JP2002508834A

JP2002508834A - βアミロイドを減少させる薬剤を同定する方法

Info

Publication number: JP2002508834A
Application number: JP54579598A
Authority: JP
Inventors: コーデル，バーバラ; スラネックヒギンズ，リンダ
Original assignee: サイオス，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-03-21
Filing date: 1998-03-19
Publication date: 2002-03-19
Also published as: DE69819696D1; CA2284261A1; WO1998043094A1; ATE254287T1; EP0970379A1; US6221670B1; EP0970379B1; AU6567198A; ES2212277T3; DE69819696T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、βアミロイドを減少させる化合物を同定するために使用され得る方法を提供する。本発明は、試験化合物の、毒性およびβアミロイドを減少させる活性に同時にアクセスするために、器官型脳スライス培養法の使用に基づく。

Description

【発明の詳細な説明】 βアミロイドを減少させる薬剤を同定する方法技術分野本発明は、アルツハイマー病を処置するための薬剤を同定するために使用されるアッセイの分野にある。本発明は、詳細には、主にアルツハイマー病の処置において、βアミロイド産生/分泌/沈着を減少させることに使用する薬剤のスクリーニングに使用する方法を提供する。技術背景アルツハイマー病（Alzheimer's）は、一般的な老化に関連する脳変性疾患である。この疾患は、特徴的な神経病理学的特徴の存在とともに進行性の痴呆によって特徴づけられる。βアミロイド沈着または斑（plaque）の形成は、アルツハイマー病の顕著な特徴および診断的特徴である(Khachaturian（1985）Arch Neur ol 42:1097-1105)。重要な一連の証拠は、βアミロイド形成および沈着の進行が、この疾患の発症に直接関連することを示唆する。例えば、βアミロイド前駆体タンパク質（β-APP）をコードする遺伝子に変異を有する個体は、アルツハイマー病を必ず発症する（Goateら(1991)Nature 353:844-846;Mullanら、（1992）Na ture Genet 1:345-347;Murrellら(1991)Science 254:97-99;Van Broeckhoven（1 995）Eur Neurol 358-19）。βアミロイドペプチドは、39〜43アミノ酸タンパク質であり（Glennerら、（1984）Biochem Biophys Res Commun 120:885-890;Mast ersら（1985）Proc Natl Acd Sci USA 82:4245-4249）、これはβプリーツシート凝集体を形成し得る。これらの凝集原線維は、その後、アルツハイマー病の犠牲者の脳実質にまたは脳血管系に実質的に沈着する。 βアミロイドペプチドは、いくつかの代替的にスプライスされた転写物を有する、より大きなI型膜貫通タンパク質β-APPに由来する(Kangら（1987）Nature 3 25:530-532;Ponteら(1988)Nature 331:525-527;Tanziら(1988)Nature 331:528-5 30;Kitaguchiら(1988)Nature 331:530-532;de Savageら(1989)Scien ce 245:651-653)。差示的にスプライスされた転写物は、695、714、751、および 770アミノ酸のβ-APPを生じる。β-APPの生物学的機能は、あまり良く理解されていないが、細胞間接触、細胞生存、および細胞増殖において機能するようである(Schubertら(1989)Neuron 3:689-694;Saitohら(1989)Cell 58:615-622;Chenら (1991)Neurosci Lett 125:223-251;Mattsonら(1993)Neuron 10:243-254)。分泌された形態のβ-APPは、通常、タンパク質分解性切断によって生成される (Weidemannら(1989)Cell 57:115-126)。このタンパク質分解性切断は、βアミロイド形成を防止するβアミロイドドメイン内で生じる（Eschら(1990)Science 24 8:1122-1124;Sisodiaら(1990)Science 248:492-495）。切断の結果として、大部分のβ-APPは、細胞から放出され、そして約８kDaのカルボキシル末端フラグメントが細胞膜に結合したまま残る。β-APPのこの非アミロイド性プロセシングを担う酵素は、γセクレターゼと呼ばれる。 βアミロイドペプチドの形成は、正常な生理学的プロセスである。ペプチドは、インビトロで培養された細胞によって（Haassら(1992)Nature 359:322-325;Se ubertら(1992)Nature 359:325-327;Shojiら(1992)Science 258:126-129;およびインビボで（Seubertら(1992)Nature 359:325-327;Vigo-Pelfreyら(1993)J Neur ochem 61:1965-1968;Tabatonら(1994)Biochem Biophys Res Commun 200:1598-16 03;Tellerら（1996）Nature Med 2:93-95）自然に産生されることが見出されている。βアミロイドペプチドは、非分泌形態のβ-APPの細胞内異化作用の変性副産物であるようであり（Higakiら(1995)Neuron 14:651-659）、そしてその形成の阻害は、インビトロでは明らかな悪性の結果を有さない。以下のようなβアミロイドペプチドを産生するために要求される２つのタンパク質分解性プロセシング工程が存在する：第一は、βセクレターゼと呼ばれる同定されていない酵素によって媒介される、ペプチドのアミノ末端を産生する工程、第二は、γセクレターゼと呼ばれる同定されていない酵素によって生成されるペプチドのカルボキシル末端を形成する工程。アルツハイマー病研究コミュニティでは、アルツハイマー病の新規の治療開発に対するアプローチとしてβ-APPのβアミロイドペプチドへのプロセシングの阻害を研究してきた。β、またはγセクレターゼプロセシング酵素のいずれも、決定的には同定または精製されていない。純粋なβ-APPおよび純粋なβアミロイドイド形成酵素を含有するアッセイは存在しない。インタクトな培養細胞は、βアミロイドペプチドの供給源を提供する。βアミロイドの産生を阻害する化合物のスクリーニングは、試験化合物の適用後の培養での細胞による、βアミロイド産生の測定に基づいて開発されてきた。化合物の毒性は同時に測定される。次いで、このようなアッセイにおいて非毒性インヒビターとしてスコアされる試験化合物は、動物での活性について試験される。しかし、動物試験は、労力を要し、高価であり、そして時間がかかる。さらに、細胞培養には存在しない、動物でのβ アミロイド産生の阻害を得ることに対する、多くの重要な障害（化合物の代謝およびクリアランス、血液脳関門によって与えられる標的器官（脳）への限定されたアクセス、および選択的細胞毒性を含む）が存在する。従って、動物試験におけるネガティブな結果は、解釈するのが困難であり、そして他の化合物の構造的設計の情報を与えるための使用が制限される。これらの理由により、インタクトな標的器官の複雑性に似ており、なお、動物全体（whole animal）を試験する実験を行い、そして解釈する技術的困難性を回避するβアミロイド阻害活性および毒性について化合物を試験するための系を得ることが高度に望ましい。器官型スライス培養法（organotypic slice culture）が脳について開発されており、そこでは、脳全体の外植片または切片、またはより一般的には、海馬または小脳のような解剖学的に異なる脳の構造が、培養において長い期間維持される(Seil（1979）Review in Neuroscience 4:105-177;Gahwiler（1981）J．Neuro sci Meth 4:329-342;Gahwiler（1984）Neuroscience 11:751-760，Gahwiler（19 88）Trends Neurosci 11:484-490)。最近では、より再現性のある結果が単純化された方法によって得られ得るように重要な改善が開発されてきた(Stoppiniら( 1991)J Neurosci Methods 37:173-182)。このような培養物に必須の特徴は、器官型組織構造の著しい保存である：細胞の解剖学は、シナプスのインプットおよび機能が正常な状態のものを模倣し、そして発達が新生仔脳スライスにおいて継続するような程度までインタクトな脳のものに密接に類似する。代表的には、これらの調製物は、インタクトな動物または器官型スライス培養においてのみ利用可能な細胞間の複雑な相互作用を必要とする学習の生化学的基礎のような脳の現象を調査する電気生理学的研究に使用する。アルツハイマー病研究における器官型脳スライス培養の２つの例の使用のみが当該分野で公知である。Londonら(( 1996)Proc Natl Acad Sci 93:4147-4153)は、合成アミロイドで前処理された単球を器官型脳スライス培養に適用して細胞の生存を測定することにより異なる脳細胞型の相互作用を観察した。Nitsch，Wurtzmanおよび共同研究者らは、脳の回路網（Diekmanら(1994)J Neural Transm Suppl 44:61-71）、およびアミロイド前駆体タンパク質の分泌（Nitschら(1994)J Neural Transm Suppl 44:21-27);Fa rberら(1995)J Neurosci 15:7442-7451）における、電極による神経刺激および神経伝達物質の効果を試験した。器官型スライス培養法は、アミロイド産生および/または試験化合物のその産生に対する効果を試験する、βアミロイドおよび細胞生存率についてのアッセイと組み合わされていない。本発明は、器官型スライス培養法とβアミロイドアッセイ法との組み合わせに部分的に基づく。本発明の得られる方法は、アルツハイマー病を処置するために使用され得る化合物を同定するための迅速でかつ効率的な方法を提供する。 βアミロイド産生を阻害するための化合物を試験するための先行技術は、動物全体、培養における初代細胞もしくは細胞株、壊れた細胞または細胞もしくは組織ホモジネート、あるいは純粋な酵素調製物における活性を試験することに依存していた。動物全体は例外として、これらの方法のいずれも、脳において見出される細胞型および相互作用の複雑性を模倣していない。細胞の相互作用は、βアミロイド前駆体タンパク質ならびにβアミロイドの産生および分泌に影響を与えることが公知であり、そして脳における化合物の利用可能性、代謝、および寛容性に影響を与えることが予想され得る。器官型脳スライス培養は、脳に存在する細胞型の全範囲を、驚くほど良好に保存された構成および細胞の相互作用を伴って提供する。従って、試験化合物のβアミロイド産生ならびに細胞の生存率および機能に対する効果は、より複雑でない単一の細胞系で測定されたこれらの測定値よりもインビボ効果の良好な予言因子である。器官型調製物において毒性効果を有するかまたは効力を欠くことが明らかである（これらは、細胞培養系においては明らかでない）候補化合物は、動物試験に進む前に排除され得る。動物全体での実験は、行うのに労力を要し、高価であり、そして時間がかかる。さらに、比較的大量の試験化合物が、動物に投薬するためには合成されなければならない。例えば、現在の動物試験プロトコル下では、一般に１データ点あたり最低７匹の動物が、動物における変動およびアッセイに必要とされる高度な感度に起因して、必要とされる。器官型培養における測定の各々は、インビボでの類似の測定としてほんの少数の動物を必要とする：１データ点あたり約３スライス（１マウスあたり20スライス、または１ラットあたり30スライスが得られる）対（vs.）１データ点あたり７匹の動物であるから、必要とされる動物の数の70 倍の減少である。器官型スライス実験において行われた用量応答および時間経過研究は、インビボ投薬レジメンのためのより良い初期の選択を容易にし、必要とされる投薬レジメンを調整して、インビボ実験の数を減少させる。動物全体での実験の別の主要な欠点は、制御され得ず、そして評価することが困難である変数の数である。例えば、化合物が効果がない場合、それは血液からの迅速なクリアランスのため、迅速な代謝のため、非標的組織による隔離のため、または血液脳関門を通過し得ないためであり得る。投薬は、感受性の非標的器官に対する毒性によって制限され得る。これらの因子のネガティブな結果に対する寄与を測定することが主な仕事（undertaking）である。従って、ネガティブな結果は、改善された化合物構造の生成を導く構造-活性相関を生成するのには使用されない。器官型スライス培養は、これらの変数を排除または最小化する。なぜなら、血液脳関門および他の組織が存在しないからである。化合物の代謝は、培地をサンプリングすることによって容易に評価される。標的器官での用量は容易に制御される。発明の開示本発明は、β-アミロイドを減少させる化合物を同定するために使用され得る方法を提供する。本発明は、試験化合物の毒性およびβ-アミロイドを減少させる活性を同時に評価するための器官型脳スライス培養法の使用に基づく。一般に、β-アミロイドを減少させる化合物は、以下の工程により同定され得る：器官型脳スライス培養物を調製する工程；この器官型脳スライス培養物中の細胞の生存率を評価する工程；試験化合物をこの器官型脳スライス培養物に適用する工程； (i)この処理された器官型脳スライス培養物および(ii)処理されていない器官型脳スライス培養物の生存率およびβ-アミロイド産生を評価する工程；ならびに β-アミロイド産生を減少させるが細胞生存率を減少させない化合物を同定する工程。図面の簡単な説明図１。海馬器官型スライス培養物の免疫組織化学的特徴付け。図２。海馬器官型スライス培養物からのβ-アミロイド1-40の分泌。図３。β-APP751についてトランスジェニックなマウスから調製した、海馬器官型スライス培養物からのβ-アミロイド1-40の分泌。図４。器官型スライス培養物の生存率およびβ-アミロイド分泌に対する試験化合物MDL 28170の評価。発明を実施するための様態一般的記載本発明は、β-アミロイドを減少させる化合物を同定するために使用され得る方法を提供する。本発明は、試験化合物の毒性およびβ-アミロイドを減少させる活性を同時に評価するための器官型脳スライス培養法の使用に基づく。一般に、β-アミロイドを減少させる化合物は、以下の工程により同定され得る：器官型脳スライス培養物を調製する工程；この器官型脳スライス培養物中の細胞の生存率を評価する工程；試験化合物をこの器官型脳スライス培養物に適用する工程； (i)この処理された器官型脳スライス培養物および(ii)処理されていない器官型脳スライス培養物の生存率およびβ-アミロイド産生を評価する工程；ならびに β-アミロイド産生を減少させるが細胞生存率を減少させない化合物を同定する工程。 β-アミロイドおよびβ-アミロイド前駆体タンパク質本明細書中で用いられる場合、「β-アミロイドペプチドまたはタンパク質」は、任意のβ-アミロイド種のタンパク質をいう。このようなタンパク質は、代表的には、約4kDaである。いくつかの異なるアミノ末端および不均質なカルボキシル末端配列が、アルツハイマー病組織由来および培養細胞由来のペプチドβ- アミロイドタンパク質の特徴付けに基づいて観察されている（GlennerおよびWon g（1984）Biochem Biophys Res Commun 120:885-890;Joachimら（1988）Brain R es 474:100-111;Prelliら（1988）J Neurochem 51:648-651;Moriら（1992）J Bi ol Chem 267:17082-17806;Seubertら（1992）Nature 359:325-327;Naslundら（1 994）Proc Natl Acad Sci USA 91:8378-8382;Roherら（1993）Proc Natl Acad S ci USA 90:10836-10840;Busciglioら（1993）Proc Natl Acad Sci USA 90:2092- 2096;Haassら（1992）Nature 359:322-325）。具体的には、、カルボキシル末端に関して、β-アミロイドペプチドは、39位、40位、41位、42位、43位、または4 4位で終了し、ここで１位は、GlennerおよびWong（1984）Biochem Biophys Res Commun 120:885-890により定義される、β-アミロイド配列のアスパラギン酸であることが示されている。用語「β-アミロイド前駆体タンパク質」すなわち「β-APP」は、任意の差示的にスプライシングされたイソ型のこのタンパク質をいい、695、714、751、および770のアミノ酸のイソ型（Kangら（1987）Nature 325:530-532;Ponteら（198 8）Nature 331:525-527;Tanziら（1988）Nature 331:528-530;Kitaguchiら（198 8）Nature 331:530-532;de Savageら（1989）Science 245:651-653）を含むがこれらに限定されない。用語β-APPはまた、天然に存在する、ヒト変異体のβ-APP （Goateら（1991）Nature 353:844-846;Mullanら（1992）Nature Genet 1:345-3 47;Murrellら（1991）Science 254:97-99;Van Broeckhoven（1995）Eu r Neurol 35:8-19）；野生型β-APP；組換えDNA方法論を用いて培養細胞により産生された変異体β-APP；およびβ-アミロイドを生成し得る、天然のまたは人工の誘導体のβ-APPを含む。器官型脳スライス培養物本明細書中で使用される場合、用語「器官型脳スライス培養物」は、培養において維持される、脳組織の切片または外植片をいう（Seil（1979）Review in Ne uroscience 4:105-177;Gahwiler（1981）J Neurosci Meth 4:329-342;Gahwiler （1984）Neuroscience 11:751-760，Gahwiler（1988）Trends Neurosci 11:484- 490;Stoppiniら,（1991）J Neurosci Methods 37:173-182）。当業者は、当該分野で公知の器官型脳スライス培養法を本発明における使用のために容易に用い得る。器官型脳スライス培養物は、脳組織全体の切片または脳の特定の領域から得た外植片を用い得る。任意の領域が用いられ、器官型脳スライス培養物を生成し得る。しかし、器官型脳スライス培養物の好ましい供給源は、脳の特定の領域（好ましくは、海馬領域または皮質領域）から得た外植片である。器官型脳スライス培養物の調製任意の哺乳動物は、その動物が組織供給源として役立ち得さえすれば、本発明の方法で使用される器官型脳スライス培養物を生成するために使用される外植片の組織供給源として用いられ得、そしてその器官型スライス培養物は樹立され、かつ本発明の方法を実施するのに充分な期間の間保持され得る。このような哺乳動物は、ラット、マウス、モルモット、サル、ウサギ、およびヒト胎児を含むがこれらに限定されない。組織供給源として用いられる哺乳動物は、野生型哺乳動物であり得るか、または導入遺伝子を含み、そして発現するように遺伝的に変更された哺乳動物であり得る。好ましくは、動物は、β-アミロイド前駆体タンパク質の神経産生を発現するように変更されたトランスジェニック動物（例えば、マウストランスジェニック）（Ouonら（1991）Nature 35:598-607;Higginsら（1995）Proc Natl Acad Sci USA 92:4402-4406）である。最も好ましくは、動物は、ヒトβ-アミロイド配列由来であるかまたはヒトβ-アミロイドに基づく、β-アミロイド前駆体タンパク質を、発現するように変更される。組織供給源として用いられる哺乳動物は、任意の年齢であり得る。好ましくは、哺乳動物組織供給源は、新生児の哺乳動物である。生存動物から培養用の組織を得るために、動物は好ましくは、迅速に殺され、および断頭され、これは一般に同時に行なわれる。次いで、脳が、生理学的pHに緩衝化した解剖培地へと迅速に取り出される。このような培地の一例は、10mM T risで緩衝化し（pH7.2）、抗生物質を補充した最少必須培地（MEM）である。次いで、脳または所望の脳領域が、無菌条件下で解剖顕微鏡下で単離される。脳組織全体を、器官型脳スライス培養物を樹立するために用い得る。あるいは、脳の特定の野または領域を、外植片供給源として用い得る。β-アミロイド産生を評価するための器官型脳スライス培養物の供給源に好ましい領域は、海馬および皮質である。次に、表面対容積の比が組織の中心と培地との間での交換を可能にするように、小さな領域が組織からスライスまたは外植片として分離される。種々の手順が、脳組織を切片化または分割するために用いられ得る。例えば、切片化デバイスが用いられ得る。組織切片のサイズ/厚さは、主に組織供絵源および切片化/分割に用いられる方法に基づく。例えば、好ましいセグメントは、直径約400〜約500 μmであり、そして組織チョッパー、カミソリの刃、または他の適切な切片化/ミクロトーム刃を用いて作製される。切片化後、切片を分離し、そして損傷した組織を除去する。脳組織の切片は、好ましくは、数滴の解剖培地中で操作され、そして培養培地中に挿入した培養プレート上に配置される。過剰な培地が、例えば、ティッシューを用いて除去され、そして培養物がインキュベーター中に配置される。培養培地および培養条件の選択は、意図される用途、組織の供給源、および切片が本発明の方法に用いられるまでの時間に依存する。培養培地の例は、抗生物質およびL-グルタミンを補充した、25％ウマ血清、50％最少必須培地、25％ハンクス培地を含むがこれには限定されない。培養条件の例は、37℃、５％CO₂を含むがこれには限定されない。培養物は、最良の条件下で数ヶ月の間は保持され得る。しかし、器官型脳スライス培養物は、好ましくは、培養物への移植の外傷に続いて安定化された後、しかし減少の始まりの前に、用いられる。一般に、生成されてから約１週間〜約４週間後のスライス培養物を用いることが好ましい。生存率の評価器官型脳スライス培養物を得た後、器官型脳スライス培養物は試験化合物の適用の前に生存率について試験される。器官型脳スライス培養物の生存率/完全性は、代表的には、調製物の健常性を実証するため、ならびに予め処理した培養物中に存在する生存組織の量の尺度を提供するために、各実験の開始時に評価される。生存率を決定するための当該分野で公知の任意の方法が用いられ得る。例えば、このような方法は、以下を含むがこれらに限定されない：顕微鏡下の視覚的検査；トリパンブルーのような生体色素での姉妹培養物の染色；正常な脳および傷害を受けた脳に存在する細胞型もしくは部分に特異的な染色および免疫組織化学試薬（例えば、銀染色、ならびに神経フィラメント、グリア原線維酸性タンパク質、S100、微小管関連タンパク質、正常なタウもしくはリン酸化されたタウ、およびシナプスタンパク質に対する抗体）；例えば、MTTアッセイを用いる代謝活性の生化学的評価、もしくは例えば、乳酸デヒドロゲナーセ（LDH）アッセイによる細胞漏出性の生化学的評価；総タンパク質含量もしくは特定のタンパク質含量の測定；またはシナプス活性のような細胞機能の評価。好ましくは、神経活性は、基底条件下での可溶性β-アミロイド前駆体タンパク質分泌または刺激の際の神経伝達物質の分泌のような分泌を測定することにより知らされる。刺激は、電気刺激、イオン脱分極（代表的には高カリウムを用いる）、または神経伝達物質基質の適用により達成され得る。代表的に測定される分泌物質は、ニューロンに存在する神経伝達物質（例えば、アセチルコリン、γ-アミノ酪酸（GABA）、グルタミン酸、カテコールアミン、およびニューロペプチド）である。当業者は、任意の現在公知の生存率試験方法を本発明における使用に容易に適用させ得る。試験物質の適用実験の開始時に、器官型スライス培養物は、代表的に、培地を有する培養皿へと移される。培養培地は、組織切片の導入の前に存在する試験化合物を有するか、または組織切片が培養皿に置かれた後に試験化合物が培地に添加され得るかのいずれかであり得る。一般に、試験物質は、適切なビヒクル（例えば、DMSO、水、生理学的食塩水、または培地を含むがこれらに限定されない）に最初に溶解されてストック溶液が作製され、次いで培地に希釈される。一般に、ビヒクルのコントロール試験は、本発明が用いられる場合、含まれる。好ましくは、ある範囲の用量が試験される。最初に試験される範囲は、精製された酵素、培養中の細胞によるβ-アミロイド産生、または他の試験系における毒性についての物質または密接に関連する物質の効果についての先行知識により情報を与えられ得る。このような知識が存在しない場合では、用量範囲は、好ましくは約１nM〜約100μMである。当業者は、任意の特定の化合物または一連の化合物についての試験範囲を容易に開発し得る。化合物は、代表的には、約４時間〜約21日、好ましくは約１日〜約７日間の間、組織切片に適用される。長期適用の場合、化合物を含む新鮮な培地が、周期的に；化学変換または代謝に起因する化合物の迅速な喪失が予測される場合は、より頻繁に、適用され得る。試験化合物この方法においてアッセイされる化合物は、ランダムに選択され得るか、または合理的に選択もしくは設計され得る。本明細書中で用いられる化合物は、他の同定された活性化合物の構造を考慮せずに化合物がランダムに選択される場合に、ランダムに選択されるといわれる。ランダムに選択される化合物の例は、化学ライブラリー、ペプチドコンビナトリアルライブラリー、生物の増殖培養液、または植物抽出物の使用である。本明細書中で用いられる化合物は、化合物がランダムではない基礎に基いて選択される場合に、合理的に選択または設計されるといわれる。合理的選択は、以前に同定された活性化合物の作用標的または構造に基づき得る。具体的に、化合物は、アルツハイマー病の処置における使用のために現在調査されている化合物の構造を利用して合理的に選択または合理的に設計され得る。本発明の化合物は、例えば、ペプチド、低分子、およびビタミン誘導体、ならびに炭水化物であり得る。当業者は、本発明の化合物の構造的性質に制限がないことを容易に認識し得る。化合物の効果の評価試験期間（試験化合物がスライス培養物と接触していた期間）の終了時に、スライス培養物中の細胞の生存率、処理された培養物およびコントロールの培養物によるアミロイド産生のレベル/程度が評価される。当該分野で公知の種々の方法が、存在するβ-アミロイドの量を決定するために用いられ得る。このような方法は、以下を含むがこれらに限定されない：免疫沈降を用いて、培養培地中へのβ-アミロイドの分泌量を決定すること（Zhongら（1994）J Biol Chem 16:121 79-12184;Higakiら（1995）Neuron 14:651-659）；放射免疫アッセイ（Naiduら（1995）J Biol Chem 270:1369-1374）；酵素結合免疫アッセイ（Vigo-Pelfrey ら（1993）J Neurochem 61:1965-1968;Suzukiら（1994）Science 264:1336-1340 ;Asami-Odakaら（1995）Biochemistry 34:10272-10278）ゲル電気泳動；および処理された器官型脳スライスおよびコントロールの器官型脳スライスにより馴化された濃縮培地または希釈していない培地を用いるウエスタンブロッティング技術。スライス組織中の可溶性β-アミロイドは、組織ホモジネートを調製し、そして免疫沈降、放射免疫アッセイ、酵素結合免疫アッセイ、ゲル電気泳動、またはウェスタンブロッティング技術を用いてアミロイドを検出することにより測定され得る。沈着したβ-アミロイドは、生化学的に、またはアミロイド沈着物およびアミロイド斑を計数することにより評価され得る。生化学的には、脳ホモジネートの遠心分離によるペレットから得られた不溶性物質が、脳ホモジネートについてちょうど記載された通りに評価され得る。β-アミロイド斑および沈着物は、標準的な組織化学染色（例えば、銀、チオフラビンS,コンゴ-レッド）により、抗β-アミロイド抗体（Higginsら（1994）Ann Neurol 35:598-607;Higgi nsら（1995）Proc Natl Acad Sci USA 92:4402-4406）を用いる免疫組織化学により、またはスライス中の予め存在する沈着物上に[¹²⁵Ｉ]-β-アミロイドを沈着させ、続いてオートラジオグラフィーにより（Maggioら（1992）Proc Nati Ac ad Sci USA 89:5462-5466）可視化され得る。β-アミロイド検出方法を本発明における使用に適用することは、当該分野の技術を用いれば充分である。本発明の実施において、脳組織からのβ-アミロイド分泌、脳組織におけるβ- アミロイド沈着、および脳組織中に存在するβ-アミロイドは、別々の実験/処理において独立して決定され得るか、あるいは２つ以上のβ-アミロイドクラスが単一の試験サンプルから決定され得る。一般に、脳組織からのβ-アミロイド分泌、脳組織におけるβ-アミロイド沈着、および脳組織中に存在するβ-アミロイドを各試験化合物について検出することが好ましい。 β-アミロイド産生を測定することに加えて、測定が、アミロイドを生成するスライスにおける生存組織の量からなることが好ましい。この測定は、培地中の β-アミロイドについての値を正規化するため、および試験薬剤の毒性を決定するための尺度として用いられる。一般に、生存率アッセイは、実験の開始時に用いられるアッセイである。好ましくは、スライスに損傷を与えないアッセイは、試験期間の開始時および終了時の両方で用いられる。このような使用は、最大の精度を提供し、そして化合物の毒性についての効率的な評価を町能にする。これが可能でない場合、生存アッセイが実験の開始時に用いられるか、またはスライスを破壊するアッセイが姉妹培養物について行なわれるかのいずれかである。 β-アミロイドを減少させる化合物の同定本発明の方法に用いられる薬剤は、β-アミロイド産生を減少させる程度および示される毒性の程度により分類される。本発明の方法を用いて同定される最も好ましい化合物は、無毒性であり、処理された培養物と処理されていない培養物との間で生存率の減少を示さない。しかし、低い毒性レベルが、特定の用途（例えば、最初の化合物試験および設計）に関しては耐えられ得る。好ましい化合物は、β-アミロイド分泌/沈着/産生を、50％より多く減少させる。より好ましくは、β-アミロイド分泌/沈着/産生は、90％より多く減少し、最も好ましくは全てのβ-アミロイド分泌/沈着/産生を除去する。これらの実施例は、本発明を例示することを意図し、本発明を制限することは意図しない。実施例１ラット器官型脳スライス培養を用いる化合物試験培養の調製。８日齢の新生仔小ラットを、無菌のガスフード中で、１つのエッジが鋸歯状のハサミを用いて迅速に断頭した。脳を、濾過滅菌しそして冷却された、100ml MEM、１mlペニシリン/ストレプトマイシン、１ml Tris 100×ストック( 最終10mM、pH7.2)を含む濾過滅菌した緩衝化解剖培地に迅速に移した。海馬(hip pocampi)を解剖顕微鏡下で単離し、そして解剖培地中で無菌のガスフードに輸送した。組織を、無菌のペイントブラシを備えたMacIllwain組織切断機のステージ上に配置し、そして400μmの切片を作成した。動物あたり約30の切片が得られた。切片を、培養培地(25％ウマ血清、25％Hank培地、50％最小必須培地、１mlペニシリン/ストレプトマイシン、0.5ml L-グルタミンを含む)中の切片を含むペトリ皿を激しく旋回することにより分離した。切片を、解剖顕微鏡で検査し、そして損傷組織を取り除いた。選択された切片を、パスツールピペット(これは、切り目をつけて折り、次いで口焼きし、適切な直径の孔を生成してある)を用いて解剖培地の液滴中で操作し、そして１mlの培養培地を含む35mmプレート中、または1.2mlの培養培地を含む６ウェルプレートにセットされたミリポア培養プレート挿入物上に置いた。挿入物および培地を含むプレートを、37℃かつ５％CO₂まで予備平衡化した。３〜６のスライスを各挿入物上に置いた。余分の培地をスライスから取り、そして培養を、37℃、５％CO₂インキュベーター中に置いた。培養を、３ケ月まで維持した。培地は、24時間目に、そしてその後３〜４日間隔で交換した。海馬器官型スライス培養により調製された培地をアッセイのために蓄えた。培養の特徴付け。器官型脳スライス培養を、培養の最初の週は毎日、そしてその後は、２〜３日毎に検査した。最初の週の間、器官型脳スライス培養は、組織構造は保持されるが、平坦になりかつ拡がった。生育スライスのエッジから出現する成長円錐が観察され、そして最初の週の間、スライスのエッジに神経膠細胞が出現した。その後、成長円錐は、退縮した。神経膠細胞は、スライスのエッジに残ったが、スライスの全体にわたっては生育しなかった。細胞組織および組成を、１〜８週に、１週間間隔で、培養中で維持されたスライスで評価し、インタクトの海馬の細胞形態、組成、および組織に似たそれらを確認した。免疫組織化学を、シナプトフィジン、成長関連タンパク質43(GAP-43)、微小管関連タンパク質２(MAP-2)、ならびにニューロンおよびS-100を可視化するための神経フィラメント200抗体および神経膠細胞を可視化するための神経膠酸性原線維タンパク質(GFAP)抗体を用いて、以下のプロトコールに従って実施した：器官型スライス培養を、培養挿入物上で操作した。挿入物は、適切な処理物を含む培養プレート間でピンセットを用いて移動した。まず、培地を、リン酸緩衝化生理食塩水PBS：(100mM NaCl、10mM NaPO₄、pH7.4)で数回リンスして培養から洗い流した。組織を、PBS中に用時調製した４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で２時間インキュベートすることにより固定した。固定液を、PBS中で２× ２分間リンスして取り除いた。内因性のペルオキシダーゼ活性を、0.3％の過酸化水素とともに30分間室温でインキュベートすることにより停止し、PBS中で10 分間そして0.2％ゼラチンを含むPBS中で10分間リンスした。次に、それらを、PB S/10％ヤギ血清/0.1％Nonident P-40中で１時間ブロックし、そしてPBS中で２× 10分間リンスした。一次抗体を、0.2％のゼラチンを含むPBS中でなされた示された希釈で適用し、そして湿潤チャンバー内で一晩インキュベートした。PBS/ゼラチン中の３×３分間のリンスの後、培養物を、２°抗体と(Vectastain Elite免疫組織化学キットで提供される抗マウスまたは抗ウサギのいずれか適切な方）、 PBS/ゼラチン中３７℃で30分間インキュベートした。Vectastain Elite ABC試薬は、製造業者の説明書に従って調製した。PBS/0.2％ゼラチンを用いた３×３分間のリンスの後、培養物を、37℃で30分間、ABC試薬とインキュベートした。免疫反応性を、Vector labsからの3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)キットで展開し、そして指示に従って調製し、そして水でリンスすることより可視化した。脱水は、35％、50％、70％、90％、および２×100％エタノール中の２分間のインキュベーションにより達成した。培養物を、ヘマトキシリンで２〜４分間対比染色し、そして透明になるまで水でリンスした。挿入物自体の脱染色には、70％エタノール中の0.5％塩酸を30秒間用い、そしてその後水道水でリンスした。風乾後、個々のスライスを挿入物から切り出し、そしてゲルマウントを用いて顕微鏡スライド上にマウントし、カバーグラスで覆い、そしてマニキュア液でシールした。代表的な顕微鏡写真を図１に示す。クレシルバイオレット、ヘマトキシリン、およびトルイジンブルー染色を、上記のように培養物をパラホルムアルデヒド中に固定することにより行った。ヘマトキシリン(Sigma)は、２〜４分間適用され、その後、上記のように、培養物を水でリンスし、そしてエタノール中で透明にした。クレシルバイオレットおよびトルイジンブルーは、蒸留水中で0.1％のストック染料溶液として作成した。染色溶液は、0.2M酢酸緩衝液、pH4.45：３部の0.2M酢酸、２部の0.2M酢酸ナトリウム、５部の水において20％として作成した。染色時間は、両方の染料について20 分間であった。上記のように、培養物を水でリンスし、エタノール中で脱水し、乾燥し、そしてマウントした。培地中へのβアミロイド1-40分泌を、培養中はじめの24時間の間、培養中１日〜４日の間、および培養中16日〜20日の間馴化培地を集めることにより調べた。馴化培地のアリコートを、サンドイッチELISAを用いてアッセイし、βアミロイド1-40を、２つの方法のうち１つで測定した。第１に、２連の100μlのアリコートをELISAで直接アッセイした。第２に、３つの別の培養ウェルからの３mlの培地のプールを、Sep-Pak C18カラムへのアプライおよびアセトニトリル中の溶出により、濃縮かつ同時にいくつかの他の成分から分離した。アミロイドを含むことが先に示されている50％溶出画分を集め、乾燥し、小容量の緩衝液中に再懸濁し、そしてELISAにおいてアッセイした。２つのアッセイの結果は、緊密に一致し、そして濃縮工程なしでさえ、馴化培地中のβアミロイド1-40の測定可能なレベルを容易に実証した(図２を参照のこと)。化合物の付与。細胞培養アッセイでβアミロイド低減活性について陽性であるとスコアされ、そして同細胞に対して非毒性であるとしてスコアされた２つの試験化合物が選択された。これら化合物は、モルモット中で試験され、そして脳組織に高度に毒性であることが見出された。この実施例を用いて、スライスアッセイが、細胞培養アッセイより良好なインビボ活性の算定アッセイであることを示した。試験化合物を、DMSO中に溶解し、100×ストック溶液を生成した。ストックを、培養培地中にさらに希釈し、０、１μＭ、および100μＭ化合物の最終濃度を得た。培地を、プレート中37℃、５％CO₂で予備平衡化した。８日齢のラットから得た３つのラットの器官型脳スライスを保持し、そして２週間培養中に維持された培養挿入物を、試験溶液を含む培地中に移した。培地を集め、そして試験溶液を含む新鮮培地を、10日間24時間間隔で提供した。器官型脳スライス培養を毎日観察した。肉眼による検査は、スライス中心における黒ずんだパッチ、細胞層組織の損失により、そして最終的にスライスエッジにおける組織損失により示される組織一体性の損失を示した。毒性の評価。毒性は、解剖顕微鏡および倒立光学顕微鏡の下、肉眼で評価した。実験の終わりに、培養を、抗シナプトフィジン抗体免疫反応性のために処理した。両方の試験化合物は、生存率を測定するためのミトコンドリア機能のアッセイ (MTTアッセイ)を用いる細胞を基礎にしたアッセイにおけるこの実験で、試験された濃度範囲にわたって非毒性とスコアされた。第１の化合物のインビボ試験は、処理されたモルモットからの脳切片の組織化学によりスコアされたとき、有意な毒性を示した。処理された器官型スライス培養の肉眼観察は、処理の５〜６日までに明白な毒性を、そして１０日の実験の終わりに重症の壊死外観を示した。免疫組織化学によりこの評価を確認した。したがって、器官型スライスアッセイは、細胞を基礎にしたアッセイより良好なインビボ結果の算定アッセイであった。第２の化合物もまた、細胞を基礎にしたアッセイで非毒性としてスコアされ、そして器官型スライス培養に重症度が僅かにより少ないがなお顕著な毒性影響を有していた。器官型スライス培養アッセイ結果により予見されるように、この化合物は、明らかな毒性が観察されたが、第１化合物より毒性が少なかった。図１の詳細な説明。器官型スライス培養を、ピンセットを用いて染色手順の間に培養挿入物上で操作し、適切な処置物を含む培養プレート間で挿入物を移動した。まず、培地を、リン酸緩衝化生理食塩水PBS：(100mM NaCl、10mM NaPO₄、pH7. 4)で数回リンスして培養から洗浄した。組織を、PBS中に用時調製した４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で２時間インキュベートすることにより固定した。固定液を、PBS中で２×２分間リンスして取り除いた。内因性のペルオキシダーゼ活性を、0.3％の過酸化水素と30分間室温でインキュベートすることにより停止し、PBS中で10分間そして0.2％ゼラチンを含むPBS中で10分間リンスした。次に、それらを、PBS/10％ヤギ血清/0.1％Nonident P-40中で１時間ブロックし、そしてPBS中で２×10分間リンスした。一次抗体を、0.2％のゼラチンを含むPB S中で作製された示された希釈で適用し、そして湿潤チャンバー内で一晩インキュベートした。PBS/ゼラチン中の３×３分間のリンスの後、培養を、２°抗体と (Vectastain Elite免疫組織化学キットで提供される抗マウスまたは抗ウサギのいずれか適切な方)、PBS/ゼラチン中３７℃で30分間インキュベートした。Vecta stain EliteABC試薬は、製造業者の説明書に従って調製した。PBS/0.2％ゼラチンを用いた３×３分間のリンスの後、培養を、37℃で30分間、ABC試薬とインキュベートした。免疫反応性を、Vector labsからの3,3'-ジアミノベンジジン(DAB )キットで展開し、そして指示に従って調製し、そして水でリンスすることより可視化した。脱水は、35％、50％、70％、90％、および２×100％エタノール中の２分間のインキュベーションにより達成した。培養を、ヘマトキシリンで２〜４分間対比染色し、そして透明になるまで水でリンスした。挿入物自体の脱染色には、70％エタノール中の0.5％塩酸を30秒間用い、そしてその後水道水でリンスした。風乾後、個々のスライスを挿入物から切り出し、そしてゲルマウントを用いて顕微鏡スライド上にマウントし、カバーグラスで覆い、そしてマニキュア液でシールした。上のパネルは、ラットから調製され、培養中で９週間維持され、そして抗シナプトフィジンモノクローナル抗体を用いて染色された、海馬器官型スライスの代表的顕微鏡写真を示す。CA-1視野は20倍で示される。左下のパネルは、ラットから調製され、培養中で4.5週間維持され、そして抗神経フィラメント200モノクローナル抗体を用いて染色され、そして20倍で写真撮影した海馬器官型スライドの代表的顕微鏡写真である。右下のパネルは、ラットから調製され、培養中で10週間維持され、そして抗神経膠原線維酸性タンパク質(GFAP)モノクローナル抗体を用いて染色され、そして40倍で写真撮影した海馬器官型スライスの代表的顕微鏡写真である。示された免疫反応性は、それぞれ、シナプス、ニューロン細胞体、および星状細胞に対する標準的マーカーである。正常細胞および組織形態が示される。実施例２トランスジェニックマウス器官型スライス培養の評価培養の調製。ヒトβアミロイド前駆体タンパク質(β-APP)の751アミノ酸イソ型について、ニューロン特異的エノラーゼプロモーターによる神経発現についてプログラムされた、10日齢のトランスジェニックマウスの子供を、海馬器官型スライス培養の組織供給源として用いた。培養を、実施例１に記載のラット脳スライス器官型培養についてのように調製した。生存率の評価。トランスジェニックマウス脳スライス培養を、解剖および倒立光学顕微鏡で一日おきに肉眼で観察した。種々の時間で、スライスを、細胞形態および器官型解剖学的構造を識別するためにクレシルバイオレットおよびヘマトキシリンを、そしてニューロンおよび神経膠を評価するためにシナプトフィシンおよびGFAP免疫組織化学をそれぞれ用いる組織化学のために採取した。βアミロイド分泌の評価。馴化培地を、インビトロの最初の24時間の期間の間、次いで３-４日の間隔の間で、３つの器官型海馬スライスを含む個々の培養ウェルから集めた。これらの馴化培地試料の２連の100μlの試料を、３匹のドナー動物に由来する海馬スライス培養についてのそれぞれ３つの培養ウェルに対し、β アミロイド1-40またはβアミロイド1-42を検出するサンドイッチELISAで直接アッセイした。この実験の結果は、トランスジェニックマウス器官型海馬培養からのアミロイド分泌が、[1]阻害活性の測定を可能にするレベルで容易に検出可能であり[2]５〜２０日間安定であり[3]個々のドナー動物に依存しないレベルで産生され、そして[4]培養ウェル間で受容可能な低い変動を示すことを実証する。 βアミロイド1-40 ELISAアッセイからの結果を図３に示す。実施例３トランスジェニックマウス器官型スライス培養を用いる化合物試験培養物の調製。海馬器官型スライス培養を、ヒトβアミロイド前駆体タンパク質 (β-APP)の751アミノ酸イソ型について、ニューロン特異的エノラーゼプロモーターにより神経発現についてプログラムされた、10日齢のトランスジェニックマウスから、実施例２に記載のように調製し、そして１０日間培養中に維持した。生存率の評価。培養をほぼ一日おきに肉眼で観察した。化合物試験の開始時、培養１０日目、生存率の定量的評価を行った。脳スライスを、高カリウム(54mM)培地を５分間適用することにより脱分極した。挿入物を、３７℃、５％CO₂で予備平衡化した培地中、２×２分間の洗浄を通過させ、そしてインキュベータに戻した。脱分極期間の間にスライスによって馴化高カリウム培地は、シナプス小胞により放出される成分を含む。この培地を２つのアリコートに分け、そしてγアミノ酪酸(GABA)およびグルタミン酸、海馬中に存在する２つのペプチド神経伝達物質についてアッセイした。培地は、簡便には、GABAおよびグルタミン酸に特異的な市販の抗体で展開するELISAを用いてアッセイした。第３のアリコートを用いて、AD海馬で初期に影響される神経伝達物質であるアセチルコリン(ACh)をアッセイし、これには、AChレセプターを保持する膜を利用する放射標識コリン作動性アンタゴニスト置換アッセイを用いた。これらのアッセイは、各挿入物上に存在する生存組織の量の定量的測定を提供し、インタクトのシナプス活性を示し、そして培養を害さない。試験化合物の付与。試験化合物を、DMSO中に溶解し、100×ストック溶液を生成し、そしてさらに培養培地中に適切な最終濃度に希釈した。これらは、化合物の活性または毒性についての先の情報が他であることを指定しなければ、これらは、通常、100nM〜100μMの化合物であった。ビヒクルの最終濃度について１％DMS Oコントロールを含めた。培養挿入物を新たなプレートに移す前に、培地を３７ ℃、５％CO₂で予備平衡化し、そして培地を48時間毎に交換し、新鮮な化合物を提供した。馴化培地を評価のために蓄えた。培養物を毎日肉眼で観察した。試験化合物の付与を10日間継続した。生存率の評価。試験期間の終わりに、最後の試験間隔からの馴化培地を集め、そしてシナプス活性を、上記のように、高カリウム培地における脱分極化、次いで放出されたGABAおよびグルタミン酸の測定により評価した。βアミロイド低下活性の評価。各試験期間間隔からの馴化培地を、ELISAアッセイを用いるβアミロイドレベルについてアッセイした。この方法により生成されたデータは、試験された各用量について、用量応答関係および時間経過を提供する。アミロイドの供給源として供するための培養挿入物の各々について異なる量の生存組織が存在し得るので、馴化培地におけるβアミロイドの値は、実験開始時に放出された神経伝達物質の値を用いて標準化した。毒性は、実験の開始時および終了時の神経伝達物質放出値を比較することにより評価した。実験開始時に対して終了時に神経伝達物質放出値の減少を引き起こす化合物は、毒性効果をもつと考えられた。この場合、βアミロイドレベルの減少は、βアミロイド産生に対する特異的影響よりもむしろ毒性が原因であるとし得る。沈着したβアミロイドを、抗βアミロイド抗体mAb4.1を用いる免疫組織化学によりスコアし、面積あたりのアミロイド沈着および斑の数を、処理スライス対コントロールスライスでスコアした。実施例４トランスジェニックマウス器官型スライス培養を用いた化合物試験培養の調製。海馬器官型スライス培養を、ヒトβアミロイド前駆体タンパク質( β-APP)の751アミノ酸イソ型について、実施例２に記載のようにニューロン特異的エノラーゼプロモーターにより神経発現についてプログラムされた10日齢トランスジェニックマウスから調製し、そして培養中６週間維持した。図４の詳細な説明。海馬器官型スライス培養を、β-APP751についてトランスジェニックマウスから調製した。インビトロで21日目に、器官型培養を、培地で２回洗浄し、そして２連のウェルを、25μM〜400μMのMDL28170を補填した培地中３日の馴化期間の間インキュベートし、プロテアーセインヒビターが100μMのIC₅₀ で細胞培養中で総βアミロイド産生を阻害することが示された。MDL28170は、 DMSO中で調製した100×ストック溶液から付与された。コントロール培養はDMSO のみを与えられた。24日目に馴化培地を集め、そしてサンドイッチELISAを用いてβアミロイド1-40について２連でアッセイした。器官型培養を、無血清培地で２回洗浄し、そしてMDL28170を連続して存在させた無血清培地でさらに24時間インキュベートした。この馴化培地を、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性についてアッセイした。LDHは、健全でない細胞によってのみ、馴化培地中に放出される遍在性細胞質酵素であり、そして生存率および毒性の指標である。血清中の高レベルのLDH活性は、無血清馴化培地中でなされるべき測定を要求する。示されたデータ点は、最初に各ウェルについて２連のELISA値の平均をとり、次いで２連の処理ウェルの値の平均を計算することにより計算した。βアミロイドインヒビター活性および毒性の評価。培養をほぼ一日おきに肉眼で観察する。化合物試験を開始する前、培養中18日目に、培地が非処理培養でならされる３日間の試験期間を開始した。この培地を集め、そして高感度ELISAを用いてβアミロイド1-40および1-42レベルについてアッセイした。次いで器官型培養を培地で２回洗浄し、そして25μM〜400μMのMDL28170を補填した培地中さらに３日の馴化期間の間インキュベートし、プロテアーゼインヒビターが100μMの IC₅₀で細胞培養中で総βアミロイド産生を阻害することが示された。MDL28170は、DMSO中で調製された100×ストック溶液から適用された。コントロール培養はD MSOのみを与えられた。21日目に馴化培地を集め、器官型培養を、無血清培地で２回洗浄し、そしてMDL28170を連続して存在させた無血清培地でさらに24時間インキュベートした。この馴化培地を、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性についてアッセイした。LDHは、健全でない細胞によってのみ馴化培地中に放出される遍在性細胞質酵素であり、そして生存率および毒性の指標である。血清中の高レベルのLDH活性は、無血清馴化培地中でなされるべき測定を要求する。次いで、器官型海馬スライス培養を、血清を含むが薬物を含まない培地中でリンスし、そして３日間新鮮な培地に馴化させた。この培地を、同じELISAでβアミロイド1-40および1-42についてアッセイし、MDL活性が、器官型脳スライス系が培養された単型細胞上にあるとき、可逆的であるか否かを決定した。このアッセイは、24時間の馴化期間後に、無血清培地を用いて行われ、MDL28170の毒性効果もまた可逆的であるか否かを決定した。図４は、トランスジェニックマウス海馬器官型スライス培養によるβアミロイド産生について、MDL28170のIC₅₀が100μMであることを示し、これは種々の単型細胞培養について同様である。さらに、阻害が毒性の非存在下で実証された。これは、肉眼観察によって、またはLDHアッセイによっては、試験化合物の濃度が400μMに達するまでは明確ではなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．βアミロイドを減少させる薬剤を同定する方法であって、以下の工程： a）器官型脳スライス培養を調製する工程； b）該器官型脳スライス培養において細胞の生存率を評価する工程； c）試験化合物を該器官型脳スライス培養に適用する工程； d）（i）工程（c）の処理された該器官型脳スライス培養および（ii）処理されていない器官型脳スライス培養の生存率およびβアミロイド産生を評価する工程；ならびに e）βアミロイド産生を減少させるが、細胞生存率を減少させないか、または他の細胞機能を変化させる化合物を同定する工程、を包含する、方法。２．前記器官型脳スライス培養が、ラット、ウサギ、モルモット、マウス、サル、ヒト胎児からなる群から選択される哺乳動物から単離された脳組織から調製される、請求項１に記載の方法。３．前記哺乳動物が、βアミロイドタンパク質を産生するように変更されたトランスジェニック哺乳動物である、請求項１に記載の方法。４．前記哺乳動物が、ヒトβアミロイドタンパク質を産生するように変更されたトランスジェニック哺乳動物である、請求項２に記載の方法。５．前記器官型脳スライス培養が、海馬および皮質からなる群から選択される脳領域から得られた外植片である、請求項１に記載の方法。６．前記器官型脳スライス培養が、海馬および皮質からなる群から選択される脳領域から得られた外植片である、請求項２に記載の方法。７．前記器官型脳スライス培養が、海馬および皮質からなる群から選択される脳領域から得られた外植片である、請求項３に記載の方法。８．前記器官型脳スライス培養が、約400μm〜約500μmの厚さの組織の切片である、請求項１に記載の方法。９．前記器官型脳スライス培養が、約400μm〜約500μmの厚さの組織の切片である、請求項５に記載の方法。１０．前記器官型脳スライス培養が、約400μm〜約500μmの厚さの組織の切片である、請求項７に記載の方法。１１．前記器官型脳スライス培養が、試験化合物での処理の前約１週間〜約４週間培養培地に維持される、請求項１に記載の方法。１２．前記器官型脳スライス培養の生存率が、以下：顕微鏡下での視覚的検査；生体色素を使用しての染色；正常および傷害を受けた脳において存在する細胞型または部分に特異的な染料および免疫組織化学的試薬；神経フィラメント、グリア原線維酸性タンパク質(glial fibrillary acidic protein)、S100、微小管関連タンパク質、正常なタウまたはリン酸化されたタウ、およびシナプスタンパク質に対する抗体；代謝活性の生化学的評価；総タンパク質含量または特定のタンパク質含量の測定；細胞機能の評価；ならびに神経活性の評価、からなる群から選択される方法によって決定される、請求項１に記載の方法。１３．前記器官型脳スライス培養の生存率が、以下：顕微鏡下での視覚的検査；生体色素を使用しての染色；正常および傷害を受けた脳において存在する細胞型または部分に特異的な染料および免疫組織化学的試薬；神経フィラメント、グリア原線維酸性タンパク質、S100、微小管関連タンパク質、正常なタウまたはリン酸化されたタウ、およびシナプスタンパク質に対する抗体；代謝活性の生化学的評価；総タンパク質含量または特定のタンパク質含量の測定；細胞機能の評価；ならびに神経活性の評価、からなる群から選択される方法によって決定される、請求項７に記載の方法。１４．前記器官型脳スライス培養の生存率が、以下：顕微鏡下での視覚的検査；生体色素を使用しての染色；正常および傷害を受けた脳において存在する細胞型または部分に特異的な染料および免疫組織化学的試薬；神経フィラメント、グリア原線維酸性タンパク質、S100、微小管関連タンパク質、正常なタウまたはリン酸化されたタウ、およびシナプスタンパク質に対する抗体；代謝活性の生化学的評価；総タンパク質含量または特定のタンパク質含量の測定；細胞機能の評価；ならびに神経活性の評価、からなる群から選択される方法によって決定される、請求項１０に記載の方法。１５．前記器官型脳スライス培養の生存率が、可溶性βアミロイド前駆体タンパク質および神経伝達物質分泌からなる群から選択される細胞性分泌を測定することによって決定される、請求項１に記載の方法。１６．前記神経伝達物質の分泌が、電気刺激、イオン脱分極、および神経伝達物質基質の適用からなる群から選択される方法によって刺激され、そしてアセチルコリン、γ-アミノ酪酸（GABA）、グルタミン酸、カテコールアミン、ニューロペプチドからなる群から神経伝達物質の存在が決定される、請求項１０に記載の方法。１７．前記培養培地における分泌されたβアミロイド産生の量、前記器官型脳スライス培養における可溶性βアミロイド産生の量、および沈着したβアミロイドの量が、決定される、請求項１に記載の方法。１８．分泌されたβアミロイド産生が、免疫沈降、ELISA、ゲル電気泳動、およびウエスタンブロッティングからなる群から選択される方法によって決定され；可溶性βアミロイド産生が、免疫沈降、ELISA、ゲル電気泳動、RIA、およびウエスタンブロッティングからなる群から選択される方法によって決定され；そして沈着したβアミロイド産生が、生化学的決定法および視覚的検査および組織切片染色からなる群から選択される方法によって決定される、請求項１７に記載の方法。