CN1427002A - 一种从种植红豆杉叶枝中制备紫杉醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种从种植红豆杉叶枝中制备紫杉醇的方法。使用种植生长了2－4年的红豆杉的树叶、树枝，剪除直径小于0.5cm的树枝后粉碎，用75％－95％的乙醇浸泡24－48小时，过滤后去除废渣，滤液浓缩后用1∶1乙酸丁酯和水分散萃取，乙酸丁酯萃取液浓缩、干燥得到1％紫杉醇粗原料；利用1％紫杉醇粗原料，经常压正相硅胶柱层析，以乙酸乙酯和环己烷梯度淋洗，分段收集淋洗液，将紫杉醇含量在10％－30％之间的馏分浓缩后经反相C₁₈高压液相色谱法分离。得到纯度为99.5％以上的紫杉醇。该方法工艺简单、成本低、试剂溶剂无毒性、不破坏天然资源、有利于生态保护。该方法特别适用于使用种植的红豆杉为原料生产紫杉醇。

Description

一种从种植红豆杉叶枝中制备紫杉醇的方法

本发明是一种从种植红豆杉叶枝中制备紫杉醇的方法。

紫杉醇是红豆杉树种中发现的一种天然有机化合物，它对乳腺癌、肺癌和白血病细胞等具有强杀伤作用。1971年Wani和Wall等(J.Amer.Chem.Soc.，1971，93，2325)首次报道了紫杉醇的分离及理化特征，并确定了其优良的抗癌活性，引起了人们广泛的关注。1983年美国食品药品管理署(FDA)批准将紫杉醇列为治疗乳腺癌和子宫癌药物，进入I期临床试验。基于多期临床试验结果，于1992年底被美国FDA正式批准作为治疗晚期卵巢癌药物进入市场，1993年底又被批准用于治疗乳腺癌。由于紫杉醇副作用小，药效显著，被称为继阿霉素及顺铂后最热点的抗癌新药，需求量迅速增加。

天然紫杉醇的来源极为有限，其主要来源于红豆杉树皮。红豆杉属植物，全世界有11种，中国有4种和1个亚种，分别为东北红豆杉(Taxus cuspid-ata Sieb.Et Zucc.)、南方红豆杉(Taxus mairei)、云南红豆杉(Taxus yunna-nensis)、西藏红豆杉(Taxus willichiana Zucc.)和美丽红豆杉(Taxus chinensis)。红豆杉树种生长极其缓慢，一颗生长百年的老树一般只能剥取25kg树皮，若提取1kg纯紫杉醇提供1万2千例癌病患者使用，相当于需要3万株红豆杉树的树皮。为了得到紫杉醇，国外开展了种植矮壮化的红豆杉树、组织培养、半合成和全合成紫杉醇等方法获取紫杉醇原料。美国使用杂交品种曼地亚红豆杉(Taxus media cv.Hicksii)，栽后3-5年其枝叶提取紫杉醇及其半合成前体物，向紫杉醇生产商百时施贵宝公司大量提供原料(Gragg等，J.Natural Prod.，1993，56，1657-1668)，但该树种生长缓慢。组织培养法获得的产量很小，培养液价格昂贵，全合成得率很小，成本巨大，难以商业化应用。半合成方法仍然需要天然红豆杉分离出的紫杉醇伴生物如10-去乙酰基巴卡丁III等作为初始原料。为了保护天然的红豆杉资源，维护生态环境，用生长快的、有效成分含量较高的种植红豆杉提取紫杉醇是最为有效的途径。

最近，我国在山东、东北、江西、福建等地种植了一定量红豆杉林，以福建省三明地区种植的南方红豆杉数量最大，种植3年以上的南方红豆杉种植量约30万株，种植3年以上约130万株，2001年又种植了150万株。在该地区，南方红豆杉生长很快，每株2年生南方红豆杉枝叶干重可达1.2公斤以上，紫杉醇含量在0.016％-0.025％之间，具有很高的利用价值。

对于红豆杉提取紫杉醇的分离纯化多为使用95％甲醇溶液浸取树皮提取液，提取液先进行脱脂后氯仿萃取；萃取液用水分散，氯仿层水层分离后浓缩，经色谱柱层析得到紫杉醇及其伴生物。常用的色谱柱层析法经需要多次柱层析，填料多分开填充不固定色谱柱，分离过程复杂，溶剂、淋洗液等毒性大，造成严重的污染。

Senilh(J.Natural Prod.，1984，47，131)等从欧洲杉(Taxul bacata)提取紫杉醇先用乙醇萃取树皮，浓缩后，在水和二氯甲烷中分配，经“过滤”色谱法分离；硅胶柱色谱分离；然后经氧化铝色谱分离；再经中压硅胶柱色谱分离；最后采用制备高压液相色谱分离。Miller(J.Org.Chem.，1981，46，1469)用Taxus wallichiana树根、树干和树叶，经甲醇萃取、浓缩至固体，在水和己烷中分配，用氯仿萃取，然后浓缩，用硅胶柱分离；再二次硅胶柱色谱分离；经逆流分配，二次逆流分配；最后用HPLC分离纯化得到184个组分，制得的紫杉醇纯度约99.1％。整个提取纯化过程主要有八个步骤，其中包括两次正相色谱柱层析。

Caster等(usp.5,440,055，1995)利用超临界法真接处理杉树叶子组织。因为杉树叶是可再生资源，利用树叶对保护稀有树种更加有益。该方法使用N₂O、CO₂、C₃H₈或CHClF₂等作为超临界气体，处理经干燥粉碎的杉叶，经系统中淋洗液抽取及C₁₈反向色谱柱分离，得到紫杉醇纯品，该方法处理约为每次30mg，最后得到的紫杉醇纯度约为99.4％。

Polysciences Inc.从太平洋红豆杉树皮中分离紫杉醇。先甲醇或乙醇萃取树皮，混合萃取后浓缩除去大部分溶剂；浓缩液用二氯甲烷萃取，萃取质浓缩干燥至粉末；粉末用丙醇和里格罗因(1∶1)溶解，不溶组分过滤除去；不含有紫杉醇的滤液浓缩，溶于30％丙醇里格罗因溶液，经Florisil柱过滤；从柱中流出的紫杉醇组分结晶纯化二次；结晶的紫杉醇近一步在硅胶柱中分离，该步中最相似的产物三尖杉宁碱从紫杉醇中分离出来；从柱中流出的紫杉醇再结晶二次；未分离的混合物和其它溶质，循环处理得到紫杉醇。

Rao等(usp.5,380,916，1992)使用臭氧处理最难分离的杂质组分三尖杉宁碱分离后得纯紫杉醇，淋洗液使用乙醇、氯仿等，最后反向制备色谱法分离粗产品后，仍含有一定量很难分开的三尖杉宁碱。紫杉醇与三尖杉宁碱的混合物通入臭氧氧化后，经过反向制备色谱分离得到纯度较高的紫杉醇，该方法需要使用二甲硫醚处理溶液中残留的臭氧及再结晶得到紫杉醇纯品。Kingston等(J.Natural Prod.，1992，55，259)也使用氧化剂O_SO₄氧化紫杉醇和三尖杉宁碱的混合物。紫杉醇不与四氧化锇反应，三尖杉宁碱的C-13侧链末端双键被氧化，易与紫杉醇分开。

Durand(usp.5,723,635，1998)利用离心分配色谱法分离纯化紫杉醇，使用一个C₁₈反相色谱柱可以良好地从粗产物中分离纯化紫杉醇，一次处理量较大。主要有四个步骤：在制备柱规模下，用反相色谱法处理紫杉醇粗处理物；从吸附剂上洗脱紫杉醇和其它产物；在洗脱的柱子中回收紫杉醇和相似物；使用臭氧纯化最终产物，从而分离除去紫杉醇的伴生物。

使用红豆杉的新鲜枝叶，也可以直接作为原料提取紫杉醇。Nalr(usp.5,279,949，1994)使用正相硅胶柱色谱法从曼地亚(Taxus media cv.Hicksii)新鲜杉树组织分离紫杉醇及其同系物。新鲜杉树组织用乙醇和水的混合物萃取Taxanes，萃取质浓缩除去大部分有机溶剂，水溶性组分离心与含紫杉醇的固体沉淀分离，过滤后的滤液用活性炭脱色用硅藻土过滤，滤液挥发至干，真空下过硅胶色谱柱，液相分离得到产物。或者将硅藻土过滤的滤液真空下脱乙醇后，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩，用真空液相色谱法经过硅胶柱纯化得到产物。Nalr(usp.5,478,736，1995)又通过改变萃取剂，即用甲醇和丙酮萃取新鲜杉树组织，可得到较高的紫杉醇产量。二次柱色谱分离，低压硅胶柱色谱分离粗紫杉醇组分，反相色谱最后纯化。

直接利用反相制备色谱，分离纯化紫杉醇的方法较为繁杂。Rao(usp.5,380,916，1995)用95％乙醇萃取干树皮3-5次，乙醇萃取物浓缩，用1∶1氯仿分散萃取。氯仿分离，再用氯仿萃取水相2次，将氯仿蒸发浓缩至干，形成固体在C₁₈填料层析柱上用乙腈和水梯度淋洗，分段承接含紫杉醇较高的馏分集中，用热水稀释后，反相柱再收集馏分，经重结晶得到高纯度的紫杉醇及其伴生物产品。

上述许多方法中大多使用毒性较大的氯仿、二氯甲烷等溶剂，分离过程包括结晶法、氧化杂质法、多次正相色谱法、多次反相液相色谱法、离心分配色谱法和超临界萃取法等，过柱冗长，达到99％以上纯度的紫杉醇一次得率较低。紫杉醇(a)与三尖杉宁碱(b)和7-表-10-去乙酰基紫杉醇(c)的性质相似(陈建民等，J.Liq.Chrom.& R.T.，2000，23，2499)，其结构分别如下：

(a)紫杉醇                                                     (b)三尖杉宁碱(c)7-表-10-去乙酰基紫杉醇针对以上三种化合物，建立一种较为简便、易于分离掉紫杉醇伴生物b、c的方法，是紫杉醇制备工业化生产的关键。

本发明使用种植的南方红豆杉、东北红豆杉、云南红豆杉和曼地亚红豆杉树枝、树叶为原料，经浸泡提取、乙酸丁酯萃取的前处理，然后常压正相硅胶柱层析色谱法分离及高压液相色谱分离得到高纯度紫杉醇的方法。所用乙酸丁酯、乙酸乙酯、环己烷等均为分析纯，经蒸馏后使用。乙腈为HPLC级，水为经美国生产的Millipore制备得到HPLC级水。原料及中间产品分析使用日本岛津1120型高压液相色谱仪，色谱柱为瑞典Kromasil生产的C₁₈硅胶色谱柱，填料尺寸为5μm，4.6×250mm，测定波长为227nm，流动相为乙腈+水(40+60)，流速为1ml/min，手动进样，进样量为10μm。高纯度紫杉醇分析使用美国Waters Breeze高压液相色谱仪，色谱柱为瑞典Kromasil生产的C₁₈，填料尺寸为5μm，4.6×250mm色谱柱，分析波长为227±2nm，流动相为乙腈+水(40+60)，流速为1.0ml/min，自动进样，进样量为10μm，色谱柱用恒温箱，柱温为35℃，PIII计算机控制，计算机操作，色谱软件为Millium2000。液-质谱分析在美国Finnigan公司生产的LCQAD-30000SPCL型LC/(MS)n进行，APCI/ESI源，液相分析为二极管矩列(PDA)监测器，Zorbax2.1×100mmC₁₈色谱柱，填料尺寸为5μm，流速为0.3ml/min，进样量为5μl，电压为15KV，扫描范围为M/Z在30-2000之间。KLG-II型离心冷冻干燥机。上海申生公司生产的5L-20L旋转蒸发仪。纯品使用美国Bush生产的21011V001R型旋转蒸发仪。CS501-SP超级数显恒温器，W22-2A自动超声仪，WKS-1A数显熔点仪。美国Waters公司生产的PrepLC 4000型制备型高效液相色谱，色谱软件为Millium2000³²，制备柱为不锈钢色谱柱，最大填充长度为370cm，直径为30cm，检测波长为227±2nm，乙腈和水混合流动相，乙腈比例从20％上升到80％，每次制备操作时间约为160min。傅立叶红外光谱测定在美国Nicolet公司生产的Avatar360傅立叶红外光谱仪上进行，Digital PII电子计算机控制光谱软件OmicZ.S.P.采集傅立叶红外光谱，样品与KBr的比例为1∶160。

本发明制备紫杉醇的方法过程如图1所示。图1所示的工艺过程分为三个过程。第一过程为利用种植的红豆杉枝叶新鲜或干燥前处理过程，即将新鲜或干燥的树叶、树枝粉碎后，在20-40℃用80％-95％乙醇浸泡24-72小时，原料和乙醇的投料体积比为1∶1-1∶5，浸泡液过滤去除滤渣，滤液置于旋转蒸发仪或浓缩罐中浓缩至干，形成暗绿色或棕色粉末，用乙酸丁酯溶解后，加入同体积的水分散，上层乙酸丁酯溶液为萃取液。0.5-2小时后，将乙酸丁酯层与水层分开，取乙酸丁酯层蒸发浓缩干燥得到暗绿色或深棕色粉末。该过程中制备的紫杉醇含量在1％以上(见图2)。

第二过程为乙酸丁酯层蒸发浓缩干燥得到的粉末，用乙酸乙酯溶解，同硅胶混合制备干样。干样置于硅胶柱上端用环己烷和乙酸乙酯的混合溶剂梯度淋洗，用相同体积的容器承接得到相同体积的馏分1-15。馏分1、2蒸干后均为淡黄色胶状物，检测不到紫杉醇；馏分3-5蒸干后为淡棕色微胶状固体，其中馏分5中含有极少量的紫杉醇，馏分6-8中，含有较多7-表-10-去乙酰基紫杉醇及7-表-紫杉醇，其中馏分6中的紫杉醇含量为0.6％，馏分7约含紫杉醇3.5％，8中约含紫杉醇7.3％，馏分9-13蒸干后，为黄色或绿黄色固体粉末。其中馏分9含紫杉醇约为8.8％，馏分10-13中紫杉醇含量在10.0％-30.0％之间，馏分12的HPLC图谱如图3所示。由图3可见，通过正相分离7-表-10-去乙酰基紫杉醇被部分除去紫杉醇含量为27.5％。馏分13中三尖杉宁碱比紫杉醇的含量高出约3-5％；馏分14-15蒸干后为淡绿色(使用新鲜枝叶)或综黄色固体粉末(使用干燥枝叶)，紫杉醇含量在7.5-0.8％之间。该过程中紫杉醇含量在10.0-30.0％之间的馏分合并蒸干用乙氰溶解，进行第三过程进一步纯化紫杉醇。

第三过程中，使用高效液相色谱柱，注入27.5％紫杉醇10克乙氰溶液，以乙腈和水作为流动相，从0min至5min乙氰比例为25％；从5min至35min乙氰比例从25％上升到45％，并保持30min；从65min至120min乙氰比例从45％上升至80％，并保持30min。使用上述梯度对紫杉醇乙腈溶液进行分离纯化，制备HPLC过程如图4所示。分三段承接得到馏分16-18。馏分16为收集的保留时间在0-80min之间的流动相，馏分17为80-92min的流动相，馏分18为92-150min的流动相。馏分16蒸干后分析表明为杂质组分，含有较多量三尖杉宁碱；馏分17均为紫杉醇，纯度高达99.6％，HPLC分析图谱如图5所示；馏分18中有少量紫杉醇及紫杉醇峰后的较多杂质，主要为7-表-10-去乙酰基紫杉醇，紫杉醇含量为3.0％以下。该过程中，馏分17在旋转蒸发仪中真空、40℃以下小心蒸干，可获得99.6％的高纯度紫杉醇。该产品为白色固体粉末，旋光度为-56°(甲醇溶液中)，熔点为236-238℃，400MZ核磁共振图谱验证与紫杉醇标准样品相同，液-质联用色谱分析M/Z⁺为853.6。该产品与标准样品在HPLC分析中保留时间一致。产品的傅立叶红外光谱如图6所示。

图1紫杉醇的制备流程图图2从枝叶经分离得到馏分12(紫杉醇含量为1.32％)的高效液相色谱图图3馏分12(紫杉醇含量为27.5％)的高效液相色谱图图4分离纯度27.5％紫杉醇的制备型高效液相色谱图图5馏分17(产品)的高效液相色谱图图6产品的傅立叶红外光谱图

实施例1：

采集新鲜种植2年的南方红豆杉树叶及直径小于0.5cm的树枝1kg，用破碎机粉碎，成粘性糊状，转移至5L烧杯中，加入95％乙醇3L，搅拌均匀，常温放置48小时。48小时以后，用砂芯漏斗抽虑，去除废渣，将滤液浓缩至粘稠液，此时该粘稠液为深绿色，体积约为90ml。向该溶液加入2L乙酸丁酯，混合均匀后加入2L水，搅拌30min，放置约20min，形成上层淡绿色清液及下层深绿色胶状液。上层清液与下层胶状液分开后，将上层清液溶剂置于旋转蒸发仪中蒸发至干，形成暗绿色粉末，重量为14.3克，经测定紫杉醇含量为1.32％以上，下层胶体液中不含紫杉醇。

实施例2：

取种植2年的南方红豆杉干叶及直径小于0.5cm的干枝1kg，用破碎机粉碎至1.2mm以下，除大枝叶后置于5L烧杯中，加入90％乙醇3L，搅拌均匀，常温放置72小时。放置过程中搅拌3-4次，浸泡完成后用砂芯漏斗抽虑，去除废渣，将滤液浓缩至呈浅绿色粘稠液，体积约为100ml。向溶液加入2L乙酸丁酯，混合均匀后加入2L水，搅拌30min，放置约20min形成上层淡青色清液及下层淡绿色胶体。上层液与下层液分开，将上层液放置于旋转蒸发仪中蒸发至干，形成深棕色粉末，重量为15.6克，经测定紫杉醇含量为1.27％以上，下层胶状液不含紫杉醇。

实施例3：

取种植生长2年以上的南方红豆杉干叶及直径小于0.2cm的干枝100kg，用破碎机粉碎后置于2m³的提取罐中，然后加入90％乙醇500L，搅拌均匀，常温浸泡24小时。浸泡过程中用抽取罐内置搅拌器搅拌。浸泡完成后，放出提取罐中的溶液(提取罐底部装有拆卸的砂芯虑头)，然后用同样方法浸泡3次。以上得到的废渣离心回收废渣中残留的乙醇溶液，并与提取罐中放出的乙醇溶液集中后置于浓缩罐中浓缩，至体积约为20L。提取罐中，用约20L乙酸丁酯分3次冲洗后集中，向该溶液加入约250L乙酸丁酯，混合均匀后加入250L水，搅拌1小时，放置约30min形成两层，放出下层胶状液，将上层液蒸发至干，形成深棕色粉末1374克，经测定紫杉醇含量为1.31％以上。使用过的硅胶在280-550℃下焙烧24-36小时重新使用效果相同。采用该方法处理的硅胶至少可重复使用12次以上。

实施例4：

称取紫杉醇含量在1.0％以上的粉末1kg，用乙酸乙酯溶解后加入2kg硅胶，旋转蒸发后得到硅胶干样。将干样填入装有10kg的玻璃层析柱上端，分别用20L环己烷、30L环己烷+乙酸乙酯(1+4)、30L环己烷+乙酸乙酯(2+1)、50L环己烷+乙酸乙酯(1+2)和20L乙酸乙酯淋洗，每10L收集一个馏分，共承接15个馏分。

蒸干1-5馏分，重量约为120克，为淡棕色胶状物或微粘胶固体，其中仅馏分5中含有极少量紫杉醇，将其全部去除，馏分6-9合并蒸干后得棕红色粉末225克，紫杉醇含量为6.8％，将所有粉末制成干样，进行柱层析分离，将馏分10-13中紫杉醇含量在10.0-30.0％之间的馏分10-13集中进行制备型HPLC处理。该部分重量总共为641克，紫杉醇平均含量为27.5％。

实施例5：

称取含量为27.5％的粉末10克，溶于100ml乙腈中，进行反相制备高效液相色谱法分离。流动相为乙腈和水，注入27.5％紫杉醇乙氰溶液，以乙腈和水作为流动相，从0min至5min乙氰比例为25％；从5min至35min乙氰比例从25％上升到45％，并保持30min；从65min至120min乙氰比例从45％上升至80％，并保持30min。流速为140ml/min。使用上述梯度对紫杉醇乙腈溶液进行分离纯化，在80min前、80-92min和92-150min承接得到三个馏分16、17和18，对馏分17在40℃真空度为0.01MP下小心旋转蒸发脱除流动相，得产品2.66克，HPLC测定表明紫杉醇纯度为99.6％(见图5)。回收率约为96.3％。产品的傅立叶红外光谱见图6。KBr基底下紫杉醇底红外吸收分别为2925、1724、1243、1070、712cm^-1，在3433cm^-1的红外吸收峰为水的红外吸收峰。

Claims (10)

1.一种从种植红豆杉叶枝中制备紫杉醇的方法。种植红豆杉叶枝特征是：

(1)使用种植的南方红豆杉的树叶和直径在0.5cm以下的树枝，种植期生

   长2年以上；

(2)本方法适用于种植的南方红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、西藏红

   豆杉、美丽红豆杉和曼地亚红豆杉等；

(3)权力要求书1中(1)、(2)中的树叶、树枝，可以是新鲜的，也可以是干

   燥的；

(4)对权力要求书1(3)中干燥的树叶、树枝的处理方法为阴凉处自然凉

   干或30-60℃加热干燥的；

2.对权力要求书1所述的树叶、树枝粉碎后，在室温下用75％-95％乙醇浸渍24-72小时，浓缩后用体积比为4∶1-1∶4的乙酸丁酯和水萃取；

3.对权力要求书2所述的乙酸丁酯萃取液浓缩，得到纯度在1％左右的紫杉醇的浓缩液；

4.对权力要求书3中所述的浓缩液用填充硅胶色谱柱分离。填充硅胶的色谱柱长度为80-1800cm，柱直径8-220cm，硅胶粒径为10-50μm，表面积为450m²/g，用硅胶填充色谱柱后，上层覆盖干法上样制备的；

5.对权力要求书4中所述的干法上样制备步骤为10-50μm的硅胶与同样体积的1％紫杉醇浓缩液混合均匀，旋转蒸发至浓缩全部蒸出，形成硅胶吸附1％紫杉醇的干样；

6.对权力要求书5中所述的硅胶吸附1％紫杉醇的干样，称取一定干样覆盖于色谱柱中的硅胶上，干样重量与填充的硅胶重量比在1∶2-1∶20之间；

7.按权力要求书4、5、6中所述填充了干样及硅胶的色谱柱用淋洗液梯度淋洗，淋洗液分为5个梯度，加入顺序分别为环己烷、环己烷+乙酸乙酯(4∶1)、环己烷+乙酸乙酯(1∶1)、环己烷+乙酸乙酯(1∶4)、乙酸乙酯，淋洗液流出色谱柱分段收集馏分，按段将含紫杉醇在10％-30％之间的淋洗液馏分集中起来，经蒸发、浓缩、干燥，制得中间产品。对含量低于10％的紫杉醇淋洗液集中收集，按权力要求书4干法上样重新分离；

8.根据权力要求书7，纯度在10％-30％的紫杉醇用乙腈溶解，用高压液相色谱分离，色谱柱为C₁₈硅胶填料，流动相为乙腈和水。经分离后，含纯紫杉醇的流动相经蒸发、干燥，可制备得到纯度高达99.5％以上的紫杉醇；

9.根据权力要求书4-7，使用过的硅胶经处理后可多次使用。处理条件为280-380℃下焙烧24-36小时，反复使用次数至少可达12次；

10.根据权力要求书7和8，淋洗液和流动相中的溶剂经过精馏后得到的乙酸丁酯、环己烷、乙酸乙酯和乙腈可反复使用。

Images