ES2212277T3 - Procedimientos de identificacion de agentes reductores de la beta-amiloide. - Google Patents
Procedimientos de identificacion de agentes reductores de la beta-amiloide.Info
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Abstract
La presente invención proporciona procedimientos que pueden usarse para identificar compuestos reductores de la {be}-amiloide. La presente invención se basa en el uso de procedimientos de cultivo organotípico de cortes cerebrales para evaluar simultáneamente la toxicidad y actividad reductora de la {be}-amiloide de un compuesto de ensayo.
Description
Procedimientos de identificación de agentes
reductores de la \beta-amiloide.
La presente invención se relaciona con el campo
de los ensayos utilizados para identificar agentes para el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. La presente invención
proporciona específicamente métodos para uso en la selección de
agentes para uso en la reducción de la producción/secreción/depósito
de \beta-amiloide, principalmente en el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
La enfermedad de Alzheimer (Alzheimer) es una
enfermedad común degenerativa del cerebro relacionada con la edad.
La enfermedad se caracteriza por demencia progresiva junto con la
presencia de rasgos neuropatológicos característicos. La formación
de depósitos o placas de \beta-amiloide es una
característica distintiva y diagnóstica de la enfermedad de
Alzheimer (Khachaturian (1985), Arch. Neurol. 42:
1097-1105). Una cantidad significativa de evidencia
sugiere que el proceso de la formación y deposición de
\beta-amiloide está directamente ligado al
desarrollo de esta enfermedad. Por ejemplo, individuos con
mutaciones en el gen codificante de la proteína precursora de la
\beta-amiloide
("\beta-APP") desarrollan invariablemente la
enfermedad de Alzheimer (Goate y col. (1991), Nature 353:
844-846; Mullan y col. (1992), Nature Genet.
1: 345-347; Murrell y col. (1991), Science
254: 97-99; Van Broeckhoven (1995), Eur.
Neurol. 35: 8-19). El péptido
\beta-amiloide es una proteína de
39-43 aminoácidos (Glenner y col. (1984),
Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 885-890;
Masters y col. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:
4245-4249), que es capaz de formar agregados
laminares con plegamientos \beta. Estas fibrillas agregantes se
depositan a continuación en el parénquima cerebral o en la
vasculatura cerebral de la víctima de la enfermedad de
Alzheimer.
El péptido \beta-amiloide
deriva de una proteína de mayor tamaño que se extiende por la
membrana de Tipo I, \beta-APP, que tiene varios
transcriptos alternativamente ayustados (Kang y col. (1987),
Nature 325: 530-532; Ponte y col. (1988),
Nature 331: 525-527; Tanzi y col. (1988),
Nature 331: 528-530; Kitaguchi y col.
(1988), Nature 331: 530-532; de Savage y col.
(1989), Science 245: 651-653). Los
transcriptos diferencialmente ayustados dan lugar a
\beta-APP de 695, 714, 751 y 770 aminoácidos. La
función biológica de la \beta-APP no está bien
comprendida, aunque parece funcionar en el contacto de célula a
célula, en la supervivencia celular y en la proliferación celular
(Schubert y col. (1989), Neuron 3: 689-694;
Saitoh y col. (1989), Cell 58: 615-622; Chen
y col. (1991), Neurosci. Lett. 125: 223-251;
Mattson y col. (1993), Neuron 10:
243-254).
Se genera normalmente una forma segregada de
\beta-APP por escisión proteolítica (Weidemann y
col. (1989), Cell 57: 115-126). Esta escisión
proteolítica se produce en el dominio de la
\beta-amiloide que imposibilita la formación de
\beta-amiloide (Esch y col. (1990), Science
248: 1122-1124; Sisodia y col. (1990),
Science 248: 492-495). Como resultado de la
escisión, se libera la masa de la \beta-APP, se
libera la generalidad de la \beta-APP de la
célula y un fragmento carboxilo terminal de \sim8 kDa permanece
unido a la membrana celular. La(s) enzima(s)
responsable(s) de este procesamiento no amiloidogénico de la
\beta-APP es(son) denominada(s)
\gamma-secretasa.
La formación del péptido
\beta-amiloide es un proceso fisiológico normal.
Se ha visto que el péptido es producido de forma natural por
células cultivadas in vitro (Haas y col. (1992),
Nature 359: 322-325; Seubert y col. (1992),
Nature 359: 325-327; Shoji y col. (1992),
Science 258: 126-129) e in vivo
(Seubert y col. (1992), Nature 359: 325-327;
Vigo-Pelfrey y col. (1993), J. Neurochem.
61: 1965-1968; Tabaton y col. (1994), Biochem.
Biophys. Res. Commun. 200: 1598-1603; Teller y
col. (1996), Nature Med. 2: 93-95). El
péptido \beta-amiloide parece ser un subproducto
de degradación del catabolismo intracelular de la forma no
segregada de \beta-APP (Higaki y col. (1995),
Neuron 14: 651-659) y la inhibición de su
formación no tiene consecuencias deletéreas aparentes in
vitro. Se necesitan dos etapas de procesamiento proteolítico
para producir el péptido \beta-amiloide: una
produce el extremo amino del péptido mediado por una
enzima(s) no identificada(s) a la(s) que se
hace referencia como \beta-secretasa(s); la
segunda forma el extremo carboxilo del péptido, que se genera por
una enzima(s) no identificada(s) denominada(s)
\gamma-secretasa(s).
En US-A-5385915
se describe un método de regulación de la fosforilación de
proteínas implicadas en el control del procesamiento o de la función
de proteínas clave encontradas en las redes neurofibrilares
intracelulares y en las placas amiloides extracelulares asociadas a
la enfermedad de Alzheimer, que consiste en introducir una cantidad
efectiva de un modulador de kinasas o de un modulador de
fosfatasas, siendo capaz el modulador de aumentar o disminuir la
velocidad del procesamiento proteolítico o de modular la función de
dichas proteínas clave.
La atención entre la comunidad investigadora de
la enfermedad de Alzheimer se ha dirigido hacia la inhibición del
procesamiento de la \beta-APP a péptido
\beta-amiloide como aproximación al nuevo
desarrollo terapéutico para la enfermedad de Alzheimer. No se han
identificado ni purificado definitivamente las enzimas procesadoras
ni de la \beta- ni de la \gamma-secretasa. No
existe ningún ensayo que contenga enzimas formadoras de
\beta-APP pura y \beta-amiloide
pura. Las células cultivadas intactas proporcionan una fuente de
péptido \beta-amiloide. Se han desarrollado
estudios selectivos para compuestos que inhiben la producción de
\beta-amiloide en base a la medición de la
producción de \beta-amiloide por células en
cultivo tras la aplicación de un compuesto de ensayo. Se mide la
toxicidad del compuesto concomitantemente. Los compuestos de ensayo
que puntúan como inhibidores no tóxicos en dicho ensayo son
entonces estudiados en cuanto a actividad en animales. Sin embargo,
los estudios animales son laboriosos, caros y llevan tiempo.
Además, existen muchos obstáculos significativos para obtener
inhibición de la producción de \beta-amiloide en
un animal, los cuales están ausentes en el cultivo de células,
incluyendo el metabolismo y el aclaramiento del compuesto, el acceso
limitado al órgano diana (cerebro) impuesto por la barrera
hematoencefálica y la toxicidad celular selectiva. Así, los
resultados negativos en las pruebas animales son difíciles de
interpretar y tienen un uso limitado en informar del diseño
estructural de otros compuestos. Por estas razones, sería altamente
deseable obtener un sistema para estudiar compuestos en cuanto a
actividad inhibitoria de la \beta-amiloide y
toxicidad que se asemejara a la complejidad del órgano diana intacto
y que, no obstante, soslayara la dificultad técnica de la
realización e interpretación de los experimentos completos de
pruebas en animales.
Se han desarrollado métodos de cultivo de cortes
organotípicos para cerebro en donde se mantienen en cultivo
explantes o secciones de cerebro completo o, más comúnmente, de una
estructura cerebral anatómica discreta, tal como el hipocampo o el
cerebelo, durante períodos prolongados de tiempo (Seil (1979),
Review in Neuroscience 4: 105-177; Gahwiler
(1981), J. Neurosci. Meth. 4: 329-342;
Gahwiler (1984), Neuroscience 11: 751-760;
Gahwiler (1988), Trends Neurosci. 11:
484-490). Recientemente, se han desarrollado
perfeccionamientos significativos, de tal forma que se pueden
obtener resultados más reproducibles mediante un método
simplificado (Stoppini y col. (1991), J. Neurosci. Methods
37: 173-182). Una característica esencial de estos
cultivos es la chocante conservación de la arquitectura tisular
organotípica: la anatomía celular guarda un estrecho parecido con
la del cerebro intacto, hasta el punto de que las entradas
sinápticas y la función imitan a las de la situación normal, y el
desarrollo continúa en cortes de cerebros de neonatos. Típicamente,
estas preparaciones son usadas para estudios electrofisiológicos
que investigan fenómenos cerebrales tales como la base bioquímica
del aprendizaje, que requieren interacciones complejas de células
disponibles sólo en el animal intacto o en cultivos de cortes
organotípicos. Sólo se conocen en la técnica dos ejemplos de uso de
cultivos de cortes cerebrales organotípicos en la investigación de
la enfermedad de Alzheimer. London y col. ((1996), Proc. Natl.
Acad. Sci. 93: 4147-4153) investigaron las
interacciones de diferentes tipos de células cerebrales aplicando
monocitos pretratados con amiloide sintética a cultivos de cortes
cerebrales organotípicos, midiendo la supervivencia cerebral.
Nitsch, Wurtzman y colaboradores examinaron los efectos de la
estimulación neural con electrodos y neurotransmisores sobre los
circuitos cerebrales (Diekman y col. (1994), J. Neural Transm.
Suppl. 44: 61-71) y la secreción de la proteína
precursora de la amiloide (Nitsch y col. (1994), J. Neural
Transm. Suppl. 44: 21-27); Farber y col. (1995),
J. Neurosci. 15: 7442-7451).
El método de cultivo de cortes organotípicos no
ha sido combinado con ensayos para la
\beta-amiloide y la viabilidad celular para
examinar la producción de amiloide y/o el efecto los compuestos de
ensayo sobre su producción. La presente invención se basa, en parte,
en la combinación de métodos de cultivo de cortes organotípicos con
métodos de ensayo de la \beta-amiloide. Los
métodos resultantes de la presente invención proporcionan un método
rápido y eficiente para identificar compuestos que pueden ser
usados para tratar el Alzheimer.
La técnica anterior para el estudio de compuestos
en cuanto a inhibición de la producción de
\beta-amiloide se basaba en el estudio de la
actividad en animales enteros, células primarias o líneas celulares
en cultivo, homogeneizados de células rotas o de células o tejidos
o preparaciones enzimáticas puras. A excepción del animal entero,
ninguno de estos métodos imita la complejidad de los tipos
celulares y las interacciones encontradas en el cerebro. Se sabe
que las interacciones celulares afectan a la producción y secreción
de la proteína precursora de la \beta-amiloide y
de la \beta-amiloide y se puede esperar que
afecten a la disponibilidad, al metabolismo y a la tolerancia del
compuesto en el cerebro. El cultivo de cortes de cerebro
organotípicos ofrece todo la variedad de tipos celulares presentes
en el cerebro, con una notable conservación de la organización y de
las interacciones celulares. Así, los efectos de los compuestos de
ensayo sobre la producción de \beta-amiloide y la
viabilidad y función celular predicen mejor los efectos in
vivo que estas medidas tomadas en sistemas menos complejos de
células simples. Se pueden eliminar antes de pasar a las pruebas
animales los compuestos candidatos que tengan efectos tóxicos o que
carezcan de eficacia, lo cual es evidente en preparaciones
organotípicas, pero no es evidente en sistemas de cultivo
celular.
Los experimentos en animales enteros son
laboriosos, caros y su realización lleva tiempo. Además, se deben
sintetizar cantidades relativamente grandes de compuesto de ensayo
para dosificar a los animales. Por ejemplo, con los protocolos de
ensayo actuales en animales, se requiere generalmente un mínimo de
7 animales/punto de datos debido a la variación entre animales y a
la alta sensibilidad necesaria de los ensayos. Cada determinación
en cultivo organotípico requiere una fracción del número de
animales como determinación similar in vivo: aproximadamente
3 cortes (se obtienen 20/ratón ó 30/rata) por punto de datos frente
a 7 animales/punto de datos, para una reducción de 70 veces en el
número de animales requeridos. Los estudios de
dosis-respuesta y de curso temporal realizados en
experimentos con cortes organotípicos facilitan la disponibilidad
de mejores elecciones iniciales para los regímenes de dosificación
in vivo, reduciendo el número de experimentos in vivo
con requerimiento de ajuste de los regímenes de dosificación.
Otro inconveniente importante de los experimentos
en animales enteros es el número de variables que no pueden ser
controladas y que son difíciles de valorar. Por ejemplo, si un
compuesto no tiene efecto, puede ser debido a un rápido
aclaramiento de la sangre, a un rápido metabolismo, a secuestro por
un tejido no-diana o incapacidad para penetrar en
la barrera hematoencefálica. La dosificación puede estar limitada
por la toxicidad para un órgano no-diana sensible.
La determinación de la contribución de estos factores a un resultado
negativo es una tarea importante. Por lo tanto, los resultados
negativos no tienen uso en la generación de las relaciones
estructura-actividad como guía para la generación
de estructuras de compuestos mejoradas. El cultivo de cortes
organotípicos elimina o minimiza estas variables, ya que no están
presentes ni la barrera hematoencefálica ni otros tejidos. El
metabolismo del compuesto es fácilmente valorado tomando muestras
del medio. La dosis en el órgano diana es fácilmente
controlada.
La presente invención proporciona métodos que
pueden ser usados para identificar compuestos reductores de la
\beta-amiloide. La presente invención se basa en
el uso de métodos de cultivo de cortes de cerebro organotípicos para
valorar simultáneamente la toxicidad y la actividad reductora de la
\beta-amiloide de un compuesto de ensayo.
En consecuencia, la invención proporciona un
método para identificar agentes reductores de la
\beta-amiloide, consistente en las siguientes
etapas:
- a)
- preparar un cultivo de cortes de cerebro organotípicos;
- b)
- valorar la viabilidad de las células en dicho cultivo de cortes de cerebro organotípicos;
- c)
- aplicar un compuesto de ensayo a dicho cultivo de cortes de cerebro organotípicos;
- d)
- valorar la viabilidad y la producción de \beta-amiloide de (i) la etapa de cultivo de cortes de cerebro organotípicos tratados de (c) y (ii) un cultivo de cortes de cerebro organotípicos no tratados, y
- e)
- identificar un compuesto que reduzca la producción de \beta-amiloide, pero que no disminuya la viabilidad celular o altere otras funciones celulares,
donde el cultivo de cortes de cerebro
organotípicos de (a) y el cultivo de cortes de cerebro
organotípicos no tratados de (d) no proceden de un feto
humano.
Figura 1. Caracterización inmunohistoquímica de
cultivos de cortes organotípicos de hipocampo.
Figura 2. Secreción de
\beta-amiloide 1-40 por cultivos
de cortes organotípicos de hipocampo.
Figura 3. Secreción de
\beta-amiloide 1-40 por cultivos
de cortes organotípicos de hipocampo preparados a partir de ratones
transgénicos para \beta-APP751.
Figura 4. Valoración del compuesto de ensayo MDL
28170 con respecto a la viabilidad y la secreción de
\beta-amiloide de cultivos de cortes
organotípicos.
Tal como se usa aquí, "péptido o proteína
\beta-amiloide" se refiere a cualquiera de las
especies de proteínas \beta-amiloides. Dichas
proteínas tienen típicamente \sim4 kDa. Se han observado varias
secuencias diferentes de extremos amino y de extremos carboxilo
heterogéneos en base a la caracterización del péptido proteína
\beta-amiloide de tejido procedente de la
enfermedad de Alzheimer y de células cultivadas (Glenner y Wong
(1984), Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:
885-890; Joachim y col. (1988), Brain Res.
474: 100-111; Prelli y col. (1988), J.
Neurochem. 51: 648-651; Mori y col. (1992),
J. Biol. Chem. 267: 17082-17806; Seubert y
col. (1992), Nature 359: 325-327; Naslund y
col. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
8378-8382; Roher y col. (1993), Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90: 10836-10840; Busciglio y col.
(1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
2092-2906; Haass y col. (1992), Nature 359:
322-325). Concretamente, con respecto a los extremos
carboxilo, se ha visto que el péptido
\beta-amiloide acaba en la posición 39, 40, 41,
42, 43 ó 44, donde la posición 1 es el aspartato de la secuencia de
la \beta-amiloide, según definen Glenner y Wong
(1984), Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:
885-890.
El término "proteína precursora de la
\beta-amiloide" o
"\beta-APP" se refiere a cualquiera de las
isoformas diferencialmente ayustadas de esta proteína, incluyendo,
aunque sin limitación, las isoformas de 695, 714, 751 y 770
aminoácidos (Kang y col. (1987), Nature 325:
530-532; Ponte y col. (1988), Nature 331:
525-527; Tanzi y col. (1988), Nature 331:
528-530; Kitaguchi y col. (1988), Nature
331: 530-532; de Savage y col. (1989),
Science 245: 651-653). El término
\beta-APP también incluye mutantes humanos
naturales de la \beta-APP (Goate y col. (1991),
Nature 353: 844-846; Mullan y col. (1992),
Nature Genet. 1: 345-347; Murrell y col.
(1991), Science 254: 97-99; Van Broeckhoven
(1995), Eur. Neurol. 35: 8-19);
\beta-APP de tipo salvaje,
\beta-APP mutante producida por células
cultivadas usando metodología de ADN recombinante y derivados
naturales o artificiales de la \beta-APP que son
capaces de generar \beta-amiloide.
Tal como se emplea aquí, el término "cultivo de
cortes de cerebro organotípicos" se refiere a secciones o
explantes de tejido cerebral que son mantenidos en cultivo (Seil
(1979), Review in Neuroscience 4: 105-177;
Gahwiler (1981), J. Neurosci. Meth. 4:
329-342; Gahwiler (1984), Neuroscience 11:
751-760; Gahwiler (1988), Trends Neurosci.
11: 484-490; Stoppini y col. (1991), J.
Neurosci. Methods 37: 173-182). Un experto en la
técnica puede fácilmente emplear métodos de cultivo de cortes de
cerebro organotípicos conocidos en este campo para uso en la
presente invención.
El cultivo de cortes de cerebro organotípicos
puede emplear secciones de tejido cerebral entero o explantes
obtenidos de regiones específicas del cerebro. Se puede usar
cualquier región para generar un cultivo de cortes de cerebro
organotípicos. Sin embargo, la fuente preferida del cultivo de
cortes de cerebro organotípicos son los explantes de regiones
específicas del cerebro, preferiblemente del hipocampo o de la
región del córtex.
Se puede usar cualquier mamífero que no sea un
feto humano como fuente de tejido para el explante que se utiliza
para generar el cultivo de cortes de cerebro organotípicos usado en
el presente método, en la medida en que el animal pueda servir como
fuente de tejido y el cultivo de cortes organotípicos pueda
establecerse y mantenerse durante un período suficiente para llevar
a cabo los presentes métodos. Dichos mamíferos incluyen, aunque sin
limitación, ratas, ratones, cobayas, monos y conejos.
El mamífero usado como fuente de tejido puede ser
un mamífero de tipo salvaje o puede ser un mamífero que haya sido
alterado genéticamente para contener y expresar un gen introducido.
Preferiblemente, el animal será un animal transgénico, que ha sido
alterado para expresar la producción neural de la proteína
precursora de la \beta-amiloide (Quon y col.
(1991), Nature 35: 598-607; Higgins y col.
(1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:
4402-4406). Más preferiblemente, el animal será
alterado para expresar una proteína precursora de la
\beta-amiloide que deriva o se basa en secuencias
de \beta-amiloide humana.
El mamífero usado como fuente de tejido puede ser
de cualquier edad. Preferiblemente, la fuente de tejido de mamífero
será un mamífero neonato no humano.
Para obtener tejidos para cultivo de animales
vivos, preferiblemente se sacrifica al animal rápidamente y se le
decapita, realizando esto generalmente de manera simultánea. Se
extrae rápidamente el cerebro a un medio de disección tamponado a
pH fisiológico. Un ejemplo de dicho medio es un medio esencial
mínimo (MEM) tamponado con Tris 10 mM, pH 7,2, y suplementado con
antibiótico.
Se aisla entonces el cerebro o la región cerebral
deseada bajo un microscopio de disección en condiciones asépticas.
Se puede usar tejido del cerebro entero para establecer un cultivo
de cortes de cerebro organotípicos. Alternativamente, se puede usar
un área o región específica del cerebro como fuente de explante. Las
regiones preferidas para la fuente del cultivo de cortes de cerebro
organotípicos para valorar la producción de
\beta-amiloide son el hipocampo y el córtex.
Se separan las pequeñas regiones próximas del
tejido como cortes o explantes, de tal forma que la razón
superficie a volumen permita el intercambio entre el centro del
tejido y el medio. Se puede emplear una variedad de procedimientos
para seccionar o dividir los tejidos cerebrales. Por ejemplo, se
pueden emplear dispositivos de seccionamiento. El tamaño/grosor de
la sección de tejido se basarán primariamente en la fuente de
tejido y el método usado para el seccionamiento/la división. Por
ejemplo, los segmentos preferidos tienen de aproximadamente 400 a
aproximadamente 500 \mum de diámetro y se hacen usando un
troceador de tejidos, una cuchilla de afeitar u otra cuchilla de
seccionamiento/microtomo apropiada.
Después del seccionamiento, se separan las
secciones y se elimina el tejido dañado. Las secciones de tejido
cerebral son preferiblemente manipuladas en gotas de medio de
disección y se colocan sobre insertos de placas de cultivo en medio
de cultivo. Se retira el exceso de medio, por ejemplo usando un
tisú, y se pone el cultivo en una incubadora.
La elección del medio de cultivo y de las
condiciones de cultivo depende del uso pretendido, de la fuente de
tejido y del período de tiempo antes de usar la sección en el
presente método. Como ejemplos de medios de cultivo se incluyen,
aunque sin limitación, 25% de suero de caballo, 50% de medio
esencial mínimo y 25% de medio de Hank, suplementado con
antibiótico y L-glutamina. Como ejemplos de
condiciones de cultivo se incluyen, aunque sin limitación, 37ºC, 5%
CO_{2}.
Se pueden mantener los cultivos durante hasta
varios meses bajo las mejores condiciones. Sin embargo, los
cultivos de cortes de cerebro organotípicos son preferiblemente
usados después de haberse estabilizado después del traumatismo de
transferencia al cultivo, pero antes de la aparición del declive. En
general, es preferible usar los cultivos de cortes de
aproximadamente 1 semana a aproximadamente 4 semanas después de
haber sido generados.
Después de obtener el cultivo de cortes de
cerebro organotípicos, se estudia su viabilidad antes de la
aplicación de un compuesto de ensayo. Se valora típicamente la
viabilidad/integridad del cultivo de cortes organotípicos a la
iniciación de cada experimento para demostrar la salud de la
preparación, así como para disponer de una medida de la cantidad de
tejido viable presente en el cultivo pretratado.
Se puede usar cualquier método conocido en la
técnica para determinar la viabilidad. Por ejemplo, dichos métodos
incluyen, aunque sin limitación: inspección visual al microscopio;
tinción de cultivos hermanos con colorantes vitales, tales como
azul tripán; tinciones y reactivos inmunohistoquímicos específicos
para tipos celulares o restos presentes en cerebro normal y
lesionado, tales como tinciones de plata y antibióticos para
neurofilamentos, proteína ácida fibrilar glial, S100, proteína
asociada a microtúbulos, tau normal o fosforilada y proteínas
sinápticas; valoración bioquímica de la actividad metabólica, tal
como con un ensayo MTT o de fugas celulares, tal como mediante un
ensayo de lactato deshidrogenasa ("LDH"); medición del
contenido proteico total o específico; o valoración de la función
celular, tal como la actividad sináptica. Preferiblemente, se
determina la actividad neural midiendo secreciones tales como la
secreción de proteína precursora de la
\beta-amiloide soluble en condiciones basales o la
secreción de neurotransmisores tras estimulación. Se puede
conseguir la estimulación por estimulación eléctrica,
depolarización iónica (típicamente con potasio elevado) o
aplicación de substancia neurotransmisora. Las substancias
segregadas típicamente medidas son los neurotransmisores presentes
en las neuronas, tales como acetilcolina, ácido
\gamma-aminobutírico ("GABA"), glutamato,
catecolaminas y neuropéptidos. Un experto en la técnica puede
adaptar fácilmente cualquiera de los métodos de ensayo de
viabilidad actualmente conocidos para uso en la presente
invención.
Al comienzo del experimento, se transfiere
típicamente un cultivo de cortes organotípicos a una placa de
cultivo con medio. El medio de cultivo puede ser un compuesto de
ensayo presente antes de la introducción de la sección de tejido, o
se puede añadir un compuesto de ensayo al medio después de haber
puesto la sección de tejido en la placa de cultivo. En general, se
disolverá primeramente una substancia de ensayo en un vehículo
apropiado, tal como, aunque sin limitación, DMSO, agua, suero
fisiológico o medio, para preparar una solución madre, y se diluirá
después en el medio. En general, se incluirá una prueba de control
de vehículo al emplear la presente invención.
Preferiblemente, se estudia una gama de dosis. La
gama estudiada inicialmente puede ser decidida por el conocimiento
previo de los efectos de la substancia o de substancias
estrechamente relacionadas sobre enzimas purificadas, por la
producción de \beta-amiloide por las células en
cultivo o por la toxicidad en otros sistemas de ensayo. En ausencia
de dicho conocimiento, la gama de dosis es preferiblemente de
aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 \muM. Un experto en la
técnica puede desarrollar fácilmente una gama de pruebas para
cualquier compuesto o serie de compuestos en particular.
El compuesto es típicamente aplicado a la sección
de tejido durante aproximadamente 4 horas a aproximadamente 21
días, preferiblemente durante aproximadamente 1 día a
aproximadamente 7 días. En el caso de una aplicación a largo plazo,
se puede aplicar medio fresco que contenga compuesto
periódicamente, más frecuentemente si se sospecha una pérdida rápida
del compuesto debido a conversión química o a metabolismo.
Los compuestos estudiados en el método anterior
pueden ser seleccionados aleatoriamente o seleccionados o diseñados
de un modo racional. Tal como se usa aquí, se dice que un compuesto
es seleccionado aleatoriamente cuando el compuesto es seleccionado
aleatoriamente sin considerar la estructura de otros compuestos
activos identificados. Un ejemplo de compuestos seleccionados
aleatoriamente es el uso de una librería química, una librería
combinatoria de péptidos, un caldo de crecimiento de un organismo o
un extracto de planta.
Tal como se usa aquí, se dice que un compuesto es
seleccionado o diseñado racionalmente cuando se elige el compuesto
sobre una base no aleatoria. La selección racional puede estar
basada en el blanco de acción o la estructura de compuestos activos
previamente identificados. Concretamente, se pueden seleccionar
racionalmente o diseñar racionalmente compuestos utilizando la
estructura de compuestos que estén siendo investigados actualmente
para uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Los compuestos de la presente invención pueden
ser, por ejemplo, péptidos, pequeñas moléculas y derivados de
vitaminas, así como carbohidratos. Un experto en la técnica puede
reconocer fácilmente que no hay límite en cuanto a la naturaleza
estructural de los compuestos de la presente invención.
Al concluir el período de ensayo, se determina el
período de tiempo en el que el compuesto de ensayo contacta con el
cultivo del corte, la viabilidad de las células en el cultivo del
corte y el nivel/grado de producción de amiloide por los cultivos
tratado y control. Se puede emplear una variedad de métodos
conocidos en la técnica para determinar la cantidad de
\beta-amiloide presente. Dichos métodos incluyen,
aunque sin limitación: la determinación de la cantidad de secreción
de \beta-amiloide al medio de cultivo usando
inmunoprecipitación (Zhong y col. (1994), J. Biol. Chem. 16:
12179-12184; Higaki y col. (1995), Neuron
14: 651-659), radioinmunoensayo (Naidu y col.
(1995), J. Biol. Chem. 270: 1369-1374),
inmunoensayo ligado a enzimas (Vigo-Pelfrey y col.
(1993), J. Neurochem. 61: 1965-1968; Suzuki y
col. (1994), Science 264: 1336-1340;
Asami-Odaka y col. (1995), Biochemistry 34:
10272-10278), electroforesis en gel y técnicas de
Western blotting usando medios concentrados o netos acondicionados
por los cortes de cerebro organotípicos tratados y controles. Se
puede medir la \beta-amiloide soluble en el
tejido del corte preparando un homogeneizado de tejido y empleando
inmunoprecipitación, radioinmunoensayo, inmunoensayo ligado a
enzimas, electroforesis en gel o técnicas de Western blotting para
detectar amiloide. Se puede valorar la
\beta-amiloide depositada bioquímicamente o
contando los depósitos y placas de amiloide. Se puede valorar
bioquímicamente el material insoluble obtenido de pellas de
centrifugación de homogeneizados de cerebro como se acaba de
describir para los homogeneizados de cerebro. La placa y los
depósitos de \beta-amiloide pueden ser
visualizados por medio de tinciones histoquímicas estándar, tales
como plata, tioflavina S y rojo Congo, por inmunohistoquímica
usando anticuerpos
anti-\beta-amiloide (Higgins y
col. (1994), Ann. Neurol. 35: 598-607;
Higgins y col. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:
4402-4406) o depositando
[^{125}I]-\beta-amiloide sobre
depósitos preexistentes en el corte, seguido de autorradiografía
(Maggio y col. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
5462-5466). Está dentro de los conocimientos de la
técnica adaptar los métodos de detección de
\beta-amiloide para uso en la presente
invención.
En la práctica de la presente invención, se puede
determinar la secreción de \beta-amiloide por el
tejido cerebral, el depósito de \beta-amiloide en
el tejido cerebral y la \beta-amiloide presente en
el tejido cerebral independientemente en experimentos/tratamientos
por separado, o, alternativamente, se pueden determinar dos o más
de las clases de \beta-amiloide a partir de una
sola muestra de ensayo. En general, es preferible detectar la
secreción de \beta-amiloide por el tejido
cerebral, el depósito de \beta-amiloide en el
tejido cerebral y la \beta-amiloide presente en
el tejido cerebral para cada compuesto de ensayo.
Además de medir la producción de
\beta-amiloide, se prefiere hacer una medición de
la cantidad de tejido viable en los cortes productor de la amiloide.
Esta medición es utilizada para normalizar los valores para la
\beta-amiloide en el medio y como medio para
determinar la toxicidad de un agente de ensayo. En general, el
ensayo de viabilidad es el empleado al inicio del experimento.
Preferiblemente, se usa un ensayo que no dañe el corte tanto al
inicio como al término del período de ensayo. Dicho uso proporciona
la mayor precisión y permite una valoración eficiente de la
toxicidad del compuesto. Si ello no es posible, se usa un ensayo de
supervivencia al inicio del experimento o se lleva a cabo un ensayo
que destruya los cortes sobre un cultivo hermano.
Los agentes usados en el presente método serán
clasificados por el grado en que reducen la producción de
\beta-amiloide y el grado de toxicidad que
exhiben. Los compuestos más preferidos identificados usando el
presente método serán no tóxicos, no mostrando reducción en la
viabilidad entre cultivos tratados y no tratados. Sin embargo,
pueden ser tolerables bajos niveles de toxicidad para determinados
usos (por ejemplo, en el estudio y diseño iniciales del compuesto).
Los compuestos preferidos reducirán la
secreción/deposición/producción de \beta-amiloide
en más de un 50%. Más preferiblemente, la
secreción/deposición/producción de \beta-amiloide
se reducirá en más de un 80%, eliminándose más preferiblemente toda
la secreción/deposición/producción de
\beta-amiloide.
Estos ejemplos pretenden ilustrar, pero no
limitar, la invención.
Se decapitaron rápidamente cachorros neonatos de
rata de ocho días de edad con tijeras de un borde serrado en una
campana de ventilación aséptica. Se extrajo rápidamente el cerebro
a medio de disección tamponado que contenía 100 ml de MEM, 1 ml de
penicilina/estreptomicina, 1 ml de stock de Tris 100x (10 mM final,
pH 7,2), se filtró en condiciones estériles y se enfrió. Se aislaron
los hipocampos bajo un microscopio de disección y se transportaron
en medio de disección a una campana de ventilación estéril. Se
colocó el tejido en la pletina de un troceador de tejidos
Mac-Illwain con un pincel estéril y se hicieron
secciones de 400 \mum. Se obtuvieron aproximadamente 30 secciones
por animal. Se separaron las secciones por agitación vigorosa de la
placa de Petri que contenía las secciones en medio de cultivo que
contenía un 25% de suero de caballo, un 25% de medio de Hank, un
50% de medio esencial mínimo, 1 ml de penicilina/estreptomicina y
0,5 ml de L-glutamina. Se inspeccionaron las
secciones con un microscopio de disección y se retiró el tejido
dañado. Se manipularon las secciones seleccionadas en gotas de
medio de disección con pipetas Pasteur, que habían sido marcadas y
rotas y luego pulidas al fuego para producir orificios de un
diámetro apropiado, y las puso en insertos de placa de cultivo
Millipore ajustados en placas de 35 mm que contenían 1 ml de medio
de cultivo o en placas de 6 pocillos que contenían 1,2 ml de medio
de cultivo. Las placas que contenían insertos y medio habían sido
preequilibradas a 37ºC y con un 5% de CO_{2}. Se pusieron de tres
a seis cortes en cada inserto. Se retiró el exceso de medio del
corte y se puso el cultivo en una incubadora a 37ºC y con un 5% de
CO_{2}. Se mantuvieron los cultivos durante hasta 3 meses. Se
cambió el medio a las 24 horas y a intervalos de
3-4 días a continuación. Se guardaron para el
ensayo los medios acondicionados por el cultivo de cortes
organotípicos de hipocampo.
Se inspeccionaron los cultivos de cortes de
cerebro organotípicos diariamente durante la primera semana en
cultivo y cada varios días a continuación. Durante la primera
semana, los cultivos de cortes de cerebro organotípicos se aplanaron
y extendieron, aunque se mantenía la arquitectura del tejido. Se
observaron los conos de crecimiento que emergían del borde de los
cortes y las células de la glía aparecieron en el borde del corte
durante la primera semana. Los conos de crecimiento se retrajeron a
continuación. Las células de la glía permanecían en el borde de los
cortes, pero no crecían sobre el cuerpo del corte. Se valoraron la
organización y la composición celular en cortes que habían sido
mantenidos en cultivo a intervalos de una semana de 1 a 8 semanas
para confirmar que la morfología, la composición y la organización
celulares se parecían a las del hipocampo intacto.
Se realizó la inmunohistoquímica usando
sinaptofisina, proteína asociada al crecimiento 43
(GAP-43), proteína asociada a microtúbulos 2
(MAP-2) y anticuerpos para los neurofilamentos 200
para visualizar las neuronas y anticuerpos para
S-100 y para la proteína fibrilar ácida glial
("GFAP") para visualizar las células de la glía, según el
siguiente protocolo:
Se manipularon cultivos de cortes organotípicos
sobre el inserto de cultivo. Se movió el inserto usando pinzas
entre placas de cultivo que contenían el tratamiento apropiado. Se
eliminó primeramente el medio del cultivo con varios lavados de
solución salina tamponada con fosfatos PBS: (NaCl 100 mM, NaPO_{4}
10 mM, pH 7,4). Se fijó el tejido por incubación durante 2 horas a
temperatura ambiente con paraformaldehído al 4% en PBS recién
preparado. Se eliminó la fijación con 2 lavados de 2 minutos en
PBS. Se inactivó la actividad peroxidasa endógena por incubación
durante 30 minutos a temperatura ambiente con peróxido de hidrógeno
al 0,3% y se lavó durante 10 minutos en PBS y 10 minutos en PBS con
un 0,2% de gelatina. A continuación, se bloquearon en PBS/10% de
suero de cabra/0,1% de Nonident P-40 durante una
hora y se hicieron 2 lavados de 10 minutos en PBS. Se aplicó
anticuerpo primario a la dilución indicada preparada en PBS que
contenía un 0,2% de gelatina y se incubó durante la noche en una
cámara humidificada. Después de 3 lavados de 3 minutos en
PBS/gelatina, se incubaron los cultivos con un 2º anticuerpo
(anti-ratón o anti-conejo, según
fuera apropiado, provisto en el kit de inmunohistoquímica Vectastain
Elite) en PBS/gelatina a 37ºC durante 30 minutos. Se preparó el
reactivo ABC de Vectastain Elite según las instrucciones del
fabricante. Después de 3 lavados de 3 minutos con PBS/0,2% de
gelatina, se incubaron los cultivos a 37ºC durante 30 minutos con
el reactivo ABC. Se visualizó la inmunorreactividad revelando con un
kit de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) de Vector Labs
preparado según las indicaciones y se lavó con agua. Se consiguió
la deshidratación mediante incubaciones de 2 minutos en etanol al
35%, 50%, 70%, 90% y 2 x 100%. Se contratiñeron los cultivos
durante 2-4 minutos con hematoxilina y se lavaron
con agua hasta quedar claros. Se destiñó a continuación el propio
inserto con ácido clorhídrico al 0,5% en etanol al 70% durante 30
seg y se hicieron lavados con agua del grifo. Después de secar al
aire, se cortaron los cortes individuales del inserto y se montaron
en pletinas de microscopio usando montaje en gel, se cubrieron con
cubreobjetos y se sellaron con barniz de uñas. En la Figura 1 se
dan fotomicrografías representativas.
Se realizaron tinciones con violeta de cresilo,
hematoxilina y azul de toluidina fijando los cultivos en
paraformaldehído como se ha descrito antes. Se aplicó hematoxilina
(Sigma) durante 2-4 minutos, después de lo cual se
lavaron los cultivos con agua y se aclararon en etanol como se ha
descrito antes. Se prepararon el violeta de cresilo y el azul de
toluidina como solución de tinte stock al 0,1% en agua destilada.
Se preparó la solución de tinción al 20% en tampón acetato 0,2 M,
pH 4,45: 3 partes de ácido acético 0,2 M, 2 partes de acetato de
sodio 0,2 M y 5 partes de agua. El tiempo de tinción era de 20
minutos para ambos colorantes. Se lavaron los cultivos con agua, se
deshidrataron en etanol, se secaron y se montaron como se ha
descrito antes.
Se examinó la secreción de
\beta-amiloide 1-40 al medio
recogiendo el medio acondicionado durante las 24 primeras horas de
cultivo, durante el día 1 al 4 de cultivo y durante el día 16 al 20
de cultivo. Se estudiaron alícuotas del medio acondicionado usando
un ELISA en emparedado para medir la
\beta-amiloide 1-40 de una de dos
formas. En primer lugar, se estudiaron alícuotas de 100 \mul por
duplicado directamente en el ELISA. En segundo lugar, se
concentraron pooles de 3 ml de medio de 3 pocillos de cultivo
independientes y se separaron simultáneamente de algunos otros
componentes por aplicación de columnas C18 Sep-Pak
y elución en acetonitrilo. Se recogió la fracción de elución del
50%, que previamente había mostrado contener amiloide, se secó, se
resuspendió en un pequeño volumen de tampón y se estudió en el
ELISA. Los resultados de los dos ensayos guardaban una estrecha
concordancia y demostraron con facilidad niveles mensurables de
\beta-amiloide 1-40 en el medio
acondicionado, incluso en ausencia de una etapa de concentración
(véase la Figura 2).
Se seleccionaron dos compuestos de ensayo que
habían dado positivo para la actividad reductora de la
\beta-amiloide en ensayos de cultivo celular y que
habían resultado no tóxicos en las mismas células. Estos compuestos
habían sido estudiados en cobayas y resultaron ser altamente
tóxicos para el tejido cerebral. Se usó el presente ejemplo para
mostrar que un ensayo de cortes predice mejor la actividad in
vivo que el ensayo de cultivo celular.
Se disolvieron los compuestos de ensayo en DMSO
para producir soluciones stock 100x. Se diluyeron los stocks en
medio de cultivo para dar concentraciones finales de 0,1 \muM y
100 \muM de compuesto. Se preequilibró el medio en placas a 37ºC
y un 5% de CO_{2}. Se transfirieron insertos de cultivo que
llevaban 3 cortes de cerebro organotípicos de rata obtenidos de
ratas de 8 días de edad y mantenidos en cultivo durante 2 semanas
al medio que contenía solución de ensayo. Se recogió el medio y se
proporcionó medio fresco que contenía solución de ensayo a
intervalos de 24 horas durante 10 días. Se observaron los cultivos
de cortes de cerebro organotípicos diariamente. La inspección visual
reveló una pérdida de integridad de tejido evidenciada por manchas
obscurecidas en el centro del corte, por pérdida de la organización
de la capa celular y finalmente por pérdida de tejido en el borde
del corte.
Se valoró la toxicidad visualmente bajo el
microscopio de disección y el de luz invertida. Al concluir el
experimento, se procesaron los cultivos en cuanto a la
inmunorreactividad de anticuerpos
anti-sinaptofisina. Ambos compuestos de ensayo
puntuaron como no tóxicos en el rango de concentraciones estudiado
en este experimento en un ensayo basado en células usando un ensayo
de la función mitocondrial (ensayo MTT) para medir la viabilidad.
El estudio in vivo del primer compuesto mostró toxicidad
significativa, según se determinó por histoquímica de secciones de
cerebro de cobayas tratados. La inspección visual de cultivos de
cortes organotípicos tratados reveló una evidente toxicidad hacia
los 5-6 días de tratamiento y un aspecto gravemente
necrótico al concluir el 10º día del experimento. La
inmunohistoquímica confirmó esta valoración. Así, el ensayo de
cortes organotípicos daba una mejor predicción de los resultados
in vivo que el ensayo basado en células. El segundo
compuesto también puntuó como no tóxico en el ensayo basado en
células y tenía un efecto tóxico ligeramente menos severo, pero
todavía marcado, sobre los cultivos de cortes organotípicos. Como
se predijo por los resultados del ensayo del cultivo de cortes
organotípicos, este compuesto era menos tóxico que el primero,
aunque se observó una clara toxicidad.
Se manipularon los cultivos de cortes
organotípicos en el inserto de cultivo durante los procedimientos
de tinción usando pinzas para mover el inserto entre placas de
cultivo que contenían el tratamiento apropiado. Primeramente, se
retiró el medio del cultivo con varios lavados de solución salina
tamponada con fosfatos, PBS (NaCl 100 mM, NaPO_{4} 10 mM, pH
7,4). Se fijó el tejido por incubación durante 2 horas a
temperatura ambiente con paraformaldehído al 4% en PBS recién
preparado. Se eliminó la fijación con 2 lavados de 2 minutos en
PBS. Se detuvo la actividad peroxidasa endógena por incubación
durante 30 minutos a temperatura ambiente con peróxido de hidrógeno
al 0,3% y se lavó durante 10 minutos en PBS y 10 minutos en PBS con
un 0,2% de gelatina. A continuación, se bloquearon en PBS/10% de
suero de cabra/0,1% de Nonident P-40 durante una
hora y se lavaron 2 veces durante 10 minutos en PBS. Se aplicó
anticuerpo primario a la dilución indicada preparada en PBS que
contenía un 0,2% de gelatina y se incubó durante la noche en una
cámara humidificada. Después de 3 lavados de 3 minutos en
PBS/gelatina, se incubaron los cultivos con un 2º anticuerpo
(anti-ratón o anti-conejo, según sea
apropiado, proporcionado con el kit de inmunohistoquímica
Vectastain Elite) en PBS/gelatina a 37ºC durante 30 minutos. Se
preparó el reactivo ABC de Vectastain Elite según las instrucciones
del fabricante. Después de 3 lavados de 3 minutos con PBS/0,2% de
gelatina, se incubaron los cultivos a 37ºC durante 30 minutos con
el reactivo ABC. Se visualizó la inmunorreactividad revelando con
un kit de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) de Vector Labs
preparado según las indicaciones y se lavó con agua. Se consiguió la
deshidratación mediante incubaciones de 2 minutos en etanol al 35%,
50%, 70%, 90% y 2 x 100%. Se contratiñeron los cultivos durante
2-4 minutos con hematoxilina y se lavaron con agua
hasta quedar claros. Se destiñó a continuación el propio inserto
con ácido clorhídrico al 0,5% en etanol al 70% durante 30 seg y se
hicieron lavados con agua del grifo. Después de secar al aire, se
cortaron los cortes individuales del inserto y se montaron en
pletinas de microscopio usando montaje en gel, se cubrieron con
cubreobjetos y se sellaron con barniz de uñas. El panel superior
muestra una fotomicrografía representativa de un corte organotípico
de hipocampo preparado a partir de rata, mantenido en cultivo
durante 9 semanas y teñido usando un anticuerpo monoclonal
antisinaptofisina. Se muestra un campo CA-1 a 20x.
El panel inferior de la izquierda es una fotomicrografía
representativa de una preparación organotípica de hipocampo
preparada a partir de rata, mantenida en cultivo durante 4,5
semanas y teñida usando un anticuerpo monoclonal antineurofilamentos
200 y fotografiada a 20x. El panel inferior de la derecha es una
fotomicrografía representativa de un corte organotípico de
hipocampo preparado a partir de rata, mantenido en cultivo durante
10 semanas y teñido usando un anticuerpo monoclonal
anti-proteína ácida fibrilar de la glía
("GFAP") y fotografiado a 40x. La inmunorreactividad mostrada
son marcadores estándar para sinapsis, somas neuronales y
astrocitos, respectivamente. Se demuestra la morfología normal de
las células y de los tejidos.
Se usaron cachorros de ratón de diez días de edad
transgénicos para la isoforma de 751 aminoácidos de la proteína
precursora de la \beta-amiloide
(\beta-APP) humana, programados para expresión
neural por el promotor de la enolasa específico de neuronas como
fuente de tejidos para los cultivos de cortes organotípicos de
hipocampo. Se prepararon los cultivos como para los cultivos
organotípicos de cortes de cerebro de rata descritos en el Ejemplo
1.
Se observaron visualmente los cultivos de cortes
de cerebro de ratones transgénicos con un microscopio de disección
y uno de luz invertida un día sí y otro no. A diversos tiempos, se
recogieron cortes para histoquímica usando violeta de cresilo y
hematoxilina para discriminar la morfología celular y la anatomía
organotípica y sinaptofisina e inmunohistoquímica GFAP para valorar
la morfología de las neuronas y de la glía, respectivamente.
Se recogió el medio acondicionado de pocillos de
cultivo individuales que contenían 3 cortes organotípicos de
hipocampo durante el primer período de 24 horas in vitro y
luego a intervalos de 3-4 días. Se estudiaron
muestras de 100 \mul por duplicado de estas muestras de medio
acondicionado para 3 pocillos de cultivo cada una para cultivos de
cortes de hipocampo derivados de 3 animales donantes directamente
en ELISA en emparedado, que detecta
\beta-amiloide 1-40 ó
\beta-amiloide 1-42. Los
resultados de este experimento demuestran que la secreción de
amiloide por cultivos de hipocampo organotípicos de ratones
transgénicos [1] es fácilmente detectable a un nivel que permite la
medición de la actividad inhibitoria, [2] que es estable durante
5-20 días, [3] que se produce a un nivel
independiente del animal donante individual y [4] que muestra una
variabilidad aceptablemente baja entre los pocillos de cultivo. En
la Figura 3 se muestran los resultados del ensayo ELISA para
\beta-amiloide 1-40.
Se prepararon cultivos de cortes organotípicos de
hipocampo según se describe en el ejemplo 2 a partir de ratones de
10 días de edad transgénicos para la isoforma de 751 aminoácidos de
la proteína precursora de la \beta-amiloide
(\beta-APP), se programaron para expresión neural
por el promotor de enolasa específico de neuronas y se mantuvieron
en cultivo durante 10 días.
Se observaron los cultivos visualmente
aproximadamente un día sí y uno no. Al comienzo del estudio de los
compuestos, el día 10 de cultivo, se hizo una valoración
cuantitativa de la viabilidad. Se despolarizaron cortes de cerebro
por aplicación de medio de alto contenido en potasio (54 mM) durante
5 minutos. Se pasaron los insertos por 2 lavados de 2 minutos en
medio preequilibrado a 37ºC y un 5% de CO_{2} y se devolvieron a
la incubadora. El medio de alto contenido en potasio acondicionado
por los cortes durante el período de despolarización contiene
restos liberados por las vesículas sinápticas. Se dividió este
medio en dos alícuotas y se estudió en cuanto al ácido
\gamma-aminobutírico ("GABA") y al glutamato,
dos neurotransmisores peptídicos presentes en el hipocampo. Se
estudió convenientemente el medio usando ELISA desarrollados con
anticuerpos comerciales específicos para GABA y glutamato. Se usó
la tercera alícuota para estudiar la acetilcolina ("ACh"), un
neurotransmisor afectado precozmente en el hipocampo AD, usando un
ensayo de desplazamiento con antagonistas colinérgicos
radiomarcados empleando membranas portadoras de receptores ACh.
Estos ensayos proporcionan una medida cuantitativa de la cantidad
de tejido viable presente en cada inserto, demuestran una actividad
sináptica intacta y no dañan los cultivos.
Se disolvió este compuesto en DMSO para producir
una solución stock 100x y se diluyó en medio de cultivo a
concentraciones finales apropiadas. Éstas correspondían normalmente
a 100 nM hasta 100 \muM de compuesto, a menos que la información
previa acerca de la actividad o toxicidad del compuesto dicte algo
diferente. Se incluyó un control de DMSO al 1% para la concentración
final de vehículo. Se preequilibró el medio a 37ºC y 5% de CO_{2}
antes de transferir el inserto de cultivo a la nueva placa y se
cambió el medio cada 48 horas para aportar compuesto fresco. Se
guardó medio acondicionado para la valoración. Se observaron los
cultivos visualmente a diario. Se continuó la aplicación del
compuesto de ensayo durante 10 días.
Al concluir el período de ensayo, se recogió el
medio acondicionado del intervalo final de ensayo y se valoró la
actividad sináptica por despolarización en medio de alto contenido
en potasio, seguido de medición del GABA y del glutamato liberados,
según se ha descrito anteriormente.
Se estudió el medio acondicionado de cada
intervalo de período de ensayo en cuanto al nivel de
\beta-amiloide usando un ensayo ELISA. Los datos
generados por este método proporcionan una relación
dosis-respuesta, así como un curso temporal para
cada dosis estudiada. Como pueden estar presentes diferentes
cantidades de tejido viable en cada inserto de cultivo para servir
como fuente de amiloide, los valores para la
\beta-amiloide en el medio acondicionado fueron
normalizados usando los valores para el transmisor liberado al
inicio del experimento. Se evaluó la toxicidad comparando los
valores de liberación de transmisor al inicio y al término del
experimento. Se consideró que los compuestos que causaban una
reducción en los valores de liberación de transmisor al concluir el
experimento en relación al comienzo tenían un efecto tóxico. En
este caso, la reducción en los niveles de
\beta-amiloide pueden ser atribuidos a toxicidad
más que a efectos específicos sobre la producción de
\beta-amiloide. Se determinó la
\beta-amiloide depositada por inmunohistoquímica
usando anticuerpo
anti-\beta-amiloide mAb 4.1 para
puntuar el número de depósitos y placas de amiloide por área en
cortes tratados frente a controles.
Se prepararon cultivos de cortes organotípicos de
hipocampo a partir de ratones de 10 días de edad transgénicos para
la isoforma de 751 aminoácidos de la proteína precursora de la
\beta-amiloide (\beta-APP), se
programaron para expresión neural por el promotor de enolasa
específico de neuronas según se describe en el Ejemplo 2 y se
mantuvieron en cultivo durante 6 semanas.
Se prepararon cultivos de cortes organotípicos de
hipocampo a partir de ratones transgénicos para
\beta-APP751. El día 21 in vitro, se
lavaron los cultivos organotípicos con medio dos veces y se
incubaron pocillos por duplicado durante un período de
acondicionamiento de 3 días en medio suplementado con 25 \muM a
400 \muM de MDL 28170, un inhibidor de proteasas que ha mostrado
inhibir la producción de \beta-amiloide total en
cultivo celular con una CI_{50} de 100 \muM. Se aplicó MDL
28170 a partir de soluciones stock 100x preparadas en DMSO. El
cultivo control recibió sólo DMSO. Se recogió el medio
acondicionado el día 24 y se estudió por duplicado en cuanto a
\beta-amiloide 1-40 usando un
ELISA en emparedado. Se lavaron los cultivos organotípicos con
medio libre de suero dos veces y se incubaron durante 24 horas más
en medio libre de suero en la continua presencia de MDL 28170. Se
estudió este medio acondicionado en cuanto a la actividad lactato
deshidrogenasa ("LDH"). La LDH es una enzima citosólica ubicua
liberada al medio acondicionado sólo por células enfermas y es un
índice de viabilidad y toxicidad. Altos niveles de actividad LDH en
suero requieren hacer mediciones en medio acondicionado libre de
suero. Se calcularon los puntos de datos mostrados tomando
primeramente la media de valores de ELISA por duplicado para cada
pocillo y calculando luego la media de los valores para los
pocillos de tratamiento por duplicado.
Se observaron los cultivos visualmente
aproximadamente un día sí y uno no. Antes de comenzar el estudio de
los compuestos, el día 18 de cultivo, se inició un período de ensayo
de tres días en el cual se acondicionó el medio por los cultivos no
tratados. Se recogió este medio y se estudió en cuanto a los niveles
de \beta-amiloide 1-40 y 1,42
usando ELISA sensibles. Se lavaron entonces los cultivos
organotípicos con medio dos veces y se incubaron durante otro
período de acondicionamiento de 3 días en medio suplementado con 25
\muM a 400 \muM de MDL 28170, un inhibidor de proteasas que ha
mostrado inhibir la producción de \beta-amiloide
total en cultivo celular con una CI_{50} de 100 \muM. Se aplicó
MDL 28170 a partir de soluciones stock 100x preparadas en DMSO. El
cultivo control recibió sólo DMSO. Después de recoger el medio
acondicionado el día 21, se lavaron los cultivos organotípicos con
medio libre de suero dos veces y se incubaron durante 24 horas más
en medio libre de suero en la continua presencia de MDL 28170. Se
estudió este medio acondicionado en cuanto a la actividad lactato
deshidrogenasa (LDH). La LDH es una enzima citosólica ubicua
liberada al medio acondicionado sólo por células enfermas y es un
índice de viabilidad y toxicidad. Altos niveles de actividad LDH en
suero requieren hacer mediciones en medio acondicionado libre de
suero. A continuación, se lavaron los cultivos de cortes
organotípicos de hipocampo con medio que contenía suero, pero no
fármaco, y se dejó que acondicionaran medio fresco durante 3 días.
Se estudió este medio en cuanto a la
\beta-amiloide 1-40 a
1-42 con los mismos ELISA para determinar si la
actividad del MDL era reversible en el sistema de cortes
organotípicos de cerebro, al igual que lo es en células monotípicas
cultivadas. Este ensayo fue seguido de un período de
acondicionamiento de 24 horas con medio libre de suero para
determinar si los efectos tóxicos de MDL 28170 eran también
reversibles. La Figura 4 ilustra que la CI_{50} de MDL 28170 es de
100 \muM para la producción de \beta-amiloide
por cultivo de cortes organotípicos de hipocampo de ratones
transgénicos, como lo es para una variedad de cultivos de células
monotípicas. Además, se demostró inhibición en ausencia de
toxicidad, que no era aparente por inspección visual o por el
ensayo de LDH hasta que la concentración del compuesto de ensayo
alcanzó 400 \muM.
Claims (11)
1. Un método para identificar agentes reductores
de la \beta-amiloide, consistente en las
siguientes etapas:
- a)
- preparar un cultivo de cortes de cerebro organotípicos,
- b)
- valorar la viabilidad de las células en dicho cultivo de cortes de cerebro organotípicos,
- c)
- aplicar un compuesto de ensayo a dicho cultivo de cortes de cerebro organotípicos,
- d)
- valorar la viabilidad y la producción de \beta-amiloide de (i) la etapa de cultivo de cortes de cerebro organotípicos tratados de c) y (ii) un cultivo de cortes de cerebro organotípicos no tratados y
- e)
- identificar un compuesto que reduce la producción de \beta-amiloide, pero que no disminuye la viabilidad celular o altera otra función celular,
donde el cultivo de cortes de cerebro
organotípicos de a) y el cultivo de cortes de cerebro organotípicos
no tratados de d) no proceden de un feto
humano.
2. Un método según la reivindicación 1, donde
dicho cultivo de cortes de cerebro organotípicos es preparado a
partir de tejido de cerebro aislado de ratas, conejos, cobayas,
ratones o monos.
3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, donde
dicho mamífero es un mamífero transgénico que ha sido alterado para
producir proteína \beta-amiloide.
4. Un método según la reivindicación 1, 2 ó 3,
donde dicho cultivo de cortes organotípicos de cerebro es un
explante obtenido del hipocampo o del córtex.
5. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde dicho cultivo de cortes
organotípicos de cerebro es una sección de tejido de
aproximadamente 400 a 500 \mum de grosor.
6. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde dicho cultivo de cortes
organotípicos de cerebro es mantenido en medio de cultivo durante
aproximadamente 1 a 4 semanas antes del tratamiento con un compuesto
de ensayo.
7. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde se determina la viabilidad de
dicho cultivo de cortes organotípicos de cerebro por inspección
visual al microscopio; tinción usando colorantes vitales; tinciones
y reactivos inmunohistoquímicos específicos para los tipos
celulares o los restos presentes en el cerebro normal y lesionado;
anticuerpos para neurofilamentos, proteína ácida fibrilar glial,
S100, proteína asociada a microtúbulos, tau normal o fosforilada y
proteínas sinápticas; valoración bioquímica de la actividad
metabólica; medición del contenido proteico total o específico;
valoración de la función celular; o valoración de la actividad
neural.
8. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la viabilidad de dicho cultivo
de cortes organotípicos de cerebro es determinada midiendo la
secreción celular de proteína precursora de la
\beta-amiloide soluble o la secreción de
neurotransmisores.
9. Un método según la reivindicación 8, donde
dicha secreción de neurotransmisor es estimulada por estimulación
eléctrica, despolarización iónica y aplicación de substancia
neurotransmisora y donde se determina la presencia de un
neurotransmisor seleccionado entre acetilcolina, ácido
\gamma-aminobutírico (GABA), glutamato,
catecolaminas y neuropéptidos.
10. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde se determina la cantidad de
secreción de \beta-amiloide segregada en el medio
de cultivo, de producción de \beta-amiloide
soluble en el tejido del cultivo de cortes organotípicos de cerebro
y de \beta-amiloide depositada.
11. Un método según la reivindicación 10, donde
se determina la producción de \beta-amiloide
segregada por inmunoprecipitación, ELISA, electroforesis en gel o
Western blotting; se determina la producción de
\beta-amiloide soluble por inmunoprecipitación,
ELISA, electroforesis en gel, RIA o Western blotting, y se
determina la producción de \beta-amiloide
depositada por determinación bioquímica o por inspección visual y
tinción de secciones de tejido.
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