CN101723953A - 从虎皮楠中分离提取两种双黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从虎皮楠中分离提取两种双黄酮的方法，包括以下步骤：1)将狭叶虎皮楠茎粉碎后，用乙醇回流提取；2)将提取液制成的浸膏分散于水中，再将所得悬浮液用石油醚萃取；3)所得萃取后水相用乙酸乙酯萃取，分层后得上层有机相和下层水相；将上层有机相过滤、浓缩，得乙酸乙酯相浸膏；4)以石油醚与乙酸乙酯的混合物作为洗脱剂，对乙酸乙酯相浸膏进行梯度洗脱，得洗脱液IV；以石油醚和乙酸乙酯的混合物作为洗脱剂，对洗脱液IV进行梯度洗脱，得洗脱液IV-2；5)将洗脱液IV-2减压旋转蒸发溶剂，再将所得的淡黄色粉末状固体用制备型HPLC进一步分离纯化，得双黄酮A和双黄酮B。

Description

从虎皮楠中分离提取两种双黄酮的方法

技术领域

本发明属于有机化合物提取领域，尤其是涉及一种虎皮楠科植物即狭叶虎皮楠的提取物——双黄酮A和双黄酮B的制备方法。

背景技术

双黄酮A的化学名为5，7，14三羟基黄烷(2→O→7，4→8)3′，5′，14′-三羟基黄酮醇，双黄酮B的化学名为5，7，14三羟基黄烷醇(2→O→7，4→8)3′，5′，14′-三羟基黄酮醇，其结构式如下：

双黄酮A为淡黄色粉末，M.p.264-266℃，ESI-MS(negative mode)：m/z＝539[M-H]^-。结合NMR数据确定分子式为C₃₀H₂₀O₁₀，不饱和度为21。该化合物遇FeCl₃显色剂显蓝色，说明分子中含有酚羟基，在254nm紫外灯下和碘蒸汽中均能显色。紫外光谱显示该化合物在350.60，245.50，212.50nm处有吸收。红外光谱有酚羟基的伸缩振动(3378cm^-1)，羰基伸缩振动(1613cm^-1)，苯环的特征吸收(1654cm^-1，1515cm^-1，1491cm^-1)，苯环CH面外弯曲振动(1254cm^-1，1160cm^-1，833cm^-1)，C-O-C伸缩振动(1136cm^-1)。

双黄酮B为淡黄色粉末，M.p.239-241℃，ESI-MS(negative mode)：m/z＝555[M-H]^-。结合NMR数据确定分子式为C₃₀H₂₀O₁₁，不饱和度为21。双黄酮B遇FeCl₃显色剂显蓝色，说明分子中含有酚羟基，在254nm紫外灯下和碘蒸汽中均能显色。紫外光谱显示双黄酮B在283.5，323.5nm处有吸收。红外光谱有酚羟基的伸缩振动(3260cm^-1)，羰基伸缩振动(1638cm^-1)，苯环的特征吸收(1614cm^-1，1515cm^-1，1458cm^-1)，苯环CH面外弯曲振动(1274cm^-1，1160cm^-1，816cm^-1)，C-O-C伸缩振动(1115cm^-1)。

狭叶虎皮楠Daphniphyllum angustifolium Hutch.为虎皮楠科Daphniphyllaceae植物，该科植物在传统中药中主要有愈合和消炎的作用，可以用来治疗哮喘、风湿、发热、流行性感冒，蛇咬伤等，在现代的临床运用中可以有治疗肠胃炎、促进消化、治疗湿疹等作用，但同时也是一种毒药，所以对它化学成分的研究具有重要意义。狭叶虎皮楠：常绿小乔木，主要分布在湖北和四川等地；生于海拔1600～2300m的阔叶林中，习见速生树种，花期4月，果期10～11月。

目前还没有从狭叶虎皮楠中提取双黄酮A和双黄酮B的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种工艺简洁、收率高的从虎皮楠中分离提取两种双黄酮的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种从虎皮楠中分离提取两种双黄酮的方法，包括：

1)、将狭叶虎皮楠茎粉碎后，用乙醇回流提取；所得提取液经真空抽滤和减压浓缩，得浸膏；

2)、将浸膏分散于水中，得悬浮液；再将悬浮液用等体积的石油醚萃取，得石油醚萃取液和萃取后水相；

3)、所述萃取后水相用等体积的乙酸乙酯萃取，分层后得上层有机相和下层水相；

将上层有机相过滤，得乙酸乙酯萃取液；再将乙酸乙酯萃取液在减压真空条件下旋转蒸发浓缩，得到乙酸乙酯相浸膏；

4)、以石油醚与乙酸乙酯分别按1∶0、10∶1、10∶3、2∶1的体积比所得的混合液作为洗脱剂，依次对乙酸乙酯相浸膏进行梯度洗脱，分别对应获得洗脱液I、洗脱液II、洗脱液III和洗脱液IV；

以石油醚和乙酸乙酯分别按3∶2、1∶1的体积比所得的混合液作为洗脱剂，依次对上述洗脱液IV进行梯度洗脱，分别对应获得洗脱液IV-1和洗脱液IV-2；

5)、将洗脱液IV-2减压旋转蒸发溶剂，得淡黄色粉末状固体；再将上述淡黄色粉末状固体用制备型HPLC进一步分离纯化，得双黄酮A和双黄酮B。

作为本发明的从虎皮楠中分离提取两种双黄酮的方法的改进，步骤5)的分离纯化的条件如下：

JAI LC-9103制备型液相，JAIGEL ODS-BP-30，30.0×250mm液相柱，流动相梯度条件为：在第0-5min，甲醇-水体积比为20∶80；在第6-10min，甲醇-水体积比为50∶50；第11-30min，甲醇-水体积比为70∶30；流速：10mL/min；在12.5和17分钟的出峰时间，分别得双黄酮A和双黄酮B。

作为本发明的从虎皮楠中分离提取两种双黄酮的方法的进一步改进：步骤2)中，浸膏与水的质量/体积比为：1g/2～3ml；步骤1)中，狭叶虎皮楠茎与乙醇的质量/体积比为：1g/2～3ml。

作为本发明的从虎皮楠中分离提取两种双黄酮的方法的进一步改进，步骤1)中用乙醇回流提取至少2次，合并每次提取所得的提取液，经真空抽滤和减压浓缩，得浸膏。

在本发明中，狭叶虎皮楠茎可以通过市购的方式获得，例如可从重庆市药物种植研究所购得。

在本发明的制备方法中，步骤2)所得的石油醚萃取液在减压条件下旋转蒸发浓缩，可得石油醚相浸膏。

步骤3)所得的下层水相用等体积的正丁醇萃取，得正丁醇萃取液；再将正丁醇萃取液在减压条件下旋转蒸发浓缩，可得到正丁醇相浸膏。

利用本发明的方法从虎皮楠中分离提取双黄酮A和双黄酮B，具有以下优点：

1、只需要经过硅胶柱就能获得双黄酮A和双黄酮B的混合成分。

2、经过一次制备液相分离，就能很好的将双黄酮A和双黄酮B分开，并且使所得双黄酮A和双黄酮B的纯度达到96％以上。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明的从虎皮楠中提取两种双黄酮的方法的工艺流程图；

图2是双黄酮A和双黄酮B的制备型HPLC分离谱图(JAI LC-9103，JAIGELODS-BP-30，30.0×250mm柱，甲醇-水70∶30，流速：10mL/min检测波长280nm)；

图3是双黄酮A的MS谱图；

图4是双黄酮A的IR谱图；

图5是双黄酮A的¹H-NMR谱图；

图6是双黄酮A的¹³C-NMR谱图；

图7是双黄酮A的DEPT 135谱图；

图8是双黄酮A的¹H-¹H COSY谱图；

图9是双黄酮A的HSQC谱图；

图10是双黄酮A的HMBC谱图；

图11是双黄酮B的MS谱图；

图12是双黄酮B的IR谱图；

图13是双黄酮B的¹H-NMR谱图；

图14是双黄酮B的¹³C-NMR谱图；

图15是双黄酮B的DEPT 135谱图；

图16是双黄酮B的¹H-¹H COSY谱图；

图17是双黄酮B的HSQC谱图；

图18是双黄酮B的HMBC谱图。

具体实施方式

实施例1、一种从虎皮楠中提取两种双黄酮的方法，依次进行以下步骤：

1)、将狭叶虎皮楠茎10kg粉碎后，用乙醇回流提取3次(20L×3)；合并3次提取所得的提取液，经真空抽滤和旋转蒸发仪减压(50Pa)浓缩，得浸膏750g。

2)、取750g浸膏分散于1.5L水中，使浸膏成悬浮状，得悬浮液；

再将悬浮液用等体积的石油醚萃取，所得萃取液分层后，得石油醚萃取液(位于上层)和萃取后水相(位于下层)；

石油醚萃取共3次(石油醚每次的用量均相等)，得经过3次萃取处理后的萃取后水相，合并3次所得的石油醚萃取液。

3)、将步骤2)所得的石油醚萃取液(3次合并所得)在减压(50Pa)条件下旋转蒸发浓缩，得石油醚相浸膏80g；

4)、将步骤2)最终所得的萃取后水相(即经过3次萃取处理后的萃取后水相)用等体积的乙酸乙酯萃取(3次)，所得萃取液分层后得上层有机相和下层水相。

合并3次所得的上层有机相。

将所得的上层有机相(合并3次所得)过滤，得乙酸乙酯萃取液；再将乙酸乙酯萃取液在减压(50Pa)真空条件下旋转蒸发浓缩，得到乙酸乙酯相浸膏156g。

将所得的下层水相(即经过3次乙酸乙酯萃取处理后的下层水相)用等体积的正丁醇萃取(3次)，所得萃取液分层后取上层有机相，过滤，得正丁醇萃取液。将正丁醇萃取液在减压(20Pa)条件下旋转蒸发浓缩，得到正丁醇相浸膏325g。

5)、先将156g的乙酸乙酯相浸膏和150g 100～200目硅胶相拌，干法上样，选用5L体积的硅胶柱进行分离；

然后分别以石油醚与乙酸乙酯分别按1∶0，10∶1，10∶3，2∶1的体积比所得的混合液各10000ml作为洗脱剂，以10ml/min的流速依次对上述灌有乙酸乙酯相浸膏的硅胶柱进行梯度洗脱，分别对应的获得洗脱液I、洗脱液II、洗脱液III和洗脱液IV；

将洗脱液IV在减压(50Pa)条件下旋转蒸发浓缩，得到洗脱液IV浓缩组分6g。

6)、将上述洗脱液IV浓缩组分6g进行TLC分析并选用合适的溶剂系统，经硅胶柱色谱分离，具体如下：

①、将洗脱液IV浓缩组分6g溶解在石油醚与乙酸乙酯按3∶2体积比混合的流动相10ml中，用800ml体积的硅胶柱进行分离；

②、分别以石油醚∶乙酸乙酯(体积比)＝3∶2，1∶1的洗脱剂各1600ml，以5ml/min的流速对上述硅胶柱进行梯度洗脱；对应的分别得到洗脱液IV-1和洗脱液IV-2。

7)、将洗脱液IV-2减压(50Pa)旋转蒸发溶剂，得淡黄色粉末状固体50mg；再将该50mg淡黄色粉末状固体用制备型HPLC进一步分离纯化，具体如下：

①、选用JAI LC-9103制备型液相，JAIGEL ODS-BP-30，30.0×250mm液相柱；

②、将50mg淡黄色粉末状固体溶解在2ml的甲醇中，一次性灌注；

③、流动相条件为：在第0-5min，甲醇-水体积比为20∶80；在第6-10min，甲醇-水体积比为50∶50；第11-30min，甲醇-水体积比为70∶30；流速：10mL/min。

④、在12.5和17分钟的出峰时间，分别得双黄酮A和双黄酮B18mg和22mg，经测定：该双黄酮A和B的纯度为96％以上。

该双黄酮A的各项检测结果如图3～图10所示。通过图3～图10给出的结论，证明所得物确为双黄酮A。

该双黄酮B的各项检测结果如图11～图18所示。通过图11～图18给出的结论，证明所得物确为双黄酮B。

对比实施例1、步骤1)～步骤6)的内容同实施例1；仅将步骤7)中的流动相条件改为：以甲醇-水90∶10(体积比)为流动相，流速：10mL/min；结果为：双黄酮A和双黄酮B这两种化合物在制备液相上重叠无法分开。

对比实施例2、步骤1)～步骤6)的内容同实施例1；仅将步骤7)中的流动相条件改为：以甲醇-水70∶30(体积比)为流动相，流速：10mL/min；结果为：双黄酮A和双黄酮B这两种化合物在制备液相上重叠无法分开。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.从虎皮楠中分离提取两种双黄酮的方法，其特征是包括以下步骤：

1)、将狭叶虎皮楠茎粉碎后，用乙醇回流提取；所得提取液经真空抽滤和减压浓缩，得浸膏；

2)、将浸膏分散于水中，得悬浮液；再将悬浮液用等体积的石油醚萃取，得石油醚萃取液和萃取后水相；

3)、所述萃取后水相用等体积的乙酸乙酯萃取，分层后得上层有机相和下层水相；

将上层有机相过滤，得乙酸乙酯萃取液；再将乙酸乙酯萃取液在减压真空条件下旋转蒸发浓缩，得到乙酸乙酯相浸膏；

4)、以石油醚与乙酸乙酯分别按1∶0、10∶1、10∶3、2∶1的体积比所得的混合液作为洗脱剂，依次对乙酸乙酯相浸膏进行梯度洗脱，分别对应获得洗脱液I、洗脱液II、洗脱液III和洗脱液IV；

以石油醚和乙酸乙酯分别按3∶2、1∶1的体积比所得的混合液作为洗脱剂，依次对上述洗脱液IV进行梯度洗脱，分别对应获得洗脱液IV-1和洗脱液IV-2；

5)、将洗脱液IV-2减压旋转蒸发溶剂，得淡黄色粉末状固体；再将上述淡黄色粉末状固体用制备型HPLC进一步分离纯化，得双黄酮A和双黄酮B。

2.根据权利要求1所述的从虎皮楠中分离提取两种双黄酮的方法，其特征是：所述步骤5)的分离纯化的条件如下：

JAI LC-9103制备型液相，JAIGEL ODS-BP-30，30.0×250mm液相柱，流动相梯度条件为：在第0-5min，甲醇-水体积比为20∶80；在第6-10min，甲醇-水体积比为50∶50；第11-30min，甲醇-水体积比为70∶30；流速：10mL/min；在12.5和17分钟的出峰时间，分别得双黄酮A和双黄酮B。

3.根据权利要求1或2所述的从虎皮楠中分离提取两种双黄酮的方法，其特征是：所述步骤2)中，浸膏与水的质量/体积比为：1g/2～3ml。

4.根据权利要求3所述的从虎皮楠中分离提取两种双黄酮的方法，其特征是：所述步骤1)中，狭叶虎皮楠茎与乙醇的质量/体积比为：1g/2～3ml。

5.根据权利要求4所述的从虎皮楠中分离提取两种双黄酮的方法，其特征是：所述步骤1)中用乙醇回流提取至少2次，合并每次提取所得的提取液经真空抽滤和减压浓缩，得浸膏。

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