CN101904849A

CN101904849A - 血根碱制备肿瘤放射治疗增敏药物的应用

Info

Publication number: CN101904849A
Application number: CN 201010256895
Authority: CN
Inventors: 徐加英; 樊赛军
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2010-08-19
Filing date: 2010-08-19
Publication date: 2010-12-08

Abstract

本发明属于放疗增敏药物领域，涉及血根碱的一种新用途，具体涉及血根碱制备肿瘤放射治疗增敏药物的应用，本发明所述血根碱以及包括血根碱的所述放射治疗增敏剂具有抑制癌细胞周期进程，增加肿瘤细胞对放射治疗的敏感性的作用，因此，可以降低肿瘤病人的放射治疗所需的辐射照射剂量，降低放射治疗所带来的毒副作用，从而提高病人的生存质量。

Description

血根碱制备肿瘤放射治疗增敏药物的应用

技术领域

本发明属于放疗增敏药物领域，涉及血根碱的一种新用途，具体涉及血根碱制备肿瘤放射治疗增敏药物的应用。

背景技术

宫颈癌是全球妇女恶性肿瘤中仅次于乳腺癌的第二位常见肿瘤。目前全球宫颈癌每年新增病例49万人，死亡病例27万人，其中80％来自于发展中国家，中国就占到三分之一。宫颈癌是我国高发的女性生殖系统恶性肿瘤，在许多城市宫颈癌发病率在肿瘤中排在第一位，虽总体发病率比20年前有所下降，但却呈现出十分明显的低龄化趋势。现在临床上的宫颈癌患者中，40至50岁人群占了约60％。其次就是30至40岁人群，所占比例超过30％。

宫颈癌治疗原则是既要提高患者的生存率，又要改善其生存质量。治疗的趋势是采用多种手段的综合治疗。目前，用于宫颈癌治疗的主要手段包括手术、放射治疗(放疗)、化学药物治疗(化疗)、生物治疗、内分泌治疗、中医中药治疗、热疗和射频消融治疗等。而宫颈癌的放疗目前是宫颈癌的基本治疗方法之一。放疗包括外照射及腔内照射两部分，各期宫颈癌均可放疗，但Ⅰ期及Ⅱa期以手术治疗为主。Ⅱb期及以后各期则以放疗为主。早期病例以腔内放疗为主，体外放疗为辅；中期病例内外各半；晚期病例则以体外放疗为主，腔内放疗为辅。腔内放疗的目的是控制局部病灶；体外放疗则用以治疗盆腔淋巴结及宫颈旁组织等处的病灶。由于高分化鳞癌、腺癌、粘液腺癌等宫颈腺癌对放疗不敏感，寻找新的抗宫颈癌药物以及增加宫颈癌细胞对放疗敏感性的放疗增敏药研究是当今宫颈癌化疗和放疗的热门课题和主要的研究方向。

血根碱(sanguinarine，SAN，3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide)来源于罂粟科植物博落回的果实，早期的研究发现血根碱具有抗炎、抗菌、抗氧化并对中枢神经有麻醉作用，最近的研究表明血根碱在人类上皮癌(A431)，前列腺癌(LNCaP)，人黑色素瘤(M4Beu)，结肠腺癌(DLD-1)，肺癌非小细胞癌(A549)等细胞株中均有抑制肿瘤细胞生长和转移、诱导细胞凋亡和引起细胞周期阻滞等作用，但同等剂量对正常的人上皮细胞(NEEKs)则未见任何影响，表明血根碱可能具有选择性抗肿瘤的功效。

目前，国外缺乏对血根碱在宫颈癌中作用的系统研究，国内此项工作尚未开展，并且国内外未见关于血根碱放疗增敏方面的报道。

发明内容

本发明目的是提供血根碱的一种新用途，即血根碱制备肿瘤放射治疗增敏药物的应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：血根碱在制备肿瘤放射治疗增敏药物中的应用。

本发明同时要求保护一种放疗增敏药物，所述放疗增敏药物的活性成分包括血根碱。

本发明还提供了一种应用血根碱增强肿瘤细胞对放疗敏感性的方法，放疗前用血根碱处理肿瘤细胞，然后进行放疗。

上述技术方案中，用血根碱处理肿瘤细胞具体地用低剂量0.5～1.5μmol/L的血根碱处理肿瘤细胞4～48h。

上述技术方案中，所述放射治疗增敏药物可通过注射、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

以血根碱为活性成分的放射治疗增敏药物，需要的时候，所述放射治疗增敏药物还包括一种以上(包括一种)药学上可接受的添加剂，所述添加剂包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

所述放射治疗增敏药物可以制备成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等形式。上述各种剂型的药物均可按照药学领域的常规方法制备。

血根碱联合放射治疗的结果表明：血根碱通过抑制宫颈癌细胞周期进程，从而增加肿瘤细胞对放射治疗的敏感性；同时，现已知肿瘤细胞主要是由于细胞周期破坏而导致了细胞的失控性生长，因此，本发明所述血根碱以及所述包括血根碱的放射治疗增敏药物在包括宫颈癌在内的不同肿瘤放射治疗前给药可以提高肿瘤放射治疗增敏性，从而提高放射治疗的治疗效果。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明所述血根碱以及包括血根碱的所述放射治疗增敏剂具有抑制癌细胞周期进程，增加肿瘤细胞对放射治疗的敏感性的作用，因此，可以降低肿瘤病人的放射治疗所需的辐射照射剂量，降低放射治疗所带来的毒副作用，从而提高病人的生存质量。

附图说明

图1为实施例二中血根碱处理后对受到照射的Hela细胞周期的影响曲线图，其中，G0/G1期：与对照组相比，^*p 0.05；^**p0.01；^#p 0.05，^##p0.01；G2/M期：与对照组相比^ap 0.05；^aap0.01；与3Gy、6Gy和9Gy相比，^b p 0.05，^bb p0.01；S期：与对照组相比⁺p0.05；⁺⁺p0.01；与3Gy、6Gy和9Gy相比，^-p0.05，^--p0.01；Sub-G1：与对照组相比^cp0.05；^ccp0.01；与3Gy、6Gy和9Gy相比，^d p 0.05，^dd p0.01；

图2为实施例三中血根碱对宫颈癌C33A细胞放射治疗的影响曲线图；

图3为实施例三中血根碱对宫颈癌HeLa细胞放射治疗的影响曲线图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

材料：人类宫颈癌细胞株HeLa、C33A购于美国细胞收藏中心(ATCC)，并由本实验室保存和培养；D-MEM培养基干粉，小牛血清，胰酶粉末购自Gibco公司。HEPES购自Sigma(美国)；各种规格培养皿、96孔板、6孔板、各种规格离心管购自Fisher公司。噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、琼脂糖、溴乙锭、溴酚兰、吐温-20(Tween-20)均为上海生物技术科技有限公司。

实施例一：

(1)细胞培养：宫颈癌HeLa细胞培养于含10％小牛血清，谷氨酸胺及100万U/L青霉素和链霉素的D-EME培养基。细胞置于5％CO₂，37℃培养箱内培养，每2-3天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

(2)用0.25％的胰酶消化对数生长期的细胞，制备单细胞悬液，将5×10⁴/ml的HeLa细胞接种于96孔培养板，每孔接种200μl。在37℃、含5％CO₂和饱和湿度条件培养24小时后，加入浓度分别为0、0.5、1、2、和3μmol/L的血根碱，每一浓度设6个复孔。然后在细胞继续培养12、24、36、48和60小时后，加入20μL浓度为5mg/ml的MTT，继续培养4小时后轻轻吸掉培养基。加入150μL的DMSO振荡溶解10分钟。在酶标仪上选取570nm主波长和630nm参考波长测定吸光值，对照组细胞存活率设为100％，其余各组细胞存活率＝(各浓度组吸光值/对照组吸光值)×100％。

结果如表1所示：MTT比色法显示宫颈癌HeLa细胞经血根碱处理24小时后细胞生长出现明显抑制，并显现剂量依赖性和时间依赖性。

表1.血根碱处理后的宫颈癌HeLa细胞的存活率呈浓度和剂量依赖

实施例二：

按照实施例一中的方法培养细胞，然后将宫颈癌HeLa细胞接种于100mm培养瓶，待贴壁后(待细胞长至60-70％左右)分别加入浓度为1μmol/L血根碱处理24小时后，照射细胞，所照剂量为3、6、9Gy收集各组细胞，采用1,800g离心速度离心5分钟。弃去上清，用1x PBS缓冲液洗涤细胞1次，1,800g离心5分钟，并收集细胞沉淀。细胞放置在冰上预冷的70％乙醇固定4小时，离心后，以1x PBS洗涤细胞两次。离心后，悬浮细胞于500μL含300μg/mLRNase A和10μg/mL proteinase K(美国Sigma Aldrich公司)的PI溶液中(10μg/mL)，30分钟后，经孔径为53μm的尼龙滤网过滤，FACS-Calibur流式细胞仪上检测分析。

结果如图1所示，血根碱处理诱导了剂量依赖性的G2/M期细胞周期阻滞，降低了S期细胞比例。但对G2/M期比例并没有产生明显影响。这些实验结果说明血根碱可以诱导宫颈癌细胞周期阻滞。随着照射剂量的增加，宫颈癌HeLa细胞G0/G和S期比例下降，同时出现明显的G2/M期细胞阻滞。现已知肿瘤细胞主要是由于细胞周期破坏而导致了细胞的失控性生长，细胞周期阻滞是宫颈癌许多化疗药物和放射治疗的重要作用机理之一。

实施例三：

按照实施例一中的方法培养细胞C33A，然后用0.5μM血根碱处理24小时的细胞接受不同剂量(0～10Gy)的χ-辐射照射，然后接种到100mm培养皿。连续培养三周后，采用甲醇固定，加姬姆萨液染色30分钟，流水洗净，最后观察和记录含有≥50细胞的克隆个数。采用克隆形成率(PE)＝(对照组克隆数/实验组细胞数)×100％公式计算克隆形成率，采用存活分数＝实验组克隆形成率/对照组克隆形成率公式计算存活分数；

其中，照射条件：细胞置于直线加速器下，射线性质为高能6兆伏χ-线，照射野为10cm×10cm，源皮距为100cm，剂量率为200cGy/min。照射时培养皿面上覆盖1.5cm厚等效蜡板以调整照射剂量。

图2结果所示，与没有血根碱24小时预处理细胞相比，不同的χ-射线辐照在0.5μM血根碱(该浓度细胞存活率在90％以上，即为无毒性剂量)24小时预处理的C33A细胞中导致更多的细胞死亡，IC₅₀(杀死50％细胞的剂量)和IC₉₀(杀死90％细胞的剂量)在单独χ-射线照射的C33A细胞分别为1.2Gy和4.2Gy，而IC₅₀和IC₉₀在血根碱24小时预处理加χ-射线照射的C33A细胞则为0.6Gy和2.0Gy，即显现两倍以上的差异。

按照上述方法，在另外一宫颈癌细胞HeLa，使用血根碱和发射治疗联合处理宫颈癌细胞HeLa，结果发现：血根碱的放射治疗增敏效果更加明显(图3)，IC₅₀和IC₉₀在单独χ-射线照射的细胞分别为1.1Gy和5.6Gy，而IC₅₀和IC₉₀在血根碱24小时预处理加χ-射线照射的HeLa细胞则为0.4Gy和2.4Gy，即显现2.5倍以上的差异。这些试验结果表明血根碱可增加宫颈癌细胞对χ-线辐射照射的放射敏感性。

Claims

1.血根碱在制备肿瘤放射治疗增敏药物中的应用。

2.一种放疗增敏药物，其特征在于，所述放疗增敏药物的活性成分包括血根碱。