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Technisches
Gebiet
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Die vorliegende Erfindung ist im
Bereich von Tests angesiedelt, die verwendet werden, um Mittel zur
Behandlung der Alzheimerschen Krankheit zu identifizieren. Genauer
stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung beim Durchtesten („Screening") von Mitteln bereit,
die zum Verringern der β-Amyloid-Bildung/-Sekretion/-Ablagerung
verwendet werden, hauptsächlich
bei der Behandlung der Alzheimerschen Krankheit.
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Hintergrund
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Die Alzheimersche Krankheit (Alzheimer)
ist eine häufige,
altersbezogene, degenerative Gehirnkrankheit. Die Krankheit ist
durch fortschreitende Demenz zusammen mit dem Vorhandensein von
charakteristischen, neuropathologischen Merkmalen bestimmt. Die
Bildung von β-Amyloid-Ablagerungen oder
Plaques ist ein Kennzeichen und diagnostisches Merkmal der Alzheimerschen
Krankheit (Khachaturian (1985) Arch. Neurol. 42, 1097–1105). Ein
beachtliches Beweismaterial weist darauf hin, dass der Prozess der β-Amyloid-Bildung
und -Ablagerung direkt mit der Entwicklung dieser Krankheit verbunden
ist. Beispielsweise entwickeln Individuen mit Mutationen in dem
Gen, das das β-Amyloidvorläuferprotein
(β-APP)
kodiert, ausnahmslos die Alzheimersche Krankheit (Goate et al. (1991)
Nature 353, 844–846;
Mullan et al. (1992) Nature Genet 1, 345–347; Murrell et al. (1991)
Science 254, 97–99; Van
Broeckhoven (1995) Eur. Neurol. 35, 8–19). Das β-Amyloidpeptid ist ein 39–43-Aminosäurenprotein (Glenner
et al. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 885–890; Masters
et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4245–4249),
das fähig
ist, β-Faltblatt-Aggregate
zu bilden. Die aggregierenden Fibrillen werden nachfolgend im Parenchym
des Gehirns oder in den Blutgefäßen des
Gehirns des Opfers der Alzheimerschen Krankheit abgelagert.
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Das β-Amyloid-Peptid stammt aus einem größeren Typ
I-Membranumspannenden Protein, β-APP,
das mehrere mögliche
gespleißte
Transkripte aufweist (Kang et al. (1987) Nature 325, 530–532; Ponte
et al. (1988) Nature 331, 525–527;
Tanzi et al. (1988) Nature 331, 528–530; Kitaguchi et al. (1988) Nature
331, 530–532;
de Savage et al. (1989) Science 245, 651–653). Die differenziell-gespleißten Transkripte
führen
zu β-APP
mit 695, 714, 751 und 770 Aminosäuren.
Die biologische Funktion von β-APP
ist nicht gut verstanden, obwohl es so aussieht, dass es beim Zell-Zell-Kontakt,
beim Zell-Überleben
und bei der Zell-Proliferation arbeitet (Schubert et al. (1989)
Neuron 3: 689–694;
Saitoh et al. (1989) Cell 58: 615–622; Chen et al. (1991) Neurosci.
Lett. 125, 223–251;
Mattson et al. (1993) Neuron 10, 243–254).
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Eine sekretierte Form des β-APP wird
normalerweise durch proteolytische Spaltung erzeugt (Weidemann et
al. (1989) Cell 57, 115–126).
Diese proteolytische Spaltung erfolgt innerhalb des β-Amyloid-Bereichs
unter Ausschluß der β-Amyloidbildung (Esch
et al. (1990) Science 248, 1122–1124;
Sisodia et al. (1990) Science 248, 492–495). Als Folge der Spaltung
wird der Hauptteil des β-APP
aus der Zelle sekretiert und ein Fragment von ~8 kDa des Carboxyl-Endes
verbleibt an der Zellmembran gebunden. Das Enzym bzw. die Enzyme,
das bzw. die für
dieses nichtamyloidogene Prozessieren des β-APP verantwortlich ist, wird γ-Sekretase
genannt.
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Die Bildung des β-Amyloidpeptids ist normalerweise
ein physiologischer Prozess. Es wurde gefunden, dass das Peptid
natürlich
in Zellkulturen in vitro gebildet wird (Haas et al (1992) Nature
359, 322–325;
Seubert et al (1992) Nature 359, 325–327; Shoji et al (1992) Science
258, 126–129;
und in vivo (Seubert et al (1992) Nature 359, 325–327; Vigo-Pelfrey
et al. (1993) J. Neurochem. 61, 1965–1968; Tabaton et al (1994)
Biochem. Biophys. Res. Commun. 200, 1598–1603; Teller et al. (1996)
Nature Med. 2, 93–95).
Das β-Amyloidpeptid scheint
ein Abbau-Nebenprodukt des intrazellulären Katabolismus der nicht-sekretierten
Form des β-APP
zu sein (Higaki et al (1995) Neuron 14, 651–659), und das Inhibieren seiner
Bildung hat keine offensichtlich schädlichen Folgen in vitro. Es
sind zwei proteolytische Prozessierungsschritte erforderlich, um
das β-Amyloidpeptid
zu erzeugen: einer erzeugt das Amino-Ende des Peptids unter Mitwirkung
eines nicht-identifizierten Enzyms bzw. Enzyme, das als β-Sekretse
bezeichnet wird, der zweite bildet das Carboxyl-Ende des Peptids,
das durch ein nicht-identifiziertes Enzym bzw. Enzyme erzeugt wird,
das als γ-Sekretase
bezeichnet wird.
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Die US-A-5385915 offenbart ein Verfahren zur
Regulierung der Phosphorylierung von Proteinen, die beim Kontrollieren
des Prozessierens oder der Funktion von Schlüsselproteinen, die im intrazellulären, neurofibrillären Gewirr
gefunden werden, und extrazellulären
Amyloid-Plaques, die mit der Alzheimerschen Krankheit in Verbindung
gebracht werden, beteiligt sind, was ein Einbringen einer wirksamen Menge
eines Kinasereglers oder Phosphotasereglers umfasst, wobei der Regler
die Fähigkeit
hat, die Geschwindigkeit des proteolytischen Prozessierens zu erhöhen oder
abzuschwächen
oder den Funktionsbereich der Schlüsselproteine zu regeln.
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In der Wissenschaftsgemeinde der
Alzheimerschen Krankheit wurde Augenmerk auf das Inhibieren des
Prozessierens von β-APP
in das β-Amyloidpeptid als
ein Ansatz zu einer neuartigen, therapeutischen Entwicklung für die Alzheimersche
Krankheit gerichtet. Weder die prozessierenden Enzyme β- noch γ-Sekretase
wurden eindeutig bestimmt oder gereinigt. Es gibt keinen Test, der
reine β-APP
und reine β-Amyloid-bildende
Enzyme enthält.
Intakte, kultivierte Zellen stellen eine Quelle für β-Amyloidpeptid
bereit. Überprüfungen (engl.:
screens) für
Verbindungen, die die β-Amyloidbildung
hemmen, wurden auf der Basis von Messungen der β-Amyloidbildung in Zellkulturen
nach Anwendung einer Testverbindung entwickelt. Die Toxizität der Verbindung
wird gleichzeitig gemessen. Testverbindungen, die als nicht-toxische
Inhibitoren in solch einem Test gelten, werden dann auf Aktivität in Tieren
getestet. Die Tierversuche sind jedoch arbeitsaufwändig, teuer
und zeitaufwändig.
Dazu kommt, dass viele wesentliche Hindernisse vorhanden sind, die
Inhibition der β-Amyloidbildung in
einem Tier zu erhalten, die in Zellkultur nicht existieren, einschließlich Abbau
und Ausleitung der Verbindung, beschränkter Zugang zum Zielorgan
(Gehirn), der durch die Blut-Hirn-Schranke auferlegt wird, und selektive
Zelltoxizität.
Somit sind negative Ergebnisse bei Tierversuchen schwierig zu deuten
und sind von beschränkter
Verwendbarkeit für
die Unterrichtung zum Strukturdesign anderer Verbindungen. Aus diesen
Gründen
ist es äußerst wünschenswert,
ein System zum Testen von Verbindungen auf die β-Amyloid-hemmende Aktivität und Toxizität zu erhalten,
das der Komplexität
des intakten Zielorgans gleicht, und somit die technischen Schwierigkeiten
des Durchführens
und Interpretierens der gesamten Tierversuchsexperimente umgeht.
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Organotypische Schnittkulturverfahren
wurden für
das Gehirn entwickelt, bei denen Explantate oder Sektionen des ganzen
Gehirns, oder üblicherweise
eine bestimmte anatomische Gehirnstruktur, wie beispielsweise Hippocampus
oder Kleinhirn, in Kultur für
längere
Zeiträume
erhalten werden können (Seil
(1979) Review in Neuroscience 4, 105–177; Gahwiler (1981) J. Neurosci.
Meth. 4, 329–342; Gahwiler
(1984) Neuroscience 11, 751–760, Gahwiler
(1988) Trends Neurosci. 11, 484–490). Kürzlich wurden
deutliche Verbesserungen entwickelt, so dass besser reproduzierbare
Ergebnisse durch ein vereinfachtes Verfahren erlangt werden können (Stoppini
et al., (1991) J. Neurosci. Methods 37, 173–182). Ein notwendiges Merkmal
solcher Kulturen ist die ausgeprägte
Bewahrung von organotypischer Gewebearchitektur: die zelluläre Anatomie
ist der des intakten Gehirns sehr ähnlich, bis zum Ausmaß, dass
synaptische Eingaben und die Funktion die der normalen Situation
nachahmt, und die Entwicklung setzt sich in neonatale Hirnschnitte
fort. Typischerweise werden diese Präparate für elektrophysiologische Studien
zur Untersuchung von Gehirn-Phänomenen,
wie der biochemischen Basis des Lernens, verwendet, was eine komplexe
Interaktion der Zellen erfordert, die nur in intakten Tieren oder
in organotypischen Schnittkulturen verfügbar ist. Bisher sind nur zwei
Beispiele von Verwendung von orgnotypischen Gehirnschnittkulturen
im Stand der Technik bezüglich
Alzheimersche Krankheit bekannt. London et al. (1996) Proc. Natl.
Acad. Sci. 93, 4147–4153) schauten
nach Wechselwirkungen verschiedener Gehirnzelltypen durch Anwenden
von mit synthetischem Amyloid vorbehandelten Monozyten auf organotypische
Hirnschnittkulturen, wobei man das Zellüberleben misst. Nitsch, Wurtzmann,
und Kollegen untersuchten die Wirkungen der neuralen Stimulation durch
Elektroden und Neurotransmitter auf den Hirnkreislauf (Diekman et
al. (1994) J. Neural. Transm. Suppl. 44, 61–71) und die Sekretion von
Amyloid-Vorläuferprotein
(Nitsch et al. (1994) J. Neural. Transm. Suppl. 44, 21–27); Farber
et al. (1995) J. Neurosci. 15, 7442–7451).
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Das organotypische Schnittkulturverfahren wurde
nicht mit Tests für β-Amyloid und Zelllebensfähigkeit
verknüpft,
um die Amyloidbildung und/oder die Wirkung der Testverbindungen
auf dessen Herstellung zu untersuchen. Die vorliegende Erfindung basiert
in Teilen auf der Verknüpfung
von organotypischen Schnittkulturverfahren mit β-Amyloid-Testverfahren. Die
resultierenden Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen ein
schnelles und effizientes Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen,
die verwendet werden können,
um Alzheimer zu behandeln, bereit.
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Der Stand der Technik zum Testen
von Verbindungen zur Hemmung der β-Amyloidbildung
verließ sich
auf das Testen der Aktivität
im ganzen Tier, in Primärzellen
oder Zelllinienkulturen, aufgeschlossenen Zellen oder Zell- oder
Gewebehomogenaten oder reinen Enzymaufarbeitungen. Mit Ausnahme des
ganzen Tieres, imitiert keines dieser Verfahren die Komplexität der Zelltypen
und der Wechselwirkungen, die im Gehirn vorkommen. Es ist bekannt, dass
zelluläre
Wechselwirkungen das β-Amyloid-Vorläuferprotein
und die β-Amyloid-Bildung und -Sekretion
beeinflussen und man kann erwarten, dass sie Verfügbarkeit,
Abbau und Verträglichkeit
der Verbindung im Gehirn beeinflussen. Organotypische Hirnschnittkulturen
bieten das gesamte Spektrum an Zelltypen, die im Gehirn vorhanden
sind, mit bemerkenswert gut erhaltener Organisation und zellulären Wechselwirkungen.
Somit sind Wirkungen von Testverbindungen auf die β-Amyloidbildung
und zelluläre Lebensfähigkeit
und Funktion bessere Voraussager von in-vivo-Effekten, als diese
Messungen, die an weniger komplexen Einzelzell-Systemen durchgeführt werden.
Mögliche
Verbindungen, die toxische Effekte oder fehlende Effizienz aufweisen,
die bei den organotypischen Präparaten
offensichtlich sind, aber die nicht in Zellkultursystemen offensichtlich
wären,
können
vor dem Weitermachen mit Tierversuchen ausgeschlossen werden.
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Ganztierexperimente sind arbeitsaufwändig, teuer
und zeitaufwändig
durchzuführen.
Dazu kommt, dass relativ große
Mengen an Testverbindungen synthetisiert werden müssen, um
diese in Tiere zu dosieren. Beispielsweise ist bei den gegenwärtigen Tierversuchsprotokollen
allgemein ein Minimum von sieben Tieren pro Messpunkt erforderlich
aufgrund der Varianz in Tieren und der hohen Empfindlichkeit, die
für die
Tests erforderlich ist. Jede Bestimmung mit organotypischen Kulturen
erfordert einen Bruchteil der Anzahl an Tieren, verglichen mit einer ähnlichen
Bestimmung in vivo: etwa 3 Schnitte (20 werden pro Maus erhalten,
30 pro Ratte) pro Messpunkt im Unterschied zu 7 Tieren pro Messpunkt,
was einer 70-fachen Verringerung der Anzahl der erforderlichen Tiere
entspricht. Die Dosisreaktion und der zeitliche Ablauf der Untersuchungen,
die in organotypischen Schnittexperimenten durchgeführt werden, erleichtern
die anfängliche
Auswahl für
die Dosierungspläne
in vivo, verringern die Anzahl der erforderlichen Experimente in
vivo mit erforderlichen Dosierungsplänen.
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Ein weiterer wesentlicher Nachteil
der Ganztierexperimente ist die Anzahl der Variablen, die nicht kontrolliert
werden können
und schwer abzuschätzen sind.
Wenn beispielsweise eine Verbindung ohne Wirkung ist, könnte dies
aufgrund von schneller Ausleitung aus dem Blut, schnellem Abbau,
Aufnahme durch ein Nicht-Zielgewebe, oder die Unfähigkeit,
die Blut-Hirn-Schranke
zu durchdringen, sein. Die Dosierung kann durch Toxizität gegenüber einem
empfindlichen Nicht-Zielorgan beschränkt sein. Die Bestimmung des
Beitrags dieser Faktoren zu einem negativem Ergebnis ist eine größere Aufgabe.
Somit sind negative Ergebnisse nicht für das Aufstellen von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen
dienlich, um die Entwicklung von verbesserten Verbindungs-Strukturen zu
leiten. Organotypische Schnittkulturen unterdrücken oder minimieren diese
Variablen, da die Blut-Hirn-Schranke und andere Gewebe nicht vorhanden
sind. Der Abbau einer Verbindung ist leicht durch die Probenmedien
zu bewerten. Die Dosierung im Zielorgan ist leicht zu kontrollieren.
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Offenbarung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt
Verfahren bereit, die zur Bestimmung von β-Amyloid-verringernden Verbindungen
verwendet werden können. Die
vorliegende Erfindung basiert auf der Verwendung von organotypischen Hirnschnittkulturverfahren zur
gleichzeitigen Bewertung der Toxizität und β-Amyloid-verringernder Aktivität einer
Testverbindung.
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Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren
zur Identifizierung von β-Amyloid-verringernden
Mitteln bereitgestellt, das folgende Schritte umfasst:
- a) Herstellen einer organotypischen Hirnschnittkultur
- b) Bestimmen der Lebensfähigkeit
von Zellen in der organotypischen Hirnschnittkultur,
- c) Anwendung einer Testverbindung auf die organotypische Hirn-Schnittkultur,
- d) Bewertung der Lebensfähigkeit
und der β-Amyloidbildung
(i) der behandelten organotypischen Hirnschnittkultur von Stufe
(c) und (ii) einer nicht behandelten organotypischen Hirnschnittkultur
- e) Identifizieren einer Verbindung, die die β-Amyloidbildung verringert,
jedoch nicht die Lebensfähigkeit
der Zelle verringert oder andere Zellfunktionen verändert,
wobei
die organotypische Hirnschnittkultur von a) und die unbehandelte
organotypische Hirnschnittkultur von d) nicht von einem menschlichen
Fötus stammen.
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Kurze Beschreibung der
Abbildungen
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1 Immunohistochemische
Charakterisierung von organotypischen Schnittkulturen aus Hippocampus.
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2 β-Amyloid
1-40-Sekretion von organotypischen Schnittkulturen aus Hippocampus.
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3 β-Amyloid
1-40-Sekretion von organotypischen Schnittkulturen aus Hippocampus,
die aus β-APP751-transgenen
Mäusen
präpariert
wurden.
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4 Bewertung
der Testverbindung MDL 28170 auf Lebensfähigkeit und β-Amyloid-Sekretion von
organotypischen Schnittkulturen.
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Ausführungsformen zur Durchführung der
Erfindung
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Allgemeine
Beschreibung
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β-Amyloid und β-Amyloid-Vorläufer-Protein
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Wie hier verwendet, bezieht sich „β-Amyloidpeptid
oder -protein" auf
jede β-Amyloid-Spezies
von Proteinen. Solche Proteine haben typischerweise ~4 kDa. Mehrere
verschiedene Sequenzen der Aminoenden und der heterogenen Carboxylenden
wurden auf der Basis der Charakterisierung des peptidischen β-Amyloid-Proteins
aus Gewebe der Alzheimerschen Krankheit und aus Zellkulturen beobachtet
(Glenner and Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 885–890; Joachim
et al. (1988) Brain Res. 474, 100; Prelli et al. (1988) J. Neurochem.
51, 648–651; Mori
et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 17082–17806; Seubert et al. (1992)
Nature 359, 325–327;
Naslund et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8378–8382; Roher
et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10836–10840;
Busciglio et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2092–2096; Haass
et al. (1992) Nature 359, 322–325).
Insbesondere im Hinblick auf die Carboxylenden wurde gezeigt, dass
das β-Amyloidpeptid
bei Position 39, 40, 41, 42, 43 oder 44 endet, wobei Position 1
das Aspartat der β-Amyloidsequenz ist,
wie durch Glenner und Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun.
120, 885–890
definiert.
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Der Begriff „β-Amyloid-Vorläuferprotein" oder „β-APP" bezieht sich auf
jede der differenziell-gespleißten
Isoformen dieses Proteins, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, die
695-, 714-, 751- und 770-Aminosäuren-Isoformen
(Kang et al. (1987) Nature 325, 530–532; Ponte et al. (1988) Nature
331, 525– 527;
Tanzi et al. (1988) Nature 331, 528–530; Kitaguchi et al. (1988)
Nature 331, 530–532;
de Savage et al. (1989) Science 245, 651653). Der Begriff β-APP schließt auch
natürlich
vorkommende menschliche Mutanten des β-APP ein (Goate et al. (1991)
Nature 353, 844–846;
Mullan et al. (1992) Nature Genet. 1, 345–347; Murrell et al. (1991)
Science 254, 97–99;
Van Broeckhoven (1995) Eur. Neurol. 35, 8–19); Wildtyp-β-APP; mutantes β-APP, hergestellt von
Kulturzellen unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahrenstechnik;
und natürliche
oder künstliche
Derivate des β-APP,
die in der Lage sind, β-Amyloid
zu erzeugen.
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Organotypische Hirnschnittkulturen
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Wie hier verwendet, bezieht sich
der Begriff „organotypische
Hirnschnittkultur" auf
Sektionen oder Explantate des Hirngewebes, das in Kultur gehalten
wird (Seil, 1979) Review in Neuroscience 4: 105–177; Gahwiler (1981) J. Neurosci.
Meth. 4, 329–342;
Gahwiler (1984) Neuroscience 11, 751–760, Gahwiler (1988) Trends
Neurosci 11, 484–490;
Stoppini et al., (1991) J. Neurosci. Methods 37, 173–182). Ein
Fachmann kann leicht aus dem Stand der Technik bekannte organotypische
Hirnschnittkulturverfahren zur Verwendung für die vorliegende Erfindung
anwenden.
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Organotypische Hirnschnittkulturen
können Sektionen
des gesamten Hirngewebes oder Explantate verwenden, die aus spezifischen
Regionen des Hirns erhalten wurden. Jede Region kann verwendet werden,
um organotypische Hirnschnittkulturen zu erzeugen. Jedoch sind die
bevorzugte Quelle für
organotypische Hirnschnittkulturen Explantate, die aus spezifischen
Regionen des Hirns, vorzugsweise des Hippocampus oder der Cortex-Region,
stammen.
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Präparierung
der organotypischen Hirnschnittkulturen
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Jeder Säuger, der kein menschlicher
Fötus ist,
kann als Gewebequelle für
das Explantat verwendet werden, das verwendet wird, um organotypische Hirnschnittkulturen
zu erzeugen, die bei dem vorliegenden Verfahren verwendet werden,
soweit das Tier als Gewebequelle dienen kann und die organotypische
Schnittkultur für
einen Zeitraum eingerichtet und erhalten werden kann, der ausreicht,
um die vorliegenden Verfahren durchzuführen. Solche Säuger schließen Ratten,
Mäuse,
Meerschweinchen, Affen und Kaninchen ein, sind aber nicht darauf
beschränkt.
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Der Säuger, der als Gewebequelle
verwendet wird, kann ein Wildtypsäuger sein oder kann ein Säuger sein,
der genetisch verändert
wurde, um ein eingeführtes
Gen zu enthalten und zu exprimieren. Vorzugsweise wird das Tier
ein transgenes Tier sein, wie beispielsweise eine transgene Maus,
die verändert
wurde, um die neurale Bildung des β-Amyloid-Vorläuferproteins
zu exprimieren (Quon et al. (1991) Nature 35, 598–607; Higgins
et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92, 4402–4406).
Am meisten bevorzugt wird das Tier so verändert, dass es ein β-Amyloid-Vorläuferprotein
exprimiert, das von menschlichen β-Amyloid-Sequenzen
abgeleitet wurde oder darauf basiert.
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Der Säuger, der als Gewebequelle
verwendet wird, kann jeden Alters sein. Vorzugsweise wird die Säugetiergewebequelle
ein neonataler, nicht-menschlicher
Säuger
sein.
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Um Gewebe zur Kultivierung aus lebenden Tieren
zu erhalten, wird das Tier vorzugsweise schnell getötet und
enthauptet, das wird im Allgemeinen gleichzeitig durchgeführt. Das
Gehirn wird dann schnell in ein Seziermedium, das auf physiologischen
pH gepufferf ist, überführt. Ein
Beispiel eines solchen Mediums ist ein Minimal-Essential-Medium (MEM)
mit 10 mM Tris, pH 7,2 gepuffert und mit Antibiotika ergänzt.
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Das Gehirn oder die gewünschte Gehirnregion
wird dann unter einem Seziermikroskop unter sterilen Bedingungen
isoliert. Das gesamte Hirngewebe kann verwendet werden, um eine
organotypische Hirnschnittkultur aufzubauen. Alternativ kann ein spezifischer
Bereich oder eine Region des Gehirns als Explantatquelle verwendet
werden. Der bevorzugte Bereich als Quelle für die organotypische Hirnschnittkultur
zur Bewertung der β-Amyloidbildung sind
Hippocampus und Cortex.
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Als nächstes werden kleine Regionen
von dem Gewebe als Schnitte oder Explantate abgetrennt, so dass
das Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis einen
Austausch zwischen dem Mittelpunkt des Gewebes und dem Medium ermöglicht.
Eine Vielzahl von Verfahren kann angewendet werden, um die Hirngewebe
zu schneiden oder zu teilen. Beispielsweise können Seziervorrichtungen verwendet werden.
Die Größe/Dicke
der Gewebeschnitte basieren primär
auf der Gewebequelle und dem zum Sezieren/Teilen angewendeten Verfahren.
Beispielsweise weisen bevorzugte Segmente etwa 400 bis etwa 500 μm im Durchmesser
auf, und werden unter Verwendung eines Gewebeschneiders, einer Rasierklinge
oder anderer geeigneter Sezier/Mikrotom-Klingen hergestellt.
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Nach dem Sezieren werden die Sektionen abgetrennt
und beschädigtes
Gewebe wird entfernt. Die Sektionen des Hirngewebes werden vorzugsweise
in Tropfen von Seziermedium gehandhabt und auf Kulturplatteneinlagen
ins Kulturmedium gelegt. Überschüssiges Medium
wird abgezogen, beispielsweise unter Verwendung eines Papiertuches,
und die Kultur wird in einen Inkubator gestellt.
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Die Wahl des Kulturmediums und der
Kulturbedingungen hängt
von der beabsichtigten Verwendung, der Gewebequelle und der Zeit
ab, bevor die Sektion gemäß des vorliegenden
Verfahrens verwendet wird. Beispiele von Kulturmedien schließen folgende
ein, sind aber nicht darauf beschränkt: 25% Pferdeserum, 50% Minimal-Essential-Medium,
25% Hanksches-Medium, mit Antibiotika und L-Glutamin ergänzt. Beispiele
von Kulturbedingungen schließen 37°C und 5%
CO2 ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
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Die Kulturen können unter besten Bedingungen über einige
Monate gehalten werden. Jedoch werden organotypische Hirnschnittkulturen
vorzugsweise verwendet, nachdem sie sich von dem Schock des Transfers
in die Kultur stabilisiert haben, aber bevor der Verfall einsetzt.
Allgemein ist es bevorzugt, die Schnittkulturen nach etwa einer
Woche bis etwa vier Wochen, nachdem sie hergestellt wurden, zu verwenden.
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Bewertung der Lebensfähigkeit
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Nachdem die organotypische Hirnschnittkultur
erhalten wurde, wird sie auf Lebensfähigkeit vor der Anwendung einer
Testverbindung getestet. Die Lebensfähigkeit/Integrität der organotypischen Schnittkultur
wird üblicherweise
am Beginn jedes Experiments bewertet, um sowohl die Gesundheit des Präparats zu
zeigen als auch ein Maß für den Umfang
an lebendem Gewebe, das in der vorbehandelten Kultur vorhanden ist,
bereitzustellen.
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Jedes im Stand der Technik bekannte
Verfahren zur Bestimmung der Lebensfähigkeit kann verwendet werden.
Beispielsweise schließen
solche Verfahren folgende ein, sind aber nicht darauf beschränkt: visuelle
Untersuchung unter einem Mikroskop; Färben von Schwesterkulturen
mit Vital-Farbstoffen
wie Trypanblau; Färbemittel
und immunohistochemische Reagenzien, die spezifisch für Zelltypen oder
Reste sind, die im normalen oder geschädigten Gehirn vorliegen, wie
beispielsweise Silberfärbemittel
und Antikörper
gegen Neurofilament, gliales fibrillares saures Protein, S100, Mikrotubulus-assoziiertes
Protein, normales oder phosphoreliertes Tau und synaptische Proteine;
biochemische Bewertung der metabolischen Aktivität, wie z. B. mit einem MTT-Test,
oder der zellulären
Undichtigkeit, wie z. B. mit einem Lactat Dehydrogenase (LDH)-Test;
Messung des gesamten oder spezifischen Proteingehalts; oder Bewertung
der zellulären
Funktion, wie beispielsweise der synaptischen Aktivität. Vorzugsweise
wird die neurale Aktivität
durch Messung der Sekretion, wie z. B. der löslichen β-Amyloid-Vorläuferprotein-Sekretion
unter Grundbedingungen oder der Neurotransmitter-Ausschüttung unter
Stimulation, aufgezeichnet. Eine Stimulation kann durch elektrische
Stimulation, ionische Depolarisation (typischerweise mit hohem Kalium)
oder durch Anwendung einer Neurotransmitter-Substanz ausgeführt werden.
Die ausgeschütteten
Substanzen, die typischerweise gemessen werden, sind Neurotransmitter,
die in Neuronen vorhanden sind, wie z. B. Acetylcholin, γ-Aminobuttersäure (GABA),
Glutamat, Catecholamine und Neuropeptide. Ein Fachmann kann leicht
jede der zur Zeit bekannten Lebensfähigkeits-Testverfahren zur Verwendung für die vorliegende
Erfindung anpassen.
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Anwendung der Testsubstanz
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Zu Beginn eines Experiments wird
eine organotypische Schnittkultur üblicherweise in eine Kulturschale
mit Medium überführt. Das
Kulturmedium kann entweder eine Testverbindung vor der Einbringung
der Gewebesektion aufweisen, oder eine Testverbindung kann zu dem
Medium zugegeben werden, nachdem die Gewebesektion in die Kulturschale gelegt
wurde. Generell wird eine Testsubstanz zuerst in einem geeigneten
Träger
gelöst,
wie z. B. in DMSO, Wasser, physiologische Kochsalzlösung oder Medium,
ist aber nicht darauf beschränkt,
um eine Vorratslösung
zu machen, die dann in das Medium verdünnt wird. Im Allgemeinen wird
ein Trägerkontrolltest
angeschlossen, wenn die vorliegende Erfindung angewendet wird.
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Vorzugsweise wird eine Bandbreite
an Dosierungen getestet. Der Testbereich kann am Anfang durch Vorwissen über die
Wirkungen der Substanz oder nahverwandter Substanzen auf gereinigte
Enzyme, β- Amyloidbildung von
Zellkulturen, oder Toxizität
in anderen Testsystemen aufgestellt werden. Bei Nichtvorhandensein
solchen Wissens beträgt
der Dosierungsbereich vorzugsweise etwa 1 nM bis etwa 100 μM. Ein Fachmann
kann leicht einen Testbereich für
jede spezielle Verbindung oder Verbindungsserien entwickeln.
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Die Verbindung wird typischerweise
auf die Gewebesektion für
etwa 4 Stunden bis etwa 21 Tage, vorzugsweise etwa 1 Tag bis etwa
7 Tage angewendet. Im Falle von langzeitiger Anwendung kann frisches
Medium, das die Verbindung enthält,
regelmäßig zugeführt werden;
häufiger,
wenn ein schneller Verlust der Verbindung durch chemische Umwandlung
oder Abbau vermutet wird.
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Testverbindung
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Verbindungen, die mit dem obigen
Verfahren getestet werden, können
statistisch ausgewählt
oder rational ausgewählt
oder entworfen werden. Wie hier verwendet, wird eine Verbindung
statistisch ausgewählt
genannt, wenn die Verbindung willkürlich ohne Berücksichtigung
der Struktur anderer identifizierter, aktiver Verbindungen gewählt wird.
Ein Beispiel von statistisch ausgewählten Substanzen ist die Verwendung
einer chemischen Bibliothek (engl.: chemical library), einer peptidkombinatorischen
Bibliothek (engl.: library), einer Wachstumsbrühe eines Organismus oder eines
Pflanzenextrakts.
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Wie hier verwendet, wird eine Verbindung
rational ausgewählt
oder entwickelt genannt, wenn die Verbindung auf einer nicht-statistischen
Basis ausgewählt
wurde. Eine rationale Auswahl kann auf dem Ziel der Wirkung basieren,
oder auf der Struktur von vormals bestimmten aktiven Verbindungen.
Speziell können
Verbindungen rational ausgewählt
oder rational entwickelt werden durch Verwenden der Struktur von
Verbindungen, die gegenwärtig
für die
Verwendung bei der Behandlung der Alzheimerschen Krankheit untersucht
werden.
-
Die Verbindungen der vorliegenden
Erfindung können
beispielsweise Peptide, kleine Moleküle, Vitaminderivate, sowie
Kohlenhydrate sein. Ein Fachmann kann leicht erkennen, dass es keine
Beschränkung
für die
strukturellen Eigenschaften der Verbindungen der vorliegenden Erfindung
gibt.
-
Bewertung der Wirkungen
der Verbindung
-
Am Ende der Testperiode, dem Zeitraum,
in dem die Testverbindung mit der Schnittkultur in Kontakt ist,
wird die Lebensfähigkeit
der Zellen in der Schnittkultur und die Höhe/der Grad der Amyloidbildung
durch behandelte Kulturen und Kontrollkulturen bewertet. Eine Vielzahl
von dem Fachmann bekannten Verfahren kann angewendet werden, um
die Menge von vorliegendem β-Amyloid
zu bestimmen. Solche Verfahren schließen folgende ein, sind aber nicht
darauf beschränkt:
Bestimmen der Menge der β-Amyloid-Sekretion ins Kulturmedium
durch Verwendung von Immunopräzipitation
(Zhong et al. (1994) J. Biol. Chem. 16, 1217912184; Higaki et al. (1995)
Neuron 14, 651–659);
Radioimmuntest (Naidu et. al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 1369– 1374);
Enzym-verknüpfter
Immuntest (Vigo-Pelfrey et al. (1993) J Neurochem 61, 1965–1968; Suzuki
et al. (1994) Science 264: 1336–1340;
Asami-Odaka et al. (1995) Biochemistry 34, 10272–10278); Gelelektrophorese
und Western-Blot-Verfahren
unter Verwendung von konzentriertem oder reinem Medium, angepasst
für behandelte
organotypische Gehirnschnitte und organotypische Gehirnschnitte
zur Kontrolle. Lösliches β-Amyloid
im Schnittgewebe kann durch Zubereitung eines Gewebehomogenats und
Anwendung einer Immunopräzipitation,
eines Radioimmuntests, Enzym-verknüpften Immuntests, einer Gelelektrophorese
oder eines Western-Blot-Verfahrens gemessen werden, um Amyloid zu
detektieren. Abgelagertes β-Amyloid
kann biochemisch oder durch Zählen
der Amyloid-Ablagerungen oder -Plaques bewertet werden. Biochemisches,
unlösliches
Material, das aus Zentrifugationspellets von Hirnhomogenaten enthalten
wurde, kann, wie gerade für
Hirnhomogenate oben beschrieben, bewertet werden. β-Amyloid-Plaques
und -Ablagerungen können
durch histochemische Standardfärbemittel,
wie z. B. Silber, Thioflavin S oder Kongorot, durch Immunohistochemie unter
Verwendung von Anti-β-Amyloid-Antikörpern (Higgins
et al. (1994) Ann. Neurol. 35, 598–607; Higgins et al. (1995)
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92, 4402–4406), oder durch Ablagerung
von 125I-β-Amyloid
auf vorhandene Ablagerungen in dem Schnitt, gefolgt von einer Autoradiographie
(Maggio et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5462– 5466) sichtbar
gemacht werden. Der Fachmann kann Detektionsverfahren für β-Amyloid
gut für
die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung anpassen.
-
Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung
kann die β-Amyloid-Sekretion aus dem
Hirngewebe, die β-Amyloid-Ablagerung
im Hirngewebe und das β-Amyloid,
das im Hirngewebe vorhanden ist, unabhängig voneinander in getrennten
Experimenten/Behandlungen bestimmt werden, oder alternativ können zwei
oder mehr der β-Amyloid-Klassen
in einer einzigen Testprobe bestimmt werden. Im Allgemeinen ist
es bevorzugt, die β-Amyloid-Sekretion
aus dem Hirngewebe, die β-Amyloid-Ablagerung
im Hirngewebe und das β-Amyloid, das im Hirngewebe
vorhanden ist, für
jede Testverbindung zu bestimmen.
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Zusätzlich zum Messen der β-Amyloidbildung
ist es bevorzugt, dass eine Messung des Umfangs des lebensfähigen Gewebes
in den Schnitten, die Amyloid bilden, gemacht wird. Diese Messung wird
verwendet, um die Werte für β-Amyloid
im Medium zu normieren, und als Mittel zum Bestimmen der Toxizität eines
Testmittels. Im Allgemeinen wird der Lebensfähigkeitstest am Anfang des
Experiments durchgeführt.
Vorzugsweise wird ein Test, der dem Schnitt keinen Schaden zuführt, sowohl
am Anfang als auch am Ende des Testzeitraumes verwendet. Eine solche
Verwendung stellt die höchste
Genauigkeit bereit und erlaubt eine gründliche Bewertung der Toxizität der Verbindung.
Wenn das nicht möglich
ist, wird entweder ein Überlebenstest
am Anfang des Experiments durchgeführt oder es wird an einer Schwesterkultur
ein Test angewendet, der die Schnitte zerstört.
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Identifizierung von β-Amyloid-verringernden
Verbindungen
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Die Mittel, die bei dem vorliegenden
Verfahren verwendet werden, werden nach dem Grad, in dem sie die β-Amyloidbildung
verringern, und dem Grad der gezeigten Toxizität eingeteilt. Die am meisten
bevorzugten Verbindungen, die mit dem vorliegenden Verfahren identifiziert
werden, sind nicht-toxisch, wobei keine Verringerung der Lebensfähigkeit zwischen
behandelten und nicht-behandelten Kulturen zu sehen ist. Jedoch
können
niedrige Toxizitätsgrade
für bestimmte
Verwendungen zulässig
sein (z. B. für
ein anfängliches
Testen und Entwicklung einer Verbindung). Die bevorzugten Verbindungen
werden β-Amyloid-Sekretion/-Ablagerung/-Bildung
um mehr als 50% verringern. Mehr bevorzugt wird die β-Amyloid-Sekretion/-Ablagerung/-Bildung um mehr als 90%
verringert, und am meisten bevorzugt wird die gesamte β-Amyloid-Sekretion/-Ablagerung/-Bildung eliminiert.
-
Diese Beispiele beabsichtigen, die
Erfindung zu veranschaulichen, aber nicht zu beschränken.
-
Beispiel 1
-
Prüfen von
Verbindungen mit organotypischen Hirnschnittkulturen aus Ratten
-
Präparierung der Kulturen. Acht
Tage alte neonatale Rattenjunge wurden in einem sterilen Abzug schnell
mit einer Schere enthauptet und an einer Seite aufgesägt. Das
Gehirn wurde schnell in ein gepuffertes Seziermedium überführt, das
100 ml MEM, 1 ml Penizillin/Streptomycin, 1 ml 100 × Tris Stammlösung (10
ml Endkonzentration, pH 7,2) enthielt, steril gefiltert und gekühlt war.
Die Hippocampi wurden unter einem Seziermikroskop isoliert und im
Seziermedium in einen sterilen Abzug überführt. Das Gewebe wurde auf einem
Maclllwain-Gewebeschneider mit einem sterilen Pinsel angeordnet
und 400 μm-Sektionen
hergestellt. Ungefähr
30 Sektionen pro Tier wurden erhalten. Die Sektionen werden durch starkes
Herumwirbeln der Petri-Schale, die die Sektionen im Kulturmedium,
das aus 25% Pferdeserum, 25% Hanksches-Medium, 50% Minimal-Essential-Medium,
1 ml Penizillin/Streptomycin, 0,5 ml L-Glutamin bestand, enthielt,
getrennt. Die Sektionen wurden mit einem Seziermikroskop begutachtet
und beschädigtes
Gewebe wurde entfernt. Die ausgewählten Sektionen wurden in Tropfen
von Seziermedium mit Pasteurpipetten gehandhabt, die eingeritzt, gebrochen
und danach feuerpoliert wurden, um einen geeigneten Röhrendurchmesser
zu erzeugen, und auf Millipore-Kulturplatteneinlagen in 35 mm-Platten,
die 1 ml Kulturmedium enthielten, oder in 6-Napf-Platten, die 1,2
ml Kulturmedium enthielten, gelegt. Die Platten, die Einsätze und
Medium enthielten, wurden auf 37°C
und 5% CO2 voräquilibriert. Drei bis sechs
Schnitte wurden auf jeder Einlage angeordnet. Überschüssiges Medium wurde vom Schnitt
abgezogen und die Kultur in einem Inkubator bei 37°C und 5%
CO2 gelegt. Die Kulturen wurden bis zu 3
Monate gehalten. Das Medium wurde nach 24 Stunden ausgetauscht und
im Folgenden in Intervallen von 3 bis 4 Tagen. Das Medium, das für die organotypischen
Schnittkulturen von Hippocampus konditioniert war, wurde für die Tests
aufbewahrt.
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Charakterisierung der Kulturen. Organotypische
Hirnschnittkulturen wurden während
der ersten Woche in Kultur täglich
begutachtet und danach alle paar Tage. Während der ersten Woche flachen
die organotypischen Hirnschnitte ab und spreizen sich, obwohl die
Gewebearchitektur erhalten bleibt. Es wurden Wachstumskegel beobachtet,
die am Rand der Schnitte auftauchten und während der ersten Woche erschienen
Gliazellen am Rand des Schnittes. Die Wachstumskegel wurden später zurückgezogen.
Die Gliazellen verblieben am Rand der Schnitte, wuchsen aber nicht über den
Schnittkörper.
Die zelluläre
Organisation und Zusammensetzung wurde für die Schnitte, die in Kultur
gehalten wurden, in 1-Wochen-Intervallen von eins bis acht Wochen
bewertet, um zu bestätigen,
dass die zelluläre
Morphologie, Zusammensetzung und Organisation der des intakten Hippocampus
gleicht.
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Die Immunohistochemie wurde unter
Verwendung von Synaptophysin, Wachstums-assoziiertes Protein 43
(GAP-43), Mikrotubulus-assoziiertem Protein 2 (MAP-2) und Neurofilament
200 -Antikörpern
durchgeführt,
um Neuronen und S-100 sichtbar zu machen, und von glialen-sauren-fibrillären Protein (GFAP)-Antikörper, um
Gliazellen sichtbar zu machen, gemäß folgendem Protokoll:
-
Organotypische Schnittkulturen wurden
auf der Kultureinlage gehandhabt. Die Einlage wurde unter Verwendung
einer Pinzette zwischen den Kulturplatten, die die adäquate Behandlung
enthielten, bewegt. Zuerst wird das Medium von der Kultur durch mehrere
Spülungen
mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung PBS (100 mM NaCl, 10 mM
NaPO4, pH 7,4) gewaschen. Das Gewebe wurde
für zwei
Stunden bei Raumtemperatur durch Inkubation mit frisch-hergestelltem
4%igem -dehyd in PBS fixiert. Das Fixierungsmittel wurde durch 2 × 2-minütige Spülungen mit
PBS entfernt. Die Aktivität
der endogenen Peroxidase wurde durch eine 30-minütige Inkubation mit 0,3% Wasserstoffperoxid
unterdrückt, danach
10 Minuten mit PBS und weitere 10 Minuten mit PBS mit 0,2% Gelatin
gespült.
Danach wurden sie in PBS/10% Ziegenserum/0,1% Nonident P-40 für eine Stunde
geblockt und 2 × 10
Minuten mit PBS gespült.
Der Erstantikörper
wurde mit der angegebenen, in 0,2%-igem Gelatin enthaltenden PBS,
Verdünnung
angewendet und über
Nacht in einer befeuchteten Kammer inkubiert. Nach 3 × 3 Spülungen mit
PBS/Gelatin wurden die Kulturen mit einem Zweitantikörper (entsprechend
entweder Anti-Maus oder Anti-Kaninchen, mit einem Vectastain Elite-Immunohistochemie-Kit
bereitgestellt) in PBS/Gelatin bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Das
Vectastain Elite-ABC-Reagenz wurde gemäß Herstellerangaben zubereitet.
Nach 3 × 3-minütigen Spülungen mit PBS/0,2%
Gelatin, wurden die Kulturen bei 37°C für 30 Minuten mit dem ABC-Reagenz
inkubiert. Die Immunoreaktivität
wurde durch Entwicklung mit einem 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Kit von Vektor-Labs sichtbar
gemacht und gemäß Anweisungen
zubereitet und mit Wasser gespült.
Die Entwässerung
wurde durch 2-minütige
Inkubationen mit 35%-, 50%-, 70 %-, 90%- und 2 × 100%-igem Ethanol durchgeführt. Die
Kulturen wurden für
zwei bis vier Minuten mit Hämatoxylin
gegengefärbt
und solange mit Wasser gespült,
bis es klar war. Das Entfärben
der Einlage selbst erfolgte für
30 Sekunden mit 0,5%-iger Salzsäure
in 70%-igem Ethanol mit nachfolgendem Spülen mit Leitungswasser. Nach
Trocknen an Luft wurden einzelne Schnitte aus der Einlage geschnitten und
auf einem Objektträger
unter Verwendung von Gel montiert, mit Deckplättchen abgedeckt und mit Nagellack
verschlossen. Typische Mikrofotographien sind in 1 bereitgestellt.
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Kresylviolett-, Hämatoxylin- und Toluidinblau-Färbung wurde
durch Fixierung der Kulturen in Paraformaldehyd, wie oben beschrieben,
durchgeführt.
Hämatoxylin
(Sigma) wurde für
2–4 Minuten
angewendet, wonach die Kulturen mit Wasser gespült und in Ethanol, wie oben
beschrieben, aufgearbeitet wurden. Kresylviolett und Toluidinblau
wurden als Stammfarblösung
von 0,1% in destilliertem Wasser hergestellt. Die Färbelösung wurde
als 20%-ige Lösung
in 0,2 M Acetatpuffer, pH 4,45, hergestellt: 3 Teile 0,2 M Essigsäure, 2 Teile
0,2 M Natriumacetat, 5 Teile Wasser. Die Färbezeit betrug 20 Minuten für beide
Färbungen.
Die Kulturen wurden mit Wasser gespült, in Ethanol entwässert, getrocknet
und wie oben beschrieben montiert.
-
Die β-Amyloid 1-40-Sekretion ins
Medium wurde durch Sammeln des Mediums, das während der ersten 24 Stunden
in Kultur, während
Tag 1 bis 4 in Kultur und während
Tag 16 bis 20 in Kultur konditioniert wurde, untersucht. Aliquots
des konditionierten Mediums wurden unter Verwendung eines Sandwich-ELISAs
getestet, um das β-Amyloid
1-40 durch eine von zwei Möglichkeiten
zu messen. Als erstes wurden zwei identische 100 μl Proben
direkt im ELISA getestet. Als zweites wurden 3 ml vereinigtes Medium
aus drei getrennten Kulturkammern konzentriert und gleichzeitig
von einigen anderen Bestandteilen durch Aufbringung auf Sep-Pak
C18-Säulen
und Elution in Acetonitril abgetrennt. Die 50%-Elutionsfraktion,
von der vormals gezeigt wurde, dass sie Amyloid enthält, wurde
aufgefangen, getrocknet, in einem kleinen Puffervolumen wieder aufgenommen und
im ELISA getestet. Die Ergebnisse der beiden Tests stimmten gut überein und
zeigen leicht messbare Mengen von β-Amyloid 1-40 in konditioniertem Medium,
selbst in Abwesenheit eines Aufkonzentrierungsschritts (siehe 2).
-
Anwendung der Verbindung. Zwei Testverbindungen
wurden ausgewählt,
die als positiv für
das Absenken der β-Amyloid-Aktivität in Zellkulturtests bewertet
waren und als nicht-toxisch bei den gleichen Zellen bewertet waren.
Diese Verbindungen wurden an Meerschweinchen getestet und als stark-toxisch für Gehirngewebe
befunden. Das vorliegende Beispiel wurde verwendet, um zu zeigen,
dass ein Schnitttest ein besserer Vorhersager der in-vivo-Aktivität ist als
der Zellkulturtest.
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Testverbindungen wurden in DMSO gelöst, um 100 × Stammlösungen herzustellen.
Die Stammlösungen
wurden weiter mit Kulturmedium verdünnt, um Endkonzentrationen
von 0,1 μM – und 100 μM – Verbindungen
zu ergeben. Das Medium wurden in Platten bei 37°C und 5% CO2 voräquilibriert.
Die Kultureinlagen, die drei organotypische Rattenhirnschnitte,
die von 8 Tage alten Ratten erhalten wurden, hielten, und für zwei Wochen
in Kultur gehalten wurden, wurden in ein Testlösung-enthaltendes Medium überführt. Das
Medium wurde gesammelt und frisches Medium, das Testlösung enthielt,
wurde in 24 Stunden-Intervallen für 10 Tage bereitgestellt. Organotypische
Hirnschnittkulturen wurden täglich
begutachtet. Die visuelle Beobachtung zeigte einen Verlust an Gewebeintegrität durch
verdunkelte Stellen im Zentrum des Schnittes, einen Verlust der
zellulären Schichtorganisation
und letztlich einen Verlust von Gewebe am Rand des Schnittes.
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Bewertung der Toxizität. Die Toxizität wurde visuell
unter Präparier-
und invertierten Licht-Mikroskopen bewertet. Am Ende des Experiments
wurden die Kulturen zur Antisynaptophysin-Antikörper-Immunreaktivität aufgearbeitet.
Beide Testverbindungen waren als nicht-toxisch über den in diesem Experiment
getesteten Konzentrationsbereich in einem Zell-basierten Test unter
Verwendung eines Tests zur Mitochondrienfunktion (MTT-Test) zur
Messung der Lebensfähigkeit
bewertet worden. Das in-vivo-Testen der ersten Verbindung zeigte
eine deutliche Toxizität, wie
durch die Histochemie von Hirnsektionen von behandelten Meerschweinchen
bewertet. Die visuelle Beobachtung der behandelten organotypischen Schnittkulturen
zeigten nach 5– 6
Tagen Behandlung eine offenkundige Toxizität und ein stark nekrotisches Erscheinungsbild
am Ende des 10-tägigen
Experiments. Die Immunohistochemie bestätigte diese Bewertung. Somit
war der organotypische Schnitt-Test ein besserer Vorhersager der
in-vivo-Ergebnisse als der Zellbasierte Test. Die zweite Verbindung
wurde in einem Zell-basierten Test ebenfalls als nicht-toxisch eingeteilt
und hatte eine etwas weniger starke, aber dennoch deutlich toxische
Wirkung auf die organotypischen Schnittkulturen. Wie durch die Ergebnisse des
organotypischen Schnittkulturtests vorhergesagt, war diese Verbindung
weniger toxisch als die erste, obwohl eine deutliche Toxizität beobachtet wurde.
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Genaue Beschreibung von 1. Organotypische Schnittkulturen
wurden auf der Kultureinlage während
des Färbeverfahrens
unter Verwendung einer Pinzette gehandhabt, um die Einlage zwischen den
Kulturplatten, die die geeignete Behandlung enthielten, zu bewegen.
Zuerst wurde das Medium von der Kultur durch mehrere Spülungen mit
Phospat-gepufferter Kochsalzlösung
PBS (100 mM NaCl, 10 mM NaPO4, pH 7,4) gewaschen.
Das Gewebe wurde für zwei
Stunden durch Inkubation bei Raumtemperatur mit frisch-hergestelltem
4%-igem Paraformaldehyd in PBS fixiert. Das Fixierungsmittel wurde
durch 2 × 2 minütige Spülungen in
PBS entfernt. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde durch eine 30-minütige Inkubation
mit 0,3%-igem Wasserstoffperoxid unterdrückt und 10 Minuten in PBS und
10 Minuten in PBS mit 0,2% Gelatin gespült. Danach wurden sie in PBS/10%
Ziegenserum/0,1% Nonident P-40 für
eine Stunde geblockt und für
2 × 10
Minuten in PBS gespült.
Der Primärantikörper wurde
mit der angegebenen in mit 0,2%-iger Gelatin enthaltendem PBS bereiteten
Verdünnung
angewendet und über
Nacht in einer befeuchteten Kammer inkubiert. Nach 3 × 3 minütigen Spülungen mit
PBS/Gelatin wurden die Kulturen mit einem Zweitantikörper (entsprechend
entweder Anti-Maus oder Anti-Kaninchen, mit einem Vectastain Elite-Immunohistochemie-Kit
bereitgestellt) in PBS/Gelatin bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Das
Vectastain ABC-Reagenz wurde gemäß Herstellerangaben
zubereitet. Nach 3 × 3-minütigen Spülungen mit
PBS/0,2% Gelatin wurden die Kulturen bei 37°C für 30 Minuten mit dem ABC-Reagenz inkubiert.
Die Immunoreaktivität
wurde durch Entwicklung mit einem 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Kit von Vector-Labs
sichtbar gemacht und gemäß Anweisungen
zubereitet und mit Wasser gespült.
Die Entwässerung
wurde durch 2-minütige
Inkubationen mit 35%-, 50%-, 70%-, 90%- und 2 × 100%-igem Ethanol ausgeführt. Die
Kulturen wurden für
2–4 Minuten
mit Hämatoxylin
gegengefärbt
und solange mit Wasser gespült,
bis es klar war. Das Entfärben
der Einlage selbst erfolgte für
30 Sekunden mit 0,5%-iger Salzsäure
in 70%-igem Ethanol mit nachfolgendem Spülen mit Leitungswasser. Nach
Trocknen an Luft wurden einzelne Schnitte aus der Einlage geschnitten
und auf einen Objektträger
unter Verwendung von Gel montiert, mit Deckplättchen abgedeckt und mit Nagellack
verschlossen. Das obere Feld zeigt eine typische Mikrophotographie
eines aus Ratte präparierten
organotypischen Schnitts des Hippocampus, der neun Wochen in Kultur
gehalten wurde und unter Verwendung eines Antisynaptophysin-monoklonalen
Antikörpers
gefärbt
wurde. Ein CA-1-Feld ist bei 20-facher Vergrößerung gezeigt. Das untere, linke
Feld ist eine typische Mikrophotogrpahie eines aus Ratte präparierten
organotypischen Schnitts des Hippocampus, der für viereinhalb Wochen in Kultur gehalten
wurde und unter Verwendung eines Antineurofilament 200-monoklonalen
Antikörpers
gefärbt wurde
und mit 20-facher Vergrößerung aufgenommen
wurde. Das untere rechte Feld ist eine typische Mikrophotographie
eines aus Ratten präparierten,
organotpyischen Schnitts vom Hippocampus, der für 10 Wochen in Kultur gehalten
wurde, und unter Verwendung eines antiglialen-sauren-fibrillären Protein (GFAP)-
monoklonalen Antikörpers
gefärbt
und bei 40-facher Vergrößerung aufgenommen
wurde. Die gezeigte Immunoreaktivität sind Standardmarker für Synapsen,
neuronale Körper
bzw. Astrozyten. Die normale Zell- und Gewebemorphologie ist dargestellt.
-
Beispiel 2
-
Bewertung
von organotypischen Schnittkulturen aus transgenen Mäusen
-
Präparierung der Kulturen. 10
Tage alte Mäusejunge,
die für
die 751-Aminosäure-Isoform
des menschlichen β-Amyloid-Vorläufer-Proteins
(β-APP) transgen
sind und zur neuronalen Expression durch einen Neuronenspezifischen
Enolasepromotor programmiert sind, wurden als Gewebequelle für organotypische
Schnittkulturen des Hippocampus verwendet. Die Kulturen wurden wie
die organotypischen Hirnschnittkulturen aus Ratten, wie in Beispiel 1
beschrieben, präpariert.
-
Bewertung der Lebensfähigkeit.
Die Hirnschnittkulturen der transgenen Mäuse wurden jeden zweiten Tag
mit einem Sezier- und einem invertierten Licht-Mikroskop begutachtet.
Zu verschiedenen Zeiten wurden Schnitte zur histochemischen Untersuchung
unter Verwendung von Kresylviolett und Hämatoxylin entnommen, um die
Zellmorphologie und organotypische Anatomie zu unterscheiden, und
von Synaptophysin -und GFAP-Immunohistochemie,
um die Morphologie von Neuronen bzw. Glia-Zellen zu bewerten.
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Bewertung der β-Amyloid-Sekretion. Konditioniertes
Medium wurde von einzelnen Kulturkammern, die drei organotypische
Schnitte des Hippocampus enthielten, während des ersten 24-Stunden-Zeitraums
in vitro und nachfolgend während
Intervallen von 3–4
Tagen gesammelt. Zwei 100 μl-Proben
dieser konditionierten Mediumproben wurden für drei Kulturkammern, jeweils
für Kulturschnitte
des Hippocampus aus drei Donor-Tieren, direkt im Sandwich-ELISA getestet, wobei
man β-Amyloid
1-40 oder β-Amyloid
1-42 detektiert. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass
die Amyloid-Sekretion aus organotypischen Kulturen des Hippocampus
von transgenen Mäusen
[1] leicht auf einem Niveau detektierbar ist, das die Messung der
inhibitorischen Aktivität
ermöglicht,
[2] für
5–20 Tage
stabil ist, [3] zu einem Grad gebildet wird, der unabhängig von
einzelnen Donor-Tieren ist und [4] eine akzeptabel niedrige Variablitiät zwischen
den Kulturkammern zeigt. Die Ergebnisse des β-Amyloid 1-40 ELISA-Tests sind
in 3 gezeigt.
-
Beispiel 3
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Testen von
Verbindungen mit organotypischen Schnittkulturen aus transgenen
Mäusen
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Präparierung der Kulturen. Organotypische Schnittkulturen
des Hippocampus wurden wie in Beispiel 2 beschrieben aus 10 Tage
alten Mäusen,
die für
die 751-Aminosäure-Isoform
des menschlichen β-Amyloid-Vorläufer-Proteins (β-APP) transgen
sind, zur neuronalen Expression durch den Neuronen-spezifischen
Enolasepromotor programmiert sind und für 10 Tage in Kultur gehalten
wurden, präpariert.
-
Bewertung der Lebensfähigkeit.
Die Kulturen wurden visuell etwa jeden zweiten Tag begutachtet. Am
Anfang des Testens der Verbindung wurde am Tag 10 in Kultur eine
quantitative Bewertung der Lebensfähigkeit durchgeführt. Die
Hirnschnitte wurden durch Gabe eines kaliumreichen (54 mM) Mediums für 5 Minuten
depolarisiert. Die Einlagen wurden einem 2 × 2-minütigen Waschen in Medium, das
bei 37°C
und 5% CO2 voräquilibriert war, unterzogen
und in den Inkubator zurückgestellt.
Kaliumreiches Medium, das durch die Schnitte während des Depolarisationszeitraums
konditioniert wurde, enthielt Reste, die durch synaptischen Vesikel
sekretiert wurden. Dieses Medium wurde in zwei Aliquots geteilt
und auf γ-Aminobuttersäure (GABA)
und Glutamat, zwei Peptidneurotransmitter, die im Hippocampus vorliegen,
getestet. Das Medium wurde zweckmäßig unter Verwendung von ELISAs
getestet, die mit handelsüblichen
Antikörpern,
die für
GABA und Glutamat spezifisch sind, entwickelt wurden. Das dritte
Aliquot wurde verwendet, um Acetylcholin (ACh), ein Neurotransmitter,
der früh
im AD-Hippocampus wirksam ist, unter Verwendung eines radiomarkierten,
cholinergen Antagonist-Austauschtests, der ACh-rezeptortragende
Membranen verwendet, zu testen. Diese Tests stellen ein quantitatives
Maß des
Umfangs an lebensfähigen
Gewebe, das auf jeder Einlage vorliegt, dar, zeigen die intakte,
synaptische Aktivität
und fügen
den Kulturen keinen Schaden zu.
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Anwendung der Testverbindung. Die
Testverbindung wurde in DMSO gelöst,
um eine 100 × Stammlösung herzustellen,
und weiter mit Kulturmedium bis zu den geeigneten Endkonzentrationen
verdünnt.
Diese betrugen üblicherweise
100 nM bis 100 μM
an Verbindung, sofern nicht die bekannte Information über die
Aktivität
und Toxizität
der Verbindung etwas anderes vorgibt. Eine 1%-ige DMSO-Kontrolle zur
Endkonzentration des Trägers
wurde eingeschlossen. Das Medium wurde bei 37°C und 5% CO2 voräquilibriert,
bevor die Kultureinlage auf die neue Platte überführt wurde, und das Medium wurde
alle 48 Stunden ausgetauscht, um frische Verbindung bereitzustellen.
Das konditionierte Medium wurde zur Bewertung aufbewahrt. Die Kulturen
wurden täglich visuell
begutachtet. Die Anwendung der Testverbindung wurde für 10 Tage
fortgesetzt.
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Bewertung der Lebensfähigkeit.
Am Ende der Testperiode wurde konditioniertes Medium von dem letzten
Testintervall gesammelt und die synaptische Aktivität wurde
durch Depolarisation mit kaliumreichem Medium getestet, gefolgt
von einer Messung von sekretiertem GABA und Glutamat, wie oben beschrieben.
-
Bewertung der Absenkung der β-Amyloid-Aktivität. Konditioniertes
Medium von jedem Intervall des Testzeitraums wurde unter Verwendung
eines ELISA-Tests auf den β-Amyloidgrad
getestet. Die Daten, die durch dieses Verfahren erzeugt wurden, stellen
sowohl eine Beziehung zur Dosisantwort als auch zu dem Zeitverlauf
für jede
getestete Dosis bereit. Da unterschiedliche Mengen an lebensfähigem Gewebe
in jeder Kultureinlage vorliegen können, um als Amyloidquelle
zu dienen, wurden die β-Amyloidwerte
in dem konditionierten Medium unter Verwendung der sekretierten
Transmitterwerte am Anfang des Experiments normiert. Die Toxizität wurde
durch Vergleichen der Werte des sekretierten Transmitters am Anfang
und am Ende des Experiments evaluiert. Die Verbindungen, die am
Ende des Experiments im Verhältnis
zum Anfang eine Abnahme bei der Transmitterfreisetzung erzeugen,
werden erachtet, einen toxischen Effekt zu haben. In diesem Fall
kann der Abfall des β-Amyloidgrades
eher der Toxizität
als einer spezifischen Wirkung auf die β-Amyloidbildung zugerechnet
werden. Abgelagertes β-Amyloid
wurde durch Immunohistochemie unter Verwendung des Anti-β-Amyloid-Antikörper mAb
4.1 bewertet, um die Anzahl der Amyloidablagerungen und Plaques
pro Bereich in den behandelten Schnitten gegenüber den Kontrollschnitten zu
erfassen.
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Beispiel 4
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Testen von
Verbindungen mit organotypischen Schnittkulturen aus transgenen
Mäusen
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Präparierung der Kulturen. Organotypische Schnittkulturen
aus Hippocampus wurden wie in Beispiel 2 beschrieben aus 10 Tage
alte Mäusen,
die für die
751-Aminosäure-Isoform
des menschlichen β-Amyloid-Vorläufer-Proteins (β-APP) transgen
sind, zur neuronalen Expression durch den Neuronen-spezifischen
Enolasepromotor programmiert sind, und sechs Wochen in Kultur gehalten
wurden, präpariert.
-
Genaue Beschreibung von 4. Organotypische Schnittkulturen
aus Hippocampus wurden aus für β-APP 751-transgenen
Mäusen
präpariert.
Am Tag 21 in-vitro wurden die organotypischen Kulturen zweimal mit
Medium gewaschen, und zwei identische Kammern wurden für einen
Konditionierungs-Zeitraum
von 3 Tagen in Medium inkubiert, das mit 25 μM bis 400 μM MDL 28170, einem Proteaseinhibitor,
von dem gezeigt wurde, dass er die vollständige β-Amyloidbildung in der Zellkultur
mit einer IC50 von 100 μM inhibiert, ergänzt wurde.
MDL 28170 wurde aus 100 × Stammlösungen,
die in DMSO hergestellt wurden, angewendet. Die Kontrollkultur erhielt
nur DMSO. Das konditionierte Medium wurde am Tag 24 entnommen und
doppelt auf β-Amyolid 1-40 unter
Verwendung eines Sandwich-ELISAs getestet. Organotpyische Kulturen
wurden zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen und für weitere
24 Stunden in serumfreiem Medium bei fortgesetztem Vorliegen von
MDL 28170 inkubiert. Dieses konditionierte Medium wurde auf Laktat-Dehydrogenase (LDH)-Aktivität getestet.
LDH ist ein allgegenwärtiges,
zytosolisches Enzym, das nur von ungesunden Zellen in das konditionierte
Medium sekretiert wird, und ist ein Maß für die Lebensfähigkeit
und Toxizität. Hohe
Pegel an LDH-Aktivität
im Serum erfordern, dass die Messungen in serumfreiem konditionierten Medium
durchgeführt
werden. Die gezeigten Messpunkte wurden zuerst durch Mittelwertbildung
der doppelten ELISA-Werte für
jede Kammer berechnet, und anschließendem Berechnen der Mittelwerte
für die
doppelten Behandlungskammern berechnet.
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Bewertung der β-Amyloid Inhibitoraktivität und Toxizität. Die Kulturen
wurden etwa jeden zweiten Tag visuell begutachtet. Vor dem Beginn
des Verbindungstestes wurde am Tag 18 in Kultur ein Testzeitraum
von 3 Tagen begonnen, in dem das Medium durch unbehandelte Kulturen
konditioniert wurde. Dieses Medium wurde gesammelt und auf die β-Amyloid
1-40 und 1-42 -Pegel unter Verwendung von empfindlicher ELISAs getestet.
Organotypische Kulturen wurden dann zweimal mit Medium gewaschen
und über
einen Konditionierungszeitraum von weiteren 3 Tagen in Medium inkubiert,
das mit 25 μM bis
400 μM MDL
28170, einem Proteaseinhibitor, von dem gezeigt wurde, dass er die
gesamte β-Amyloidbildung
in Zellkultur mit einer IC50 von 100 μM inhibiert,
ergänzt
wurde. Die Kontrollkultur erhielt nur DMSO. Nachdem das konditionierte
Medium am Tag 21 gesammelt wurde, wurden die organotpyischen Kulturen
zweimal mit serumfreien Medium gewaschen und für weitere 24 Stunden in serumfreiem Medium
bei fortgesetztem Vorhandensein von MDL 28170 inkubiert. Dieses
konditionierte Medium wurde auf Laktatdehydrogenase (LDH)-Aktivität getestet. LDH
ist ein allgegenwärtiges,
zytosolisches Enzym, das in das konditionierte Medium nur von ungesunden
Zellen sekretiert wird und ist ein Maß für die Lebensfähigkeit
und Toxizität.
Hohe Pegel an LDH-Aktivität
in Serum erfordern, dass die Messungen in serumfreiem konditionierten
Medium durchzuführen sind.
Danach wurden die organotpyischen Schnittkulturen aus Hippocampus
in Medium gespült,
das Serum aber keinen Wirkstoff enthielt, und ermöglicht,
frisches Medium für
drei Tage zu konditionieren. Dieses Medium wurde auf β-Amyloid
1-40 und 1-42 mit den gleichen ELISAs getestet, um zu bestimmen,
ob die MDL-Aktivität
in dem organotypischen Hirnschnittsystem reversibel ist, so wie
es bei kultivierten, monotypischen Zellen der Fall ist. Diesem Test
folgte eine 24-stündige
Konditionierungsperiode mit serumfreiem Medium, um zu bestimmen,
ob die toxische Effekte von MDL 28170 ebenso reversibel ist. 4 veranschaulicht, dass
die IC50 von MDL 28170 100 μM für die β-Amyloidbildung
durch organotypische Schnittkulturen aus dem Hippocampus von transgenen
Mäusen beträgt, wie
es auch für
eine Vielzahl von monotypischen Zellkulturen der Fall ist. Zusätzlich wurde
eine Inhibition bei Abwesenheit von Toxizität gezeigt, was nicht durch
die visuelle Begutachtung oder durch den LDH-Test offensichtlich
war, bis die Konzentration der Testverbindung 400 μM erreicht
hatte.