를 바탕으로 주목 (T. cuspidata)의 잎, 줄기 및 뿌리에서 탁솔을 초임계 유체 추출법을 이용하여 추출하고자 하였다. 일반적으로 탁솔 계열 물질의 자원으로는 T. brevifolia, T, baccata, T. cuspidata., T. canadensis, T. chinensis, T. globosa, T.wallichiana, T. yunnanensis, T. sumatrana 등이 사용되었다. 이 중 T. brevifolia의 줄기 껍질이 탁솔의 중요한 자원으로 사용되었으며 그 함량은 대략 0.01 % 정도로 알려져 있다.

본 발명에서 사용한 국내의 T. cuspidata 잎, 줄기 및 뿌리에서의 탁솔의 함량은 T. brevifolia의 줄기 껍질 보다는 훨씬 그 함량이 높았다. 잎에서는 0.039% (0.39±0.0019 mg/g), 줄기에서는 0.013% (0.13±0.0018 mg/g), 뿌리에서는 0.019% (0.19±0.00039 mg/g)의 탁솔이 검출되었으며 이는 기존의 탁솔의 자원으로 사용된 T. brevifolia보다 2∼4 배의 높은 함량을 나타낸다.

순수 초임계 이산화탄소를 이용하여 주목에서 탁솔을 추출하였다. 가장 높은 용해도를 나타낸 조건인 80 ℃, 34.0 MPa에서 추출 수율을 비교한 결과 잎, 줄기 껍질 및 뿌리에서 각각 0.24 mg/g(±0.026), 0.047 mg/g(±0.0087), 0.022 mg/g(±0.00070)을 나타내었다.

도 6에서 보인 바와 같이 잎으로부터는 탁솔이 62%가 추출되었으나 줄기껍질이나 뿌리부터는 각각 36, 12%의 상대적으로 적은 추출량을 나타내었다.

다음으로 추출 선택성 면에서 순수 이산화탄소와 기존의 메탄올 추출을 탁솔이 순수 이산화탄소에 의해 가장 높게 추출된 잎을 비교하였다. 그 결과 순수 초임계 이산화탄소는 추출물에 대한 탁솔의 함량이 0.33%로 메탄올 추출의 0.14%에 비해 두 배 가까운 높은 추출 선택성을 나타내었다.

다음으로 본 발명에서는 추출 수율을 높이기 위하여 80 ℃, 34.0 MPa의 초임계 이산화탄소에 메탄올, 에탄올 물을 공용매로 첨가하여 탁솔의 추출 수율을 측정하였다. 잎의 경우에 있어서는 각각의 공용매를 10% 첨가하였을 때 기존의 메탄올 추출에 비해 탁솔의 수율이 107∼143%까지 증가하였다.

특히 에탄올의 경우에는 단지 1% 만 첨가하더라도 110% 까지 높아졌다. 셀룰로즈 페이퍼 실험에서는 탁솔의 추출 수율이 물을 제외한 어떠한 공용매도 40% 이상을 나타내지 못하였다. 그러나 직접 식물체에서 추출하는 경우 모든 공용매가 추출 수율을 크게 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 원인은 탁솔이 잎의 기질에 셀룰로오즈만큼 강하게 흡착되어 있지 않아 순수 초임계 이산화탄소에 비해 약간의 탈착력을 나타내는 용매를 사용할 경우라도 추출 효율을 크게 증가시킬 수 있는 것으로 생각되었다.

한편, 물을 공용매로 사용하는 경우 특이한 결과를 확인할 수 있었다. 본 발명의 추출 기질인 잎, 줄기껍질, 뿌리에서 물을 공용매로 사용할 경우 5%이상에서는 순수 초임계 이산화탄소의 추출효율에 비해 크게 증가되었다. 그러나 1%의 경우에는 오히려 탁솔의 추출효율이 감소하였다. 이는 공용매로써의 물의 역할에서 기인한다. 물을 첨가하였을 때 탁솔의 추출 효율이 증가하는 것은 셀룰로즈 페이퍼 실험에서도 밝혔듯이 이산화탄소에 대한 용해도를 증가시키는 것이 아니라 기질로부터의 탈착을 증가 시켜 추출 효율을 높인다. 따라서 소량의 물은 식물 기질로부터의 용해도를 증가시키지 못할 뿐만 아니라 탁솔의 탈착에도 큰 영향을 미치지 못하기 때문이다.

주목으로부터 탁솔을 추출 정제하는 공정에 상업적 이용가능성을 확인하기 위하여 본 발명에서는 탁솔 함량이 가장 높고 그 채취가 항시 용이한 잎으로부터 탁솔의 추출 수율 외에도 추출 선택성을 살펴보았으며 기존의 메탄올 추출법과 비교하였다(도 7). 그 결과 잎으로부터 탁솔을 추출할 때 메탄올, 에탄올 및 물을 10% 부피비로 이산화탄소에 첨가할 시에는 메탄올 추출에 비해 추출물내에서의 탁솔의 추출 선택성이 4∼6배 증가하였다.

(비교예) 주목 (Taxus cuspidata Siebold et Zuccarini)으로부터 탁솔의 추출

주목의 잎, 줄기 껍질, 뿌리 각 100 mg을 메탄올 100 mL로 3 시간 동안 추출한 후 감압 농축하였다. 농축된 추출물을 다시 메탄올 1 mL에 녹인 후 메탄올, 물, 메탄올-물 (55:45) 각각 10 mL로 세척한 Sep-pak에 로딩(loading)한 후 메탄올-물 (55:45) 2 mL, 메탄올-물 (80:20) 6 mL, 메탄올 2 mL로 각각 흘려 이 중 메탄올-물 (80:20) 6 ml 분획을 감압 농축한 후 메탄올 1mL에 녹였다. HPLC 분석을 위하여 멤브레인 필터(membrane filter)로 여과하여 시료를 조제하였다. 비교예에 따라 추출된 탁솔의 수율은 본 발명의 탁솔의 수율에 비해 20∼30% 정도였다.

본 발명의 효과는 주목의 탁솔의 새로운 추출, 정제 방법으로 초임계 유체 기술을 적용하기 위하여 다양한 종류의 공용매가 추출 수율 및 목적 성분의 선택성에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 메탄올 및 에탄올, 물 등을 10%의 부피비로 초임계 이산화탄소에 첨가하였을 때 기존의 유기 용매 추출보다 수율 면에서 1.5배 추출 선택성 면에서 4배 이상 증가함을 확인하였다. 첨가한 공용매의 추출 기전에 미치는 영향을 밝히기 위하여 탁솔의 용해도 및 기질로부터의 탈착 정도를 측정한 결과 메탄올 및 에탄올은 초임계 이산화탄소의 극성을 높여 용해도를 증가시키는 것에 의해, 물은 기질로부터의 탈착 효율을 높여 추출 수율을 증대시키는 것이다.

Claims

주목을 초임계 추출 장치에서 70∼90℃의 온도 및 4000∼6000 PSI 압력으로 이산화탄소를 주용매로 하고, 5∼20%의 물을 공용매로 혼합시켜 추출한 후, 수차례 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분리 여과시키고, 최종적으로 HPLC를 이용하여 탁솔을 분리함을 특징으로 하는 탁솔의 제조 방법
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제1항에 있어서, 상기 칼럼 크로마토그래피는 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 분리 후, RP-18 수지 칼럼크로마토그래피로 분리하고, 세파텍스 칼럼 크로마토그래피로 분리함을 특징으로 하는 탁솔의 제조 방법
제1항에 있어서, 최종 탁솔 분리를 위한 HPLC는 펜타플루오로페닐을 충진시 킨 칼럼을 사용함을 특징으로 하는 탁솔의 제조 방법
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 분리시 용출액으로는 추출물 중량대비 1∼30배의 클로로포름과 메탄올 혼합 용액을 순차적으로 그라디언트시켜 혼합비를 조절한 용액을 사용하고, RP18 수지 칼럼크로마토그래피 분리시 용출액으로는 추출물 중량대비 1∼30배의 메탄올을 사용하며, 마지막으로 세파텍스 칼럼 크로마토그래피 분리시 용출액으로는 메탄올을 사용함을 특징으로 하는 탁솔의 제조 방법
제1항의 방법에 따라 제조된 탁솔