ES2304393T3 - Utilizacion de la proteina grf-1 para el cribado de moleculas. - Google Patents
Utilizacion de la proteina grf-1 para el cribado de moleculas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2304393T3 ES2304393T3 ES01963064T ES01963064T ES2304393T3 ES 2304393 T3 ES2304393 T3 ES 2304393T3 ES 01963064 T ES01963064 T ES 01963064T ES 01963064 T ES01963064 T ES 01963064T ES 2304393 T3 ES2304393 T3 ES 2304393T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- grf1
- protein
- cells
- ras
- proteins
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Conductive Materials (AREA)
- Superconductors And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Utilización de una proteína que presenta una identidad de al menos 85% con una proteína Factor 1 de Liberación de Nucleótido de Guanina (GRF1) o de células que expresen dicha proteína, en un método de detección de compuestos destinados a la prevención y/o al tratamiento de patologías o trastornos del sistema nervioso central que impliquen una muerte neuronal o estén asociados a la obesidad.
Description
Utilización de la proteína GRF1 para el cribado
de moléculas.
La presente invención trata del dominio de la
biología y de la señalización celular en las neuronas. Más
precisamente, la presente invención se refiere a nuevas
utilizaciones de toda o parte de la proteína GRF1 (Factor 1 de
Liberación de Nucleótido de Guanina) para el cribado de moléculas
que presentan una actividad de protección contra la muerte neuronal
y el tratamiento de la obesidad. La proteína GRF1, que se representa
esquemáticamente en la Figura 1A, ha sido descubierta originalmente
por el hombre por su capacidad para modular el estado de activación
de la proteína p21Ras. Las secuencias de proteínas GRF1 humanas, de
ratón y de rata son respectivamente las secuencias SEC ID Nº 1, SEC
ID Nº 2 y SEC ID Nº 3. La solicitud de patente internacional WO
93/21314 y la patente de EE.UU. 5.656.595 describen la
identificación, el aislamiento así como la caracterización de la
forma humana de esta proteína.
La patente internacional WO0040718 describe
mutantes en las posiciones 1.184 y 1.124 de la proteína GNRF de
ratones. Según esta solicitud estas proteínas o los ácidos nucleicos
que las codifican podrían ser utilizados con fines terapéuticos, en
particular en el tratamiento de tumores.
GRF1 posee diversos dominios funcionales
denominados dominios PH, IQ, DH y CDC25 cuyo significado e
implicación se precisan a continuación.
La localización de los dominios funcionales de
GRF1 en las secuencias proteicas humanas, de ratones y de rata, se
indica en la tabla a continuación.
GRF1 consta de un dominio DH (homología Db1) que
presenta una fuerte homología de secuencia con una región del
proto-oncogén Dbl. Dbl es un factor de intercambio
de proteínas G pequeñas de la familia Rho/Rac/Cdc42Hs implicadas en
la regulación de diversas señales celulares que controlan o la
motilidad del citoesqueleto o la activación de las cinasas
denominadas de "estrés" (1).
En la proteína Dbl, la actividad de intercambio
de GDP/GTP en las proteínas de la familia Rho la lleva el dominio
DH. Éste se encuentra en otros factores de intercambio de proteínas
G de pequeño peso molecular entre ellas las proteínas GRFs y las
proteínas SOSs. Se han publicado resultados que sugieren que el
dominio DH de GRF1 es funcional en Rac (activación de Rac en forma
GTP) y conduce a la activación de la JNK1 en células en cultivo que
sobreexpresan la subunidad beta/gamma de las proteínas G
heterotriméricas (2). Por otro lado, se ha sugerido igualmente el
papel funcional del dominio DH de GRF1 en los procesos neuronales
por los resultados de las experiencias de mutagénesis dirigida que
muestran que la activación de la proteína GRF1 por el calcio
requiere un dominio DH íntegro
(3, 4).
(3, 4).
El calcio juega un papel importante en la
regulación de las actividades neuronales: secreción de
neuromediadores, crecimiento de las neuronas, muerte/supervivencia
celular, adaptación y estimulación de la transmisión sináptica,
activación transcripcional de ciertos genes. Estudios realizados en
cultivos primarios de neuronas de córtex de ratas recién nacidas
han demostrado que la activación de Ras por GRF1 aumenta en
presencia de calcio. Esta activación está regulada por la fijación
de la calmodulina en el dominio IQ de GRF1
(3-5).
La actividad de intercambio de GRF1 para las
proteínas Ras (Ha, Ki y N-Ras) es llevada en cuanto
a ella se refiere por la región homóloga a CDC25 de
Saccharomyces cerevisiae, situada en la extremidad
carboxi-terminal de la molécula (6).
GRF1 posee dos dominios PH (Homología
Pleckstrin) que son dominios de interacción entre proteínas y que
están implicados probablemente en el enlace en las subunidades
beta-gamma de proteínas G
hetero-triméricas (7-9).
Hoy se conocen con más detalle las funciones de
la proteína GRF1, descubierta inicialmente por su actividad de
intercambio en el proto-oncogén Ras. Contrariamente
a las proteínas SOS1, SOS2 y GRF2, otros tres factores de
intercambio de Ras que se expresan de manera ubicua, se admite ahora
que la expresión del gen grf1 está limitada al sistema nervioso
central en seres humanos, ratones y ratas (6, 10, 11).
En el cerebro, se ha estudiado extensamente la
regionalización de esta expresión. En ratas, es importante en el
hipocampo, el neocórtex, algunos núcleos profundos y células en
grano del lóbulo anterior del cerebelo (12). En ratones, se ha
descrito igualmente que es abundante en la amígdala (13) y el
hipotálamo (14).
Entre los diferentes tipos celulares presentes
en el sistema nervioso central, la expresión del gen grf1 parece
limitar a las neuronas (15). Este gen experimenta en el tiempo, un
control transcripcional estricto puesto que no se expresa durante
la vida embrionaria y no comienza a transcribirse hasta el momento
del nacimiento para alcanzar un nivel máximo en torno al día quince
(14, 15).
La expresión de grf1 está controlada por un
mecanismo transcripcional particular denominado huella parental que
se traduce en ratones por una expresión del gen a partir del alelo
de origen paterno mientras que el alelo materno es silencioso (14,
16). Es interesante señalar que algunos genes
(proto-oncogenes) normalmente sometidos a huella
parenteral están implicados en la proliferación celular y la
aparición de tumores cuando se produce un malogro del mecanismo de
la huella y que se transcriben los dos alelos.
Entonces la vía de activación de Ras por los
factores de intercambio SOS está bien documentada, parece ser que
se sabe muy poco de cosas sobre las vías de señalización que
utilizan GRF1 y sobre su función biológica in vivo.
Parece que contrariamente a los otros factores
de intercambio de Ras de la familia SOS, GRF1 no traduce las
señales que resultan de la fijación de ligandos en los receptores,
en actividad de la tirosina cinasa, sino más bien las resultantes
de receptores en siete dominios transmembrana acoplados a las
proteínas G hetero-triméricas
(17-19).
Finalmente se observará que algunas de las
funciones biológicas de GRF1 se han podido abordar in vivo
gracias al estudio del fenotipo de ratones portadores de una
mutación inactivante del gen grf1 - ratón knock-out
o KO, obtenido por la técnica de recombinación homóloga - que no
expresa más GRF1 (13, 14). Estos animales son poco competentes,
vistos deficientes en los ensayos de aprendizaje y de memorización
que aplican los estímulos "aversivos". Según los autores de
este trabajo, la totalidad de la región del cerebro denominada
amígdala será alterada en ratones mutantes y será responsable del
fenotipo observado (13). Sin embargo no se da ninguna indicación
por lo que se refiere a una posible utilización de estos ratones
para el cribado de moléculas que presentan una actividad
terapéutica.
Las lesiones físicas del cerebro tales como la
isquemia cerebral o el trauma cerebral (lesiones agudas o
accidentales) y las enfermedades neurodegenerativas tales como la
enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, continúan
siendo una de las principales causas de mortalidad y de morbilidad
en los países desarrollados.
Se ha demostrado que la apoptosis constituye uno
de los mecanismos que conduce a estas lesiones.
Se ha evaluado con éxito un número considerable
de moléculas que actúan en diversos procesos fisiopatológicos
causados por lesiones en el sistema nervioso central, en
investigación experimental en diferentes modelos y especies. Aunque
algunas de ellas han sido o son utilizadas en ensayos clínicos para
estos trastornos, ninguna de las moléculas ensayadas ha demostrado
eficacia real durante los estudios en fase III o durante su
introducción en el mercado.
La única medicación utilizada actualmente para
el tratamiento de la isquemia cerebral consiste en la inyección de
trombolíticos sólo a pacientes que no presenten riesgos
hemorrágicos.
La solicitante ha demostrado por el estudio de
ratones que portan una mutación inactivante del gen grf1 que la
ausencia de expresión de la proteína GRF1 confiere una protección
contra la lesión física del cerebro durante una isquemia
cerebral.
Por otro lado, en algunas décadas, la obesidad
ha llegado a ser un problema principal de salud pública en los
países industrializados donde afecta ahora al 20 a 30% de la
población. Estas cifras deberían aún crecer de manera alarmante en
los años venideros. Debido a sus orígenes multifactoriales que
llevan sus fuentes a niveles más o menos importantes entre los
factores medioambientales de una parte (comportamientos
alimenticios, acceso al alimento, gasto energético,...) y múltiples
orígenes genéticos por otra parte, la obesidad constituye un
verdadero desafío para la medicina.
La fisiopatología de las enfermedades asociadas
al peso es compleja y heterogénea. La obesidad con frecuencia está
asociada a un riesgo incrementado de fallecimiento, a enfermedades
cardiovasculares, a una diabetes no dependiente de la insulina y a
una resistencia a la insulina. Los trastornos psicológicos y
comportamentales como la ansiedad y la depresión vienen a añadirse
incluso al cuadro clínico de la enfermedad. Por otro lado y
fenotípicamente en el lado opuesto, la pérdida excesiva de peso en
los contextos medioambientales (desnutrición) o patológicos
(anorexia mental por ejemplo) particulares, está asociada con una
morbilidad y una mortalidad importantes. Por estas diferentes
razones, la identificación de un gen que desempeñe un papel en el
aumento del peso, presenta un interés considerable que interesa en
el tratamiento de la obesidad o el de la pérdida de peso
excesiva.
La solicitante ha demostrado, por el estudio en
ratones portadores de una mutación inactivante del gen grf1 que la
expresión de la proteína GRF1 es indispensable en la regulación de
la expresión de la leptina. La leptina es una citocina asociada con
la sensación de saciedad que juega un papel principal en el control
del aumento de peso (20).
En el contexto científico tal como se acaba de
resumir, aún existe la necesidad de una mejor comprensión de los
diferentes mecanismos en juego que puedan conducir especialmente a
los trastornos que implican una apoptosis neuronal o estén
asociados al metabolismo de la leptina.
Existe además una necesidad de medicamentos
eficaces en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso
central y en el tratamiento de la obesidad.
La solicitante está vinculada a la búsqueda de
compuestos destinados a la prevención y/o al tratamiento de
trastornos que afectan especialmente al sistema nervioso central y a
la obesidad.
Ha demostrado con ayuda de ratones portadores de
una mutación inactivante del gen grf1 como modelo de estudio, que
GRF1 interviene en estos trastornos.
La presente invención se refiere pues a la
utilización de una proteína que presenta una identidad de al menos
85% con una GRF1 o de células que expresan una proteína que presenta
una identidad de al menos 85% con una GRF1, en los procesos de
detección de compuestos destinados a la prevención y/o al
tratamiento de patologías o de trastornos del sistema nervioso
central que impliquen una muerte neuronal, tal como la
apoptosis.
Está relacionada además con compuestos
destinados a la prevención y/o al tratamiento de patologías o
trastornos del sistema nervioso central que impliquen una muerte
neuronal o estén asociados con la obesidad.
La proteína GRF1 es preferentemente de origen
humano. Puede ser sin embargo de otro origen y en particular ser la
proteína GRF1 de ratones o de un mamífero muy distinto. También
puede ser toda proteína que presente una identidad de al menos 85%
y preferentemente 90% con una proteína GRF1 y en particular con la
proteína GRF1 humana que presente la secuencia SEC ID Nº 1 o con
una proteína GRF1 de origen animal tal como las que presenten las
secuencias SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº 3. Se interpreta por parte de la
proteína GRF1 una secuencia de aminoácidos que comprende una parte
funcional de la proteína GRF1 y en particular las secuencias que
corresponden a todo o parte de uno de los dominios PHs, DH o CDC25
de las proteínas GRF 1.
Una de las ventajas de los procedimientos de
cribado objeto de la presente invención reside en particular en la
posición de GRF1 anterior de JNKs (Figura 1B) lo que presenta como
ventaja poder regular de manera específica las vías de activación
de los JNKs que pasarán por GRF1.
Otra ventaja reside en poner de manifiesto la
ausencia de toxicidad de estos compuestos, siendo viables los
ratones inactivados por grf1 y de buena salud.
El procedimiento de cribado según la presente
invención que utiliza todo o parte de la proteína GRF1 puede
comprender las etapas de valoración de:
- -
- la fosforilación de la proteína GRF1 o de
- -
- la actividad de intercambio de la proteína GRF1 en, o las proteínas de la familia Ras (Ha, K, N-Ras) o las proteínas Rac y Cdc42; de manera directa o indirecta o de
- -
- la interacción entre la proteína GRF1 y o las subunidades beta-gamma de las proteínas G heterotriméricas o las proteínas G pequeñas de la familia Ras o Rac y Cdc42.
- -
- la transformación celular por GRF 1.
Así según un primer modo de aplicación
ventajosa, la presente invención se refiere a un procedimiento de
cribado o de detección de compuestos destinados a la prevención y/o
al tratamiento de patologías del sistema nervioso central que
implique una muerte neuronal comprendiendo las etapas que consisten
en:
- (i)
- poner en cultivo células que expresen la proteína GRF1 en presencia de un compuesto fosforilado marcado y un compuesto que se vaya a ensayar,
- (ii)
- lisar dichas células y
- (iii)
- medir la cantidad de proteína GRF 1 marcada.
El lisado celular obtenido en la etapa (ii) se
puede incubar en los pozos de placas de microtitulación recubierto
previamente con un anticuerpo anti-GRF1.
La fosforilación de GRF1 se puede medir también
con ayuda de un anticuerpo específico de un aminoácido
fosforilado.
Así según otro modo de aplicación ventajosa, la
presente invención se refiere a un procedimiento de cribado o de
detección de compuestos destinados a la prevención y/o al
tratamiento de patologías del sistema nervioso central que
impliquen una muerte neuronal, comprendiendo las etapas que
consisten en:
- (i)
- poner en cultivo células que expresen la proteína GRF1 en presencia de un compuesto que se vaya a ensayar,
- (ii)
- lisar dichas células
- (iii)
- medir la cantidad de GRF1 fosforilada.
La medición de la cantidad de GRF1 fosforilada
se efectúa preferentemente con ayuda de un anticuerpo específico de
un aminoácido fosforilado.
Se pueden poner dichas células en cultivo en un
medio que contenga ortofosfato marcado con P32 o con P33.
La fosforilación de la proteína GRF1 se puede
realizar en dichas células neuronales por adición de carbacol en el
medio de cultivo o bien en líneas celulares carentes de suero
durante una noche, después puestas de nuevo en incubación en
presencia de suero o incluso en líneas celulares cotransinfectadas
por los ADNc codificantes para las subunidades
beta-gamma de las proteínas G triméricas
\beta1\gamma2 o \beta1\gamma5, después carentes de suero
durante una noche, después puestas de nuevo en incubación en
presencia de suero.
Según otro modo de realización de la invención
el cribado comprende la medición de la actividad de intercambio de
GRF1 en ciertas proteínas de la familia de las proteínas G pequeñas
(Ras, Rac, Cdc42). Así según otro modo de ventajosa, la presente
invención se refiere a un procedimiento de cribado o de detección de
compuestos destinados a la prevención y/o al tratamiento de
patologías del sistema nervioso central que impliquen una muerte
neuronal, comprendiendo las etapas que consisten en:
- (i)
- poner todo o parte de la proteína GRF1, en presencia de una proteína de la familia de las proteínas G pequeñas cargada en GDP o en GTP marcado y un compuesto que se vaya a ensayar,
- (ii)
- añadir respectivamente GTP o GDP no marcado
- (iii)
- medir la cantidad de proteína G marcada.
Una de dichas proteínas de la familia de las
proteínas G pequeñas puede ser especialmente Ras (53, 54, 55), Rac
(56, 57, 58) o Cdc42 (59).
La medición de la actividad de intercambio de la
proteína GRF1 en las proteínas de la familia Ras o las proteínas
Rac y CDC42 se puede realizar in vitro en un medio acelular
por incubación en pozos de placas de microtitulación de una mezcla
de reacción que comprenda a dichas proteínas G pequeñas en estado
recombinante cargadas en GDP tritiado, GTP frío y todo o parte de
la proteína GRF1 en estado recombinante. Se extrae una fracción
alícuota de dicha mezcla de reacción y se filtra por una membrana y
en que se mide la radioactividad que está retenida o incluso se
hace pasar el contenido de cada uno de dichos pozos por una columna
PD 10 y en que se mide la radioactividad del eluyente.
Dichas proteínas G pequeñas en estado
recombinante se pueden elegir del grupo constituido por las
proteínas Ras, Cdc42 o Rac salvajes o en forma de proteínas de
fusión y expresadas en E. coli o en células de mamíferos, o
en una forma etiquetada (tagged en inglés) en un baculovirus,
expresadas en células de insectos y purificadas. La cantidad de los
nucleótidos intercambiados también se puede poner de manifiesto por
retención.
Ventajosamente se añaden proteínas de fusión
GST-Raf (dominio RBD) o GST-PAK
(dominio CRIB) y una mezcla de IgG anti-GST y
proteína A PVT SPA (Análisis de Centelleo por Proximidad) acoplada a
microesferas (Amersham) y en que se mide de la fluorescencia de
dichas placas de microtitulación después de centrifugación. Las
formas asociadas al GDP no permiten la interacción. Las secuencias
de PAK y Raf han sido publicadas (véanse respectivamente las
referencias 60 a 64 y 65 a 69).
Se incuba la proteína recombinante Ras (o Rac)
con GDP frío. Se forma Ras-GDP (o
Rac-GDP). Después se añade GTP tritiado y GRF1.
Tiene lugar la reacción de intercambio. Se forma
Ras-GTP tritiado. Al cabo de 60 minutos se añade
una proteína de fusión GST-Raf (o
GST-PAK si se trabaja con Rac). La proteína de
fusión interreacciona con Ras-GTP cuya cantidad en
el medio depende de la actividad de intercambio de GRF1. Se añaden
las microesferas que están acopladas a un anticuerpo
anti-GST. El complejo
GST-Raf/Ras-GTP tritiado se fija en
las esferas. Esta tiene la capacidad de centellear cuando están
cerca de una fuente radioactiva. Permiten entonces cuantificar la
proporción de Ras-GTP y la actividad de intercambio
de GRF1 en el medio.
También se puede aplicar el procedimiento de
cribado en un sistema celular.
Así se puede realizar poniendo en contacto los
compuestos que se tienen que cribar y una levadura transformada por
grf1 y cuyos genes CDC25 y/o CDC24 han sido inactivados o mutados.
Ventajosamente, la membrana de una de dichas levaduras se
permeabiliza previamente y/o al menos uno de los genes implicados en
los mecanismos de destoxificación ha sido inactivado.
Se puede realizar también simplemente en una
levadura S. cerevisiae transformada por grf1. Se mide
entonces el cese de los trastornos metabólicos creados por la
expresión de grf1.
El procedimiento de cribado también puede ser un
sistema denominado de doble híbrido de interacción
proteína-proteína que consta de una primera
proteína híbrida constituida por una proteína de fusión entre Ras,
CDC42Hs o Rac y un dominio de interacción con el ADN y una segunda
proteína híbrida constituida por una proteína de fusión entre todo
o parte de GRF1 y un dominio transactivador. También puede ser un
sistema denominado "doble híbrido más uno" que consiste en
expresar en el núcleo de una misma levadura S. cerevisiae o
todo o parte de GRF1, PAK1 (dominio CRIB) fusionada con un dominio
transactivador y o Rac o CDC42Hs fusionadas con un dominio de
interacción con el ADN, o todo o parte de GRF1,
c-Raf1 (RBD) fusionada con un dominio transactivador
y Ras fusionada con un dominio de interacción con el ADN.
Finalmente, el cribado puede ser un cribado
celular que comprenda las etapas que consisten en:
- (i)
- transinfectar células de mamíferos inmortalizadas por un vector que exprese un transgen gsf1 (todo o parte) y que confiera a dichas células el fenotipo transformado y una resistencia a un agente de selección.
- (ii)
- seleccionar dichas células transinfectadas y que expresen el transgen y clonarlas en un soporte de crecimiento en agar, la transformación por GRF1 que permite a las células crecer sin adherirse.
- (iii)
- añadir dichos compuestos que se vayan a ensayar a una suspensión de dichas células y
- (iv)
- detectar dichos compuestos inhibidores de GRF1 por disminución del número de clones obtenidos en el medio de crecimiento.
Como ya se ha mencionado, el objeto de la
presente solicitud es la búsqueda de compuestos destinados a la
fabricación de medicamentos para la prevención y/o el tratamiento de
diversas patologías del sistema nervioso central (A) y de la
obesidad (B). Debido al papel central de GRF1, también se pueden
utilizar los procedimientos objeto de la presente solicitud para
cribar moléculas que presenten una actividad en contra de ciertas
enfermedades cardiovasculares (B), procesos angiogénicos
patológicos (C), así como con respecto a otros blancos biológicos
(D).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención permite el cribado de
compuestos que antagonizan el efecto de la actividad de GRF 1 y que
confieren una protección contra la muerte neuronal inducida por
isquemia cerebral, traumatismo craneal o cerebral y traumatismo
espinal o medular.
Los procedimientos objeto de la presente
invención se pueden utilizar para cribar moléculas para el
tratamiento o la prevención de la neurodegeneración que implica la
apoptosis neuronal, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de
Alzheimer, la demencia senil, corea de Huntington, esclerosis
lateral amiotrófica, epilepsias, esclerosis en placas, trastornos
cerebrales y espinocerebrales, trastornos cognitivos, traumatismo
craneal, traumatismo medular, traumatismos del oído interno,
traumatismos de la retina, glaucomas, tumores malignos del sistema
nervioso.
Los procedimientos objeto de la presente
invención se pueden utilizar para cribar moléculas para el
tratamiento o la prevención de psicosis incluida esquizofrenia,
trastornos de ansiedad, depresión, ataques de pánico, neuropatías
periféricas, migraña, temblores, trastorno
compulsivo-obsesivo, trastornos tímicos, discinesias
tardías, trastornos bipolares, trastornos del movimiento inducido
por medicamentos, distonías, choques endotoxémicos, choques
hemorrágicos, hipotensión, insomnio, enfermedades inmunológicas,
vómitos, trastornos del apetito (bulimia, anorexia), obesidad,
trastornos de la memoria, en la retirada gradual de la medicación en
tratamientos crónicos y abuso del alcohol o de medicamentos
(opioides, barbitúricos, cannabis, cocaína, anfetamina,
fenciclidina, halucinógenos, benzodiazepinas por ejemplo), como
analgésicos o potenciadores de la actividad analgésica de
medicamentos narcóticos y no narcóticos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención permite la búsqueda de
compuestos que antagonicen la actividad de GRF1 y que jueguen un
papel protector contra el aumento de peso, principalmente en
individuos adultos.
GRF1 intervendría en la regulación antes de la
síntesis de leptina y esto de forma directa o indirecta. La leptina
es una hormona conocida por inhibir la liberación de
Neuropéptido-Y (NPY), molécula que estimula el
apetito y es producida por las neuronas del núcleo arqueado del
hipotálamo (20, 21). Controla igualmente la síntesis de un péptido
anorexígeno: CART (Transcripción Regulada de Cocaína y Anfetamina)
en el núcleo arqueado (22). Las actividades antagonistas de estos
dos neuropéptidos tienen como consecuencia equilibrar los efectos
de la señal de la leptina en la toma de alimentos. La leptina
estimula igualmente el circuito anorexígeno
alfa-MSH/Receptor de Melanocortina 4
(23-25).
GRF1 es susceptible de participar en las vías de
señalización que utilizan estos neuromediadores (que se asocian a
los receptores en siete dominios transmembrana). Su ausencia en
nuestros ratones mutantes podría traducirse por una señal de tipo
"saciedad y/o aumento del gasto energético" con, como
consecuencia, una reducción de la masa adiposa y una
hipoleptinemia.
El endotelio vascular se presenta como una nueva
criba de la leptina. Resultados recientes demuestran que la leptina
estimula la proliferación de las células endoteliales y la
angiogénesis in vivo (26, 27).
La angiogénesis juega un papel importante en la
embriogénesis, la cicatrización, el ciclo menstrual pero también en
situaciones patológicas como la vascularización de tumores, artritis
reumatoide, soriasis, sarcoma de Kaposi, retinopatías diabéticas y
aterosclerosis.
Los presentes autores han demostrado que los
ratones adultos knock-out por el gen grf1 tienen un
índice de leptina bastante más bajo que el de los animales de
control. Es posible que los animales mutantes presenten una cierta
forma de protección contra la aparición de procesos angiogénicos
patológicos y por consiguiente contra el crecimiento y la
diseminación de tumores y contra todas las patologías
precitadas.
Los antagonistas de GRF1 que conducirían a una
disminución de la leptinemia podrían tener un papel protector
contra estas enfermedades. También se puede considerar un papel
contraceptivo.
\vskip1.000000\baselineskip
La leptina está implicada en el
desencadenamiento de la pubertad y el control de la reproducción
(28-32).
La leptina juega igualmente un papel en la
regulación de la respuesta inmunitaria regulada por los linfocitos T
(33).
Los moduladores de la actividad de GRF1 podrían
tener un efecto en la función inmunitaria y los mecanismos de la
reproducción. Esta última hipótesis parece verificarse por otra
parte, puesto que las observaciones de los presentes autores
indican una pubertad retardada y una menopausia precoz en los
ratones grf1 KO. Este fenómeno puede ser debido en parte a la
disminución del índice de leptina o a la desregulación de la
síntesis de hormonas sexuales controladas por el eje
hipotálamo-hipofisario.
Las propiedades inhibidoras de la leptina con
respecto a la síntesis ósea se han puesto de manifiesto
recientemente. Reacciona inhibiendo la actividad de los
osteoblastos, una población de células responsables de la formación
del hueso (34). Modificar la leptinemia reaccionando en GRF1 podría
permitir tratar las enfermedades asociadas con una disminución de
la densidad ósea como por ejemplo la osteoporosis o a la inversa
células asociadas a una calcificación importante como por ejemplo
la osteopetrosis.
Los trabajos realizados en ratones
knock-out por el gen NPY han demostrado que estos
animales manifestaron un gusto pronunciado por el alcohol y eran
más resistentes a sus efectos sedantes e hinópticos que los ratones
salvajes (35). La leptina juega un papel negativo en la liberación
de NPY (20, 21). Los moduladores de la actividad de GRF1 se podrían
utilizar en el tratamiento del comportamiento alcohólico y en el
tratamiento de trastornos del
sueño.
sueño.
Otros objetos, características y ventajas
complementarias se van a describir a continuación con referencia a
los ejemplos de realización que siguen, dados a título puramente
ilustrativo y no limitante y en referencia a los dibujos adjuntos
en los que:
- la Figura 1A es una representación esquemática
de la proteína GRF1,
- la Figura 1B es un esquema que reagrupa las
principales vías de señalización que implican la función de la
proteína GRF1,
- las Figuras 2A y 2B son histogramas que
representan exámenes neurológicos,
- las Figuras 3A a 3B son histogramas que
ilustran la extensión de lesiones cerebrales respectivamente
globales y de córtex,
- la figura 3C ilustra lesiones de diferentes
zonas de la región cortical,
- la figura 3D ilustra el volumen de las
lesiones de la región cortical comprendido entre 3, 22 y 1,76.
- las Figuras 4A y 4B ilustran respectivamente
el peso y la leptinemia de ratones mutantes grf1 KO (señalados -/-)
y salvajes (señalados +/+) y
- las Figuras 5A y 5B ilustran respectivamente
el peso y la leptinemia de ratones mutantes KO grf1 y salvajes
después de un ayuno de 48 h.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Los ratones KO grf1 ofrecen la posibilidad de
buscar el impacto de las vías dependientes de la proteína GRF1 en
la isquemia cerebral. Los ratones KO y de tipo salvaje son sometidos
a una isquemia cerebral focal permanente. Los parámetros medidos
para determinar la incidencia de GRF1 en el dominio isquémico
resultan (i) de un examen de la función neurológica y (ii) de una
cuantificación histológica de las lesiones cerebrales.
Se utilizan ratones macho de
22-37 g procedentes de los fondos genéticos C57B1/6
y 129SV anestesiados con halotano al 1,4% en una mezcla de óxido
nitroso-oxígeno (70: 30). Se realiza una incisión
entre el ojo y la oreja derecha. Se reclina el músculo temporal. Se
realiza una craniotomía al nivel del hueso temporal, que permite
acceder a la arteria cerebral media. Esta se cauteriza por
electrocoagulación. Se provoca entonces una isquemia cerebral focal
permanente por oclusión de la arteria cerebral media derecha (MCA.O,
(36)). Durante la cirugía, tanto la temperatura del músculo
temporal como la temperatura corporal se mantienen en normotermia.
La incisión se sutura a continuación y se devuelven los animales a
sus jaulas en una habitación calentada a
24-26ºC.
Se dividen los ratones en grupos como sigue:
Ratones deficientes para la expresión de GRF1
(ratones KO): mutantes C57B1/6 (n = 10), mutantes 129SV (n =
21).
Los ratones de tipo salvaje utilizados como
muestras son controles C57B1/6 (n = 10) y controles 129 SV (n =
20).
Para el examen neurológico se procede como
sigue:
Antes de isquemia, después 1 h y 24 h después de
isquemia, se realiza un examen neurológico, inicialmente descrito
en ratas (37) y ligeramente modificado por los presentes autores.
Durante el examen se señalan diferentes unidades: 0 (normal), 1
(flexión de la pata anterior), 2 (movimiento circular), 3 (flexión
de la pata anterior y torsión del tórax), 4 (pérdida de reflejos de
recuperación).
Como se puede constatar en las Figuras 2A y 2B,
todos los ratones revelan un déficit neurológico significativo, por
comparación con su propia evaluación de preisquemia neuronal, 1 h y
24 h post-MCA.O. En los ratones C57B1/6, no se
observa ninguna diferencia entre los ratones de tipo salvaje y los
ratones KO en el conjunto de puntos examinados en el transcurso del
tiempo. Al contrario, comparado con los ratones de tipo salvaje, los
ratones 129SV-KO presentan un déficit netamente
menos pronunciado 1 h (p<0,01) y 24 h (p<0,05)
post-isquemia.
Se procede como sigue: Después de la notación de
su "neurovaloración", se sacrifican los ratones y se extraen
los cerebros rápidamente y se congelan en isopentano líquido a -
30ºC. Las secciones coronales de 40 \mum de espesor se acoplan a
diferentes niveles estereotáxicos con un criostato y se colorean a
continuación con violeta de cresilo al 0,5%. Se miden las zonas de
lesión con un analizador de imagen (Leica Q500) a diferentes
niveles coronales. Se calcula a continuación el volumen de las
lesiones cerebrales por integración de las superficies.
En los ratones C57B1/6, no se observa una
diferencia significativa entre los ratones de tipo salvaje y los
ratones KO (resultados no ilustrados).
Como se puede constatar en las Figuras 3A a 3B,
en los ratones 129SV, no se observa una reducción significativa
global o cortical de la lesión cerebral.
Sin embargo, se observan reducciones
significativas de las zonas de lesión en ciertos niveles
estereotáxicos (fig 3C), correspondiendo este resultado a una
reducción del 23% (p<0,05) de la lesión en esta región específica
(fig 3D).
Los resultados descritos en el Ejemplo 1
anterior muestran que la ausencia del gen grf1 tiene como
consecuencia una mejor recuperación funcional en los ratones
isquémicos KO-129SV.
La reducción de las lesiones en los niveles
coronales específicos podría corresponder a las estructuras
implicadas en las funciones motrices y
sensori-motrices examinadas (especialmente el
neocórtex y el cerebelo), en las que el gen grf1 podría estar
fuertemente expresado (12). Por el contrario, no se observa efecto
en los ratones de fondo genético C57B1/6.
La inactivación del gen grf1 podría interrumpir
una de las vías de señalización que conduce a la apoptosis. Dicho
de otro modo, los resultados señalados anteriormente sugieren que la
proteína GRF1 participa en la señalización que conduce a la
apoptosis neuronal interviniendo en la vía de activación de las
cinasas del estrés por activación de una o varias de las proteínas
G pequeñas de la familia de las proteínas Rho, Rac y Cdc42. Se ha
descrito por otra parte la actividad de GRF1 en la proteína Rac
(2).
En resumen, la proteína GRF1 podría activar en
parte una vía apoptótica responsable de la vulnerabilidad a la
isquemia. Estos resultados sugieren además que la proteína GRF1
misma podría representar un blanco en particular para trastornos
neurodegenerativos agudos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Los ratones salvajes de edades
10-12 meses, alimentados desde el destete con una
alimentación destinada a la cría, rica en proteínas (22%) y en
materias grasas (7%) (ref: D03, Código: R0310. Proveedor: UAR,
Francia), presentan una masa adiposa importante entre la piel y la
túnica muscular abdominal, así como en la cavidad abdominal,
principalmente alrededor de los pliegues uterinos en las hembras y
en el peritoneo. La presencia de grasa alrededor del corazón se
encuentra igualmente en los individuos más gordos que se pueden
calificar como obesos y cuyo peso sobrepasa 35 gramos en las
hembras y 40 gramos en los machos.
En las mismas condiciones de cría y de
nutrición, los ratones portadores de la mutación inactivante para el
gen grf1 de un año de edad y más no presentan ninguna de las
características que describa la obesidad. La mayoría de ellos no
tiene tejido adiposo entre la piel y la pared abdominal. En las
hembras, el depósito de grasa alrededor de los pliegues uterinos es
muy débil y comparable en cantidad al de los animales salvajes de
6-8 semanas. Los ratones grf1 KO adultos se
caracterizan aún por la ausencia de grasa en el peritoneo y
alrededor del corazón.
Se observa que la inactivación del gen grf1 en
ratones adultos, se traduce en una protección contra el aumento de
peso y la acumulación de tejido adiposo.
Para correlacionar las observaciones hechas en
los ratones grf1 KO y salvajes con las características conocidas
del fenotipo obeso, hemos administrado la dosis de leptina
plasmática de ratones salvajes y mutantes.
La leptina es una citocina que tiene por efecto
disminuir la ingesta de alimento y aumentar el gasto energético.
Existe una relación de proporcionalidad entre por una parte, el
número de adipocitos - que segregan leptina - y el tamaño de las
vesículas lipídicas que contienen y por otra parte, la concentración
plasmática de esta hormona (20).
Los presentes autores han determinado el peso y
la leptinemia de ratones macho y hembra salvajes o mutantes (KO)
por el gen grf1, de un año de edad. El grupo de animales estudiados
está constituido por diversas hermandades. Cada hermandad está
compuesta por animales salvajes y mutantes.
Las muestras sanguíneas han sido extraídas
durante la eutanasia de los animales por decapitación.
La dosificación de la leptina plasmática se ha
realizado utilizando un radioinmunoensayo (RIA) fabricado por la
compañía Linco, en forma de estuche (ref: ML-82K)
que es comercializado en Francia por la compañía Clinisciences.
Como se puede observar en las Figuras 4A y 4B en
los ratones mutantes (señalados -/-), la proporción plasmática en
leptina es muy baja comparado con la de los ratones salvajes de
muestras de la misma edad (señalados +/+). Si nos remitimos a la
bibliografía, la leptinemia de los ratones grf1
knock-out de más de 12 meses de edad y comparada
con la de ratones muy jóvenes de 6-8 semanas (5 a 10
ng/ml). El examen comparativo del perfil de estos animales abunda
en este sentido.
Si se pone en ayunas a los animales durante 48 h
(Figuras 5A y 5B), sigue una disminución del peso corporal
acompañado en los animales de control, por una disminución
importante de la concentración plasmática en leptina, mientras que
en los animales KO la disminución de la leptinemia es muy pequeña.
Este último resultado sugiere que en los animales KO, la proporción
en leptina ya está en un umbral mínimo que no se puede modular más
que débilmente en respuesta a un ayuno prolongado.
Las primeras mediciones del consumo de alimentos
en ratones mutantes indican que la toma de alimento se reduce con
respecto a los controles. Sin embargo si se reduce la cantidad de
alimento absorbido al peso de los animales no hay diferencia
significativa entre los KO y los salvajes.
Se tiene que observar que si el fenotipo de los
ratones mutantes tiene por origen un aumento del gasto energético,
esto último no aparece debido a una hiperactividad de los ratones
grf1 KO.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Esta experiencia se realiza en células en
cultivo.
La inducción de la fosforilación de GRF1 se
induce en estas células en cultivo de diferentes maneras.
Se utilizan tres protocolos:
\vskip1.000000\baselineskip
Se hacen estos diferentes tratamientos en
presencia y en ausencia de moléculas para cribar, en medio de
cultivo que contiene el ortofosfato marcado con P32 o con P33 (200
\muCi a 1 mCi/caja de Petri de 10 mm). La lisis de células se
hace en frío en un tampón HNTG (Hepes 20 mM pH 7,5; NaCl 150 mM;
Tritón al 0,1%; Glicerol al 10%, en presencia de inhibidores de
proteasas y de fosfatasas: Na3VO4 1 mM, Aprotinina 2,2 \mug/ml,
Leupeptina 1 \mug/ml, Antipaína 1 \mug/ml, Benzamidina 10
\mug/ml, 1 \mug/ml de inhibidor de tripsina de soja,
Quimostatina 1 \mug/ml, Pepstatina-A 1 \mug/ml)
o RIPA (Tris 50 mM, pH 8,0; NaCl 150 mM; NP-40 al
1%, Desoxicolato de Na al 0,5%; SDS al 0,1%; Na3VO4 1 mM; fluoruro
de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 100 \muM, Aprotinina 25 \mug/ml,
Leupeptina 25 \mug/ml). La proteína GRF1 se inmunoprecipita a
continuación con ayuda de anticuerpos anti-GRF1 o
anti-tag (10), (epítopo reconocido por un anticuerpo
monoclonal y que permite la detección o inmunoprecipitación de la
proteína etiquetada (tagged en inglés) como FLAG, myc o
hemaglutinina (HA)) y se separa el inmunoprecipitado en un gel
SDS-poliacrilamida al 4-20%. La
cuantificación de la radioactividad de la banda que corresponde a
la proteína GRF1 (140 kDa) se realiza con ayuda de un detector de
radiación de tipo PhosphoreImager. La eficacia de una molécula se
calcula por el porcentaje de inhibición de la fosforilación de la
proteína GRF1 considerando el valor encontrado para las células no
estimuladas como el valor 0% y el valor encontrado para las células
estimuladas en ausencia de la molécula cribada como el valor
100%.
\vskip1.000000\baselineskip
Una primera alternativa a este método consiste
en incubar el lisado celular obtenido anteriormente en pozos de
placas CYTOSTAR (comercializadas por la compañía Amersham)
recubierto previamente con un anticuerpo anti-GRF1
o anti-tag con el fin de retener la proteína GRF1.
Después de aclarados, se obtiene la cuantificación de la señal
radioactiva con ayuda de un contador de centelleo.
\vskip1.000000\baselineskip
Una segunda alternativa a este método consiste
en tratar las células como anteriormente pero en ausencia de
ortofosfato marcado. Los lisados celulares se utilizan entonces
según el método de dosificación E.L.I.S.A. Para esta dosificación,
los pozos de las placas se recubren con un anticuerpo
anti-GRF1 o anti-tag y la
fosforilación de GRF1 es revelada y cuantificada por un segundo
anticuerpo marcado (radioelemento, fluorescencia, enzima, etc) o
no, que puede ser o un anti-fosfotirosina o un
anti-fosfoserina/fosfotreonina. En el caso en que no
esté marcado el segundo anticuerpo, el revelado y la cuantificación
se hacen con ayuda de un tercer anticuerpo
anti-especie dirigido contra el segundo y marcado.
Después de aclarado, la cuantificación de la señal se hace con
ayuda de un contador de radioactividad, de un espectrofotómetro de
fluorescencia o por la medición de una actividad enzimática, que de
lugar a una lectura de densidad óptica por espectrofotometría
(lectores de placas).
Las células en cultivo, pueden ser:
- \sqbullet
- cultivos primarios de células neuronales, mantenidas 10 días en cultivo para permitir la expresión de la proteína GRF1 endógena
- \sqbullet
- líneas celulares en cultivo de todo origen tisular transinfectadas con un vector que permita la expresión de la proteína GRF1 (murina o humana), total y eventualmente etiquetada (tagged en inglés). Se puede utilizar todo vector plasmídico o viral que permita la expresión de cADNs heterólogos en células de mamíferos.
La fosforilación de la proteína GRF1 en las
células en cultivo se obtiene en las células neuronales, por adición
de 100 \muM de Carbacol (5 a 30 minutos) en el medio de cultivo
de las neuronas.
\newpage
Para las células no neuronales transinfectadas
por el cADN codificante para GRF1, se estudia la fosforilación de
la proteína de interés en las siguientes condiciones:
- \sqbullet
- o las células transinfectadas carecen de suero durante la noche, después se vuelven a incubar en presencia de suero fetal bovino al 10%,
- \sqbullet
- o las células se cotransinfectan por el cADNs codificante para las subunidades beta-gamma de las proteínas G triméricas \beta1\gamma2 o \beta1\gamma5. Los vectores de expresión son los plásmidos que permiten la expresión en las células eucariotas bajo el control de activadores del tipo CMV o SV40 (ejemplos pSV2 o bien pCDNA3 (INVITROGEN)). Los cADNs codificantes para las proteínas de interés se insertan después de la multiplicación de los fragmentos por PCR, verificación de la secuencia y subclonación de los fragmentos en los múltiples sitios de clonación presentes en los vectores. Las células están desprovistas de suero durante la noche, después se vuelven a incubar en presencia de suero.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Estas actividades se pueden medir en sistemas
acelulares (utilización de proteínas recombinantes) o en sistemas
celulares.
Las proteínas Ras, Rac o Cdc42 recombinantes en
la concentración final 0,5 \muM, se incuban en presencia de
3H-GDP (0,5 \muM final, NEN 111 \mumoles, 9
Ci/mmoles) en el tampón de intercambio (tris-HCl 50
mM, pH 7,5; MgCl2 1 mM, ditiotreitol 10 mM, AEDT 1 mM, 1 mg/ml de
suero de albúmina bovino) durante 30 minutos a 30ºC, después
conservadas en hielo. Se añade a continuación MgCl2 para tener una
concentración final de 10 mM para bloquear la reacción de
intercambio después se extraen 50 \mul de cada incubación
(Ras/Rac/Cdc42 ligado al GDP tritiado) que se distribuyen en uno de
los 96 pozos de una microplaca.
La reacción de intercambio se inicia con la
adición a los pozos de 10 \mul de GTP frío 10 mM (0,1 mM final),
de la proteína GRF1 recombinante (todo o partes) y de las moléculas
que se vayan a ensayar.
Después de una incubación de 60 minutos a 30ºC,
se extrae una alíquota de 40 \mul y se filtra en una membrana de
nitrocelulosa de 0,45 \mum (placa de 96 pozos de fondos
recubiertos de una membrana de filtración que puede retener las
proteínas, Sartorius SM 11306). El recuento de la radioactividad
(GDP tritiado ligado a la proteína G pequeña) se efectúa en un
contador por centelleo, en presencia de líquido que centellea. En
este caso, se recuenta la radioactividad en la membrana de
filtración de nailon.
Una alternativa a la reacción de filtración
consiste en hacer pasar, después de incubación, el contenido de
cada pozo en una columna PD10 equilibrada previamente con el tampón
de elución (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; MgCl2 5 mM,
PMSF 1 mM, DTT 5 mM y AEDT 1 mM). En este caso, se mide la
radioactividad del eluyente de la columna (se hacen pasar 4 ml de
tampón de elución por la columna + 10 ml de líquido de centelleo
ReadyGel Beckman).
En los dos casos, la actividad de intercambio se
mide por la diferencia de cantidad de radioactividad en presencia
de proteína GRF1 comparado con la obtenida en un ensayo sin proteína
GRF1. La eficacia de una molécula se calcula por la inhibición de
esta actividad de intercambio.
Las proteínas Ras, Rac o Cdc42 recombinantes
pueden ser las proteínas Ras, Cdc42 o Rac salvajes de diferentes
orígenes (humano, murinas,..) expresadas:
- bien en forma de proteínas de fusión (GST, sistema pGEX-1\lambdaT o -2T, Producto Pharmacia) en E. coli (según el protocolo descrito por el fabricante y después de la transformación de los plásmidos en las bacterias BL21. La expresión de las proteínas se induce durante 4 horas con IPTG (isopropil-1-tio-beta-D-galactósido) 0,5 mM, a 30ºC) o en células de mamíferos (pBCGST, (38)) en las células CHO transinfectadas por los plásmidos. La expresión se obtiene a 37ºC en una estufa de CO2 al 5%, durante la noche. Las proteínas se purifican en columna de afinidad de glutatión según los protocolos proporcionados por Pharmacia (Biotech (GST-Gene Fusion system). Estas proteínas de fusión pueden ser o no divididas por digestión en trombina con el fin de suprimir su dominio GST.
- bien en una forma etiquetada (tagged en inglés) (pBlueBacHis2, Produit Invitrogen) en baculovirus, expresada en células de insectos (Sf9, Sf21, High Five,...) después de la infección de las células por un baculovirus recombinante obtenido según los procedimientos recomendados por el vendedor. La expresión se hace a 27ºC, en dos a cuatro días y se purifican las proteínas a continuación en columna de níquel.
Las proteínas GRF1 recombinantes pueden ser la
totalidad o fracciones de proteínas GRF1 de diferentes orígenes
(humano, murina,..) que contengan los dominios de intercambio bien
CDC25, bien DH, bien los dos, expresadas en baculovirus o en E.
coli y purificadas en columna de afinidad.
Una variante de la técnica anterior consiste en
utilizar la capacidad bien de Ras-GTP para unirse a
Raf-1 por el dominio "dominio de Unión a Ras"
de Raf (RBD), bien de Racl-GTP o
Cdc42-GTP para unirse a PAK1 por el dominio CRIB de
esta última (39). El sistema SPA ("Análisis de Centelleo por
Proximidad"), descrito en la patente de EE.UU. 4 568 649, la
patente europea EP 154 734 y la patente japonesa JP 84/52452,
permite poner de manifiesto y cuantificar el enlace entre dos
proteínas en una criba a flujo alto.
Las proteínas Ras, CDC42 o Rac recombinantes -
en esta experiencia, las G pequeñas serán divididas de su dominio
GST o bien expresadas con otra etiqueta (tag en inglés) por ejemplo,
cola de His,...- en la concentración final 0,5 \muM, se incuban
en presencia de GDP frío en el tampón de intercambio
(Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; MgCl2 1 mM, ditiotreitol
10 mM, AEDT 1 mM, 1 mg/ml de suero de albúmina bovina) durante 30
minutos, a 30ºC, se conservan después en hielo. Las siguientes
etapas consisten en añadir MgCl2 hasta una concentración final de
10 mM para bloquear la reacción de intercambio, después se extraen
50 \mul de cada incubación y se distribuyen en uno de los 96
pozos de una microplaca.
La reacción de intercambio se inicia con la
adición a los pozos de 10 \mul de GTP tritiado (NEN 111
\mumoles, 9 Ci/mmoles), de la proteína GRF1 recombinante y de las
moléculas que se vayan a ensayar.
Después de una incubación de 60 minutos a 30ºC,
añadir 80 \mul de proteínas GST-Raf (dominio RBD)
o GST-PAK (dominio CRIB) en la concentración de
0,0013 mg/ml en un tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,5;
ditiotreitol 2 mM y 40 \mul de una mezcla de inmunoglobulina
anti-GST (0,12 mg/ml) y de proteína A PVT SPA
acoplada a microesferas (Amersham; 12,6 mg/ml) en un tampón
Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; ditiotreitol 2 mM, MgCl2 2
mM. Las placas se precintan a continuación, se agitan 1 h a 22ºC,
después se centrifugan a 760 g durante 2 minutos y se cuentan en un
contador de centelleo.
La eficacia de la molécula se calcula por el
porcentaje de inhibición de la actividad de intercambio y es igual
a: 100 x (1 - (valor en presencia de GRF1 y de la molécula - muestra
en ausencia de GRF1 y de la molécula)/(valor en presencia de GRF1 y
en ausencia de la molécula - muestra en ausencia de GRF1 y de la
molécula)).
Son posibles diferentes posibilidades. Utilizan
bien los sistemas de enriquecimiento de la levadura
(Saccharomyces cerevisiae), bien sistemas de competición que
produzcan un trastorno fisiológico, bien el sistema
doble-híbrido. Todas las técnicas y los métodos que
utilizan la levadura se describen extensamente en la bibliografía
(40-45).
Es posible la utilización de uno u otro de estos
sistemas por la existencia en la levadura de parejas de proteína G
de peso molecular/factor de intercambio pequeño, homólogos a los
descritos en las células de mamíferos. En cuanto a las proteínas G,
las proteínas RAS de levadura son homólogas a las proteínas Ras de
mamíferos (éstas últimas complementan en la levadura las mutaciones
inactivantes de las proteínas RAS) y la proteína CDC42 S.c. es
homóloga a las proteínas Rac de mamíferos. En cuanto a los factores
de intercambio, CDC25 y SDC25 son homólogas a GRF1 y sus partes
catalíticas son activas en las proteínas Ras de mamíferos (46, 47).
GRF1, por su dominio homólogo a CDC25, es capaz de complementar toda
mutación inactivante de CDC25 o bien de un doble mutante
CDC25/SDC25 (los mutantes o KO SDC25 no teniendo fenotipo). También
se conoce para CDC42 S.c. un factor de intercambio denominado CDC24
que se puede complementar por el dominio DH de Vav (48). Se puede
extrapolar una actividad de intercambio de todo o parte (incluyendo
el dominio DH) de GRF1 en CDC42 en una levadura mutante para CDC24,
teniendo estas mutaciones inactivantes un fenotipo letal. Esta
actividad de GRF1 (todo o parte) imitará total o parcialmente
(según su afinidad) el efecto de CDC24.
En este sistema, GRF1 (todo o partes) es capaz
de imitar la función de los factores de intercambio de la levadura
(CDC25, CDC24) cuando estos son inactivados por una mutación que
conduce a un fenotipo del tipo interrupción del crecimiento. Esta
enriquecimiento tiene por efecto permitir la supervivencia de la
levadura restaurando el crecimiento. Una molécula que inhiba la
función de GRF 1 (proteína entera, dominio CDC25, dominio DH) en
las proteínas RAS o CDC42, en un contexto CDC25 o CDC24 inactivados
(mutaciones termosensibles) conduce a la pérdida del fenómeno de
enriquecimiento y a la muerte de la célula a temperatura permisiva.
La especificidad del modo de acción de la molécula en el sistema
RAS/dominio CDC25 o CDC42/dominio DH se verificará por la medición
de la acción de la molécula en una levadura salvaje (información
sobre la actividad antifúngica).
El cribado se hará para las moléculas pequeñas
en una levadura permeabilizada por técnicas conocidas por el
experto en la materia, que consiste en extraer la concentración
intracelular de las moléculas jugando con la permeabilidad de la
membrana y la expresión de genes implicados en los procesos de
destoxificación (por ejemplo utilizando mutantes del gen Erg6 y/o
de los genes de la familia PDR) Estas técnicas, denominadas de
permeabilización, se describen en las solicitudes de patente
siguientes: patente francesa FR 9411509 y patente internacional WO
96/1082.
Se utiliza una cepa del género S.
cerevisiae, CDC25 TS o CDC24 TS (mutaciones termosensibles). No
puede crecer más que en condiciones de temperatura permisiva. Se
cultiva en el medio de cultivo siguiente:
Medio YNB mínimo:- Base Nitrogenada de Levadura
(sin aminoácidos) (6,7 g/l) (Difco)
- -
- Glucosa (20 g/l) (Merck)
Se puede volver sólido este medio por adición de
20 g/l de agar (Difco).
Para permitir el crecimiento de levaduras
auxótrofas en este medio, es necesario añadir los aminoácidos o las
bases nitrogenadas, de las que dependen a 50 mg/ml. Se añaden 100
\mug/ml de ampicilina al medio para evitar contaminaciones
bacterianas.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa TG1 de Escherichia coli, genotipo
supE, hsd\Delta5, thi, \Delta(lac-proAB),
F'[tra D36 pro A+B+ lacIq lacZ\DeltaM15], se emplea para la
construcción de plásmidos y para la multiplicación y el aislamiento
de plásmidos. Se cultiva en el medio siguiente:
Medio LB: - NaCl (5 g/l) (Sigma)
- -
- Bactotriptona (10 g/l) (Difco)
- -
- Extracto de Levadura (5 g/l) (Difco)
Se puede volver sólido este medio por adición de
20 g/l de agar (Difco).
Se utiliza ampicilina, a 100 \mug/ml, para
seleccionar las bacterias que hayan recibido los plásmidos que
portan como marcador el gen de resistencia a este antibiótico.
Las preparaciones en pequeñas cantidades y en
grandes cantidades de ADN plasmídico se efectúan según los
protocolos recomendados por el fabricante Quiagen de los estuches
de purificación de ADN:
- -
- estuche Quiaprep Spin Miniprep, ref: 27106
- -
- estuche Quiaprep Plasmid Maxiprep, ref: 12163.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hacen competentes las levaduras por un
tratamiento al LiAC/PEG según el método descrito por Gietz et
al, (49) y transformadas por 1 \mug de plásmido que permita
la expresión constitutiva o inducible de todo o parte de GRF1 en la
levadura. Después de las etapas de transformación, se vuelven a
poner las levaduras en cultivo en condiciones no permisivas Los
clones seleccionados serán los que habrán sido enriquecidos por
GRF1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extiende un clon seleccionado enriquecido por
GRF1 en cajas que contienen el medio de selección en el que se
aplican gotas de compuestos químicos. Se ponen las cajas en
condiciones permisivas. Los productos que dan un halo de inhibición
del crecimiento de la levadura, son retenidos y ensayados en una
levadura salvaje de control para eliminar las moléculas con
actividad antifúngica que den el mismo tipo de inhibición del
crecimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
En este sistema, la expresión de GRF1 todo o
parte, en la levadura se acompaña de una perturbación del
crecimiento debido a la estimulación constitutiva del intercambio
en las proteínas RAS o CDC42. Una molécula activa en el sistema
conducirá a una normalización más o menos perfecta del trastorno
fisiológico (fenotipo) engendrado por la expresión de GRF 1.
Se utiliza una cepa de levadura salvaje del
género S. cerevisiae. Se cultiva en el medio YNB mínimo como
se describe en 2.1. La construcción y la multiplicación de
plásmidos se efectúa como se describe en 2.1.
En el ejemplo descrito a continuación, la
expresión de GRF1 conduce a la superactivación de RAS de levadura.
Dichas levaduras ya no serán entonces capaces de fabricar reservas
de glicógenos cuando alcancen la fase de crecimiento
preestacionario. Se identificarán por la ausencia de coloración
marrón después de exposición a vapores de iodo.
\vskip1.000000\baselineskip
El cribado se hará en una levadura
permeabilizada según las técnicas descritas anteriormente.
Se aplican gotas de compuestos químicos
directamente en la superficie de cajas de cultivo previamente
sembradas con una levadura que exprese GRF1, todo o parte. Se ponen
a cultivar las cajas, después se exponen a vapores de iodo en un
recinto cerrado que contiene cristales de iodo. Los productos que
permiten el crecimiento de la levadura y que restauran la aparición
de la coloración marrón, se retendrán como positivos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede igualmente considerar que la expresión
de GRF1, todo o parte, se incluye en la levadura como un dominante
negativo, inhibe la actividad de las proteínas de la levadura CDC25
o CDC24 y provoca un trastorno fisiológico del tipo interrupción
del crecimiento, que será parado total o parcialmente por las
moléculas activas en el sistema.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utiliza una cepa salvaje del género S.
cerevisiae. Se cultiva en el medio YNB mínimo como se describe
en 2.1. La construcción y la multiplicación de plásmidos se efectúa
como se describe en 2.1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hace competente la levadura salvaje por un
tratamiento al LiAC/PEG según el método descrito por Gietz et
al, (49) y es transformada por 1 \mug de plásmido que permita
la expresión inducible de todo o parte de GRF1 en la levadura
(ejemplo: la expresión del gen grf1 se pone bajo el control del
activador del gen Gal 4 que es inducible en presencia de galactosa
como única fuente de carbono en el medio de cultivo).
En el ejemplo descrito a continuación y en las
condiciones de inducción, la expresión de GRF1 conduce a la
perturbación de la señalización celular que utiliza las proteínas
RAS en la levadura y se traduce por un fenotipo de tipo
interrupción del crecimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
El cribado se hará en una levadura
permeabilizada según las técnicas descritas anteriormente.
Se aplican gotas de compuestos químicos
directamente a la superficie de cajas de cultivo sembradas con una
levadura transformada por el plásmido de expresión inducible de
GRF1, pero previamente cultivada en ausencia de agente inductor. Se
ponen las cajas a incubar en condiciones que permitan la expresión
de GRF1. Los productos que permiten el crecimiento de la levadura
serán retenidos como positivos.
Se puede considerar realizar estos sistemas de
competición en las levaduras mutantes (mutantes termosensibles) por
RAS (RAS mut TS) enriquecidas con un Ras de mamífero o CDC42 mut TS
enriquecidas por Rac de mamífero.
\vskip1.000000\baselineskip
1a aplicación:
La utilización de este sistema permite realizar
una criba en las moléculas que pueden inhibir la interacción física
entre Ras o Rac/CDC42Hs y GRF1 (50, 2).
La técnica descansa en la realización de una
primera proteína de fusión entre Ras, CDC42Hs o Rac y un dominio de
interacción con el ADN y una segunda proteína de fusión entre GRF1
(todo o los dominios de tipo CDC25 o DH) y un dominio
transactivador. La interacción entre las dos proteínas híbridas
conduce a la activación de un gen informador (HIS3, LEU2, URA3,
CYH2, CAN1, LacZ, GFP, etc.). Se utiliza el sistema en la levadura
apropiada (ej: mutante ura3 si el gen transportador es URA3).
Ejemplo de un sistema
doble-híbrido inverso para la criba de moléculas
(51): La cepa de levadura CL9 se utiliza como herramienta de
cribado de moléculas que interfieren en el sistema
doble-híbrido. Permite poner de manifiesto la
interacción proteína-proteína. Se puede hacer
permeable por introducción de mutaciones en la familia de los genes
PDR y del gen ERG6 implicado en los procesos de destoxificación.
Se cultiva en el medio YNB mínimo.
La cepa TG1 de Escherichia coli, genotipo
supE, hsd\Delta5, thi, \Delta(lac-proAB),
F'[tra D36 pro A+B+ lacIq lacZ\DeltaM15], se emplea para la
construcción de plásmidos y para la multiplicación y el aislamiento
de plásmidos.
Los plásmidos aplicados son los siguientes:
El vector pGAD10, proporcionado por Clontech®
permite la expresión en la levadura de una proteína de fusión entre
GRF1, todo o partes y el dominio transactivador de GAL4 (proteína
GRF1-TA).
El vector pGBT9, proporcionado por Clontech®
permite la expresión en la levadura de una proteína de fusión entre
Ras, Rac o Cdc42 y el dominio de interacción con el ADN de GAL4
(proteínas Ras-BD o Rac-BD o
Cdc42-BD). Comentario: de manera ventajosa, el
dominio carboxi-terminal de farnesilación de Ras o
de geranil-geranilación de las proteínas Rac y
Cdc42, se eliminan de la construcción. Lo que permite obtener
proteínas que no se enganchen a las membranas lipídicas y que
entren eficazmente en el núcleo de las células.
La levadura CL9 se hace competente por un
tratamiento al LiAC/PEG según el método descrito por Gietz et
al, (49). Se transforma a continuación por 1 \mug de cada
plásmido permitiendo la expresión de las proteínas de fusión que
componen el sistema doble-híbrido. La expresión de
éstas conduce a una sensibilidad de la cepa a la cicloheximida.
Un producto que interfiere con la interacción
entre las proteínas de fusión del sistema
doble-híbrido permitirá el crecimiento de la
levadura en este tipo de medio. Para hacer un cribado, se extiende
la levadura en la superficie de un medio selectivo que contenga 10
\mug/ml de cicloheximida. Se aplican gotas de compuestos
químicos directamente en la superficie de la caja. Los productos
seleccionados son los que dan una aureola de crecimiento alrededor
del depósito.
El cribado se hará en una levadura
permeabilizada según las técnicas descritas anteriormente.
El cribado se hará en una levadura
permeabilizada según las técnicas descritas anteriormente.
En otro sistema la inhibición de la
intercalación proteína-proteína por moléculas
activas se puede revelar por la disminución de la expresión de un
gen transportador. Pudiendo ésta ponerse de manifiesto, según el
caso, por un ensayo colorimétrico, fluorimétrico o enzimático
(ejemplo: \beta-galactosidasa). La inhibición del
crecimiento se puede medir por la utilización de un medio selectivo
(ej: medio al fluorato para la utilización del gen transportador
URA3 o medio a la canavanina para CAN1).
La medición de la actividad
\beta-galactosidasa se realiza de la siguiente
forma:
La cepa L40 del género S. cerevisiae
(Mata, his3D200, trp1-901,
leu2-3,112, ade2, LYS2::
(lexAop)4-HIS3, URA3::
(lexAop)8-LacZ, GAL4, GAL80) se utiliza como
herramienta de cribado. Esta cepa permite poner de manifiesto la
interacción proteína-proteína cuando una de las
parejas proteínicas se fusiona a la proteína LexA (70). Se ha
cultivado en el medio de cultivo YNB mínimo.
Se ha empleado la cepa TG1 de Escherichia
coli, genotipo supE, hsdD5, thi,
D(lac-proAB), F'[tra D36 pro A+B+ lacIq
lacZDM15], para la construcción de plásmidos y para la
multiplicación y el aislamiento de plásmidos (como se describe en
2.1)
Los plásmidos aplicados son los siguientes:
El vector pGAD10, proporcionado por Clontech®
permite la expresión en la levadura de proteínas de fusión entre
GRF1, todo o partes y el dominio transactivador de GAL4.
El vector pLex9 (pBTM116) permite la expresión
en la levadura de proteínas de fusión entre Ras, Rac o Cdc42 y el
dominio de interacción con el ADN de la proteína LexA.
La levadura se hace competente por un
tratamiento con LiAC/PEG según el método descrito por Gietz et
al, (49). Se transforma a continuación por 1 \mug de cada
plásmido permitiendo la expresión de las proteínas de fusión que
componen el sistema doble-híbrido. La expresión de
éstas conduce a la expresión de la
\beta-galactosidasa.
Se deposita una hoja de nitrocelulosa en la caja
de Petri que contenga el tapiz de levaduras y las gotas de
compuestos químicos que se tienen que cribar. Esta hoja se sumerge a
continuación en nitrógeno líquido durante 30 segundos para hacer
estallar las levaduras y liberar así la actividad
\beta-galactosidasa. Después de descongelación,
se deposita la hoja de nitrocelulosa, colonias hacia arriba, en otra
caja de Petri que contenga un papel Whatman previamente embebido en
1,5 ml de disolución de PBS (Na2HPO4 60 mM, NaH2PO4 40 mM, KCl 10
mM, MgSO4 1 mM, pH 7) conteniendo 15 \mul de X-Gal
(5-bromo-4-cloro-3-indoil-\beta-D-galactósido)
a 40 mg/ml en N,N-dimetilformamida. A continuación
se pone la caja en una estufa a 37ºC. Se dice que el ensayo es
positivo cuando las colonias viran al azul en la membrana al cabo de
6 horas.
Señalar que en el caso de interacciones débiles
o muy fugaces entre proteínas, es posible considerar introducir
mutaciones en éstas para hacer más fuerte la interacción (52).
Segunda aplicación:
Esta aplicación utiliza las propiedades de
interacción de PAK1 (dominio CRIB) con Rac y Cdc42 cuando estas
proteínas G pequeñas están en forma asociada a GTP y de
c-Raf1 (dominio RBD) con Ras-GTP. Se
puede entonces considerar una variante del sistema doble híbrido
denominada doble-híbrido más uno que consistirá en
expresar en el núcleo una misma levadura bien:
- GRF1 (todo o parte), PAK1 (dominio CRIB) fusionado con un dominio transactivador de GAL4 y o Rac o Cdc42 Hs fusionadas con un dominio de interacción con el ADN de GAL4 o
- GRF1 (todo o parte), c-Raf1 (RBD) fusionada con un dominio transactivador de GAL4 y Ras fusionada con un dominio de interacción con el ADN de GAL4.
El dominio carboxi-terminal de
farnesilación de Ras o de geranil-geranilación de
las proteínas Rac y Cdc42, se puede eliminar de la construcción, lo
que permite obtener proteínas que no se enganchen a las membranas
lipídicas y que entren eficazmente en el núcleo de las células.
La activación de G pequeñas por GRF1 inducirá su
carga en GTP y su interacción pues con su efector (PAK1 o
Raf-1) y permitirá pues la expresión del gen
transportador como se describe a continuación.
La inhibición de la actividad de intercambio de
la proteína GRF1 por pequeñas moléculas se traducirá pues en la
inhibición de la expresión del gen transportador. (véase
anteriormente).
La cepa de levadura CL9 se utiliza como
herramienta de cribado de moléculas que interfieren en el sistema
doble-híbrido. Permite poner de manifiesto las
interacciones proteína-proteína. Se puede hacer
permeable por introducción de mutaciones en la familia de los genes
PDR y del gen ERG6 implicados en los procesos de
destoxificación.
Se ha cultivado en el medio YNB mínimo.
La cepa TG1 de Escherichia coli, genotipo
supE, hsd\Delta5, thi, \Delta(lac-proAB),
F'[tra D36 pro A+B+ lacIq lacZ\DeltaM15], se emplea para la
construcción de plásmidos y para multiplicación y el aislamiento de
plásmidos. Se cultiva en el medio LB.
Los plásmidos aplicados son los siguientes:
El vector pGAD10, proporcionado por Clontech®
permite la expresión en la levadura de una proteína de fusión entre
PAK1 (dominio CRIB) o c-Raf1 (dominio RBD) y el
dominio transactivador de GAL4 (proteína PAK1-TA o
c-Raf1-TA).
El vector pGBT9, proporcionado por Clontech®
permite la expresión en la levadura de una proteína de fusión entre
Ras, Rac o Cdc42 y el dominio de interacción con el ADN de GAL4
(proteínas Ras-BD o Rac-BD o
Cdc42-BD).
Un vector que permite la expresión en la
levadura de GRF1 (todo o partes).
La levadura CL9 se hace competente por un
tratamiento al LiAC/PEG según el método descrito por Gietz et
al, (49). Se transforma a continuación por 1 \mug de cada
plásmido permitiendo la expresión de las proteínas de fusión y GFR1
que componen el sistema doble-híbrido más uno. La
expresión de éstas conduce a una sensibilidad de la cepa a la
cicloheximida.
Un producto interferente con la activación por
GRF1 de las proteínas de fusión Ras-BD,
Rac-BD o Cdc42-BD del sistema
permitirá el crecimiento de la levadura en este tipo de medio. Para
hacer un cribado, se extiende la levadura en la superficie de un
medio selectivo que contenga 10 \mug/ml de cicloheximida. Se
aplican gotas de compuestos químicos directamente en la superficie
de la caja. Los productos seleccionados son los que dan una aureola
de crecimiento alrededor del depósito.
El cribado se hace en una levadura
permeabilizada según las técnicas descritas anteriormente.
La especificidad de los productos para la
activación por GRF1 de las proteínas Ras-BD o
Rac-BD o Cdc42-BD se validará por
uno de los otros ensayos dados en el ejemplo.
Se pueden aplicar otras técnicas de revelado de
un sistema doble-híbrido más uno.
Inhibiendo la interacción
proteína-proteína, las moléculas activas se pueden
revelar por la disminución de la expresión de un gen transportador.
Pudiendo ésta, según el caso, ponerse de manifiesto por un ensayo
colorimétrico, fluorimétrico o enzimático. La inhibición del
crecimiento se puede medir por utilización de un medio selectivo
(ej: medio al fluorato para la utilización del gen transportador
URA3 o medio a la canavanina para CAN1).
Se observa que en el caso de interacciones
débiles o muy fugaces entre proteínas, es posible considerar
introducir mutaciones en éstas para hacer más fuerte la
interacción.
Para aplicar estos últimos ejemplos el experto
en la materia se puede referir a las patentes de EE.UU. US
5.283.173, US 5.468.614, US 5.525.490, US 5.580.736 y US
5.885.779.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Existe una interacción física entre el dominio
PH de GRF1 y las subunidades beta-gamma de proteínas
G hetero-triméricas (7-9). El
sistema doble-híbrido en la levadura (tal como se
describe en el ejemplo 4) parece ser la herramienta adaptada para
la realización de una criba que permita poner de manifiesto
moléculas capaces de perturbar esta interacción. Se podría utilizar
bien la proteína GRF 1 entera, bien los dominios PH, bien la cadena
de dominios PH-DH-PH tal como se
encuentra de manera natural en la proteína GRF1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Según la bibliografía, la sobreexpresión de
partes catalíticas de GRF1 confiere a la célula transinfectada el
fenotipo transformado (46, 47).
El ensayo de cribado para inhibidores de GRF1
utiliza los clones estables de células transinfectadas por grf1,
para las que los presentes autores han podido demostrar una
sobreexpresión del transgen por el método western.
La sobreexpresión de GRF1 confiere a las células
la capacidad para clonar en agar que se verifica según el protocolo
siguiente:
Se cuentan las células y se vuelven a suspender
en medio completo sin rojo de fenol y a una concentración de 2,5.
105 células por ml.
En los pozos de placas de 96 pozos, se vierte
sucesivamente:
- 75 \mul de "Bottom layer" (capa de base) que contiene 50% de medio de cultivo 2X sin rojo de fenol y 50% de agarosa ((1,2%, "low melting point" (un punto de fusión bajo) como por ejemplo SIGMA (A-6560) tipo VII preparado en agua y esterilizado en autoclave)),
- 75 \mul de "capa superior" preparada a partir de la mezcla siguiente:
- -
-
\vtcortauna
Una vez solidificado el agar, se diluyen las
moléculas que se van a ensayar en medio 1X en las concentraciones
que convienen y se añaden 75 \mul en las capas de agar en los
pozos.
Se cuentan las células después de dos semanas
por una coloración a la calceína: La Calceína AM (Molecular Probes
C-1430, DMSO 4 mM) se diluye a 10 \muM en HBSS y
se conserva a -20ºC. Se añaden 25 \mul de calceína AM a cada pozo
y se dejan las células en incubadora (37ºC) durante al menos una
hora. Se lee la placa en un aparato C0.
\newpage
Un inhibidor de GRF1 se revelará por la
disminución del número de clones en agar. También se puede utilizar
toda célula de mamífero inmortalizada y transinfectada por un vector
de expresión eucariota (plásmido) que permita la expresión de todo
o parte (dominio de tipo CDC25 o dominio DH) de grf1, humano o
murina. Este vector de expresión confiere al mismo tiempo el
fenotipo resistente a un agente de selección como higromicina,
neomicina, zeocina u otros y permite de esta manera seleccionar
después de clonar (por FACS o por dilución límite) las células
transinfectadas y que expresan el transgen.
1- Hall, A., Rho GTPases and the actin
citoskeleton. Science, 279, 509-14
(1.998).
2- Kiyono, M., et al., G protein
\beta\gamma subunit-dependent
Rac-guanine nucleotide exchange activity of
Ras-GRF1/
CDC25Mm. Proc. Natl. Sci. USA, 96, 4.826-4.831 (1.999).
CDC25Mm. Proc. Natl. Sci. USA, 96, 4.826-4.831 (1.999).
3- Farnsworth, C.L., et al.,
Calcium activation of Ras mediated by neuronal exchange factor
Ras-GRF. Nature, 376,
524-527 (1.995).
4- Freshney, NW., et al.,
Activation of the exchange factor Ras-GRF by calcium
requires an intact Dbl homology domain. FEBS Lett, 407,
111-5 (1.997).
5- Buchsbaum, R., et al., The
N-terminal pleckstrin, coiled-coil,
and IQ domains of the exchange factor Ras-GRF act
cooperatively to facilitate activation by calcium. Mol Cell
Biol, 16, 4.888-96 (1.996).
6- Schweighoffer, F., et al.,
Identification of a human guanine
nucleotide-releasing factor
(H-GRF55) specific for Ras proteins.
Oncogene, 8, 1.477-1.485 (1.993).
7- Sawai, T., et al., Interaction
between Pleckstrin homology domains and G protein
betagamma-subunits: analyses of kinetic parameters
by a biosensor-based method. Biol Pharm Bull,
22, 229-33 (1.999).
8- Shaw, G., The pleckstrin homology
domain: an intriguing multifunctional protein module.
Bioessays, 18, 35-46 (1.996).
9- Touhara, K., et al., Binding of
G protein beta gamma-subunits to pleckstrin homology
domains. J Biol Chem, 269, 10.217-20
(1.994).
10- Martegani, E., et al., Cloning
by functional complementation of a mouse cDNA encoding a homologue
of CDC25, a Saccharomyces cerevisiae RAS activator. EMBO
J, 11, 2.151-2.157 (1.992).
11- Shou, C., et al., Molecular
cloning of cDNAs encoding a
guanine-nucleotide-releasing factor
for Ras p21. Nature, 358, 351-354
(1.992).
12- Wei, W., et al., Localization
of the cellular expression pattern of CDC25NEF and ras in the
juvenile rat brain. Molecular brain research, 19,
339-344 (1.993).
13- Brambilla, R., et al., A role
for the Ras signalling pathway in synaptic transmission and
long-term memory. Nature, 390,
281-286 (1.997).
14- Itier, JM., et al., Imprinted
gene in postnatal role. Nature, 393, 125-126
(1.998).
15- Zippel, R, et al.,
Ras-GRF, the activator of Ras, is expressed
preferentially in mature neurons of the central nervous system.
Molecular brain research, 48, 140-144
(1.997).
16- Plass, C., et al.,
Identification of GRF1 on mouse chromosome 9 as an imprinted gene by
RLGS-M. Nature genetics, 14,
106-109 (1.996).
17- Shou, C., et al., Differential
response of the Ras exchange factor, Ras-GRF to
tyrosine kinase and G protein mediated signals. Oncogene,
10, 1.887-1.893 (1.995).
18- Mattingly, RR. and Macara,
IG., Phosphorylation-dependent activation of the
Ras-GRF/CDC25Mm exchange factor by muscarinic
receptors and G-protein \beta\gamma subunits.
Nature, 382, 268-272 (1.996).
19- Zippel, R., et al., The brain
specific Ras exchange factor CDC25Mm: modulation of its activity
through Gi-protein- mediated signals.
Oncogene, 12, 2.697-2.703 (1.996).
20- Friedman, JM., Halaas, JL.,
Leptin and the regulation of body weight in mammals. Nature,
395, 763-70 (1.998).
21- Schwartz, MW., et al.,
Identification of targets of leptin action in rat hypothalamus. J
Clin Invest, 98, 1.101-6 (1.996).
22- Kristensen, P., et al.,
Hypothalamic CART is a new anorectic peptide regulated by leptin.
Nature, 393, 72-6 (1.998).
23- Krude, H., et al., Severe
early-onset obesity, adrenal insufficiency and red
hair pigmentation caused by POMC mutations in humans. Nat
Genet, 19, 155-7 (1.998).
24- Yeo, GS., et al., A frameshift
mutation in MC4R associated with dominantly inherited human obesity.
Nat Genet, 20, 111-2 (1.998).
25- Vaisse, C., et al., A
frameshift mutation in human MC4R is associated with a dominant form
of obesity. Nat Genet, 20, 113-4
(1.998).
26- Sierra-Honigmann,
MR., et al., Biological action of leptin as an angiogenic
factor. Science, 281, 1.683-6
(1.998).
27- Bouloumie, A., et al., Leptin,
the product of Ob gene, promotes angiogenesis. Circ Res, 83,
1.059-66 (1.998).
28- Chehab, FF., et al.,
Correction of the sterility defect in homozygous obese female mice
by treatment with the human recombinant leptin. Nat Genet,
12, 318-20 (1.996).
29- Barash, IA., et al., Leptin is
a metabolic signal to the reproductive system. Endocrinology,
137, 3144-7 (1.996).
30- Chehab, FF., et al., Early
onset of reproductive function in normal female mice treated with
leptin. Science, 275, 88-90
(1.997).
31- Strobel, A., et al., A leptin
missense mutation associated with hypogonadism and morbid obesity.
Nat Genet, 18, 213-5 (1.998).
32- Clement, K., et al., A
mutation in the human leptin receptor gene causes obesity and
pituitary dysfunction. Nature, 392, 398-401
(1.998).
33- Lord, GM., et al., Leptin
modulates the T-cell immune response and reverses
starvation-induced immunosuppression.
Nature, 394, 897-901 (1.998).
34- Duci P. et al., Leptin
inhibits bone formation through a hypothalamic relay: a central
control of bone mass. Cell, 100, 197-207,
2.000.
35- Thiele, TE., et al., Ethanol
consumption and resistance are inversely related to neuropeptide Y
levels. Nature, 396, 366-9
(1.998).
36- Tamura, A., et al., Focal
cerebral ischemia in the rat:1. Description of technique and early
neuropathological consequences following middle cerebral artery
occlusion. J Cereb Blood Flow Metab, 1, 53-60
(1.981).
37- Bederson, JA., et al., Rat
middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and
development of a neurologic examination. Stroke, 17,
472-476 (1.986).
38- Chatton, B., et al.,
Eukaryotic GST fusion vector for the study of
protein-protein associations in vivo:
application to interaction of ATFa with Jun and Fos.
Biotechniques, 18, 142-5 (1.995).
39- Lowe N et al., Delineation of
the Cdc42/Rac-binding Domain of
p21-Activated Kinase. Biochemistry, 37,
7.885-7.891, (1.998).
40- Methods Enzymol., Guide to yeast
genetics and molecular biology, 194, 1-863
(1.991).
41- Biotechnology, Yeast genetics
engineering, 13, 1-354 (1.989).
42- Methods in molecular biology, Yeast
protocols, 53, 1-433 (1.996).
43- Molecular Genetics of Yeast: A
Practical Approach. Edited by John R. Johnston,
1-300 (1.994).
44- The Yeast Two-Hybrid System.
Paul L. Bartel and Stanley Fields, 1-356
(1.997).
45- Methods in Yeast Genetics: A Laboratory
Course Manual (1.997).
46- Chevallier-Multon MC
et al. Saccharomyces cerevisiae CDC25
(1.028-1.589) is a guanine nucleotide releasing
factor for mammalian Ras proteins and is oncogenic in NIH3T3 cells.
J. Biol. chem. 268, págs. 11.113-11.119,
1.993.
47- Barlat I et al., The
Saccharomyces cerevisiae gene product SDC25
C-domain functions as an oncoprotein in NIH3T3
cells. Oncogene, 8, 215-218,
1.993.
48- Han, J., et al., Lck regulates
Vav activation of members of the Rho family of GTPases. Mol Cell
Biol, 17, págs. 1.346-1.353, 1.997.
49- Gietz, R.D., R. H. Schiestl,
A. R. Willems, and R. A. Woods. Studies on the transformation
of intact yeast cells by LiAC/SS-DNA/PEG procedure.
Yeast, 11: 355-360. 1.995.
50- Mosteller, RD., et al.,
Analysis of interaction between Ras and CDC25 guanine nucleotide
exchange factor using yeast GAL4 two-hybrid system.
Methods Enzymol. 255, 135-48
(1.995).
51- Leanna, C.A., Hannink M. The
reverse two-hybrid system: a genetic scheme for
selection against specific protein/protein interactions.
Nucleic. Acids. Research. 96, 3.341-3.347.
1.996.
52- Kamada, S., et al., A cloning
method for caspase substrates that uses the yeast
two-hybrid system: cloning of the antiapoptotic
gene gelsolin. Proc Natl Acad Sci U S A, 95,
8.532-7 (1.998).
53- Capon, D. J., Chen, E. Y.,
Levinson, A. D., Seeburg, P. H. and Goeddel, D.
V. Complete nucleotide sequences of the T24 human bladder carcinoma
oncogene and its normal homologue, Nature 302 (5.903),
33-37 (1.983).
54- McGrath, J. P., Capon, D. J.,
Smith, D. H., Chen, E. Y., Seeburg, P. H.,
Goeddel, D. V. and Levinson, A. D. Structure and
organization of the human Ki-ras
proto-oncogene and a related processed pseudogene.
Nature 304 (5.926), 501-506
(1.983).
55- Taparowsky, E., Shimizu, K.,
Goldfarb, M. and Wigler, M. Structure and activation
of the human N-ras gene. Cell 34 (2),
581-586 (1.983).
56- Didsbury, J., Weber, R. F.,
Bokoch, G. M., Evans, T. and Snyderman, R.
rac, a novel ras-related family of proteins that
are botulinum toxin substrates, J. Biol. Chem. 264 (28),
16.378-16.382 (1.989).
57- Polakis, P. G., Weber, R. F.,
Nevins, B., Didsbury, J. R., Evans, T. And
Snyderman, R., Identification of the ral and racl gene
products, low molecular mass GTP-binding proteins
from human platelets. J. Biol. Chem. 264 (28),
16.383-16.389 (1.989).
58- Drivas, G. T., Shih, A.,
Coutavas, E., Rush, M. G. and D'Eustachio, P.
Characterization of four novel ras-like genes
expressed in a human teratocarcinoma cell line. Mol. Cell.
Biol. 10 (4), 1.793-1.798 (1.990).
59- Shinjo, K., Koland, J. G.,
Hart, M. J., Narasimhan, V., Johnson, D. I.,
Evans, T. and Cerione, R. A. Molecular cloning of the
gene for the human placental GTP-binding protein Gp
(G25K): identification of this GTP-binding protein
as the human homolog of the yeast
cell-division-cycle protein CDC42.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (24),
9.853-9.857 (1.990).
60- Brown, J. L., Stowers, L.,
Baer, M., Trejo, J., Coughlin, S. and
Chant, J. Human Ste20 homologue hPAK1 links GTPases to the
JNK MAP kinase pathway. Curr. Biol. 6 (5),
598-605 (1.996).
61- Bekri S, Adelaide J,
Merscher S, Grosgeorge J,
Caroli-Bosc F,
Perucca-Lostanlen D, Kelley PM,
Pebusque MJ, Theillet C, Birnbaum D and
Gaudray P. Detailed map of a region commonly amplified at
11q13-->q14 in human breast carcinoma Cytogenet. Cell
Genet. 79 (1-2), 125-131
(1.997).
62- Sanders, L. C., Matsumura, F.,
Bokoch, G. M. and de Lanerolle, P. Inhibition of
myosin light chain kinase by p21-activated kinase.
Science 283 (5.410), 2.083-2.085
(1.999).
63- Sells, M.A., Boyd, J.T. and
Chernoff, J. p21-activated kinase 1 (Pak1)
regulates cell motility in mammalian fibroblasts. J. Cell
Biol. 145 (4), 837-849 (1.999).
64- Bagrodia, S. and Cerione, R.
A. Pak to the future. Trends Cell Biol. 9 (9),
350-355 (1.999).
65- Bonner, T. I., Oppermann, H.,
Seeburg, P., Kerby, S. B., Gunnell, M. A.,
Young, A. C. and Rapp, U. R. The complete coding
sequence of the human raf oncogene and the corresponding structure
of the c-raf-1 gene Nucleic
Acids Res. 14 (2), 1.009-1.015
(1.986).
66- Nassar, N., Horn, G.,
Herrmann, C., Scherer, A., McCormick, F. And
Wittinghofer, A. The 2.2 A crystal structure of the
Ras-binding domain of the serine/treonine kinase
c-Raf1 in complex with RaplA and a GTP analogue
Nature 375 (6.532), 554-560
(1.995).
67- Nassar, N., Horn, G.,
Herrmann, C., Block, C., Janknecht, R. And
Wittinghofer, A. Ras/Rap effector specificity determined by
charge reversal Nat. Struct. Biol. 3 (8),
723-729 (1.996).
68- Emerson, S. D., Madison, V.
S., Palermo, R. E., Waugh, D. S., Scheffler, J.
E., Tsao, K. L., Kiefer, S. E., Liu, S. P. and
Fry, D. C. Solution structure of the
Ras-binding domain of
c-Raf-1 and identification of its
Ras interaction surface Biochemistry 34 (21),
6.911-6.918 (1.995).
69- Mott, H. R., Carpenter, J. W.,
Zhong, S., Ghosh, S., Bell, R. M. and
Campbell, S. L. The solution structure of the
Raf-1 cysteine-rich domain: a novel
ras and phospholipid binding site Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 93 (16), 8.312-8.317 (1.996).
70- Vojtek, A. B., S. M.
Hollenberg, and J. A. Cooper.. Mammalian Ras interacts
directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell, 74:
205-214. (1.993).
<110> AVENTIS PHARMA SA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Utilización de la proteína GRF1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> GRF1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1275
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1262
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Utilización de una proteína que presenta una
identidad de al menos 85% con una proteína Factor 1 de Liberación
de Nucleótido de Guanina (GRF1) o de células que expresen dicha
proteína, en un método de detección de compuestos destinados a la
prevención y/o al tratamiento de patologías o trastornos del sistema
nervioso central que impliquen una muerte neuronal o estén
asociados a la obesidad.
2. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho método de detección consta de una
etapa de medición de la fosforilación de la proteína GRF1.
3. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho método comprende una etapa de
medición de la actividad de intercambio de la proteína GRF1 en las
proteínas de la familia de las proteínas G pequeñas, especialmente
Ras, Rac y Cdc42.
4. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho método comprende una etapa de
medición de la interacción entre la proteína GRF1 y las subunidades
beta-gamma de las proteínas G heterotriméricas.
5. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho método de detección consta de una
etapa para poner en contacto los compuestos que se van a cribar con
las levaduras transformadas por grf1.
6. Utilización según la reivindicación 5,
caracterizada porque dicho método de detección consta de una
etapa para poner en contacto los compuestos que se tienen que
cribar con las levaduras transformadas por grf1 y cuyos genes CDC25
y/o CDC24 han sido inactivados o mutados.
7. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho método de detección consta de una
etapa para poner en contacto los compuestos que se tienen que
cribar con las levaduras que expresan una primera proteína híbrida
constituida por una proteína de fusión entre Ras, CDC42Hs o Rac y un
dominio de interacción con el ADN y una segunda proteína híbrida
constituida por una proteína de fusión entre todo o parte de GRF 1
y un dominio transactivador.
8. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho método de detección consta de una
etapa para poner en contacto los compuestos que se tienen que
cribar con las levaduras que expresan una proteína que presenta una
identidad de al menos 85% con una proteína GRF1, PAK1 fusionada con
un dominio transactivador y Rac o CDC42Hs fusionada con un dominio
de interacción con el ADN.
9. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho método de detección consta de una
etapa para poner en contacto los compuestos que se tienen que
cribar con las levaduras que expresan una proteína que presenta una
identidad de al menos 85% con una proteína GRF1, Raf1 fusionada con
un dominio transactivador y Ras fusionada con un dominio de
interacción con el ADN.
10. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes caracterizada porque la
patología es isquemia cerebral, enfermedad de Parkinson o
enfermedad de Alzheimer.
11. Procedimiento de cribado o de detección de
compuestos destinados a la prevención y/o al tratamiento de
pato-
logías del sistema nervioso central que impliquen una muerte neuronal, que comprende las etapas que consisten en:
logías del sistema nervioso central que impliquen una muerte neuronal, que comprende las etapas que consisten en:
- (i)
- poner en cultivo células constituidas por células que expresan la proteína GRF1 en presencia de un substrato de fosforilo marcado con un compuesto que se va a ensayar,
- (ii)
- lisar dichas células y
- (iii)
- medir la cantidad de proteína GRF 1 marcada.
12. Procedimiento de cribado o de detección de
compuestos destinados a la prevención y/o al tratamiento de
patologías del sistema nervioso central que impliquen una muerte
neuronal, que comprende las etapas previas que consisten en:
- (i)
- poner en cultivo células constituidas por células que expresan la proteína GRF1 en presencia de un compuesto que se va a ensayar,
- (ii)
- lisar dichas células y
- (iii)
- medir la cantidad de GRF1 fosforilada con ayuda de un anticuerpo específico de un aminoácido fosforilado.
13. Procedimiento de cribado o de detección de
compuestos destinados a la prevención y/o al tratamiento de
patologías del sistema nervioso central que impliquen una muerte
neuronal, que comprende las etapas que consisten en:
- (i)
- poner en presencia de la proteína GRF 1, todo o parte de una proteína de la familia de las proteínas G pequeñas, cargada en GDP o en GTP marcado y un compuesto que se vaya a ensayar,
- (ii)
- añadir respectivamente GTP o GDP no marcado y
- (iii)
- medir la cantidad de proteína G marcada.
14. Procedimiento de detección por cribado
celular e in vitro de compuestos destinados a la prevención
y/ o al tratamiento de patologías del sistema nervioso central que
impliquen una muerte neuronal, que comprende las etapas que
consisten en:
- (i)
- transinfectar células de mamíferos inmortalizadas por un vector que expresa un transgen grf1 y que confiere a dichas células una resistencia a un agente de selección
- (ii)
- seleccionar y clonar dichas células transinfectadas y que expresan el transgen y clonarlas en un soporte de crecimiento en agar,
- (iii)
- añadir dichos compuestos que se van a ensayar a una suspensión de dichas células y
- (iv)
- detectar dichos compuestos inhibidores de GRF1 por disminución del número de clones.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0010539 | 2000-08-10 | ||
| FR0010539A FR2812945B1 (fr) | 2000-08-10 | 2000-08-10 | Utilisation de la proteine grf1 et cellules exprimant la proteine grf1 pour le criblage de molecules |
| PCT/FR2001/002561 WO2002012901A2 (fr) | 2000-08-10 | 2001-08-07 | Utilisation de la proteine grf1 pour le criblage de molecules |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2304393T3 true ES2304393T3 (es) | 2008-10-16 |
Family
ID=8853473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01963064T Expired - Lifetime ES2304393T3 (es) | 2000-08-10 | 2001-08-07 | Utilizacion de la proteina grf-1 para el cribado de moleculas. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20050100972A1 (es) |
| EP (1) | EP1314040B1 (es) |
| JP (1) | JP4868692B2 (es) |
| AT (1) | ATE391915T1 (es) |
| AU (2) | AU8411201A (es) |
| CA (1) | CA2418655C (es) |
| DE (1) | DE60133563T2 (es) |
| DK (1) | DK1314040T3 (es) |
| ES (1) | ES2304393T3 (es) |
| FR (1) | FR2812945B1 (es) |
| WO (1) | WO2002012901A2 (es) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050208595A1 (en) * | 2004-03-19 | 2005-09-22 | Brown Arthur M | High throughput assay systems and methods for identifying agents that alter expression of cellular proteins |
| WO2012016963A1 (en) | 2010-08-02 | 2012-02-09 | Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor | Peptides for the treatment of brain diseases |
| US10528897B2 (en) * | 2011-04-28 | 2020-01-07 | Intuit Inc. | Graph databases for storing multidimensional models of software offerings |
| CN108614119A (zh) * | 2018-04-23 | 2018-10-02 | 南京医科大学第二附属医院 | 一种尿液exosome的蛋白标记物的检测方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5426029A (en) * | 1986-03-31 | 1995-06-20 | T Cell Diagnostics, Inc. | Therapeutic and diagnostic methods using leukocyte surface antigens |
| FR2690162B1 (fr) * | 1992-04-21 | 1995-08-04 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Peptides ayant une activite de facteur d'echange du gdp, sequences d'acides nucleiques codant pour ces peptides, preparation et utilisation. |
| US5518911A (en) * | 1995-01-06 | 1996-05-21 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Human PAK65 |
| DE69729145T2 (de) * | 1996-05-24 | 2005-06-09 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Reagenz und Verfahren zur Inhibierung der N-RAS Expression |
| US5700821A (en) * | 1996-07-30 | 1997-12-23 | University Of Pittsburgh | Phosphatase inhibitors and methods of use thereof |
| US6238881B1 (en) * | 1996-11-06 | 2001-05-29 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acids and polypeptides related to a guanine exchange factor of Rho GTPase |
| US6340575B1 (en) * | 1997-06-17 | 2002-01-22 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating abnormal cell growth related to unwanted guanine nucleotide exchange factor activity |
| GB9722320D0 (en) * | 1997-10-22 | 1997-12-17 | Janssen Pharmaceutica Nv | Human cell cycle checkpoint proteins |
| IT1306190B1 (it) * | 1999-01-04 | 2001-05-30 | Dipartimento Di Biotecnologie | Mutanti di proteine e plasmidi idonei per la loro sintesi. |
| CA2259830A1 (en) * | 1999-01-20 | 2000-07-20 | Hsc Research And Development Limited Partnership | Ras activator nucleic acid molecules, proteins and methods of use |
| US6589773B1 (en) * | 2000-02-17 | 2003-07-08 | Morphochem, Inc. | Methods and compositions for a modified yeast strain with increased permeability and uses thereof |
-
2000
- 2000-08-10 FR FR0010539A patent/FR2812945B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-08-07 DK DK01963064T patent/DK1314040T3/da active
- 2001-08-07 DE DE60133563T patent/DE60133563T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 JP JP2002517534A patent/JP4868692B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-07 AU AU8411201A patent/AU8411201A/xx active Pending
- 2001-08-07 AT AT01963064T patent/ATE391915T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-08-07 CA CA2418655A patent/CA2418655C/fr not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-07 WO PCT/FR2001/002561 patent/WO2002012901A2/fr active IP Right Grant
- 2001-08-07 US US10/344,223 patent/US20050100972A1/en not_active Abandoned
- 2001-08-07 EP EP01963064A patent/EP1314040B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 ES ES01963064T patent/ES2304393T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 AU AU2001284112A patent/AU2001284112B2/en not_active Ceased
-
2011
- 2011-08-03 US US13/197,242 patent/US8852878B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60133563T2 (de) | 2009-04-30 |
| US20050100972A1 (en) | 2005-05-12 |
| AU2001284112B2 (en) | 2007-03-22 |
| US20120009604A1 (en) | 2012-01-12 |
| CA2418655A1 (fr) | 2002-02-14 |
| JP4868692B2 (ja) | 2012-02-01 |
| EP1314040A2 (fr) | 2003-05-28 |
| US8852878B2 (en) | 2014-10-07 |
| AU8411201A (en) | 2002-02-18 |
| ATE391915T1 (de) | 2008-04-15 |
| JP2004537961A (ja) | 2004-12-24 |
| EP1314040B1 (fr) | 2008-04-09 |
| DK1314040T3 (da) | 2008-08-04 |
| WO2002012901A3 (fr) | 2002-09-06 |
| DE60133563D1 (de) | 2008-05-21 |
| WO2002012901A2 (fr) | 2002-02-14 |
| CA2418655C (fr) | 2011-12-13 |
| FR2812945A1 (fr) | 2002-02-15 |
| FR2812945B1 (fr) | 2002-10-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| McWilliams et al. | Phosphorylation of Parkin at serine 65 is essential for its activation in vivo | |
| Huppke et al. | Homozygous NMNAT2 mutation in sisters with polyneuropathy and erythromelalgia | |
| ES2299205T3 (es) | Factor de transcripcion islet-brain 1 (ib1). | |
| Lee et al. | Pyk2 signaling through Graf1 and RhoA GTPase is required for amyloid-β oligomer-triggered synapse loss | |
| US9034299B2 (en) | ATF4 inhibitors and their use for neural protection, repair, regeneration, and plasticity | |
| Ishikawa et al. | Regulation of Bax translocation through phosphorylation at Ser-70 of Bcl-2 by MAP kinase in NO-induced neuronal apoptosis | |
| Vaucher et al. | Amyloid β peptide levels and its effects on hippocampal acetylcholine release in aged, cognitively-impaired and-unimpaired rats | |
| Kelly | A role for phosphodiesterase 11A (PDE11A) in the formation of social memories and the stabilization of mood | |
| US8852878B2 (en) | Method for identifying an antagonist of guanine nucleotide releasing factor 1 | |
| Singer et al. | Brain-penetrant PQR620 mTOR and PQR530 PI3K/mTOR inhibitor reduce huntingtin levels in cell models of HD | |
| Bhagat et al. | Mouse model of rare TOR1A variant found in sporadic focal dystonia impairs domains affected in DYT1 dystonia patients and animal models | |
| Cains et al. | Addressing a folate imbalance in fetal cerebrospinal fluid can decrease the incidence of congenital hydrocephalus | |
| ES2665849T3 (es) | Biomarcador para el diagnóstico de envejecimiento o amiotrofia | |
| Cooper et al. | Familial Parkinson's disease iPSCs show cellular deficits in mitochondrial responses that can be pharmacologically rescued | |
| Ding et al. | Fbxl18 targets LRRK2 for proteasomal degradation and attenuates cell toxicity | |
| Janson et al. | Functional regulatory regions of human transcription factor MEF2C | |
| EP1272517B1 (en) | Multiprotein-complexes comprising a nmda receptor and uses thereof | |
| Schulze-Krebs et al. | In situ enzymatic activity of transglutaminase isoforms on brain tissue sections of rodents: A new approach to monitor differences in post-translational protein modifications during neurodegeneration | |
| ES2328033T3 (es) | Modulacion de la actividad quinasa s6 para el tratamiento de la obesidad. | |
| ES2315273T3 (es) | Parejas del dominio ptb1 de fe65, preparacion y utilizaciones. | |
| Vitiello et al. | Corpus callosum abnormalities: neuroimaging, cytogenetics and clinical characterization of a very large multicenter Italian series | |
| JP2003533226A (ja) | 神経細胞のセリンスレオニンプロテインキナーゼ | |
| Nguyen | The Function of Neurofibromatosis Type 1 Exon 23a Alternative Splicing in Ras/Erk Signaling and Learning Behaviors in Mice | |
| Hao | Regulation of Regenerative and Degenerative Responses to Axonal Injury | |
| JP2005516608A (ja) | エネルギー恒常性の調節に関与するキナーゼ |