DE60036224T2

DE60036224T2 - Screening-verfahren für auf neuronen wirkzamen verbindungen

Info

Publication number: DE60036224T2
Application number: DE60036224T
Authority: DE
Inventors: Pascal Villa; Michel Delaage; Toni Williamson; Christopher Henderson
Original assignee: Trophos SA
Current assignee: Trophos SA
Priority date: 1999-12-09
Filing date: 2000-12-07
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2020-12-08
Also published as: EP1107003A1; US20030077665A1; WO2001042784A9; CA2390671A1; WO2001042784A3; CA2390671C; EP1236046A2; JP4898047B2; DE60036224D1; US6949354B2; EP1236046B1; WO2001042784A2; JP2003516139A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zum Durchmustern und/oder Identifizieren von Verbindungen, die biologisch aktiv auf Neuronen wirken. Die Erfindung kann bei der experimentellen Forschung, Arzneimittelforschung, Arzneimittelentwicklung und dergleichen verwendet werden. Insbesondere kann die Erfindung verwendet werden, um Verbindungen, die auf Neuronen aktiv wirken, zu identifizieren und/oder zu charakterisieren und/oder zu verbessern und kann zur Behandlung von Störungen des Nervensystems verwendet werden.
Es gibt einen großen Bedarf für neue Arzneimittel für neurodegenerative Krankheiten, insbesondere bei Motoneuronkrankheiten, der Alzheimer'schen Krankheit und der Parkinson'schen Krankheit. Trotz einer aktiven chemischen Forschung gibt es sehr wenig Arzneitmittelbehandlungen für diese Krankheiten, und alle sind alles andere als zufrieden stellend.
Nach dem Stand der Technik wurde von mehreren Verfahren berichtet, um Verbindungen zu identifizieren, die aktiv auf neurodegenerative Störungen wirken. Insbesondere wurden mehrere rekombinante Zelllinien, die ausgewählte Rezeptoren darstellen, die an Nervenübertragungen beteiligt sind, zubereitet und verwendet, um Liganden davon zu durchmustern. Diese Durchmusterungsverfahren, die isolierte Rezeptoren verwenden, haben jedoch bis jetzt nicht zu brauchbaren, aktiven Verbindungen geführt. Dies wahrscheinlich aufgrund der Tatsache, dass nicht die geeigneten Untersuchungsgegenstände verwendet wurden. Andere Verfahren umfassen das Durchmustern von Verbindungen, die die Produktion von therapeutischen Formen von Proteinen wie z.B. die Produktion von b-Amyloid-Peptid hemmen. Diese Verfahren stellen jedoch nur begrenzte Informationen hinsichtlich der Kandidaten-Verbindungen zur Verfügung, dass sie künstliche Zellsysteme verwenden und die Komplexität des Nervensystems nicht berücksichtigen. Standardmäßig gemischte neuronale Kulturen sind für den Test von Verbindungen ebenfalls nicht nützlich, da es unmöglich ist, den spezifischen fraglichen Neuronen zu folgen und Zellwechselwirkungen hinsichtlich der Bedeutung für die pathologische Situation zu interpretieren. Schließlich ist es nicht machbar, Tierversuche durchzuführen, da diese zeitaufwändig, teuer und nicht dazu geeignet sind, die große Anzahl von Verbindungen aus der kombinatorischen Chemie zu testen. Es wurden mehrere Durchmusterungsproben oder -verfahren vorgeschlagen, die schlecht definierte und/oder spezifische Zellpopulationen, besondere induzierende Bedingungen und einen umfassenden Signalnachweis (d.h. für die gesamte behandelte Zellpopulation) verwenden, wie z.B. in WO99/10741 , WO96/40982 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung schlägt nun zum ersten Mal Durchmusterungsverfahren, basierend auf definierten Zellpopulationen, bei Kulturen mit geringen Dichten und unter Verwendung einer individualisierten Ablesung, die eine erhöhte Empfindlichkeit, eine erhöhte Zuverlässigkeit und einen höheren Durchsatz ermöglichen, vor und ermöglicht diese.
Die vorliegende Erfindung stellt nun Verfahren zum Test von Verbindungen vor, die biologisch aktiv auf Neuronen wirken. Die Erfindung kann mit einer großen Anzahl von Kandidaten-Verbindungen durchgeführt werden, sie ist empfindlich und reproduzierbar. Die Verfahren sind auch in hohem Masse vorhersagend, da ganze Neuronen verwendet werden, die die In-vitro-Bedingung imitieren.
Insbesondere hat der Anmelder entdeckt, dass aufgereinigte Neuronen, die spezifisch für eine bestimmte Krankheit sind, isoliert und in ausreichender Menge und mit ausreichender Reproduzierbarkeit kultiviert werden können, um bei einer Durchmusterung mit hohem Durchsatz verwendet zu werden. Der Anmelder hat weiter gezeigt, dass die isolierten und aufgereinigten Neuronen von Robotern gehandhabt und in Mikrotiterplatten verschiedener Größen mit einer sehr geringen Dichte (z.B. 25 Neuronen pro mm² oder weniger, insbesondere 10 Neuronen pro mm² oder weniger) kultiviert werden können, so dass eine einzige Neuronenzubereitung bis zu 10 000 Mikrotiterlöcher oder mehr ergeben kann, die für eine Durchmusterung von Verbindungen mit hohem Durchsatz geeignet sind. Der Anmelder hat auch gezeigt, dass die isolierten und aufgereinigten Neuronen in Kultur in An- oder Abwesenheit einer oder mehrerer Testverbindungen zum Absterben veranlasst werden können, wodurch sie einen pathologische Prozess nachahmen, und dass der Tod oder das Überleben von Neuronen auf dem individuellen Zellniveau überwacht werden kann (d.h. durch die individuelle Analyse aller oder einiger der isolierten Neuronen), insbesondere durch Fluoreszenzmikroskopie, die an Mikrotiterlöcher angepasst ist. Die Erfindung stellt somit einen nützlichen und vorausschauenden Test für aktive Verbindungen sowie für die Durchmusterung auch von großen Bibliotheken von Verbindungen dar. Dieses Verfahren wird in den beigefügten Ansprüchen beschrieben.
Eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die aktiv auf die neuronale Zellfunktion wirken, umfassend das in Kontakt bringen einer Kandidaten-Verbindung in vitro mit einer isolierten neuronalen Zellpopulation und die Bestimmung der Wirkung der Kandidaten-Verbindung auf die Funktion der Zellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung, zur Auswahl oder zur Charakterisierung einer Verbindung, die aktiv auf die neuronale Zellfunktion wirkt, umfassend das in Kontakt bringen einer oder mehrerer Kandidaten-Verbindungen parallel mit mindestens zwei verschiedenen isolierten neuronalen Zellpopulationen, und Bestimmung der Wirkung der Kandidaten-Verbindungen auf die Funktion der Zellen.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchmusterung einer Bibliothek von Verbindungen, umfassend den Test jeder oder einiger Verbindungen der Bibliothek auf ihre aktive Wirkung auf eine oder mehrere isolierte neuronale Zellpopulationen hin.
Innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Verbindung" jedes Produkt in isolierter Form oder in Mischung mit einem anderen Material (z.B. einem/mehreren anderen Produkt(en)). Die Verbindung kann hinsichtlich der Struktur und der Zusammensetzung definiert sein, oder sie kann ohne Definition sein. Zum Beispiel kann die Verbindung ein isoliertes und strukturell definiertes Produkt, ein isoliertes Produkt unbekannter Struktur, eine Mischung von mehreren Bekannten und charakterisierten Produkten oder eine undefinierte Zusammensetzung, umfassend ein oder mehrere Produkte, sein.
Beispiele von derartigen undefinierten Zusammensetzungen umfassen z.B. Gewebeproben, biologische Flüssigkeiten, Zellenüberstände, pflanzliche Zubereitungen usw. Die Kandidaten-Verbindung kann jedes organische oder anorganische Produkt sein, darin eingeschlossen ein Polypeptid (oder ein Protein oder Peptid), eine Nukleinsäure, ein Lipid, ein Polysaccharid, ein chemisches Produkt oder alle Mischungen oder Derivate davon. Die Verbindungen können natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein, darin eingeschlossen Bibliotheken von Verbindungen.
Wie weiter unten erörtert, ist die vorliegende Erfindung insbesondere für die Durchmusterung von einer großen Anzahl von Verbindungen, wie z.B. kombinatorischen Bibliotheken von Verbindungen, geeignet. In der Tat stellt die vorliegende Erfindung Materialien und Verfahren bereit, die eine wirksame und einfache Durchmusterung verschiedener Verbindungen in kurzen Zeiträumen ermöglichen. Insbesondere können die vorliegenden Verfahren teilweise automatisiert werden, wobei eine wirksame und gleichzeitige Durchmusterung von umfangreichen Sätzen von Verbindungen möglich ist.
Wenn die Aktivität der Kandidaten-Verbindung(en) unbekannt ist, ermöglicht das Verfahren die Durchmusterung oder Identifizierung von Verfahren, die die ausgewählte Eigenschaft aufweisen (z.B. Stoffwechselaktivität). Alternativ kann, wenn die Aktivität (oder die Art der Aktivität) der Kandidaten-Verbindung(en) bekannt ist oder angenommen wird, das Verfahren verwendet werden, um die Aktivität weiter zu charakterisieren (hinsichtlich der Besonderheit, Wirksamkeit usw.) und/oder um die Aktivität durch die Überprüfung von Derivaten der Kandidaten-Verbindungen zu verbessern.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit Verfahren zur Durchmusterung, Identifizierung, Charakterisierung oder Verbesserung von neuroaktiven Verbindungen, d.h.
Verbindungen, die auf neuronalen Zellfunktionen aktiv wirken. Gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen neuroaktive Verbindungen jede Verbindung, die dazu in der Lage ist, eine oder mehrere Funktionen einer Zelle (insbesondere eines Neurons) zu ändern (z.B. wiederherzustellen oder zu korrigieren), besonders mit der Fähigkeit, mindestens einen Stoffwechselweg oder eine biologische oder funktionelle Eigenschaft eines Neurons zu ändern. Eine biologisch aktive Verbindung dieser Erfindung ist insbesondere eine Verbindung, die dazu in der Lage ist, das Überleben, die Entwicklung, das Wachstum, die Reifung, die Neurotransmission, den Tod oder die Regeneration eines kultivierten Neurons zu ändern (z.B. wiederherzustellen, zu korrigieren). Zum Beispiel ist eine biologisch aktive Verbindung dieser Erfindung eine Verbindung, die dazu in der Lage ist, einen normalen Phänotyp für ein verletztes Neuron wiederherzustellen oder zumindest teilweise die schädliche Wirkung einer Verletzung eines Neurons zu hemmen. Abhängig von der Situation kann die aktive Verbindung wegen ihrer Fähigkeit, einen Zellmechanismus zu unterdrücken oder zu aktivieren, wegen ihrer Fähigkeit, einen Stoffwechselweg zu stimulieren oder zu hemmen, eine biologische Eigenschaft wiederherzustellen, den Zelltod zu verhindern usw. ausgewählt werden.
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die aktiv auf eine neuronale Zellfunktion wirken, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

– Verwendung einer rein isolierten neuronalen Population, gewonnen aus einem isolierten Tiernervengewebe,
– Direkte Kultivierung dieser neuronalen Population in vitro bei einer Zelldichte von 50 Neuronen/mm² oder weniger auf Mikrotiterplatten,
– Aussetzen der neuronalen Population an Behandlungen, die

Disregulation bewirken, vergleichbar mit solchen, die unter pathologischen Bedingungen angetroffen werden, nämlich Kultivierung der neuronalen Population unter Behandlung oder Bedingungen, die das Absterben induzieren,

– Paralleles in Kontakt bringen von Kulturen der behandelten Zellen mit mehreren unterschiedlichen Kandidaten-Verbindungen,
– Individuelle Messung des Wachstums oder Überlebens der Neuronen Zelle für Zelle, und
– Auswahl der Verbindungen, die aktiv auf das Überleben oder Wachstum wirken.

Wie weiter in dieser Anmeldung erörtert, werden die Zellen vorzugsweise in einer Vorrichtung mit zahlreichen Löchern kultiviert, insbesondere in Mikrotiterplatten. Außerdem wird die Funktion der Zellen in einer typischen Ausführungsform auf automatische Weise beobachtet (oder bewertet).
Die vorliegende Erfindung ist besonders für die Durchmusterung (oder Identifizierung, Charakterisierung oder Verbesserung) von Verbindungen geeignet, die aktiv auf das neuronale Überleben oder die neuronale Entwicklung wirken, die insbesondere das Überleben und/oder die Entwicklung von Neuronen verbessern.
Dementsprechend betrifft die Erfindung in einer besonderen Ausführungsform Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die das neuronale Überleben oder die neuronale Entwicklung von Zellen fördern.
Die vorliegende Erfindung ist auch besonders für die Durchmusterung (oder Identifizierung, Charakterisierung oder Verbesserung) von Verbindungen geeignet, die den programmierten Zelltod von Neuronen verhindern. In dieser Hinsicht kann die Verhinderung teilweise oder vollständig sein. Bevorzugt ausgewählte Verbindungen sind dazu in der Lage, den Zelltod von Neuronen im Vergleich zu unbehandelten Neuronen um mindestens 50% zu reduzieren (oder zu verzögern).
Ein bedeutender Vorteil der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von isolierten neuronalen Zellpopulationen, d.h. im Wesentlichen reine typenspezifische neuronale Kulturen. In der Tat beschreibt die vorliegende Erfindung nun die Aufreinigung mehrerer spezifischer neuronaler Zellpopulationen und führt vor, dass die Zellpopulationen in Kultur erhalten werden können, ohne ihren Phänotyp und ihre Funktion zu verlieren, und für Zwecke der Durchmusterung verwendet werden können. Die Erfindung führ weiter vor, dass derart spezifische neuronale Populationen verschiedenen Bedingungen und/oder Behandlungen ausgesetzt werden können, um ihre Stoffwechselwege zu ändern oder eine pathologische Situation zu induzieren. Die Erfindung ist besonders vorteilhaft, da die Verwendung von spezifischen neuronalen Populationen eine vorhersagende und verlässliche Bewertung der biologischen Aktivität einer Verbindung ermöglicht.
In der vorliegenden Erfindung können verschiedene aufgereinigte neuronale Populationen verwendet werden, darin eingeschlossen im Wesentlichen reine Kulturen vom Motonervenzellen, Vorderhirn-cholinergen Nervenzellen, hippokampus Nervenzellen, dopaminergen Nervenzellen, gabaergischen Nervenzellen, serotoninergen Nervenzellen, Kleinhirn-Körnerzellen, Kortexnervenzellen, Striatiumnervenzellen und retinalen Ganglienzellen. Bevorzugte Neuronen für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung umfassen Motoneuronen. In der Tat werden diese Neuronen bei Motoneuronerkrankungen oder bei neurodegenerativen Erkrankungen betroffen und stellen in hohem Masse vorhersagende Informationen hinsichtlich der Aktivität von Verbindungen bereit. Verbindungen, die aktiv auf die Neuronen wirken, stellen Kandidaten-Arzneimittel für die Behandlung von Motoneuronerkrankungen dar, darin eingeschlossen ALS oder potentielle Bleie zur Verwendung bei Bleioptimierungsprozessen, um derartige Arzneimittel zu erhalten. Andere bevorzugte Neuronen sind Neuronen, die von Fetalquellen isoliert werden, z.B. Vorderhirn-cholinergen Nervenzellen vom Vorderhirn (die verwendet werden können, um Verbindungen auszuwählen, die bei der Alzheimer'schen Krankheit aktiv wirken), hippokampus Nervenzellen (Alzheimer'sche Krankheit) und dopaminerge Nervenzellen (die verwendet werden können, um Verbindungen auszuwählen, die bei der Huntington'schen Krankheit, der Parkinson'schen Krankheit und der zerebralen Ischämie aktiv wirken).
Die isolierten Neuronen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können aus verschiedenen Quellen stammen, darin eingeschlossen Säugetiere (z.B. Nagetiere, Menschen, Primaten usw.), Hühner usw. Diese isolierten neuronalen Populationen können gemäß bestimmter Verfahren, die unten beschrieben werden, zubereitet werden.
In einer besonderen Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung das parallele in Kontakt bringen verschiedener Kandidaten-Verbindungen mit der isolierten neuronalen Zellpopulation. Wie oben angegeben, ist die vorliegende Erfindung insbesondere für den parallelen (optional simultanen) Test von mehreren verschiedenen Kandidaten-Verbindungen geeignet. In der Tat können ungefähr eine Million Neuronen aus einem Gehirn (oder fetalem Abfall) hergestellt werden, die etwa 10 000 Durchmusterungsproben ermöglichen In einer bevorzugten Ausführungsform werden parallel 1 bis 1000, allgemeiner 1 bis 500 und insbesondere 1 bis 100 verschiedene Kandidaten-Verbindungen getestet. In einem typischen Experiment werden die aufgereinigten Neuronen auf verschiedene Vorrichtungen verteilt (z.B. auf verschiedene Löcher einer Platte), und 1 bis 100 Verbindungen werden gleichzeitig auf ihre Neuroaktivität hin durchmustert.
Weiterhin umfasst in einer anderen besonderen Ausführungsform die vorliegende Erfindung das parallele in Kontakt bringen der Kandidaten-Verbindung(en) mit mehreren verschiedenen isolierten neuronalen Zellpopulation. Diese Ausführungsform ist besonders vorteilhaft, da sie die Bestimmung der Selektivität der Verbindungen oder ihr Aktivitätsprofil gegenüber verschiedenen Klassen von isolierten Neuronen ermöglicht. Die Erfindung umfasst somit auch die parallele Verwendung verschiedener Populationen von isolierten Neuronen, um die Selektivität einer Kandidaten-Verbindung zu bestimmen. Dieser Gesichtspunkt ist besonders vorteilhaft zur Auswahl von Verbindungen, die hinsichtlich spezifischer neuronaler Zellpopulationen aktiv und hinsichtlich anderer neuronaler Zellpopulationen inaktiv oder im Wesentlichen inaktiv wirken. In dieser Hinsicht wurde beschrieben, dass die Caspase-3-Desaktivierung den Tod von Neuronen im Gehirn, jedoch nicht von Motoneuronen verhindert. Auch zeigen jnk1/jnk2-doppeldefiziente Mäuse einen verringerten programmierten Zelltod im Hinterhirn und einen erhöhten programmierten Zelltod im Vorderhirn, was weiter die Selektivität gewisser Stoffwechselwege bei der Regulierung neuronaler Aktivität veranschaulicht. Durch die Bereitstellung von isolierten neuronalen Zellpopulationen ermöglicht die vorliegende Erfindung nun die Durchmusterung von Verbindungen, die die Funktion (z.B. Verhinderung des Zelltods) gewisser Arten von Neuronen betreffen können, ohne die Funktion anderer Arten von Neuronen zu betreffen. Ein bevorzugtes Verfahren dieser Erfindung umfasst daher das parallele in Kontakt bringen einer oder mehrerer Kandidaten-Verbindungen mit:

– Mindestens zwei verschiedenen neuronalen Zellpopulationen,

Vorzugsweise werden 2 bis 5, insbesondere 2 bis 3 verschiedene neuronale Zellpopulationen parallel getestet. In typischen Ausführungsformen werden mindestens zwei, vorzugsweise drei verschiedene neuronale Zellpopulationen, die aus Motonervenzellen, cholinergen Nervenzellen und hippokampus Nervenzellen ausgewählt wurden, parallel getestet. Der Begriff „parallel" gibt an, dass die Verbindung(en) getrennt bei den verschiedenen Populationen getestet wird/werden, vorzugsweise im Wesentlichen zur gleichen Zeit.
Außerdem können andere Zellpopulationen parallel getestet werden, darin eingeschlossen nicht-neuronale Zellpopulationen, um die Selektivität und/oder die Toxizität einer Testverbindung weiter zu bewerten.
In dieser Hinsicht betrifft eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung, zur Auswahl oder zur Charakterisierung einer Verbindung, die aktiv auf die neuronale Zellfunktion wirkt, umfassend das in Kontakt bringen einer oder mehrerer Kandidaten-Verbindungen parallel mit:

– mindestens einer, vorzugsweise mindestens zwei verschiedenen isolierten neuronalen Zellpopulationen, und
– mindestens einer nicht neuronalen Zellpopulation,

Bevorzugte nicht-neuronale Zellpopulationen umfassen z.B. hämatopoetische Zellen (wie z.B. T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Makrophagen, dendritische Zellen und Vorstufen davon), Darmgewebe, Leberzellen usw. In einer bevorzugten Ausführungsform werden mindestens hämatopoetische Zellen verwendet, die Informationen hinsichtlich der Selektivität und der potenziellen Toxizität der Verbindungen bereitstellen. Die nicht-neuronalen Zellen können primäre Zellkulturen sein, insbesondere menschlichen Ursprungs, oder Zelllinien, die davon abgeleitet sind. Die nicht-neuronalen Zellen und die neuronalen Zellen können autolog, allogen oder xenogen sein. In einer besonderen Ausführungsform stammen die neuronalen Zellen von Mäusen, und die nicht-neuronalen Zellen sind menschlichen Ursprungs.
In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Profilierung oder Bewertung des Toxizitätspotenzials einer Kandidaten-Verbindung, umfassend das parallele in Kontakt bringen der Verbindung mit einer isolierten neuronalen Zellpopulation und mindestens eine Zellpopulation, die aus hämatopoetischen Zellen, Darmgewebe und Leberzellen ausgewählt wurde.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung oder Auswahl von Verbindungen, die den programmierten Zelltod von Neuronen verhindern, umfassend das in Kontakt bringen einer Testverbindung parallel mit:

– einer isolierten neuronalen Zellpopulation und
– einer nicht-neuronalen Zellpopulation, vorzugsweise einer hämatopoetischen Zellpopulation, insbesondere einer Population von T-Lymphozyten, und Auswahl der Verbindung, die dem programmierten Zelltod von Nervenzellen vorbeugt und im Wesentlichen dem programmierten Zelltod von nicht-neuronalen Zellpopulation nicht vorbeugt.

Allgemeiner ermöglicht die vorliegende Erfindung die Durchmusterung von Verbindungen, die selektiv den Stoffwechsel (z.B. das Überleben, die Entwicklung usw.) von neuronalen und/oder nicht-neuronalen Zellpopulationen betrifft.
In einer spezifischen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur schnellen Durchmusterung von Verbindungen, die aktiv auf das Überleben oder die Entwicklung von Motonervenzellen wirken, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

– Aufreinigen von ausreichenden Mengen an reinen Motonervenzellen aus einem isolierten Tiernervengewebe, gewonnen aus einem nicht-transgenen nicht-humanen Säugetier,
– Kultivierung der neuronalen Population in vitro auf Mikrotiterplatten, die vorzugsweise 384 Löcher oder mehr enthalten,
– Aussetzen der neuronalen Population an Behandlungen, die Disregulation bewirken, vergleichbar mit 20 solchen, die unter pathologischen Bedingungen angetroffen werden, nämlich Kultivierung der neuronalen Population unter Behandlung oder Bedingungen, die das Absterben induzieren,
– Paralleles in Kontakt bringen von Kulturen der behandelten Zellen mit 1 bis 1000 unterschiedlichen Kandidaten-Verbindungen,
– Individuelle Messung des Wachstums oder Überlebens der Neuronen Zelle für Zelle, und
– Auswahl der Verbindungen, die aktiv auf das Überleben oder Wachstum wirken.

Bereitstellung von isolierten neuronalen Populationen
Isolierte, spezifisch neuronale Populationen können aus verschiedenen Säugetierarten unter Verwendung verschiedener biologischer Ausgangsmaterialien hergestellt werden. Insbesondere können die isolierten Neuronen von verschiedenen Geweben zubereitet werden, darin eingeschlossen der Gehirnbereich, das Rückenmark, die Ganglien und dergleichen, in verschiedenen Entwicklungsstadien. Vorzugsweise werden die Neuronen jedoch von unreifen (z.B. fetalen) Geweben zubereitet, die die Herstellung von lebensfähigen neuronalen Kulturen ermöglichen
Bevorzugte Quellen von Neuronen umfassen Nagetiere (insbesondere Mäuse und Ratten). Alternativ können die neuronalen Populationen von Hühnern oder anderen Tierarten zubereitet werden.
Das biologische Material (Nervengewebe) kann auch von vorher modifizierten Tieren (darin eingeschlossen transgenen Tieren), kranken Tieren oder Tieren erhalten werden, die modifiziert wurden, um die Forschungen zu erleichtern, und z.B. für die Aufreinigung von spezifischen Neuronen „gekennzeichnet" wurden. Es ist vorteilhaft, als Neuronenquelle ein transgenes Tier zu verwenden, in dem ein Membranprotein, das normalerweise bei Neuronen nicht vorhanden ist, unter der Kontrolle eines neuronenspezifischen Promotors, z.B. des Dopadecarbozylase-Promotors, ausgedrückt wird. Die gekennzeichneten Neuronen (z.B. die dopaminergen Nervenzellen) können dann leicht unter Verwendung eines Antikörpers zu dem Protein aufgereinigt werden.
Diese Anmeldung offenbart eine im Wesentlichen reine Kultur von isolierten hippokampus Nervenzellen. Eine weitere spezifische Aufgabe dieser Anmeldung ist eine im Wesentlichen reine Kultur von isolierten Vorderhirncholinergen Nervenzellen. Die oben erwähnten Kulturen sind Kulturen mit geringer Zelldichte, die weniger als ungefähr 50 Neuronen/mm² enthalten. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwenden Neuronenkulturen mit einer Zelldichte von weniger als ungefähr 25 Neuronen pro mm², vorzugsweise von weniger als 15 Neuronen pro mm², insbesondere von weniger als 10 Neuronen pro mm². Wie unten angegeben, schlägt die Erfindung nun vor, Verbindungen mit Neuronenzellkulturen mit geringer Dichte zu durchmustern, was die Durchführung einer individuellen Zellanalyse, niedrigere Kosten, eine höhere Anzahl von Experimenten aus einer einzigen Zubereitung und die Messung einer biologisch relevanteren Reaktion ermöglicht.
In einer spezifischen Ausführungsform werden die isolierten aufgereinigten Neuronen dieser Erfindung aus einem isolierten tierischen Nervengewebe aus einem genetisch veränderten Tier erzeugt, insbesondere aus einem Tier, das genetisch verändert wurde, um ein Markierungsmolekül auf spezifischen neuronalen Populationen auszudrücken.
Um isolierte neuronale Populationen oder Kulturen herzustellen, wird das gesammelte biologische Material im Allgemeinen einer Dissektion, mechanischen Behandlung und/oder enzymatischen Verdauung unterzogen, um die Zellen zu trennen. Die Zellen können dann durch Zentrifugierung und/oder Zellsortierung (darin eingeschlossen immunomagnetische Sortierung) getrennt werden. Die Zentrifugierung wird vorzugsweise als Gradientenzentrifugierung z.B. in Metrizamid durchgeführt. Wenn das Nervengewebe von genetisch veränderten Tieren erhalten wurde, wie oben beschrieben, kann die immunogenetische Sortierung auf der Grundlage von spezifischen Markierungen durchgeführt werden, die durch die spezifischen neuronalen Populationen ausgedrückt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die isolierten neuronalen Zellpopulationen aus fetalem Nervengewebe hergestellt. In einem besonderen Verfahren werden die isolierten neuronalen Zellpopulationen durch mechanische und/oder chemische und/oder enzymatische Behandlung von fetalem Nervengewebe hergestellt. Die Erfindung zeigt in der Tat, dass funktionelle, lebensfähige neuronale Zellpopulationen aus Nervengeweben in bestimmten Reifestadien erhalten werden können.
Im Allgemeinen können ausgehend von einem Tierabfall (z.B. einem Nagetier) bis zu 1 Million isolierter Neuronen verschiedener Arten hergestellt werden, die die Durchführung von ungefähr 50 000 Tests ermöglichen. In einer besonderen Ausführungsform werden mehrere verschiedene neuronale Zellpopulationen aus einem fetalen Nagetier hergestellt, die in parallelen Durchmusterungsproben gemäß dieser Erfindung verwendet werden.
Die isolierten aufgereinigten Neuronen können in einer In-vitro-Kultur in verschiedenen Nährmedien, die für Säugetierzellen geeignet sind, erhalten werden, darin eingeschlossen Neurobasal- oder L15-Medien (Life Technologies, Rockville, Maryland), die durch verschiedene Verbindungen ergänzt werden können, darin eingeschlossen Antibiotika, Vitamine, trophische Faktoren, fetales Serum usw. Vorzugsweise werden die Zellen in Neurobasalmedium, ergänzt durch Nährstoffe und Wachstumsfaktoren, kultiviert. Die Zellen können mehrere Tage oder Wochen erhalten werden, ohne ihre Eigenschaften zu verlieren. Vorzugsweise werden sie kurz nach ihrer Herstellung verwendet, d.h. vorzugsweise innerhalb einer Woche nach der Herstellung.
Die Erfindung zeigt nun, dass isolierte Neuronen mit geringer Zelldichte kultiviert werden können, was die industrielle Durchmusterung gemäß der vorliegenden Erfindung erleichtert. Kulturen mit geringer Zelldichte dieser Erfindung enthalten weniger als ungefähr 50 Neuronen pro mm², vorzugsweise weniger als ungefähr 25 Neuronen pro mm², insbesondere weniger als ungefähr 10 Neuronen pro mm². Die neuronale Population wird vorzugsweise in vitro auf Mikrotiterplatten, die vorzugsweise 384 Löcher oder mehr enthalten, kultiviert. Die Erfindung zeigt, dass aus einem Tierabfall Kulturen mit geringer Dichte zubereitet und auf Mikrotiterplatten verteilt werden können, insbesondere Mikrotiterplatten mit mehr als 384 Löchern, wodurch eine wirksame und schnelle Durchmusterung von Verbindungen ermöglicht wird.
Behandlung der Neuronen
Bei den Durchmusterungsversuchen dieser Erfindung werden die Neuronen im Allgemeinen Bedingungen und/oder Behandlungen unterzogen, die eine Disregulation bewirken, vergleichbar mit denjenigen, die bei pathologischen Bedingungen angetroffen werden. Die Neuronen werden Bedingungen und/oder Behandlungen unterzogen, die ihre Funktion, insbesondere ihr Überleben oder ihre Entwicklung (z.B. das Wachstum) verändern. Diese umfassen chemische, physische, genetische und/oder enzymatische Behandlungen, ebenso wie kulturspezifische Bedingungen der Kultur (Temperatur, Umfeld usw.).
Spezifische Behandlungen oder Bedingungen umfassen eine Kultur in Anwesenheit von Absterbe-Induktoren, Apoptose(d.h. programmierten Zelltod)Induktoren, Glutamatagonisten, Stimulierung von Fas- und anderen proapoptotischen Rezeptoren, Entzug des tropischen Faktors usw.
Bevorzugte Absterbe-Induktor-Behandlungen oder -bedingungen umfassen:
Trophischer Entzug: Wachsende Zellen bei fehlenden neurotrophischen Faktoren, was zu schnellem neuronalen Zelltod führt. Trophische Faktoren sind z.B. CNTF (Sendtner et al. (1992) Nature 358, 502–4), BDNF, oder GDNF (Henderson et al. (1994) Science 266, 1062–1064). Trophischer Entzug wird z.B. in Beispiel 4 veranschaulicht – vergleiche Neurobasal mit BDNF).
Glutamattoxizität: Domoinsäure ist ein Glutamatrezeptor-Agonist, der keine Herunterregulierung von Glutamatrezeptoren verursacht (wie es bei Glutamat selbst der Fall ist). Domoinsäure bei 10^–5 M führt zu einem Verlust von mehr als 50% der Motoneuronen nach 24 Stunden (siehe Beispiel), mit noch dramatischeren Wirkungen nach längeren Inkubationen.
Aβ-Peptide: Amyloide β-Peptide werden im Gehirn von Patienten mit der Alzheimer'schen Krankheit abgelagert, und es ist bekannt, dass sie für differenzierte Hippocampus-Neuronen in Kultur toxisch sind (z.B. Yankner et al. (1990) Science 250, 279–282). Es handelt sich um ein sehr gut gesichertes (und gut untersuchtes) In-vitro-Modell des Zelltods bezüglich der Alzheimer'schen Krankheit.
Ein weiterer bevorzugter Weg, die Neuronen zu verändern, liegt darin, Neuronen mit Nukleinsäuresequenzen einzuschleusen, die menschliche Krankheitsprozesse imitieren. Ein bevorzugter Vektor ist ein rekombinanter lentiviraler Vektor (z.B. eine rekombinante Nukleinsäure oder Sequenz, die in einen rekonstituierten lentiviralen Partikel eingebaut ist).
Ein weiterer bevorzugter Weg, um Neuronen zu verändern, liegt darin, Chemikalien oder Peptide in das Zytoplasma einzuführen, wobei z.B. Peptidvektoren verwendet werden. Ein bevorzugter Vektor ist Penetratin.
Diese verschiedenen Bedingungen und Behandlungen können getrennt oder in Kombinationen verwendet werden und können von Fachleuten je nach dem ausgewählten Profil der Verbindungen ausgewählt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform, in der Verbindungen gesucht werden, die neuronales Überleben oder neuronale Entwicklung fördern, umfassen die Behandlungen vorzugsweise trophischen Entzug, Glutamattoxizität oder Apoptoseinduktoren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, in der Verbindungen gesucht werden, die den programmierten Zelltod von Neuronen hemmen, umfasst die Behandlung vorzugsweise den Kontakt mit Apoptoseinduktoren oder dem Entzug von trophischen Faktoren.
In Kontakt bringen von Zellen mit den Verbindungen
Die Durchmusterungsverfahren dieser Erfindung umfassen einen Schritt des In-Kontakt-Bringens der Kandidaten-Verbindungen mit den ausgewählten isolierten neuronalen Zellpopulationen. Die Verbindungen können für verschiedene Zeiträume in Kontakt gebracht werden, je nach ihrer Wirkung, Konzentration, der neuronalen Population und/oder der Bewertungstechnik.
Im Allgemeinen werden die Zellen der/den Kandidaten-Verbindung(en) zwischen 1 nM und 1 mM ausgesetzt. Es sollte davon ausgegangen werden, dass andere Konzentrationen getestet werden können, ohne von der unmittelbaren Anwendung abzuweichen. Weiterhin kann jede Verbindung parallel bei verschiedenen Konzentrationen getestet werden.
Weiterhin können, falls erforderlich, verschiedene Zusätze und/oder Vektoren und/oder Produkte, die den Verbindungen helfen, in die Zellen einzudringen, hinzugefügt werden, darin eingeschlossen Liposome, kationische Lipide oder Polymere, Penetratin, Tat PDT, Peptide von Adenoviren (z.B. Penton oder Faser) oder andere Viren usw.
Das In-Kontakt-Bringen kann in jedem angemessenen Träger oder jeder angemessenen Vorrichtung durchgeführt werden, darin eingeschlossen Platten, Rohre, Kolben und dergleichen. Im Allgemeinen erfolgt das In-Kontakt-Bringen in Platten mit zahlreichen Löchern, die es ermöglichen, parallel zahlreiche Versuche durchzuführen. Typische Träger umfassen Mikrotiterplatten, insbesondere das 384-Löcher-Mikrotiterplatten-Format, das leicht gehandhabt und mit herkömmlicher Erregung leicht erleuchtet werden kann.
Vorzugsweise werden etwa 10 bis 200 isolierte Neuronen für jeden Durchmusterungspunkt in jedem geeigneten Nährmedium, wie oben beschrieben, verwendet. In dieser Hinsicht liegen ein besonderer Gesichtspunkt und ein besonderer Vorteil des Verfahrens gemäß dieser Erfindung in der Verwendung von geringen Anzahlen von Neuronen und/oder Neuronen, die mit einer geringen Zelldichte kultiviert wurden. In der Tat ist es durch die Verwendung von Neuronenkulturen mit geringer Zelldichte möglich, sehr hohe Anzahlen von Tests aus einer einzigen Zubereitung durchzuführen, wodurch einer höhere Reproduzierbarkeit und eine größere Wirtschaftlichkeit ermöglicht wird. Aber wichtiger ist, dass die Verwendung derartiger Neuronenzellkulturen mit geringer Dichte eine biologisch relevantere Reaktion bereitstellt. In der Tat wurde berichtet, dass Neuronen ihre eigenen Überlebensfaktoren produzieren, so dass Neuronen bei einer hohen Dichte ein besonderes Muster der Reaktion auf Stimuli an den Tag legen und eine erhöhte Resistenz gegen Apoptose oder den Entzug von trophischen Faktoren zeigen. Die Verwendung von Zellpopulationen mit geringer Dichte erleichtert somit die Vorbehandlung oder Konditionierung der Neuronen. Außerdem ermöglicht die Verwendung von Neuronenzellkulturen mit geringer Dichte gemäß dieser Erfindung die Durchführung einer individuellen Zellenanalyse (d.h. eine Beobachtung auf der Zellenebene). In dieser Hinsicht ist es nun möglich, die Aktivität einer Testverbindung durch die individuelle Analyse jeder einzelnen Zelle (oder die individuelle Analyse einiger der Zellen in der Kultur) zu überwachen, um eine präzise und zuverlässige Reaktion zu erhalten.
Die oben erwähnten Kulturen mit geringer Zelldichte enthalten weniger als ungefähr 50 Neuronen/mm². Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwenden Neuronenkulturen mit einer Zelldichte von weniger als ungefähr 25 Neuronen pro mm², vorzugsweise von weniger als 15 Neuronen pro mm², insbesondere von weniger als 10 Neuronen pro mm².
Aktivität der Verbindungen – Durchmusterung
Die Bestimmung des neuroaktiven Profils der Kandidaten-Verbindungen kann gemäß verschiedener Verfahren durchgeführt werden. Insbesondere können verschiedene Endpunkte gemessen werden, um die Neuroaktivität der Verbindungen zu bewerten, wie z.B.: Überleben, Expression von Antigenen, Transkription von spezifischen Genen, morphologische Änderungen – Größe, Wachstum von Neuriten usw.
Die Tests für die Aktivität auf Neuronen sind vorzugsweise:

– Der Calceinversuch zum Testen des Überlebens,
– Morphometrische Analyse wie z.B. Neuritlänge und/oder -verzweigung, die auf festen Neuronen unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Programmen durchgeführt werden kann, und
– Markierung von Antigenen durch Antikörper.

Vorzugsweise wird die Neuroaktivität der Kandidaten-Verbindungen bei fehlenden Verbindungen durch Vergleich mit neuronalen Kontroll-Zellpopulationen bestimmt und/oder bezüglich der Referenzverbindungen behandelt.
In einer besonderen Ausführungsform wird die Aktivität der Kandidaten-Verbindungen durch Vergleich des Überlebens der aufgereinigten Neuronen in Abwesenheit der Kandidaten-Verbindung mit dem Überleben bei Anwesenheit der Kandidaten-Verbindungen während des gleichen Zeitraums bestimmt.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform wird die Aktivität der Kandidaten-Verbindungen durch Vergleich der Expression eines zellulären Antigens in den aufgereinigten Neuronen in Abwesenheit der Kandidaten-Verbindung mit der Expression des zellulären Antigens bei Anwesenheit der Kandidaten-Verbindungen während des gleichen Zeitraums bestimmt.
Die Bestimmung des Status der Neuronen kann durch Bewertung verschiedener physischer Messungen, optischer Eigenschaften, Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen, Lumineszenz usw. durchgeführt werden. Es können verschiedene Instrumente verwendet werden, darin eingeschlossen Plattenleser, automatische Mikroskope, ausgestattet mit Lampen oder Lasern usw. Andere Techniken umfassen Lichterfassung durch eine gekühlte CCD-Kamera. Die gemessenen Signale können gemäß bekannter Techniken, z.B. unter Verwendung einer Software mit Pixelhistogramm, einer Clusteranalyse und einer Morphologieanalyse verarbeitet werden. Die Zellpopulation wird auf der Zellebene analysiert, d.h. einzeln Zelle für Zelle. In dieser Hinsicht ist es nun möglich, die Aktivität einer Testverbindung durch die individuelle Analyse jeder Zelle (oder die individuelle Analyse einiger der Zellen in der Kultur) zu überwachen, um eine präzise und zuverlässige Reaktion zu erhalten. Dies steht in deutlichem Kontrast zu vorhergehenden Verfahren auf der Grundlage der Überwachung von ganzen Zellpopulationen und nicht Zelle für Zelle. Das Verfahren dieser Erfindung ermöglich somit, die Aktivität einer Testverbindung durch die Beobachtung oder Überwachung jeder (oder einiger) individuellen Zellpopulation zu bestimmen. Durch eine derartige Bestimmung kann ein höheres spezifisches Signal erhalten werden, das nicht spezifische Hintergrundsignal reduziert werden, es ist informativer usw.
Wie oben angegeben ermöglicht die Erfindung nun eine schnelle und zuverlässige parallele Durchmusterung von großen Anzahlen von Kandidaten-Verbindungen einer oder mehrerer isolierter neuronaler Zellpopulationen. Die Verfahren sind vorausschauend, automatisch und für die Durchmusterung, Profilierung oder Verbesserung jeder Art von Verbindung geeignet und können verwendet werden, um neuroaktive Kandidaten-Arzneimittel zur Behandlung von degenerativen Störungen zu identifizieren.
In dieser Hinsicht offenbart die Anmeldung auch Ausrüstungen zur Verwendung bei der Bewertung der Neuroaktivität einer Kandidaten-Verbindung, umfassend eine isolierte neuronale Zellpopulation, einen Träger und, optional, Mittel zum Induzieren einer/von Stoffwechseländerung(en) an den Neuronen und/oder Mittel, um alle Stoffwechseländerungen in einer neuronalen Population zu bewerten.
Andere Gesichtspunkte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden im folgenden experimentellen Abschnitt offenbart, der als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung des Schutzumfanges der vorliegenden Anmeldung betrachtet werden sollte.
Erläuterung der Figuren
1: Bestimmung des Überlebens isolierter Motoneuronen nach trophischem Entzug und Behandlung mit Natrium-Valproat (A) oder (4-carboxyphenyloxyamino) Butansäure (B).
2: Induzierung des Motoneuron-Zelltodes durch Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von Domoinsäure.
3: Beobachtung von Löchern mit Neuronen in einer Kultur mit geringer Dichte nach der Behandlung mit einer Testverbindung.
Beispiele
Beispiel 1: Aufreinigung von Motoneuronen der Ratte
Rückenmark wird von Embryos von Sprague-Dawley-Ratten des Tages E14,5 seziert (Camu et al., (1993) In: "Immunoselection Strategies for Neural Cell Culture", Neuroprotocols: A companion to Methods in Neurosciences 2, 191–199). Der hintere Teil des Rückenmarks wird abgeschnitten, und die Hirnhaut wird entfernt. Jedes Mark wird unter Verwendung eines Skalpells in Stücke geschnitten und 10 Minuten lang in 1 ml modifiziertes F10-Medium (Ca2+, Mg2+-frei, kein Glutamin oder Phenolrot), mit 0,025% Trypsin bei 37°C gegeben. Die Fragmente werden in 1 ml L15 mit 0,4% BSA und 0,1 mg/ml DNase übertragen und unter Verwendung eines blauen (1 ml) Hütchens trituriert. Die Zellen werden dann durch ein BSA (4% w/v) Kissen 5 Minuten lang bei 480 g zentrifugiert. Die kleinen Zellen werden unter Verwendung eines Metrizamid-(Serva)Dichtegradienten entfernt: 6,5% (w/v) Metrizamid wird unter die Zellsuspension gegeben und 15 Minuten lang bei 860 g zentrifugiert. Die großen Motoneuronen bleiben an der Schnittstelle zwischen dem Medium und dem Metrizamid, während die kleinen Zellen (darin eingeschlossen nicht neuronale Zellen) pelletiert werden. Die Zellen an der Schnittstelle werden gesammelt, gewaschen und dann weiter unter Verwendung einer magnetischen Zellsortierung aufgereinigt. Die Zellen werden primär mit dem Antikörper (Anti-Ratte p75 Antikörper [192]) 0,5% BSA in PBS inkubiert, gewaschen und mit Mikroperlen, die mit einem sekundären Ziegen-anti-Maus-Antikörper beschichtet sind, inkubiert. Nach 15 Minuten bei 4°C werden die Zellen wieder gewaschen und die Antikörper-gebundenen Zellen unter Verwendung eines starken Magnetfeldes getrennt.
Die Zellen werden durch ein BSA-Kissen zentrifugiert und erneut in ein Neurobasal-Medium, ergänzt mit B27 (Life Technologies), 2% Pferdeserum, 0,5 mM Glutamin, 25 μM 2-Mercaptoethanol, 25 μM Glutamat suspendiert. Die Zellen werden auf Schalen aufgebracht, die mit Polyornithin und Laminin (beide bei 3 μg/ml) beschichtet sind.
Beispiel 2: Aufreinigung von hippokampus Nervenzellen der Ratte
Dieses Verfahren basiert auf einer Veränderung der klassischen Hippocampus-Kulturen (Goslin & Banker (1990) In "Culturing nerve cells" (G. Banker & K. Goslin, Eds), pp251–281. MIT Press, Cambridge), jedoch unter Verwendung der Metrizamidgradienten (wie oben), um nicht neuronale Zellen und kleine Neuronen zu entfernen.
Hippocampi von 10–12 Rattenembryos (E18) werden in HBSS+ (Ca2+/Mg2+-frei HBSS, 7 mM HEPES, 4,5 g/L Glucose) seziert. Gewebe wird in 0,25% Trypsin 15 Minuten lang bei Raumtemperatur trypsiniert, dreimal mit HBSS+ gewaschen, dann mit Pasteur-Glaspipetten trituriert. Die Zellen werden dann durch ein BSA (4% (w/v) Kissen 5 Minuten lang bei 480 g zentrifugiert. Die kleinen Zellen werden unter Verwendung eines Metrizamid (Serva) Dichtegradienten entfernt: 6.5% (w/v) Metrizamid wird unter die Zellsuspension gegeben und 15 Minuten lang bei 860 g zentrifugiert. Die Neuronen bleiben an der Schnittstelle zwischen dem Medium und dem Metrizamid, während die kleinen Zellen (darin eingeschlossen nicht neuronale Zellen) pelletiert werden. Die Schnittstelle wird gesammelt und die Zellen werden durch ein BSA-Kissen zentrifugiert. Zellen werden auf Deckplättchen aufgebracht, die mit Polyornithin/Laminin beschichtet sind, und bei 37°C, 5% CO² in Neurobasal-Medium, ergänzt mit B27, 2% Pferdeserum, 0,2 mM Glutamin, 1 mM Pyruvat gezüchtet.
Beispiel 3: Aufreinigung von septalen cholinergen Nervenzellen
Septa von 10–12 Rattenembryos (E17) werden in HBSS+ (Ca2+/Mg2+-frei 20 HBSS, 7 mM HEPES, 4,5 g/L Glucose) seziert. Gewebe wird in 0,25% Trypsin 15 Minuten lang bei Raumtemperatur trypsiniert, dreimal mit HBSS+ gewaschen, dann mit Pasteur-Glaspipetten trituriert. Die Zellen werden dann durch ein BSA (4% (w/v) Kissen 5 Minuten lang bei 480 g zentrifugiert. Die kleinen Zellen werden unter Verwendung eines Metrizamid (Serva) Dichtegradienten entfernt: 6.5% (w/v) Metrizamid wird unter die Zellsuspension gegeben und 15 Minuten lang bei 860 g zentrifugiert. Die großen Neuronen bleiben an der Schnittstelle zwischen dem Medium und dem Metrizamid, während die kleinen Zellen (darin eingeschlossen nicht neuronale Zellen) pelletiert werden.
Die Zellen an der Schnittstelle werden gesammelt, gewaschen und dann weiter unter Verwendung einer magnetischen Zellsortierung aufgereinigt. Die Zellen werden primär mit dem Antikörper in 0,5% BSA in PBS inkubiert, gewaschen und mit Mikroperlen, die mit einem sekundären Antikörper beschichtet sind, inkubiert. Nach 15 Minuten bei 4°C werden die Zellen wieder gewaschen und die Antikörper-gebundenen Zellen unter Verwendung eines starken Magnetfeldes getrennt. Zellen werden auf Deckplättchen aufgebracht, die mit Polyornithin/Laminin beschichtet sind, und bei 37°C, 5% CO² in Neurobasal-Medium, ergänzt mit B27, 2% Pferdeserum, 0,2 mM Glutamin, 1 mM Pyruvat und NGF (50 ng/ml) gezüchtet.
Beispiel 4: Induktion des Zelltods bei Motoneuronen und Analyse des Überlebens
Motoneuronen der Ratte wurden isoliert und aufgereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben und 3 Tage lang in Neurobasal Medium ohne neurotrophische Faktoren (d.h. Entzug des trophischen Faktors) in Platten mit 4 Löchern in An- oder Abwesenheit des Testmoleküls gezüchtet. Der neurotrophische Faktor BDNF wird als positive Kontrolle für alle Experimente verwendet. 1A zeigt ein Beispiel eines kleinen Moleküls (Natrium-Valproa), das das Überleben von Motoneuronen beim Entzug des trophischen Faktors fördert. 1B zeigt ein Beispiel eines kleinen Moleküls, das keine Auswirkung auf das Überleben der Motoneuronen hat. 2 zeigt die Induzierung des Zelltods von Motoneuronen durch Glutamat-Toxizität. Motoneuronen wurden 3 Tage lang in vitro gezüchtet, dann wurde Domoinsäure in verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt, und die Anzahl der überlebenden Motoneuronen wurde nach 26 Stunden gezählt.
Das Überleben kann auch durch die Verwendung von Calceinmarkierung nachverfolgt werden: Zellen werden mit einer endgültigen Konzentration von 4 μM Calcein-AM (molekulare Sonde) in Medium behandelt und bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Das Medium wird entfernt, die Zellen mit 20% Glycerol in L15 (ohne Phenolrot) gespült, und die Zellen werden durch Zählen der fluoreszenten Zellen analysiert.
3 stellt zwei 9 mm²-Löcher einer Mikrotiterplatte (384 Löcher) dar, die Kulturen von isolierten Neuronen gemäß dieser Erfindung mit geringer Dichte umfasst. Die Kulturen werden einem Entzug des Wachstumsfaktors unterzogen, um Apoptose zu induzieren, und mit BDNF behandelt oder nicht. Wie in 3A gezeigt, schützt die Behandlung mit BDNF die Neuronen wirksam (es sind 73 Neuronen vorhanden, die individuell beobachtet und/oder überwacht werden können), während bei Abwesenheit einer aktiven Verbindung 18 Neuronen vorhanden sind (3B). Die Ausschlussschwelle liegt unter 300 μm². Diese Ergebnisse veranschaulichen weiter die Fähigkeit der Erfindung, Kulturen von isolierten, spezifischen Neuronen mit geringer Dichte zu verwenden, um Testverbindungen auf der Grundlage eines hohen Durchsatzes durch individuelle Zellüberwachung zu analysieren.

Claims

Ein Verfahren zum schnellen Durchmustern auf Verbindungen, die aktiv auf neuronales Überleben oder neuronaler Entwicklung wirken, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: – Verwendung einer rein isolierten neuronalen Population, gewonnen aus einem isolierten Tiemervengewebe, – Direkte Kultivierung dieser neuronalen Population in vitro bei einer Zelldichte von 50 Neuronen/mm² oder weniger auf Mikrotiterplatten, – Aussetzen der neuronalen Population mit Behandlungen, die Disregulation bewirken, vergleichbar mit solchen, die unter pathologischen Bedingungen angetroffen werden, nämlich Kultivierung dieser neuronalen Population unter Behandlung oder Bedingungen, die das Absterben induzieren, – Paralleles in Kontakt bringen von Kulturen der behandelten Zellen mit mehreren unterschiedlichen Kandidaten-Verbindungen, – Messung des Wachstums oder Überlebens der Nervenzelle anhand der Zelle als Einzelne, und – Auswahl der Verbindungen, die aktiv auf Überleben oder Wachstum wirken.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die neuronale Zellpopulation einen Nagetier Ursprung hat.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei die neuronale Zellpopulation aus einer Wildtyp-, transgenen, pathologischen oder modifizierten Maus aufgereinigt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die neuronale Zellpopulation einen menschlichen Ursprung hat.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die kultivierten Nervenzellen Kandidaten-Verbindungen in einem Bereich von 1 nM bis 1 mM ausgesetzt werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die kultivierten Nervenzellen parallel mit 1 bis 1000 verschiedener Kandidaten-Verbindungen in Kontakt gebracht werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Aktivität der Kandidaten-Verbindungen durch Vergleich des Überlebens dieser Nervenzellen in Abwesenheit von den Kandidaten-Verbindungen mit dem Überleben der in Anwesenheit dieser Kandidaten-Verbindungen über denselben Zeitraum untersucht wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die neuronale Population ausgewählt ist aus isolierten Motonervenzellen, hippokampus Nervenzellen, Vorderhirncholinergen Nervenzellen, dopaminergen Nervenzellen, gabaergischen Nervenzellen, serotoninergen Nervenzellen, Kleinhirn Körnerzellen, Kortexnervenzellen, Striatiumnervenzellen und retinalen Ganglienzellen.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Identifizierung, Auswahl oder Charakterisierung einer Verbindung, die dem programmierten Zelltod von Nervenzellen vorbeugt und nicht dem programmierten Zelltod von einer nicht-neuronalen Zellpopulation, insbesondere von einem T-Lymphozyten, vorbeugt.
Ein Verfahren zum schnellen Durchmustern auf Verbindungen, die aktiv auf neuronales Überleben oder neuronaler Entwicklung wirken, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Aufreinigen von ausreichenden Mengen an reinen Motonervenzellen aus einem isolierten Tiemervengewebe, gewonnen aus einem nicht-transgenen nicht-humanen Säugetier, – Direkte Kultivierung dieser neuronalen Population in vitro bei einer Zelldichte von 50 Neuronen/mm² oder weniger auf Mikrotiterplatten, bevorzugt mit 384 Löchern oder mehr, – Aussetzen der neuronalen Population mit Behandlungen, die Disregulation bewirken, vergleichbar mit solchen, die unter pathologischen Bedingungen angetroffen werden, nämlich Kultivierung dieser neuronalen Population unter Behandlung oder Bedingungen, die das Absterben induzieren, – Paralleles in Kontakt bringen von Kulturen der behandelten Zellen mit 1 bis 1000 unterschiedlichen Kandidaten-Verbindungen, – Messung des Wachstums oder Überlebens der Nervenzelle anhand der Zelle als Einzelne, und – Auswahl der Verbindungen, die aktiv auf Überleben oder Wachstum wirken.