DE60133563T2

DE60133563T2 - Verwendung des proteins grf-1 zur auswahl von molekülen

Info

Publication number: DE60133563T2
Application number: DE60133563T
Authority: DE
Inventors: Jean-Michel Itier; Marie-Christine Multon; Gwenaëlle RET; Jean-Marie Stutzmann; Florence Wahl
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 2000-08-10
Filing date: 2001-08-07
Publication date: 2009-04-30
Anticipated expiration: 2021-08-08
Also published as: CA2418655C; ATE391915T1; WO2002012901A2; DE60133563D1; US20120009604A1; AU8411201A; CA2418655A1; EP1314040B1; JP4868692B2; AU2001284112B2; ES2304393T3; DK1314040T3; FR2812945A1; FR2812945B1; US8852878B2; EP1314040A2; WO2002012901A3; JP2004537961A; US20050100972A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biologie und der Zellsignalgebung in Neuronen. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung neue Verwendungen des gesamten oder eines Teils des Proteins GRF1 (Guanin Nucleotide Releasing Factor 1) zum Durchmustern von Molekülen, die eine schützende Aktivität gegen das Absterben von Neuronen aufweisen, und zur Behandlung von Fettleibigkeit. Das Protein GRF1, das in der 1A schematisch dargestellt ist, wurde beim Menschen ursprünglich aufgrund seiner Fähigkeit entdeckt, den Aktivierungszustand des Proteins p21Ras zu modulieren. Die Sequenzen der GRF1-Proteine von Mensch, Maus und Ratte sind die Sequenzen SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 bzw. SEQ ID Nr. 3. Die Anmeldung WO 93/21314 und das Patent US 5,656,595 beschreiben die Identifizierung, Isolierung sowie die Charakterisierung der humanen Form dieses Proteins.
WO0040718 beschreibt Mutanten an den Positionen 1184 und 1124 des Proteins GNRF aus Maus. Dieser Anmeldung zufolge könnten diese Proteine oder die Nukleinsäuren, die sie codieren, zu therapeutischen Zwecken, insbesondere zur Behandlung von Tumoren, verwendet werden.
GRF1 besitzt mehrere funktionelle Domänen, die so genannten PH-, IQ-, DH- und CDC25-Domänen, deren Bedeutung und Beteiligung im folgenden näher ausgeführt werden.
Die Lokalisierung der funktionellen Domänen von GRF1 in den Proteinsequenzen von Mensch, Maus und Ratte ist in der nachstehenden Tabelle angegeben.
GRF1 weist eine DH-(Dbl-Homologie-)Domäne auf, die eine starke Sequenzhomologie mit einer Region des Protoonkogens Dbl besitzt. Dbl ist ein Austauschfaktor für kleine G-Proteine der Rho-/Rac/Cdc42Hs-Familie, die an der Regulation verschiedener zellulärer Signale beteiligt sind, die entweder die Beweglichkeit des Cytoskeletts oder die Aktivierung so genannter "Stress"-Kinasen steuern (1).
Im Protein Dbl liegt die Aktivität für den Austausch von GDP/GTP an Proteinen der Rho-Familie in der DH-Domäne. Diese findet man auch in anderen Austauschfaktoren für G-Proteine mit niedrigem Molekulargewicht, darunter die GRF-Proteine und die SOS-Proteine. Es wurden Ergebnisse veröffentlicht, die nahelegen, dass die DH-Domäne von GRF1 an Rac funktionell ist (Aktivierung von Rac in der GTP-Form) und zur Aktivierung von JNK1 in Zellen in Kultur führt, welche die beta-/gamma-Untereinheit heterotrimerer G-Proteine überexprimieren (2). Außerdem wurde die funktionelle Rolle der DH-Domäne von GRF1 bei neuronalen Vorgängen auch durch die Ergebnisse von gerichteten Mutageneseexperimenten nahegelegt, die zeigen, dass die Aktivierung des Proteins GRF1 durch Calcium eine intakte DH-Domäne erfordert (3, 4).
Calcium spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation neuronaler Aktivitäten: Sekretion von Neuromediatoren, Neuronenwachstum, Absterben/Überleben von Zellen, Anpassung und Stimulation der synaptischen Übertragung, transkriptionelle Aktivierung bestimmter Gene. Studien, die an Primärkulturen von Cortex-Neuronen neugeborener Ratten durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass die Aktivierung von Ras durch GRF1 in Anwesenheit von Calcium erhöht wird. Diese Aktivierung wird durch Bindung von Calmodulin an die IQ-Domäne von GRF1 reguliert (3–5).
Die Austauschaktivität von GRF1 für die Ras-Proteine (Ha, Ki und N-Ras) liegt ihrerseits in der Region, die zu CDC25 von Saccharomyces cerevisiae homolog ist und sich am Carboxyterminus des Moleküls befindet (6).
GRF1 besitzt zwei PH-(Pleckstrin-Homologie-)Domänen, bei denen es sich um die Interaktionsdomänen zwischen Proteinen handelt und die vermutlich an der Bindung an die beta-gamma-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine beteiligt sind (7–9).
Heutzutage kennt man die Funktionen des Proteins GRF1, das erstmals aufgrund seiner Austauschaktivität an dem Protoonkogen Ras entdeckt wurde, in mehr Einzelheiten. Im Gegensatz zu den Proteinen SOS1, SOS2 und GRF2, drei anderen Austauschfaktoren für Ras, die ubiquitär exprimiert werden, ist jetzt bekannt, dass die Expression des Gens grf1 beim Menschen, bei der Maus und bei der Ratte auf das Zentralnervensystem beschränkt ist (6, 10, 11).
Die Regionalisierung dieser Expression im Gehirn ist eingehend untersucht worden. Bei der Ratte ist sie im Hippocampus, im Neocortex, einigen tiefen Zentren und in den Körnerzellen des anterioren Lobus des Kleinhirns beträchtlich (12). Bei der Maus wurde auch beschrieben, dass sie in der Amygdala (13) und im Hypothalamus (14) reichlich ist.
Unter den verschiedenen, im Zentralnervensystem vorliegenden Zelltypen scheint Expression des Gens grf1 auf die Neuronen beschränkt zu sein (15). Dieses Gen unterliegt einer strengen zeitlichen transkriptionellen Steuerung, da es nicht während der Embryonalperiode exprimiert wird und seine Transkription erst zum Zeitpunkt der Geburt beginnt, wobei sie einen maximalen Spiegel um den fünfzehnten Tag herum erreicht (14, 15).
Die Expression von grf1 wird durch einen speziellen Transkriptionsmechanismus gesteuert, der als parentale Prägung bezeichnet wird, was sich bei Mäusen durch eine Expression des Gens von dem väterlichen Allel äußert, während das mütterliche Allel abgeschaltet ist (14, 16). Es soll hervorgehoben werden, dass bestimmte Gene (Protoonkogene), die normalerweise einer parentalen Prägung unterliegen, an der Zellproliferation und am Auftreten von Tumoren beteiligt sind, wenn es zu einem Verlust des Prägungsmechanismus kommt und beide Allele transkribiert werden.
Während der Weg für die Ras-Aktivierung durch die SOS-Austauschfaktoren gut dokumentiert ist, weiß man anscheinend sehr wenig über die Signalisierungswege, die GRF1 verwenden, und über seine biologische Funktion in vivo.
Im Gegensatz zu anderen Austauschfaktoren für Ras aus der SOS-Familie scheint GRF1 keine Signale zu übermitteln, die durch die Bindung von Liganden an Rezeptoren mit Tyrosinkinase-Aktivität entstehen, sondern eher solche, die von Rezeptoren mit sieben Transmembrandomänen stammen, die mit heterotrimeren G Proteinen gekoppelt sind (17–19).
Schließlich wird darauf hingewiesen, dass bestimmte biologische Funktionen von GRF1 in vivo untersucht werden konnten, indem der Phänotyp von Mäusen untersucht wurde, die eine inaktivierende Mutation des grf1-Gens tragen – durch homologe Rekombination erhaltene Knockout- oder KO-Mäuse – und die kein GRF1 mehr exprimieren (13, 14). Diese Tiere sind wenig leistungsfähig oder sogar mangelhaft bei Tests von Lernen und Gedächtnis, die "aversive" Stimuli einsetzen. Den Autoren dieser Arbeit zufolge ist die Integrität der Region des Gehirns, die als Amygdala bezeichnet wird, bei den mutierten Mäusen verändert und für den beobachteten Phänotyp verantwortlich (13). Trotzdem wird kein Hinweis auf eine mögliche Verwendung dieser Mäuse zum Durchmustern von Molekülen gegeben, die eine therapeutische Aktivität aufweisen.
Physikalische Schädigungen des Gehirns, wie Hirnischämie oder Hirntrauma (akute Schädigungen oder Schädigungen durch Unfall), und neurodegenerative Krankheiten, wie Morbus Alzheimer und Morbus Parkinson, gehören weiterhin zu den hauptsächlichen Ursachen von Mortalität und Morbidität in den Industrieländern.
Es ist gezeigt worden, dass Apoptose einen der Mechanismen darstellt, die zu diesen Schädigungen führen.
Eine beträchtliche Anzahl an Molekülen, die auf verschiedene physiopathologische Ereignisse einwirken, die durch Schädigungen des Zentralnervensystem verursacht werden, sind erfolgreich bei der experimentellen Forschung in verschiedenen Modellen und Spezies untersucht worden. Während einige von ihnen in klinischen Tests auf diese Störungen verwendet wurden oder werden, hat keines der getesteten Moleküle bei Phase-III-Studien oder bei ihrer Markteinführung eine echte Wirksamkeit gezeigt.
Die einzige Medikation, die derzeit zur Behandlung von Hirnischämie verwendet wird, besteht aus einer Injektion von Thrombolytika nur bei Patienten, die keine Hämorrhagie-Risiken aufweisen.
Die Anmelderin hat durch Untersuchung von Mäusen, die eine inaktivierende Mutation des Gens grf1 tragen, gezeigt, dass die Abwesenheit der Expression des Proteins GRF1 einen Schutz gegen physikalische Schädigung des Gehirns während einer Hirnischämie verleiht.
Außerdem hat sich die Fettleibigkeit über mehrere Jahrzehnte zu einem hauptsächlichen Problem der öffentlichen Gesundheit in den industrialisierten Ländern entwickelt, in denen sie inzwischen 20 bis 30% der Population betrifft. Diese Zahlen werden in den kommenden Jahren noch besorgniserregend ansteigen. Aufgrund ihrer multifaktoriellen Ursachen, die ihren Ursprung in mehr oder weniger erheblichem Ausmaß einerseits in Umweltfaktoren (Ernährungsverhalten, Verfügbarkeit von Nahrung, Energieverbrauch ...) und andererseits in mehreren genetischen Ursachen finden, stellt Fettleibigkeit eine wahre Herausforderung für die Medizin dar.
Die Physiopathologie von Krankheiten, die mit dem Gewicht zusammenhängen, ist komplex und heterogen. Fettleibigkeit geht häufig mit einem erhöhten Risiko von Tod, kardiovaskulären Krankheiten, nicht-insulinabhängigem Diabetes und Insulinresistenz einher. Psychologische und Verhaltensstörungen, wie Angst und Depression, werden ebenfalls zu dem klinischen Bild der Krankheit gezählt. Außerdem und phänotypisch entgegengesetzt dazu geht übermäßiger Gewichtsverlust in besonderen Umwelt-(Unterernährung) oder pathologischen Zusammenhängen (zum Beispiel mentale Anorexie) mit einer beträchtlichen Morbidität und Mortalität einher. Aus diesen verschiedenen Gründen ist die Identifizierung eines Gens, das eine Rolle bei der Gewichtszunahme spielt, von erheblichem Wert, wenn man sich für die Behandlung von Fettleibigkeit oder von übermäßigem Gewichtsverlust interessiert.
Die Anmelderin hat durch Untersuchung von Mäusen, die eine inaktivierende Mutation des Gens grf1 tragen, gezeigt, dass die Expression des Proteins GRF1 für die Regulation der Expression von Leptin unerlässlich ist. Leptin ist ein Cytokin, das mit einem Sättigungsgefühl einhergeht und eine größere Rolle bei der Steuerung der Gewichtszunahme spielt (20).
Wie gerade zusammengefasst, existiert im wissenschaftlichen Kontext immer noch ein Bedarf an einem besseren Verständnis verschiedener beteiligter Mechanismen, die insbesondere zu Störungen führen können, an denen eine Apoptose von Nervenzellen beteiligt ist oder die mit dem Leptin-Stoffwechsel zusammenhängen.
Es besteht außerdem ein Bedarf an Medikamenten, die bei der Behandlung von Störungen des Zentralnervensystems und bei der Behandlung von Fettleibigkeit wirksam sind.
Die Anmelderin hat sich mit der Forschung nach Verbindungen zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Störungen befasst, die insbesondere das Zentralnervensystem und Fettleibigkeit betreffen.
Sie hat mithilfe von Mäusen, die eine inaktivierende Mutation des Gens grf1 tragen, als Studienmodell gezeigt, dass GRF1 an diesen Störungen beteiligt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft folglich die Verwendung eines Proteins mit mindestens 85% Identität zu einem GRF1 oder von Zellen, die ein Protein mit mindestens 85% Identität zu einem GRF1 exprimieren, in Verfahren zum Nachweisen von Verbindungen für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Pathologien oder Störungen des Zentralnervensystems, die mit dem Absterben von Neuronen einhergehen, wie Apoptose.
Außerdem betrifft sie Verbindungen für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Pathologien oder Störungen des Zentralnervensystems, die mit dem Absterben von Neuronen einhergehen oder mit Fettleibigkeit assoziiert sind.
Das Protein GRF1 ist vorzugsweise menschlichen Ursprungs. Es kann jedoch auch jeden anderen Ursprungs sein und insbesondere das Protein GRF1 aus Maus oder jedem anderen Säugetier sein. Es kann auch jedes Protein sein, das eine Identität von mindestens 85% und vorzugsweise 90% zu einem GRF1-Protein und insbesondere zu dem menschlichen GRF1-Protein, welches die Sequenz SEQ ID Nr. 1 hat, oder zu einem GRF1-Protein tierischen Ursprungs, wie denjenigen, welche die Sequenzen SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 haben, aufweist. Unter Teil des Proteins GRF1 wird eine Aminosäuresequenz verstanden, die einen funktionellen Teil des Proteins GRF1 umfasst, und insbesondere die Sequenzen, die dem ganzen oder einem Teil einer der PH-, DH- oder CDC25-Domänen von GRF1-Proteinen entsprechen.
Einer der Vorteile der Durchmusterungsverfahren, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, liegt insbesondere in der Position von GRF1 stromaufwärts der JNKs (1B), was den Vorteil hat, dass man die Aktivierungswege der JNKs, die möglicherweise über GRF1 verlaufen, spezifisch regulieren kann.
Ein anderer Vorteil liegt in dem Nachweis des Fehlens von Toxizität dieser Verbindungen, da Mäuse, bei denen grf1 inaktiviert worden ist, lebensfähig und bei guter Gesundheit sind.
Das erfindungsgemäße Durchmusterungsverfahren, welches das gesamte oder einen Teil des Proteins GRF1 verwendet, kann die folgenden Messungsschritte umfassen:

– die Phosphorylierung des Proteins GRF1; oder
– direkt oder indirekt die Aktivität des Austausches des Proteins GRF1 entweder mit Proteinen der Ras-Familie (Ha, K, N-Ras) oder den Proteinen Rac und Cdc42, oder
– die Interaktion zwischen dem Protein GRF1 und entweder den beta-gamma-Untereinheiten von heterotrimeren G-Proteinen oder kleinen G-Proteinen der Ras-Familie, nämlich Rac und Cdc42;
– die Zelltransformation durch GRF1.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer ersten vorteilhaften Ausführungsform ein Verfahren zum Durchmustern oder Nachweisen von Verbindungen für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Pathologien des Zentralnervensystems, die mit dem Absterben von Nervenzellen einhergehen, umfassend die folgenden Schritte:

(i) Kultivieren von Zellen, die das Protein GRF1 exprimieren, in Gegenwart einer markierten phosphorylierten Verbindung und einer Testverbindung,
(ii) Lysieren dieser Zellen sowie
(iii) Bestimmen der Menge des markierten Proteins GRF1.

Das im Schritt (ii) erhaltene Zelllysat kann in Vertiefungen von Mikrotiterplatten inkubiert werden, die zuvor mit Anti-GRF1-Antikörpern beschichtet wurden.
Die Phosphorylierung von GRF1 kann auch mithilfe eines Antikörpers gemessen werden, der für eine phosphorylierte Aminosäure spezifisch ist.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform ein Verfahren zum Durchmustern oder Nachweisen von Verbindungen für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Pathologien des Zentralnervensystems, die mit dem Absterben von Nervenzellen einhergehen, bei dem man die folgenden Schritte durchführt:

(i) Kultivieren von Zellen, die das Protein GRF1 exprimieren, in Gegenwart einer Testverbindung,
(ii) Lysieren dieser Zellen sowie
(iii) Bestimmen der Menge an phosphoryliertem GRF1.

Die Messung der Menge an phosphoryliertem GRF1 erfolgt vorzugsweise mithilfe eines Antikörpers, der für eine phosphorylierte Aminosäure spezifisch ist.
Diese Zellen können in einem Medium kultiviert werden, das mit P³² oder P³³ markiertes Orthophosphat enthält.
Die Phosphorylierung des Proteins GRF1 kann in den Nervenzellen durch Zugabe von Carbachol zum Kulturmedium oder auch in Zelllinien, die für eine Nacht an Serum verarmt und dann wieder in Anwesenheit von Serum inkubiert werden, oder auch in Zelllinien, die mit cDNA cotransformiert sind, die für die beta-gamma-Untereinheiten trimerer G-Proteine β1γ2 oder β1γ5 codieren, dann für eine Nacht an Serum verarmt und dann wieder in Anwesenheit von Serum inkubiert werden, durchgeführt werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das Durchmustern das Messen der Aktivität des Austausches von GRF1 an bestimmten Proteinen aus der Familie der kleinen G-Proteine (Ras, Rac, Cdc42). Somit betrifft die vorliegende Erfindung gemäß noch einer anderen vorteilhaften Ausführungsform ein Verfahren zum Durchmustern oder Nachweisen von Verbindungen für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Pathologien des Zentralnervensystems, die mit dem Absterben von Nervenzellen einhergehen, umfassend die folgenden Schritte:

(i) Vorlegen des ganzen oder eines Teils des Proteins GRF1, eines Proteins aus der Familie der kleinen G-Proteine, das mit markiertem GDP oder GTP beladen wurde, sowie einer Testverbindung,
(ii) Versetzen mit unmarkiertem GTP bzw. GDP sowie
(iii) Bestimmen der Menge an markiertem Protein G.

Ein solches Protein aus der Familie der kleinen G-Proteine kann insbesondere Ras (53, 54, 55), Rac (56, 57, 58) oder Cdc42 (59) sein.
Die Austauschaktivität des Proteins GRF1 an Proteinen der Ras-Familie oder den Proteinen Rac und CDC42 kann in vitro in einem zellfreien Medium durchgeführt werden, indem man in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten ein Reaktionsgemisch inkubiert, das die kleinen G-Proteine in rekombinantem Zustand und mit tritiiertem GDP beladen, kaltes GTP und das gesamte oder einen Teil des Proteins GRF1 im rekombinanten Zustand enthält. Ein Aliquotanteil des Reaktionsgemisches wird entnommen und über eine Membran filtriert, wobei man die Radioaktivität misst, die darauf zurückgehalten wird, oder der Inhalt jeder der Vertiefungen wird über eine PD 10-Säule geleitet und die Radioaktivität des Eluats gemessen.
Die kleinen G-Proteine im rekombinanten Zustand können aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus den Wildtyp-Ras, -Cdc42 oder -Rac-Proteinen, entweder in Form von Fusionsproteinen, die in E. coli oder in Säugetierzellen exprimiert werden, oder in einer markierten Form (engl. tagged) in einem Baculovirus, die in Insektenzellen exprimiert und gereinigt werden. Die Menge der ausgetauschten Nukleotide kann auch durch Retention nachgewiesen werden.
Vorteilhafterweise werden die Fusionsproteine GST-Raf (RBD-Domäne) oder GST-PAK (CRIS-Domäne) und ein Gemisch von Anti-GST-IgG und Protein A-PVT-SPA (Scintillation Proximity Assay), gekoppelt an Mikrosphären (Amersham), zugegeben und die Fluoreszenz der Mikrotiterplatten wird nach Zentrifugation gemessen. Die an GDP gebundenen Formen ermöglichen keine Interaktion. Die Sequenzen von PAK und Raf sind veröffentlicht (siehe die Bezugsstellen 60 bis 64 bzw. 65 bis 69).
Das rekombinante Ras-(oder Rac-)Protein wird mit kaltem GDP inkubiert. Es bildet sich Ras-GDP (oder Rac-GDP). Dann gibt man tritiiertes GTP und GRF1 hinzu. Die Austauschreaktion findet statt. Es bildet sich tritiiertes Ras-GTP. Nach 60 Minuten wird ein GST-Raf-Fusionsprotein (oder GST-PAK, wenn man mit Rac arbeitet) zugegeben. Das Fusionsprotein interagiert mit Ras-GTP, dessen Menge im Medium von der Austauschaktivität von GRF1 abhängt. Man gibt die Mikrosphären hinzu, die mit Anti-GST-Antikörpern gekoppelt sind. Der Komplex GST-Raf/Ras-tritiiertes-GTP bindet an die Sphären. Diese haben die Fähigkeit zu szintillieren, wenn sie sich in der Nähe einer radioaktiven Quelle befinden. Somit gestatten sie es, den Anteil an Ras-GTP und folglich die Austauschaktivität von GRF1 im Medium zu quantifizieren.
Das Durchmusterungsverfahren kann auch in einem zellulären System durchgeführt werden.
So kann es durchgeführt werden, indem man die zu durchmusternden Verbindungen mit einer Hefe in Kontakt bringt, die mit grf1 transformiert ist und deren Gene CDC25 und/oder CDC24 inaktiviert oder mutiert sind. Vorteilhafterweise wird die Membran einer solchen Hefe zuvor permeabilisiert und/oder mindestens eines der Gene, die an den Entgiftungsmechanismen beteiligt sind, wurde inaktiviert.
Es kann auch einfach in einer S.-cerevisiae-Hefe durchgeführt werden, die mit grf1 transformiert wurde. Man misst dann das durch die Expression von grf1 erzeugte Ansteigen der metabolischen Störungen.
Das Durchmusterungsverfahren kann auch ein so genanntes "Doppel-Hybrid"-Protein-Protein-Interaktionssystem sein, das ein erstes Hybridprotein, das aus einem Fusionsprotein zwischen Ras, CDC42Hs oder Rac und einer DNA-Interaktionsdomäne besteht, und ein zweites Hybridprotein umfasst, das aus einem Fusionsprotein zwischen dem gesamten oder einem Teil von GRF1 und einer Transaktivatordomäne besteht. Es kann auch ein "Doppel-Hybrid-plus-eins"-System sein, bei dem man im Zellkern der gleichen S.-cerevisiae-Hefe entweder das gesamte oder einen Teil von GRF1, PAK1 (CRIS-Domäne) in Fusion mit einer Transaktivatordomäne und entweder Rac oder CDC42Hs in Fusion mit einer DNA-Interaktionsdomäne oder das gesamte oder einen Teil von GRF1, c-Raf1 (RBD) in Fusion mit einer Transaktivatordomäne und Ras in Fusion mit einer DNA-Interaktionsdomäne exprimiert.
Schließlich kann das Durchmustern ein Durchmustern von Zellen sein, umfassend die folgenden Schritte:

(i) Transfektion von immortalisierten Säugetierzellen mit einem Vektor, der ein (gesamtes oder einen Teil von einem) grf1-Transgen exprimiert und diesen Zellen den transformierten Phänotyp sowie eine Resistenz gegen ein Selektionsmittel verleiht,
(ii) Selektion dieser transfizierten Zellen, die das Transgen exprimieren, und Klonieren in einem Agarwachstumsträger, wobei die Zellen durch die Transformation mit GRF1 wachsen können, ohne sich anzuheften,
(iii) Versetzen der Testverbindungen mit einer Suspension dieser Zellen sowie
(iv) Nachweisen der GRF1-Hemmer-Verbindungen durch zahlenmäßige Verringerung der in dem Wachstumsmedium erhaltenen Klone.

Wie bereits erwähnt wurde, ist die Aufgabe der vorliegenden Anmeldung die Suche nach Verbindungen zur Herstellung von Medikamenten für die Vorbeugung und/oder Behandlung verschiedener Pathologien des Zentralnervensystems (A) und von Fettleibigkeit (B). Wegen der zentralen Rolle von GRF1 können die Verfahren, die Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind, auch zur Durchmusterung von Molekülen, die eine Aktivität gegen bestimmte kardiovaskuläre Krankheiten (B), pathologische angiogene Vorgänge (C) sowie gegen andere biologische Ziele (D) aufweisen, verwendet werden.
A – Zentralnervensystem
1 – Akute neurodegenerative Krankheiten
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Durchmusterung von Verbindungen, welche der Wirkung der Aktivität von GRF1 entgegenwirken und einen Schutz gegen das Absterben von Nervenzellen verleihen, das durch Hirnischämie, Schädel- oder Hirntrauma und Spinal- oder Rückenmarkstrauma induziert wird.
2 – Absterben von Nervenzellen und Apoptose
Die Verfahren, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können auch zur Durchmusterung von Molekülen für die Behandlung oder Vorbeugung von Neurodegeneration, an der eine Apoptose von Nervenzellen beteiligt ist, Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer, seniler Demenz, Chorea Huntington, amyotropher Lateralsklerose, Epilepsien, multipler Sklerose, Kleinhirn- und spinozerebellären Störungen, kognitiven Störungen, Schädeltrauma, Rückenmarkstrauma, Innenohrtraumen, Netzhauttraumen, Glaukomen, Krebserkrankungen des Nervensystems verwendet werden.
3 – Andere
Die Verfahren, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können auch zur Durchmusterung von Molekülen für die Behandlung oder Vorbeugung von Psychosen, einschließlich Schizophrenie, Angststörungen, Depression, Panikattacken, peripheren Neuropathien, Migräne, Tremor, Zwangsstörung, thymischen Störungen, Dyskinesia tarda, bipolaren Störungen, durch Medikamente induzierten Bewegungsstörungen, Dystonien, Endotoxinschock, hämorrhagischem Schock, Hypotonie, Schlaflosigkeit, Immunkrankheiten, Erbrechen, Essstörungen (Bulimie, Magersucht), Fettleibigkeit, Gedächtnisstörungen, beim Entzug von chronischen Behandlungen und Alkohol- oder Medikamentenmissbrauch (zum Beispiel Opioide, Barbiturate, Cannabis, Kokain, Amphetamin, Phencyclidin, Halluzinogene, Benzodiazepine), als Analgetika oder Verstärker der schmerzlindernden Aktivität narkotischer und nicht-narkotischer Medikamente verwendet werden.
B – Fettleibigkeit/kardiovaskuläre Krankheiten
Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch die Suche nach Verbindungen, die der Aktivität von GRF1 entgegenwirken und, hauptsächlich bei erwachsenen Individuen, eine schützende Rolle gegen Gewichtszunahme spielen.
GRF1 ist an der Regulation stromaufwärts der Leptin-Synthese beteiligt, und dies direkt oder indirekt. Leptin ist ein Hormon, das dafür bekannt ist, dass es die Freisetzung von Neuropeptid-Y (NPY) hemmt, einem appetitanregenden Molekül, das durch die Neurone des Nucleus arcuatus des Hypothalamus erzeugt wird (20, 21). Es steuert zudem die Synthese eines anorexigenen Peptids: CART (Cocaine- and Amphetamine-Regulated Transcript) im Nucleus arcuatus (22). Die antagonistischen Aktivitäten dieser beiden Neuropeptide haben zur Folge, dass die Wirkungen des Leptin-Signals auf die Nahrungsaufnahme ausgeglichen werden. Leptin stimuliert auch den anorexigenen alpha-MSH/Melanocortin-4-Rezeptor-Kreislauf (23–25).
GRF1 kann an den Signalwegen teilnehmen, die diese Neuromediatoren verwenden (die an Rezeptoren mit sieben Transmembrandomänen binden). Sein Fehlen in unseren mutierten Mäusen könnten sich durch ein Signal des Typs "Sättigung und/oder Erhöhung des Energieverbrauchs" mit der Folge einer Abnahme der Fettmasse und einer niedrigen Leptinämie manifestieren.
C – Angiogenese
Das Gefäßendothel stellt sich als neues Ziel für Leptin dar. Neuere Ergebnisse zeigen, dass Leptin die Proliferation von Endothelzellen und die Angiogenese in vivo stimuliert (26, 27).
Die Angiogenese spielt eine wichtige Rolle bei der Embryogenese, der Narbenbildung, im Menstruationszyklus, aber auch bei pathologischen Zuständen, wie Tumorvaskularisierung, rheumatoider Arthritis, Psoriasis, Kaposi-Sarkom, diabetischen Retinopathien und Atherosklerose.
Die Erfinder haben gezeigt, dass die adulten grf1-Gen-Knockout-Mäuse einen Leptin-Gehalt aufweisen, der sehr viel niedriger ist als derjenige von Kontrolltieren. Es ist möglich, dass die mutierten Tiere eine bestimmte Form des Schutzes gegen das Auftreten pathologischer angiogener Vorgänge und infolgedessen gegen das Wachstum und die Verbreitung von Tumoren und gegen alle vorstehend erwähnten Pathologien aufweisen.
Antagonisten von GRF1, die zu einer Verringerung der Leptinämie führen, könnten eine schützende Rolle gegen diese Krankheiten ausüben. Eine Rolle als Kontrazeptive lässt sich ebenfalls in Betracht ziehen.
D – Andere biologische Ziele
Leptin ist an der Auslösung der Pubertät und an der Steuerung der Fortpflanzung beteiligt (28–32).
Leptin spielt auch eine Rolle bei der Regulation der Immunantwort, die durch T-Lymphozyten reguliert wird (33).
Modulatoren der GRF1-Aktivität könnten eine Wirkung auf die Immunfunktion und auf Fortpflanzungsmechanismen ausüben. Diese letztere Hypothese scheint sich außerdem zu bestätigen, da die Beobachtungen der Erfinder auf eine verzögerte Pubertät und eine vorzeitige Menopause bei den grf1-KO-Mäusen hindeuten. Dieses Phänomen kann teilweise auf eine Abnahme des Anteils an Leptin oder eine Deregulation der Synthese von Geschlechtshormonen zurückzuführen sein, die durch die Hypothalamus-Hypophysen-Achse gesteuert wird.
Die hemmenden Eigenschaften von Leptin auf die Knochensynthese sind vor kurzem gezeigt worden. Es wirkt, indem es die Aktivität der Osteoblasten hemmt, einer Population von Zellen, die für die Knochenbildung verantwortlich sind (34). Die Modifikation der Leptinämie durch Einwirken auf GRF1 könnte eine Behandlung von Krankheiten ermöglichen, die mit einer Abnahme der Knochendichte einhergehen, wie zum Beispiel Osteoporose, oder im Gegensatz dazu von Krankheiten, die mit einer erheblichen Kalzifizierung einhergehen, wie zum Beispiel Osteopetrose.
An NPY-Gen-Knockout-Mäusen durchgeführte Studien haben gezeigt, dass diese Tiere eine ausgeprägte Vorliebe für Alkohol aufwiesen und resistenter gegenüber dessen sedativen und hypnotischen Wirkungen waren als die Wildtyp-Mäuse (35). Leptin spielt eine negative Rolle bei der Freisetzung von NPY (20, 21). Modulatoren der GRF1-Aktivität könnten zur Behandlung des Verhaltens gegenüber Alkohol und zur Behandlung von Schlafstörungen verwendet werden.
Andere zusätzliche Aufgaben, Eigenschaften und Vorteile werden nachstehend anhand der folgenden Herstellungsbeispiele beschrieben, die rein zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung gegeben werden, sowie anhand der beigefügten Zeichnungen, in denen:
1A eine schematische Darstellung des Proteins GRF1 ist,
1B ein Schema ist, das die hauptsächlichen Signalwege zusammenfasst, an denen die Funktion des Proteins GRF1 beteiligt ist,
die 2A und 2B Histogramme sind, die neurologische Untersuchungen darstellen,
die 3A und 3B Histogramme sind, welche das Ausmaß der globalen Gehirnläsionen bzw. der Läsionen des Cortex zeigen,
3C die Läsionen von verschiedenen Zonen der Cortexregion veranschaulicht,
3D das Volumen der Läsionen der Cortexregion zwischen 3,22 und 1,76 veranschaulicht.
die 4A und 4B das Gewicht bzw. die Leptinämie bei mutierten grf1-KO-Mäusen (als –/– bezeichnet) und Wildtyp-Mäusen (als +/+ bezeichnet) veranschaulichen und
die 5A und 5B das Gewicht bzw. die Leptinämie bei mutierten grf1-KO- und Wildtyp-Mäusen nach 48-stündigem Fasten veranschaulichen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Verwendung von Mäusen, die eine inaktivierende Mutation des grf1-Gens tragen (als "grf1-Knockout"- oder "grf1-KO"-Mäuse bezeichnet) als Modell zur Untersuchung des Schutzes gegen das durch Hirnischämie induzierte Absterben von Nervenzellen
Die grf1-KO-Mäuse bieten die Möglichkeit, die Auswirkung der von dem Protein GRF1 abhängigen Wege auf die Hirnischämie zu untersuchen. KO-Mäuse und Wildtyp- Mäuse werden einer permanenten fokalen Hirnischämie unterworfen. Die Parameter, die gemessen wurden, um die Beteiligung von GRF1 an der ischämischen Schädigung zu bestimmen, wurden (i) aus einer Untersuchung der neurologischen Funktion und (ii) aus einer histologischen Quantifizierung der Hirnläsionen erhalten.
1.1.: Modell für die permanente fokale Hirnischämie
Es werden 22–37 g schwere männliche Mäuse mit dem genetischen Hintergrund C57B1/6 und 129SV verwendet, die mit 1,4% Halothan in einem Stickoxid-Sauerstoff-Gemisch (70:30) anästhesiert werden. Ein Einschnitt wird zwischen dem Auge und dem linken Ohr gemacht. Der Temporalmuskel wird zurückgeklappt. Man führt eine Craniotomie am Temporalknochen durch, durch die man Zugang zur mittleren Hirnarterie erhält. Diese wird mittels Elektrokoagulation kauterisiert. Man ruft dann eine permanente fokale Hirnischämie durch Verschluss der linken mittleren Hirnarterie hervor (MCA.O, (36)). Während der Chirurgie werden sowohl die Temperatur des Temporalmuskels als auch die Körpertemperatur bei Normothermie gehalten. Der Einschnitt wird dann vernäht und die Tiere werden wieder in ihre Käfige in einem bei 24–26°C beheizten Raum gebracht.
Die Mäuse werden folgendermaßen in Gruppen eingeteilt:
für die GRF1-Expression defiziente Mäuse (KO-Mäuse): mutierte C57B1/6 (n = 10), mutierte 129SV (n = 21).
Die als Kontrollen verwendeten Wildtyp-Mäuse sind Kontroll-C57B1/6 (n = 10) und Kontroll-129SV (n = 20).
1.2.: Neurologische Untersuchung
Für die neurologische Untersuchung wird wie folgt vorgegangen:
Vor der Ischämie und dann 1 Std. und 24 Std. nach der Ischämie wird eine neurologische Untersuchung durchgeführt, die erstmals bei der Ratte beschrieben (37) und von den Erfindern leicht modifiziert wurde. Während der Untersuchung werden verschiedene Punkte notiert: 0 (normal), 1 (Beugen der Vorderpfote), 2 (kreisförmige Bewegung), 3 (Beugen der Vorderpfote und Verdrehen des Thorax), 4 (Verlust des Aufrichtungsreflexes).
Wie aus den 2A und 2B ersichtlich ist, zeigen alle Mäuse ein signifikantes neurologisches Defizit im Vergleich zu ihrer guten neuronalen Bewertung vor der Ischämie, 1 Std. und 24 Std. post-MCA.O. Bei den C57B1/6-Mäusen wird keinerlei Unterschied zwischen den Wildtyp-Mäusen und den KO-Mäusen bei sämtlichen untersuchten Punkten mit der Zeit beobachtet. Im Gegensatz dazu weisen die 129SV-KO-Mäuse verglichen mit den Wildtyp-Mäusen ein leicht weniger ausgeprägtes Defizit 1 Std. (p < 0,01) und 24 Std. (p < 0,05) nach der Ischämie auf.
1.3: Gehirnläsion
Es wird wie folgt vorgegangen: Nach Aufzeichnen ihres "Neuroscore" werden die Mäuse getötet und die Gehirne schnell entfernt und in flüssigem Isopentan bei –30°C eingefroren. Koronarschnitte von 40 μm Dicke werden auf verschiedenen stereotaktischen Ebenen mit einem Kryostat geschnitten und dann mit 0,5% Kresyl-Violett gefärbt. Die Läsionszonen werden mit einem Bildanalysator (Leica Q500) auf verschiedenen Koronalebenen gemessen. Das Volumen der Gehirnläsionen wird dann durch Integration der Oberflächenbereiche berechnet.
Bei den C57B1/6-Mäusen wird kein signifikanter Unterschied zwischen den Wildtyp-Mäusen und den KO-Mäusen beobachtet (Ergebnisse nicht dargestellt).
Aus den 3A und 3B ist ersichtlich, dass man bei den 129SV-Mäusen keine signifikante globale oder cortikale Abnahme der Gehirnläsion beobachtet.
Man stellt jedoch signifikante Verringerungen der Läsionszonen auf bestimmten stereotaktischen Ebenen fest (3C), wobei dieses Ergebnis einer 23%igen Verringerung (p < 0,05) der Läsion in dieser spezifischen Region entspricht (3D).
Die im vorstehenden Beispiel 1 beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass die Abwesenheit des Gens grf1 eine bessere funktionelle Wiederherstellung bei den 129SV-KO-Mäusen, bei denen eine Ischämie induziert wurde, zur Folge hat.
Die Verringerung der Läsionen in den spezifischen koronalen Ebenen könnte Strukturen entsprechen, die an den untersuchten motorischen und sensomotorischen Funktionen beteiligt sind, (insbesondere der Neocortex und das Kleinhirn), in denen das Gen grf1 stark exprimiert werden könnte (12). Im Gegensatz dazu stellt man keine Wirkung bei den Mäusen mit dem genetischem Hintergrund C57B1/6 fest.
Die Inaktivierung des Gens grf1 könnte einen der Signalwege unterbrechen, die zur Apoptose führen. Anders gesagt, legen die vorstehend beschriebenen Ergebnisse nahe, dass das Protein GRF1 an der Signalgebung beteiligt ist, die zur Apoptose von Nervenzellen führt, indem es in den Aktivierungsweg der Stress-Kinasen durch Aktivierung eines oder mehrerer der kleinen G-Proteine aus der Familie der Proteine Rho, Rac und Cdc42 eingreift. Es wurde außerdem eine Aktivität von GRF1 an dem Protein Rac beschrieben (2).
Zusammenfassend gesagt, könnte das Protein GRF1 einen Apoptoseweg teilweise aktivieren, der für die Anfälligkeit gegenüber Ischämie verantwortlich ist. Diese Ergebnisse legen ferner nahe, dass das GRF1-Protein selbst ein Ziel, insbesondere für akute neurodegenerative Störungen, darstellen könnte.
Beispiel 2: Verwendung von Mäusen, die eine inaktivierende Mutation des grf1-Gens tragen (als "grf1-Knockout"- oder "grf1-KO"-Mäuse bezeichnet) als Modell zur Untersuchung des Schutzes gegen Fettleibigkeit
2.1: Fettleibigkeit
10–12 Monate alte Wildtyp-Mäuse, die seit dem Abstillen mit einer zur Züchtung bestimmten, an Proteinen (22%) und Fett (7%) reichen Diät (Bezugsnr.: D03, Code: R0310. Lieferant: UAR, Frankreich) ernährt wurden, weisen eine beträchtliche Fettmasse zwischen der Haut und der abdominalen Muskelschicht sowie in der Abdominalhöhle, bei Weibchen hauptsächlich um die Uterusbögen, und im Peritoneum auf. Das Vorliegen von Fett um das Herz findet man zudem bei den dicksten Individuen, die man als fettleibig bezeichnen kann und deren Gewicht 35 Gramm bei Weibchen und 40 Gramm bei Männchen überschreitet.
Unter den gleichen Züchtungs- und Ernährungsbedingungen zeigen die Mäuse, welche die inaktivierende Mutation für das Gen grf1 tragen, im Alter von einem Jahr und darüber keines der Merkmale, die Fettleibigkeit kennzeichnen. Die Mehrzahl unter ihnen hat kein Fettgewebe zwischen der Haut und der Bauchwand. Bei den Weibchen ist die Fettablagerung um die Uterusbögen sehr klein und in der Menge mit derjenigen von 6–8 Wochen alten Wildtyp-Tieren vergleichbar. Die adulten grf1-KO-Mäuse sind ferner durch das Fehlen von Fett im Peritoneum und um das Herz gekennzeichnet.
Es wird beobachtet, dass die Inaktivierung des Gens grf1 bei der adulten Maus zu einem Schutz gegen Gewichtszunahme und die Ansammlung von Fettgewebe führt.
2.2: Leptinämie
Um die bei den grf1-KO- und Wildtyp-Mäusen gemachten Beobachtungen mit bekannten Eigenschaften des fettleibigen Phänotyps zu korrelieren, haben wir das Plasma-Leptin bei Wildtyp- und mutierten Mäusen untersucht.
Leptin ist ein Cytokin, das eine Verringerung der Nahrungsaufnahme und eine Erhöhung des Energieverbrauchs bewirkt. Es besteht eine proportionale Beziehung zwischen der Anzahl an Adipozyten – die Leptin sezernieren – und der Größe der Lipidvesikel, die sie enthalten, einerseits und der Plasmakonzentration dieses Hormons andererseits (20).
Die Erfinder haben das Gewicht und die Leptinämie bei ein Jahr alten männlichen und weiblichen Wildtyp- oder für das Gen grf1 mutierten (KO-)Mäusen bestimmt. Die Gruppe der untersuchten Tiere besteht aus mehreren Geschwisterpaaren. Jedes Geschwisterpaar besteht aus Wildtyp- und mutierten Tieren.
Die Blutproben wurden zum Zeitpunkt der Tötung der Tiere mittels Enthauptung entnommen.
Die Bestimmung des Plasma-Leptins erfolgte unter Verwendung eines von der Firma Linco hergestellten Radioimmunoassay (RIA) in Form eines Kits (Bezugsnr.: ML-82K), das in Frankreich von der Firma Clinisciences vertrieben wird.
Wie aus den 4A und 4B ersichtlich ist, ist bei den mutierten Mäusen (als –/– bezeichnet) der Plasmagehalt an Leptin sehr klein verglichen mit demjenigen der Wildtyp-Mäuse (als +/+ bezeichnet) des gleichen Alters. In Bezug auf die Literatur ist die Leptinämie der grf1-Knockout-Mäuse im Alter von mehr als 12 Monaten vergleichbar mit derjenigen bei sehr jungen Mäusen von 6–8 Wochen (5 bis 10 ng/ml). Eine vergleichende Untersuchung der Gestalt dieser Tiere stimmt damit überein.
Wenn die Tiere für 48 Std. nüchtern gehalten werden (5A und 5B), folgt daraus eine begleitende Abnahme des Körpergewichts bei den Kontrolltieren, eine beträchtliche Abnahme der Plasmakonzentration an Leptin, während bei den KO-Tieren die Abnahme der Leptinämie sehr klein ist. Diese letzteren Ergebnisse legen nahe, dass bei den KO-Tieren der Leptin-Gehalt bereits bei einer minimalen Schwelle liegt, die als Reaktion auf längeres Fasten nur wenig moduliert werden kann.
Die ersten Messungen des Nahrungsverbrauchs bei den mutierten Mäusen zeigen, dass die Nahrungsaufnahme verglichen mit den Kontrollen verringert ist. Wenn man jedoch die Menge der aufgenommenen Nahrung auf das Gewicht der Tiere bezieht, gibt es keinen signifikanten Unterschied zwischen KO und Wildtyp.
Es soll darauf hingewiesen werden, dass, wenn der Phänotyp der mutierten Mäuse seinen Ursprung in einer Erhöhung des Energieverbrauchs hat, dieser letztere nicht auf eine Hyperaktivität der grf1-KO-Mäuse zurückzuführen zu sein scheint.
Beispiel 3: Verwendung des Proteins GRF1 zur Durchführung von Durchmusterungen von Verbindungen durch Messen der Serin-/Threonin- oder Tyrosin-Phosphorylierung des Proteins GRF1
Dieses Experiment wird an Zellen in Kultur durchgeführt.
Die Induktion der Phosphorylierung von GRF1 wird in diesen kultivierten Zellen auf verschiedenerlei Weisen induziert.
Drei Protokolle werden verwendet:
1) Radioaktive Markierung und Immunpräzipitation des Proteins GRF1
Diese verschiedenen Behandlungen werden in Gegenwart und Abwesenheit der zu durchmusternden Moleküle in Kulturmedium durchgeführt, das mit P³² oder mit P³³ (200 μCi bis 1 mCi/10-mm-Petri-Schale) markiertes Orthophosphat enthält. Die Lyse der Zellen erfolgt kalt in einem HNTG-Puffer (20 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton, 10% Glycerin, in Anwesenheit von Protease- und Phosphatase-Hemmern: 1 mM Na₃VO₄, 2,2 μg/ml Aprotinin, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Antipain, 10 μg/ml Benzamidin, 1 μg/ml Soyabohnen-Trypsin-Hemmer, 1 μg/ml Chymostatin, 1 μg/ml Pepstatin-A) oder RIPA-Puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS, 1 mM Na₃VO₄, 100 μM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 25 μg/ml Aprotinin, 25 μg/ml Leupeptin). Das Protein GRF1 wird dann mit Anti-GRF1-Antikörpern oder Anti-Tag-Antikörpern (10) (ein Epitop, das durch einen monoklonalen Antikörper erkannt wird und einen Nachweis oder eine Immunpräzipitation des markierten (engl.: tagged) Proteins ermöglicht, wie FLAG, myc oder Hämagglutinin (HA)) immunpräzipitiert und das Immunpräzipitat wird dann auf einem 4–20%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Quantifizierung der Radioaktivität der Bande, die dem Protein GRF1 entspricht (140 kDa), wird mit einem Strahlungsdetektor des Typs PhosphorImager durchgeführt. Die Wirksamkeit eines Moleküls wird aus der prozentualen Hemmung der Phosphorylierung des Proteins GRF1 berechnet, wobei man den für unstimulierte Zellen gefundenen Wert als 0%-Wert und den Wert, der für Zellen gefunden wird, die in Abwesenheit des durchmusterten Moleküls stimuliert werden, als 100%-Wert annimmt.
2) Radioaktive Markierung und Retention des Proteins Grf1 in CYTOSTAR-Platten
Eine erste Alternative zu diesem Verfahren besteht aus dem Inkubieren des zuvor erhaltenen Zelllysats in den Vertiefungen von CYTOSTAR-Platten (von der Firma Amersham vertrieben), die zuvor mit Anti-GRF1- oder Anti-Tag-Antikörpern beschichtet wurden, so dass sie das Protein GRF1 darin zurückhalten. Nach Spülen wird die Quantifizierung des radioaktiven Signals mithilfe eines Szintillationszählers erhalten.
3) Quantifizierung durch ELISA
Eine zweite Alternative zu diesem Verfahren besteht aus dem Behandeln der Zellen wie vorstehend, aber in Abwesenheit von markiertem Orthophosphat. Die Zelllysate werden dann gemäß dem ELISA-Nachweisverfahren verwendet. Für diese Quantifizierung werden die Vertiefungen der Platten mit einem Anti-GRF1- oder Anti-Tag-Antikörper beschichtet und die Phosphorylierung von GRF1 wird mit einem zweiten Antikörper sichtbar gemacht und quantifiziert, der markiert (radioaktives Element, Fluoreszenz, Enzym usw.) oder unmarkiert ist und der entweder ein Anti-Phospho tyrosin- oder ein Anti-Phosphoserin-/Phosphothreonin-Antikörper sein kann. Wenn der zweite Antikörper nicht markiert ist, erfolgen das Sichtbarmachen und die Quantifizierung mithilfe eines dritten Antikörpers, der gegen den zweiten gerichtet und markiert ist. Nach Spülen erfolgt die Quantifizierung des Signals mithilfe eines Radioaktivitätszählers, eines Fluoreszenzspektralphotometers oder durch Messen einer Enzymaktivität, die eine optische-Dichte-Ablesung mittels Spektralphotometrie (Plattenleser) liefert.
Die kultivierten Zellen können folgende sein:

– Primärkulturen von Nervenzellen, die 10 Tage in Kultur gehalten werden, um die Expression des endogenen GRFl-Proteins zu ermöglichen;
– kultivierte Zelllinien aus jedem beliebigen Gewebe, die mit einem Vektor transformiert sind, der die Expression des gesamten und gegebenenfalls markierten (engl.: taggend) (murinen oder menschlichen) Proteins GRF1 ermöglicht. Jeder Plasmid- oder Virusvektor, der die Expression heterologer cDNA in Säugetierzellen gestattet, kann verwendet werden.

Die Phosphorylierung des Proteins GRF1 in den kultivierten Zellen wird in Nervenzellen durch Zugabe von 100 μM Carbachol (5 bis 30 Minuten) zum Kulturmedium der Neuronen erhalten.
In nicht-neuronalen Zellen, die mit der für GRF1 codierenden cDNA transfiziert sind, wird die Phosphorylierung des interessierenden Proteins unter den folgenden Bedingungen untersucht:

– Entweder werden die transfizierten Zellen über Nacht an Serum verarmt und dann in Anwesenheit von 10% fötalem Kälberserum inkubiert
– oder die Zellen werden mit cDNAs cotransfiziert, die für die beta-gamma-Untereinheiten trimerer G-Proteine β1γ2 oder β1γ5 codieren. Die Expressionsvektoren sind Plasmide, welche die Expression in eukaryotischen Zellen unter der Kontrolle von Promotoren des Typs CMV oder SV40 ermöglichen (Beispiele pSV2 oder auch pcDNA3 (INVITROGEN)). Die für die interessierenden Proteine codierenden cDNAs werden nach Amplifikation der Fragmente mittels PCR, Überprüfung der Sequenz und Subklonierung der Fragmente in die in den Vektoren vorliegenden Mehrfach-Klonierungsstellen inseriert. Die Zellen werden über Nacht an Serum verarmt und dann erneut in Anwesenheit von Serum inkubiert.

Beispiel 4: Verwendung des Proteins GRF1 zur Durchführung von Durchmusterungen von Verbindungen durch Messen der Austausch-Aktivität an dem Protein Ras oder den Proteinen Rac oder Cdc42 in Anwesenheit von GRF1
Diese Aktivitäten können in zellfreien Systemen (Verwendung rekombinanter Proteine) oder in zellulären Systemen gemessen werden.
1) Messung in zellfreien Systemen
Die rekombinanten Proteine Ras, Rac oder Cdc42 in einer Endkonzentration von 0,5 μM werden in Anwesenheit von ³H-GDP (0,5 μM Endkonzentration, NEN, 111 μMol, 9 Ci/mmol) in Austausch-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, l mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM EDTA, 1 mg/ml Rinderserumalbumin) für 30 Minuten bei 30°C inkubiert und dann auf Eis gehalten. Anschließend gibt man MgCl₂ hinzu, so dass eine Endkonzentration von 10 mM erhalten wird, um die Austauschreaktion zu blockieren, und entnimmt dann 50 μl von jeder Inkubation (an tritiiertes GDP gebundenes Ras/Rac/Cdc42), die in eine der 96 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte überführt werden.
Die Austauschreaktion wird durch Zugabe von 10 μl kaltem 10 mM GTP (0,1 mM Endkonzentration), rekombinantem Protein GRF1 (des gesamten oder von Teilen) und der zu testenden Moleküle eingeleitet.
Nach Inkubation für 60 Minuten bei 30°C wird ein Aliquot von 40 μl entnommen und über eine 0,45-μm-Nitrocellulosemembran filtriert (Platte mit 96 Vertiefungen, deren Böden mit einer Filtrationsmembran bedeckt sind, die die Proteine zurückhalten kann, Sartorius SM 11306). Die Zählung der Radioaktivität (tritiiertes GDP, das an das kleine G-Protein gebunden ist) erfolgt in einem Szintillationszähler in Anwesenheit von Szintillationsflüssigkeit. In diesem Fall wird die auf der Nylon-Filtrationsmembran zurückgehaltene Radioaktivität gezählt.
Eine Alternative zur Filtrationsreaktion besteht darin, dass man nach der Inkubation den Inhalt der jeweiligen Vertiefungen über eine PD10-Säule leitet, die zuvor mit Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 1 mM PMSF, 5 mM DTT und 1 mM EDTA) äquilibriert wurde. In diesem Fall wird die Radioaktivität des Eluats der Säule gemessen (4 ml über die Säule geleiteter Elutionspuffer + 10 ml Beckman-ReadyGel-Szintillationsflüssigkeit).
In beiden Fällen wird die Austauschaktivität durch die Differenz der Menge an Radioaktivität in Anwesenheit des Proteins GRF1 verglichen mit derjenigen, die in einer Probe ohne GRF1-Protein erhalten wird, gemessen. Die Wirksamkeit eines Moleküls wird aus der Hemmung dieser Austauschaktivität berechnet.
Die rekombinanten Proteine Ras, Rac oder Cdc42 können die Wildtyp-Ras-, -Cdc42- oder -Rac-Proteine aus verschiedenen Quellen (menschlich, murin usw.) sein, die folgendermaßen exprimiert werden:
entweder in Form von Fusionsproteinen (GST, pGEX-1λT- oder -2T-System, Produkt von Pharmacia) in E. coli (gemäß dem vom Hersteller beschriebenen Protokoll und nach Transformation der Plasmide in BL21-Bakterien. Die Expression der Proteine wird für 4 Stunden mit 0,5 mM IPTG (Isopropyl-1-thio-beta-D-galactosid) bei 30°C induziert) oder in Säugetierzellen (pBCGST (38)) in mit den Plasmiden transfizierten CHO-Zellen. Die Expression wird bei 37°C in einem Inkubator mit 5% CO₂ über Nacht erhalten. Die Proteine werden auf einer Glutathion-Affinitätssäule gemäß den von Pharmacia bereitge stellten Protokollen gereinigt (Biotech (GST-Gen Fusionssystem). Diese Fusionsproteine können durch Spaltung mit Thrombin gespalten werden, um ihre GST-Domäne zu beseitigen oder nicht;
oder in einer markierten (engl.: tagged) Form (pBlueBacHis2, Produkt von Invitrogen) in Baculovirus, die in Insektzellen (Sf9, Sf21, High Five usw.) nach Infektion der Zellen mit einem rekombinanten Baculovirus, das gemäß den vom Verkäufer empfohlenen Verfahren erhalten wird, exprimiert wird. Die Expression erfolgt bei 27°C über zwei bis vier Tage und die Proteine werden anschließend auf einer Nickel-Säule gereinigt.
Bei den rekombinanten GRF1-Proteinen kann es sich um die Gesamtheit oder Anteile der GRF1-Proteine aus den verschiedenen Quellen (menschlich, murin usw.) handeln, welche die Austauschdomänen, entweder CDC25 oder DH oder beide, enthalten und die in Baculovirus oder E. coli exprimiert und auf einer Affinitätssäule gereinigt werden.
Eine Variante der vorstehenden Technik besteht aus der Verwendung der Fähigkeit von entweder Ras-GTP, an Raf-1 über die "Ras-Bindungsdomäne" von Raf (RED) zu binden, oder von Rac1-GTP oder von Cdc42-GTP, an PAK1 über die CRIS-Domäne des letzteren zu binden (39). Das SPA-System ("Scintillation Proximity Assay"), das in US 4 568 649 , EP 154 734 und JP 84/52452 beschrieben ist, ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung der Bindung zwischen zwei Proteinen bei einer Durchmusterung mit hohem Durchsatz.
Die rekombinanten Ras-, CDC42- oder Rac-Proteine – in diesem Experiment werden die kleinen G-Proteine von ihrer GST-Domäne abgespalten oder auch mit einer anderen Markierung (engl.: tag) exprimiert, zum Beispiel einem His-Schwanz – werden in einer Endkonzentration von 0,5 μM in Anwesenheit von kaltem GDP in Austausch-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM EDTA, 1 mg/ml Rinderserumalbumin) für 30 Minuten bei 30°C inkubiert und dann auf Eis gehalten. Die folgenden Schritte bestehen aus der Zugabe von MgCl₂ auf eine Endkonzentration von 10 mM, um die Austauschreaktion zu blockieren, und dann aus dem Entnehmen von 50 μl von jeder Inkubation und dem Verteilen in einer der 96 Vertiefungen einer Mikroplatte.
Die Austauschreaktion wird durch Zugabe von 10 μl tritiiertem GTP (NEN 111 μMol, 9 Ci/mmol), des rekombinanten GRF1-Proteins und der Testmoleküle zu den Vertiefungen eingeleitet.
Nach einer Inkubation für 60 Minuten bei 30°C Zugeben von 80 μl der Proteine GST-Raf (RBD-Domäne) oder GST-PAK (CRIS-Domäne) in einer Konzentration von 0,0013 mg/ml in einem Puffer aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM Dithiothreitol, und 40 μl einer Mischung von Anti-GST-Immunglobulin (0,12 mg/ml) und Protein-A-PVT-SPA, das an Mikrosphären gebunden ist, (Amersham; 12,6 mg/ml) in einem Puffer aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM Dithiothreitol, 2 mM MgCl₂. Die Platten werden dann verschlossen, für 1 Std. bei 22°C geschüttelt, dann bei 760 g für 2 Minuten zentrifugiert und in einem Szintillationszähler gezählt.
Die Wirksamkeit des Moleküls wird aus der prozentualen Hemmung der Austauschaktivität berechnet und ist gleich: 100 × (1 – (Wert in Anwesenheit von GRF1 und Molekül – Kontrolle in Abwesenheit von GRF1 und Molekül)/(Wert in Anwesenheit GRF1 und in Abwesenheit des Moleküls – Kontrolle in Abwesenheit von GRF1 und Molekül)).
2) Messung in zellulären Systemen (Hefe)
Verschiedene Möglichkeiten können in Betracht gezogen werden. Sie verwenden entweder Systeme zur Komplementation der Hefe (Saccharomyces cerevisiae) oder Kompetitionssysteme, die ein physiologisches Ungleichgewicht erzeugen, oder das Doppel-Hybrid-System. Alle Techniken und Verfahren, die Hefe verwenden, sind in der Literatur weitgehend beschrieben (40–45).
Die Verwendung des einen oder anderen dieser Systeme kann in Betracht gezogen werden, weil in der Hefe Paare aus einem G-Protein mit niedrigem Molekulargewicht/Austauschfaktor vorliegen, die zu den in Säugetierzellen beschriebenen homolog sind. Was die G-Proteine anbetrifft, sind die RAS-Proteine der Hefe homolog zu den Ras-Proteinen von Säugetieren (letztere komplementieren in der Hefe inaktivierende Mutationen der RAS-Proteine) und das S.c.-CDC42-Protein ist homolog zu den Rac-Proteinen von Säugetieren. Was die Austauschfaktoren angeht, sind CDC25 und SDC25 homolog zu GRF1 und ihre katalytischen Anteile sind an den Ras-Proteinen von Säugetieren aktiv (46, 47). GRF1 kann aufgrund seiner zu CDC25 homologen Domäne jede inaktivierende Mutation von CDC25 oder auch eine CDC25/SDC25-Doppelmutante komplementieren (die mutierten oder KO-SDC25 haben keinen Phänotyp). Für S.c.-CDC42 kennt man auch einen als CDC24 bezeichneten Austauschfaktor, der durch die DH-Domäne von Vav komplementiert werden kann (48). Man kann auf eine Austauschaktivität für das gesamte oder einen Teil (der die DH-Domäne umfasst) von GRF1 an CDC42 in einer für CDC24 mutierten Hefe schließen, wobei diese inaktivierenden Mutationen einen letalen Phänotyp haben. Diese Aktivität von (dem gesamtem oder einem Teil von) GRF1 könnte (je nach seiner Affinität) die Wirkung von CDC24 ganz oder teilweise nachahmen.
2.1 Komplementation in Hefe
In diesem System ist (das gesamte oder ein Teil von) GRF1 in der Lage, die Funktion der Hefe-Austauschfaktoren (CDC25, CDC24) nachzuahmen, wenn diese durch eine Mutation inaktiviert werden, die zu einem Wachstumsstopp-Phänotyp führt. Diese Komplementation wirkt derart, dass sie das Überleben der Hefe ermöglicht, indem sie das Wachstum wiederherstellt. Ein Molekül, das die Funktion von GRF1 (gesamtes Protein, CDC25-Domäne, DH-Domäne) an den Proteinen RAS oder CDC42 in einem Kontext hemmt, in dem CDC25 oder CDC24 inaktiviert sind (thermosensitive Mutationen), führt zu einem Verlust des Komplementationsphänomens und zum Absterben der Zelle bei der permissiven Temperatur. Die Spezifität der Wirkungsweise des Moleküls an dem RAS/CDC25-Domäne- oder CDC42/DH-Domäne-System wird durch Messen der Wirkungsweise des Moleküls an einer Wildtyp-Hefe überprüft (Information über die fungizide Aktivität).
Die Durchmusterung erfolgt für kleine Moleküle in einer Hefe, die mittels dem Fachmann bekannten Techniken permeabilisiert wurde, wobei man die intrazelluläre Konzentration der Moleküle erhöht, indem man die Membranpermeabilität und die Expression der Gene variiert, die an Entgiftungsprozessen beteiligt sind (zum Beispiel unter Verwendung von Mutanten im Gen Ergo und/oder in den Genen der PDR-Familie). Diese so genannten Permeabilisierungstechniken sind in den folgenden Patentanmeldungen beschrieben: FR 9411509 und WO 96/1082 .
Verwendete Hefestämme
Es wird ein Stamm der Gattung S. cerevisiae CDC25 TS oder CDC24 TS (thermosensitive Mutationen), verwendet. Er kann nur unter den permissiven Temperaturbedingungen wachsen. Er wird in dem folgenden Kulturmedium gezüchtet:
YNB-Minimalmedium: – Yeast Nitrogen Base (ohne Aminosäuren) (6,7 g/l) (Difco)

– Glucose (20 g/l) (Merck)

Dieses Medium kann durch Zugabe von 20 g/l Agar (Difco) verfestigt werden.
Damit das Wachstum auxotropher Hefen auf diesem Medium möglich ist, muss man50 mg/ml Aminosäuren oder stickstoffhaltige Basen, von denen sie abhängig sind, hinzufügen. 100 μg/ml Ampicillin werden zum Medium gegeben, um bakterielle Verunreinigungen zu vermeiden.
Konstruktion und Amplifikation der Plasmide
Der Escherichia coli-Stamm TG1 mit dem Genotyp supE, hsdΔ5, thi, Δ(lac-proAB), F'[traD36 ProA⁺B⁺ lacI^q lacZΔM15] wird zur Konstruktion von Plasmiden und zur Amplifikation und Isolation von Plasmiden verwendet. Er wird auf folgendem Medium gezüchtet:
LB Medium: – NaCl (5 g/l) (Sigma)

– Bactotrypton (10 g/l) (Difco)
– Hefe-Extrakt (5 g/l) (Difco)

Dieses Medium kann durch Zugabe von 20 g/l Agar (Difco) verfestigt werden.
Es werden 100 μg/ml Ampicillin verwendet, um die Bakterien zu selektieren, die die Plasmide aufgenommen haben, die als Marker das Gen für die Resistenz gegenüber diesem Antibiotikum tragen.
Die Präparationen von Plasmid-DNA in kleinen und in großen Mengen werden gemäß den Protokollen durchgeführt, die vom Hersteller der folgenden DNA-Reinigungskits, Quiagen, empfohlen werden:

– Quiaprep Spin Miniprep Kit, Bezugsnr.: 27106
– Quiaprep Plasmid Maxiprep Kit, Bezugsnr.: 12163.

Transformation der Hefe durch ein Plasmid
Die Hefen werden durch eine Behandlung mit LiAC/PEG gemäß dem von Gietz et al. beschriebenen Verfahren (49) kompetent gemacht und mit 1 μg Plasmid transformiert, das eine konstitutive oder induzierbare Expression des gesamten oder eines Teils von GRF1 in der Hefe ermöglicht. Nach den Transformationsschritten werden die Hefen unter nicht-permissiven Bedingungen kultiviert. Die selektierten Klone sind diejenigen, die durch GRF1 komplementiert wurden.
Durchmustern der Moleküle
Ein selektierter, durch GRF1 komplementierter Klon wird auf Schalen plattiert, die Selektionsmedium enthalten, auf das Tropfen chemischer Verbindungen aufgebracht werden. Die Schalen werden unter permissiven Bedingungen gehalten. Die Produkte, die einen Hemmhof des Hefewachstums ergeben, werden aufbewahrt und an einer Kontroll-Wildtyp-Hefe getestet, um die Moleküle mit fungizider Aktivität zu beseitigen, die den gleichen Typ der Wachstumshemmung liefern.
2.2 Kompetition mit Hefe-GEFs (zwei Varianten)
a – Konstitutive Aktivierungen/dominant-positive Wirkung:
In diesem System geht die Expression des gesamten oder eines Teils von GRF1 in der Hefe mit einer Wachstumsstörung aufgrund der konstitutiven Stimulation des Austauschs an den Proteinen RAS oder CDC42 einher. Ein Molekül, das an dem System aktiv ist, führt zu einer mehr oder weniger vollständigen Normalisierung der physiologischen Störung (Phänotyp), die durch die Expression von GRF1 erzeugt wird.
Verwendete Stämme
Es wird ein Wildtyp-Hefestamm der Gattung S. cerevisiae verwendet. Er wird auf YNB-Minimalmedium gezüchtet, wie in 2.1 beschrieben. Die Konstruktion und die Amplifikation der Plasmide werden durchgeführt, wie in 2.1 beschrieben.
Bei dem nachstehend beschriebenen Beispiel führt die Expression von GRF1 zur Überaktivierung von Hefe-RAS. Solche Hefen sind dann nicht mehr in der Lage, Glykogenreserven herzustellen, wenn sie die prästationäre Wachstumsphase erreichen. Sie werden durch das Fehlen einer braunen Färbung nach Aussetzen gegenüber Ioddämpfen identifiziert.
Durchmustern der Moleküle
Die Durchmusterung erfolgt in einer gemäß den vorstehend beschriebenen Techniken permeabilisierten Hefe.
Tropfen chemischer Verbindungen werden direkt auf die Oberfläche von Kulturschalen aufgebracht, die zuvor mit einer Hefe beimpft wurden, die das gesamte oder einen Teil von GRF1 exprimiert. Man kultiviert die Schalen und setzt sie dann in einer abgeschlossenen Kammer, die Iodkristalle enthält, Ioddämpfen aus. Die Produkte, die das Hefewachstum ermöglichen und das Auftreten der braunen Färbung wiederherstellen, werden als Positive selektiert.
b – Konstitutive Hemmungen/dominant-negative Wirkung:
Man kann sich auch vorstellen, dass die Expression des gesamten oder eines Teils von GRF1 in der Hefe dominant-negativ erfolgt, die Aktivität der CDC25- oder CDC24-Proteine der Hefe hemmt und eine physiologische Störung des Typs eines Wachstumsstopps verursacht, die vollständig oder teilweise durch Moleküle aufgehoben wird, die an dem System aktiv sind.
Verwendete Stämme
Es wird ein Wildtypstamm der Gattung S. cerevisiae verwendet. Er wird auf YNB-Minimalmedium gezüchtet, wie in 2.1 beschrieben. Die Konstruktion und die Amplifikation der Plasmide werden durchgeführt, wie in 2.1 beschrieben.
Transformation der Hefe durch ein Plasmid
Die Wildtyp-Hefe wird durch eine Behandlung mit LiAC/PEG gemäß dem von Gietz et al. beschriebenen Verfahren (49) kompetent gemacht und mit 1 μg Plasmid, das eine induzierbare Expression des gesamten oder eines Teils von GRF1 in der Hefe ermöglicht, transformiert (Beispiel: Die Expression des grf1-Gens wird unter die Kontrolle des Promotors des Gal-4-Gens gestellt, das in Gegenwart von Galactose als einziger Kohlenstoffquelle im Kulturmedium induzierbar ist.)
Bei dem nachstehend beschriebenen Beispiel und unter den Induktionsbedingungen führt die Expression von GRF1 zu einer Störung der zellulären Signalgebung, die die RAS-Proteine in der Hefe verwendet, und äußert sich in einem Wachstumsstopp-Phänotyp.
Durchmustern der Moleküle
Die Durchmusterung erfolgt in einer gemäß den vorstehend beschriebenen Techniken permeabilisierten Hefe.
Tropfen chemischer Verbindungen werden direkt auf die Oberfläche von Kulturschalen aufgebracht, die zuvor mit einer Hefe beimpft wurden, die mit einem induzierbaren GRF1-Expressionsplasmid transformiert, aber zuvor in Abwesenheit des Induktionsmittels gezüchtet wurde. Man kultiviert die Schalen unter Bedingungen, welche die Expression von GRF1 ermöglichen. Die Produkte, die das Wachstum der Hefe zulassen, werden als Positive zurückbehalten.
Man kann sich die Durchführung von Kompetitionssystemen in Hefemutanten (thermosensitiven Mutanten) für RAS (RAS mut TS), die mit einem Säugetier-Ras komplementiert sind, oder CDC42 mut TS, die mit Säugetier-Rac komplementiert sind, vorstellen.
2.3 – Doppel-Hybrid- und reverse Doppel-Hybrid-Systeme/-Protein-Protein-Interaktion
1. Anwendung:
Die Verwendung dieses Systems gestattet die Durchführung einer Durchmusterung an Molekülen, die die physikalische Interaktion zwischen Ras oder Rac/CDC42Hs und GRF1 hemmen können (50, 2).
Die Technik basiert auf der Herstellung eines ersten Fusionsproteins zwischen Ras, CDC42Hs oder Rac und einer DNA-Interaktionsdomäne und eines zweiten Fusionsproteins zwischen (dem gesamten oder der CDC25-ähnlichen oder DH-Domäne von) GRF1 und einer Transaktivierungsdomäne. Die Interaktion zwischen den zwei Hybridproteinen führt zur Aktivierung eines Reportergens (HIS3, LEU2, URA3, CYH2, CAN1, LacZ, GFP usw.). Das System wird in der geeigneten Hefe verwendet (Beispiel: ura3-Mutante, wenn das Reportergen URA3 ist).
Beispiel für ein reverses Doppel-Hybrid-System zum Durchmustern von Molekülen (51): Der Hefestamm CL9 wird als Durchmusterungswerkzeug für Moleküle verwendet, die im Doppel-Hybrid-System störend wirken. Er gestattet den Nachweis einer Protein-Protein-Interaktion. Er kann durch Einführen von Mutationen in der Familie der PDR-Gene und im Gen ERG6, die bei Entgiftungsprozessen beteiligt sind, permeabel gemacht werden.
Er wird auf YNB-Minimalmedium gezüchtet.
Der Escherichia coli-Stamm TG1 mit dem Genotyp supE, hsdΔ5, thi, Δ(lac-proAB), F'[traD36 ProA⁺B⁺ lacI^q lacZΔM15] wird zur Konstruktion von Plasmiden und zur Amplifikation und Isolation von Plasmiden verwendet.
Folgende Plasmide werden verwendet:
Der von Clontech^® gelieferte Vektor pGAD10 ermöglicht die Expression eines Fusionsproteins zwischen dem gesamten oder einem Teil von GRF1 und der Transaktivierungsdomäne von GAL4 (GRF1-TA-Protein) in der Hefe.
Der von Clontech® gelieferte Vektor pGBT9 ermöglicht die Expression eines Fusionsproteins zwischen Ras, Rac oder Cdc42 und der DNA-Interaktionsdomäne von GAL4 (Proteine Ras-BD oder Rac-BD oder Cdc42-BD) in der Hefe.
Anmerkung: Vorteilhafterweise werden die carboxyterminale Farnesylierungsdomäne von Ras oder die Geranylgeranylierungdomäne der Proteine Rac und Cdc42 aus der Konstruktion entfernt. Dadurch lassen sich Proteine erhalten, die nicht an Lipidmembranen binden und effizient in den Zellkern eintreten.
Transformation der Hefe durch ein Plasmid
Die Hefe CL9 wird durch Behandlung mit LiAC/PEG gemäß dem von Gietz et al. beschriebenen Verfahren (49) kompetent gemacht. Sie wird dann mit jeweils 1 μg der Plasmide transformiert, welche die Expression der Fusionsproteine ermöglichen, die das Doppel-Hybrid-System bilden. Deren Expression führt dazu, dass der Stamm sensitiv für Cycloheximid ist.
Ein Produkt, das die Interaktion zwischen den Fusionsproteinen des Doppel-Hybrid-Systems stört, ermöglicht das Wachstum der Hefe auf diesem Mediumtyp. Zur Durchführung einer Durchmusterung wird die Hefe auf die Oberfläche eines Selektionsmediums plattiert, das 10 μg/ml Cycloheximid enthält. Tropfen chemischer Verbindungen werden direkt auf die Oberfläche der Schale aufgebracht. Die selektierten Produkte sind diejenigen, die einen Wachstumshof um die Auftragung ergeben.
Die Durchmusterung erfolgt in einer gemäß den vorstehend beschriebenen Techniken permeabilisierten Hefe.
Die Durchmusterung erfolgt in einer gemäß den vorstehend beschriebenen Techniken permeabilisierten Hefe.
In einem anderen System kann die Hemmung der Protein-Protein-Interaktion durch aktive Moleküle durch die Verringerung der Expression eines Reportergens sichtbar gemacht werden. Dies kann je nachdem durch einen kolorimetrischen, fluorimetrischen oder enzymatischen Test (Beispiel: β-Galactosidase) durchgeführt werden. Die Hemmung des Wachstums kann durch Verwendung eines selektiven Mediums (z. B.: Fluorat-Medium bei Verwendung des Reportergens URA3 oder Canavanin-Medium für CAN1) gemessen werden.
Die Messung der β-Galactosidase-Aktivität wird folgendermaßen durchgeführt:
Der Stamm L40 aus der Gattung S. cerevisiae (Mata, his3D200, trp1-901, leu2-3,112, ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3, URA3::(lexAop)8-LaCZ, GAL4, GAL80) wird als Durchmusterungswerkzeug verwendet. Mit diesem Stamm kann man eine Protein-Protein-Interaktion nachweisen, wenn einer der Protein-Partner mit dem LexA-Protein fusioniert ist (70). Er wurde auf YNB-Minimalkulturmedium gezüchtet.
Der Escherichia coli-Stamm TG1 mit dem Genotyp supE, hsdΔ5, thi, Δ(lac-proAB), F'[traD36 ProA⁺B⁺ lacI^q lacZΔM15] wird zur Konstruktion von Plasmiden und zur Amplifikation und Isolation von Plasmiden verwendet (wie in 2.1 beschrieben).
Folgende Plasmide werden verwendet:
Der von Clontech^® gelieferte Vektor pGAD10 ermöglicht die Expression von Fusionsproteinen zwischen dem gesamten oder einem Teil von GRF1 und der Transaktivierungsdomäne von GAL4 in der Hefe.
Der Vektor pLex9 (pBTM116) ermöglicht die Expression von Fusionsproteinen zwischen Ras, Rac oder Cdc42 und der DNA-Interaktionsdomäne des LexA-Proteins in der Hefe.
Die Hefe wird durch Behandlung mit LiAC/PEG gemäß dem von Gietz et al. beschriebenen Verfahren (49) kompetent gemacht. Sie wird dann mit jeweils 1 μg der Plasmide transformiert, welche die Expression der Fusionsproteine ermöglichen, die das Doppel-Hybrid-System bilden. Deren Expression führt zur Expression von β-Galactosidase.
Ein Blatt Nitrocellulose wird auf die Petrischale aufgelegt, welche den Heferasen und die Tropfen der zu durchmusternden chemischer Verbindungen enthält. Dieses Blatt wird anschließend für 30 Sekunden in flüssigen Stickstoff getaucht, um die Hefen aufzubrechen und so die β-Galactosidase-Aktivität freizusetzen. Nach Auftauen wird das Nitrocellulose-Blatt mit den Kolonien nach oben in einer anderen Petrischale platziert, die ein Whatman-Papier enthält, das zuvor mit 1,5 ml PBS-Lösung (60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄, pH 7), die 15 μl 40 mg/ml X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indoyl-β-D-galactosid) in in N,N-Dimethylformamid enthält, getränkt wurde. Die Schale wird anschließend in einen Inkubator bei 37°C überführt. Der Test gilt als positiv, wenn die Kolonien nach 6 Stunden auf der Membran blau werden.
Es soll darauf hingewiesen werden, dass es im Fall schwacher oder sehr flüchtiger Wechselwirkungen zwischen Proteinen möglich ist, die Einführung von Mutationen in diese in Betracht zu ziehen, um die Wechselwirkung zu verstärken (52).
Zweite Anwendung:
Diese Anwendung verwendet die Eigenschaften der Interaktion von PAK1 (CRIB-Domäne) mit Rac und Cdc42, wenn diese kleinen G Proteine in der an GTP gebundenen Form vorliegen, und von c-Raf1 (RBD-Domäne) mit Ras-GTP. Man kann dann eine Variante des Doppel-Hybrid-Systems in Betracht ziehen, die als Doppel-Hybrid plus eins bezeichnet wird und bei der im Zellkern der gleichen Hefe folgendes exprimiert wird:
(das gesamte oder ein Teil von) GRF1, PAK1 (CRIB-Domäne) in Fusion mit einer Transaktivierungsdomäne von GAL4 und entweder Rac oder Cdc42 Hs in Fusion mit einer DNA-Interkationsdomäne von GAL4 oder
(das gesamte oder ein Teil von) GRF1, c-Raf1 (RBD) in Fusion mit einer Transaktivierungsdomäne von GAL4 und Ras in Fusion mit einer DNA-Interaktionsdomäne von GAL4.
Die carboxyterminale Farnesylierungsdomäne von Ras oder die Geranylgeranylierungdomäne der Proteine Rac und Cdc42 können aus der Konstruktion entfernt werden, wodurch sich Proteine erhalten lassen, die nicht an Lipidmembranen binden und effizient in den Zellkern eintreten.
Die Aktivierung der kleinen G-Proteine durch GRF1 induziert ihre Beladung mit GTP und folglich ihre Interaktion mit ihrem Effektor (PAKT oder Raf-1) und ermöglicht folglich die Expression des Reportergens, wie vorstehend beschrieben.
Die Hemmung der Austauschaktivität des Proteins GRF1 durch kleine Moleküle äußert sich folglich durch die Hemmung der Expression des Reportergens (siehe oben).
Der Hefestamm CL9 wird als Durchmusterungswerkzeug für Moleküle verwendet, die im Doppel-Hybrid-System störend wirken. Er gestattet den Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen. Er kann durch Einführen von Mutationen in der Familie der PDR-Gene und im Gen ERG6, die bei Entgiftungsprozessen beteiligt sind, permeabel gemacht werden.
Er wird auf YNB-Minimalmedium gezüchtet.
Der Escherichia coli-Stamm TG1 mit dem Genotyp supE, hsdΔ5, thi, Δ(lac-proAB), F'[traD36 ProA⁺B⁺ lacI^q lacZΔM15] wird zur Konstruktion von Plasmiden und zur Amplifikation und Isolation von Plasmiden verwendet. Er wird auf LB-Medium gezüchtet.
Folgende Plasmide werden verwendet:
Der von Clontech^® gelieferte Vektor pGAD10 ermöglicht die Expression eines Fusionsproteins zwischen PAK1 (CRIB-Domäne) oder c-Raf1 (BD-Domäne) und der Transaktivatordomäne von GAL4 (Protein PAK1-TA oder c-Raf1-TA) in der Hefe.
Der von Clontech^® gelieferte Vektor pGBT9 ermöglicht die Expression eines Fusionsproteins zwischen Ras, Rac oder Cdc42 und der DNA-Interaktionsdomäne von GAL4 (Proteine Ras-BD oder Rac-BD oder Cdc42-BD) in der Hefe.
Transformation der Hefe durch ein Plasmid
Die Hefe CL9 wird durch Behandlung mit LiAC/PEG gemäß dem von Gietz et al. beschriebenen Verfahren (49) kompetent gemacht. Sie wird dann mit jeweils 1 μg der Plasmide transformiert, welche die Expression der Fusionsproteine und von GRF1 ermöglichen, die das Doppel-Hybrid plus eins-System bilden. Deren Expression führt dazu, dass der Stamm sensitiv für Cycloheximid wird.
Ein Produkt, das die Aktivierung der Fusionsproteine Ras-BD, Rac-BD oder Cdc42-BD des Systems durch GRF1 stört, ermöglicht das Wachstum der Hefe auf diesem Mediumtyp. Zur Durchführung einer Durchmusterung wird die Hefe auf die Oberfläche eines Selektionsmediums plattiert, das 10 μg/ml Cycloheximid enthält. Tropfen chemischer Verbindungen werden direkt auf die Oberfläche der Schale aufgebracht. Die selektierten Produkte sind diejenigen, die einen Wachstumshof um die Auftragung ergeben.
Die Durchmusterung erfolgt in einer gemäß den vorstehend beschriebenen Techniken permeabilisierten Hefe.
Die Spezifität der Produkte für die Aktivierung der Proteine Ras-BD oder Rac-BD oder Cdc42-BD durch GRF1 wird durch einen der anderen beispielhaft beschriebenen Tests validiert.
Andere Techniken zum Sichtbarmachen eines Doppel-Hydrid plus eins-Systems können verwendet werden.
Indem die Protein-Protein-Interaktion gehemmt wird, können die aktiven Moleküle durch eine Verringerung der Expression eines Reportergens nachgewiesen werden. Dies kann je nachdem durch einen kolorimetrischen, fluorimetrischen oder enzymatischen Test durchgeführt werden. Die Hemmung des Wachstums kann durch Verwendung eines selektiven Mediums (z. B.: Fluorat-Medium bei Verwendung des Reportergens URA3 oder Canavanin-Medium für CAN1) gemessen werden.
Es soll darauf hingewiesen werden, dass es im Fall schwacher oder sehr flüchtiger Wechselwirkungen zwischen Proteinen möglich ist, die Einführung von Mutationen in diese in Betracht zu ziehen, um die Wechselwirkung zu verstärken (52).
Zur Durchführung dieser letzteren Beispiele kann der Fachmann auf die Patente US 5,283,173 , US 5,468,614 , US 5,525,490 , US 5,580,736 und US 5,885,779 Bezug nehmen.
Beispiel 5: Verwendung des Proteins GRF1 zur Durchführung der Durchmusterung von Verbindungen durch Messen der Wechselwirkung zwischen GRF1 und den beta-gamma-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine
Es existiert eine physikalische Wechselwirkung zwischen der PH-Domäne von GRF1 und den beta-gamma-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine (7–9). Das Doppel-Hybrid-System in der Hefe (wie im Beispiel 4 beschrieben) scheint das geeignete Werkzeug zur Durchführung einer Durchmusterung zu sein, das den Nachweis der Moleküle ermöglicht, die diese Wechselwirkung stören können. Es kann entweder das gesamte GRF1-Protein oder die PH-Domänen oder die Abfolge der Domänen PH-DH-PH, wie man sie natürlicherweise im Protein GRF1 findet, verwenden.
Beispiel 6: Verwendung von GRF1 in einem zellulären Durchmusterungstest nach Hemmern von GRF1 unter Verwendung transfizierter Zellen
Der Literatur zufolge verleiht eine Überexpression katalytischer Abschnitte von GRF1 der transfizierten Zelle einen transformierten Phänotyp (46, 47).
Der Durchmusterungstest nach Hemmern von GRF1 verwendet stabile Klone von Zellen, die mit grf1 transfiziert sind, für die die Erfinder eine Überexpression des Transgens mittels Western-Blot zeigen konnten.
Die Überexpression von GRF1 verleiht den Zellen die Fähigkeit, auf Agar Klone zu bilden, was gemäß folgendem Protokoll überprüft wird: Die Zellen werden gezählt und in Vollmedium ohne Phenolrot in einer Konzentration von 2,5 × 10⁵ Zellen pro ml resuspendiert.
In die Vertiefungen von Platten mit 96 Vertiefungen wird nacheinander folgendes gegeben:
75 μl "Bottom Layer" (Bodenschicht), die 50% 2 × Kulturmedium ohne Phenolrot und 50% Agarose ((1,2%, "low melting point" Agarose (mit niedrigem Schmelzpunkt), wie zum Beispiel SIGMA (A-6560) Typ VII, in Wasser hergestellt und autoklaviert)),
75 μl "Top Layer", die aus folgender Mischung hergestellt wird:

– 25 ml 1,67 × Medium ohne Phenolrot (500 ml 2 × Medium ohne Phenolrot, 100 ml fötales Kälberserum, 2 × Glutamin und 2 × Penicillin/Streptomycin, 100 ml steriles Wasser), 10 ml Zellsuspension, 15 ml Agarose (1,2%, "low melting point", wie zum Beispiel SIGMA (A-6560) Typ VII, in Wasser hergestellt und autoklaviert).

Sobald sich der Agar verfestigt hat, werden die zu testenden Moleküle in 1 × Medium auf geeignete Konzen trationen verdünnt, und 75 μl werden auf die Agarschichten in den Vertiefungen gegeben.
Die Zellen werden nach zwei Wochen durch eine Calcein-Färbung gezählt: Calcein AM (Molecular Probes C-1430, 4 mM DMSO) wird in HBSS auf 10 μM verdünnt und bei –20°C aufbewahrt. 25 μl Calcein AM werden zu jeder Vertiefung zugegeben und die Zellen werden für mindestens eine Stunde im Inkubator (37°C) belassen. Die Platte wird in einer C0-Apparatur gelesen.

Ein GRF1-Hemmer wird durch Verringerung der Anzahl der Klone auf dem Agar nachgewiesen. Jede immortalisierte Säugetierzelle, die mit einem eukaryotischen Expressionsvektor (Plasmid) transfiziert ist und die Expression des gesamten oder eines Teils (CDC25-ähnliche Domäne oder DH-Domäne) von humanem oder murinem grf1 ermöglicht, kann ebenfalls verwendet werden. Dieser Expressionsvektor verleiht gleichzeitig einen gegen ein Selektionsmittel, wie Hygromycin, Neomycin, Zeocin oder andere, resistenten Phänotyp und ermöglicht es damit, die transfizierten Zellen, die das Transgen exprimieren, zu selektieren und anschließend zu klonieren (mittels FACS oder limitierter Verdünnung). Tabelle: Lokalisierung der funktionellen Domänen der GRF1-Proteine von Säuetieren

Spezies	Mensch	Maus	Ratte
Proteingröße	1275	1262	1244
Pleckstrin-Homologie Nr. 1 (PH)	22–129	22–130	22–129
Dbl-Homologie-(DH-)Domäne für den Austausch an Rac	244–455	248–459	244–455
Pleckstrin-Homologie Nr. 2 (PH)	456–590	460–588	456–582
CDC25-Homologie-Domäne, Domäne für Austausch an Ras	1045–1272	1032–1259	1014–1241

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68 – Emerson, S. D., Madison, V. S., Palermo, R. E., Waugh, D. S., Scheffler, J. E., Tsao, K. L., Kiefer, S. E., Liu, S. P. und Fry, D. C. Solution structure of the Ras-binding domain of c-Raf-1 and identification of its Ras interaction surface Biochemistry 34 (21), 6911–6918 (1995).
69 – Mott, H. R., Carpenter, J. W., Zhong, S., Chosh, S., Bell, R. M. und Campbell, S, L. The solution structure of the Raf-1 cysteine-rich domain: a novel ras and phospholipid binding site Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (16), 8312–8317 (1996).
70 – Vojtek, A. B., S. M. Hollenberg und J. A. Cooper. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell, 74: 205–214. (1993).

((legend for the sequences)) ((page 19)) Liste de Sequences = Sequenzprotokoll ((page 20)) Utilisation de la protéine GRF1 = Verwendung des Proteins GRF1
Schlüssel zu den Figuren
(1B))

Membrane = Membran
Cytoplasme = Cytoplasma
Noyau = Zellkern
Activation de facteurs de transcription = Aktivierung von Transkriptionsfaktoren
Modification de l'expression des Genes = Modifikation der Expression von Genen

((2A))

Score neuronal = neuronale Bewertung
C57B1/6 controles = Kontroll-C57B1/6
C57B1/6 mutantes = mutierte C57B1/6

((2B))

Score neuronal = neuronale Bewertung
129SV controles = Kontroll-129SV
129SV mutantes = mutierte 129SV

((3A))

volume (mm3) = Volumen (mm3)
129SV controles = Kontroll-129SV
129SV mutantes = mutierte 129SV

((3B))

((3C))

surfaces de la lésion = Flächen der Läsion
distance depuis la ligne interaurale = Abstand bis zur Interaurallinie

((3D))

volume de la lésion (mm3) = Volumen der Läsion (mm3)
129SV controles = Kontroll-129SV
129SV mutantes = mutierte 129SV

((4A))

Poids (gr) = Gewicht (g)

((4B))

Leptinemie = Letinämie

((5A))

Poids (gr) = Gewicht (g)

((5B))

Leptinemie = Leptinämie

Claims

Verwendung eines Proteins mit mindestens 85% Identität zu dem Protein Guanin Nucleotide Releasing Factor 1 (GRF1) oder von Zellen, die solch ein Protein exprimieren, in einem Verfahren zum Nachweisen von Verbindungen für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Pathologien oder Störungen des Zentralnervensystems, die mit dem Absterben von Neuronen einhergehen oder mit Fettleibigkeit assoziiert sind.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Nachweisverfahren einen Schritt umfaßt, bei dem das Protein GRF1 phosphoryliert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren einen Schritt umfaßt, bei dem man die Aktivität des Austausches des Proteins GRF1 mit Proteinen der Familie der kleinen G-Proteine, insbesondere Ras, Rac und Cdc42, bestimmt.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren einen Schritt umfaßt, bei dem man die Interaktion zwischen dem Protein GRF1 und den beta-gamma-Untereinheiten von heterotrimeren G-Proteinen bestimmt.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Nachweisverfahren einen Schritt umfaßt, bei dem man zu durchmusternde Verbindungen mit grf1-transformierten Hefen in Kontakt bringt.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Nachweisverfahren einen Schritt umfaßt, bei dem man zu durchmusternde Verbindungen mit grf1-transformierten Hefen, deren CDC25- und/oder CDC24-Gen(e) inaktiviert oder mutiert worden sind, in Kontakt bringt.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Nachweisverfahren einen Schritt umfaßt, bei dem man zu durchmusternde Verbindungen mit Hefen in Kontakt bringt, die ein erstes Hybridprotein, das aus einem Fusionsprotein zwischen Ras, CDC42Hs oder Rac und einer DNA-Interaktionsdomäne besteht, sowie ein zweites Hybridprotein, das aus einem Fusionsprotein zwischen dem gesamten GRF1 oder einem Teil von GRF1 und einer Transaktivatordomäne besteht, exprimieren.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Nachweisverfahren einen Schritt umfaßt, bei dem man zu durchmusternde Verbindungen mit Hefen in Kontakt bringt, die ein Protein mit mindestens 85% Identität zu einem Protein GRF1, PAK1 in Fusion mit einer Transaktivatordomäne, sowie Rac oder CDC42Hs in Fusion mit einer DNA-Interaktionsdomäne exprimieren.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Nachweisverfahren einen Schritt umfaßt, bei dem man zu durchmusternde Verbindungen mit Hefen in Kontakt bringt, die ein Protein mit mindestens 85% Identität zu einem Protein GRF1, Raf1 in Fusion mit einer Transaktivatordomäne, sowie Ras in Fusion mit einer DNA-Interaktionsdomäne exprimieren.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Pathologie um Hirnischämie, Morbus Parkinson oder Morbus Alzheimer handelt.
Verfahren zum Durchmustern oder Nachweisen von Verbindungen für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Pathologien des Zentralnervensystems, die mit dem Absterben von Neuronen einhergehen, umfassend die folgenden Schritte: (i) Kultivieren von Zellen, die aus Zellen, die das Protein GRF1 exprimieren, bestehen, in Gegenwart eines markierten phosphorylierten Substrats und einer Testverbindung, (ii) Lysieren dieser Zellen, sowie (iii) Bestimmen der Menge des markierten Proteins GRF1.
Verfahren zum Durchmustern oder Nachweisen von Verbindungen für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Pathologien des Zentralnervensystems, die mit dem Absterben von Neuronen einhergehen, bei dem man zuvor die folgenden Schritte durchführt: (i) Kultivieren von Zellen, die aus Zellen, die das Protein GRF1 exprimieren, bestehen, in Gegenwart einer Testverbindung, (ii) Lysieren dieser Zellen, sowie (iii) Bestimmen der Menge an phosphoryliertem GRF1 mit einem Antikörper, der für eine phosphorylierte Aminosäure spezifisch ist.
Verfahren zum Durchmustern oder Nachweisen von Verbindungen für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Pathologien des Zentralnervensystems, die mit dem Absterben von Neuronen einhergehen, umfassend die folgenden Schritte: (i) Vorlegen des Proteins GRF1, eines ganzen Proteins bzw. eines Teils eines Proteins der Familie der kleinen G-Proteine, das mit markiertem GDP oder GTP beaufschlagt wurde, sowie einer Testverbindung, (ii) Versetzen mit unmarkiertem GTP bzw. GDP sowie (iii) Bestimmen der Menge an markiertem Protein G.
Verfahren zum Nachweisen von Verbindungen für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Pathologien des Zentralnervensystems, die mit dem Absterben von Neuronen einhergehen, mittels in-vitro-Durchmustern von Zellen umfassend die folgenden Schritte: (i) Transfektion von immortalisierten Säugetierzellen mit einem Vektor, der ein grf1-Transgen exprimiert und diesen Zellen eine Resistenz gegen ein Selektionsmittel verleiht, (ii) Selektion und Klonieren dieser transfizierten Zellen, die das Transgen exprimieren, und Klonieren in einem Agarwachstumsmedium, (iii) Versetzen der Testverbindungen mit einer Suspension dieser Zellen, sowie (iv) Nachweisen der GRF1-Hemmer-Verbindungen durch zahlenmäßige Verringerung der Klone.