DE60117701T2 - Testverfahren für agonisten oder antagonisten der bindung von dynorphin a an den mas-rezeptor - Google Patents

Testverfahren für agonisten oder antagonisten der bindung von dynorphin a an den mas-rezeptor Download PDF

Info

Publication number
DE60117701T2
DE60117701T2 DE60117701T DE60117701T DE60117701T2 DE 60117701 T2 DE60117701 T2 DE 60117701T2 DE 60117701 T DE60117701 T DE 60117701T DE 60117701 T DE60117701 T DE 60117701T DE 60117701 T2 DE60117701 T2 DE 60117701T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
test compound
dynorphin
mas receptor
cell
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE60117701T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60117701D1 (de
Inventor
Sultan AstraZeneca R & D Montreal St-Laurent AHMAD
Eric AstraZeneca R & D Montreal St-Laurent GRAZZINI
Paola AstraZeneca R & D Montreal St-Laurent LEMBO
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AstraZeneca AB
Original Assignee
AstraZeneca AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AstraZeneca AB filed Critical AstraZeneca AB
Application granted granted Critical
Publication of DE60117701D1 publication Critical patent/DE60117701D1/de
Publication of DE60117701T2 publication Critical patent/DE60117701T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9486—Analgesics, e.g. opiates, aspirine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9406—Neurotransmitters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/665—Assays involving proteins derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/988—Lyases (4.), e.g. aldolases, heparinase, enolases, fumarase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

  • Technisches Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Testverfahren, mit denen sich bestimmen läßt, ob eine Testverbindung zur Modulation der Bindung und Aktivität von Dynorphin A und Analogen am menschlichen MAS-Rezeptor verwendet werden kann. Als effektive Modulatoren identifizierte Verbindungen besitzen eine potentiell Verwendung als Therapeutika bei der Behandlung von Schmerzen, neuropathischen und entzündlichen Erkrankungen, Lern- und Gedächtnisstörungen, Angstzuständen ebenso wie bei der Regulation von Herzkreislauffunktionen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • A. Dynorphin A
  • Im Jahr 1979 wurde entdeckt, daß es sich bei Dynorphin um ein endogenpotentes Opioidpeptid handelt (PNAS, USA 76: 6666–6670:1979). Die pharmakologischen Wirkungen von Dynorphinen sind ziemlich umfangreich. So konnte gezeigt werden, daß Dynorphin A und verwandte Peptide bei einer ICV-Verabreichung eine mäßige Wirksamkeit in der nichtthermischen und mechanischen Analgesie aufweisen (Dubner, R., Trends Neurosci. 15:96–103, 1992), und sie wurden auch im klinischen Bereich zur Behandlung hartnäckiger Schmerzen bei Krebspatienten eingesetzt (Wen, H.L., Central and peripheral Endorphins: basic and clinical aspects, New York: Raven Press; 1993:319–323). Ebenso ist bekannt, daß Dynorphine eine Wirkung auf das Herzkreislaufsystem über die zentralen und peripheren Nervensysteme ausüben (Dumont, M. 37:1–33, 1996). Zudem besitzt Dynorphin A eine immunmodulatorische Aktivität. Wurde Dynorphin A an Mäuse verabreicht, so wurde die Phagozytose in den peritonealen Makrophagen der Maus verbessert. Diese phagozytische Aktivität wurde durch Behandlung mit Naloxon nicht gehemmt, was auf die Beteiligung eines nichtopioiden Rezeptors hindeutet (J. Neuroimmunol. 60:37–43, 1995).
  • Zwar wurde Dynorphin A zuerst als ein potentes opioides Peptid mit Selektivität für den Kappa-Opioid-Rezeptor beschrieben, doch ist vorgeschlagen worden, daß seine pathologischen und physiologischen Wirkungen von Nicht-Opioidrezeptoren vermittelt werden. Somit wird hier zum erstenmal die Fähigkeit von Dynorphin A, an den MAS-Rezeptor zu binden und diesen zu aktivieren, beschrieben.
  • Der menschliche MAS-Onkogenrezeptor wurde zuerst im Jahr 1986 über einen Tumorgenitätstest in Nacktmäusen isoliert (Young, M., Cell, 45:711–719, 1986). Dieser Rezeptor codiert für ein Protein mit sieben Transmembrandomänen, wobei in dessen codierender Sequenz ein kennzeichnendes Merkmal, wie beispielsweise das NPY-Motiv in der siebten Transmembrandomäne, vorhanden ist. Der MAS-Rezeptor wird im zentralen Nervensystem (ZNS) exprimiert, wobei das höchste Signal der mRNA im Hippocampus, Kortex, Zerebellum, piriformen Kortex und Bulbus Olfactorius beobachtet wird. Die mRNA für diesen Rezeptor wurde auch in peripheren Geweben, einschließlich Hoden, Niere und Herz, nachgewiesen (FEBS Letters, 357, 27–32, 1995). Die Expression des MAS-Rezeptors ist während der Entwicklung und neuronalen Aktivität stark reguliert. Interessanterweise zeigten Mäuse, denen das MAS-Protoonkogen fehlte, nicht nur eine erhöhte Unruhe, sondern die Langzeitpotenzierung verlängerte sich, ohne sich auf die Gesamtmorphologie des Hippocampus auszuwirken (JBC, 273, 11867–11873, 1998).
  • Somit könnten auf den MAS-Rezeptor als Agonisten, Antagonisten oder inverse Agonisten gerichtete Arzneistoffe potentiell zur Behandlung von Problemen von Langzeitgedächtnis-, neuropathischen und entzündlichen Störungen ebenso wie einer Herzkreislauffunktionsstörung eingesetzt werden.
  • B. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
  • G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden eine Familie von Proteinen, die eine gemeinsame strukturelle Organisation teilen, die durch ein extrazelluläres N-terminales Ende, sieben hydrophobe Alpha-Helices, die mutmaßlicherweise Transmembrandomänen ausbilden, sowie eine intrazelluläre C-terminale Domäne gekennzeichnet ist. GPCRs binden eine große Vielfalt von Liganden, die intrazelluläre Signale durch die Aktivierung transduzierender G-Proteine auslösen (Caron, et al., Rec. Prog. Horm. Res. 48:277–290 (1993); Freedman, et al., Rec. Prog. Horm. Res. 51:319–353 (1996)).
  • Bisher konnten mehr als 300 GPCRs kloniert werden, wobei allgemein angenommen wird, daß weit über 1000 derartige Rezeptoren existieren. Etwa 50–60% aller klinisch relevanten Arzneistoffe wirken über die Modulation der Funktionen verschiedener GPCRs (Gudermann et al., J. Mol. Med. 73:51–63 (1995)). Viele der klinisch relevanten Rezeptoren sind im zentralen Nervensystem lokalisiert.
  • Unter den GPCRs, die identifiziert und kloniert wurden, befindet sich ein Gen, das für ein zu den Rezeptoren der DRR/RTA-Familie homologes Protein kodiert. Dieser Rezeptor wurde von uns MAS-Rezeptor genannt, wobei die Struktur des Gens, wie es im Menschen existiert, beschrieben wurde. Allerdings konnte der endogene Ligand für diese Familie von Rezeptoren bisher noch nicht identifiziert werden (Cell:45, 711–719 1986, JBC 273, 11867–11873 1998, WO 99/32519).
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß Dynorphin A und seine Analogen (Dynorphin A-Amid und Dynorphin 1–13) den MAS-Rezeptor der Ratte und des Menschen aktivieren. Dabei können rekombinante Zellen, die den MAS-Rezeptor entweder aus der Ratte oder dem Menschen exprimieren, in Verbindung mit Dynorphin A und seinen Analogen in zur Identifizierung von Agonisten, inversen Agonisten und Antagonisten vorgesehenen Screening-Tests verwendet werden. Somit bezieht sich in ihrem ersten Aspekt die Erfindung auf ein Verfahren zum Testen einer Testverbindung auf ihre Fähigkeit zur Bindung an den MAS-Rezeptor. Dies wird dadurch erreicht, daß man das Rezeptorgen exprimierende Zellen oder Membranen mit Dynorphin A und seinen Analogen sowie der Testverbindung inkubiert. Anschließend wird der Grad der Verdrängung der Bindung des Dynorphin A und seiner Analogen bestimmt. Dabei können Radioligandentests oder ELISA-Tests (enzyme-linked immunosorbent assays) durchgeführt werden, bei denen entweder Dynorphin A und seine Analogen oder die Testverbindung nachweisbar markiert ist. Obwohl eine beliebige, den MAS-Rezeptor exprimierende Zelle verwendet werden kann, ist eine rekombinante Zelle, die ein heterologes MAS-Rezeptorgen entweder aus der Ratte oder dem Menschen exprimiert, bevorzugt. Dabei bezieht sich der Begriff "heterolog", wie er hier verwendet wird, auf ein beliebiges MAS-Rezeptorgen, das in eine Zelle transfiziert wird, d.h. der Begriff bezieht sich auf einen beliebigen nichtendogenen MAS-Rezeptor.
  • Die Erfindung umfaßt ebenso Verfahren auf Grundlage eines Funktionstests zur Bestimmung davon, ob es sich bei einer Testverbindung um einen Agonisten, Antagonisten oder inversen Agonisten der Bindung von Dynorphin A und seinen Analogen handelt. Dabei besteht ein Weg zur Durchführung solcher Tests darin, eine den MAS-Rezeptor exprimierende Zelle mit der Testverbindung zu inkubieren und anschließend zu bestimmen, ob intrazelluläre Phospholipase C, Adenylcyclase-Aktivität oder intrazelluläre Calciumkonzentrationen moduliert werden. Dabei sollten die Ergebnisse typischerweise mit denjenigen Ergebnissen, die erhalten werden, wenn Inkubationen auf ähnliche Weise, jedoch in Abwesenheit der Testverbindung durchgeführt werden, verglichen werden. Im allgemeinen werden Funktionstests dieser Art in Verbindung mit Bindungstests der oben beschriebenen Art durchgeführt. Als Zelle wird zur Verwendung in den Tests eine rekombinante Zelle bevorzugt, die mit einem MAS-Rezeptorgen transformiert wurde. Als Agonisten wirkende Testverbindungen sollten eine Erhöhung der Phospholipase C, eine Abnahme oder Erhöhung der Adenylylcyclase-Aktivität oder eine Erhöhung der intrazellulären Calciumspiegel produzieren. Inverse Agonisten können die Phospholipase-C-Aktivität oder intrazellulären Calciumspiegel erniedrigen, insbesondere, wenn Tests in Gegenwart einer festen Menge an Dynorphin A und seinen Analogen durchgeführt werden. Antogonisten sollten die Bindung von Dynorphin A und seinen Analogen an den Rezeptor blockieren, jedoch nicht die entgegengesetzte Reaktion bezüglich Phospholipase-C-Aktivität oder intrazellulärem Calcium produzieren, die das Kennzeichen eines inversen Agonisten ist.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Tests, die sich zum Screening von Verbindungen auf deren Fähigkeit zur Modulation der Bindung von Dynorphin A und seinen Analogen an die MAS-Rezeptoren der Ratte und des Menschen verwenden lassen. Dabei können Dynorphin A und seine Analogen oder Fragmente in beliebiger Form verwendet werden (Dynorphin A: YGGFLRRIRPKLKWDNQ-COOH oder NH2). Derartige Peptide können kommerziell erhalten (z.B. Bachem, American Peptide Company) oder mit im Fachgebiet allgemein bekannten Standardmethoden synthetisiert werden. Das Peptid kann nachweisbar mit Radioisotopen, wie z.B. 125I, markiert werden, oder es können als Alternative Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzmarkierungen eingebaut werden. Ebenso kann das Peptid mit Enzymen verknüpft werden, die leicht nachweisbar sind, wie z.B. Meerrettich-Peroxidase.
  • Der MAS-Rezeptor kann aus Zellen/Geweben der Ratte und/oder des Menschen unter Verwendung des bei Young, M., Cell, 45:711–719, 1986 beschriebenen Verfahrens kloniert werden. Der Beispielteil enthält eine ausführliche Beschreibung einer Verfahrensweise, die bei der Klonierung des MAS-Rezeptors verwendet werden kann. Nach Erhalten der MAS-Rezeptorsequenz sollte diese in einen Expressionsvektor mit einem in Säugerzellen aktiven Promotor eingebaut werden (Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press (1989)). Zu verwendbaren Promotoren gehören beispielsweise der des Metallothionein-I-Gens der Maus (Hamer, et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273–288 (1982)); der "immediate-early" und TK-Promotor aus Herpesvirus (Yao, et al., J. Virol. 69:6249–6258 (1995); McKnight, Cell 31:355–365 (1982)); der frühe SV 40-Promotor (Benoist, et al., Nature 290:304–310 (1981)); und der CMV-Promotor (Boshart, et al., Cell 41:521–530 (1985)). Vektoren können auch Enhancer und andere Regulationselemente enthalten.
  • Nach der Konstruktion von Expressionsvektoren können diese in eine Säugerzelllinie mit Verfahren, wie beispielsweise Calciumphosphatpräzipitation, Mikroinjektion, Elektroporation, Liposomentransfer, Virustransfer oder partikelvermitteltem Gentransfer, eingeführt werden. Obwohl andere Säugerzellen verwendet werden können, stellte sich heraus, daß HEK-293-Zellen erfolgreiche Ergebnisse liefern, wobei im Beispielteil eine Verfahrensweise zur Expression von MAS-Rezeptor in diesen Zellen beschrieben ist. Zur Selektion und zum Testen der Zellen auf die Expression von MAS-Rezeptor (z.B. mittels Northern-Analyse) können Standardverfahren durchgeführt werden.
  • Nach Erhalten des Dynorphin-A-Peptids (oder eines analogen Peptids) sowie von die MAS-Rezeptoren der Ratte und des Menschen exprimierenden Zellen können Tests durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob Testverbindungen irgendeinen Effekt auf die Bindung haben. Dabei können eine große Vielfalt unterschiedlicher Arten von Tests unter Verwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Standardverfahren durchgeführt werden. So werden beispielsweise in Radioliganden Bindungstests MAS-Rezeptor exprimierende Zellen mit Dynorphin A und seinen Analogen sowie mit einer auf Bindungsaktivität getesteten Verbindung inkubiert. Als Quelle für MAS-Rezeptor sind rekombinante transformierte HEK-293-Zellen bevorzugt. Es können auch andere Zellen verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie keine anderen Proteine, die Dynorphin A und seine Analogen stark binden, exprimieren. Dies läßt sich leicht bestimmen, indem man Bindungstests an mit MAS-Rezeptor transformierten Zellen durchführt und die erhaltenen Ergebnisse mit den bei Verwendung ihrer nichttransformierten Gegenstücke erhaltenen Ergebnissen vergleicht.
  • Tests können entweder unter Verwendung intakter Zellen oder mit aus den Zellen präparierten Membranen durchgeführt werden (siehe z.B. Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A: 90:10230–10234 (1993)). Wie oben vorgeschlagen, werden die Membranen, oder Zellen, mit Dynorphin A und seinen Analogen sowie mit einer Präparation der getesteten Verbindung inkubiert. Nach vollständiger Bindung wird der Rezeptor von der Liganden und Testverbindung enthaltenen Lösung getrennt, z.B. durch Filtration, und die Menge an stattgefundener Bindung bestimmt. Dabei wird der verwendete Ligand vorzugsweise mit einem Radioisotop, wie z.B. 125I, nachweisbar markiert. Es können jedoch auch falls gewünscht andere Arten von Markierungen verwendet werden. Zu den am häufigsten verwendeten Fluoreszenzmarkierungsverbindungen gehören Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin-o-Phthalaldehyd und Fluorescamin. Zu geeigneten Chemilumineszenzverbindungen zählen Luminol, Isoluminol, aromatischer Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalatester.
  • Nichtspezifische Bindung kann bestimmt werden, indem man die Bindungsreaktion in Gegenwart eines großen Überschusses an unmarkiertem Liganden durchführt. So können beispielsweise markiertes Dynorphin A und seine Analogen mit Rezeptor und Testverbindung in Gegenwart eines tausendfachen Überschusses an nichtmarkiertem Dynorphin A und/oder seinen Analogen inkubiert werden. Nichtspezifische Bindung sollte von der Gesamtbindung, d.h. Bindung in Abwesenheit von nichtmarkiertem Liganden, subtrahiert werden, um die spezifische Bindung für die jeweils getestete Probe zu erhalten. Die Tests können je nach Bedarf weitere Schritte, wie beispielsweise Waschen, Rühren, Schütteln, Filtern und dergleichen, beinhalten. Typischerweise werden Waschschritte nach der Trennung von membrangebundenen Liganden von in Lösung verbliebenen Liganden und vor der Quantifizierung der Menge an gebundenem Liganden, z.B. durch Zählen von radioaktivem Isotop, eingefügt. Die erhaltene spezifische Bindung in Gegenwart von Testverbindung wird mit der in Gegenwart von markiertem Liganden allein verglichen, um den Grad der Verdrängung der Rezeptorbindung durch die Testverbindung zu bestimmen.
  • Bei der Durchführung von Bindungstests muß darauf geachtet werden, Artifakte zu vermeiden, die es möglich machen, daß eine Testverbindung mit Rezeptor wechselzuwirken scheint, wenn tatsächlich die Bindung durch einen anderen Mechanismus gehemmt wird. So sollte die getestete Verbindung beispielsweise in einem Puffer vorliegen, der nicht selbst die Bindung von Dynorphin A und seinem Analogen weitgehend hemmt, und vorzugsweise bei mehreren unterschiedlichen Konzentrationen getestet werden. Präparationen der Testverbindung sollten auch auf proteolytische Aktivität untersucht werden, wobei es wünschenswert ist, daß die Tests Antiproteasen beinhalten. Schließlich ist es höchst wünschenswert, daß Verbindungen, bei denen festgestellt wurde, daß sie die Bindung von Dynorphin A und seine Analogen verdrängen, nochmals in einem Konzentrationsbereich untersucht werden, der zur Durchführung einer Scatchard-Analyse der Ergebnisse ausreicht. Diese Art von Analyse ist im Fachgebiet allgemein bekannt und läßt sich zur Bestimmung der Affinität einer Testverbindung für einen Rezeptor verwenden (siehe z.B. Ausubel, et al., Current Protocols and Molecular Biology, 11.2.1–11.2,19 (1993)); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Work, et al., Ed. N.Y. (1978)). Bei der Analyse der Ergebnisse können Computerprogramme behilflich sein (z.B. Munson, P., Methods Enzymol. 92:543–577 (1983)).
  • Je nach ihrer Wirkung auf die Aktivität des Rezeptors kann es sich bei Agentien, die die Bindung von Dynorphin A und seinen Analogen an Rezeptor hemmen, entweder um Agonisten oder Antagonisten handeln. Die Aktivierung von Rezeptor kann mit einer Reihe unterschiedlicher Verfahren verfolgt werden. So können beispielsweise Phospholipase-C-Tests durchgeführt werden, indem man Zellen in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte anzieht und dann die Vertiefungen in Gegenwart oder Abwesenheit von Testverbindungen inkubiert. Anschließend können Inositolphosphate (IP) in ihrer Gesamtheit auf Harzsäulen extrahiert und im Testpuffer resuspendiert werden. Der Test von auf diese Weise gewonnenen IP läßt sich unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens zur Bestimmung der IP-Konzentration durchführen. Typischerweise werden Phospholipase-C-Tests getrennt von Bindungstests durchgeführt, doch ist es auch möglich, Phospholipase-C-Bindungstests an einer einzigen Präparation von Zellen durchzuführen.
  • Die Aktivierung von Rezeptor kann auch auf Grundlage einer Messung der intrazellulären Calciumkonzentration bestimmt werden. So können beispielsweise transformierte HEK-293-Zellen auf Objektträgern mit Deckgläschen zur Konfluenz angezogen werden. Nach dem Spülen können diese in Gegenwart eines Agens, wie z.B. Fluo-3, Fluo-4 und FURA-2 AM (Molecular Probe F-1221) inkubiert werden. Nach Spülen und weiterer Inkubation kann die Calciumverdrängung unter Verwendung eines Fotometers gemessen werden. Weitere Arten von Tests zur Bestimmung intrazellulärer Calciumkonzentrationen sind im Fachgebiet allgemein bekannt und können ebenso eingesetzt werden.
  • Zur Bestimmung der Aktivität inverser Agonisten können Tests, die die intrinsische Aktivität des Rezeptors messen, wie beispielsweise solche auf Grundlage von Inositolphosphatmessung, verwendet werden. Im Gegensatz zu Antagonisten, die die Aktivität von Agonisten blockieren, jedoch aus sich heraus keine Aktivität produzieren, produzieren inverse Agonisten eine biologische Reaktion, die der von einem Agonisten produzierten Reaktion diametral entgegensteht. So würde beispielsweise bei einer von einem Agonisten geförderten Erhöhung an intrazellulärem Calcium ein inverser Agonist eine Abnahme interzellulärer Calciumspiegel verursachen.
  • Die oben erörterten Radioliganden- und Zellaktivierungstests stellen Beispiele für die Arten von Tests dar, die sich zur Bestimmung davon, ob eine bestimmte Testverbindung die Bindung von Dynorphin A und seinen Analogen an die Mensch/Ratte-MAS-Rezeptoren verändert und als Agonist oder Antagonist wirkt, einsetzen lassen. Diese Tests können in vielen Variationen vorliegen, die mit der vorliegenden Erfindung kompatibel sind. Solche Tests können die Verwendung markierter Antikörper als Mittel zum Nachweis von an Rezeptor gebundenem Dynorphin A und seinen Analogen beinhalten oder können in Form des FLIPR-Tests (fluorescent imaging plate reader assay) vorliegen, wie im hier vorliegenden Beispielteil beschrieben.
  • Beispiele
  • I. Verfahren
  • Präparation des Klons mit MAS-Rezeptor der Ratte und des Menschen:
  • Siehe Beschreibung in: Cell 1986 Jun 6; 45 (5):711–9
  • Expression
  • HEK-293-Zellen wurden mit einem für den MAS-Rezeptor aus Ratte und Mensch codierenden Säugerexpressionskonstrukt (pcDNA 3.1 Vektor, Invitrogen) unter Verwendung des Superfect-Reagens (Qiagen) transfiziert. Ein stabiler Rezeptor-Pool von MAS-Rezeptor wurde durch Einsatz eines Selektionsmarkers (G418, 0,9 mg/ml) entwickelt, wobei die Zellen in diesem Selektionsmedium gehalten wurden. Das Vorhandensein von für den MAS-Rezeptorklon spezifischer mRNA wurde mittels Northern-Blot-Analyse und über reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) analysiert.
  • Liganden
  • Zur Identifizierung des Liganden des klonierten MAS-Rezeptors der Ratte und des Menschen wurde eine Sammlung von Peptid- und Nichtpeptidliganden aus kommerziellen Quellen (Sigma, CalBiochem, American Peptide Company, Bachem, RBI, Phoenix) bezogen. Die Verbindungen wurden in Wasser/DMSO bei 3 μM gelöst und in 96-Loch-Mikroplatten gegeben. Insgesamt wurden 1000 Verbindungen (Peptide und Nichtpeptide) hergestellt und getestet.
  • Tests
  • 1) FLIPR-Test
  • Es wurde in einer 96-Loch-Plattform ein Funktionstest mit FLIPR (Fluorescent Imaging Plate Reader, Molecular Devices) unter Verwendung des fluoreszierenden Calciumindikators Fluo-3 (Molecular Probes) durchgeführt. Dabei wurden entweder den Rezeptor exprimierende HEK-293-Zellen oder Wildtyp-Zellen wie folgt mit Fluo-3 beladen. Den MAS-Rezeptor der Ratte und des Menschen exprimierende stabile HEK-293-Klone oder Elternzellen wurden mit einer Dichte von 10 000 Zellen/Loch in einer 96-Loch-Platte ausplattiert. Am Tag des Experiments wurden die MAS-Rezeptorzellen mit Fluoreszenzlösung (Dulbecco's modifiziertes Medium mit 10% fötalem Rinderserum mit 4 μM Fluo-3 und 20% Pluronic Acid) beladen. Die Zellen wurden eine Stunde in einer luftbefeuchteten Kammer bei 37°C inkubiert. Nach dem Inkubationsschritt wurden die Zellen fünfmal in Hanks'-Lösung mit 20mM Hepes und 0,1% BSA (pH 7,4) gewaschen. Die Zellen wurden mit dem FLIPR-System zur Messung der Mobilisierung von intrazellulärem Calcium als Antwort auf unterschiedliche Verbindungen analysiert.
  • 2) Bindungstest
  • Membranen entweder von den Rezeptor exprimierenden HEK-293-Zellen oder von Wildtyp-Zellen wurden wie zuvor beschrieben präpariert und bei –80°C eingefroren. Am Tag des Experiments wurden die Membranen in einem Puffer mit 50 mM TRIS/HCl pH 7,4, 5 mM MgCl2, EDTA 2 mM, PMSF 0,1 mM, BSA 1 mg/ml unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators homogenisiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur mit unterschiedlichen Konzentrationen an 125I-Dynorphin A-NH2 sowie mit (nichtspezifische Bindung) oder ohne (spezifische Bindung) 1 μM nichtmarkiertem Dynorphin A-NH2 inkubiert. Das gebundene 125I-Dynorphin A-NH2 wurde über Filtration durch zuvor in PEI getränkte Whatman GF/B-Filter gesammelt. Die Filter wurden dreimal mit 2,5 ml des kalten Tris/MgCl2-Puffers gespült und anschließend mit dem TopCount NXT (Packard) gezählt. Protein wurde unter Verwendung eines Farbstoffreagens von Bio-Rad gemessen.
  • II. Ergebnisse
  • 1) FLIPR-Ergebnisse
  • HEK-293-Zellen exprimieren endogen einige GPCRs, wie beispielsweise Bradykinin und PACAP-Rezeptoren, die als interne Kontrollen für Tests verwendet werden können. Das Hintergrundsignal wurde bei allen Verbindungen in den HEK-293-Elternzellen (nicht transfiziert) mit dem FLIPR-Test ermittelt. Den klonierten MAS-Rezeptor exprimierende HEK-293-Zellen wurden mit allen Verbindungen stimuliert, wobei die Calciumantworten mit denen in HEK-293-Elternzellen verglichen wurden. Drei Verbindungen (Dynorphin A, Dynorphin A-NH2 und Dynorphin A 1–13) lösten beständig in den transformierten Zellen, jedoch nicht in den Wildtyp-Zellen Signale aus. Dies deutet darauf hin, daß Dynorphin A und seine Analogen mit den rekombinant exprimierten Rezeptoren wechselwirken. Diese Schlußfolgerung wurde durch die Beobachtung einer dosisabhängigen Beziehung mit Dynorphin A und seinen Analogen in den mit MAS-Rezeptor transfizierten Zellen, jedoch nicht in den nichttransfizierten Zellen oder in mit anderen Orphan-Rezeptoren transfizierten Zellen bestätigt. Es wurde somit ermittelt, daß es sich bei dem klonierten MAS-Rezeptor der Ratte bzw. des Menschen um spezifische Rezeptoren für Dynorphin A und seine Analogen handelt. Die MAS-Rezeptoren der Ratte und des Menschen lassen sich zum Screening von Verbindungen verwenden, die entweder die Wirkung von Dynorphin A und seinen Analogen imitieren (Agonisten) oder die Wirkung von Dynorphin A und seinen Analogen antagonisieren (Antagonisten).
  • Screening-Tests lassen sich unter Verwendung des oben beschriebenen FLIPR-Tests durchführen.
  • 2) Bindungsergebnisse
  • Den klonierten MAS-Rezeptor exprimierende HEK-293S-Membranen zeigten eine spezifische Bindung für 125I-Dynorphin A-NH2. In nichtransfizierten HEK-293S-Membranen wurde keine spezifische Bindung beobachtet.
  • Screening-Tests lassen sich mit dem oben beschriebenen Bindungstest durchführen. Zu weiteren Tests, die verwendet werden können, zählen der GTPase-Test, Adenylylcyclase-Tests, Inositolphosphate messende Tests sowie Reportergen-Tests (z.B. solche unter Nutzung von Luciferase, Aqueorin, alkalischer Phosphatase usw.).
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00140001
  • Figure 00150001

Claims (8)

  1. Verfahren zum Testen einer Testverbindung auf seine Fähigkeit zur Bindung an den MAS-Rezeptor aus der Ratte bzw. dem Menschen, wobei man: a. eine das MAS-Rezeptor-Gen exprimierende Zelle mit Dynorphin A und seinen Analogen sowie der Testverbindung inkubiert und b. den Grad der Verdrängung der Bindung des Dynorphin A und seiner Analogen durch die Testverbindung bestimmt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der den MAS-Rezeptor aus der Ratte bzw. dem Menschen exprimierenden Zelle um eine rekombinante Zelle handelt, die mit einem heterologen MAS-Rezeptor-Gen transformiert wurde.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Test um einen Radioligandentest handelt und das Dynorphin A und seine Analogen oder die Testverbindung radioaktiv markiert ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Test um einen ELISA-Test (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) handelt und entweder das Dynorphin A und seine Analogen oder die Testverbindung mit einem Enzym verbunden sind.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, bei dem man ferner bestimmt, ob die Testverbindung entweder die Konzentration der Phospholipase C oder des intrazellulären Calciums in der Zelle signifikant erhöht oder erniedrigt.
  6. Verfahren zur Bestimmung davon, ob es sich bei einer Testverbindung um einen Agonisten, einen Antagonisten oder einen inversen Agonisten von Dynorphin A und seinen Analogen handelt, wobei man: a. eine MAS-Rezeptor exprimierende Zelle mit der Testverbindung inkubiert, b. die intrazelluläre Phospholipase-C- oder Adenylylcyclase-Aktivität oder die intrazelluläre Calciumkonzentration während der Inkubation in Schritt a) bestimmt, c. die in Schritt b) erhaltenen Ergebnisse mit den bei den in Abwesenheit der Testverbindung durchgeführten Inkubationen erhaltenen Ergebnissen vergleicht und, d. wenn das Niveau der Phospholipase-C- oder Adenylylcyclase-Aktivität oder des intra zellulären Calciums bei Vorhandensein der Testverbindung signifikant höher liegt als bei deren Abwesenheit, die Schlußfolgerung zieht, daß es sich bei der Testverbindung um einen Agonisten von Dynorphin A und seinen Analogen handelt, oder, wenn das Niveau der Phospholipase-C- oder Adenylylcyclase-Aktivität oder des intrazellulären Calciums bei Vorhandensein der Testverbindung signifikant niedriger liegt als bei deren Abwesenheit, die Schlußfolgerung zieht, daß es sich bei der Testverbindung um einen Antagonisten von Dynorphin A und seinen Analogen handelt.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei der Zelle um eine rekombinante Zelle handelt, die mit einem heterologen MAS-Rezeptor-Gen (Ratte und Mensch) transformiert wurde.
  8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die MAS-Rezeptor exprimierende Zelle und die Testverbindung in einem Medium, das ferner Dynorphin A und seine Analogen umfaßt, inkubiert werden.
DE60117701T 2000-12-22 2001-12-19 Testverfahren für agonisten oder antagonisten der bindung von dynorphin a an den mas-rezeptor Expired - Fee Related DE60117701T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25797700P 2000-12-22 2000-12-22
US257977P 2000-12-22
PCT/SE2001/002854 WO2002052267A1 (en) 2000-12-22 2001-12-19 A method of assaying for agonists or antagonist of dynorphin a binding to the mas receptor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60117701D1 DE60117701D1 (de) 2006-05-04
DE60117701T2 true DE60117701T2 (de) 2006-09-21

Family

ID=22978581

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60117701T Expired - Fee Related DE60117701T2 (de) 2000-12-22 2001-12-19 Testverfahren für agonisten oder antagonisten der bindung von dynorphin a an den mas-rezeptor

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7078177B2 (de)
EP (1) EP1346221B1 (de)
JP (1) JP2004516036A (de)
AT (1) ATE320005T1 (de)
CA (1) CA2430719A1 (de)
DE (1) DE60117701T2 (de)
WO (1) WO2002052267A1 (de)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0502497A (pt) * 2005-06-28 2007-02-06 Univ Minas Gerais uso de agonistas e antagonistas do receptor acoplado a proteìna g, mas, como moduladores de atividade apoptótica para o estudo, a prevenção e o tratamento de doenças

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5017689A (en) * 1989-07-06 1991-05-21 Arizona Technology Development Corporation Dynorphin analogs specific for kappa opioid receptors
SE9704836D0 (sv) 1997-12-22 1997-12-22 Astra Pharma Inc Novel receptor

Also Published As

Publication number Publication date
CA2430719A1 (en) 2002-07-04
ATE320005T1 (de) 2006-03-15
US20040171080A1 (en) 2004-09-02
US7078177B2 (en) 2006-07-18
WO2002052267A1 (en) 2002-07-04
JP2004516036A (ja) 2004-06-03
EP1346221B1 (de) 2006-03-08
EP1346221A1 (de) 2003-09-24
DE60117701D1 (de) 2006-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mantyh et al. Substance P receptors: localization by light microscopic autoradiography in rat brain using [3H] SP as the radioligand
DE60126337T2 (de) Verfahren zum screenen für gpr40-liganden
EP2205247B1 (de) Verwendung von norgestimat als selektiver hemmer der ionenkanäle trpc3, trpc6 und trpc7
DE602004013280T2 (de) Screening-tests für cannabinoid-ligand-artige modulatoren von gpr55
DE60120653T2 (de) High throughput screening durch messen der intrazellulären kalziumspiegel
DE60127435T2 (de) VERFAHREN ZUM SCREENEN EINES PLäTTCHENHEMMERS
DE60117701T2 (de) Testverfahren für agonisten oder antagonisten der bindung von dynorphin a an den mas-rezeptor
Pinelli et al. Distribution of FMRFamide‐like immunoreactivity in the amphibian brain: comparative analysis
US20030129664A1 (en) Novel Assays
US7270965B2 (en) Assays to screen for compounds that bind the dorsal root receptor
Shimura et al. Characterization of α1-adrenergic receptor subtypes linked to iodide efflux in rat FRTL cells
DE60133563T2 (de) Verwendung des proteins grf-1 zur auswahl von molekülen
AU5260500A (en) Assays for agonists, agonists and inverse agonists of melanin concentrating hormone (mch) binding to the somatostatin-like receptor (slc-1)
DE10350054B4 (de) Rekombinantes Zellsystem zur Deorphansisierung von G Protein-gekoppelten Rezeptoren
EP1680678B1 (de) Rekombinantes zellsystem zur deorphanisierung von g protein-gekoppelten rezeptoren
EP3271731B1 (de) In-vitro-verfahren zum nachweis von mutiertem leptin und verwendung eines nachweisreagenzes
AU2002217669A1 (en) A method of assaying for agonists or antagonist of dynorphin a binding to the MAS receptor
US20080064046A1 (en) Assays
Breen Alpha-1 adrenergic receptors, protein kinase C, and regulation of intracellular pH in cardiac purkinje fibers
AU2004222744A1 (en) Assays for agonists, agonists and inverse agonists of melanin concentrating hormone (MCH) binding to the somatostatin-like receptor (SLC-1)

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee