KR20010084325A - 식물 원료로부터 초임계 유체를 이용하여 알칼로이드를제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 초임계 유체 추출 기술을 이용하여 알칼로이드를 식물 원료로부터 추출 제조하는 방법 및 그 방법으로 제조된 알칼로이드에 관한 것이다. 더욱 상세히는 식물 재료를 초임계 추출 장치에서 70∼90℃의 온도 및 4000∼6000 PSI 압력으로, 주용매인 이산화탄소 100 중량부에 대해 2∼18(v/v)%의 디에틸아민 또는 트리에틸아민이 용해된 메탄올, 에탄올, 물 또는 이들의 혼합용매에서 선택된 1종 이상의 알칼리성 공용매 1∼20 중량부를 혼합시켜 알칼로이드를 추출한 후, 크로마토그래피를 이용하여 분리, 여과, 정제시킴을 특징으로 하는 알칼로이드의 제조 방법 및 그의 방법으로 제조된 알칼로이드를 제공하는 것이다.

Description

식물 원료로부터 초임계 유체를 이용하여 알칼로이드를 제조하는 방법{Method for preparing alkaloid using supercritical fluid from plant}

본 발명은 초임계 유체 추출 기술을 이용하여 알칼로이드를 식물 원료로부터 추출 제조하는 방법 및 그 방법으로 제조된 알칼로이드에 관한 것이다. 더욱 상세히는 고온 고압하의 초임계 상태에서 이산화탄소 또는 이산화탄소와 1개 이상의 공용매를 혼합시켜 식물 원료에서 알칼로이드를 추출하고 이를 다시 분리 정제시키는 방법 및 분리 정제시켜 제조된 알칼로이드에 관한 것이다.

초임계 유체 추출기술(Supercritical Fluid Extraction Technology)은 임계 온도 및 임계 압력 이상의 유체를 사용하는 기술로 의약품, 식품가공 및 석유화학물질 정제 등의 추출, 정제관련 분야에서 기존의 공정을 대체할 수 있는 새로운 환경 친화적 청정기술로 주목받고 있다. 특히, 근자에 이르러 에너지 자원 가격의 상승, 전통적인 분리 공정이 지니는 환경폐해, 기체나 액체 공정으로 제조가 불가능한 특수 목적 신소재 수요의 신장 등의 이유로 선진 각국에서는 지난 30여 년간,전통적인 공정으로 기체나 액체를 사용하는 개념을 탈피하여 초임계 유체 기술을 공정 유체로 사용하는 신공정 유체기술의 개발에 심혈을 기울여 오고 있다. 그 결과 공정 유체로서 초임계 유체를 사용하는 기술은 정밀화학, 에너지, 환경, 신소재 등 제반 산업에 급속도로 파급되면서 전통적인 다양한 분리기술을 초임계 유체 공정을 이용하는 신기술로 대체해가고 있다.

특히 다양한 초임계 유체 후보 중 이산화탄소를 사용할 경우에는 또 다른 장점이 있다. 이산화탄소는 자연에 무한량 존재할 뿐만 아니라 제철산업이나 석유화학산업에서 다량 발생하는 물질이다. 또한 이산화탄소는 무색, 무취, 인체에 무해하며 또한 화학적으로 매우 안정한 물질이다.

여기에 덧붙여 이산화탄소는 그 어떤 유체 보다 낮은 임계 온도(31.1 ℃)와 임계 압력(7.4 MPa)을 나타내 쉽게 초임계 조건으로 조정이 가능하여 환경 친화적 특성뿐만 아니라 효율적 에너지 사용면에서도 큰 장점을 갖는다. 더군다나 이 기술이 천연생리활성물질의 분리, 정제 분야에서 적용될 시에는 기존의 공정에서 발생하는 문제점, 즉 최종 산물 내에 잔류하는 유기용매에 의한 인체독성, 고비용, 폐기용매에 의한 환경공해, 목적성분의 변성 및 낮은 추출 선택성 등을 상당부분에서 해결 또는 보완할 수 있다.

초창기 초임계 유체 기술이 천연물 추출 정제에 주로 적용된 분야는향신료(flavor), 향수(perfume), 지방산(fatty acid), 지질(lipid), 스테로이드(steroid) 등과 같이 비극성, 저가의 식품이나 향료 성분에 국한되었으나 최근 들어 이 기술에 관련된 여러 현상학적 특성 및 부가적 기술의 발전으로 극성, 소량, 고가의 천연의약품 추출 정제에 응용되기에 이르렀다.

산업전반에 걸쳐 모든 공정에서 환경에 대한 관심이 증가되는 현 상황에서 천연물 유효 성분을 추출, 정제하는 공정 또한 기존의 유기용매를 이용한 추출, 정제 공정이 갖는 여러 문제점, 즉 환경 및 인체 독성, 목적 성분에 대한 비선택성, 고비용 등을 해결할 수 있는 새로운 공정을 도입하기 위한 다각도의 시도가 국내외에서 모색되고 있다.

초임계 유체(Supercritical Fluid)는 임계점(critical point) 즉, 임계 온도(critical temperature), 및 임계 압력(critical pressure) 이상에 존재하는 물질의 상태로, 기체와 액체의 중간 성격을 갖는 유체이다. 초임계 유체는 액체에 상응하는 밀도를 가지며 또한 기체에 해당하는 투과성을 나타낸다.

모든 순수 물질은 온도, 압력의 변화에 따라 기체 및 액체 고체 등의 상태 (phase)를 나타낸다. 기체 및 액체의 상전이 곡선인 증기압 곡선을 살펴보면 온도가 증가함에 따라 압력도 함께 증가하는 데 이는 새로운 평형점에 도달하기 위한 결과로써 증기압의 증가를 가져오고 결국 액상과 기상 사이의 밀도 차이가 감소된다. 이러한 액체와 기체의 밀도 차이가 임계점 이라는 곳에서 동일해져 구별할 수 없게 된다. 임계점 이상의 영역에서는 압력을 증가시켜도 액화현상이 일어나지 않고 또한 온도를 높여도 기화현상이 일어나지 않는다.

이러한 임계점 이상에서 기체와 액체의 중간 성격을 갖는 유체를 초임계 유체라 정의한다. 초임계 유체는 미세한 온도, 압력 변화에도 밀도가 크게 변하므로 용해력을 쉽게 조절할 수 있으며 또한 기체 및 액체와는 또 다른 고유의 특성을 갖추고 있다.

즉 용매와 용질 분자 사이의 상호작용에 관련된 용해(dissolution), 기질(matrix)로부터 용질을 분리해 내는 능력과 밀접한 연관성을 갖는 밀도(density) 등의 측면에서는 액체의 특성을 나타내며 기질 투과성과 관련이 있는 높은 확산도(diffusivity), 낮은 표면 장력(surface tension) 등은 기체의 성질을 나타낸다.

그러나 실제로는 초임계 상태를 유지하기 위한 임계온도 및 압력이 가능하면 낮은 물질을 초임계 유체를 추출 정제 분야에 사용하고 있다. 이산화탄소는 다른 물질에 비해 초임계 상태로 만들기 위한 임계 온도 및 압력이 낮고 또한 인체에 무해하며, 환경 친화적이고 비용면에서 저렴한 장점으로 인하여 추출, 정제 용매로 널리 사용되고 있다.

그러나 이산화탄소는 이러한 장점에도 불구하고 낮은 극성으로 말미암아 다양한 극성 천연물을 추출하기에는 많은 문제점을 내포한다. 따라서 이러한 문제점을 극복하기 위해 다양한 시도가 진행되었으며 대표적으로는 우선 이산화탄소 이외의 N₂O와 같은 다른 초임계 유체의 사용, 온도, 압력의 증가, 극성 공용매의 첨가 등이다. N₂O의 경우 임계온도 및 압력이 36.5 ℃와 70.6 bar로 이산화탄소와 마찬가지로 낮은 임계점을 나타내어 초임계 유체화시키는데 큰 어려움이 없다.

초임계 유체의 온도 증가는 압력과는 달리 유체의 밀도를 감소시킨다. 그러나 유체의 확산도, 목적 성분의 휘발성(volatility) 및 기질로부터의 탈착에는 긍정적 영향을 미친다.

초임계 유체의 조절 변수인 온도, 압력을 증가시키는 것은 경제적으로나 기술적으로 한계가 있으며, 상당수의 화합물들의 추출 효율에 대해서는 큰 영향을 나타내지 못한다. 따라서 낮은 극성이 문제가 되는 초임계 이산화탄소의 경우 용매의 극성을 높이기 위해 대부분 소량의 유기용매를 첨가하는 방법을 사용하고 있다.

일반적으로 시료내의 수분은 초임계 유체 추출 효율을 감소시킨다. 그러나 특별한 경우에 있어서는 시료의 수분 함량의 증가가 추출 효율을 상승시키는 결과를 가져온다.

알칼로이드는 다양하고 강력한 생리활성 때문에 초임계 유체 기술법이 천연물에 적용되기 시작한 초창기부터 여러 화합물에 대해 그 응용가능성이 검토되었다. 그러나 다른 여타의 천연물 계열 성분에 비해서는 아직 다양한 화합물 성분에 비해 그 적용범위가 한정되어있다.

대표적으로 초임계 유체 기술이 접목된 알칼로이드계열 성분은 카페인이다. Sugiyama 등(1985)은 커피 열매으로부터 카페인을 초임계 이산화탄소로 추출할 시 그 추출효율에 미치는 온도, 압력, 시료내의 수분 및 추출 시간 등의 영향에 대해 평가하여 최적 온도, 압력을 산출하였으며 또한 다른 화합물들과는 달리 시료내의 수분함량의 증가에 따라 추출효율이 증가함을 확인하였다.

또한 Elisabeth 등 (1991)은 초임계 유체 크로마토그래피 법을 이용하여 커피 열매로부터 카페인을 분리 정제 하였으며 Ndiomu와 Simpson (1988)은 콜라넛으로부터 카페인을 추출할 시 공용매로 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran) 또는 메탄올을 사용하면 순수 이산화탄소에 비해 추출 수율이 2배 가까이 증가함을 보고하였다. 피롤리지딘(Pyrrolizidine)계열 알칼로이드에 대해서는 Schaeffer 등(1991)이 크로탈라리아 스펙타빌리스(Crotalaria spectabilis)에서 모노크로탈린 (monocrotaline)을 5∼10 mol%가 첨가된 이산화탄소(35∼55℃, 10.34∼22.15 MPa)로 추출하여 추출 수율을 95%로 증가시켰다. 또한 세네시오종(Senecio species)의 피놀리지딘 알칼로이드에 대해서는 Bicchi등(1991)이 55℃, 15 MPa 의 이산화탄소에 11%의 메탄올을 첨가하여 메탄올 속슬렛 추출법에 비해 수율 및 정제 시간면에서 효율적임을 밝혔다.

이상과 같이 초임계 유체 기술을 몇몇 알칼로이드 계열 성분에 대해 적용한 예가 보고되었으나 아직은 다른 천연물 계열 성분에 비해 그 응용범위가 한정되어 있다. 이와 같은 원인은 알칼로이드성분의 높은 극성 및 천연물내에서 식물 기질(matrix)과의 강한 결합에 기인한다. 이러한 문제점을 극복하고자 초임계 이산화탄소에 첨가하는 공용매의 양을 증가시켜 추출 수율을 증가시키려는 연구가 수행되었으나 필요한 공용매양의 상승으로 기존의 유기용매 추출방법에 대해 초임계 유체 기술이 갖는 장점인 인체 및 환경에 대한 무독성을 상쇄시켜 보다 근본적인 해결책이 모색되어야 했다. 실례로 테바인(thebaine), 코데인(codeine), 몰핀(morphine) 등을 추출하기 위하여 초임계 이산화탄소가 사용되었으나 이 경우 공용매로 사용한 메탄올 등의 함량이 25∼50% 가까이 되어야 기존의 유기용매 추출법에 필적할 수 있음이 밝혀졌다(Janicot et al., 1991).

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 산업전반에 걸쳐 모든 공정에서 환경에 대한 관심이 증가되는 현 상황에서 알칼로이드를 추출, 정제하는 공정 또한 기존의 유기용매를 이용한 추출, 정제 공정이 갖는 여러 문제점, 즉 환경 및 인체 독성, 목적 성분에 대한 비선택성, 고비용 등을 해결할 수 있는 새로운 공정을 개발키 위해 초임계 유체 추출 방법을 도입하여 식물에서 알칼로이드를 추출하는 방법을 개발한 것이다.

도 1은 본 발명의 초임계 유체 추출 장치의 개략도이다.

도 2는 본 발명의 미치광이풀으로부터 초임계 유체 추출 후 가스 크로마토그래피 그래프이다. 1은 히요시나민을 나타내고 2는 스코폴라민을 나타낸다.

도 3은 본 발명의 마황으로부터 초임계 유체 추출 후 가스크로마토그래피 그래프이다. 1은 메틸에페드린, 2는 노어에페드린, 3은 에페드린, 4는 슈도에페드린을 나타낸다.

※ 도면부호 설명

10 : 항온조, 11 : 추출기, 12 : 시린지 펌프,

13 : 리스트릭터, 14 :수집 베셀, 15 : 공급 밸브,

16 :배출 밸브

본 발명은 식물 재료를 초임계 추출 장치에서 70∼90℃의 온도 및 4000∼6000 PSI 압력으로, 주용매인 이산화탄소 100 중량부에 대해 2∼18(v/v)%의 디에틸아민 또는 트리에틸아민이 용해된 메탄올, 에탄올, 물 또는 이들의 혼합용매에서 선택된 1종 이상의 알칼리성 공용매 1∼20 중량부를 혼합시켜 알칼로이드를 추출한 후, 크로마토그래피를 이용하여 분리, 여과, 정제시킴을 특징으로 하는 알칼로이드 의 제조 방법 및 그의 방법으로 제조된 알칼로이드를 제공하는 것이다.

또한 이때 알칼로이드의 초임계 추출 온도는 75∼85℃임을 특징으로 하고, 압력은 4700∼5300 PSI임을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 식물은 미치광이풀이며 추출 제조된 알칼로이드는 히요시나민, 스코폴라민임을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 식물은 마황이며 추출 제조된 알칼로이드는 메틸에페드린, 노어에페드린, 에페드린, 슈도에페드린 등임을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 식물은Cephalotaxus wilsoniana Hayta이며 추출 제조된 알칼로이드는 세팔로탁신임을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

일반적으로 알칼로이드는 천연물내에서 유리 염기 형태가 아닌 염 형태로 존재한다. 따라서 대부분의 알칼로이드는 식물 세포 중에 액포(vacuole)에 존재하며 액포의 산성 용액에 의해 염화 된다. 이러한 알칼로이드의 염 형태는 이산화탄소와 같은 비극성 용매에 대한 용해도를 저하시키며 또한 천연물 기질에 강하게 결합되어 있는 형태이다.

따라서 본 발명에서는 알칼로이드 계열 성분의 이상과 같은 천연물 내에서의 특성을 파악하여 염 형태로 존재하는 알칼로이드를 이산화탄소와 같은 비극성 용매로 추출 가능한 유리 염기 형태로 변환시키고 초임계 유체 기술을 적용하였을 때 그 추출효율을 확인하였다.

본 발명에서 목적성분으로 선택한 알칼로이드 및 그 함유식물은 다음과 같다.

1. 미치광이풀의 히요시나민 및 스코폴라민

미치광이풀(Scopolia japonica Nakai)은 가지과에 속하는 다년생 초본으로 근경은 굵고 튼튼하며 줄기는 높이 30∼60 cm으로 기부에 인편이 있다. 생약으로 사용되는 부위는 뿌리, 뿌리 줄기 및 잎이 진경, 진통약으로서 주로 스코폴리아 엑스 제조 원료 및 브롬화수소산 스코폴리아의 원료로 사용된다. 분리된 성분으로는 트로판 알칼로이드인 히요시나민, 스코폴라민, 아포아트로핀과 쿠마린류로 스코포레틴과 스코포린 등이 보고되어 있다. 이중 히요시나민은 진경, 동공, 산대 작용 등의 부교감 신경 차단 작용이 강하고, 항스트레스성 궤양 작용, 소장 운동 및 분비 억제 작용 등이 있으며 스코폴라민의 경우 부교감 신경 차단 작용은 히요시나민과 비슷하나 중추 작용은 더 강하다.

2. 마황의 메틸에페드린(methylephedrine), 노어에페드린(norephedrine), 에페드린, 슈도에페드린(pseudoephedrine)

마황(Ephedra sinica Stapf.)은 마황과(Ephedraceae)에 속하며 중국의 화중, 동북부 길림성에 자생하는 초본상의 소관목으로 건조한 고지, 구릉에서 자라며 높이는 30∼70 cm이며, 암수 딴그루이다. 생약으로 사용되는 부위는 전초이고 분리 보고된 성분으로는 메틸에페드린, 노어에페드린, 에페드린, 슈도에페드린 등이다.

3. 세팔로탁신

Cephalotaxus wilsoniana Hayta는 개비자나무과(Cephalotaxaceae)에 속하는 자웅이주의 상록교목으로 대만 산간지방의 해발 400∼2700 m 지역에 자생하고 있다. 높이는 완전히 자랐을 때 40 m에 이르며 가지에는 털이 없다.

Cephalotaxus wilsonina의 함유성분으로는 세팔로탁신, 세팔로탁시논, 아세틸세파로탁신, 디메틸 세팔로타신, 에피세팔로탁신, harrigtonine, homoharringtonine, wilsonine, c-3epi-wilsonine, hydroxycephalotasine, isoharringtonine 등의 알칼로이드가 보고되었다(Chiu and Chang, 1992; Powell et al., 1972).

순수 화합물의 초임계 유체 추출 효율에 미치는 기질의 영향을 확인하기 위하여 1g의 필터 페이퍼 디스크[filter paper disk (Advantec No. 2, Toyo Roshi Kaisha, Tokyo, Japan)]를 1.0 cm으로 세절한 후 추출조에 넣었다. 각각의 대상 화합물 용액(0.2 mg/mL)을 필터 페이퍼 디스크가 있는 추출조에 떨어뜨린 후 35∼45℃ 진공 오븐에서 20∼28시간 동안 건조한 후 사용하였다.

초임계 유체 추출 기기는 두개의 Isco 260D syringe pump(Lincoln, NE, U.S.A.)가 연결된 Isco supercritical fluid extractor, model SFX 3560을 사용하였다. 사용된 초임계 유체 추출 장치의 모식도는 도 1에 나타내었다.

냉각된 이산화탄소가 탱크로부터 먼저 시린지 펌프(12)에 주입되고 다른 하나의 시린지 펌프(12)에는 미리 선택된 공용매가 채워졌다. 이산화탄소와 공용매는 T-믹서에 의해 섞이고 예열기를 통해 원하는 온도로 예열된 용매는 공급 밸브(15)를 통해 추출조(10 : 57 mm 20 mm, Isco)에 주입되었다. 주입된 용매는 용질과 접촉을 위하여 일정시간의 접촉 시간(static time)을 거쳐 추출하였다.

일정시간의 접촉 시간을 거친 후 배출 밸브(16)가 열린 후 추출물이 수집 베셀(14)에 포집되었다. 유속은 일정온도(80 ℃)로 가열된 리스트릭터(13)를 통해 조절되며 추출물은 해압시의 손실을 방지하기 위해 메탄올이 채워진 수집 베셀(14)에 모았다.

추출이 끝난 후에는 세척 밸브를 통해 이산화탄소로 리스트릭터(13)에 남아 있는 추출물을 수집 베셀(14)에 모으고 다시 리스트릭터에 연결된 용매 펌프에 의해 메탄올로 리스트릭터에서의 해압과정시 남아 있을 가능성이 있는 추출물을 씻어내었다.

추출 성분의 초임계 유체 내 용해도를 측정한 후 다시 화합물의 추출 효율에 미치는 기질과의 관계를 확인하기 위하여 1 g의 여과지에 흡착된 시료를 최적 용해도를 나타내는 초임계 유체 조건에서 추출하였다. 유속 및 리스트릭터의 온도는 각각 1.0 mL/min 및 80 ℃였다.

알칼로이드가 흡착된 여과지의 추출은 알칼로이드가 흡착된 여과지는 80 ℃, 34.0 MPa 에서 순수 이산화탄소 및 부피비 1, 5, 10 % (v/v)의 메탄올, 물, 에탄올과 디메틸아민, 트리메틸아민 등이 용해된 메탄올, 물, 에탄올 등을 공용매로 첨가된 이산화탄소를 사용하여 추출하였다.

미치광이풀, 마황,Cephalotaxus wilsoniana Hayta등 식물의 잎, 줄기껍질, 뿌리 각 100 mg을 추출조에 넣은 후 여과지 실험과 같은 조건에서 초임계 유체 추출하였다. 추출 시간대별 분획은 초임계 유체 추출 장치에 장착된 분획 수집기 (fraction collector)로 일정 시간 동안 추출한 후 배출 밸브를 닫고 다시 다음 수집 베셀에 추출물을 포집하였다.

본 발명에 따른 미치광이풀의 알칼로이드 최종 추출물을 가스 크로마토그래피로 분리 후, 데이터를 도 2에 나타내었다. 또한 마황의 최종 추출물을 가스 크로마토그래피로 분리 후, 데이터를 도 3에 나타내었다.

이하 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.

(실시예 1) 미치광이풀로부터 초임계 유체 기술을 이용한 알칼로이드인 히요시나민과 스코폴라민의 추출

초임계 이산화탄소 추출효율을 위한 기초 실험으로 히요시나민과 스코폴라민 유리 염기 및 염의 순수 초임계 이산화탄소 용해도를 측정하였다.

히요시나민과 스코폴라민의 염은 어떠한 온도, 압력 조건 (40∼60 ℃, 13.6∼34.0 MPa)의 초임계 이산화탄소에서도 전혀 녹지 않았다. 그러나 유리 염기는 염의 경우와는 달리 모든 조건에서 510 μg/mL이상의 용해도를 나타내었다.

실험 조건 내에서 히요시나민과 스코폴라민 용해도는 온도 압력의 증가에 비례하였으며 60 ℃, 34. MPa에서의 히요시나민과 스코폴라민 유리 염기의 용해도는 각각 5.9, 11 mg/mL로 순수 초임계 이산화탄소에 상당량 녹음을 알 수 있었다. 그러나 이러한 히요시나민과 스코폴라민 유리 염기의 순수 초임계 이산화탄소 내에서의 높은 용해도와는 달리 식물체에서는 어떠한 온도, 압력 조건에서도 전혀 추출되지 않았다. 이러한 이유는 식물세포의 액포에서 히요시나민과 스코폴라민이 유리 염기 형태가 아닌 수용성의 염 형태로 존재하며(Huges and Genest, 1973) 대다수 알칼로이드와 마찬가지로 히요시나민과 스코폴라민 유리 염기 형태는 초임계 이산화탄소와 같은 비극성 용매에 잘 녹지만 염 형태는 거의 녹지 않는다는 사실로 설명될 수 있다.

다음으로 본 발명에서는 이러한 염 형태의 히요시나민과 스코폴라민을 초임계 이산화탄소에 녹이기 위하여 물이나 메탄올과 같은 극성 용매를 첨가하여 용해도를 증가시키고자 하였다.

초임계 이산화탄소에 대한 히요시나민과 스코폴라민 염의 용해도를 향상시키기 위하여 이산화탄소의 극성을 증가시키는 공용매로써 메탄올과 물을 선정하였다. 초임계 유체를 이용한 추출에 있어 메탄올을 공용매로써 가장 널리 사용하는데 이는 메탄올의 높은 용매 극성 파라미터로 인해 이산화탄소의 극성을 크게 증가시킬 수 있고 또한 식물 추출에 이용할 경우 식물 기질의 swelling 효과를 증가 시켜 추출 효율을 높일 수 있기 때문이다.

첨가하는 공용매 양에 따른 용해도 변화를 보면 메탄올의 경우 히요시나민과 스코폴라민 두 종류 염 모두 용해도가 급격히 증가하였다. 그러나 물의 경우에 있어서는 메탄올과는 달리 첨가하는 공용매 양에 따라 용해도가 크게 증가하지 않았다. 이와 같은 원인은 첨가하는 물의 양이 증가하면 이산화탄소에 섞이는 정도가 작아지는 것에 기인한다. 각각의 공용매가 이산화탄소와 섞이는 정도를 확인하기 위하여 view cell을 통해 각각의 상을 관찰하였다.

한편 히요시나민과 스코폴라민의 유리 염기는 염 형태가 순수 초임계 이산화탄소에 전혀 녹지 않는 것과는 달리 모든 실험 조건에서 상당량이 녹은 결과를 바탕으로 염을 유리 염기 형태로 변환시켜 용해도를 증가시키고자 하였다. 이를 위하여 초임계 이산화탄소에 첨가하는 공용매를 염기성화시켜 사용하였다. 이를 위하여 메탄올과 물에 각각 디에틸아민을 10% (v/v)로 혼합한 공용매를 이산화탄소에 대해1, 5, 10%로 첨가하여 그 용해도를 측정하였다.

염기성 공용매의 첨가는 순수한 메탄올 혹은 물을 사용하였을 때 보다 어떤 부피 (1, 5, 10%)의 첨가에서도 용해도를 크게 증가시켰다. 이는 공용매로써 디에틸아민에 의해 염기화된 메탄올 혹은 물의 첨가로 히요시나민과 스코폴라민 염가 이산화탄소에 잘 녹는 유리 염기로 변환되었기 때문이다.

본 발명에서 사용된 공용매의 효과를 살펴보면 용해도의 결과와 마찬가지로 메탄올이나 물에 비해 염기성 공용매가 목적 알칼로이드의 탈착을 증가시키는 것으로 나타났다. 특히 메탄올에 디에틸아민이 첨가된 공용매는 다른 어떤 것보다도 효과적이었으며 10%를 이산화탄소에 첨가할 시 히요시나민과 스코폴라민 유리 염기 및 염 모두 50∼80% 가까이 추출 할 수 있음이 나타났다.

결론적으로 공용매가 히요시나민과 스코폴라민의 유리 염기 및 염의 용해도 및 기질로부터의 탈착에 미치는 효과를 측정한 결과 디에틸아민이 첨가된 메탄올이 모든 면에서 초임계 이산화탄소 추출효율을 가장 크게 증가시켰다.

뿌리 및 지상부로부터 히요시나민과 스코폴라민의 추출 수율은 디에틸아민이 첨가된 메탄올을 10% 사용할 경우 기존의 유기용매 추출법에 대해 다른 공용매에 의해서는 10∼54%의 추출 수율을 나타낸 반면에 각각 98% 및 84%로 나타났다.

(실시예 2) 마황으로부터 초임계 유체 기술을 이용한 알칼로이드인 메틸에페드린, 노어에페드린, 에페드린, 슈도에페드린의 추출

에페드린 유도체도 히요시나민 및 스코폴라민과 마찬가지로 식물 내에서 salt 형태로 존재한다는 가정 하에 본 발명에서는 염기성 공용매를 첨가하여 초임계 이산화탄소 내에서의 용해도를 측정하였다. 그 결과 예상대로 디에틸아민에 의해 염기성 메탄올은 순수한 메탄올에 비해 용해도를 2배 이상 증가시켰다. (-)-메틸에페드린의 경우에는 순수한 메탄올에 비해 디에틸아민이 첨가된 메탄올이 크게 용해도를 증가시키지 못했다.

용매의 극성 증가만으로도 굳이 염 형태를 유리 염기 형태로 변화시킬 필요가 없음을 보여준다. 디에틸아민이 첨가된 물의 공용매 효과 또한 디에틸아민이첨가된 메탄올의 경우와 마찬가지로 (-)-메틸에페드린을 제외한 모든 에페드린 유도체 염의 용해도를 물에 비해 크게 증가시켰다.

이상의 결과로써 에페드린 유도체도 히요시나민 및 스코폴라민과 마찬가지로 용해도 면에서 염기성 공용매를 사용하는 것이 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.

용해도 외에도 추출효율에 영향을 미치는 기질로부터 탈착 정도를 확인하기 위하여(-)-메틸에페드린 및 (-)-노어에페드린, (-)-에페드린 및 (+)-슈도에페드린 하이드로클로라이드 등을 셀룰로즈 페이퍼에 흡착시킨 후 각 공용매의 추출 효율에 미치는 효과를 측정하였다. 그 결과 용해도에서와 마찬가지로 염기성 공용매가 순수한 메탄올이나 물에 비해 에페드린 유도체의 추출 효율을 크게 증가시킬 수 있음이 확인되었다.

이러한 결과는 염기성 공용매가 화합물의 용해도를 증가시키는 것 외에도 기질로부터 탈착을 크게 증가시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 사용된 공용매 중에서 디에틸아민이 첨가된 메탄올을 10% 로 이산화탄소에 첨가할 경우 모든 에페드린유도체의 추출 효율을 가장 크게 증가 시켰다

(-)-에페드린과 (+)-슈도에페드린은 구조면에서 이성질체(diastereomer)의관계이다. 기존의 유기용매 추출로는 이러한 두 물질의 선택적 추출이 불가능하나 본 발명에서 사용한 디에틸아민이 첨가된 공용매를 이산화탄소와 함께 사용할 경우 에페드린을 선택적으로 추출할 수 있음이 밝혀졌다.

(실시예 3)Cephalotaxus wilsoniana Hayta로부터 초임계 유체 기술을 이용한 알칼로이드인 세팔로탁신의 추출

C. wilsoniana 1g 을 기존의 유기용매 추출법에 따라 정량한 결과 C. wilsoniana 잎에는 세팔로탁신이 0.0022% (22±0.51 μg/g) 함유되어 있는 것으로 확인되었다. 순수한 초임계 이산화탄소를 40∼80℃, 10.2∼34.0 MPa의 조건에서 사용한 경우에는 예상대로 세팔로탁신이 전혀 추출되지 않았다. 수율을 증대시키기 위하여 메탄올 및 water를 80 ℃, 34.0 MPa에서 1, 5, 10% 부피비로 첨가하여 추출한 결과 기존의 유기용매 추출에 비해 모든 조건에서 20% 미만의 추출율을 나타내었다.

그러나 메탄올에 디에틸아민을 10%의 부피비로 첨가한 염기성 공용매를 사용한 경우 기존의 추출법에 비해 28% 가까이 높아졌다. 이는 앞서 트로판 계열 성분과 벤질아민 성분의 초임계 이산화탄소의 추출에 밝힌 바와 같이 염기성 공용매가 식물체내에 존재하는 세팔로탁신의 염 형태를 초임계 이산화탄소에 잘 녹는 유리 염기 형태로 변환시키기 때문으로 판단되었다.

따라서 이러한 세팔로탁신의 초임계 이산화탄소 추출 결과를 앞서의 히요시나민, 스코폴라민, 메틸에페드린, 노어에페드린, 에페드린, 슈도에페드린 등의 결과와 함께 판단하여 볼 때 본 발명에서 제안한 염기성 공용매로 10%의 디에틸아민에 염기성 메탄올을 초임계 이산화탄소에 10%로 첨가된 것을 사용하는 것은 염기성 알칼로이드의 초임계 유체 추출에 있어 일반화된 방법으로 정착될 수 있을 것으로 간주된다.

본 발명의 효과는 식물의 알칼로이드의 새로운 추출, 정제 방법으로 초임계 유체 기술을 적용하기 위하여 다양한 종류의 공용매가 추출 수율 및 목적 성분의 선택성에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 2∼18(v/v)%의 디에틸아민 또는 트리에틸아민이 용해된 메탄올 및 에탄올, 물 등의 공용매를 10%의 부피비로 초임계 이산화탄소에 첨가하였을 때 기존의 유기 용매 추출보다 수율 면에서 1.5배 추출 선택성 면에서 4배 이상 증가함을 확인하였다.

Claims (6)

1. 식물 재료를 초임계 추출 장치에서 70∼90℃의 온도 및 4000∼6000 PSI 압력으로, 주용매인 이산화탄소 100 중량부에 대해 2∼18(v/v)%의 디에틸아민 또는 트리에틸아민이 용해된 메탄올, 에탄올, 물 또는 이들의 혼합용매에서 선택된 1종 이상의 알칼리성 공용매 1∼20 중량부를 혼합시켜 알칼로이드를 추출한 후, 크로마토그래피를 이용하여 분리, 여과, 정제시킴을 특징으로 하는 알칼로이드의 제조 방법
2. 제1항에 있어서, 알칼로이드의 초임계 추출 온도는 75∼85℃이고, 압력은 4700∼5300 PSI임을 특징으로 하는 알칼로이드의 제조 방법
3. 제1항에 있어서, 상기 식물은 미치광이풀이며 추출 제조된 알칼로이드는 히요시나민, 스코폴라민임을 특징으로 하는 알칼로이드의 제조 방법
4. 제1항에 있어서, 상기 식물은 마황이며 추출 제조된 알칼로이드는 메틸에페드린, 노어에페드린, 에페드린, 슈도에페드린 등임을 특징으로 하는 알칼로이드의제조 방법
5. 제1항에 있어서, 상기 식물은Cephalotaxus wilsoniana Hayta이며 추출 제조된 알칼로이드는 세팔로탁신임을 특징으로 하는 알칼로이드의 제조 방법
6. 제1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 알칼로이드인 히요시나민, 스코폴라민, 메틸에페드린, 노어에페드린, 에페드린, 슈도에페드린, 세팔로탁신