ES2335848B1 - Composicion celular in vitro con sobreexpresion simultanea de genes humanos mutados ps1 m146v, app swe y tau p301l. - Google Patents
Composicion celular in vitro con sobreexpresion simultanea de genes humanos mutados ps1 m146v, app swe y tau p301l. Download PDFInfo
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Abstract
Composición celular in vitro con
sobreexpresión simultánea de genes humanos mutados PS1_{M146V},
APP_{Swe} y tau_{P301L}. Composición que comprende cultivos
primarios de neuronas corticales obtenibles a partir de embriones de
ratones 3XTgAD cultivados en condiciones despolarizantes. Además, la
invención se refiere a un método in vitro para evaluar la
eficacia de compuestos y materiales para modificar, tratar o
prevenir enfermedades relacionadas con patología tau,
beta-amiloide o APP que comprende el empleo de
cultivos primarios de neuronas corticales obtenibles a partir de
embriones de ratones 3XTgAD cultivados en condiciones
despolarizantes.
Description
Composición celular in vitro con
sobreexpresión simultánea de genes humanos mutados PS1_{M146V},
APP_{Swe} y tau_{P301L}.
La presente invención se refiere a un modelo
in vitro obtenido a partir de ratones 3xTg-AD
para la enfermedad de Alzheimer con sobreexpresión simultánea de
PS1_{M146V}, APP_{Swe} y tau_{P301L} así como su utilidad para
el estudio de las bases biológicas de la enfermedad de alzheimer y/o
enfermedades relacionadas con patología tau y
beta-amiloide y para la evaluación de terapias
preventivas, terapéuticas y/o paliativas para esta enfermedad.
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una
enfermedad neurodegenerativa de carácter progresivo, de origen
todavía desconocido, y frente a la que no se puede, actualmente,
ofrecer ningún tratamiento capaz de curarla o prevenirla. Afecta al
5-7% de las personas de más de sesenta y cinco años
y es la causa de invalidez, dependencia y mortalidad más frecuente
entre las personas de edad avanzada. Según los datos disponibles en
la Fundación Alzheimer España
(http://www.fundacionalzheimeresp.org) cerca de 700.000
personas están afectadas en España y se manifiestan más de 100.000
nuevos enfermos al año, lo que representa que más de dos millones de
españoles y sus familiares, hoy en día, ven su vida trastornada por
la enfermedad. Según las últimas estimaciones, 8 millones de
europeos están afectados por la enfermedad de Alzheimer y además
teniendo en cuenta el envejecimiento de la población se prevé que el
número de enfermos se duplique en 2020 y triplique en 2050.
A nivel neuropatológico la EA se caracteriza por
dos estructuras anormales que se acumulan en el cerebro: depósitos
amiloides y placas neurofibrilares. Los depósitos amiloides son
fibras extracelulares formadas por \beta-amiloide,
(\betaA, concretamente \betaA40 y \betaA42), péptidos
generados por la ruptura proteolítica de la proteína precursora de
\beta-amiloide (APP). Las marañas neurofibrilares,
en contraste, son filamentos intracelulares formados por la
polimeración de tau, que normalmente funciona como proteína asociada
a los microtúbulos en los axones neuronales. Aunque hoy en día,
existe considerable debate acerca de si las fibras de \betaA y los
filamentos de tau poseen toxicidad intrínseca o simplemente son
resultado de otros procesos neurodegenerativos, numerosas evidencias
confirman el papel de tau y \betaA en la neurodegeneración. A
pesar de las investigaciones iniciales encaminadas a dilucidar el
papel individual de tau y \betaA en la EA, los últimos estudios
indican que la patología amiloide puede empeorar la patología tau y
que no necesariamente los tratamientos que mejoran la patología
amiloide mejoran también la patología tau, de ahí la necesidad de
disponer de modelos para la enfermedad de alzheimer que presenten
patología tau y \betaA de manera simultánea. La proteína
precursora de beta-amiloide (APP) es una proteína
transmembrana ampliamente conocida por su papel en la enfermedad de
Alzheimer. En los cerebros de pacientes con EA las placas amiloides
conteniendo agregados de beta-amiloide aparecen en
regiones cerebrales específicas, desencadenando una respuesta
inflamatoria, muerte neuronal y deteriodo cognitivo progresivo. Uno
de los mecanismos por los cuales el péptido
beta-amiloide se genera a partir de APP es la
ruptura de APP en una posición extracelular (sitio beta) seguido por
una ruptura inusual dentro del segmento transmembrana de APP (sitio
gamma), generando un fragmento de APP que contiene
39-43 aminoácidos. Varias mutaciones en la proteína
APP han sido correlacionadas con la EA debido al incremento o
alteración en la transformación de APP en
beta-amiloide, en particular la transformación de
APP a cantidades grandes de la forma larga de
beta-amiloide (es decir
beta-amiloide 40 y beta-amiloide
42). El péptido \beta-amiloide ha sido implicado
ademas en defectos neuropatológicos en individuos con el síndrome de
Down. Por ejemplo, prácticamente todos los individuos con síndrome
de Down, que poseen una copia extra del cromosoma 21 muestran
alteraciones neuropatológicas similares a las observadas en la
enfermedad de alzheimer si sobreviven más allá de los 40 años y esto
parece ser debido a una producción excesiva de
\beta-amiloide, la cual está codificada por el gen
de APP localizado en el cromosoma 21.
Durante los últimos años, los modelos animales
para la enfermedad de Alzheimer han proporcionado oportunidades
excelentes para profundizar en el conocimiento de la etiopatología y
de las terapias para la enfermedad. Las principales características
de la enfermedad de Alzheimer han sido reproducidas en diferentes
modelos murinos obtenidos a partir de ratones transgénicos,
obtenidos por ingeniería genética incorporando alguno de los
transgenes que en humanos están presentes en los pocos casos (sólo
un 10%) de Alzheimer de tipo familiar, principalmente modelos que
sobreexpresan el gen APP que da lugar a la proteína precursora del
\betaA. Sin embargo, ninguno de estos modelos había logrado aunar
las principales características neuropatológicas, conductuales y
neuroquímicas de la enfermedad de Alzheimer hasta que en el año 2003
el Profesor LaFerla desarrolló los ratones triple transgénicos
3xTgAD. Se ha demostrado que los ratones 3xTgAD, con transgenes
humanos PS1_{M146V}, APP_{Swe} y tau_{P301L}, presentan los
caracteres más sobresalientes de la EA y desarrollan,
progresivamente, placas de \betaA y marañas neurofibrilares de Tau
en un patrón temporal y neuroanatómico paralelo al de humanos.
Además, presentan disfunción sináptica, deficiencias colinérgicas y
conductuales, de forma dependiente a la edad pero iniciándose antes
de la patología de placas y marañas, y los déficits en plasticidad
sináptica a largo plazo correlacionan con la acumulación de \betaA
a nivel intracelular. En base a todo ello, los ratones
3xTg-AD proporcionan un modelo animal único para
estudiar la neurobiología de la enfermedad y evaluar estrategias
preventivas y terapéuticas potenciales sobre ambos tipos de lesión
(patología tau y beta-amiloide) y otras deficiencias
celulares y moleculares presentes en la enfermedad de Alzheimer.
Uno de los mayores desafíos en las
aproximaciones a la patogénesis de la EA es el desarrollo de modelos
celulares adecuados en los que se reproduzcan determinados aspectos
celulares, moleculares y bioquímicos de la EA en humanos. A pesar de
la proliferación y utilidad de modelos transgénicos in vivo
para la EA, en todos ellos las alteraciones neuropatológicas de la
EA no aparecen antes de los 2 meses de edad del animal. Esto
conlleva que no se pueden realizar estudios de las bases
neurobiológicas de la enfermedad ni evaluar sustancias preventivas
y/o terapéuticas para la EA hasta una cierta edad del animal.
Además, las aproximaciones in vivo son extremadamente
costosas tanto en términos de tiempo como económicos debido al coste
del mantenimiento de los animales, la muerte prematura y el número
de animales que se necesitan para cada uno de estos estudios, etc
por lo que el potencial preventivo y/o terapéutico de distintos
tipos de estrategias para la EA que pueden tener enorme valor
terapéutico, no pueden ser evaluadas mediante estos métodos.
Un primer aspecto de la presente invención se
refiere a un modelo celular in vitro para evaluar la eficacia
de compuestos y materiales para modificar, tratar o prevenir
enfermedades relacionadas con patología tau,
beta-amiloide o APP que comprende el empleo de
cultivos primarios de neuronas corticales obtenibles a partir de
embriones de ratones 3xTgAD cultivados en condiciones
despolarizantes.
Por "patologías relacionadas con patología
tau, beta-amiloide o APP" se entiende cualquier
enfermedad que curse con incremento en los agregados de proteína
tau, y/o incremento de los niveles de beta-amiloide
o proteína precursora de beta amiloide.
En una realización preferida de la invención los
compuestos evaluados se seleccionan del grupo que consiste en
péptidos, polipéptidos, proteínas, agentes biológicos o fármacos. En
una realización más preferida de la presente invención la enfermedad
es la enfermedad de Alzheimer. En una realización aún más preferida
de la presente invención la evaluación se lleva a cabo empleando
métodos de HTS (high through-put screening).
En aún otra realización de la invención los cultivo primarios de
neuronas se obtienen a partir de embriones de ratones 3XTgAD cuya
edad está comprendida entre 15-17 días.
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere a una composición (de aquí en adelante composición de la
presente invención) que comprende cultivos primarios de neuronas
corticales obtenibles a partir de la corteza cerebral de embriones
de ratones 3xTgAD de 15-17 días de gestación y que
se mantienen en condiciones despolarizantes.
Los "ratones 3xTgAD" descritos en la
presente invención se refieren a ratones triple transgénicos
obtenibles mediante el procedimiento detallado en la solicitud
internacional WO2003/053136 y proporcionados por los titulares de
dicha solicitud.
Un tercer aspecto de la presente invención se
refiere a un método de preparación de la composición de la
inven-
ción.
ción.
Un cuarto aspecto de la presente invención se
refiere al uso de la composición de la invención para el estudio de
las bases biológicas de enfermedades relacionadas con patología tau,
beta-amiloide o APP. En una realización preferida de
la presente invención, la composición de la invención se emplea para
evaluar la eficacia de compuestos y materiales para modificar,
tratar o prevenir enfermedades relacionadas con patología tau,
beta-amiloide o APP. En un aspecto aún más preferido
de la invención la composición la enfermedad es la enfermedad de
Alzheimer.
La Figura 1 muestra una imagen de microscopía
confocal en la que se representa la expresión de la proteína
precursora de beta-amiloide (APP) en cultivos
silvestres (A) y cultivos neocorticales obtenidos de animales triple
transgénicos (B). A los 8 días en cultivo la expresión de APP está
incrementada en cultivos primarios obtenidos de animales
triple-transgénicos. Barra de escala 20 \mum.
La Figura 2 muestra una imagen de microscopía
confocal en la que se representa la expresión de
beta-amiloide en cultivos silvestres (A) y cultivos
neocorticales obtenidos de animales triple transgénicos (B). A los 8
días en cultivo la expresión de \betaA está incrementada en
cultivos primarios obtenidos de animales
triple-transgénicos. Barra de escala 20 \mum.
La Figura 3 muestra una imagen de microscopía
confocal en la que se representa la expresión de Tau 46 (tau total)
en cultivos silvestres (A) y cultivos neocorticales obtenidos de
animales triple transgénicos (B) después de 8 div. A los 8 días en
cultivo la expresión de Tau total está incrementada en cultivos
primarios obtenidos de animales triple-transgénicos.
Barra de escala 20 \mum.
La Figura 4 muestra una imagen de microscopia
confocal en la que se representa la expresión de Tau HT7 (residuos
159-163 de la proteína) en cultivos silvestres (A) y
cultivos neocorticales obtenidos de animales triple transgénicos (B)
después de 8 div. A los 8 días en cultivo la expresión de Tau está
incrementada en cultivos primarios obtenidos de animales
triple-transgénicos. Barra de escala 20 \mum.
La Figura 5 muestra una imagen de microscopia
confocal en la que se representa la expresión de Tau AT8 (Tau
fosforilada en Ser 202) en cultivos silvestres (A) y cultivos
neocorticales obtenidos de animales triple transgénicos (B) después
de 8 div. A los 8 días en cultivo la expresión de Tau fosforilada en
Ser 202 está incrementada en cultivos primarios obtenidos de
animales triple-transgénicos. Barra de escala 20
\mum.
La Figura 6 muestra una imagen de microscopia
confocal en la que se representa la expresión de Tau AT100 (tau
phosphorilada en Thr 212 y Ser 214) en cultivos silvestres (A) y
cultivos neocorticales obtenidos de animales triple transgénicos (B)
después de 8 div. A los 8 días en cultivo la expresión de esta
isoforma proteica está incrementada en cultivos primarios obtenidos
de animales triple-transgénicos. Barra de escala 20
\mum.
La Figura 7 muestra una imagen de microscopia
confocal en la que se representa la expresión de Tau AT270 (Tau
phosphorilada en Thr 181) en cultivos silvestres (A) y cultivos
neocorticales obtenidos de animales triple transgénicos (B) después
de 8 div. A los 8 días en cultivo la expresión de esta isoforma de
la proteína está incrementada en cultivos primarios obtenidos de
animales triple-transgénicos. Barra de escala 20
\mum.
La Figura 8 muestra una imagen de microscopía
confocal en la que se representa la expresión de Tau 46 (tau total)
en cultivos silvestres (A) y cultivos neocorticales obtenidos de
embriones de animales triple transgénicos (B) después de 14 div. A
los 14 días en cultivo la expresión de Tau total está incrementada
en cultivos primarios obtenidos de animales
triple-transgénicos. Barra de escala 20 \mum.
La presente invención se enfrenta al problema
técnico de encontrar una solución que solvente los problemas
asociados a los modelos transgénicos in vivo para la EA que
existen hoy en día.
En este sentido, la presente invención
proporciona un modelo in vitro nuevo, rápido, eficaz y
reproducible para estudiar las bases biológicas y evaluar terapias y
compuestos para el tratamiento y prevención de la enfermedad de
Alzheimer y/o enfemedades asociadas a Tau y \betaA basado en el
empleo de una composición que comprende cultivos primarios de
neuronas corticales obtenibles a partir de embriones de ratones
3xTgAD que se mantienen in vitro en condiciones
despolarizantes.
Para explorar en profundidad las funciones
celulares y propiedades de los productos génicos relacionados con la
EA, los modelos celulares son indispensables. Por otra parte, aunque
tanto astrocitos como neuronas producen niveles elevados de
beta-amiloide, las neuronas son más drásticamente
afectadas por la enfermedad. Por consiguiente el estudio de las
células neuronales parece más relevante para comprender los aspectos
moleculares o las cascadas patológicas causantes de la EA así como
para iniciar el estudio de terapias preventivas y/o terapéuticas
para la misma.
En el caso del los ratones 3xTgAD, los
transgenes humanos PS1_{M146V}, APP_{Swe} y tau_{P301L} son
expresados bajo el control del promotor Thy1.2 que dirige la
expresión de los mismos predominantemente al sistema nervioso
central, y se expresan ya en estadios embrionarios.
A pesar de que en embriones de ratones 3xTgAD la
sobreexpresión de los transgenes humanos para PS1_{M146V},
APP_{Swe} y tau_{P301L} es 3 veces mayor que en embriones de
ratones control, hasta el momento no se ha podido establecer un
modelo in vitro con sobreexpresión de estos transgenes ya que
la expresión del promotor Thy1.2 es demasiado baja en el
embrión lo cual impide obtener sobreexpresión de los transgenes en
condiciones habituales de cultivo de neuronas corticales. De hecho,
hasta el momento la baja expresión del promotor Thy1.2 en el
embrión, ha imposibilitado la obtención de un modelo neuronal in
vitro obtenido a partir de células embrionarias. En el modelo
descrito en la presente invención y en las condiciones de cultivo
descritas, los transgenes humanos están activados en cultivos
neuronales in vitro tal como se demuestra en la presente
invención y además se sobreexpresan de forma dependiente del tiempo
en cultivo, por lo tanto los cultivos neuronales primarios obtenidos
de embriones de ratones 3xTgAD constituyen un modelo singular para
la EA.
Las condiciones de cultivo indispensables para
conseguir una expresión génica dependiente del tiempo son
condiciones despolarizantes (KCl 10-25 mM) y
elevada densidad de siembra (más de 2.800.000 células por ml).
Por ello, este modelo in vitro
proporciona un modelo multidimensional único para estudiar las bases
biológicas de la enfermedad y evaluar estrategias preventivas y/o
terapéuticas para la EA ya que se ha demostrado que algunos
tratamientos en modelos que sobreexpresan únicamente
beta-amiloide o tau pueden mejorar una de las
patologías y empeorar la otra (por ejemplo los tratamientos crónicos
con nicotina mejoran los depósitos de
\beta-amiloide pero empeoran las marañas
neurofibrilares). Hasta la fecha no existe ningún modelo in
vitro que reproduzca a nivel celular, molecular y funcional el
espectro neuropatológico de la enfermedad de alzheimer que muestran
los pacientes
humanos.
humanos.
Así, la invención propuesta describe un modelo
in vitro para estudiar las bases biológicas de la EA y
evaluar la eficacia de compuestos y materiales, tales como productos
biológicos, fármacos y productos químicos o interacciones
neuroquímicas resultantes de cultivos obtenidos a partir de animales
híbridos, en modificar, tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer
y otras enfermedades relacionadas con patología tau,
beta-amiloide o APP.
De acuerdo con esta invención, el método implica
el empleo de cultivos primarios de neuronas corticales obtenidos a
partir de un modelo animal para la enfermedad de Alzheimer, los
ratones triple transgénicos 3xTgAD. Los cultivos celulares se
obtienen a partir de fetos de ratones 3xTgAD y se comparan con
cultivos no tratados o con cultivos obtenidos de ratones control
non-3xTgAD proporcionando así un sistema in
vitro para evaluar los efectos de diferentes compuestos en las
propiedades bioquímicas y funcionales de neuronas control y neuronas
con neuropatología característica de la EA y/o enfermedades
relacionadas. Este método proporciona un modelo económico, fiable y
rápido y permite el empleo de técnicas de análisis que no requieran
esperar a alcanzar un determinado estado de desarrollo del animal
tal como se emplea en modelos in vivo para la enfermedad de
alzheimer. La utilización de cultivos celulares primarios,
preferentemente cultivos corticales, obtenidos a partir de animales
triple transgénicos 3xTgAD es una nueva aproximación para
identificar y descubrir terapias (farmacológicas o no) relacionados
con la prevención o tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Los
cultivos celulares primarios obtenidos a partir de ratones 3xTgAD
presentan numerosas ventajas sobre otras preparaciones tales como
cultivos neuronales primarios obtenidos de ratones transgénicos para
la EA que sobreexpresan solamente beta-amiloide o
tau, rodajas de cerebro o experimentos in vivo para evaluar
la eficacia de compuestos en el tratamiento o prevención de la
enfermedad de alzheimer. Entre estas ventajas destacan: facilidad de
acceso de sustancias aplicadas extracelularmente, capacidad para
evaluar la eficacia de un compuesto después de un corto período de
tiempo, fácil visualización de células y sinapsis para medidas
ópticas y electrofisiológícas, capacidad para mantener acceso a las
células en un entorno controlado para manipulaciones genéticas y
bioquímicas, y la simplicidad de los protocolos de ensayo,
diagnóstico o evaluación debido a la exclusión de diferentes tipos
de células no neuronales, así como la sobreexpresión simultánea de
APP, \betaA
y Tau.
y Tau.
La invención propuesta describe varias
utilidades basadas en el descubrimiento de que este modelo presenta
sobreexpresión de \beta-amiloide, APP y Tau.
A lo largo de toda la descripción y
reivindicaciones de la especificación, la palabra "comprende" y
las variaciones de la misma, no pretenden excluir otros aspectos de
la presente invención, que resultarán evidentes para un experto en
la materia a la vista de la descripción.
La exposición detallada de los modos de
realización (ejemplos) y de las figuras que siguen se proporciona a
modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
De acuerdo con esta invención, los cultivos
neuronales primarios obtenidos de fetos de 15-17
días de gestación de animales triple transgénicos 3xTgAD constituyen
un modelo celular con sobreexpresión simultánea de APP, tau y
Beta-amiloide lo que permite el estudio in
vitro de las bases biológicas de la enfermedad de alzheimer,
incluyendo expresión génica y proteica, actividades enzimáticas,
sistemas de neurotransmisión, propiedades funcionales de las
neuronas afectadas por la EA y de los elementos involucrados en la
cascada de beta-amiloide así como los procesos
inflamatorios y excitotóxicos o de estrés oxidativo asociados a la
patología de la EA.
En la presente invención los cultivos primarios
se establecen a partir de embriones de 15-17 días de
gestación obtenidos de ratones 3xTgAD y ratones control
non-3xTgAD. El procedimiento empleado para obtener
cultivos corticales primarios de acuerdo con la presente invención
es el siguiente:
Los cultivos celulares, preferentemente
corticales se obtienen a partir de la corteza cerebral de embriones
de ratones 3xTgAD y non-3xTgAD de entre 15 y 17 días
de gestación. Las hembras gestantes se sacrifican mediante anestesia
con éter, se desinfecta el abdomen con etanol al 70% y se extraen
los fetos. El útero, conteniendo los fetos se transfiere a una
campana de flujo laminar en una placa de Petri y a continuación se
extraen los fetos. La corteza cerebral se separa del resto del
cerebro y las células se diseccionan empleando tratamiento
enzimático y disgregación mecánica. La corteza cerebral fetal se
extrae, se corta y se disocia mediante tratamiento con tripsina y
posterior tratamiento con solución conteniendo inhibidor de tripsina
y DNAsa. Las células disociadas se centrifugan (5 minutos a 1000
rpm) y se resuspenden en medio de cultivo de Dulbecco que contiene
10% v/v de suero fetal bovino, 10-25 mM KCl, 0.2 mM
glutamina, 10 unidades/l de penicillin G, 0.1 I.U./I de insulina y
7.3 \muM de ácido p-aminobenzoico. Las células se
siembran en placas de cultivo pretratadas con
poly-D-lysine (entre 10 y 60 mg/l) y
se mantienen a 37ºC en una atmósfera húmeda con 5% CO2 /95% aire.
Entre 36 y 48 horas en cultivo se añade arabinósido de citosina (20
\muM) para prevenir la proliferación de células no neuronales en
el caso de que se deseen obtener cultivos de neuronas corticales
puros. Este último paso puede obviarse cuando sea necesario obtener
cultivos mixtos de neuronas y glia. A partir de los 6 días en
cultivo se ha caracterizado la sobreexpresión de la APP, tau y
beta-amiloide en los cultivos neuronales primarios
obtenidos de ratones 3xTgAD en comparación con los cultivos
neuronales primarios obtenidos de ratones silvestres sometidos al
mismo procedimiento (non-3xTgAD).
\newpage
Ejemplo
2
De acuerdo con esta invención cultivos
neuronales primarios de animales triple transgénicos
3xTg-AD para la enfermedad de Alzheimer han sido
caracterizados para evaluar la eficacia de compuestos y materiales
(ejemplo, fármacos y otros agentes y sustancias biológicos o
sintéticos) en el tratamiento o prevención de la enfermedad de
Alzheimer o enfermedades asociadas a beta-amiloide
y/o tau y APP. Los compuestos que pueden ser evaluados en este
modelo incluyen pequeñas moléculas tales como péptidos y proteínas,
agentes biológicos, compuestos químicos y fármacos. Preferentemente,
serán compuestos no tóxicos y bien tolerados para ser empleados en
el tratamiento, terapia y prevención de la EA o enfermedades
asociadas a beta-amiloide y/o tau. Las respuestas de
las células en este modelo celular pueden ser determinadas de manera
cuantitativa, permitiendo por lo tanto determinar la actividad o
efecto de un compuesto en los mecanismos moleculares, bioquímicos y
fisiológicos que tengan lugar en la célula y que estén asociados con
EA o enfermedades relacionadas con beta-amiloide y/o
tau. Para la determinación inmunocitóquímica de la sobreexpresión
proteica presente en este modelo in vitro, los cultivos
neuronales obtenidos de animales 3xTgAD y non-3xTgAD
se fijan en paraformaldehido al 4% y posteriormente se marcan con
anticuerpos primarios frente a APP/\betaA (NAB228: 1:50),
\beta-amiloide 6E10 (1:500), Tau 46 (Tau Total
1:500), Tau HT7 (1:200, residuos 159-163), Tau AT8
(Tau fosforilada en Ser 202, 1:100), Tau AT100 (1:100, tau
phosphorilada en Thr 212 y Ser 214) y Tau AT270 (1:100, Tau
phosphorilada en Thr 181). La inmunoreactividad se visualiza
empleando un anticuerpo secundario fluorescente en microscopio
confocal (Nikon, Mellville, NY,USA), con una cámara
ORCA-ER Hamamatsu (Hamamatsu Photonics KK,
Hamamatsu, Japón). Los controles para la especificidad de los
métodos de detección se realizaron omitiendo la incubación con el
anticuerpo primario en uno de cada cuatro pocillos consecutivos.
Ninguno de los pocillos sin anticuerpo primario mostró ninguna señal
comparable a la señal obtenida con los anticuerpos primarios.
Este proceso se puede automatizar para HTS (high
throughput screening) utilizando placas de cultivo a las que
previamente se añadieron las células, que fueron cultivadas durante
al menos 6 días. Estas placas son suceptibles de ser incorporadas a
sistemas automáticos de medición de los marcadores que interesen,
mediante distintos métodos de medida (absorbancia, luminiscencia,
flurescencia). De la misma forma, el efecto de diferentes terapias
en dianas celulares, moleculares y bioquímicas de relevancia para la
enfermedad de Alzheimer es susceptible de ser investigado en este
modelo in vitro mediante métodos de HTS empleando kits
comerciales de interés para la evaluación del efecto de un
tratamiento de cualquier naturaleza en la evolución de la EA o
enfermedades asociadas a tau y beta-amiloide,
después de que las células hayan sido sometidas al tratamiento en
cuestión.
Claims (12)
1. Método in vitro para evaluar la
eficacia de compuestos y materiales para modificar, tratar o
prevenir enfermedades relacionadas con patología tau,
beta-amiloide o APP que comprende el empleo de
cultivos primarios de neuronas corticales obtenibles a partir de
embriones de ratones 3XTgAD cultivados en condiciones
despolarizantes.
2. Método in vitro de acuerdo con la
primera reivindicación, donde los compuestos evaluados se
seleccionan del grupo que consiste en péptidos, polipéptidos,
proteínas, agentes biológicos, sustancias químicas o fármacos.
3. Método in vitro de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la
enfermedad es la enfermedad de Alzheimer.
4. Método in vitro de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el proceso de
evaluación se lleva a cabo empleando métodos de HTS (high
through-put screening).
5. Método in vitro de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los cultivo
primarios de neuronas se obtienen a partir de embriones de ratones
3XTgAD cuya edad está comprendida entre 15-17 días
de gestación.
6. Composición que comprende cultivos primarios
de neuronas corticales obtenibles a partir de embriones de ratones
3XTgAD cultivados en condiciones despolarizantes.
7. Método de preparación de la composición de la
reivindicación 6, que comprende los siguientes pasos:
- a.
- Extraer y disociar la corteza cerebral fetal de embriones de ratones 3XTgAD mediante tratamiento con tripsina,
- b.
- Tratar la corteza cerebral fetal con solución conteniendo inhibidor de tripsina y DNAsa.
- c.
- Centrifugar,
- d.
- resuspender las células en medio de cultivo de Dulbecco que contiene suero fetal bovino, KCl, glutamina, antibiótico, insulina y ácido p-aminobenzoico.
- e.
- Sembrar las células en placas de cultivo pretratadas con poli-D-lisina y mantenerlas a aproximadamente 37ºC en una atmósfera húmeda.
8. Método de preparación de la composición de la
reivindicación 6 según la reivindicación anterior, donde los
embriones de ratones 3XTgAD tienen una edad de entre 15 y 17 días de
gestación.
9. Método de preparación de la composición de la
reivindicación 6 según cualquiera de las reivindicaciones
7-8, que además comprende:
- f.
- añadir arabinósido de citosina entre 36 y 48 horas de cultivo.
10. Uso de la composición de la reivindicación 6
para el estudio de las bases biológicas de enfermedades relacionadas
con patología tau, beta-amiloide o APP.
11. Uso de la composición de la reivindicación 6
para evaluar la eficacia de compuestos y materiales para modificar,
tratar o prevenir enfermedades relacionadas con patología tau,
beta-amiloide o APP.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
10 o 11, donde la enfermedad es la enfermedad de Alzheimer.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| ES200802799A ES2335848B1 (es) | 2008-10-02 | 2008-10-02 | Composicion celular in vitro con sobreexpresion simultanea de genes humanos mutados ps1 m146v, app swe y tau p301l. |
| PCT/ES2009/070304 WO2010037884A1 (es) | 2008-10-02 | 2009-07-23 | Composición celular in vitro con sobrexpresión simultánea de genes humanos mutados ps1 m146v, app swe y tau p301l |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200802799A ES2335848B1 (es) | 2008-10-02 | 2008-10-02 | Composicion celular in vitro con sobreexpresion simultanea de genes humanos mutados ps1 m146v, app swe y tau p301l. |
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|---|---|
| ES2335848A1 ES2335848A1 (es) | 2010-04-05 |
| ES2335848B1 true ES2335848B1 (es) | 2011-02-02 |
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ID=42026647
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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|---|---|
| ES (1) | ES2335848B1 (es) |
| WO (1) | WO2010037884A1 (es) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1469717A4 (en) * | 2001-12-20 | 2007-08-22 | Univ California | TRIPLE TRANSGENIC MOUSE MODEL OF ALZHEIMER'S DISEASE |
-
2008
- 2008-10-02 ES ES200802799A patent/ES2335848B1/es active Active
-
2009
- 2009-07-23 WO PCT/ES2009/070304 patent/WO2010037884A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (3)
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|---|
| FAURÉ, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and cellular neurosciences. Abril 2006. Vol. 31(4), páginas 642-948. ISSN 1044-7431. Ver resumen; página 645; página 646, último párrafo; y página 647, 2$^{o}$ párrafo. * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| WO2010037884A1 (es) | 2010-04-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
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|
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Ref document number: 2335848 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B1 Effective date: 20110121 |