Neue Schmerzmittel, die Inhibitoren von TRP-Kanälen sind
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Targets für Schmerzmittel sowie Verfahren zum Auffinden von neuen Schmerzmitteln und deren Verwendung.
Nozizeptoren sind feine unmyelinisierte oder dünn myelinisierte Nervenfasern mit freien Nervenendigungen, die in fast allen Geweben zu finden sind, und deren Aufgabe die Detek- tion von potentiell gewebeschädigenden, noxische Einflüssen aus der Umwelt oder dem Körperinneren ist. Noxische Reize (z.B. mechanische Abscherung oder Hitze) an den re- zeptiven Feldern rufen Aktionspotentiale in Nozizeptoren hervor. Ebenso wirken viele Entzündungsmediatoren auf Nozizeptoren exzitatorisch (Kress & Reeh, 1996). Im entzündeten Gewebe reagieren Nozizeptoren häufig mit einer Zunahme der Empfindlichkeit für Hitzereize (Sensibilisierung), die charakterisiert ist durch eine gesteigerte Entladungsaktivität sowie durch eine Verschiebung der Reizschwelle in den nicht-noxischen Temperaturbereich (Kress & Reeh, 1996). Eine Schlüsselrolle bei der Nozizeptorsensibilisierung spielt die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration (Guenther et al. 1999; Kress & Guenther, 1999). Solche Veränderungen an nozizeptiven Neuronen werden durch endogene Entzündungsmediatoren wie Bradykinin oder Trypsin hervorgerufen, die an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren in der Nozizeptormembran binden (Koltzenburg et al. 1992). Sowohl für Brady- kinin als auch für Trypsin sind Anstiege der intrazellulären Kalziumkonzentration beschrieben worden, die durch die bisher bekannten Signalwege nicht erklärt werden können (Steinhoffet al. 2000; Jiang et al. 1998; Reiser & Hamprecht, 1985). Auch die funktioneile Grundlage für die exzitatorische Wirkung von Bradykinin ist bisher unbekannt. Wegen der geringen Größe der nozizeptiven Nervenendigungen (<1 μm) sind Untersuchungen zur Aufklärung dieser Signalwege an den Nozizeptoren in vivo oder im isolierten Gewebe in vitro nicht möglich. Als zelluläres Model des Nozizeptors werden daher Primärkulturen von dissoziierten Neuronen aus dem Spinalganglion verwendet, die modernen zellphysiologischen Untersuchungsmethoden gut zugänglich sind und die in vielen Aspekten funktioneil den Nozizeptoren in situ ähneln. Mit diesem Model ist es möglich, die Funktion von Memb- ranrezeptoren und Ionenkanälen im Detail zu untersuchen, die für die Entstehung von
Schmerzen wichtig sind. Ohne genauere Kenntnisse dieser Prozesse ist das gerichtete Auf-
finden von Wirkstoffen, die in diese Prozesse eingreifen und als Schmerzmittel verwendet werden könnten, nicht möglich.
In der Drosophilafliege sind Ionenanäle bekannt, die an der Entstehung des Sensorpotentials (transientes Rezeptorpotential) in der Retina beteiligt sind, und die deshalb als TRP-Kanäle bezeichnet werden (Hofmann et al. 2000; Harteneck et al. 2000). In nicht-erregbaren Zellen werden TRP-Kanäle durch ein unbekanntes Link bei Entleerung der intrzellulären Kalziumspeicher geöffnet, um die Speicher wieder zu füllen (zur Übersicht s. Harteneck et al. 2000). Außerdem führt die Aktivierung der Proteinkinase C durch Phorbolmyristatacetat oder O- leylacylglyerol zur Öffnung von einigen TRP -Kanälen (Hofmann et al. 1999). TRP-Kanäle können in Neuronen heteromerisieren und entwickeln dann neue Eigenschaften. Z.B. wird die Aktivierung dieses neuen Ionenkanals unabhängig von intrazellulären Kalziumspeicher (Strübing et al. 2001). Ein in der Retina nicht exprimierter Vertreter der TRP-Subfamilie OTRPC, der Vanilloidrezeptor VR-1, ist als multimodaler Kationenkanal bei der Transduk- tion von Hitzereizen und der Entstehung von protonenaktivierten Membranströmen für die Nozizeption von Bedeutung (Caterina et al. 1997; Tominaga et al. 1998; WO 00/32766). In der WO 00/04929 ist die Verwendung von antisense-Oligonukleotiden oder Inhibitoren vorgeschlagen worden, um die Expression von TRP -Protein bzw. deren Funktionalität zu reduzieren und so bestimmte entzündliche Prozesse, insbesondere Asthma, günstig zu be- einflussen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass TRP-Kanäle das funktioneile Korrelat für die durch Entzündungsmediatoren hervorgerufenen Kalziumantworten in sensorischen Neuronen sind. Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis der funkti- onellen Bedeutung von TRP-Kanälen in der Entstehung von Schmerz, insbesondere Entzündungsschmerz und /oder -hyperalgesie. Die Aktivierung von TRP-Kanälen stellt ein "common link" dar, über das möglicherweise alle G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die den Phospholipase C/Proteinkinase C Signalweg aktivieren, einen Kalziumeinstrom in Nozizeptoren induzieren können. Derartige Kalziumanstiege führen zur Sensibilisrerung von Nozizeptoren für Temperaturanstiege und damit zur Hitzehyperalgesie (Guenther et al 1999, Kress & Guenther 1999). Diesen Signalweg können damit solche Entzündungsmediatoren nutzen, um eine Nozizeptorerregung oder -sensibilisierung hervorzurufen. Somit stellen
TRP-Kanäle ein neues Target für potentiell analgetisch wirksame Substanzen dar. Solche Substanzen verhindern vor allem die Entstehung von Entzündungsschmerz und -hyperalge- sie. Da auch im Randbezirk von Tumoren häufig Entzündungsmediatoren in hohen Konzentration gefunden werden, stellen sie ein neues therapeutisches Prinzip bei Tumorschmer- zen und -hyperalgesie dar.
Die vorliegende Erfindung stellt somit eine neue Klasse von Schmerzmitteln bereit. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Inhibitoren für Ionenkanäle der TRP -Familie zur Behandlung von Schmerzzuständen, insbesondere von Schmerzzuständen, die durch entzündliche Prozesse hervorgerufen werden. Insbesondere können solche Inhibitoren bei Schmerzzuständen angewendet werden, die durch Nozizeptoren vermittelt werde. Der Schmerzzustand kann dabei durch einen noxischen Reiz oder einen Entzündungsmediator induziert werden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verhinderung oder Verringerung des Entstehens der Hyperalgesie, insbesondere der Hitzehyperalgesie, durch TRP-Inhibitoren.
Bevorzugt inhibiert der Inhibitor die Aktivität von TRP -Kanalproteinen der Subfamilie STRPC („Short" TRP, Einteilung siehe Harteneck et al., 2000). Insbesondere gehören zu dieser Familie die folgenden humanen Kanalproteine: TRP-1 (NCBI GenBank Accession No. NM 003304; Wes et al., 1995; Zhu et al., 1995; Zitt et al., 1996), TRP-IA (GenBank Accession No. Z 73903; Zitt et al., 1996); TRP-2, TRP-3 (GenBank Accession No. U 47050, Zhu et al., 1996); TRP-4 (GenBank Accession No. NM 016179; Zhu et al., 1996; Philipp et al., 2000; McCay et al, 2000), TRP-5 (GenBank Accession No. AF 054568; Sos- sey-Alaoui et al., 1999), TRP-6 (GenBank Accession No. NM 004621; D'Esposito et al., 1996), oder TRP-7 (WO 00/29571). Inhibitoren für diese Ionenkanäle hemmen den Kalziumeinstrom aus dem Extrazellulärraum in sensorische Neuronen, der durch verschiedene G- Protein-gekoppelte Rezeptorsysteme und auch durch direkte Aktivierung des Proteinkinase C Signalwegs durch Phorbolmyristatacetat oder Oleylacylglycerol aktiviert wird. Besonders bevorzugt sind dabei TRP-1, TRP-3, TRP-4, und TRP-6.
Dem Fachmann ist bekannt, wie er solche Inhibitoren auffinden kann. Entsprechende Methoden sind beispielsweise in der WO 98/08979 und der WO 00/04929 beschrieben. So
können geeignete Wirtszellen, beispielsweise COS-Zellen, mit Expressionsvektoren transfi- ziert werden, die für einen der genannten TRP-Kanäle kodieren, beispielsweise gleichzeitig mit einem Expressionsvektor, der für den muscarinen Rezeptor M5 kodiert. Die Funktion der Rezeptoren in den transfizierten Zellen kann dann über die Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration nach der FURA2 -Methode oder des Membranpotentials mit patch- clamp-Techniken in An- bzw. Abwesenheit von Testsubstanzen, die potentielle Inhibitoren sein könnten, bestimmt werden. Dabei kann, wenn die Zelle einen muscarinen Rezeptor exprimiert, beispielsweise Muscarin als Stimulus für den Kalziumeinstrom in die Zelle benutzt werden. Solche Untersuchungen können im Hochdurchsatz-Musterungs-Format (High Throughput Screening, HTS) an grossen Substanzbibliotheken ausgeführt werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung deshalb ein Verfahren zum Auffinden eines Wirkstoffes gegen Schmerz, dadurch gekennzeichnet, dass
(a) eine Zelle oder Zellinie bereitgestellt wird, die ein Ionenkanalprotein der TRP-Familie exprimiert;
(b) eine Testsubstanz in Kontakt mit der Zelle oder Zellinie gebracht wird;
(c) der durch einen Stimulus induzierte Kalziumeinstrom in die Zelle oder Zellinie in Anwesenheit der Testsubstanz gemessen wird; und
(d) der gemessene Wert mit einem Referenzwert ohne Testsubstanz verglichen und dadurch bestimmt wird, ob die Substanz ein Inhibitor für das Ionenkanalprotein ist.
Vorzugsweise wird in einem solchen Verfahren der Kalziumeinstrom durch die zeitabhängige Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration bestimmt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Inhibitors eines Ionenkanalproteins der TRP-Familie zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Schmerzzuständen, insbesondere Entzündungsschmerzen.
Formulierung, Dosierung und Anwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung richten sich dabei nach der chemischen Natur des Inhibitors, der Art der Erkrankung sowie dem Zustand des Patienten.
Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, wie er erfindungsgemässe Wirkstoffe für bestimmte Anwendungsweisen formulieren kann (Gennaro, Alfonso R. Remington's Pharma- ceutical Sciences. Easton Mack 1990. XVI). Dem Fachmann sind ebenfalls Verfahren be- kannt, wie er die optimale Dosierung eines Wirkstoffs für einen bestimmte Erkrankung bestimmen kann.
Die Verbindungen können oral, parenteral oder topisch verabreicht werden. Der gewünschte therapeutische Dosis ist von der Indikation und Darreichungsform abhängig und kann expe- rimentell bestimmt werden. Geeignete Anwendungsformen sind beispielsweise Tabletten, Kapseln, Zäpfchen, Lösungen, Säfte, Emulsionen, Aerosole oder dispersible Pulver. Entsprechende Tabletten können beispielsweise durch Mischen des oder der Wirkstoffe mit bekannten Hilfsstoffen, beispielsweise inerten Verdünnungsmitteln, wie Kalziumcarbonat, Kalziumphosphat oder Milchzucker, Sprengmitteln, wie Maisstärke oder Alginsäure, Bin- demitteln, wie Stärke oder Gelatine, Schmiermitteln, wie Magnesiumstearat oder Talk, und/oder Mitteln zur Erzielung des Depoteffektes, wie Carboxypolymethylen, Carboxy- methylcellulose, Celluloseacetatphthalat, oder Polyvinylacetat erhalten werden. Die Tabletten können auch aus mehreren Schichten bestehen.
Entsprechend können Dragees durch Überziehen von analog den Tabletten hergestellten Kernen mit üblicherweise in Drageehüllen verwendeten Mitteln, beispielsweise Kollidon oder Schellack, Gummi arabicum, Talk, Titandioxid oder Zucker, hergestellt werden. Zur Erzielung eines Depoteffektes oder zur Vermeidung von Inkompatibilitäten kann der Kern auch aus mehreren Schichten bestehen. Desgleichen kann auch die Drageehülle zur Erzie- lung eines Depoteffektes aus mehreren Schichten bestehen, wobei die oben bei den Tabletten erwähnten Hilfsstoffe verwendet werden können.
Säfte der erfindungsgemässen Wirkstoffe bzw. Wirkstoffkombinationen können zusätzlich noch ein Süssungsmittel, wie Saccharin, Cyclamat, Glycerin oder Zucker sowie ein ge- schmacksverbessemdes Mittel, z.B. Aromastoffe, wie Vanillin oder Orangenextrakt, enthalten. Sie können ausserdem Suspendierhilfsstoffe oder Dickungsmittel, wie Natriumcar-
boxymethylcellulose, Netzmittel, beispielweise Kondensationsprodukte von Fettalkoholen mit Ethylenoxid, oder Schutzstoffe, wie p-Hydroxybenzoate, enthalten.
Injektionslösungen werden in üblicher Weise, z.B. unter Zusatz von Konservierungsmitteln, wie p-Hydroxybenzoaten, oder Stabilisatoren, wie Alkalisalzen der Ethylendiamintetraes- sigsäure, hergestellt und in Injektionsflaschen oder Ampullen abgefüllt.
Die eine oder mehrere Wirkstoffe bzw. Wirkstoffkombinationen enthaltenden Kapseln können beispielsweise hergestellt werden, indem man die Wirkstoffe mit inerten Trägern, wie Milchzucker oder Sorbit, mischt und in Gelatinekapseln einkapselt.
Geeignete Zäpfchen lassen sich beispielsweise durch Vermischen mit dafür vorgesehenen Trägermitteln, wie Neutralfetten oder Polyethylenglykol bzw. dessen Derivaten herstellen.
Die Verbindungen können sowohl enteral als auch parenteral verabreicht werden. Als Dosis für die orale Anwendung werden 0,1 bis 500 mg Wirkstoff pro Dosis, für die i.v.- Anwendung von 0,05 bis 150 mg pro Dosis vorgeschlagen. Der gewünschte therapeutische Dosis ist von der Indikation und Darreichungsform abhängig und kann experimentell bestimmt werden.
Die Arzneimittel sind für orale oder parenterale, gegebenenfalls auch topische Verabreichung geeignet. Als Arzneimittelformen dien en vorwiegend Tabletten, Dragees, Ampullen und Saftzubereitungen. Die Einzeldosis zu diesen Arzneimittelformen beträgt zwischen 1,0 und 200 mg, vorzugsweise 20 und 50 mg pro 75 kg Körpergewicht. Je nach der Schwere des Falles sind täglich im allgemeinen 1 bis 3 Einzeldosen zu verabreichen.
Ein TRP-Inhibitor ist beispielsweise die Substanz (R,S)-(3,4-dihydro-6,7- dimethoxyisochinolin- 1 -yl)-2-cyclohexyl-N-(3 ,3 -diphenylpropyl)-acetamid- hydrochloride (BIIA 388 CL; Krishtal et al., 2001), die gemäss EP 0 957 092 hergestellt und formuliert werden kann. Diese Substanz wurde ursprünglich als Blocker bestimmter sogenannter „störe operated" Kationenkanäle in bestimmten elektrisch nicht erregbaren Zellen (RBL-Zellen) beschrieben, die nicht im Zentralnervensystem vorkommen.
Von der Entwicklung eines solchen Präparats würden alle Patienten profitieren, deren Erkrankung zur plastischen Veränderung von Nozizeptoren im peripheren Nervensystem führt und erst sekundär Lernprozesse des ZNS anschaltet, die die Chronifizerung der Schmerzen weiterführen. Vor allem bei Rheumatischen Erkrankungen, z.B. Chronischer Rheumatoider Polyarthritis, bedeutet die Entwicklung von potenten peripher wirksamen Analgetika einen großen Fortschritt. Aber auch Schmerzen als Folge anderer Erkrankungen mit entzündlicher Beteiligung können dadurch wesentlich gebessert werden, z.B. Migräne, entzündliche Arth- ritiden und Tumorschmerzen.
Literatur
D'Esposito M, Strazzullo M, Cuccurese M, Spalluto C, Rocchi M, D'Urso M and Ciccodi- cola A. Identification and assignment of the human transient receptor potential Channel 6 gene TRPC6 to chromosome 1 Iq21->q22. Cytogenet. Cell Genet. 83 (1-2), 46-47 (1998)
Dittert I, Vlachovä V, Knotkovä H, Vitaskova Z, Vyklicky L, Kress M, Reeh PW (1998) A technique for fast application of heated Solutions of different composition in culrured neu- rons. J Neurosci Meth 82:195-201.
Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY (1985) A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem 260:3440-3450.
Guenther S, Reeh PW, Kress M (1999) Rises in [Ca2+]; mediate capsaicin- and proton- induced heat sensitization ofrat primary nociceptive neurons. Eur J Neurosci 11:3143-3150.
Harteneck C, Plant TD, Schultz G (2000) From worm to man: three subfamilies of TRP Channels. Trends Neurosci 23:159-166.
Hof ann T, Obukhov AG, Schaefer M, Hartenek C, Gudermann T, Schultz G (1999) Direct activation of human TRPC6 und TRPC3 Channels by diacylglycerol. Nature 397:259-263.
Hofmann T, Schaefer M, Schultz G, Gudermann T (2000) Transient receptor potential Channels as molecular Substrates of receptor-mediated cation entry. J Mol Med 78:14-25.
Jiang T, Danilo P, Steinberg SF (1998) The thrombin receptor elevates intracellular calcium in adult rat ventricular myocytes. J Mol Cell Cardiol 30:2193-2199.
Koltzenburg M, Kress M, Reeh PW (1992) The Nociceptor Sensitization by Bradykinin Does Not Depend on Sympathetic Neurons. Neurosci 46:465-473.
Kress M, Guenther S (1999) The role of [Ca2+]j in the ATP-induced heat sensitization pro- cess of rat nociceptive neurons. J Neurophysiol 81:2612-2619.
Kress M, Reeh PW (1996) Chemical excitation and sensitization in nociceptors. In: Neuro- biology of Nociceptors (Cervero F, Belmonte C eds), pp 258-297. New York: Oxford Uni- versity Press Inc.
Kristhtal O, Kirichok Y, Tsintsadze T, Lozovaya N, Loesel W, Arndts (2001) New Channel blocker BIIA388CL blocks delayed rectifier, but not A-type potassium current in central neurons. Neuropharmacology 40: 233-241.
McKay RR, Szymeczek-Seay CL, Lievremont JP, Bird GS, Zitt C, Jungling E, Luckhoff A and Putney Jr JW. Cloning and expression of the human transient receptor potential 4 (TRP4) gene: localization and functional expression of human TRP4 and TRP3. Biochem. J. 351 Pt 3, 735-746 (2000)
Philipp S, Trost C, Warnat J, Rautmann J, Himmerkus N, Schroth G, Kretz O, Nastainczyk W, Cavalie A, Hoth M and Flockerzi V. TRP4 (CCE1) protein is part of native calcium re- lease-activated Ca2+-like Channels in adrenal cells. J. Biol. Chem. 275 (31), 23965-23972 (2000)
Reiser G, Hamprecht B (1985) Bradykinin causes a transient rise of intracellular Ca2+- activity in cultured neural cells. Pflüger's Archiv 405:260-264.
Sossey-Alaoui,K., Lyon .A., Jones,L., Abidi,F.E., Hartung,A.J., Haήe,B., Schwartz,C.E., Stevenson,R.E. and Srivastava,A.K. Molecular cloning and characterization of TRPC5 (HTRP5), the human homologue of a mouse brain receptor-activated capacitative Ca(2+) entry Channel. Genomics 60 (3), 330-340 (1999)
Stefanini M, DeMartino C, Zamboni L (1967) Fixation of ejaculated spermatozoa for e- lectron microscopy. Nature 216:173-174.
Steinhoff M, Vergnolle N, Young SH, Tognetto M, Amadesi S, Ennes HS, Trevisani M, Hollenberg MD, Wallace JL, Caughey GH, Mitchell SE, Williams LM, Geppetti P, Mayer EA, Bunnett NW (2000) Agonists of proteinase-activated receptor 2 induce inflammation by a neurogenic mechanism. Nat Med 6:151-158.
Strübing C, Krapivinsky G, Krapivinsky L, Clapham DE. (2001) Trpcl and trpc5 form a novel cation Channel in mammalian brain. Neuron. 29:645-55.
Tominaga M, Caterina MJ, Malmberg AB, Rosen TA, Gilbert H, Skinner K, Raumann B, Basbaum AI, Julius D (1998) The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain- producing Stimuli. Neuron 21:531-543.
Wes,P.D., Chevesich ., Jeromin,A., Rosenberg,C, Stetten,G. and Montell,C. TRPC1, a human homolog of a Drosophila store-operated Channel. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 92 (21), 9652-9656 (1995)
Zhu X, Chu PB, Peyton M and Birnbaumer L. Molecular cloning of a widely expressed human homologue for the Drosophila trp gene. FEBS Lett. 373 (3), 193-198 (1995)
Zhu X, Jiang M, Peyton M, Boulay G, Hurst R, Stefani E and Birnbaumer L. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell 85 (5), 661-671 (1996)
Zitt,C, Zobel,A., Obukhov,A.G., Harteneck,C, Kalkbrenner,F., Luckhoff,A. and Schultz,G. Cloning and functional expression of a human Ca2+-permeable cation Channel activated by calcium störe depletion. Neuron 16 (6), 1189-1196 (1996)
Beispiele
Methoden:
Neuronenprimärkultur
Die lumbalen Spinalganglien der Ratte wurden nach Entfernung der lumbalen Wirbelsäule und sagittaler Eröffnung des Wirbelkanals entfernt, gereinigt und mit Collagenase (0.28 U/ml in D-MEM, 75 min, Boehringer Mannheim) und Trypsin behandelt (25.000 U/ml in Phosphatpuffer, 12 min, Sigma, Diesenhofen). Nach dem Waschen der Ganglien in Dulbec- co's modified eagle medium (D-MEM, Gibco, Karlsruhe) erfolgte die mechanische Triturie- rung mittels einer partiell zugeschmolzenen Pasteurpipette. Die vereinzelten Spinalgang- lienneurone wurden mit Kulturmedium (s.u.) gewaschen, zentrifugiert und auf sterile Kul- turschälchen mit Glasboden und Poly-L-lysin-Beschichtung ausplattiert. Dem synthetischen Kulturmedium TNB 100 (mit Supplement, Biochrom, Berlin) wurden 100 ng/ml Nerven- Wachstumsfaktor (NGF 7S, Alomone, Israel), Penicillin/Streptomycin (je 20.0001.U./100 ml) und 2 mM L-Glutamin (beides von Gibco Life Technologies) zugesetzt. Die gewonnenen Primärkulturen waren nach 2 Stunden adhärent und wurden für maximal 36 Stunden unter sterilen Bedingungen bei 37 °C und wasserdampfgesättigter, 5%-iger CO -Atmosphäre inkubiert.
Kalziummikrofluorimetrie
Zur funktionellen Untersuchung wurden die Neurone nicht-disruptiv mit dem membrangängigen Kalziumindikatorfarbstoff FURA-2/ AM (3 μM, Molecular Probes, Leiden, Nieder- lande) beladen, und der Farbstoff für 30 min mit externer Lösung (ECS) ausgewaschen. Die ECS bestand aus (in mM) 145 NaCl, 2 CaCl
2, 1 MgCl
2, 10 HEPES und 10 Glucose, pH 7,4 mit NaOH eingestellt. Die Messung der intrazellulären Calciumkonzentration erfolgte ra-
tiometrisch. Dazu wurden Hintergrund-korrigierte Fluoreszenzbilder mittels eines Slow Scan CCD-Kamera-Systems mit einem - in ein Axiovert Mikroskop mit 40-fach Fluotar- Ölimmersions-Objektiv (Zeiss, Jena, Germany) eingekoppelten - schnellem Monochromator (PTI, New Jersey) wurde aufgenommen. Die Fluoreszenz wurde bei λ > 420 nm mit einer Frequenz von 1 Hz bei gleicher Anregungsdauer je Wellenlänge (340 und 380 nm je 200 ms) aufgenommen. Die intrazelluläre Kalziumkonzentration [Ca ]j wurde berechnet (Grynkiewicz et al. 1985) und als Kalibrationskonstanten in vitro wurden bestimmt:
8.0 and K
eff= 1.2 μM.
Zur Stimulation der Neurone wurde ein 7-Kanal-Applikationssystem mit Magnetventilen verwendet, das einen schnellen Lösungswechsel an der Zelle (τ = 100 ms) erlaubte (Dittert et al. 1998). Alle Substanzen zur Stimulation der Neurone wurden in ECS gelöst und mittels Schwerkraft appliziert. Zur Stimulation wurden benutzt: 10 μM Bradykinin, 1 μM Musca- rin, 1 μM Phorbol-Myristat-Acetat, bzw. 1 μM Trypsin. Eine Reihe von Ableitungen wur- den in Kalziumfreier ECS durchgeführt, in der CaCl2 durch 10 mM EGTA ersetzt wurde. Alle Salze und Chemikalien außer den gesondert genannten wurden von Sigma, Deisenho- fen bezogen. Die Substanzen BIIA388CL und BIIA908MS wurden uns von der Firma Boehringer Ingelheim überlassen.
Fixierungsmethoden und Immunzytochemie:
Der immunhistochemische Nachweis der Kanalproteine erfolgte durch indirekte Immun- histochemie an Kryostatschnitten oder kultivierten Neuronen mittels Fluoreszenzmarkierung. Zur Gewinnung von Ganglienschnitten wurden fünf junge erwachsene Wistar Ratten durch eine Überdosis Chloroform getötet und die Ganglien entnommen. Anschliessend wurde die Ganglien in flüssigem Stickstoff schockgefroren und an einem Kryostaten (Jung Frigocut 1900 E, Leica, Bensheim) Schnitte einer Dicke von 10 μm angefertigt. Die Schnitte und die auf Glasobjektträgern kultivierten Neurone wurden je nach verwendetem Material entweder 15 min mit Zambonifixativ (Stefanini et al. 1967), oder 10 min mit Ace- ton (-20°C) fixiert.
Nach dem Auswaschen des Fixativs mit 0.1 M Phosphatpuffer folgte die Blockung unspezifischer Bindungsstellen (PBS-Puffer, 10 % normales Schweineserum, 0.1 % bovines Serumalbumin und 0.5 % Tween 20) . Die Schnitte/Zellen wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit Antiseren gegen TRP-Kanäle (TRP-1, TRP-3,TRP-6, Alomone Lab., TelAviv, Israel; TRP-4 Prof. Flockerzi, Universität des Saarlandes) und biotinyliertem Isolectin B4 (IB4, Sigma) bzw. Antiseren gegen den Vanilloirezeptor 1 (VR1 , Neuromics) inkubiert (TRP/IB4, TRP/VR1). Nach Waschen in PBS erfolgte die Inkubation mit den sekundären Reagentien. Die TRP -Antiseren wurden mit Fluoresceinisothiocyanat (FΙTC)-konjugiertem anti-Kaninchen IgG aus der Ziege, das biotinylierte Isolectin B4 mit Cy-3 konjugiertem Streptavidin, und das VR1 -Antiserum mit Cy-3 konjugiertem anti-Meerschweinchen IgG inkubiert. Nach weiterem Waschen in PBS erfolgte die Einbettung von Schnitten und Zellen in gepuffertem Glycerol pH 8,6. Die indirekte Immunfluoreszenz wurde an einem Epifluo- reszenzmikroskop (Olympus BX 60F, Hamburg) unter Verwendung geeigneter Filter (Cy3, Anregungsfilter 525-560 nm, Sperrfilter 570-650 nm und FITC Anregungsfilter 460-490 nm, Sperrfilter 515-550 nm) ausgewertet. Vier Schnitte pro Tier mit einem Mindestabstand von 50 μm bzw. 3 Glasträger mit Zellkulturen wurden für jeden TRP -Kanal von zwei unabhängigen Untersuchern beurteilt.
Kontrollschnitte, die mit einem präabsorbierten Antiserum (20-100 μg Antigen ml ver- dünntes Antiserum) inkubiert wurden zeigten keine Immunreaktion. Zur computergestützten Bildanalyse wurden für jeden TRP-Subtyp mindestens zwei Schnitte aus einem Ganglion (Mindestabstand 50 μm) verwendet (Scionlmage, Scion, Las Vegas, NV). Es wurden nur Zellen mit deutlich sichtbarem Zellkern aufgenommen und zur Messung verwendet.
Nachweis der mRNA-Expression mit der RT-PCR:
Der Nachweis von TRPs auf mRNA-Ebene erfolgte mittels der RT-PCR. Dafür wurden die lumbalen Spinalganglien und das Gehirn (Positivkontrolle) aus 5 Ratten isoliert, in RNazol (W AK-Chemie, Bad-Homburg, Germany) schnellgefroren und mit dem Ultratürrax homo- genisiert. Die Gesamt-RNA wurde mit der RNazol-Reagenz Technik nach dem Protokoll des Herstellers präpariert.
Mögliche Kontamination durch DNA wurde mit DNase (1 U/μg total RNA, Gibco-BRL, Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Germany) in 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 2 mM MgCl2, 50 mM KC1 für 15 min at 25 °C entfernt. Gleiche Mengen von RNA wurden revers transkribiert. Ansatz: 3 mM MgCl2, 75 mM KC1, 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 10 mM Dithiothreitol, 0.5 mM dNTPs (Gibco-BRL) und 25 μg oligo(dT) (MWG Biotech, Ebersberg, Germany) mit 200 U Superscript RNase H" Reverse-Transcriptase (Gibco-BRL) für 50 min bei 42 °C. Für die PCR Reaktion wurden 4 μl Puffer II, 4 μl MgCl2, 1 μl dNTP (je 10 mM), 0.4 μl (2 U) AmpliTaq Gold Polymerase (alle von Perkin Eimer) und 1 μl von jedem Primer (20 μM) gemischt
Tabelle 1 : Verwendete Primer
Für die PCR wurde 10 min bei 95 °C, 30 Zyklen von 45 s bei 94 °C, 60 s bei 58 °C und 45 s bei 73 °C und im Anschluß für 7 min bei 73 °C inkubiert. Als Kontrollen wurden Ansätze ohne vorausgehende RT-Reaktion verwendet und das jeweilige Template durch Wasser ersetzt. Unter diesen Bedingungen wurde keine Amplifizierung nachgewiesen.
Ergebnisse:
Die Stimulation mit Bradykinin, Prostaglandin E2, Muscarin oder Trypsin verursachten in kultivierten DRG-Neuronen einen Kalziumanstieg von etwa 100 bis 300 nM. Die 4 Substanzen zeigten eine unterschiedliche Tachyphylaxie: der durch Bradykinin verursachte Kalziumanstieg zeigte in Kontrolllösungen eine deutliche Tachyphylaxie , während die Neurone auf wiederholte Gabe alle anderen Mediatoren mit etwa gleich großen Kalziumanstiegen antworteten. Als Ursache der Tachyphylaxie wird eine Inaktivierung durch Interna- lisierung von Bradykininrezeptoren vermutet. Da für jede der Substanzen Membranrezeptoren bekannt sind, die durch Aktivierung von Phospholipase C (PLC) und die Entstehung von Inositoltriphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) Kalzium aus intrazellulären Speichern freisetzen, wurde in einigen Experimenten kalziumfreie ECS verwendet. Unter diesen Bedingungen rief keine der Substanzen einen signifikanten Kalziumanstieg hervor, die Anstiege scheinen daher durch einen Kalziumeinstrom von außen in die Zelle verursacht zu werden. Der Kalziumeinstrom kann einerseits durch die Aktivierung spannungsabhängiger Kalziumkanäle, andererseits durch Liganden-gesteuerte Kationenkanäle erfolgen. Daher wurden in einigen Muskarin-Experimenten die spannungsabhängigen Kalziumkanäle durch Zugabe von 200 μM Cd /Co blockiert. Unter dieser Bedingung waren die durch Muskarin verursachten Antworten nur wenig vermindert, was auf eine Aktivierung von Liganden- gesteuerten Kationenkanälen schliessen lässt.
Da für IP außer der Kalzium-Freisetzung aus intrazellulären Speichern keine weitere Wirkung bekannt ist, haben wir den zweiten Second messenger in diesem System genauer untersucht. DAG aktiviert das Enzym Proteinkinase C (PKC) und scheint direkt Kationenkanäle zu öffnen (Hofmann et al. 1999). Deshalb wurden die Zellen durch extrazelluläre Zu- gäbe von Phorbol-Myristat-Acetat (PMA), einem membrangängigen Aktivators der PKC, stimuliert. PMA sowie Oleyl-Acylglycerol (OAG), ein membrangängiges DAG-Analogon riefen einen Kalziumeinstrom an DRG-Neuronen hervor, der in Kalziumfreier ECS ausblieb. Dies läßt auf die Aktivierung eines - durch DAG und/oder PKC aktivierten - Kationenkanal schließen.
Die Entleerung der intrazellulären Kalziumspeicher durch Vorbehandlung mit Thapsigargin (1 μM) beeinflusste die durch PMA hervorgerufene Antwort nicht. Demnach ist die Akti-
vierung des durch PMA aktivierten Kalziumeinstroms nicht von der Entleerung intrazellulärer Speicher abhängig. Der am Kalziumeinstrom beteiligte Kationenkanal wird möglicherweise direkt über die PKC abhängige Phosphorylierung eines Kanalproteins aktiviert. Von Schultz und Mitarbeitern wurde ein solcher Aktivierungsmechanismus für einige Mitglieder der TRP-Kanalfamilie beschrieben (Hofmann et al. 1999). Für die meisten der bekannten TRP-Kanäle sind die molekularen Aktivierungsmechanismen bisher nicht aufgeklärt. Auch OAG/DAG können die PKC aktivieren, so daß die Phosphorylierung des Kanalproteins durch das Enzym als Aktivierungsmechanismus nicht ausgeschlossen ist. Deshalb wurden einige Neurone mit PMA in Anwesenheit des PKC-Inhibitors Staurosporin (0.25 μM) sti- muliert. Unter diesen Bedingungen blieb die Antwort auf PMA-Stimulation aus. Dies läßt auf die Beteiligung der PKC an der Kanalaktivierung schließen.
Im Gegensatz zu diesen Befunden war die Antwort auf Muskarin nach Vorbehandlung mit Thapsigargin deutlich reduziert. Möglicherweise ist dieser Unterschied auf die Expression und differentielle Aktivierung mehrerer TRP-Kanal-Subtypen in sensorischen Neuronen zurückzuführen.
Um die Beteiligung von TRP-Kanälen an dem o.g. Kalziumeinstrom weiter untersuchen zu können, wurde die Substanz BIIA388CL verwendet, die als Inhibitor von TRP-Kanälen wirkt. BIIA388CL (1 μM) verursachte in einigen Fällen bei der ersten Applikation selbst einen Kalziumanstieg. Gleichzeitig verhinderte die Substanz aber die PMA- bzw. die OAG- Antwort vollständig. Ebenso wirksam war der kommerziell erhältliche TRP-Inhibitor SKF 96365 (l-(beta-[3 -(4-Methoxyphenyl)propoxy] -4-methoxyphenethyl)- 1 H-imidazol- Hydrochlorid, CAS 130495-35-1, Merritt, J.E., et al., Biochem. J., 271, 515 (1990); 1 μM, Sigma, Deisenhofen). Auch die Antworten auf Trypsin wurden durch SKF 96365 oder durch BIIA388CL inhibiert.
Diese Befunde, die bereits stark für eine Beteiligung von TRP-Kanälen and der exzitatori- schen und sensibilisierenden Wirkung einiger schmerzrelevanter Mediatoren sprechen, wur- den auf mRNA-Ebene weiter erhärtet. Nach Isolierung und Amplifizierung der mRNA/cDNA aus Spinalganglien, wurde die Identität mehrerer TRP-Kanäle durch Sequenzierung der amplifizierten Produkte bestätigt. In Spinalganglien (DRG) wurde mRNA für
TRP-1 (7/7 DRGs), TRP-3 (7/7 DRGs), TRP-4 (7/7 DRGs) und TRP-6 (6/7 DRGs) nachgewiesen. mRNA für TRP-2, TRP-5 und TRP-7 wurden nur in Einzelfällen gefunden (s. Tabelle 2).
Tabelle 2:
Auf Proteinebene wurden diese Ergebnisse weiter untermauert. Mittels Immunhistochemie konnte TRP- 1 -Immunreaktivität (IR) in den Perikaryen großer Neuronen (Aß- Faserneurone), TRP-3-IR in VRl- und EB4-positiven (C, Ad-Faser-) Neuronen sowohl in vitro unter Kulturbedingungen als auch in situ in Schnitten von Spinalganglien nachgewiesen werden. Die Lokalisation des TRP -4 und TRP-6 Kanalproteins in Spinalganglien ist Gegenstand derzeitiger Untersuchungen.
Pharmazeutische Anwendungsbeispiele
a) Dragees
1 Drageekern enthält: Wirkstoff gemäss Erfindung 30,0 mg Milchzucker 100,0 mg Maisstärke 75,0 mg Gelatine 3,0 mg Magnesiumstearat 2,0 mg 210,0 mg
Herstellung:
Die Mischung der Wirksubstanz mit Milchzucker und Maisstärke wird mit einer 10%-igen wässerigen Gelatinelösung durch ein Sieb mit 1 mm Maschenweite granuliert, bei 40 DEG C getrocknet und nochmals durch ein Sieb gerieben. Das so erhaltene Granulat wird mit Magnesiumstearat gemischt und veφresst. Die so erhaltenen Kerne werden in üblicher Weise mit einer Hülle überzogen, die mit Hilfe einer wässerigen Suspension von Zucker, Titandioxyd, Talkum und Gummi arabicum aufgebracht wird. Die fertigen Dragees werden mit Bienenwachs poliert.
b) Tabletten
Wirkstoff gemäss Erfindung 30,0 mg Milchzucker 100,0 mg Maisstärke 70,0 mg löslich Stärke 7,0 mg Magnesiumstearat 3,0 mg 210,0 mg
Herstellung Wirkstoff und Magnesiumstearat werden mit einer wässerigen Lösung der löslichen Stärke granuliert, das Granulat getrocknet und innig mit Milchzucker und Maisstärke vermischt. Das Gemisch wird sodann zu Tabletten von 210 mg Gewicht veφresst.
c) Kapseln Wirkstoff gemäss Erfindung 20,0 mg Milchzucker 230,0 mg Maisstärke 40,0 mg Talk 10,0 mg 300,0 mg
Herstellung
Wirkstoff, Milchzucker und Maisstärke werden zunächst in einem Mischer und dann in ei-
ner Zerkleinerungsmaschine vermengt. Das Gemisch wird nochmals in den Mischer gegeben, gründlich mit dem Talk vermengt und maschinell in Hartgelatinekapseln abgefüllt.
d) Tabletten Wirkstoff gemäss Erfindung 40,0 mg
Milchzucker 100,0 mg
Maisstärke 50,0 mg kolloidale Kieselsäure 2,0 mg
Magnesiumstearat 3,0 mg insgesamt 200,0 mg
Herstellung:
Der Wirkstoff wird mit einem Teil der Hilfsstoffe gemischt und mit einer Lösung der löslichen Stärke in Wasser granuliert. Nach dem Trocknen des Granulats wird der Rest der Hilfsstoffe zugemischt und die Mischung zu Tabletten veφresst.
e) Dragees
Wirkstoff gemäss Erfindung 20,0 mg Milchzucker 100,0 mg Maisstärke 65,0 mg kolloidale Kieselsäure 2,0 mg lösliche Stärke 5,0 mg Magnesiumstearat 3.0 mg insgesamt 195,0 mg
Herstellung:
Der Wirkstoff und die Hilfsstoffe werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, zu Tablettenkernen veφresst, die mit Zucker, Talcum und Gummi arabicum in üblicher Weise dragiert werden.
f) Suppositorien
Wirkstoff gemäss Erfindung 50,0 mg Milchzucker 250,0 mg
Suppositorienmasse q.s. ad 1,7 g
Herstellung:
Der Wirkstoff und der Milchzucker werden miteinander vermischt und die Mischung in der geschmolzenen Suppositorienmasse gleichmässig suspendiert. Die Suspensionen werden in gekühlte Formen zu Suppositorien von 1,7 g Gewicht ausgegossen.
g) Ampullen
Wirkstoff gemäss Erfindung 20,0 mg Natriumchlorid 5,0 mg
Bi-destilliertes Wasser q.s. ad 2,0 ml
Herstellung:
Der Wirkstoff und das Natriumchlorid werden in bi-destilliertem Wasser gelöst und die Lö- sung in Ampullen steril abgefüllt.
h) Ampullen
Wirkstoff gemäss Erfindung 10,0 mg Natriumchlorid 7,0 mg Bi-destilliertes Wasser q.s. ad 1,0 mg
i) Tropfen
Wirkstoff gemäss Erfindung 0,70 g p-Hydroxybenzoesäuremethylester 0,07 g p-Hydroxybenzoesäurepropylester 0,03 g Entmineralisiertes Wasser q.s. ad 100,00 ml
Herstellung:
Der Wirkstoff und die Konservierungsmittel werden in entmineralsiertem Wasser gelöst, die Lösung filtriert und in Flaschen zu je 100 ml abgefüllt.