CN111929377B - 一种清达颗粒中钩藤4种生物碱的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种清达颗粒中钩藤4种生物碱的含量测定方法，该方法包括：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和采用超高效液相色谱仪进行测定，其中，所述供试品溶液的制备包括取装量差异项下的清达颗粒，研细，精密称定，加入甲醇，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液过碱性氧化铝柱，加洗脱溶剂进行洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加复溶溶剂进行溶解，摇匀。本发明解决了从清达颗粒充分提取钩藤相关成分的问题，减少在检测过程中杂质对色谱柱的损害，另外还能实现测出莲子心的定性研究。

Description

一种清达颗粒中钩藤4种生物碱的含量测定方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，涉及清达颗粒中钩藤4种生物碱的含量测定方法。

背景技术

高血压是常见的心血管疾病，其并发症是造成人类死亡的主要原因之一。近年来，高血压的患病率迅速上升，其预防和治疗现状刻不容缓。目前，药物治疗是高血压病最主要的治疗方法，其中中药治疗在高血压的早期防治中逐渐成为一个热点(许红叶,王友群.中药在高血压治疗中的研究及应用[J].中国实用医药,2008,3(25):189-192)。国医大师陈可冀院士认为高血压发病存在由阳盛到阴阳两虚的一个演化过程，临床上高血压初期多以肝阳上亢或肝火上炎为主要证候特征，故陈可冀院士在天麻钩藤饮的基础上加减化裁，创立了清眩降压汤用以治疗上述证型的高血压患者。临床研究表明：清眩降压汤可较好地控制血压，有效改善高血压患者的临床症状和生活质量(余军,徐凤芹.清眩降压汤治疗肝肾阴虚肝阳上亢型高血压病的观察[J].中西医结合心脑血管病杂志,2010,8(1):1-3)。清达颗粒是由陈可冀院士根据早治防变的思路，将清眩降压汤进行精简而来的。清达颗粒主要由天麻、钩藤、莲子心、黄芩四味药组成(CN106421447A)。钩藤为茜草科，钩藤属，植物钩藤或其同属植物的带钩茎枝，性凉，味甘，归肝、心包经，具有清凉平肝、活血通经、息风定惊等传统功效，现有研究发现，钩藤的主要有效成分为总生物碱，其中以钩藤碱、异钩藤碱为主，具有降血压、抗心律失常以及抗血小板聚集和抗血栓形成的作用(王克英,郭思妤,祝晶等.黔产钩藤HPLC指纹图谱的研究[J].中国医药指南,2012,10(35):69-70)。目前，随着医药科技的发展，钩藤的开发研究不断深入，功能效用也在不断扩大，已越来越受到人们关注。因此，利用钩藤制成的具有降血压、抗心律失常等治疗各种病症的复方制剂越来越多，如潜阳降压胶囊、天钩灵胶囊等，特别是进几年来利用钩藤提取制成的钩藤碱静脉注射液，具有抗脑血栓的作用。因此，为了保证用药安全以及满足药效使用，钩藤的含量检测越来越重要。

目前钩藤总生物碱含量测定法包括滴定法、直接紫外分光度法、酸性染料法、高效液相色谱法等。其中滴定法、直接紫外分光光度法和酸性染料比色法所测得的结果准确性存在较大的争议，而高效液相色谱法(HPLC)已被很好地应用于钩藤碱、异钩藤碱的含量分析。但检测的精密度、准确度还有待进一步提高，另外HPLC法在进行含量测定时，所耗时间长，大约20min左右才能完成一次色谱分析，也提高了检测成本。由于科技的进步以及技术水平的提高，钩藤的含量检测也出现了一些新型的检测方法：高效毛细管电泳法、非水毛细管电泳法和气相色谱法等。以上三种含量测定方法均可以快速有效地分离并同时测定钩藤中钩藤碱、异钩藤碱的含量，但这些测定方法操作复杂，且目前应用并不多。同时供试液的制备方法过程非常复杂，难度较大，还需要用到三氯甲烷等毒性较强的试剂，容易造成安全隐患。此类方法还需进一步验证与优化方可普及。

以上方法大多针对钩藤药材中钩藤碱(C₂₂H₂₈N₂O₄)或异钩藤碱(C₂₂H₂₈N₂O₄)单一组分进行含量测定。钩藤碱的酯键受热易分解，并在极性条件下能相互转化，其他两种成分：去氢钩藤碱(C₂₂H₂₆N₂O₄)、异去氢钩藤碱(C₂₂H₂₆N₂O₄)，目前很少有人对它们的含量进行具体研究，且很少有报道同时测定钩藤4种生物碱含量，李珊等人使用高效液相色谱法同时测定钩藤药材中4种生物碱的含量(李珊,李江,游邵雪.高效液相色谱法同时测定钩藤中4种生物碱的含量[J].贵州农业科学,2013,41(2):50-53)，但其针对的钩藤药材。

中药复方成分复杂，钩藤复方制剂的质量标准(如：国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂:19册[M].北京:人民卫生出版社，1998:38或国家药品监督管理局.国家中成药标准汇编(经络肢体脑系分册)[S].2002:111)中均无钩藤定量分析项目。关于HPLC法测定复方制剂中钩藤生物碱含量报道较少，多涉及测定钩藤碱或异钩藤碱的单一成分，比如徐宇等建立反相高效液相色谱测定天麻钩藤制剂中钩藤碱和黄芩苷的方法，测出了天麻钩藤制剂中钩藤碱的含量(徐宇,谈红,李涛.RP-HPLC测定天麻钩藤制剂中钩藤碱和黄芩苷的含量[J].中国药学杂志,2001,36(6):414-415)；CN108627581A公开了一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法。为有效、全面地控制药品的内在质量，有必要对复方中钩藤4种生物碱成分同时进行含量测定，但目前此类的研究很少，于晨等建立钩藤复方制剂中钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱HPLC定量方法(于晨,杨丽娟,马斌,等.HPLC法同时测定复方制剂中4种钩藤生物碱成分含量[J].沈阳药科大学学报,2010,27(11):897-901)，测定了天麻钩藤饮模型制剂和3种市售钩藤复方制剂中4种钩藤生物碱成分的含量。但是本发明人发现其采用三元流动相：甲醇-乙腈-醋酸铵缓冲液(pH＝5.2)梯度洗脱，其色谱条件复杂，使用梯度洗脱，耗时长，提高分析成本。因此，在色谱条件以及分析时间上还需进一步改进和优化。方面。另外，针对清达颗粒体系中钩藤4种生物碱的含量测定，目前尚无报道。为全面有效控制清达颗粒的内在质量，有必要对清达颗粒的四个组分进行定性测定同时对天麻、钩藤的多个指标成分进行含量测定。如何减少清达颗粒中其他药材对待测药材的干扰，提高指标成分纯度、进一步提高清达颗粒的检测标准是问题的关键。

发明内容

发明要解决的问题

为了克服现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一种清达颗粒中钩藤4种生物碱的含量测定方法，其还可以实现了对清达颗粒中钩藤和莲子心的定性分析。

用于解决问题的方案

在一个技术方案中，本发明提供了一种清达颗粒中钩藤4种生物碱的含量测定方法，所述方法包括：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和采用超高效液相色谱仪进行测定，

其中，所述4种生物碱包括异钩藤碱、钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱；

所述供试品溶液的制备包括取装量差异项下的清达颗粒，研细，精密称定，加入甲醇，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液过碱性氧化铝柱，加洗脱溶剂进行洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加复溶溶剂进行溶解，摇匀。

在一个实施方式中，所述超高效液相色谱仪采用二元流动相体系进行等度洗脱，其中流动相A为乙腈，流动相B为0.05～0.20v/v％的氨水溶液或磷酸二氢钾溶液。

在一个实施方式中，所述流动相B为0.1％的氨水溶液。

在另一个实施方式中，所述流动相A与所述流动相B的体积比为25～45:75～55。

在另一个实施方式中，所述流动相B的pH值为7.5～7.6，优选采用磷酸水溶液进行pH调节。

在另一个实施方式中，所述洗脱溶剂选自氨水、二氯甲烷或者二氯甲烷和甲醇的混合溶液。

在另一个实施方式中，所述二氯甲烷和甲醇的混合溶液中二氯甲烷与甲醇的体积比为3～7：7～3，优选的体积比为3:7。

在另一个实施方式中，所述复溶溶剂包括甲醇和/或由流动相A为乙腈，流动相B为0.05～0.20v/v％的氨水溶液或磷酸二氢钾溶液构成的二元流动相体系，优选复溶溶剂为所述二元流动相体系。

在另一个实施方式中，所述对照品溶液的制备包括取异钩藤碱对照品，精密称定，加甲醇定容。

在另一个实施方式中，所述超高效液相色谱仪的色谱条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；采用二元流动相体系进行等度洗脱，其中流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的氨水溶液，两者体积比为35:65；检测波长246nm，柱温30℃，流速0.4mL/min；理论板数按异钩藤碱计算不低于8000。

进一步地，本发明还提供了一种对清达颗粒中的钩藤和莲子心进行定性分析的方法，所述方法包括本发明前述任一方法。

发明的效果

本发明利用UPLC采用一测多评法实现了同时测定清达颗粒钩藤中钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱4种成分的含量，本发明的方法快速、准确，能够有效控制钩藤的质量，实现了对清达颗粒的钩藤和莲子心的定性研究，提高了清达颗粒的检测标准，为清达颗粒以及其他制剂开发提供依据。通过对供试品提取方式改进，减少莲子心对钩藤测定的干扰，减少了钩藤小极性杂质的析出，减少了检测过程中杂质对色谱柱的损害。在本发明一个实施方式中，通过流动相的改进，解决了三乙胺损害色谱柱的问题，延长色谱柱的使用寿命。

本发明方法简单，能够成功分离出钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱，重现性好，钩藤供试液在室温12h内保持含量稳定，且在8min内完成了钩藤总碱含量的测定，提高了分析效率，节省了分析时间，减少了溶剂损耗，降低了分析成本。相比于HPLC来说，节约时间，溶剂消耗量少，对环境污染小。

附图说明

图1示出了异钩藤碱对照品超高效液相色谱图。

图2示出了清达颗粒样品超高效液相色谱图。

图3示出了流动相为乙腈-5mmol/L乙酸铵的超高效液相色谱图。

图4示出了流动相为乙腈-5mmol/L磷酸氢二钾溶液的超高效液相色谱图和柱压图。

图5示出了流动相为乙腈-0.1％氨水溶液的超高效液相色谱图。

图6示出了流动相为乙腈-5mmol/L磷酸二氢钾溶液多次进样的超高效液相色谱图和柱压图。

图7示出了流动相为乙腈-0.1％氨水溶液多次进样的超高效液相色谱图。

图8示出了流动相为乙腈-0.05％氨水溶液的超高效液相色谱图。

图9示出了流动相为乙腈-0.1％氨水溶液的超高效液相色谱图。

图10示出了流动相为乙腈-0.2％氨水溶液的超高效液相色谱图。

图11示出了混标对照品与未过碱性氧化铝处理的对比结果图。

图12示出了混标对照品与碱性氧化铝柱处理的对比结果图。

图13示出了通过中性氧化铝柱处理的钩藤供试品超高效液相色谱图。

图14示出了去氢钩藤碱对照品的线性关系图。

图15示出了异去氢钩藤碱对照品的线性关系图。

图16示出了异钩藤碱对照品的线性关系图。

图17示出了钩藤碱对照品的线性关系图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

应当理解，在本申请说明书和权利要求书中用到的单数形式的冠词“一”(对应于英文“a”、“an”和“the”)包括复数的对象，除非文中另外明确地规定。

本说明书中，所提及的“一个或一些具体/优选的实施方式/方案”、“另一个或另一些具体/优选的实施方式/方案”、“一个或另一个实施方式/方案”、“一个或另一个技术方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方式中，并且可存在于其它实施方式中或者可不存在于其它实施方式中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方式中。

本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含一系列步骤或单元的过程、方法或系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

除非另有说明，本文中所使用的术语“对照品”是指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质，通常由国家药品检定机构审查认可，其标准应不低于制品的质量标准。

除非另有说明，本文中所使用的术语“对照药材”(或称“参比药材”)是指已经完成种属鉴定的，用于鉴定待测药材的标准药材。

除非另有说明，本文中所使用的术语“供试品”是指用作检测或鉴定的实验样品。

除非另有说明，本文中所使用的术语“精密称定”是指称取重量应准确至所取重量的千分之一，术语“称定”是指称取重量应准确至所取重量的百分之一，术语“精密量取”是指量取体积应准确至所取体积的千分之一，术语“精密吸取”是指通过微量进样器来准确量取样品的操作方式。

除非另有说明，本文中所使用的术语“续滤液”是指过滤时弃去初滤液后继续收集的滤液。与初滤液相比，续滤液更加接近样品的真实浓度，因为过滤介质(如滤膜、滤纸等)有可能会吸附溶质，因而造成初滤液中样品浓度偏低；另外，续滤液更加干净，因为被过滤介质吸附的溶质可以形成滤饼，降低了过滤孔径，因而能够截留更微小的微粒。

除非另有说明，本文中所使用的术语“复溶溶剂”是指用于溶解经干燥处理的残余物或经浓缩处理的浸膏而得到相应溶液的溶剂。

除非另有说明，本文中所使用的术语“填充剂”是指在色谱分析法中用作固定相的物质，术语“固定相”是指在色谱分析法中位置固定不动、对样品产生吸附效果的一相，术语“流动相”是指在色谱分析法中位置不固定、可以自由流动、对样品产生解吸效果的一相。

除非另有说明，本文中所使用的术语“二元流动相体系”是指由两种组分组成的流动相，通常将其中一种(优选前者)记为“流动相A”，将另一种(优选后者)记为“流动相B”。例如，在乙腈-醋酸铵水溶液二元流动相体系中，流动相A为乙腈，流动相B为醋酸铵水溶液。但上述标记方法并未固定不变，同样可将醋酸铵水溶液记为流动相A，而将乙腈记为流动相B。

除非另有说明，本文中所使用的术语“等度洗脱”是指在样品的色谱分析周期中，流动相的组成、比例和流速恒定不变的洗脱方式。

除非另有说明，本文中所使用的术语“超高效液相色谱”(或称“UPLC”)是指在高效液相色谱(HPLC)的基础上开发一种全新技术，具有填料颗粒小、检测速度快、分析通量大、灵敏度高等特点。

除非另有说明，本文中所使用的术语“保留时间”是指被分离组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时为止所经历的时间，即从进样开始到出现被分离组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间；术语“相对保留时间”是指被分离组分的校正保留时间与标样的校正保留时间之比；术语“校正保留时间”是指被分离组分的保留时间减去空气的保留时间。例如，若空气的保留时间是3s，被分离组分的保留时间是9s，标样的保留时间是15s，则被分离组分的校正保留时间是6s，标样的校正保留时间是12s，被分离组分相对于标样的相对保留时间是0.5。

除非另有说明，本文中所使用的术语“参照峰”(或称“对照峰”)是指在计算相对保留时间时标样所对应的色谱峰。

除非另有说明，本文中所使用的术语“对应峰”是指对照药材中与标准品对应的组分在对照药材色谱图中的色谱峰。

除非另有说明，本文中涉及溶液浓度百分比“％”是指体积百分比，比如0.1％氨水是指将0.1mL的氨水加纯水至100mL，由于量筒不建议作为混合溶液的容器，故0.1％氨水也约等于将100mL纯水与0.1mL的氨水混合均匀。

具体而言，本发明提供了一种清达颗粒中钩藤4种生物碱的含量测定方法，所述方法包括：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和采用超高效液相色谱仪进行测定。

<供试品溶液的制备>

清达颗粒是由清眩降压汤化裁而来，主要由如下重量配比的原料药制备而成：天麻10-30份、钩藤10-20份、莲子心5-15份、黄芩5-15份。清达颗粒主要用于高血压前期或1级高血压，以天麻为君平肝潜阳，辅以钩藤，助天麻清热平肝熄风，佐以黄芩清肝热，莲子芯泄心火，从而使肝之浮阳潜藏，心肝火热得降，从而达到潜阳平肝，抑制动风，使血压得降，心脑肾损伤得复。方中的钩藤具有降压、镇静、抗氧化等多种作用。钩藤主要有效成分为钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱等氧化吲哚类生物碱。为全面有效控制清达颗粒的内在质量,有必要对钩藤的上述4种生物碱成分同时进行含量测定。本发明的清达颗粒由申请人自制。

根据钩藤的溶解性，本发明供试品溶液的制备包括取装量差异项下的清达颗粒，研细，精密称定，加入甲醇，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。所述甲醇包括纯甲醇以及甲醇溶液，进一步地本发明所用的甲醇为60-80％的甲醇水溶液，在本发明的一些具体实施方式中，采用70％的甲醇水溶液，百分比为体积比。

在本发明的一些具体实施方式中，所述清达颗粒研细后的供试品与所述甲醇第一次加入的量之比为：1g:20-30mL，优选地为1g:25mL，以实现提取充分且满足检测的浓度要求。

在本发明的另一些具体实施方式中，所述超声处理的时间为10～70min，优选10～40min，更优选为15～35min，本发明研究表明超声15min后，4个指标成分的总含量基本不再增加，说明提取充分，综合考虑检验周期和提取充分等因素，更优选超声时间为30min。超声功率为100～400W，优选为200～300W，进一步地超声功率为250W，超声频率为10～100KHz，优选为30～50KHz，更优选为40KHz。在供试品制备过程中，对于过滤没有特定的限定，可以是本领域任何常规的过滤手段，优选为膜过滤，例如采用孔径为0.1～0.5μm的微孔滤膜，进一步优选为0.22μm的微孔滤膜。

进一步地，本发明人发现采用超声处理的供试品在进行多次进样分析后，较第1次进样结果，峰型变得圆钝，很可能出现了色谱柱柱效下降的问题。因此，本发明人对供试品制备方法进行了进一步的优化，本发明所述供试品溶液的制备还包括在所述滤过步骤后，精密吸取续滤液(如10mL)过碱性氧化铝柱，加洗脱溶剂进行洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加复溶溶剂进行溶解，摇匀。

碱性氧化铝柱通常用于胺或其它碱性物质的分离。考虑到钩藤主要有效成分为氧化吲哚类生物碱，因此选用碱性氧化铝柱。相比于中性氧化铝柱，通过碱性氧化铝柱处理的钩藤色谱峰峰型良好，分离度高，还能测出莲子心的指标成分甲基莲心碱峰，实现了莲子心的定性研究。进一步地，本发明选用100-200目的碱性氧化铝柱，内径为1cm，以获得峰型更加良好的钩藤色谱峰。

在本发明的一些具体实施方式中，考虑到钩藤4种生物碱的溶解度，所述洗脱溶剂选自氨水、二氯甲烷或者二氯甲烷和甲醇的混合溶液。在优选的实施方式中，本发明采用二氯甲烷和甲醇的混合溶液作为洗脱溶剂。为了获得更好的洗脱效果，优选地二氯甲烷与甲醇的体积比为3～7：7～3，进一步地，为了获得更高的钩藤各成分含量，优选的体积比为3:7。在本发明的一些具体实施方式中，续滤液和洗脱溶剂的体积比为1:0.5～2.5，进一步地续滤液和洗脱溶剂的体积比为1:2。

本发明人发现在收集到洗脱液后采用蒸干后复溶的提取方式可以有效减少钩藤小极性杂质的析出，避免在检测过程中杂质对色谱柱的损害。在本发明的一些具体实施方式中，所述蒸干采用水浴蒸干。在本发明的一些具体实施方式中，复溶溶剂包括甲醇和/或本发明采用的二元流动相体系，为了与后续检测手段相匹配，优选复溶溶剂为本发明采用的二元流动相体系。

在本发明的一些具体实施方式中，在复溶溶剂溶解之后，进一步地，定容至5mL的量瓶中，摇匀得到本发明的供试品溶液。

本发明的供试品溶液的制备方法能够对钩藤4种生物碱进行有效、充分的提取，能够减少清达颗粒其他味药材对钩藤测定的影响，减少钩藤中小极性杂质的析出，可以得到良好峰型的钩藤色谱峰，分离度高，同时能够实现多次进样情况下仍能保持较高的色谱柱柱效。另外，本发明的供试品溶在12小时稳定性良好。

本发明的供试品溶液的制备方法不仅能够对钩藤4种生物碱进行有效、充分的提取，用超高效液相色谱检测钩藤指标成分时还同时能够获得莲子心指标成分(甲基莲心碱)的色谱峰。

<对照品溶液的制备>

本发明的对照品溶液的制备包括取异钩藤碱对照品，精密称定，加甲醇定容。选用异钩藤碱作为对照品，主要基于异钩藤碱是药检所专供并且采用异钩藤碱作为对照峰，峰定位误差小，结果更准确。进一步地，加甲醇定容制成每1mL含异钩藤碱10μg溶液。更进一步地，所述甲醇包括纯甲醇以及甲醇溶液，进一步地本发明所用的甲醇为60-80％的甲醇水溶液，在本发明的一些具体实施方式中，采用70％的甲醇水溶液，百分比为体积比。

<采用超高效液相色谱仪进行测定>

本发明采用了UPLC法，与常规HPLC法相比，分析周期短，分离度更高，更加环保，使用UPLC检测大大提高了研究检测的精度和效率，另外UPLC还可分离出HPLC包峰的某些成分。

色谱条件确认

通常钩藤测定多以甲醇—三乙胺作为流动相，三乙胺会导致色谱柱难以洗净，对柱子产生较大损害。为了减少对色谱柱的损害，本发明人对流动相进行了研究。在本发明中，采用二元流动相体系进行等度洗脱，其中流动相A为乙腈，流动相B为0.05～0.20v/v％的氨水溶液或磷酸二氢钾溶液。采用上述流动相B可以实现结果色谱峰的分离且峰型良好。进一步地，所述流动相A与所述流动相B的体积比为25～45:75～55，在本发明的一些具体实施方式中，所述流动相A与所述流动相B的体积比为35:65。进一步地，所述流动相B的pH值为7.5～7.6，优选采用磷酸水溶液进行pH调节。进一步地，磷酸水溶液中磷酸浓度为2％，百分比为体积比。

本发明人发现为了保证多次进样分析后色谱柱仍保持良好的柱效，优选流动相为0.05～0.20v/v％的氨水溶液。如果氨水浓度过低或过高，会造成结果峰的分离度不高。在本发明的一些具体实施方式中，使用0.1％的氨水溶液，结果峰峰型良好，分离度高，没有杂质峰的干扰。

本发明的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，本发明人发现该分离效果较好，保留时间适中，不同批次色谱柱对样品的测定结果影响较小，且具有良好的耐用性。

对钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱四种生物碱进行全波长扫描，结果显示在246nm处出现最大吸收，因此选择246nm作为检测波长。

在本发明的一些具体实施方式中，所述超高效液相色谱仪的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；采用二元流动相体系进行等度洗脱，其中流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的氨水溶液，两者体积比为35:65；检测波长246nm，柱温30℃，流速0.4mL/min；理论板数按异钩藤碱计算不低于8000。在本发明的一些具体实施方式中，选用ThermoAccucore C18色谱柱(2.1×100mm，2.6μm)，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径2.6μm。

测定与分析

本发明的一些具体实施方式中，本发明分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μL，注入超高效液相色谱仪，测定。

本发明采用一测多评的分析方法。一测多评法是基于在一定线性范围内某物质的量(质量/浓度)和仪器响应值成正比，即在一定线性范围内，相同进样量和色谱条件下，某物质的校正因子(峰面积/浓度)为确定值，而不同的物质其校正因子可能不一样，所以可以通过内参物对待测物的校正因子(Fsi相对校正因子)这种确定的函数(比例)关系实现一测多评，以达到对多成分含量快速检验，同时简化操作，节省成本的目的。

计算相对校正因子的公式如下：

Fsi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)

式中Fsi为相对校正因子，As为内参物对照品s峰面积，Cs为内参物对照品s浓度，Ai为某待测成分对照品i峰面积，Ci为某待测成分对照品i浓度。

计算相对保留时间公式如下：

R＝ti/ts

式中R为相对保留时间，ts为内参物对照品s峰保留时间，ti为内参物对照品峰保留时间。

在本发明中采用异钩藤碱作为内参物。更具体地，用异钩藤碱对照品，测定钩藤中异钩藤碱、钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱4种指标成分的含量，通过建立异钩藤碱与钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱的相对校正因子，并用该校正因子进行钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱的含量计算，实现一测多评。

为了确定相对校正因子，在本发明的一些具体实施方式中，取10批钩藤药材，按照本发明前述的供试品溶液制备方式进行处理，分别进行测定，以外标一点法、标准曲线法、校正因子法分别计算去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱含量，计算RSD％值。本发明确定的相对保留时间的规定值和相对校正因子如表1：

表1相对保留时间的规定值和相对校正因子

色谱峰的准确定位是一测多评法的关键之一，一般可以采用保留时间差或相对保留值等参数结合色谱图整体特征，以及每个峰的紫外吸收特征来定位其余待测成分色谱。在本发明中以异钩藤碱对照品为参照，以其相应的峰为s峰，用待测成分的色谱峰与异钩藤碱色谱峰的相对保留时间确定异去氢钩藤碱、去氢钩藤碱，钩藤碱的峰位，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。

一测多评法能快速准确对钩藤4种生物碱进行含量测定。该测定方法精密度高、重现性好、稳定性好，测定结果准确度高，可有效控制钩藤的质量，从而确保其临床用药的安全、有效。

以下将结合具体的实施例来进一步阐述本发明中的技术方案。本领域技术人员容易理解的是，下列实施例中所描述的具体实验条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当且不会被理解为用于限制本发明。在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围之内。此外，除非另有说明，实施例中所使用的仪器、材料、试剂等均可通过常规商业手段获得。

实施例：

1、实验材料：

1.1试药：

1.1.1对照品(供含量测定用，使用前无须处理)：

钩藤碱，批号：112028-201601，购于中国食品药品检定研究所；

异钩藤碱，批号：11927-201403，购于中国食品药品检定研究所；

去氢钩藤碱，货号：ST10570120MG 630-94-4，纯度≥98.0％，购于上海诗丹德生物技术有限公司；

异去氢钩藤碱，货号：ST11080120MG 51014-29-0，纯度≥98.0％，购于上海诗丹德生物技术有限公司。

1.1.2供试品

清达颗粒批号：1905310、1905001、1905002、1905003，由江阴天江药业有限公司提供。

1.1.3其他试剂：

甲醇，优级纯；

乙腈，色谱纯；

氨水，色谱纯；

磷酸，色谱纯；

超纯水，自制。

1.2仪器和耗材：

Thermo-UPLC超高效液相色谱仪，型号/规格：Thermo VANQUISH，购于广州市诚屹进出口有限公司

KQ-250E超声清洗机，购于昆山超声仪器有限公司；

电子分析天平，购于梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

控温水浴锅，购于南通华泰实验仪器有限公司；

纯水系统，购于Sartoriμs公司；

Thermo Accucore C₁₈色谱柱(2.1×100mm，2.6μm)。

2、色谱条件

以Thermo Accucore C₁₈色谱柱(2.1×100mm，2.6μm)为固定相；采用二元流动相体系，以乙腈为流动相A，以0.1％的氨水溶液为流动相B(由2％的磷酸水溶液调节pH值至7.5～7.6)；采用等度洗脱，V_流动相A:V_流动相B＝35:65；流速为0.4mL/min；柱温为30℃；检测波长为246nm。理论板数按异钩藤碱计算不低于8000。

3、对照品溶液的制备

取异钩藤碱对照品，精密称定，加甲醇定容制成每1mL含异钩藤10μg溶液，即得。

4、供试品溶液的制备

取装量差异项下的清达颗粒，研细，取约1.0g，精密称定，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40KHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密吸取续滤液10mL过碱性氧化铝柱(100-200目，内径为1cm)，加二氯甲烷：甲醇(3：7)20mL进行洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加前述第2点的流动相溶解，定容至5mL量瓶中，摇匀，即得。

5、采用超高效液相色谱仪(UPLC)进行测定

分别精密吸取前述第4点的供试品溶液和第3点的对照品溶液各2μL，注入UPLC，按照前述第2点的色谱条件进行测定。

图1为异钩藤碱对照品超高效液相色谱图，图2为清达颗粒样品超高效液相色谱图。横坐标是时间，单位：分钟(min)，纵坐标是毫吸光度值(mAu)，峰1为去氢钩藤碱、峰2为异去氢钩藤碱、峰3为异钩藤碱、峰4为钩藤碱、峰5为甲基莲心碱。由此可证明，本发明的方法可以实现对钩藤、莲子心的定性研究。

对不同批号清达颗粒进行钩藤4种生物碱含量测定，结合表1所确定的相对保留时间和相对校正因子，利用一测多评获得的结果见下表2。试验结果表明：6批清达颗粒符合清达颗粒质量标准钩藤项下标准限度。清达颗粒每袋含去氢钩藤碱(C₂₂H₂₆N₂O₄)、异去氢钩藤碱(C₂₂H₂₆N₂O₄)、钩藤碱(C₂₂H₂₈N₂O₄)、异钩藤碱(C₂₂H₂₈N₂O₄)总量不得少于0.7.mg。

表2不同批号清达颗粒含量测定结果表

由此可证明本发明的方法可以实际应用于清达颗粒的质量控制，可测得不同批号清达颗粒中钩藤的4种生物碱的含量和总量，该方法具有可操作性。

6、方法学考察和验证

6.1考察流动相的种类：

按照上述第4点中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液2μL，注入UPLC，流动相B分别采用a.5mmol/L磷酸氢二钾溶液(2％磷酸调节pH至7.5-7.6)、b.5mmol/L乙酸铵溶液(2％磷酸调节pH至7.5-7.6)、c.0.1％氨水溶液(2％磷酸调节pH至7.5-7.6)，流动相A均为乙腈，流动相A和流动相B的体积比为35:65，进行洗脱分析，结果见图3、图4、图5。试验结果表明：采用流动相B为5mmol/L乙酸铵，结果色谱峰无法实现分离；流动相B为5mmol/L磷酸氢二钾溶液和0.1％氨水溶液可以实现结果色谱峰的分离，且峰型良好。但是40多次的进样分析后，5mmol/L磷酸二氢钾的峰型基本正常，但色谱柱出现堵塞现象，参见图4与图6的上方柱压图，可以看出多次进样分析柱压明显升高，即出现色谱柱堵塞现象，而0.1％氨水溶液仍保持良好峰型，柱压平稳，参见图7，因此选择乙腈-0.1％氨水溶液(2％磷酸调节pH至7.5-7.6)(35：65)为流动相。

6.2考察流动相的浓度：

按照上述第4点中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液2μL，注入UPLC，分别使用流动相乙腈-0.05％氨水溶液(2％磷酸调节pH至7.5-7.6)(35：65)、乙腈-0.1％氨水溶液(2％磷酸调节pH至7.5-7.6)(35：65)、乙腈-0.2％氨水溶液(2％磷酸调节pH至7.5-7.6)(35：65)进行洗脱分析，结果见图8-图10。试验结果表明：当使用0.05％氨水溶液和0.2％氨水溶液进行洗脱分析时，结果峰的分离度不高，其中当使用0.2％氨水溶液进行洗脱分析时，结果峰与杂质峰没有完全分离；使用0.1％氨水溶液时，结果峰峰型良好，分离度高，没有杂质峰的干扰。因此选用乙腈-0.1％氨水溶液(2％磷酸调节pH至7.5-7.6)(35：65)为流动相。

6.3供试品溶液制备考察：

方法一：取装量差异项下的清达颗粒，研细，取约1.0g，精密称定，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40KHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

方法二：取装量差异项下的清达颗粒，研细，取约1.0g，精密称定，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40KHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密吸取续滤液10mL过碱性氧化铝柱(100-200目，内径为1cm)，加二氯甲烷：甲醇(3：7)20mL进行洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加流动相(即乙腈-0.1％氨水溶液)溶解，定容至5mL量瓶中，摇匀，即得。

方法三：取装量差异项下的清达颗粒，研细，取约1.0g，精密称定，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40KHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密吸取续滤液10mL过中性氧化铝柱(100～200目，内径为1cm)，加二氯甲烷：甲醇(3：7)20mL进行洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加流动相(即乙腈-0.1％氨水溶液)溶解，定容至5mL量瓶中，摇匀，即得。

混标溶液的制备：取钩藤碱对照品、异钩藤碱对照品、去氢钩藤碱对照品、异去氢钩藤碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱的25μg混合溶液，摇匀，即得。

分别精密吸取方法一和方法二供试品溶液与混标对照品溶液各2μL，注入UPLC，按照前述第2点的色谱条件进行测定。结果见图11、图12。试验结果表明：未经过氧化铝处理的供试品结果峰为能全部出峰，不过峰型圆钝矮小，经过氧化铝处理的供试品能完全出现结果峰，且峰型良好，分离度高。

精密吸取方法三供试品溶液2μL和第3点的对照品溶液各2μL，注入UPLC，按照前述第2点的色谱条件进行测定。结果见图13。图13和图2对照，表明：通过中性氧化铝柱处理的钩藤色谱峰峰型矮小，出现死吸附现象，通过碱性氧化铝柱处理的钩藤色谱峰峰型良好，分离度高，能测出甲基莲心碱峰，实现莲子心的定性研究。因此本发明选用碱性氧化铝柱进行钩藤供试品处理。

6.4相对校正因子验证试验

取清达颗粒，按照上述第4点中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，以外标一点法、标准曲线法、校正因子法分别计算去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱含量，计算RSD％值。结果见表3-10，相应对照品的线性关系图见图14-17。试验结果表明：校正因子计算结果与外标一点法及标准曲线法计算数据相一致，因此确定去氢钩藤碱相对校正因子(以异钩藤碱计)为1.02，相对保留时间为0.80；异去氢钩藤碱的相对校正因子为0.97，相对保留时间为0.90；钩藤碱的相对校正因子为1.0，相对保留时间为1.08。

表3去氢钩藤碱一测多评

表4去氢钩藤碱外标一点法

表5异去氢钩藤碱一测多评

表6异去氢钩藤碱外标一点法

表7异钩藤碱一测多评

表8异钩藤碱外标一点法

表9钩藤碱一测多评

表10钩藤碱外标一点法

6.5加样回收率试验

取清达颗粒(批号：1905001)，精密称定约0.5g，分别加入去氢钩藤碱(15.415μg/mL)、异去氢钩藤碱(37.4752μg/mL)、异钩藤碱(17.65μg/mL)、钩藤碱(34.40μg/mL)对照品三份，按上述3.2供试品制备方法制备样品，按本发明前述第2点的色谱条件，分别进样2μL，以下列公式计算回收率，RSD％，结果见表11、表12。试验结果表明：钩藤加样回收在药典规定范围之内，因此方法学验证通过。

回收率(％)＝(测得量(mg)-样品中含量(mg))/加入对照品量(mg)×100％

表11去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱回收率试验

表12异钩藤碱、钩藤碱回收率试验

6.6线性关系考察

分别精密吸取去氢钩藤碱对照品溶液(39.79μg/mL)，异去氢钩藤碱对照品溶液(42.10μg/mL)，异钩藤碱对照品溶液(39.80μg/mL)，钩藤碱对照品溶液(40.92μg/mL)0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积积分值(Y)为纵坐标，进样量(μg)(X)为横坐标，绘制标准曲线。结果见表13，试验结果表明：各成分在各自的线性范围内具有良好的线性关系。

表13钩藤对照品4种生物碱的线性关系考察结果

6.7精密度试验

精密吸取混合对照品溶液注入液相色谱仪，按上述第2点色谱条件测定，进样2μL连续进样6次，记录其峰面积测量值，计算相对标准偏差，结果见表14。试验结果表明：仪器精密度良好，可用于含量测定。

表14仪器精密度试验

6.8稳定性试验

取清达颗粒(批号：1905310)按照上述3.2供试品制备方法制备样品，按本发明前述第2点的色谱条件，分别于0小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时进样进样2μL，，测定峰面积值，计算其RSD％，结果见表15。试验结果表明：去氢钩藤碱与异去氢钩藤碱，钩藤碱与异钩藤碱相互转化，但是总碱含量在12h内稳定性良好。

表15稳定性试验测定结果

以上实施例仅用于阐明本发明的若干实施方案，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明的范围产生任何限制。应当明确的是，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种清达颗粒中钩藤4种生物碱的含量测定方法，其特征在于，所述方法包括：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和采用超高效液相色谱仪进行测定，

其中，所述4种生物碱包括异钩藤碱、钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱；

所述供试品溶液的制备包括取装量差异项下的清达颗粒，研细，精密称定，加入甲醇，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液过碱性氧化铝柱，加洗脱溶剂进行洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加复溶溶剂进行溶解，摇匀；所述洗脱溶剂选自二氯甲烷和甲醇的混合溶液，其中二氯甲烷与甲醇的体积比为3：7；所述超高效液相色谱仪采用二元流动相体系进行等度洗脱，其中流动相A为乙腈，流动相B为0.1 v/v%的氨水溶液；所述流动相A与所述流动相B的体积比为25~45:75~55，所述超高效液相色谱仪选用Thermo Accucore C18色谱柱，粒径2.6μm。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相B的pH值为7.5~7.6。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述流动相B采用磷酸水溶液进行pH调节。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述复溶溶剂包括甲醇和/或由所述流动相A和所述流动相B构成的二元流动相体系。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备包括取异钩藤碱对照品，精密称定，加甲醇定容。

6.一种对清达颗粒中的钩藤和莲子心进行定性分析的方法，其特征在于，所述方法包括权利要求1-5任一项所述的方法。

Images