CN103508984A - 连续浸漉吸附富集法从红豆杉中提取10-dab的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种连续浸漉吸附富集法从红豆杉枝叶中提取10-DAB的方法，该方法将浸漉提取和大孔树脂吸附技术结合，通过弱酸性水浸漉，将枝叶中的10-DAB等相关成分溶解到水中，然后通过树脂富集、肼解后得油状物，加入乙腈，搅拌，析出固体为10-DAB粗品；再用树脂色谱柱纯化及重结晶得到纯度为98％以上的10-DAB纯品。利用该方法从高含量枝叶提取率达到90％以上，低含量枝叶也能达到75％以上，加上肼解转化出的10-DAB，提取率达到150～300％；该方法对设备要求较低，减少有机溶剂的排放，投资少，且使得含10-DAB较低的红豆杉干枝叶的10-DAB产率达到0.8‰-1.5‰，是传统技术无法达到的。
Description
技术领域
本发明涉及一种从植物中提取有机物的方法，具体涉及一种连续浸漉吸附富集法从红豆杉中提取10-DAB的方法。
背景技术
紫杉烷类化合物是临床上使用的一种重要的抗癌药，1992年底美国Bristol-Myers Squibb公司生产的紫杉醇批准上市。1994年紫杉醇的销售额即达4亿美元，而2000年销售额更是达到16亿美元，2003年全球紫杉醇总销售额已经超过20亿美元，最近几年销售在以20％/年的速度递增。
多西他赛(Docetaxel)又被称为多西紫杉醇，属于紫杉类化合物，1995年4月在墨西哥上市，随后在英、美、法、意、德、日等国家上市，年销售量逐年上升，2000年销售收入超过1亿美元，2002年销售额已达到5亿美元。多西他赛作为紫杉醇的改良药物，大有取代紫杉醇的趋势，最近几年销售额更是大幅度的增加。
紫杉烷类的药物是目前治疗癌症的一线药物，紫杉醇和多西他赛上市以来都取得了巨大的成功。
卡巴他赛(Jevtana Cabazitaxel)由赛诺菲-安万特(Sanofi-Aventis)公司研发，于2010/06/17优先批准上市，属于紫杉烷类抗肿瘤药物。它通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必需的微管网络而起抗肿瘤作用。它可与游离的微管蛋白结合，促进微管蛋白装配成稳定的微管，同时抑制其解聚，导致丧失了正常功能的微管束的产生和微管的固定，从而抑制细胞的有丝分裂。Jevtana与泼尼松联合用药，用于治疗接受过多西他赛治疗方案的转移性激素难治性前列腺癌患者。
拉洛他赛(larotaxel)为法国赛诺菲-安万特公司三期临床评价即将上市的新一代紫杉烷类衍生物，临床结果显示其有效率高于紫杉醇，且对紫杉醇耐药的乳腺癌仍然有效。
10-去乙酰基巴卡亭III(10-Deacetylbaccatin III)即10-DAB，是紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛以及拉洛他赛的合成前体，也是从红豆杉类植物的枝叶中提取出来的。天然紫杉醇是从红豆杉树皮树根等提取，由于野生红豆杉资源有限，并且被列入保护植物名单，大部分紫杉醇也是由10-DAB人工半合成。所以10-DAB的价格，决定了抗癌药物紫杉醇、多西他赛和拉洛他赛的价格。优化和改进10-DAB提取技术，降低抗癌药物价格，是关系到人民幸福、社会和谐的重要科技工作。
10-DAB广泛存在于红豆杉科植物的枝叶中，甚至在马尾松和粗榧的叶中也有少量10-DAB的存在。对一些常见红豆杉品种进行比较，欧洲红豆杉枝叶中10-DAB含量较高，一般在1.0～1.5‰，有些甚至达到2‰以上。而国内的红豆杉，如南方红豆杉、东北红豆杉、西藏红豆杉等枝叶中，含量则偏低，大部分在0.1-0.5‰左右，偶尔也能见到1.0‰以上的单株，同时在其枝叶提取物中，还含有大量如7-木糖紫杉醇、三尖杉宁碱、紫杉醇等紫杉烷类化合物。
10-DAB提取的传统工艺，都是通过甲醇或乙醇提取，再用二氯甲烷或氯仿萃取，接着是硅胶柱层析得到粗品，最后重结晶制备而来。该工艺大量使用甲醇、氯仿等有毒试剂，成本太高，污染严重。
在2006年和2007年，本发明申请人参与过关于10-DAB提取的两篇专利(CN1903849和CN101230053)，阐述了当时比较先进的10-DAB新型提取工艺，是以水作为溶媒，通过浸泡、淋浸或者超声，将枝叶中的10-DAB等相关成分溶解到水中，CN1903849通过氯仿萃取等工艺进行分离纯化，尽管这种工艺用水提取代替了甲醇提取，但大量氯仿使用仍然无法工业化。由于氯仿沸点比较低，回收率很低，毒性大，环境污染严重，成本难以下降。CN101230053采用超声提取技术，用水提取，减少环境污染。但使用的连续逆流超声设备昂贵，只能用于10-DAB含量较高的欧洲红豆杉枝叶提取。含量较低的国内种植的南方红豆杉、曼地亚红豆杉等枝叶如果采用该技术，成本太高，得不偿失。
目前国内很多地方都开始大量种植红豆杉，如江苏、福建、浙江、四川等省份。但由于品种、气候等原因，无论是南方红豆杉还是曼地亚红豆杉，枝叶中紫杉醇、10-DAB等含量都很低，10-DAB只能达到0.5‰以下，现有10-DAB提取技术无法对其处理，用传统甲醇浸泡或者我们前期较新型超声水提取技术都无法控制成本。很多种植基地只能将红豆杉树当园艺绿化树木来卖，无法实现其最大的药用价值。
国内10-DAB的生产，主要是依赖进口欧洲红豆杉枝叶，在国内提取分离，其价格也由欧洲进口枝叶的价格所左右。开发新工艺，使国内种植的红豆杉能生产出合格10-DAB产品，降低国内对欧洲红豆杉枝叶的依赖，是关系民生的大事。
发明内容
本发明的目的是提供一种连续浸漉吸附富集法从红豆杉中提取10-DAB的方法，该方法将浸漉提取和大孔树脂吸附技术结合，形成目前国内外适用于工业化提取10-DAB的一套工艺，既满足高含量枝叶如欧洲红豆杉枝叶中10-DAB提取，又适用于国内低含量枝叶如南方红豆杉及曼地亚红豆杉提取，对设备要求大大降低，减少有机溶剂的排放，投资少。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种连续浸漉吸附富集法从红豆杉枝叶中提取10-DAB的方法，包括浸泡
2)在所述滤液中加入HP-20大孔吸附树脂，拌样；
3)将拌好的树脂样加入HP-20大孔树脂柱中进行分离，流动相为丙酮和水，实时监测，收集所述10-DAB；
4)除去丙酮，水中析出固体，过滤、干燥得10-DAB；
5)将所述10-DAB进行重结晶，得到98～99％甚至更高含量的10-DAB纯品。
进一步地，所述肼解是在除去有机溶剂的物质中加入乙酸乙酯、80％水合肼，加热肼解，分离有机层并将有机层中的溶剂除去，得到暗黄色油状物。
进一步地，所述步骤②中当树脂吸附饱和后，先向吸附罐中加入两倍吸附罐体积的水，洗脱除掉大极性杂质，控干树脂后再加有机溶剂洗脱。
进一步地，所述大孔吸附树脂为非极性或弱极性树脂，所述非极性树脂包括HP-20、HPD-100、HPD-300、D-101、D-101-1、X-5以及H103型的树脂，弱极性树脂包括AB-8、DA-201及HPD-400型的树脂；
进一步地，所述弱酸水溶液是用冰醋酸将水的PH值调节为5-6所得；所述浸泡渗漉的次数为2～3次。
进一步地，所述浸漉罐为有过滤筛网的敞口不锈钢浸漉罐。
进一步地，所述重结晶是用四氢呋喃和水进行重结晶。
进一步地，步骤1)中所加四氢呋喃水溶液中四氢呋喃和水的比例为9：1～6：4。
进一步地，所述使用后的大孔吸附树脂可通过碱-酸-乙醇进行活化，循环使用。
本发明所述的一种连续浸漉吸附富集法从红豆杉枝叶中提取10-DAB的方法，与传统技术相比主要具有以下有益效果：
1)连续浸漉吸附提取技术所用提取液是弱酸水溶液，最后到大孔吸附树脂渗漉、10-DAB富集、10-DAB粗品制备以及10-DAB纯品制备，所述浸泡渗漉包括以下步骤：
(1)将红豆杉枝叶装入浸漉罐中，加入弱酸水溶液，浸泡8小时；
(2)打开(1)中所述的浸漉罐放出浸漉液，同时将弱酸水溶液喷洒到浸泡过的枝叶上，加水速度和浸漉液流出速度保持一致；
(3)HPLC实时监测，当流出的浸漉液中10-DAB含量下降到原来的8～12％时停止洒水；
所述10-DAB富集为大孔吸附树脂吸附富集，所述富集的方法包括以下步骤：
①将(2)和(3)中所述的浸漉液通过大孔吸附树脂吸附罐，则包括10-DAB在内的物质被所述树脂吸附，而水溶液从吸附罐中流出，用于下一级浸泡渗漉；
②HPLC实时监测，当所述树脂饱和后，停止吸附；
③用有机溶剂作为流动相洗脱所述的所述树脂中所吸附的物质；
所述10-DAB粗品制备的步骤如下：
A.将③中所述的有机溶剂除去；
B.肼解后得黄色油状物；
C.向油状物中加入乙腈，加热溶解，得到浑浊状乙腈混合物；
D.冷却过夜，过滤、干燥，得到含有10-DAB的黄褐色粉末状物，为10-DAB粗品；
所述10-DAB纯品制备是将所述10-DAB粗品进行纯化得10-DAB纯品。
进一步地，所述10-DAB粗品纯制备所述10-DAB纯品的步骤如下所示：
1)向10-DAB粗品中加入四氢呋喃水溶液，加热溶解后，加入活性炭，加热搅拌1小时，过滤，收集滤液；洗脱采用少量有机溶剂，大部分设备都不需要防火防爆，所以对生产场地要求不高；而早期用甲醇乙醇等浸泡提取，对场地要求极高，同时有机溶剂的大量使用，也对员工身体造成长期伤害；
2)设备投资少：无需传统工艺中大量甲醇回收设备，也不用连续逆流超声提取实用的昂贵超声设备；
3)绿色环保：在生产过程中，不需要大量使用氯仿甲醇的溶剂，对环境污染；浸漉液通过吸附后可以连续多次使用，排放的污水很少。完全符合绿色低碳环保概念；
4)由于既不使用大量有机溶剂，又不需要昂贵的防爆或超声设备，使得10-DAB的生产成本大大降低，增加其在市场上的价格竞争力以及利润空间；
5)利用水合肼肼解，将提取物中7-木糖紫杉醇、三尖杉宁碱、紫杉醇等紫杉烷类似物转化为10-DAB，简化分离操作，使10-DAB的提取率从60％～80％左右，提高到150％到300％左右；
6)这种技术可以用于低10-DAB含量红豆杉枝叶的提取，有效地从国内大量种植的南方红豆杉枝叶中提取10-DAB，打破了中国国内种植的红豆杉提取10-DAB无法工业化的难题，减少对欧洲红豆杉枝叶的依赖，将给中国红豆杉种植业及癌症患者带来真正的实惠。
附图说明
下面根据附图对本发明作进一步详细说明。
图1是本发明实施例所述的连续浸漉吸附提取红豆杉枝叶中的10-DAB的流程图。
具体实施方式
如图1所示，本发明实施例所述的一种连续浸漉吸附富集法从红豆杉枝叶中提取10-DAB的方法，包括浸泡渗漉、10-DAB富集、10-DAB粗品制备以及10-DAB纯品制备，具体过程如下所示：
第一步：浸泡渗漉
(1)将红豆杉枝叶装入浸漉罐中，加入弱酸水溶液，浸泡8小时；该弱酸水溶液优选用冰醋酸将水的PH值调节为5-6所得，选择冰醋酸目的主要有三点：首先，10-DAB在弱酸性中能长时间保持稳定；其次，促进10-DAB在水中的溶解度；而且冰醋酸可抑制霉菌在提取液中生成，使水溶液可以多次使用；
(2)打开(1)中所述的浸漉罐放出浸漉液，该浸漉罐优选设有过滤筛网的敞口不锈钢浸漉罐，放出浸漉液的同时将弱酸水溶液喷洒到浸泡过的枝叶上，加水速度和浸漉液流出速度保持一致；浸泡过的枝叶优选再进行2～3次的浸泡渗漉；
(3)用高效液相(HPLC)法进行实时监测，当浸漉液中10-DAB含量下降到开始流出浸漉液中10-DAB含量的10％左右时停止洒水，直到无明显浸漉液体流出为止。
第二步：10-DAB富集
①将(2)和(3)中所述的浸漉液通过大孔吸附树脂吸附罐进行富集，则包括10-DAB在内的有效成分被该树脂吸附，而水溶液从吸附罐中流出，用于下一级浸泡渗漉；该大孔吸附树脂为非极性或弱极性的树脂，非极性树脂包括HP-20、HPD-100、HPD-300、D-101、D-101-1、X-5以及H103等型的树脂，弱极性树脂包括AB-8、DA-201及HPD-400等型的树脂；如果产生废水，则将其在废水池处理后继续使用；
②HPLC实时监测，当D-101-1型树脂吸附饱和后，停止吸附；
③用有机溶剂作为流动相洗脱所述的D-101-1型树脂中所吸附的物质；洗脱液保存于储存罐中，而使用后的D-101-1型树脂可通过碱-酸-乙醇进行活化，循环使用。
第三步：10-DAB粗品制备
A.将储存罐中的有机溶剂除去；
B.加入乙酸乙酯、80％水合肼，加热肼解；反应完毕后分离有机层，除去有机溶剂，得黄色油状物；
C.向油状物中加入乙腈，加热溶解，得到浑浊状乙腈混合物；
D.冷却过夜，过滤、干燥，得到黄褐色粉末状物，为10-DAB粗品，10-DAB的含量为30％～60％。
第四步：10-DAB纯品制备
1)向10-DAB粗品中加入四氢呋喃(THF)水溶液，加热溶解后，加入活性炭，加热搅拌1小时，过滤，收集滤液；
2)在滤液中加入HP-20大孔吸附树脂，拌样；
3)将拌好的树脂样加入HP-20大孔树脂色谱柱中进行分离，流动相为丙酮和水，HPLC实时监测，收集10-DAB；
4)除去丙酮，水中析出固体，过滤、干燥得含有96％的10-DAB；
5)将10-DAB用四氢呋喃和水进行重结晶，得到含量为98％以上的10-DAB纯品。
下面以具体实施例来加以说明本发明的具体实施方式，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释说明本发明，并不用于限定本发明。
实施例
取当年生南方红豆杉干燥枝叶5Kg，加入到20L浸漉罐中，加入用冰醋酸调PH为5～6的弱酸水溶液15L，浸泡过夜；然后将浸漉罐底部阀门打开收集浸漉液，控制流速；同时，浸漉罐上加滴液漏斗，将弱酸水溶液洒到浸泡过的红豆杉枝叶上，使滴入弱酸水溶液的速度与流出浸漉液的速度相当。
HPLC检测浸漉液中10-DAB的含量，当流出的浸漉液中10-DAB含量低于开始流出浸漉液中的浓度10％时，停止加弱酸水溶液，并将釜中溶液控干，得到约125L的浸漉液，该浸漉液呈黄绿色。
玻璃吸附罐中加入5L活化后的D-101-1型树脂吸附浸漉液，HPLC检测，当D-101-1型树脂吸附饱和时，吸附完毕；向吸附罐中加入两倍吸附罐体积的水，洗脱除掉大极性杂质，控干树脂；以乙酸乙酯做为流动相进行洗脱，所得乙酸乙酯溶液进行减压蒸馏，浓缩到1～2L时为止；再加入100～200mL80％水合肼，20-60℃搅拌3小时，分离有机相，除去有机溶剂得黄色油状物。
向黄色油状物中加入100～200mL乙腈，得乙腈浑浊液，放入冰箱中冷冻过夜，过滤，干燥，得到黄褐色固体粉末12g，为10-DAB粗品；HPLC检测，用归一化法10-DAB含量为89％，外标法10-DAB含量为58％。
用10倍量的四氢呋喃水溶液(THF/H2O＝9：1)溶解粗品，活性炭脱色后，用HP-20树脂拌样，用丙酮-水体系为流动相分离，HPLC监测，收集含10-DAB归一化法90％以上的流出液，浓缩、冷却、过滤、干燥，得到归一化法含96％左右10-DAB，用四氢呋喃水溶液重结晶，干燥，得到4.9克10-DAB，纯度98.5％。归一化法低于90％的流动相，收集后蒸去有机溶剂，过滤，干燥，与粗品合并，重新进行柱层析分离。
用本发明所述的方法得到的10-DAB纯度达98％以上，符合市场需要的10-DAB纯品，还可继续纯化达到99.5％以上高纯的10-DAB产品。本发明利用水合肼肼解，将提取物中的7-木糖紫杉醇、三尖杉宁碱以及紫杉醇等紫杉烷类似物转化为10-DAB，不仅简化分离操作，而且使10-DAB的提取率从70％-80％左右提高到150％～300％左右；使得南方红豆杉或曼地亚红豆杉等含10-DAB较少的干枝叶的10-DAB产率达到0.8‰～1.5‰，接近欧洲红豆杉的产率，是传统技术无法达到的。
将本发明所述的方法与结果与专利CN1903849和CN101230053所述的方法与结果进行比较，如下表所示：
需要说明的是：本发明中研究所用国内红豆杉枝叶，主要来自江苏、福建等地，产地、品种差异，枝叶内所含紫杉烷类化合物差异很大，造成最终枝叶中10-DAB提取率、总产率有较大波动，且粗品中10-DAB含量差别也大，造成本发明中有些数据的范围较大。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下所作的有关本发明的任何修饰或变更，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种连续浸漉吸附富集法从红豆杉枝叶中提取10-DAB的方法，包括浸泡渗漉、10-DAB富集、10-DAB粗品制备以及10-DAB纯品制备，其特征在于：所述浸泡渗漉包括以下步骤：
(1)将红豆杉枝叶装入浸漉罐中，加入弱酸水溶液，浸泡8小时；
(2)打开(1)中所述的浸漉罐放出浸漉液，同时将弱酸水溶液喷洒到浸泡过的枝叶上，加水速度和浸漉液流出速度保持一致；
(3)HPLC实时监测，当流出的浸漉液中10-DAB含量下降到原来的8～12％时停止洒水；
所述10-DAB富集为大孔吸附树脂吸附富集；
所述10-DAB粗品制备是将富集得到的含有10-DAB的物质进行肼解，肼解后得黄色油状物，向油状物中加入乙腈，加热溶解，得到浑浊状乙腈混合物；然后冷却过夜，过滤、干燥，得到含有10-DAB的黄褐色粉末状物，为10-DAB粗品；
所述10-DAB纯品制备是将所述10-DAB粗品进行纯化得10-DAB纯品。
2.根据权利要求1所述的连续浸漉吸附富集法从红豆杉枝叶中提取10-DAB的方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂吸附富集的具体过程为：
①将(2)和(3)中所述的浸漉液通过大孔吸附树脂吸附罐，则包括10-DAB在内的物质被所述树脂吸附，而水溶液从吸附罐中流出，用于下一级浸泡渗漉；
②HPLC实时监测，当所述树脂饱和后，停止吸附；
③用有机溶剂作为流动相洗脱所述大孔吸附树脂，除去洗脱后所得溶液中的有机溶剂。
3.根据权利要求1或2所述的连续浸漉吸附富集法从红豆杉枝叶中提取10-DAB的方法，其特征在于：所述肼解是在除去有机溶剂的物质中加入乙酸乙酯、80％水合肼，加热肼解，分离有机层并将有机层中的溶剂除去，得到暗黄色油状物。
4.根据权利要求1所述的连续浸漉吸附富集法从红豆杉枝叶中提取10-DAB的方法，其特征在于：所述10-DAB粗品纯制备所述10-DAB纯品的步骤如下所示：
1)向10-DAB粗品中加入四氢呋喃水溶液，加热溶解后，加入活性炭，加热搅拌1小时，过滤，收集滤液；
2)在所述滤液中加入HP-20大孔吸附树脂，拌样；
3)将拌好的树脂样加入HP-20大孔树脂柱中进行分离，流动相为丙酮和水，实时监测，收集所述10-DAB；
4)除去丙酮，水中析出固体，过滤、干燥得10-DAB；
5)将所述10-DAB进行重结晶，得到超过98％含量的10-DAB纯品。
5.根据权利要求1所述的连续浸漉吸附富集法从红豆杉枝叶中提取10-DAB的方法，其特征在于：所述步骤②中当树脂吸附饱和后，先向吸附罐中加入两倍吸附罐体积的水，洗脱除掉大极性杂质，控干树脂后再加有机溶剂洗脱。
6.根据权利要求1所述的连续浸漉吸附富集法从红豆杉枝叶中提取10-DAB的方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂为非极性或弱极性树脂，所述非极性树脂包括HP-20、HPD-100、HPD-300、D-101、D-101-1、X-5以及H103型的树脂，弱极性树脂包括AB-8、DA-201及HPD-400型的树脂。
7.根据权利要求1所述的连续浸漉吸附富集法从红豆杉枝叶中提取10-DAB的方法，其特征在于：所述弱酸水溶液是用冰醋酸将水的PH值调节为5-6所得；所述浸泡渗漉的次数为2～3次；所述浸漉罐为有过滤筛网的敞口不锈钢浸漉罐。
8.根据权利要求4所述的连续浸漉吸附富集法从红豆杉枝叶中提取10-DAB的方法，其特征在于：所述四氢呋喃水溶液中四氢呋喃和水的比例为9：1～6：4。
9.根据权利要求4所述的连续浸漉吸附富集法从红豆杉枝叶中提取10-DAB的方法，其特征在于：所述重结晶是用四氢呋喃和水进行重结晶。
10.根据权利要求1或2所述的连续浸漉吸附富集法从红豆杉枝叶中提取10-DAB的方法，其特征在于：使用后的所述大孔吸附树脂可通过碱-酸-乙醇进行活化，循环使用。
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