CN104262341A - 一种舒张血管活性化合物钩藤碱的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种舒张血管活性化合物钩藤碱的提取方法，所述方法包括如下步骤：(1)将原料粉碎、过筛，得原料粉末，将其加入到有机溶剂中，再通入二氧化碳，形成膨胀溶剂体系进行搅拌提取，得提取液；(2)浓缩提取液，得初提浓缩物；(3)向初提浓缩物中加入无机物溶液和有机溶剂，进行液液萃取，分层得有机相I，向有机相I中加入水，充分搅拌均匀，分层得有机相II，将其浓缩得浸膏；(4)将浸膏溶解并装入层析柱顶部，溶剂洗脱，收集洗脱液，浓缩得粗产物，重结晶得钩藤碱。如此得到的钩藤碱具有良好的得率和纯度，在工业化生产上具有良好的应用前景和潜力。
Description
技术领域
本发明涉及具有药理活性的植物活性化合物的提取方法，更具体地涉及一种舒张血管活性化合物钩藤碱的提取方法，属于植物活性成分提取领域。
背景技术
钩藤(Ramulus Uucariae cum uncis)原名钩藤，是我国传统的重要中药，属于茜草科钩藤属，广泛分布在我国的南方各省，如贵州、福建、江西、湖南、云南、广东、广西、四川等地。其种类繁多，例如有钩藤、大叶钩藤、毛钩藤、华钩藤、无柄果钩藤等。
钩藤的入药部位主要为钩藤属植物的干燥带钩茎枝，经过研究发现，其主要成分为钩藤生物碱以及常春藤苷元、钩藤苷元A、钩藤苷元B、钩藤苷元C、乌苏酸、β-谷甾醇等，进一步的主要为吲哚类生物碱，例如钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱、柯诺辛碱B、去氢钩藤碱、去氢异构钩藤碱等。其中，钩藤碱和异钩藤碱是钩藤生物碱中最重要的两种成分，其含量可分别达到钩藤生物碱的30％和15％左右。
钩藤碱具有优异的药理活性，其结构式如下：
经过研究发现，钩藤碱对心脑血管系统、中枢神经系统、肺部呼吸系统、坐骨神经等均具有良好的药理活性作用，尤其是对心脑血管系统而言，钩藤碱通过抑制血管运动中枢，以及阻滞交感神经及其神经节，从而使得外周血管扩张。此外，钩藤碱通过抑制细胞内的Ca2+释放，可以产生直接的血管扩张。科研工作者发现，钩藤碱可以直接扩张小血管，且对多种激动剂所致的血管收缩有效。
由于钩藤碱具有血管扩张、舒张效果，从而在心脑血管系统临床领域具有良好的应用前景和临床潜力。此外，如上所述，其在多个其它治疗领域同样具有优良的治疗效果，从而使得其在中药活性成分领域具有重要的应用。
正是由于钩藤碱如此的药理效果，科研工作者对其提取方法和化学合成方法进行了大量的研究，并取得了一定的成果，例如：
CN102093359A公开了一种从钩藤中提取钩藤碱单体的提取工艺，其包括如下步骤：(1)取40目钩藤粉，按照每重量份钩藤粉加入5-10体积份的低级醇水溶液配置成钩藤液，于4℃下保存8-16h，得到钩藤冷浸液；(2)将步骤(1)所述的钩藤冷浸液于室温超声30-60min，过滤，蒸干，得到固体粗提物；(3)步骤(2)得到固体粗提物经丙酮溶解后，柱层析法洗脱固体粗提物的溶解液，其洗脱液为丙酮石油醚氨水，洗脱速度为每小时200-250ml，收集馏分段，收集时间为14-16h；(4)将步骤(3)所得馏分用盐酸萃取，收集酸液后以氯仿萃取，水相用氨水调节其pH为8-9，离心收集沉淀；(5)将步骤(4)所得沉淀以超纯水反复洗涤脱色3次，-80℃冻干，即得纯度>90％的钩藤碱单体。
CN102311435A公开了一种高纯度钩藤碱的制备方法，所述方法包括：取钩藤药材粉碎20-60目，加入4-5倍量5％的碳酸钠溶液超声提取1小时，滤除液体，再加入二氯甲烷超声提取2-3次，提取液回收试剂，浓缩至小体积，采用高速逆流色谱分离，紫外检测器在线监测，收集目标成分，冷藏结晶即得高纯度钩藤碱。
CN103789369A公开了一种钩藤碱和异钩藤碱的合成方法，包括以下步骤：(1)取色胺和裂环马钱素放入烧瓶中，加水和冰醋酸，60℃反应2-5天；反应结束后减压蒸出溶剂得产物；(2)取上述得到的产物和β-葡萄糖苷酶，37℃反应2-5天；反应液冷却后用氯仿萃取3次，合并萃取液，无水硫酸镁干燥，得到化合物；(3)取上述化合物溶于甲醇中，加Pd/C，置于加氢反应釜中室温加氢6小时；反应结束后，过滤除去催化剂；滤液加固体无水碳酸钠和硫酸二甲酯进行甲基化反应；减压除去溶剂后，过硅胶柱分离得到钩藤碱和异钩藤碱的混合物。
王瑞俭等人(“钩藤碱提取工艺研究”，《吉林林学院学报》，第14卷第2期，1998年，p.109-111)设计了钩藤碱的几种提取方法：乙醇提取法、碱化醚提法、碱化苯提法和碱化醇提法，经过研究发现，碱化醚提法和碱化苯提法可得到较高的提取率，而乙醇提取法不甚可取。
张荣等人(“钩藤中钩藤碱、异钩藤碱的提取与含量测定”，《中药新药与临床药理》，第20卷第4期，2009年7月，p.338-341)对钩藤中钩藤碱的提取进行了研究，发现甲醇冷浸超升提取法的提取率是水煎法的10倍以上，其中影响提取率的因素从大到小依次为超声时间、甲醇用量、冷浸时间。
李晓云等人(“正交设计优选钩藤碱的提取工艺”，《亚太传统医药》，第5卷第1期，2009年6月，p.49-50)公开了钩藤碱的提取工艺研究，发现采用乙醇回流提取时，以体积分数90％的乙醇、3h的提取时间和3次提取是最佳工艺。
如上所述，现有技术中公开了多种钩藤碱的提取方法，但这些提取方法仍存在一些缺陷，例如提取率不高、纯度偏低等等。因此，研发一种钩藤碱的具有高提取率和高纯度的新型提取方法，非常具有必要性，也是目前钩藤碱提取领域的研究热点和重点，这也正是本发明得以完成的基础和动力。
发明内容
为了开发钩藤碱的具有高提取率和高纯度的新型提取方法，本发明人对此进行了大量深入的研究，在付出了充分的创造性劳动和经过深入的科学探究后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明涉及一种舒张血管活性化合物钩藤碱的提取方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将原料粉碎、过筛，得原料粉末，将其加入到有机溶剂中，再通入二氧化碳，形成膨胀溶剂体系进行搅拌提取，得提取液；
(2)浓缩提取液，得初提浓缩物；
(3)向初提浓缩物中加入无机物溶液和有机溶剂，进行液液萃取，分层得有机相I，向有机相I中加入水，充分搅拌均匀，分层得有机相II，将其浓缩得浸膏；
(4)将浸膏溶解并装入层析柱顶部，溶剂洗脱，收集洗脱液，浓缩得粗产物，重结晶得钩藤碱。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(1)中，所述原料是各种钩藤类植物的干燥带钩茎枝，所述钩藤类植物例如可为钩藤、大叶钩藤、毛钩藤、华钩藤、无柄果钩藤等中的任何一种或多种的混合物，优选为大叶钩藤。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(1)中，将原料粉碎，过50-150目筛，例如过50目、100目或150目筛，得到原料粉末。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(1)中，所述有机溶剂为异丙醇和乙酸乙酯的混合物，其中异丙醇与乙酸乙酯的体积比为1:2-4，例如可为1:2、1:2.5、1:3、1:3.5或1:4，优选为1:3。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(1)中，所述原料粉末与有机溶剂的质量体积比为1:10-20g/ml，即每1g原料粉末使用10-20ml所述有机溶剂，例如可为1:10g/ml、1:15g/ml或1:20g/ml。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(1)中，通入二氧化碳后，密封加压，使得所形成的膨胀溶剂体系的压力为1.5-2.5MPa，例如可为1.5MPa、2MPa或2.5MPa。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(1)中，所述有机溶剂与所述二氧化碳的体积质量比为1:3-5ml/g，即每1ml所述有机溶剂使用3-5g二氧化碳，例如可使用3g、4g或5g。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(1)中，搅拌提取的温度为30-50℃，例如可为30℃、40℃或50℃；提取时间为1.5-3小时，例如可为1.5小时、2小时、2.5小时或3小时。
在本发明的所述提取方法中，所述步骤(2)的具体操作如下：在40-50℃水浴中，用氮气吹扫提取液，直至近干，即为初提浓缩物。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(3)中，所述无机物溶液为KH2PO4水溶液，其质量百分浓度为8-12％，例如可为8％、10％或12％，最优选为10％。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(3)中，所述有机溶剂为丙酮与石油醚的混合物，其中丙酮与石油醚的体积比为1:1.5-4，例如可为1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5或1:4，优选为1:2.5-3。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(3)中，所述无机物溶液与有机溶剂的体积比为1:0.6-1.4，例如可为1:0.6、1:0.8、1:1、1:1.2或1:1.4，优选为1:1。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(3)中，所述初提浓缩物与无机物溶液的质量体积比为1:15-25g/ml，即每1g初提浓缩物使用15-25ml所述无机物溶液，例如可为1:15g/ml、1:20g/ml或1:25g/ml。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(3)中，加入到有机相I中的水的用量并无特别的限定，例如有机相I与水的体积比可为1:0.5-2，例如可为1:0.5、1:1、1:1.5或1:2。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(3)中，分层得到有机相II后，将其在40-50℃的水浴中，氮气吹扫，直至有机溶剂挥发完全，得到浸膏。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(4)中，将浸膏用乙醇溶解，乙醇的量并无特别的限定，只要其能够将浸膏溶解完全即可。但为了随后过层析柱的方便，优选其量为能够恰恰将浸膏完全溶解的量。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(4)中，所述层析柱以其柱体积(即柱的内部空间体积)计，自上而下依次填充20％碱性氧化铝、15％中性硅胶、10％碱性硅胶、5％中性氧化铝和30％大孔弱酸性阳离子交换树脂(例如柱的高度为1000mm，则装填200mm的碱性氧化铝、150mm中性硅胶、100mm碱性硅胶、50mm中性氧化铝和300mm大孔弱酸性阳离子交换树脂)。换言之，碱性氧化铝、中性硅胶、碱性硅胶、中性氧化铝和大孔弱酸性阳离子交换树脂在柱中的高度分别为柱高度的20％、15％、10％、5％和30％，保留20％未装填的柱高度以进行洗脱液的洗脱。
其中，所述中性硅胶和中性氧化铝的粒度均为100-200目。
其中，所述碱性氧化铝为公知的市售产品，其粒度为100-150目。
其中，所述碱性硅胶按照下面的方法制得，或者说其制备方法如下：
(I)将粒度为100-200目的中性硅胶(为公知的市售产品)于马弗炉中和550℃下高温烘烤15小时，然后降低温度到200℃并在该温度下保温下1.5小时，然后取出并自然降温到室温，得到活化硅胶；
(II)向活化硅胶中加入摩尔浓度为1mol/L的NaOH水溶液，并在摇床上充分振荡，直至没有结块为止，得到所述碱性硅胶；其中，所述活化硅胶与NaOH水溶液的质量比为1:0.5。
其中，所述大孔弱酸性阳离子交换树脂优选为丙烯酸系列阳离子交换树脂，更优选为CD180树脂(有时也称为CD-180树脂)、D110树脂(有时也称为CD-110树脂)、D113树脂(有时也称为CD-113树脂)、D151树脂(有时也称为CD-151树脂)或D152树脂(有时也称为CD-152树脂)，最优选为CD180树脂。
其中，所述大孔弱酸性阳离子交换树脂在装柱前，使用质量百分比浓度为95％的乙醇浸泡15-25小时。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(4)中，所述层析柱装柱完毕后(即正式开始提取前)，加入石油醚，使其液面始终处于碱性氧化铝之上，自然沉降2-4小时，然后排出石油醚。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(4)中，所述浸膏(即未溶解前的，也即步骤(3)所得到的浸膏)与所述碱性氧化铝的质量比为1:30-50，例如可为1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(4)中，首先使用正己烷进行洗脱，其体积用量为1-2倍柱体积(含义同上，即为柱的内部空间体积，例如柱的内部空间体积为1000mm3，则使用1000-2000mm3的正己烷进行洗脱，下面具有相同的含义)；然后使用乙酸乙酯进行洗脱，其体积用量为1.5-2.5倍柱体积；最后使用正丁醇与乙醚的不同体积比的混合溶剂进行梯度洗脱，正丁醇与乙醚的体积比为分别为15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1和2:1，每个不同体积比的混合溶剂用量均为1-1.4倍柱体积，收集并合并两者体积比为10:1、7:1和5:1的洗脱液，然后在40-50℃水浴中，用氮气吹扫洗脱液，直至近干，得到粗产物。
在本发明的所述提取方法中，在步骤(4)中，将粗产物在乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂中进行重结晶，粗产物与混合溶剂的质量体积比为1:15-25g/ml，即每1g粗产物使用15-25ml的混合溶剂，例如可使用10ml、20ml或25ml；其中，在混合溶剂中，乙酸乙酯与正己烷的体积比为1:4-6，例如可为1:4、1:5或1:6。
优选地，该重结晶步骤如下：将上述体积比的乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂加热到50-60℃，然后加入粗产物，粗产物与混合溶剂的质量体积比为1:15-25g/ml，搅拌使其充分溶解；然后以3℃/分钟的降温速率进行梯度降温，直至降至10±2℃，并在该温度下保持3-4小时；最后过滤，得到晶体，去离子水洗涤，在45-55℃的真空烘箱中干燥，得到最终产物钩藤碱。
如上所述，本发明提供了一种舒张血管活性化合物钩藤碱的提取方法，所述方法通过诸多特定条件的选择和/或选择以及彼此之间的协同作用，而取得了优异的技术效果，包括优异的提取率和纯度，从而比现有技术中具有更大的技术优势，在工业化生产和应用方面具有广阔的前景和潜力。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
制备例1：碱性硅胶的制备
(I)将粒度为200目的中性硅胶置于马弗炉中和550℃下高温烘烤15小时，然后降低温度到200℃并在该温度下保温下1.5小时，然后取出并自然降温到室温，得到活化硅胶；
(II)向活化硅胶中加入摩尔浓度为1mol/L的NaOH水溶液(所述活化硅胶与NaOH水溶液的质量比为1:0.5)，并在摇床上充分振荡，直至没有结块为止，得到所述碱性硅胶。
制备例2：层析柱的装填
1.将大孔弱酸性阳离子交换树脂CD180树脂用质量百分比浓度为95％的乙醇浸泡20小时。
2.取内径为2cm的1米长的透明玻璃管装填柱，在下端出口处用脱脂棉塞紧，以防止其中的装填物漏出。然后，依玻璃管的体积计，自上而下填充20％碱性氧化铝(市售、粒度为150目)、15％中性硅胶(市售、粒度为200目)、10％碱性硅胶(上述制备例1得到的)、5％中性氧化铝(市售、粒度为200目)和30％大孔弱酸性阳离子交换树脂(经上述步骤1处理的CD180树脂)。
3.装填完毕后，向柱中缓慢加入石油醚，使其液面始终保持在柱中最上端的碱性氧化铝之上，下端用容器接收流出的石油醚。如此冲洗沉降3小时使其沉积致密，然后让石油醚流出，从而得到层析柱。除非另有说明，否则在如下的所有实施例中均使用该层析柱。
实施例1
(1)将大叶钩藤的干燥带钩茎枝粉碎，过100目筛，得原料粉末；将该原料粉末加入到下表1所示的有机溶剂中(原料粉末与有机溶剂的质量体积比为1:15g/ml)，然后通入二氧化碳(混合有机溶剂与二氧化碳的体积质量比为1:4ml/g)，密封加压，使其压力为2MPa，以形成膨胀溶剂体系，并在40℃下搅拌提取2小时，得到提取液；
(2)在40-50℃水浴中，用氮气吹扫提取液，直至近干，得到初提浓缩物；
(3)向初提浓缩物中加入质量百分浓度为10％的KH2PO4水溶液和有机溶剂(初提浓缩物与KH2PO4水溶液的质量体积比为1:20g/ml、KH2PO4水溶液与有机溶剂的体积比为1:1)，其中有机溶剂为丙酮和石油醚的混合物(丙酮与石油醚体积比为1:2.5)，进行液液萃取，分层得有机相I，向有机相I中加入等体积的水，充分搅拌均匀，分层得有机相II，将有机相II置于40-50℃的水浴中，氮气吹扫，直至有机溶剂挥发完全，得到浸膏；
(4)将浸膏用恰恰能将其完全溶解的适量乙醇溶解，然后加入到层析柱顶部(浸膏与层析柱中碱性氧化铝的质量比为1:40)；首先使用1.5倍柱体积的正己烷进行洗脱，然后使用2倍柱体积的乙酸乙酯进行洗脱，最后使用正丁醇与乙醚的不同体积比的混合溶剂进行梯度洗脱，正丁醇与乙醚的体积比为分别为15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1和2:1，每个不同体积比的混合溶剂用量均为1.2倍柱体积，收集并合并两者体积比为10:1、7:1和5:1的洗脱液，然后在40-50℃水浴中，用氮气吹扫洗脱液，直至近干，得到粗产物；
将体积比为1:5的乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂加热到55℃，然后加入粗产物(粗产物与混合溶剂的质量体积比为1:25g/ml)，搅拌使其充分溶解；然后以3℃/分钟的降温速率进行梯度降温，直至降至10±2℃，并在该温度下保持4小时；最后过滤，得到白色的针状晶体，去离子水洗涤，在50℃的真空烘箱中干燥，得到最终产物。
对该最终产物使用高效液相色谱进行分析，并分离其中与钩藤碱标准样品具有相同保留时间的流出组分，对其进行分析，其各种表征数据如下：
熔点：203-204℃；
核磁共振：1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm：9.04(s,1H),7.27(d,J＝7.6Hz,1H),7.28(s,1H),7.16(m,1H),7.00(m,1H),6.81(d,J＝7.5Hz,1H),3.76(s,3H),3.55(s,3H),3.27(dd,1H),3.20(m,1H),2.43(dd,1H),2.36(dd,1H),1.99(m,1H),1.93(m,1H),1.60(t,J＝10.4Hz,1H),0.94(m,1H),0.81(t,J＝7.2Hz,3H)。
以上的熔点以及核磁共振数据均与现有技术中钩藤碱的表征数据完全一致，因此确定最终所得的产物就是钩藤碱。
同时结合和使用经HPLC确定的钩藤碱标准样品曲线，从而计算得到了所提取的最终产物中的钩藤碱的得率和纯度。
对步骤(1)中使用的有机溶剂进行考察，并计算各自的钩藤碱得率(每1000g原料粉末得到多少g钩藤碱)，以此来选择步骤(1)的最佳溶剂。
表1
由此可见，对于膨胀体系提取过程，其中提取溶剂的选择至关重要，本发明人发现当采用异丙醇与乙酸乙酯的体积比为1:3的混合溶剂时，能取得优异的提取效果。而当将异丙醇替换为哪怕是正丙醇时，都将导致提取效果有显著降低，如此证明了异丙醇与乙酸乙酯的特定的、唯一的协同效果和非显而易见性。
实施例2
2.1步骤(3)中无机物溶液的选择
(1)将大叶钩藤的干燥带钩茎枝粉碎，过100目筛，得原料粉末；将该原料粉末加入异丙醇与乙酸乙酯的混合物中(原料粉末与有机溶剂的质量体积比为1:20g/ml，异丙醇与乙酸乙酯的体积比为1:3)，然后通入二氧化碳(混合有机溶剂与二氧化碳的体积质量比为1:5ml/g)，密封加压，使其压力为2.5MPa，以形成膨胀溶剂体系，并在30℃下搅拌提取3小时，得到提取液；
(2)在40-50℃水浴中，用氮气吹扫提取液，直至近干，得到初提浓缩物；
(3)向初提浓缩物中加入质量百分浓度为10％的下表2.1中无机物水溶液和有机溶剂(初提浓缩物与无机物水溶液的质量体积比为1:20g/ml、无机物水溶液与有机溶剂的体积比为1:1)，其中有机溶剂为丙酮和石油醚的混合物(丙酮与石油醚体积比为1:2.5)，进行液液萃取，分层得有机相I，向有机相I中加入等体积的水，充分搅拌均匀，分层得有机相II，将有机相II置于40-50℃的水浴中，氮气吹扫，直至有机溶剂挥发完全，得到浸膏；
(4)将浸膏用恰恰能将其完全溶解的适量乙醇溶解，然后加入到层析柱顶部(浸膏与层析柱中碱性氧化铝的质量比为1:30)；首先使用2倍柱体积的正己烷进行洗脱，然后使用1.5倍柱体积的乙酸乙酯进行洗脱，最后使用正丁醇与乙醚的不同体积比的混合溶剂进行梯度洗脱，正丁醇与乙醚的体积比为分别为15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1和2:1，每个不同体积比的混合溶剂用量均为1.2倍柱体积，收集并合并两者体积比为10:1、7:1和5:1的洗脱液，然后在40-50℃水浴中，用氮气吹扫洗脱液，直至近干，得到粗产物；
将体积比为1:4的乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂加热到50℃，然后加入粗产物(粗产物与混合溶剂的质量体积比为1:25g/ml)，搅拌使其充分溶解；然后以3℃/分钟的降温速率进行梯度降温，直至降至10±2℃，并在该温度下保持3小时；最后过滤，得到白色的针状晶体，去离子水洗涤，在50℃的真空烘箱中干燥，得到最终产物。
如实施例1中的相同方法，对该最终产物进行分析，计算得到了所提取的最终产物中的钩藤碱的得率和纯度(表征数据同实施例1)。
对步骤(3)中使用的无机物水溶液进行考察，并计算各自的钩藤碱得率(每1000g原料粉末得到多少g钩藤碱)，以此来选择步骤(3)的最佳无机物水溶液，结果列于下表2.1中。
表2.1
注：“--”表示未加入无机物水溶液，而直接用有机溶剂溶解，然后加入等体积水，分层得有机相II，后续处理相同。
由表2可见，步骤(3)中液液萃取所使用的无机物水溶液的类型选择非常重要，其中磷酸二氢钾水溶液具有最好的液液萃取效果，即便是与之非常类似的磷酸二氢钠水溶液，其效果也要低于磷酸二氢钾水溶液。而其它的常用无机物水溶液，效果均显著低于磷酸二氢钾水溶液的相应效果。原因可能是磷酸二氢钾由于其溶液酸碱性而对于钩藤中的杂质成分具有最优的水相萃取效果，从而提高了有机相中的目标产物的萃取率并降低了其中的杂质含量。
而当不进行无机物水溶液的液液萃取时，导致钩藤碱的产率和纯度均急剧降低，已经失去应用价值，更无工业化基础。
2.2步骤(3)中无机物溶液浓度的选择
步骤(1)和(2)同上述2.1；
(3)向初提浓缩物中加入不同质量百分比浓度的下表2.2中KH2PO4水溶液(初提浓缩物与KH2PO4水溶液的质量体积比为1:20g/ml、KH2PO4水溶液与有机溶剂的体积比为1:1)，其中有机溶剂为丙酮和石油醚的混合物(丙酮与石油醚体积比为1:2.5)，进行液液萃取，分层得有机相I，向有机相I中加入等体积的水，充分搅拌均匀，分层得有机相II，将有机相II置于40-50℃的水浴中，氮气吹扫，直至有机溶剂挥发完全，得到浸膏；
步骤(4)同上述2.1。
如实施例1中的相同方法，对该最终产物进行分析，计算得到了所提取的最终产物中的钩藤碱的得率和纯度(表征数据同实施例1)。
对步骤(3)中KH2PO4水溶液的浓度进行考察，并计算各自的钩藤碱得率(每1000g原料粉末得到多少g钩藤碱)，以此来选择步骤(4)的最佳浓度，结果列于下表2.2中。
表2.2
由此可见，KH2PO4水溶液的浓度同样对于最终的钩藤碱得率和纯度有着显著影响，其中当其质量百分浓度为8-12％时具有优异的效果，尤其是10％时达到峰值，具有最好的提取效果。
实施例3
(1)将大叶钩藤的干燥带钩茎枝粉碎，过100目筛，得原料粉末；将该原料粉末加入异丙醇与乙酸乙酯的混合物中(原料粉末与有机溶剂的质量体积比为1:15g/ml，异丙醇与乙酸乙酯的体积比为1:3)，然后通入二氧化碳(混合有机溶剂与二氧化碳的体积质量比为1:4ml/g)，密封加压，使其压力为2MPa，以形成膨胀溶剂体系，并在40℃下搅拌提取2小时，得到提取液；
步骤(2)和步骤(3)同实施例1；
(4)将浸膏用恰恰能将其完全溶解的适量乙醇溶解，然后加入到层析柱顶部(浸膏与层析柱中碱性氧化铝的质量比为1:40)；然后分别进行如下操作：
①省略掉“使用1.5倍柱体积的正己烷进行洗脱”，后续操作均同实施例1。
②省略掉“使用2倍柱体积的乙酸乙酯进行洗脱”，后续操作均同实施例1。
③同时省略掉“使用1.5倍柱体积的正己烷进行洗脱”和“使用2倍柱体积的乙酸乙酯进行洗脱”，后续操作均同实施例1。
所得结果列于下表3中，但为了对比方便，仍将实施例1步骤(1)中使用体积比为1:3的异丙醇与乙酸乙酯的混合物时的结果(即分别除上述①-③的不同外，其余均相同)一同列出。
如实施例1中的相同方法，对所述①-③的最终产物进行分析，计算得到了所提取的最终产物中的钩藤碱的得率和纯度(表征数据同实施例1)，结果见下表3。
表3
由此可见，在步骤(4)中，正己烷和乙酸乙酯的预洗脱非常重要，而当不进行正己烷或乙酸乙酯的预洗脱，或者都省略掉时，钩藤碱的得率和纯度都有大幅度降低(尤其是纯度有显著降低)，这证明了使用正己烷和乙酸乙酯进行预洗脱的必要性、重要性和出人意料性，其原因在于通过如此的预洗脱，洗脱掉了其中的一些低极性组分，从而提高了目标产物的洗脱率和纯度。
实施例4
(1)将大叶钩藤的干燥带钩茎枝粉碎，过100目筛，得原料粉末；将该原料粉末加入异丙醇与乙酸乙酯的混合物中(原料粉末与有机溶剂的质量体积比为1:15g/ml，异丙醇与乙酸乙酯的体积比为1:3)，然后通入二氧化碳(混合有机溶剂与二氧化碳的体积质量比为1:4ml/g)，密封加压，使其压力为2MPa，以形成膨胀溶剂体系，并在40℃下搅拌提取2小时，得到提取液；
步骤(2)和步骤(3)同实施例1；
(4)除使用“正丁醇与乙醚的体积比为分别为10:1、7:1、5:1、3:1和2:1”的混合溶剂进行洗脱外，其余均通实施例1的步骤(4)。也即：未使用正丁醇与乙醚的体积比为15:1、12:1的混合溶剂进行洗脱。
所得结果列于下表4中，但为了对比方便，仍将实施例1步骤(1)中使用体积比为1:3的异丙醇与乙酸乙酯的混合物时的结果一同列出。
如实施例1中的相同方法，对最终产物进行分析，计算得到了所提取的最终产物中的钩藤碱的得率和纯度(表征数据同实施例1)，结果见下表4。
表4
由此可见，当不使用体积比为15:1、12:1的正丁醇与乙醚进行洗脱时，钩藤碱的得率和纯度均有显著降低，尤其是纯度。这证明了进行如此梯度洗脱的重要性：首先使用特定浓度比的正丁醇与乙醚的混合溶剂进行洗脱，洗脱掉其中的某些极性略大的杂质成分，从而为后续的钩藤碱的得率和纯度提高奠定了基础。
实施例5
(1)将大叶钩藤的干燥带钩茎枝粉碎，过100目筛，得原料粉末；将该原料粉末加入异丙醇与乙酸乙酯的混合物中(原料粉末与有机溶剂的质量体积比为1:15g/ml，异丙醇与乙酸乙酯的体积比为1:3)，然后通入二氧化碳(混合有机溶剂与二氧化碳的体积质量比为1:4ml/g)，密封加压，使其压力为2MPa，以形成膨胀溶剂体系，并在40℃下搅拌提取2小时，得到提取液；
步骤(2)和步骤(3)同实施例1；
(4)将浸膏用恰恰能将其完全溶解的适量乙醇溶解，然后加入到层析柱顶部(浸膏与层析柱中碱性氧化铝的质量比为1:40)；首先使用1.5倍柱体积的正己烷进行洗脱，然后使用2倍柱体积的乙酸乙酯进行洗脱，最后使用下表5中不同醇与乙醚的不同体积比的混合溶剂进行梯度洗脱，各种醇与乙醚的体积比为分别为15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1和2:1，每个不同体积比的混合溶剂用量均为1.2倍柱体积，收集并合并两者体积比为10:1、7:1和5:1的洗脱液，然后在40-50℃水浴中，用氮气吹扫洗脱液，直至近干，得到粗产物；
将体积比为1:5的乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂加热到55℃，然后加入粗产物(粗产物与混合溶剂的质量体积比为1:25g/ml)，搅拌使其充分溶解；然后以3℃/分钟的降温速率进行梯度降温，直至降至10±2℃，并在该温度下保持4小时；最后过滤，得到白色的针状晶体，去离子水洗涤，在50℃的真空烘箱中干燥，得到最终产物。
所得结果列于下表5中，但为了对比方便，仍将实施例1步骤(4)中使用正丁醇与乙醚的混合物时的结果一同列出。
如实施例1中的相同方法，对最终产物进行分析，计算得到了所提取的最终产物中的钩藤碱的得率和纯度(表征数据同实施例1)，结果见下表5。
表5
由此可见，步骤(4)中洗脱的混合溶剂中醇类物质的选择非常重要，只有正丁醇与乙醚的组合才能取得最优的技术效果，其它的丁醇异构体均不能取得如此的效果，而甲醇、乙醇和丙醇等效果更差。但令人感兴趣的是，甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇的效果均要优于叔丁醇，对此发明人将进行继续研究。
实施例6
(1)将大叶钩藤的干燥带钩茎枝粉碎，过100目筛，得原料粉末；将该原料粉末加入到异丙醇与乙酸乙酯的混合有机溶剂中(原料粉末与有机溶剂的质量体积比为1:15g/ml、异丙醇与乙酸乙酯的体积比为1:3)，然后通入二氧化碳(混合有机溶剂与二氧化碳的体积质量比为1:4ml/g)，密封加压，使其压力为2MPa，以形成膨胀溶剂体系，并在40℃下搅拌提取2小时，得到提取液；
步骤(2)与(3)同实施例1；
(4)除将层析柱中的大孔弱酸性阳离子交换树脂由CD180分别替换为下表6中的其它阳离子交换树脂外，其它处理和操作均相同于实施例1的步骤(4)。
所得结果列于下表6中，但为了对比方便，仍将实施例1步骤(1)中使用体积比为1:3的异丙醇与乙酸乙酯的混合物时的结果一同列出。
如实施例1中的相同方法，对最终产物进行分析，计算得到了所提取的最终产物中的钩藤碱的得率和纯度(表征数据同实施例1)，结果见下表6。
表6
由此可见，即便都是丙烯酸系的大孔弱酸性阳离子交换树脂，但CD180的分离效果要显著高于其它大孔弱酸性阳离子交换树脂，可能在经过中性硅胶、碱性硅胶、中性氧化铝和碱性氧化铝的在先吸附分离后，其吸附系数、解吸系数等性能与目标产物有着最好的匹配性和适应性。
实施例7
(1)将大叶钩藤的干燥带钩茎枝粉碎，过100目筛，得原料粉末；将该原料粉末加入到异丙醇与乙酸乙酯的混合有机溶剂中(原料粉末与有机溶剂的质量体积比为1:15g/ml、异丙醇与乙酸乙酯的体积比为1:3)，然后通入二氧化碳(混合有机溶剂与二氧化碳的体积质量比为1:4ml/g)，密封加压，使其压力为2MPa，以形成膨胀溶剂体系，并在40℃下搅拌提取2小时，得到提取液；
步骤(2)与(3)同实施例1；
(4)将浸膏用恰恰能将其完全溶解的适量乙醇溶解，然后加入到层析柱顶部(浸膏与层析柱中碱性氧化铝的质量比为1:40)；首先使用1.5倍柱体积的正己烷进行洗脱，然后使用2倍柱体积的乙酸乙酯进行洗脱，最后使用正丁醇与乙醚的不同体积比的混合溶剂进行梯度洗脱，正丁醇与乙醚的体积比为分别为15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1和2:1，每个不同体积比的混合溶剂用量均为1.2倍柱体积，收集并合并两者体积比为10:1、7:1和5:1的洗脱液，然后在40-50℃水浴中，用氮气吹扫洗脱液，直至近干，得到粗产物；
将体积比为1:5的乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂加热到55℃，然后加入粗产物(粗产物与混合溶剂的质量体积比为1:25g/ml)，搅拌使其充分溶解；然后以下表7的降温速率进行梯度降温，直至降至10±2℃，并在该温度下保持4小时；最后过滤，得到白色的针状晶体，去离子水洗涤，在50℃的真空烘箱中干燥，得到最终产物。
所得结果列于下表7中，但为了对比方便，仍将实施例1步骤(1)中使用体积比为1:3的异丙醇与乙酸乙酯的混合物时的结果一同列出。
如实施例1中的相同方法，对最终产物进行分析，计算得到了所提取的最终产物中的钩藤碱的得率和纯度(表征数据同实施例1)，结果见下表7。
表7
由此可见，在重结晶阶段，降温速率对于钩藤碱得率和纯度具有显著影响，其中以3℃/分钟的降温速率最为合适，当降温速率分别为2℃/分钟、1℃/分钟、4℃/分钟或5℃/分钟时，虽然得率变化不大，但纯度有显著降低。这可能是因为降温速率不同时，导致目的产物和杂质容易同时析出，从而导致纯度有显著降低。
如上所述，本发明提供了一种钩藤碱的提取方法，所述方法能够以高得率、高纯度而得到钩藤碱，尤其是通过合适的膨胀溶剂体系中有机溶剂的选择、液液萃取时无机物溶液的种类和浓度选择、以及合适的预洗脱层析柱和合适洗脱液的选择、特定浓度洗脱组分的收集、特定树脂的选择、重结晶降温速率的确定等等多个因素的协同组合，而取得了优异的提取效果。当缺少或者改变任何其中的一个关键因素时，都将导致提取效果的显著降低，这证明了该优异效果的取得是多个不可预测因素的协同作用。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种舒张血管活性化合物钩藤碱的提取方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将原料粉碎、过筛，得原料粉末，将其加入到有机溶剂中，再通入二氧化碳，形成膨胀溶剂体系进行搅拌提取，得提取液；
(2)浓缩提取液，得初提浓缩物；
(3)向初提浓缩物中加入无机物溶液和有机溶剂，进行液液萃取，分层得有机相I，向有机相I中加入水，充分搅拌均匀，分层得有机相II，将其浓缩得浸膏；
(4)将浸膏溶解并装入层析柱顶部，溶剂洗脱，收集洗脱液，浓缩得粗产物，重结晶得钩藤碱。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述有机溶剂为异丙醇和乙酸乙酯的混合物，其中异丙醇与乙酸乙酯的体积比为1:2-4。
3.权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述无机物溶液为KH2PO4水溶液，其质量百分浓度为8-12％。
4.如权利要求1-3任一项所述的提取方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述有机溶剂为丙酮与石油醚的混合物，其中丙酮与石油醚的体积比为1:1.5-4。
5.如权利要求1-4任一项所述的提取方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述层析柱以其体积计，自上而下依次填充20％碱性氧化铝、15％中性硅胶、10％碱性硅胶、5％中性氧化铝和30％大孔弱酸性阳离子交换树脂。
6.如权利要求5所述的提取方法，其特征在于：所述碱性硅胶的制备方法如下：
(I)将粒度为100-200目的中性硅胶于马弗炉中和550℃下高温烘烤15小时，然后降低温度到200℃并在该温度下保温下1.5小时，然后取出并自然降温到室温，得到活化硅胶；
(II)向活化硅胶中加入摩尔浓度为1mol/L的NaOH水溶液，并在摇床上充分振荡，直至没有结块为止，得到所述碱性硅胶；其中，所述活化硅胶与NaOH水溶液的质量比为1:0.5。
7.如权利要求5所述的提取方法，其特征在于：所述大孔弱酸性阳离子交换树脂优选为丙烯酸系列阳离子交换树脂，更优选为CD180树脂、D110树脂、D113树脂、D151树脂或D152树脂，最优选为CD180树脂。
8.如权利要求1-7任一项所述的提取方法，其特征在于：在步骤(4)中，首先使用正己烷进行洗脱，其体积用量为1-2倍柱体积；然后使用乙酸乙酯进行洗脱，其体积用量为1.5-2.5倍柱体积；最后使用正丁醇与乙醚的不同体积比的混合溶剂进行梯度洗脱，正丁醇与乙醚的体积比为分别为15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1和2:1，每个不同体积比的混合溶剂用量均为1-1.4倍柱体积，收集并合并两者体积比为10:1、7:1和5:1的洗脱液，然后在40-50℃水浴中，用氮气吹扫洗脱液，直至近干，得到粗产物。
9.如权利要求1-8任一项所述的提取方法，其特征在于：步骤(4)中，将粗产物在乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂中进行重结晶，粗产物与混合溶剂的质量体积比为1:15-25g/ml，其中，在混合溶剂中，乙酸乙酯与正己烷的体积比为1:4-6。
10.如权利要求1-9任一项所述的提取方法，其特征在于：步骤(4)中，重结晶步骤如下：将体积比为1:4-6的乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂加热到50-60℃，然后加入粗产物，粗产物与混合溶剂的质量体积比为1:15-25g/ml，搅拌使其充分溶解；然后以3℃/分钟的降温速率进行梯度降温，直至降至10±2℃，并在该温度下保持3-4小时；最后过滤，得到晶体，去离子水洗涤，在45-55℃的真空烘箱中干燥，得到最终产物钩藤碱。
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