CN107519188B - 葡萄糖胺在制备放疗增敏药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物领域，具体是葡萄糖胺的新用途，即在制备放疗增敏药物中的应用，所述葡萄糖胺的结构式如下所示。本发明所述葡萄糖胺可以用于制备放射治疗增敏药物，并且可以在无毒副作用的浓度下，明显增加肺癌细胞的放疗敏感性。

Description

葡萄糖胺在制备放疗增敏药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体地说，是葡萄糖胺的新用途，即在制备放疗增敏药物中的应用。

背景技术

肺癌发生于支气管粘膜上皮，亦称支气管癌。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率明显增高，在男性癌瘤病人中，肺癌已居首位，在女性发病率也迅速增高，占女性常见恶性肿瘤的第2位或第3位。肺癌的病因至今尚不完全明确，但是严重影响了患者的生命健康和生存质量。其中非小细胞型肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。目前肺癌的主要治疗手段包括手术治疗、放射治疗、化学治疗及靶向治疗。其中，放射治疗是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)重要的局部治疗手段，资料显示：约60％的患者在治疗不同阶段会应用该种治疗方法，但多数患者出现辐射抵抗，治疗效果不如人意。因此如何增加肺癌细胞辐射敏感性，降低肺癌细胞辐射抗性，成为近年来肺癌治疗研究的热点和难点。

葡萄糖胺(glucosamine)是葡萄糖的一个羟基被一个氨基取代的化合物。分子式C₆H₁₃O₅N，俗称氨基糖，简称氨糖。广泛存在于自然界，2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖通常以N-乙酰基衍生物(如甲壳素)或以N-硫酸酯和N-乙酰-3-O-乳酸醚(胞壁酸)形式存在于微生物、动物来源的多糖和结合多糖中。它是人体内合成的物质，是形成软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然组织成份。随着年龄的增长，人体内的氨基葡萄糖的缺乏越来越严重，关节软骨不断退化和磨损。美国、欧洲和日本的大量医学研究表明：氨基葡萄糖可以帮助修复和维护软骨，并能刺激软骨细胞的生长。近期研究发现，葡萄糖胺可以抑制肿瘤细胞中异常高表达的组织型转谷氨酰胺酶，从而抑制肿瘤细胞的生长。

现有技术中未见关于葡萄糖胺放疗增敏方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供葡萄糖胺的新用途，即在制备放疗增敏药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明的第一方面，提供葡萄糖胺在制备放疗增敏药物中的应用，所述的葡萄糖胺的结构式如下式I所示：

优选的，所述放疗增敏药物为适用于肺癌的放疗增敏药物。

优选的，所述的放疗增敏药物为口服制剂或注射制剂。

优选的，所述的放疗增敏药物的给药时间为照前2小时-0小时。

本发明将不同浓度(<15mM)的葡萄糖胺直接加到肺癌细胞A549和正常肺上皮细胞BEAS-2B中，处理24及48小时后采用CCK-8检测细胞生长和增殖，结果发现：小于5μM的葡萄糖胺对BEAS-2B细胞的生长和增殖不产生抑制作用，对A549细胞的生长和增殖有轻微抑制作用。

同时，本发明采用5mM葡萄糖胺处理A549细胞2小时后，再给予细胞不同剂量(0、2、4、8Gy)的⁶⁰Coγ射线照射，然后继续培养2周后采用克隆形成率检测细胞生长和增殖，结果显示：无毒副作用浓度的葡萄糖胺(5μM)预处理后，随着照射剂量的增加，可以明显增加放射治疗所诱导的A549细胞的细胞死亡率。同时，本发明采用5mM葡萄糖胺处理A549细胞及BEAS-2B细胞2小时后，再给予细胞8Gy的⁶⁰Coγ射线照射，然后继续培养24小时后采用Annexin V-FITC及PI双染后通过流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示：无毒副作用浓度的葡萄糖胺(5mM)预处理可明显增加放射治疗所诱导的A549细胞的细胞凋亡率，但对BEAS-2B细胞没有产生放射诱导的凋亡现象。这些研究数据表明葡萄糖胺可以增加肺癌细胞的放射敏感性，而在该浓度下，对正常细胞无明显毒副作用。

此外，本发明将中国科学院实验动物中心购买的8周龄的雌性C57BL/6小鼠用于动物实验。在25±1℃的日常更换垫料的笼子中喂养小鼠。所有动物在固定位置植入5X10E6个小鼠路易斯肺癌细胞(25μL PBS)，距离剑突下端5mm，与右肺平行，固定位置插针深度为5mm。将处理的小鼠随机分为4组：第1组，未照射+生理盐水对照组；第2组，照射+生理盐水组；第3组，照射+葡萄糖胺组。局部照射全肺前3天，葡萄糖胺(100mg/kg/d)通过腹腔注射至相应的组。然后继续喂养荷瘤小鼠一周后取出肺组织。结果显示，未经照射及葡萄糖胺处理的小鼠肿瘤平均直径最大，照射组小鼠肿瘤平均直径比对照组小2mm，照射及葡萄糖胺联合处理组小鼠肿瘤平均直径比对照组小6mm，表明葡萄糖胺具有明显的放射增敏作用。

因此，本发明要求保护葡萄糖胺在制备放射治疗增敏药物中的应用。在对正常肺组织细胞的生长无任何明显作用的用药浓度条件下，采用葡萄糖胺处理肺癌细胞，可以提高放射治疗的敏感性，从而提高放射治疗疗效。

本发明的第二方面，提供一种放疗增敏药物，所述的放疗增敏药物的活性成分为葡萄糖胺。

优选的，所述的放疗增敏药物还包括药学上可接受的辅料。

本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明所述葡萄糖胺可用于制备放射治疗增敏药物，并且可以在无毒副作用的浓度下，提高肺癌细胞的放疗敏感性。

附图说明

图1为实施例1中不同浓度(<15μM)的葡萄糖胺处理24小时对A549细胞和BEAS-2B细胞生长和增殖的影响；

图2为实施例2中不同照射剂量下葡萄糖胺预处理A549细胞照后生长和增殖的改变；

图3为实施例3中葡萄糖胺预处理A549细胞及BEAS-2B细胞的放射治疗敏感性改变；

图4为实施例4中葡萄糖胺预处理荷瘤小鼠全肺照射后肿瘤平均直径大小的改变。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

材料：

细胞株和细胞培养：将人肺泡II型上皮癌细胞系A549(美国细胞收藏中心)及小鼠Lewis肺癌细胞LLC(美国细胞收藏中心)在含有10％胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5％CO₂培养箱中培养。将人支气管上皮细胞系BEAS-2B(美国细胞收藏中心)在含有10％胎牛血清的RMPI 1640培养基于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

药物与主要试剂：药物葡萄糖胺，溶于PBS中，配成母液为1mol/L于4度冰箱保存。DMEM培养基、RMPI 1640培养基、胎牛血清、胰酶购自Gibco公司；CCK-8试剂购于日本同仁化学研究所；Annexin V-FITC及PI购自Invitrogen公司。

小鼠：中国科学院实验动物中心获得的8周龄的雌性C57BL/6小鼠。

实施例1：

(1)细胞培养：将A549细胞及LLC细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中；将BEAS-2B细胞培养于含10％胎牛血清的RMPI培养基中。所有细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每2-3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

(2)CCK-8比色法：在药物处理前24h将对数生长期细胞(5*10⁴/mL)接种至96孔板中，每种浓度设6个平行孔。加入不同浓度的葡萄糖胺继续培养24和48小时。细胞培养液中加入10μL CCK-8试剂继续培养1-4小时。采用酶标仪测定在450nm处的吸光度。最后采用细胞存活率＝加药组值/对照组值×100％的公式计算细胞存活率。

所得结果如图1所示，结果表明小于5mmol/L的葡萄糖胺对BEAS-2B细胞的生长和增殖不产生抑制作用，对A549细胞的生长和增殖有轻微抑制作用。24小时和48小时葡萄糖胺处理的A549细胞半数致死浓度(IC 50)分别为14.6mmol/L和10.4mmol/L。

实施例2：

(1)细胞培养同实施例1；

(2)细胞克隆形成方法：取对数生长期A549细胞，并按不同照射剂量要求接种不同数量的细胞到六孔板中(0,2,4,8Gy剂量接种细胞数量分别为200,400,800和1600个)。24小时后，葡萄糖胺与辐射联合组加入5mmol/L葡萄糖胺处理1小时，对照组采用等量PBS作为阴性对照。两组细胞同时接受不同剂量(0-8Gy)的γ-射线照射，照后继续培养24小时，两组均换成普通培养基，并继续直至培养皿中出现明显肉眼可见的细胞克隆时终止培养。弃培养基，PBS洗两次，并采用无水甲醇固定30分钟，Gimsa染液染色30分钟，流水冲洗后晾干。在显微镜下计数超过50个细胞的克隆集落，各计量点至少设3个平行样，取平均值，计算出细胞存活率。所得结果如图2所示，无毒副作用浓度的葡萄糖胺(5mmol/L)预处理后，随着照射剂量的增加，可以明显增加放射治疗所诱导的A549细胞的细胞死亡率。

实施例3：

(1)细胞培养同实施例1；

(2)流式细胞仪检测细胞凋亡法：取对数生长期A549细胞和BEAS-2B细胞(1*10⁵/mL)接种至六孔板中，加入5mmol/L葡萄糖胺处理A549细胞及BEAS-2B细胞后，再给予细胞8Gy的60Coγ射线照射，然后继续培养24h后，使用不含EDTA的胰酶消化细胞，1500转离心5分钟后PBS洗三遍，采用Annexin V-FITC及PI双染后通过流式细胞仪检测细胞凋亡。所得结果如图3所示，无毒副作用浓度的葡萄糖胺(5mmol/L)处理可明显增加A549细胞的放射治疗敏感性，而对BEAS-2B细胞无放射增敏作用：在5mmol/L葡萄糖胺处理A549细胞后，放射诱导的细胞凋亡环比增加了13％；在5mmol/L葡萄糖胺处理BEAS-2B细胞后，放射诱导的细胞凋亡环比降低了2％。这些研究数据表明葡萄糖胺在无明显毒副作用浓度下可以增加肺癌细胞的放射敏感性而对正常肺上皮细胞无放射增敏作用。

实施例4：

(1)细胞培养同实施例1；

(2)小鼠喂养：将小鼠置于25±1℃日常更换垫料的笼子中，保证水分及食物充足。

(3)荷瘤小鼠模型构建及处理：取对数生长期LLC细胞，胰酶消化后离心，在PBS中吹匀。所有动在固定位置植入50个LLC细胞(25μLPBS)——距离剑突下端5mm，与右肺平行，固定位置插针深度为5mm。将处理的小鼠随机分为4组：第1组，未照射+生理盐水对照组；第2组，照射+生理盐水组；第3组，照射+葡萄糖胺组。局部照射全肺前3天，葡萄糖胺(100mg/kg/d)通过腹腔注射至相应的组。然后继续喂养荷瘤小鼠一周后取出肺组织。结果显示，未经照射及葡萄糖胺处理的小鼠肿瘤平均直径最大，照射组小鼠肿瘤平均直径比对照组小2mm，照射及葡萄糖胺联合处理组小鼠肿瘤平均直径比对照组小6mm，表明葡萄糖胺具有明显的放射增敏作用。

其中，照射条件：辐射中心(第二军医大学海军医学系，中国上海)的⁶⁰Coγ射线照射。用10％氯醛水合物(350mg/kg)麻醉后，对小鼠进行全肺照射。所有辐射动物接受单次剂量15Gy，剂量率为1Gy/min，并在照射后监测至1周。以8Gy的γ射线照射剂量率1Gy/min处理细胞。

统计学处理：上述实施例的所有实验均重复3次以上，结果采用表示。采用SAS统计软件对相关数据进行t检验，以P<0.05为有显著性差异。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (3)

1.葡萄糖胺在制备放疗增敏药物中的应用，所述放疗增敏药物为适用于肺癌的放疗增敏药物，所述的葡萄糖胺的结构式如下式I所示：

2.根据权利要求1所述的葡萄糖胺在制备放疗增敏药物中的应用，其特征在于，所述的放疗增敏药物为口服制剂或注射制剂。

3.根据权利要求1所述的葡萄糖胺在制备放疗增敏药物中的应用，其特征在于，所述的放疗增敏药物的给药时间为照前2小时-0小时。