ES2197453T3

ES2197453T3 - Ensayos, agentes, terapia y diagnostico relacionados con la modulacion de la actividad reparadora del dna celular.

Info

Publication number: ES2197453T3
Application number: ES98900589T
Authority: ES
Inventors: Stephen Philip Jackson; Susan Elizabeth Critchlow
Original assignee: Kudos Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Kudos Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 1997-01-13
Filing date: 1998-01-13
Publication date: 2004-01-01
Anticipated expiration: 2018-01-13
Also published as: GB2322193A; GB9800663D0; DE69813194T2; JP2001508868A; US6753158B1; DE69813194D1; AU5568198A; CA2277481A1; ATE237136T1; GB2322193B; DK0966683T3; PT966683E; WO1998030902A1; EP0966683B1; EP0966683A1; AU724108B2

Abstract

SE PRESENTAN UN HOMOLOGO DE LEVADURA DE ADN LIGASA IV DE MAMIFEROS UN PAPEL ATRIBUIDO AL ADN LIGASA IV ESTABLECIDO EN LA TRAYECTORIA DE REPARACION DEL ADN ASOCIADA A KU. ADEMAS SE ESTABLECEN LAS INTERACCIONES ENTRE ADN LIGASA IV Y XRCC4, Y LA INTERACCION ENTRE XRCC4 Y ADN - PKCS/KU, QUE PERMITEN LLEVAR A CABO ENSAYOS DE AGENTES CAPACES DE MODULAR TALES INTERACCIONES Y POR TANTO LA ACTIVIDAD DE REPARACION DEL ADN CELULAR. TALES AGENTES SON UTILES EN EL TRATAMIENTO DE CANCERES, INFECCIONES RETROVIRALES, TRASTORNOS DEL SISTEMA INMUNITARIO Y OTRAS CONDICIONES EN QUE LA ACTIVIDAD DE REPARACION DEL ADN CELULAR JUEGA UN PAPEL. SE PUEDEN DIAGNOSTICAR INDIVIDUOS CON UNA PREDISPOSICION A UN TRASTORNO EN QUE LA REPARACION DEL ADN JUEGA UN PAPEL, A BASE DE DETERMINAR LA PRESENCIA O AUSENCIA DE UN DEFECTO EN LA ACTIVIDAD DE LA XRCC4 Y/O ADN LIGASA IV.

Description

Ensayos, agentes, terapia y diagnóstico relacionados con la modulación de la actividad reparadora del DNA celular.

La presente invención se refiere a procedimientos, péptidos e imitadores de análisis, y procedimientos de uso basados en el sorprendente descubrimiento y caracterización de una interacción entre proteínas conocidas, y el establecimiento de que tal interacción juega un papel clave en la reparación del ADN, y, por tanto, en numerosos procesos celulares de interés en contextos terapéuticos. Dos proteínas en cuestión son la XRCC4 y la ligasa IV de ADN. También se indica la interacción entre la XRCC4 y la DNA-PKcs/Ku.

La invención ha surgido sobre la base del trabajo de los actuales inventores, estableciendo por primera vez información crucial sobre la XRCC4. Había alguna información disponible sobre la función fisiológica e esta proteína, había sido relacionada con el aparato de reparación de roturas del ADN de doble hebra asociado con Ku (KADR). No obstante, se sabía muy poco sobre su actividad biológica y cual era su papel real en el aparato KADR. Antes de la realización de la presente invención, no era posible proporcionar ensayos útiles como buscadores primarios de inhibidores de la XRCC4.

Más aún, el nuevo trabajo de clonación de los investigadores ha identificado un homólogo de levadura de la ligasa IV de ADN de mamíferos. Previamente no se le había asignado función fisiológica alguna a la ligasa IV de mamíferos, pero el trabajo de los investigadores con levaduras, incluyendo el análisis del efecto de una mutación knock-out en levadura, establece ahora la importancia fisiológica de la ligasa IV del ADN, y proporciona por tanto una indicación de contextos terapéuticos en los que puede efectuarse la modulación de su función.

El trabajo descubierto en ésta, que establece la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV del ADN, la interacción entre la XRCC4 y la DNA-PKcs/Ku, y también el rol fisiológico de tales interacciones, da lugar ahora a procedimientos de análisis para identificar compuestos que afecten la interacción, particularmente aquéllos que interfieren con ésta, y que podrían afectar o modular aspectos particulares de la actividad de reparación del ADN celular, útiles en un contexto terapéutico, por ejemplo, en el tratamiento de patologías proliferativas, cánceres y tumores, alteraciones que implican retrovirus, tales como el SIDA, la leucemia/linfoma de células T de adultos, la diabetes del Tipo I, y la esclerosis múltiple, y también en radioterapia. Más aún, da lugar al diseño racional de péptidos o imitaciones o análogos funcionales que realicen esta función.

Una de las formas de lesión más peligrosas que puede afrontar una célula es la rotura de la doble hebra del ADN (DSB), que es la principal lesión letal inducida por la radiación ionizante y por los agentes radiomiméticos. En consecuencia, las células han desarrollado sistemas altamente efectivos y complejos para reconocer este tipo de lesión del ADN y asegurarse que es reparada eficiente y precisamente. En eucariotas se han desarrollado dos vías principales para reparar los DSB del ADN, la recombinación homóloga y la unión de extremos no homólogos del ADN (NHEJ).

Mucho de lo que actualmente se sabe sobre el NHEJ del ADN en sistemas de mamíferos se ha obtenido a través del estudio de una serie de líneas celulares mutantes de roedores que se identificaron originariamente como hipersensibles a la radiación ionizante, y que presentan graves defectos en la reparación de los DSB del ADN (revisado en Jeggo et al., 1995; Roth et al., 1995). La caracterización de estas líneas celulares ha revelado que se agrupan en tres grupos de complementariedad, denominados IR4, IR5 e IR7. La línea celular XR-1 de hámster define el IR4, el IR5 consiste en un número de mutantes de células de hámster aisladas independientemente, e IR7 contiene la línea celular V3 de hámster y células derivadas de ratón con inmunodeficiencia severa combinada (scid). Varios estudios han mostrado que IR4, IR5 y las células IR5 son defectuosas en la recombinación V(D)J de anticuerpo y receptor de células T.

Se ha dirigido un esfuerzo considerable a establecer la naturaleza de los genes-productos deficitarios en las células de IR4, IR5 e IR7, y a determinar como funcionan en el NHEJ del ADN. A resultas de tales estudios, se observó que las células del IR5 e IR7 son deficitarias en componentes de la proteína quinasa dependiente del ADN (DNA-PK) (respectivamente Ku80 y DNA-PKcs). LA DNA-PK es una proteína nuclear quinasa de Ser/Thr que muestra la inusual propiedad de activarse a partir de la unión a ADN DSB u otras perturbaciones de la doble hélice del ADN (Jackson, 1997). A la luz de las propiedades bioquímicas de la DNA-PK que han sido establecidas, una hipótesis atractiva es que este enzima sirve como un sensor in vivo del daño del ADN.

Contrariamente a las células de IR5 e IR7, las células XR-1 de IR4 no son deficitarias en un componente de la DNA-PK, tal como se evidencia por el hecho de que los extractos de estas células tienen actividad normal de unión al extremo del ADN (Getts y Stamato, 1994; Rathmell y Chu, 1994; Finnie et al., 1996) y la actividad DNA-PK (Blunt et al., 1995), y que ni la expresión de Ku80 ni la de la DNA-PKcs complementa la recombinación V(D)J o los defectos radiosensibles de las células XR-1 (Taccioli et al., 1994; Blunt et al., 1995). En cambio, se ha observado que el ADN procedente de la región 5q13-14 del cromosoma humano complementa las células XR-1, denominándose el gen complementario XRCC4 (Otevrel y Stamato, 1995).

Más aún, (Li et al., 1995) han identificado recientemente el gen XRCC4 a través de su capacidad para conferir actividad recombinante V(D)J normal y restablecer parcialmente el defecto de la reparación de DSB en células XR-1, y han demostrado que el locus XRCC4 está suprimido en células XR-1.

De forma interesante, el XRCC4 codifica una pequeña proteína de 334 residuos aminoácidos, de peso molecular calculado de 38 kDa, y se ha observado que los homólogos humanos y de ratón de esta proteína son aproximadamente un 75% idénticos (Li et al., 1995). Sin embargo, tal vez sorprendentemente, el análisis de la secuencia reveló que el XRCC4 no está significativamente relacionado con ninguna proteína previamente caracterizada. Por tanto, aunque está claro que el XRCC4 juega un papel crucial en la reparación de los DSB del ADN y la recombinación V(D)J, la clonación y secuenciación del cADN para este factor ha proporcionado, hasta la fecha, pocas claves sobre su mecanismo de acción.

El artículo de Li et al. es el único artículo publicado sobre la proteína XRCC4 como tal antes de la fecha de prioridad de la presente invención. Informa que la XRCC4 no está relacionada con ninguna otra proteína y por tanto su secuencia no proporciona claves sobre su función. Por tanto, antes del presente trabajo los únicos ensayos disponibles para la XRCC4 eran ensayos de radiosensibilidad celular y de recombinación V(D)J celular, ensayos que no pueden usarse como análisis principales para inhibidores. En consecuencia, era imposible concebir ningún análisis bioquímico para la actividad de este factor.

Debería destacarse que el artículo de Li et al. no proporciona evidencia alguna de que la XRCC4 sea una proteína nuclear (mostrado en ésta) y discute en la página 1084 que la XRCC4 tiene sitios putativos para las proteínas tirosín-quinasas citoplasmáticas. Por tanto, esta claro que no se sabía nada sobre cómo podía actuar esta proteína.

Los presentes inventores han mostrado que la XRCC4 existe, al menos en parte, en los núcleos celulares, y han demostrado convincentemente que interacciona con la ligasa IV del ADN, y también con la DNA-PKcs/Ku. Se proporciona evidencia en ésta en la sección experimental, siendo proporcionada la confirmación también por Mizuta et al., 1997. Grawunder et al., 1997 también han proporcionado evidencia de interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV del ADN. Ver también las publicaciones de los inventores Teo y Jackson, 1997 y Critchlow et al., 1997.

Las ligasas del ADN son catalizadores que unen juntos fragmentos de Okazaki durante la síntesis retrasada del ADN, completan los sucesos de intercambio entre moléculas de ADN dúplex homólogas, y sellan roturas de una hebra o de doble hebra en el ADN, las cuales son producidas o por la acción directa de un agente que daña el ADN, o por los enzimas de reparación del ADN que suprimen lesiones en el ADN (para una revisión consultar Lindahl y Barnes, 1992). En contraste con los sistemas de procariotas y levaduras, donde sólo una única especie de ligasa del ADN ha sido descrita previamente (Johnston y Nasmyth, 1978), en las células de mamíferos se han identificado cuatro ligasas del ADN bioquímicamente distintas (Tomkinson et al., 1991; Wei et al., 1995; Robins y Lindahl, 1996). Los ensayos in vitro, y los estudios de levaduras y células humanas conteniendo alelos mutados de la ligasa I del ADN sugieren que este enzima une fragmentos de Okazaki durante la replicación del ADN (Henderson et al., 1985; Malkas et al., 1990; Tomkinson et al., 1991; Barnes et al., 1992; Li et al., 1994; Prigent et al., 1994; Waga et al., 1994). Más aún, la sensibilidad de las células mutantes de la ligasa I del ADN a la irradiación ultravioleta (UV) y algunos agentes dañinos para el ADN sugiere que la ligasa I del ADN está implicada en la reparación por excisión de nucleótido y en la reparación por excisión de base (Henderson et al., 1985; Lehmann et al., 1988; Malkas et al., 1990; Tomkinson et al., 1991; Barnes et al., 1992; Li et al., 1994; Prigent et al., 1994; Waga et al., 1994).

Sin embargo, se conoce mucho menos sobre la función de las otras tres ligasas del ADN de mamífero. Actualmente no está claro si las ligasas II y III del ADN proceden de genes separados o, mediante empalmes diferentes, del mismo gen (Roberts et al., 1994; Wang et al., 1994; Husain et al., 1995). No obstante, la ligasa II es inducida en respuesta a lesiones de alquilación (Creissen y Shall, 1982), sugiriendo un rol en la reparación del ADN. De forma similar, la elevación de los niveles de una variante de empalme de la ligasa III (ligasa III-\beta) en espermatocitos que están experimentando recombinación meiótica (Chen et al., 1995; Husain et al., 1995; Mackey et al., 1997) y la asociación de otra variante de empalme (ligasa III-\alpha) con la proteína de reparación del ADN XRCC1 (Caldecott et al., 1994; Thompson et al., 1990) son consistentes con que este enzima una roturas de hebras del ADN para completar la recombinación y reparación del ADN (Jessberger et al., 1993). Más aún, la ligasa III del ADN, cuando está presente en un complejo con la XRCC1, puede reconstituir el suceso de ligación necesario para completar in vitro la reparación de excisión de base (Kubota et al., 1996).

Un cuarto enzima, la ligasa IV del ADN, ha sido recientemente purificado a partir de células humanas, y tiene propiedades bioquímicas distintas de las otras ligasa (Robins y Lindahl, 1996). No obstante, la función fisiológica de la ligasa IV de mamíferos no está clara.

En la mayoría de procariotas sólo hay una ligasa del ADN, y este enzima cataliza todos los sucesos de unión del ADN durante la replicación, la recombinación y reparación (Lindahl y Barnes, 1992). Similarmente, los datos genéticos y bioquímicos sugieren que hay sólo una ligasa de ADN en Saccharomyces cerevisiae (Lindahl y Barnes, 1992), aunque el fraccionamiento de los extractos de células de levadura ha proporcionado indicación de actividad de una segunda ligasa de ADN (Tomkinson et al., 1992).

Los presentes inventores buscaron homólogos de la ligasa de ADN en el genoma de S. Cerevisiae, que fue completamente secuenciada recientemente (Goffeau et al., 1996; Oliver, 1996). Estas búsquedas identificaron un marco de lectura abierto (ORF), no caracterizado hasta la fecha, con similitud de secuencia a lo largo de toda su longitud con la ligasa IV de ADN de mamíferos. La sección experimental de más adelante describe los efectos de alterar este gen, que los inventores han denominado LIG4, sobre la replicación del ADN, la recombinación homóloga, y la reparación del ADN en respuesta a una variedad de agentes que dañan el ADN. Estos estudios muestran que el LIG4 juega un papel crucial en la reparación de la rotura de la doble hebra del ADN a través de la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ), pero que no tiene un papel esencial en otras vías de reparación del ADN estudiadas.

Más aún, se muestra que el LIG4 funciona en la misma vía de reparación del ADN que utiliza la proteína Ku unidora de extremos de ADN. No obstante, el fenotipo de las levaduras mutantes en lig4 no es idéntico al de aquellas levaduras con la función Ku alterada, revelando que Ku tiene roles adicionales en el mantenimiento del genoma.

En resumen, se sabía que el XRCC4 estaba implicado de alguna manera en la reparación asociada a Ku de roturas de la doble hebra del ADN (KADR), pero que su actividad biológica era oscura. Los presentes inventores han establecido por primera vez la actividad biológica de la XRCC4, que se une a la ligasa IV de ADN. Más aún, no se conocía la importancia fisiológica de la ligasa IV de ADN. Los inventores han establecido ahora que la ligasa IV de ADN es importante para la reparación de la rotura de la doble hebra del ADN a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ), identificando de forma inesperada y clonando, y a continuación mutando, un gen homólogo de levadura, y estableciendo una fuerte interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN.

Los inventores también han establecido que la XRCC4 interacciona con la DNA-PKcs/Ku, y muestran que la DNA-PKcs es capaz de fosforilar la XRCC4.

En base a éste y otros trabajos descritos más adelante, la presente invención proporciona, en varios aspectos, medios para la modulación de la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN.

Varios aspectos de la presente invención proporcionan medios para el uso de la XRCC4 y la ligasa IV de ADN en procedimientos de análisis y ensayos para agentes que modulan la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN.

Otros aspectos de la invención proporcionan medios para la modulación de la interacción entre la XRCC4 y la DNA-PKcs/Ku, y el uso de estas moléculas en procedimientos y ensayos de análisis para agentes que modulan la interacción entre la XRCC4 y la DNA-PKcs/Ku. Por simplicidad, muchos de los descubrimientos actuales se refieren a la XRCC4 y la ligasa IV de ADN. No obstante, a menos que el contexto requiera lo contrario, cada referencia tal debería tomarse como igualmente aplicable a la interacción entre la XRCC4 y la DNA-PKcs/Ku.

Los procedimientos para obtener agentes capaces de modular la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV del ADN (o, debe recordarse, la XRCC4 y la DNA-PKcs/Ku) incluye procedimientos en donde un punto final apropiado se usa para verificar la presencia o ausencia de una sustancia de ensayo. Más abajo se incluye una discusión detallada en relación a esto. No obstante, vale la pena destacar que la tecnología de biblioteca combinatoria proporciona una forma eficiente de ensayar un potencialmente vasto número de sustancias diferentes por su capacidad para modular la unión y/o actividad de un polipéptido. Tales bibliotecas y su uso son bien conocidas en la técnica, para todo tipo de productos naturales, moléculas pequeñas y péptidos, entre otros. El uso de una biblioteca de péptidos podría preferirse en ciertas circunstancias.

Los agentes apropiados podrían obtenerse, diseñarse y usarse para cualquiera de una variedad de propósitos.

Uno es la terapia anti-tumoral o anti-cáncer, particularmente el aumento de la radioterapia o quimioterapia. La radiación ionizante y las drogas radiomiméticas se usan comúnmente para tratar el cáncer causando lesiones en el ADN. Las células deficientes en la reparación del ADN, particularmente a través de la vía de la KADR, son hipersensibles a la radiación ionizante y los radiomiméticos. La evidencia proporcionada en ésta muestra que la vía de la KADR implica la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, indicando que la inhibición de su función, por ejemplo, inhibiendo su interacción tendrá un efecto sobre la vía de la KADR, la reparación del ADN y la sensibilidad celular a la radiación ionizante y radiomiméticos.

Otro es la potenciación del apuntamiento hacia un gen y de la terapia génica. La inhibición de la KADR podría usarse para incrementar la eficiencia del apuntamiento hacia un gen, de interés, y el uso final en terapia génica. Existen dos vías para reparar los cortes en la doble hebra del ADN (DSB). Una es a través del proceso de recombinación ilegítima (conocida también como unión de extremos no homólogos del ADN o NHEJ) y está catalizada por el sistema de la KADR, que ahora se sabe implica la XRCC4 y la ligasa IV de ADN. El otro sistema es el proceso de recombinación homóloga, en el que la molécula de ADN dañada intercambia información con una molécula pareja de ADN homóloga y no dañada. En las células de mamíferos, la vía ilegítima tiende a predominar. La inhibición del sistema de la KADR hará que aumente la proporción de DSB reparados mediante recombinación homóloga. Por tanto, los agentes anti-factor KADR, incluyendo aquéllos proporcionados de acuerdo con la presente invención, tendrán este efecto. El apuntamiento a genes homólogos se usa para fabricar ratones knock-out y otros animales transgénicos, pero no es muy eficiente, por tanto, el incremento de esta eficiencia de acuerdo con la presente invención será altamente beneficioso. En último lugar, el terapeuta de genes quisiera remplazar precisamente el gen mutado con uno funcional. Actualmente la prioridad es conseguir que el gen se integre en el genoma en cualquier lugar, pero el objetivo a largo plazo es la integración en el sitio correcto. Por tanto, los inhibidores de la KADR (por ejemplo, la XRCC4 y la ligasa IV, o la XRCC4 y/o la DNA-PKcs/Ku) tendrán un potencial terapéutico elevado en tal contexto.

Un propósito ulterior, relacionado, está en la terapia anti-retrovirus, ya que las vías de reparación del ADN, tales como las que implican la KADR y los componentes XRCC4 y la ligasa IV de ADN, están implicadas en efectuar de la integración del retrovirus y retrotransposón en el genoma de una célula huésped. Los retrovirus son un riesgo considerable para la salud de humanos y animales, causando, entro otros, el SIDA, varios cánceres, y la leucemia/linfoma de células T en humanos adultos. La integración del ADN retroviral en el genoma es esencial para la eficiente propagación viral, y podría apuntarse mediante inhibición de los componentes de la vía de reparación del ADN.

Adicionalmente, los moduladores de los componentes de la KADR, tales como la XRCC4 y la ligasa IV, la DNA-PKcs/Ku, podrían usarse en la modulación de la función del sistema inmune, puesto que tales factores son necesarios para la generación de genes maduros de inmunoglobulinas y receptores de las células T mediante recombinación V(D)J específica.

Los compuestos que estabilizan la interacción entre dos componentes, tales como la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, o la XRCC4 y la DNA-PKcs/Ku, y que podrían regularla actividad, podrían buscarse usando ensayos en los que las condiciones son demasiado duras para la interacción relevante. Podrían identificarse los agentes que estabilizan la interacción. Una alternativa es buscar sustancias que potenciar la actividad catalítica de la ligasa IV de ADN, las cuales podrían determinarse tal como se discute en otras partes. Un regulador de la actividad podría usarse para potenciar aún más la reparación del ADN, y esto podría ser en individuos normales, con posibles efectos beneficiosos a largo término teniendo en cuenta que muchas de las manifestaciones comunes del envejecimiento surgen a través de la acumulación inexorable de mutaciones en células somáticas. Los reguladores podrían usarse para tratar pacientes que tienen debilitada la vía de la KADR u otra vía de reparación del ADN.

La interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, o la XRCC4 y la DNA-PKcs/Ku, podría inhibirse mediante la inhibición de la producción de la proteína relevante. Por ejemplo, la producción de uno o más de estos componentes podría inhibirse usando el ácido nucleico apropiado para influenciar la expresión de la regulación anti-sentido. El uso de genes anti-sentido o de secuencias parciales de genes para desregular la expresión génica está ahora bien establecido. El ADN de doble hebra se coloca bajo el control de un promotor apropiado en una ``orientación invertida'', de tal forma que la transcripción de la hebra ``anti-sentido'' del ADN origine un ARN que es complementario al mARN normal transcrito a partir de la hebra ``con sentido'' del gen diana. Se cree que la secuencia de ARN anti-sentido complementaria se une entonces con el mARN para formar un dúplex, inhibiendo la traducción del mARN endógeno desde el gen diana a la proteína. Todavía es incierto si este es o no el modo de acción real. No obstante, es un hecho establecido que la técnica funciona.

Otra posibilidad es que se use ácido nucleico que durante la transcripción produce un ribozima, el cual es capaz de cortar el ácido nucleico en un sitio específico por tanto, útil también para influenciar la expresión génica. Las referencias para los ribozimas incluyen Kashani-Sabet y Scanlon, Cancer Gene Therapy 2(3):213-223 (1995), y Mercola y Cohen, Cancer Gene Therapy 2(1):47-59 (1995).

Por tanto, se proporcionan varios procedimientos y usos de moduladores, particularmente inhibidores, de la interacción y o actividad de la XRCC4 y ligasa IV de ADN, o XRCC4 y DNA-PKcs/Ku, como aspectos ulteriores de la presente invención. El propósito de alterar, interferir con, o modular la interacción entre la XRCC4 y ligasa IV de ADN, y/o XRCC4 y DNA-PKcs/Ku, podría se modular cualquier actividad mediada gracias a tal interacción, tal como se ha discutido más arriba y se discute más abajo.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra la co-purificación de la XRCC4 y la ligasa IV de ADN a partir de células HeLa.

La Figura 1A muestra los resultados de análisis de inmunotransferencias Western cuantitativas de la ligasa IV de ADN (rombos) y XRCC4 (cuadrados) (porcentaje de proteína) para varias fracciones de cada etapa cromatográfica o cromatografía de filtración en gel de la purificación de la ligasa IV de ADN a partir de células HeLa.

La Figura 1B muestra resultados de análisis de inmunotransferencias Western cuantitativas de la ligasa IV de ADN (rombos), XRCC4 (cuadrados) y ligasa III de ADN (círculos) (porcentaje de proteína) para varias fracciones de cada etapa del fraccionamiento en columna Mono S de la fracción marcada con un asterisco en la Figura 1A.

La Figura 2 muestra que el YOR005c codifica un homólogo de la ligasa IV de ADN de mamíferos, indicando las similitudes en la secuencia de aminoácidos entre el Lig4p de S. Cerevisiae (scLig4; el producto del ORF de YOR005c) y la ligasa IV de ADN humana (hLIGIV). El alineamiento se generó usando el programa PILEUP del paquete GCC (Genetics Computer Group, Wisconsin), y los residuos aminoácidos idénticos y similares se indican respectivamente mediante sombreado invertido y sombreado en gris, usando el programa BOXSHADE. Los residuos de aminoácidos se numeran desde los extremos amino de los polipéptidos de longitud completa. Se introdujeron intervalos para el alineamiento máximo. El residuo de lisina del sitio activo se indica con una punta de flecha. La región conservada ``núcleo'' de las ligasas de ADN de eucariotas y virus de eucariotas se marca con una barra.

La Figura 3 muestra que la LIG4 funciona en la vía dependiente de Ku para reparar el daño del ADN inducido por radiación ionizante. La sensibilidad de las diversas cepas de levadura a la muerte por radiación ionizante se juzgó mediante exposición a varias dosis de radiación. Las barras de error no se muestran por simplicidad; la desviación estándar es <5% en cada punto.

La Figura 3A muestra el % de supervivencia de las células para mutantes lig4/yku70, mutantes rad52, mutantes rad52/lig4, mutantes rad52/yku70, y mutantes rad52/lig4/yku70 a varias dosis, en kRad, de radiación ionizante.

La Figura 4 muestra la alteración de los resultados de LIG4 en una reducción dramática de la capacidad de reparar DSB cohesivos de ADN generados mediante enzimas de restricción en el ADN de plásmido (pBTM116), representando la recuperación de transformantes relativa a plásmidos control sin cortar, en los que varias cepas de levadura, del tipo salvaje y mutante, se transformaron con pBTM116 digerido con EcoRI (panel izquierdo) o PstI (panel derecho).

La Figura 5 muestra un modelo en el que la XRCC4 sirve como puente molecular para apuntar la ligasa IV de ADN hacia un DSB de ADN.

La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos y secuencia de nucleótidos codificante para S. Cerevisiae LIG4, proporcionada de acuerdo con los aspectos de la presente invención. La traducción empieza en el sitio de inicio indicado por la flecha.

Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de polipéptidos útiles en varios aspectos de la presente invención están disponibles en el GeneBank con los números de acceso siguientes: Ku70 humana - J04611; Ku80 humana - M30938; Ku70 de S. Cerevisiae - X70379; Ku80 de S. cerevisiae - Z49702; ligasa IV humana - X83441; ligasa IV de S. cerevisiae - YOR005c en el brazo derecho del cromosoma XV de S. cerevisiae, número de acceso Z74913; XRCC4 humana - U40622 (pauta de lectura abierta de 334 aminoácidos); DNA-PKcs humana - U4.7077 (Hartley et al. proporcionaron originariamente la secuencia, aunque carecía de intrón. Poltoratsky et al., proporcionaron una secuencia parcial incluyendo el intrón no incluido en la secuencia de Hartley et al. La secuencia disponible en el GeneBank está completa).

Todos los documentos y secuencias del GeneBank mencionados en cualquier lugar en esta especificación se incorporan por referencia.

La presente invención proporciona, en varios aspectos, medios para modular, interferir con, o interrumpir la interacción entre la proteína XRCC4 y la ligasa IV de ADN, usando un agente apropiado. La presente invención también proporciona medios en aspectos análogos para modular, interferir con, o interrumpir la interacción entre la proteína XRCC4 y la DNA-PKcs/Ku, usando un agente apropiado.

Tal agente capaz de modular la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV podría ser capaz de bloquear la unión entre un sitio ubicado dentro de los residuos 550-884 de la ligasa IV humana, el cual podría estar entre los dominios BRCT, y un sitio en la XRCC4 humana. El sitio en la ligasa IV de ADN podría ser los residuos 677-727. La secuencia completa de aminoácidos de la proteína XRCC4 ha sido elucidada, y se detalla en Li et al., (Cell 83:1079-1089 (1995)), la cual se incorpora en esta por referencia, y cuya numeración de residuos aminoácidos se usa junto con la secuencia codificante de ácidos nucleicos. La referencia del GeneBank se indica más arriba. Las secuencias de aminoácidos y codificante de nucleótidos de la ligasa IV de ADN se hallan en Wei et al., de la cual se usa la numeración de residuos aminoácidos, mostrándose las secuencias de levaduras LIG4 en la Figura 6. Las referencias del GeneBank se indican más arriba.

Hay que destacar que, recientemente, Wilson et al., Nature 388:495-498 (1997), han sugerido que la metionina inicial de la ligasa IV de ADN humana se halla cadena arriba respecto la indicada por Wei et al., 1995, cuya numeración de la secuencia de aminoácidos se usa en ésta. Consultar el artículo de Wilson para más detalles. Los presentes inventores tienen datos preliminares que están en desacuerdo con los de Wilson. No obstante, si se probara que Wilson está en lo cierto, esto no tendría consecuencias sobre aspecto alguno de la presente invención. La presencia o ausencia de aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal de la ligasa IV de ADN es improbable que tenga efecto alguno sobre su interacción con la XRCC4, y permanece el hecho de que el trabajo de los presentes inventores muestra la interacción de la XRCC4 con la ligasa IV de ADN, la cual ocurre en células humanas.

Podrían identificarse agentes mediante técnicas de análisis que implican determinar si un agente que está siendo ensayado inhibe o altera la unión de la proteína ligasa IV de ADN, o un fragmento apropiado de la misma (por ejemplo, que incluya los residuos aminoácidos 550-884, los residuos 591-676, los residuos 728-844, o los residuos 677-727, o un fragmento menor de cualquiera de estas regiones) de la ligasa IV de ADN humana con la XRCC4, o un fragmento de la misma, o un fragmento análogo apropiado o variante de la misma.

Los fragmentos apropiados de la XRCC4 o la ligasa IV de ADN incluyen aquéllos que incluyen residuos que interaccionan con la proteína contrapartida. Los fragmentos más pequeños, y los análogos y variantes de este fragmento podrían emplearse similarmente, por ejemplo, tal como se identifican mediante técnicas tales como el análisis de supresión o el barrido de alanina.

Por tanto, la presente invención proporciona un fragmento de péptido de la XRCC4 que es capaz de unir la ligasa IV de ADN y/o inhibir la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, y proporciona un fragmento de péptido de la ligasa IV de ADN que es capaz de unir la ligasa IV de ADN y/o inhibir la interacción entre la ligasa IV de ADN y la XRCC4, pudiendo obtenerse tales fragmentos peptídicos mediante medios de análisis de supresión y/o barrido de alanina de la proteína relevante efectuando una mutación apropiada en la secuencia, poniendo en contacto un fragmento mutado de una de las proteínas con la otra o un fragmento de la misma, y determinando la interacción. En las realizaciones preferidas, el péptido es corto, tal como se discute más abajo, y podría ser una porción mínima que es capaz de interaccionar con la proteína contrapartida relevantes y/o inhibir la interacción relevante.

Por supuesto, consideraciones similares se aplican a la porciones que interaccionan de la XRCC4 y DNA-PKcs/Ku.

Los procedimientos y ensayos de búsqueda se discuten con mayor detalle más abajo.

Una clase de agentes que pueden usarse para alterar la unión de la XRCC4 y la ligasa IV de ADN son los péptidos que se basan en los motivos de secuencia de la XRCC4 o la ligasa IV de ADN que interaccionan con la ligasa IV o XRCC4 de contrapartida. Tales péptidos tienden a ser cortos, y podrían ser de aproximadamente 40 aminoácidos o menos de longitud, preferiblemente de aproximadamente 35 aminoácidos o menos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 35 aminoácidos o menos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 30 aminoácidos o menos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 25 aminoácidos o menos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 20 aminoácidos o menos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 15 aminoácidos o menos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 10 aminoácidos o menos de longitud, ó 9, 8, 7, 6, 5 o menos de longitud. La presente invención también abarca péptidos que son variantes o derivados de secuencias de una secuencia de XRCC4 o ligasa IV de ADN del tipo salvaje, pero que retienen la capacidad de interaccionar con la ligasa IV de ADN o XRCC4 (respectivamente, como pudiera ser el caso) y/o la capacidad de modular la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN.

En vez de usar un fragmento de la XRCC4 o ligasa IV de ADN del tipo salvaje, un péptido o polipéptido podría incluir una secuencia de aminoácidos que difiere en uno o más residuos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del tipo salvaje, por una o más de entre la adición, sustitución, supresión y sustitución de uno o más aminoácidos. Por tanto, se incluyen las variantes, derivados, alelos, mutantes y homólogos, por ejemplo, procedentes de otros organismos.

Preferiblemente, las secuencias de aminoácidos comparten homología con un fragmento de la secuencia de un fragmento de la XRCC4 o ligasa IV de ADN relevante, mostrando preferiblemente al menos aproximadamente un 30%, ó 40%, ó 50%, ó 60%, ó 70%, ó 75%, u 80%, u 85% de homología, o al menos aproximadamente el 90% ó 95% de homología. Por tanto, un fragmento de péptido de la XRCC4 o ligasa IV de ADN podría incluir 1, 2, 3, 4, 5, más de 5, o más de 10 alteraciones de aminoácidos, tales como sustituciones, con respecto la secuencia del tipo salvaje.

Un derivado de un péptido para el que se descubre en ésta la secuencia específica podría tener en ciertas realizaciones la misma longitud o ser más corto que el péptido específico. En otras realizaciones podría incluirse la secuencia del péptido o una variante de la misma en un péptido mayor, como se ha discutido más arriba, el cual podría incluir o no una porción adicional de la XRCC4 o de la ligasa IV de ADN. Podrían incluirse 1, 2, 3, 4, 5 o más aminoácidos adicionales, adyacentes al fragmento de péptido específico relevante en la XRCC4 o ligasa IV de ADN, o heterólogo a las mismas, en un extremo o en ambos extremos del péptido.

No debería olvidarse que la referencias a la XRCC4 y a la ligasa IV de ADN se aplican igualmente a la XRCC4 y la DNA-PKcs/Ku.

Como se comprende de forma correcta, la homología a nivel de aminoácidos es generalmente en términos de similitud o identidad de aminoácidos. La similitud permite ``la variación conservadora'', es decir, la sustitución de un residuo hidrofóbico tal como la isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, tal como la arginina por lisina, el glutámico por ácido aspártico, o la glutamina por asparagina. La similitud podría ser como es definida y determinada por el programa TBLASTN, de Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), el cual es de uso estándar en la técnica. La homología podría ser a lo largo de toda la longitud del péptido relevante, o a lo largo de una secuencia contigua de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 50, 75, 100 o más aminoácidos, comparada con la secuencia de aminoácidos del tipo salvaje relevante.

Tal como se ha destacado, podrían emplearse secuencias peptídicas variantes y análogos y miméticos peptídicos y no peptídicos, tal como se discute más adelante.

Varios aspectos de la presente invención proporcionan una sustancia, la cual podría ser una molécula única o una composición incluyendo dos o más componentes, la cual incluye un fragmento peptídico de la XRCC4 o ligasa IV de ADN, la cual incluye una secuencia como la incluida en la entrada relevante del GeneBank, un péptido consistente esencialmente de tal secuencia, un péptido incluyendo una secuencia variante, derivada o análoga, o un análogo o mimético no peptídico que tiene la capacidad de unir la XRCC4 o ligasa IV de ADN y/o modular, alterar o interferir con la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN.

Las variantes incluyen péptidos en los que pueden sustituirse aminoácidos individuales por otros aminoácidos que estén estrechamente relacionados, tal como se entiende en la técnica y se indica más arriba.

Las imitaciones no peptídicas de péptidos se discuten con más detalle más adelante.

Tal como se ha destacado, un péptido según la presente invención y para su uso en varios aspectos de la presente invención podría incluir, o consistir esencialmente en, un fragmento de la XRCC4 o la ligasa IV de ADN tal como se descubre, tal como un fragmento cuya secuencia está incluida en la entrada relevante del GeneBank. Cuando se incluyen uno o más aminoácidos adicionales, tales aminoácidos podrían proceder de la XRCC4 o de la ligasa IV de ADN, o podrían ser heterólogos o ajenos a la XRCC4 o a la ligasa IV de ADN. Un péptido podría incluirse también en una proteína de fusión mayor, particularmente cuando el péptido se fusiona con una secuencia que no es de XRCC4 o de ligasa IV de ADN (es decir, heteróloga o ajena), tal como un polipéptido o dominio proteico.

La invención también incluye derivados del péptido, incluyendo el péptido unido a un compañero unidor por ejemplo, una molécula efectora, una marca, una droga, una toxina, y/o un portador o molécula de transporte, y/o una molécula apuntadora tal como un anticuerpo, o fragmento unidor del mismo, u otro ligando. Las técnicas para acoplar los péptidos de la invención tanto a compañeros unidores no peptídicos como peptídicos son bien conocidas en la técnica. En una realización, la molécula portadora es una secuencia peptídica de 16 aa derivada del homeodominio de Antennapedia (por ejemplo, como el vendido bajo el nombre ``Penetratin''), la cual puede acoplarse a través de un residuo Cys terminal. La molécula ``Penetratin'' y sus propiedades se describen en WO-91/18981.

Los péptidos podrían generarse total o parcialmente mediante síntesis química. Los compuestos de la presente invención pueden prepararse fácilmente de acuerdo con procedimientos estándares y bien establecidos de síntesis líquida o, preferiblemente, sólida de péptidos, de los cuales hay descripciones generales ampliamente disponibles (ver, por ejemplo, en J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª edición, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), en M. Bodanzsky y A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Nueva York (1984); y Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California), o podrían prepararse en solución, mediante el procedimiento de fase líquida o mediante cualquier combinación de fase sólida, fase líquida y química en solución, por ejemplo, completando primero la porción de péptido respectiva, y, a continuación, si se desea y es apropiado, después de retirar cualquier grupo protector que estuviera presente, mediante la introducción del residuo X mediante reacción del respectivo ácido carbónico o sulfónico, o de un reactivo derivado de los mismos.

Otra forma conveniente de producir una molécula peptídica de acuerdo con la presente invención (péptido o polipéptido) es expresar el ácido nucleico que la codifica mediante el uso del ácido nucleico en un sistema de expresión.

En consecuencia, la presente invención también proporciona, en varios aspectos, ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos y péptidos de la invención.

Generalmente, el ácido nucleico según la presente invención se proporciona como un aislado, en forma aislada y/o purificada, o libre o sustancialmente libre de material con el que podría estar asociado naturalmente, tal como libre o sustancialmente libre del ácido nucleico que flanquea el gen en el genoma humano, excepto posiblemente por una o más secuencia(s) reguladora(s) de la expresión. El ácido nucleico podría ser total o parcialmente sintético, y podría incluir ADN genómico, cADN, o ARN. Cuando el ácido nucleico según la invención incluye ARN, la referencia a la secuencia mostrada debería constreñirse como referencia a la equivalente de ARN, con U sustituyendo a T.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido o péptido de acuerdo con la presente invención pueden ser fácilmente preparadas por la persona formada usando la información y referencias contenidas en ésta y las técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, ver Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992), dados la secuencia de ácido nucleico y los clones disponibles. Estas técnicas incluyen (i) el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar muestras de tal ácido nucleico, por ejemplo, a partir de fuentes genómicas, (ii) síntesis química, o (iii) preparar secuencias de cADN. El ADN codificando fragmentos de la XRCC4 y ligasa IV de ADN podría generarse y usarse en cualquier forma apropiada conocida por aquéllos con formación en la técnica, incluyendo el tomar ADN codificante, identificar sitios de reconocimiento de enzimas de restricción apropiados en cualquier lado de la porción a expresar, y recortar dicha porción del ADN. La porción podría entonces unirse operativamente a un promotor apropiado en un sistema de expresión estándar comercialmente disponible. Otra estrategia de recombinación es amplificar la porción relevante del ADN con cebadores de PCR apropiados. Pueden hacerse modificaciones a las secuencias de la XRCC4 y ligasa IV de ADN, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida hacia un sitio, para conducir a la expresión de péptido modificado de XRCC4 o ligasa IV de ADN, o para tener en cuenta la preferencia de codón en las células huésped usadas para expresar el ácido nucleico.

Con objeto de obtener la expresión de las secuencias del ácido nucleico, las secuencias se pueden incorporar en un vector que tiene una o más secuencias de control operativamente unidas al ácido nucleico para controlar su expresión. Los vectores podrían incluir otras secuencias tales como promotores o potenciadores para dirigir la expresión del ácido nucleico insertado, las secuencias de ácido nucleico de forma que el polipéptido o péptido de interés se produce como una fusión y/o ácido nucleico que codifica señales de secreción, de forma que le polipéptido producido en la célula huésped es secretado de la célula. El polipéptido puede entonces obtenerse transformando los vectores en células huésped en las que el vector es funcional, cultivando las células huésped de forma que se produce el polipéptido, y recuperando el polipéptido de las células huésped o del medio que las rodea. Las células procariotas y eucariotas se usar para este propósito en la técnica, incluyendo cepas de E. coli, levaduras, y células eucariotas tales como células COS o CHO.

Por tanto, la presente invención también abarca un procedimiento para preparar un polipéptido o péptido (tal como el descubierto), incluyendo el procedimiento la expresión a partir de ácido nucleico que codifica el polipéptido o péptido (generalmente ácido nucleico de acuerdo con la invención). Esto podría conseguirse convenientemente haciendo crecer una célula huésped en cultivo, conteniendo un vector tal, bajo condiciones apropiadas que causarán o permitirán la expresión del polipéptido. Los polipéptidos o péptidos también podrían expresarse en sistemas in vitro, tales como el lisado de reticulocitos.

Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped diferentes son bien conocidos. Las células huésped apropiadas incluyen bacterias, células eucariotas tales como de mamíferos y levaduras, y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamíferos disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen las células ováricas de hámster chino, las células HeLa, las células renales de crías de hámster, las células COS, y muchas otras. Una célula huésped común preferida es E. coli.

Los vectores apropiados pueden escogerse o construirse, conteniendo secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos terminadores, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores, y otras secuencias según convengan. Los vectores podrían ser plasmídicos, virales, por ejemplo, fagos o fagémidos, según convenga. Para más detalles consultar, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión de genes, y análisis de proteínas, se describen con detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992.

Por tanto, un aspecto ulterior de la presente invención proporciona una célula huésped que contiene ácido nucleico heterólogo tal como se descubre en ésta.

El ácido nucleico de la invención podría estar integrado en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula huésped. La integración podría estar promovida por la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas estándares. El ácido nucleico podría ser un vector extra-cromosómico dentro de la célula, o identificable de otra forma como heterólogo o ajeno a la célula.

Todavía otro aspecto proporciona un procedimiento que incluye introducir el ácido nucleico en una célula huésped. La introducción, que podría (particularmente para la introducción in vitro) denominarse generalmente sin limitación como ``transformación'', podría emplear cualquier técnica disponible. Para células eucariotas, las técnicas apropiadas podrían incluir la transfección mediante fosfato cálcico, la DEAE-dextrano, la electroporación, la transfección mediada por liposomas y la transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplos, el virus de la viruela o, para células de insectos, baculovirus. Para células bacterianas, las técnicas apropiadas podrían incluir la transformación con cloruro cálcico, la electroporación y la transfección usando bacteriófagos. Como una alternativa, podría emplearse la inyección directa de ácido nucleico.

Los genes marcadores, tales como los genes de resistencia o sensibilidad a antibióticos, podrían usarse para identificar clones que contengan ácido nucleico de interés, como es bien conocido en la técnica.

La introducción podría seguirse causando o permitiendo la expresión desde el ácido nucleico, por ejemplo, cultivando células huésped (las cuales podrían incluir células que han sido transformadas, aunque más probablemente las células serán descendientes de las células transformadas) en condiciones para la expresión del gen, de forma que se produzca el polipéptido (o péptido) codificado. Si el polipéptido se expresa acoplado a un péptido líder señalizador apropiado, este podría secretarse desde la célula hacia el medio de cultivo. Siguiendo la producción mediante expresión, podría aislarse un polipéptido o péptido y/o purificarse a partir de la célula huésped y/o del medio de cultivo, como pudiera ser el caso, y usarse subsiguientemente como se desee, por ejemplo, en la formulación de una composición que podría incluir uno o más componentes adicionales, tal como una composición farmacéutica que incluye uno o más excipientes, vehículos o portadores farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, ver más abajo).

La introducción de ácido nucleico codificando una molécula peptídica de acuerdo con la presente invención podría tener lugar in vivo mediante terapia génica, para alterar o interferir con la interacción entre la XRCC4 o la ligasa IV de ADN.

Por tanto, una célula huésped conteniendo ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, a resultas de la introducción del ácido nucleico en la célula o dentro de una predecesora de la célula, y/o a la alteración genética de la secuencia endógena de la célula o predecesora (introducción o alteración que podría tener lugar in vivo o ex vivo), podría estar comprendida (por ejemplo, en el soma) dentro de un organismo que es un animal, particularmente un mamífero, que podría ser humano o no humano, tal como un conejo, conejillo de indias, rata, ratón, u otro roedor, gato, perro, cerdo, oveja, cabra, vaca, o caballo, o que es un pájaro, tal como una gallina. Los animales modificados genéticamente o los animales transgénicos también se proporcionan como aspectos ulteriores de la presente invención.

Ésta podría tener un objetivo terapéutico. (La terapia génica se discute más adelante). También, la presencia de un mutante, alelo, secuencia derivada o variante dentro de las células de un organismo, particularmente cuando se halla en lugar de una secuencia homóloga endógena, podría permitir que el organismo fuera usado como un modelo para verificar y/o estudiar sustancias que modulan la actividad del polipéptido codificado in vitro, o que están indicadas como potencialmente terapéuticas. Por ejemplo, podrían usarse ratones knock-out para ensayar la radiosensibilidad. No obstante, de forma conveniente, al menos los ensayos preliminares de tales sustancias podrían realizarse in vitro, esto es, dentro de células huésped o en sistemas carentes de células. Cuando se establece un efecto de un compuesto de ensayo sobre células in vitro, aquellas células, o células del mismo tipo o similar, podrían injertarse en un animal huésped apropiado para ensayos in vivo.

Los procedimientos de análisis apropiados son convencionales en la técnica. Estos incluyen técnicas tales como el radioinmunoensayo, el ensayo de proximetría de centelleo, y los procedimientos de ELISA. De forma apropiada, o la proteína XRCC4 o un fragmento, o la ligasa IV de ADN o un fragmento, o un análogo, derivado, variante o imitación funcional de las mismas, se inmoviliza, momento a partir del cual se aplica la otra en presencia de los agentes a ensayar. En el ensayo de proximetría de centelleo, un fragmento de proteína biotinilado se une a cuentas impregnadas de compuesto centelleante y recubiertas con estreptoavidina (producidas por Amersham). La unión de péptido radiomarcado se mide a continuación determinando el centelleo inducido por la radiactividad a medida que el péptido radiactivo se une al fragmento inmovilizado. Los agentes que interceptan esto son, por tanto, inhibidores de la interacción. Más adelante se discuten otras formas y medios de búsqueda de agentes que modulan la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN.

En un aspecto general, la presente invención proporciona un procedimiento de ensayo de una sustancia con capacidad para modular, por ejemplo, alterar o interferir con la interacción o unión entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, incluyendo el procedimiento:

(a): poner en contacto una sustancia de acuerdo con la invención que incluye un fragmento peptídico de la XRCC4 o un derivado, variante o análogo de la misma, según se descubre, una sustancia que incluye el fragmento relevante de ligasa IV de ADN, o una variante, derivado o análogo del mismo, y un compuesto de ensayo, en condiciones en las que, en ausencia del compuesto de ensayo que es un inhibidor de la interacción o unión de dichas sustancias, dichas sustancias interaccionan o se unen; y

(b): determinar la interacción o unión entre dichas sustancias.

Por tanto, podría identificarse un compuesto de ensayo que altera, reduce, interfiere con, o suprime total o parcialmente la unión o interacción entre dichas sustancias (por ejemplo, incluyendo un fragmento de la XRCC4 e incluyendo un fragmento de la ligasa IV de ADN), y que modula la actividad de la XRCC4 y/o ligasa IV de ADN.

Otro aspecto general de la presente invención proporciona un procedimiento de ensayo para una sustancia capaz de unir la región relevante de la XRCC4 o ligasa IV de ADN, como pudiera ser el caso, incluyendo el procedimiento:

(a): poner en contacto una sustancia que incluye un fragmento peptídico de la XRCC4 que interacciona con la ligasa IV de ADN, tal como se descubre, o que incluye un fragmento de péptido de la ligasa IV de ADN que interacciona con la XRCC4, o una variante, derivado o análogo de tal fragmento peptídico, como se ha descubierto, y un compuesto de ensayo; y

(b): determinar la unión entre dichas sustancia y el compuesto de ensayo.

Un compuesto de ensayo que se halla que une la porción relevante de la XRCC4 podría ensayarse por su capacidad para modular, por ejemplo, interrumpir o interferir con, la interacción de la XRCC4 o la unión con la ligasa IV de ADN, y/o la capacidad de afectar la actividad de la ligasa IV de ADN y/o la XRCC4, u otra actividad mediada por la XRCC4 o la ligasa IV de ADN, tal como ya se ha discutido más arriba.

Similarmente, un compuesto de ensayo que se halla que une la porción relevante de la ligasa IV de ADN podría ensayarse por su capacidad para modular, por ejemplo, interrumpir o interferir con, la interacción de la ligasa IV de ADN o la unión con la XRCC4, y/o la capacidad de afectar la actividad de la XRCC4 y/o la ligasa IV de ADN, u otra actividad mediada por la ligasa IV de ADN o la XRCC4, tal como ya se ha discutido más arriba.

Estos aspectos se aplican igualmente a la interacción entre la DNA-PKcs/Ku y la XRCC4. Más aún, puesto que la DNA-PKcs/Ku fosforila la XRCC4, la determinación de tal fosforilación puede usarse en un ensayo apropiado.

Un aspecto ulterior de la presente invención proporciona un procedimiento de ensayo que incluye:

(a): poner en contacto una sustancia que incluye al menos un fragmento de DNA-PKcs/Ku que fosforila la XRCC4, una sustancia que incluye al menos un fragmento de XRCC4, incluyendo un sitio fosforilado por la DNA-PKcs/Ku, y un compuesto de ensayo; y

(b): determinar la fosforilación en dicho sitio.

Por supuesto, en un ensayo tal podría emplearse cualquier variante o derivado apropiado de la DNA-PKcs/Ku y/o XRCC4.

La fosforilación podría determinarse, por ejemplo, inmovilizando la XRCC4 o un fragmento, variante o derivado de la misma, por ejemplo, sobre una cuenta o placa, y detectando la fosforilación usando un anticuerpo u otra molécula unidora que se una al sitio de fosforilación relevante con una afinidad diferente cuando el sitio está fosforilado respecto cuando el sitio no está fosforilado. Tales anticuerpos podrían obtenerse por medios de cualquier técnica estándar, tal como se discute en otros sitios en ésta, por ejemplo, usando un péptido fosforilado (tal como un fragmento de la XRCC4). La unión de una molécula unidora que discrimina entre la forma fosforilada y no fosforilada de la XRCC4 o fragmento, variante o derivado de la misma relevante, podría verificarse usando cualquier técnica disponible a aquéllos formados en la técnica, la cual podría implicar determinar la presencia de una marca apropiada, tal como la fluorescencia. La fosforilación podría determinarse inmovilizando la XRCC4, o un fragmento, variante o derivado de la misma, sobre un sustrato apropiado, tal como una cuenta o placa, en donde el sustrato está impregnado con compuesto centelleante, tal como en un ensayo estándar de proximetría de centelleo, siendo determinada la fosforilación a través de la medición de la incorporación de fosfato radiactivo. En vez de inmovilizar la XRCC4, su fosforilación por parte de la DNA-PKcs/Ku podría ensayarse permitiendo que su radiomarcaje u otro marcaje en solución, con un miembro de unión específica apropiado, tal como un anticuerpo o ligasa IV de ADN, o usándose un fragmento unidor de la XRCC4 de la misma para extraerla para determinar el marcaje. La incorporación de fosfato en la XRCC4 o un fragmento, variante o derivado de la misma, podría determinarse mediante precipitación con ácido, tal como el ácido tricloroacético, y recolección del precipitado sobre un material apropiado, tal como el papel de filtro de nitrocelulosa, seguida por la medición de la incorporación del fosfato radiomarcado. La separación mediante SDS-PAGE del sustrato podría emplearse, seguida por detección del radiomarcaje.

Otro aspecto general de la presente invención proporciona un procedimiento de ensayo para una sustancia capaz de afectar la actividad de la ligasa IV de ADN cuando interacciona con la XRCC4, incluyendo el procedimiento:

(a): poner en contacto la ligasa IV de ADN y un compuesto de ensayo en presencia de XRCC4; y

(b): determinar la actividad ligasa IV de ADN.

La actividad de la ligasa IV de ADN podría determinarse en presencia y ausencia de la XRCC4 para permitir que un efecto de un compuesto de ensayo sobre la actividad sea atribuido a un efecto sobre la interacción entre la ligasa IV de ADN y la XRCC4.

La actividad de la ligasa IV de ADN podría determinarse convenientemente por medio de su adenilación. La ligasa IV de ADN podría incubarse con ATP radiomarcado (por ejemplo, como se describe más abajo) o cualquier análogo apropiado del ATP que interaccione con la ligasa IV de ADN de forma análoga, de forma que el radiomarcaje se incorpora en la ligasa. (La ligasa pasa a través de un intermediario enzima-AMP adenilado). Tal incorporación de radiomarcaje podría detectarse mediante varias estrategias, incluyendo, por ejemplo, el ensayo de proximetría de centelleo. Por tanto, el radiomarcado de la ligasa IV de ADN podría determinarse en presencia y en ausencia de XRCC4. La pre-adenilación de la ligasa IV de ADN con radiomarcaje permite ensayar la descarga de radiomarcaje.

Otra actividad de la ligasa IV de ADN que podría determinarse es la unión de hebras de ADN mediada por ligasa IV de ADN. Por ejemplo, podrían proporcionarse dos moléculas de ADN, cada una de las cuales incluye un sitio al que se une un cebador de PCR en condiciones apropiadas. Cuando las dos moléculas de ADN son unidas covalentemente por la ligasa IV de ADN para formar una única molécula de ADN, el resultado es una plantilla de PCR que puede amplificarse usando los cebadores. En ausencia de ligación no resulta producto alguno de la PCR. La cantidad de producto de la PCR obtenido en una reacción determinada se puede cuantificar con respecto a la actividad ligasa de ADN. Otra opción es unir una molécula de ADN a un soporte insoluble, y añadir otra molécula de ADN marcada. A continuación de la adición de ligasa IV de ADN, en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo y una paso de lavado, la unión de la segunda molécula al soporte, que tan sólo puede tener lugar a través de la ligación a la molécula de ADN unida sobre el soporte, puede determinarse a través de la marca y relacionarse con la actividad ligasa IV de ADN. Aún otro ensayo podría incluir la unión de extremos de ADN, por ejemplo, tal como fue descrito por Gawunder et al., 1997.

Una sustancia que se halla que es capaz de modular la actividad ligasa IV de ADN en presencia de XRCC4 podría emplearse en un ensayo similar usando la ligasa I de ADN y/o la ligasa III de ADN, con objeto de verificar su especificidad por la ligasa IV de ADN.

Las prestaciones de un procedimiento de ensayo según la presente invención podrían seguirse mediante aislamiento y/o fabricación y/o uso de un compuesto, sustancia, o molécula que de positivo en el ensayo por su capacidad para modular la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, y/o inhibir la actividad de la XRCC4 o ligasa IV de ADN, o una actividad mediada.

El formato preciso de un ensayo de la invención podría ser variado por aquéllos formados en la técnica usando formación y conocimiento rutinarios. Por ejemplo, la interacción entre sustancias podría estudiarse in vitro marcando una con una marca detectable, y poniéndola en contacto con la otra, la cual ha sido inmovilizada sobre un soporte sólido. Las marcas detectables apropiadas, especialmente para sustancias peptídicas, incluyen la ^{35}S-metionina, la cual podría incorporarse en péptidos y polipéptidos producidos de forma recombinante. Los péptidos y polipéptidos producidos de forma recombinante también podrían expresarse como una proteína de fusión conteniendo un epítopo que puede marcarse con un anticuerpo.

La proteína que se inmoviliza sobre un soporte sólido podría inmovilizarse usando un anticuerpo contra esa proteína unido a un soporte sólido o a través de otras tecnologías que son conocidas por sí mismas. Una interacción in vitro preferida podría utilizar una proteína de fusión que incluyera una glutatión-S-transferasa (GST). Ésta podría inmovilizarse sobre cuentas de agarosa con glutatión. En un formato de ensayo in vitro del tipo descrito más arriba, un compuesto de ensayo puede ensayarse determinando su capacidad de disminuir la cantidad de péptido o polipéptido marcado que se une al polipéptidos de fusión-GTS inmovilizado. Ésta podría determinarse fraccionando las cuentas de glutatión-agarosa mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Alternativamente, las cuentas podrían lavarse para retirar la proteína no unida y la cantidad de proteína que está unida puede determinarse contando la cantidad de marcador presente, por ejemplo, en un contador de centelleo apropiado.

Un ensayo de acuerdo con la presente invención también podría tomar la forma de un ensayo in vivo. El ensayo in vivo podría realizarse en una línea celular tal como una cepa de levadura o una línea celular de mamífero, en la que los péptidos o polipéptidos relevantes se expresan a partir de uno o más vectores introducidos en la célula.

La capacidad de un compuesto de ensayo para modular la interacción o unión entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN podría determinarse usando el llamado ensayo de dos híbridos.

Por ejemplo, un polipéptido o péptido conteniendo un fragmento de la XRCC4 o de la ligasa IV de ADN, como pudiera ser el caso, o un análogo peptídico o variante del mismo, tal como se ha descubierto, podría fusionarse a un dominio de unión del ADN, tal como el del factor de transcripción GAL 4 de levadura. El factor de transcripción GAL 4 incluye dos dominios funcionales. Estos dominios son el dominio de unión del ADN (GAL4DBD) y el dominio de activación de la transcripción del GAL4 (GAL4TAD). Fusionando un polipéptido o péptido a uno de esos dominios, y otro polipéptido o péptido a la contrapartida respectiva, se restaura un factor de transcripción GAL 4 funcional sólo cuando dos polipéptidos o péptidos de interés interaccionan. Por tanto, la interacción de los polipéptidos o péptidos podría medirse mediante el uso de un gen informador, probablemente unido al sitio de unión del ADN del GAL 4, que es capaz de activar la transcripción de dicho gen informador. Este formato de ensayo fue descrito por Fields y Song, Nature 340:245-246 (1989). Este tipo de formato de ensayo puede usarse tanto en células de mamífero como en levaduras. Hay otras combinaciones de dominio de unión de ADN y dominio de activación de la transcripción en la técnica, y podrían ser preferibles, tales como el dominio de unión de ADN LexA y el dominio de activación de la transcripción VP60.

Para tomar el análisis de dos híbridos de Lex/VP60 a modo de ejemplo con el propósito de ilustrar, las células de levadura o de mamífero podrían transformarse con una construcción de gen informador, la cual expresa una proteína marcadora selectiva (por ejemplo, codificando una \beta-galactosidasa o luciferasa). El promotor de ese gen se diseña de tal forma que contiene el sitio de unión para la proteína unidora de ADN LexA. La expresión del gen a partir del plásmido es usualmente muy baja. Podrían transformarse dos o más vectores de expresión en la levadura que contiene el plásmido de expresión del marcador seleccionable, conteniendo uno la secuencia codificante para la totalidad de la longitud del gen de la LexA unido a un sitio de clonación múltiple. Este sitio de clonación múltiple se usar para clonar un gen de interés, es decir, codificar un polipéptido o péptido de la XRCC4 o de la ligasa IV de ADN según la presente invención, en pauta con la región codificante de la LexA. El segundo vector de expresión contiene entonces el dominio de activación del transactivador VP16 del virus del herpes simple, fusionado a una secuencia peptídica de ensayo o, más preferiblemente, a una biblioteca de secuencias codificando péptidos con secuencias diversas, por ejemplo, aleatorias. Esos dos plásmidos facilitan la expresión a partir de la construcción del informador que contiene el marcador seleccionable sólo cuando la construcción de fusión del LexA interacciona con una secuencia polipeptídica o peptídica derivada de la biblioteca de péptidos.

Una modificación de esto cuando se buscan péptidos u otras sustancias que interfieren con la interacción entre un polipéptido o péptido de la XRCC4 o un polipéptido o péptido de la ligasa IV de ADN, emplea el polipéptido o péptido de la XRCC4 o ligasa IV de ADN como una fusión con el dominio unidor de ADN de la LexA, y el polipéptido o péptido contrapartida de la ligasa IV de ADN o XRCC4 como una fusión con VP60, e implica un tercer cassette de expresión, el cual podría estar en un vector de expresión distinto, a partir del cual podrían expresarse un péptido o una biblioteca de péptidos de secuencia diversa y/o aleatoria. Una reducción en la expresión del gen informador (por ejemplo, en el caso de la \beta-galactosidasa un debilitamiento del color azul) resulta de la presencia de un péptido que altera la interacción XRCC4/ligasa IV de ADN, interacción que es necesaria para la activación de la transcripción del gen de la \beta-galactosidasa. Cuando una sustancia de ensayo no es peptídica y no se puede expresar a partir de ácido nucleico dentro de un tercer cassette de expresión, podría emplearse un sistema similar suministrándose exógenamente la sustancia de ensayo.

Tal como se ha destacado, en vez de usar LexA y VP60, podrían usarse otras combinaciones similares de proteínas, la cuales forman juntas un activador de la transcripción funcional, tales como el dominio unidor de ADN de GAL4 y el dominio de activación de la transcripción de GAL4.

Cuando se realiza un ensayo de dos híbridos para buscar sustancias que interfieren con la interacción entre dos polipéptidos o péptidos, podría ser preferible usar células de mamífero en vez de células de levadura. Se aplican los mismos principios y los procedimientos apropiados son bien conocidos por los especialistas en la técnica.

La cantidad de sustancia o compuesto de ensayo que podría añadirse a un ensayo de la invención normalmente se determinará mediante prueba y error, dependiendo del tipo de compuesto usado. Típicamente, podría usarse desde aproximadamente 0,01 nM hasta 100 \muM o más de concentración de compuesto inhibidor, por ejemplo, desde 0,1 hasta 50 \muM, tal como aproximadamente 10 \muM. Podrían usarse concentraciones superiores cuando la sustancia de ensayo es un péptido. Incluso una molécula con una unión débil podría ser un compuesto líder útil para posterior investigación y desarrollo.

Los compuestos que podrían usarse podrían ser compuestos químicos naturales o sintéticos usando en programas de búsqueda de drogas. También podrían usarse extractos de plantas que contienen varios componentes caracterizados o no caracterizados.

Los anticuerpos dirigidos contra el sitio de interacción en cualquier proteína forman otra clase de compuestos inhibidores putativos. Podrían caracterizarse los anticuerpos inhibidores candidatos, y determinarse sus regiones unidoras para proporcionar anticuerpos de cadena única y fragmentos de los mismos que son responsables de interrumpir la interacción.

Los anticuerpos podrían obtenerse usando técnicas que son estándares por sí mismas. Los procedimientos para producir anticuerpos incluyen inmunizar un mamífero (por ejemplo, ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja o mono) con la proteína o fragmento de la misma. Los anticuerpos podrían obtenerse a partir de animales inmunizados usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la técnica, y examinarse, preferiblemente usando la unión del anticuerpo al antígeno de interés. Por ejemplo, podrían usarse técnicas de transferencia Western o la inmunoprecipitación (Armitage et al., Nature 357:80-82 (1992)). El aislamiento de anticuerpos y/o células productoras de anticuerpos a partir de un animal podría ir acompañado por un paso de sacrificio del animal.

Como una alternativa o suplemento a la inmunización de un animal con un péptido, podría obtenerse un anticuerpo específico para una proteína a partir de una biblioteca, producida de forma recombinante, de dominios variables expresados de inmunoglobulinas, por ejemplo, usando el bacteriófago lambda o el bacteriófago filamentoso, los cuales muestran dominios unidores funcionales de inmunoglobulina sobre sus superficies; por ejemplo, consultar WO-92/01047. La biblioteca podría ser ``ingenua'', que está construida a partir de secuencias obtenidas de un organismo que no ha sido inmunizado con ninguna de las proteínas (o fragmentos), o podría ser una construida usando secuencias obtenidas de un organismo que ha estado expuesto al antígeno de interés.

Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención podrían modificarse de varias formas. Además, el término ``anticuerpo'' debería ser considerado como que abarca cualquier sustancia unidora que tiene un dominio de unión con la especificidad requerida. Por tanto, la invención abarca los fragmentos de anticuerpo, los derivados, los equivalentes funcionales y los homólogos de anticuerpos, incluyendo moléculas sintéticas y moléculas cuya forma imita la de un anticuerpo, permitiéndolas unirse a un antígeno o epítopo.

Son ejemplos de fragmentos de anticuerpos capaces de unir un antígeno u otro par de unión, el fragmento Fab, consistente en los dominios Vl, VH, CI y CH1; el fragmento Fd, consistente en los dominios VH y CH1; el fragmento Fv, consistente en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; y el fragmento dAb, que consiste en un dominio VH; las regiones CDR aisladas; y los fragmentos F(ab')2; un fragmento bivalente incluyendo dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra. También se incluyen los fragmentos Fv de cadena única.

Un hibridoma que produjera un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención podría someterse a mutación genética u otros cambios. Los especialistas en la técnica comprenderán además que un anticuerpo monoclonal puede someterse a las técnicas de la tecnología del ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas, las cuales retienen la especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas podrían implicar introducir ADN codificando la región variable de inmunoglobulinas, o las regiones determinantes de complementariedad (CDR), de un anticuerpo en la región constante, o regiones constantes más regiones estructurales, de una inmunoglobulina diferente. Ver, por ejemplo, EP-184187-A, GB-2.188.638-A, o EP-A-0.239.400. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describe en EP-A-0.120.694 y EP-A- 0.125.023.

Los hibridomas capaces de producir anticuerpos con las características de unión deseadas se hallan dentro del ámbito de la presente invención, así como los están las células huésped, eucariotas o procariotas, que contienen ácidos nucleicos que codifican anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpos) y capaces de su expresión. La invención también proporciona procedimientos de producción de los anticuerpos, incluyendo hacer crecer una célula capaz de producir el anticuerpo en condiciones en las que el anticuerpo es producido, y, preferiblemente, secretado.

Las reactividades de los anticuerpos en una muestra podrían determinarse mediante cualquier medio apropiado. El marcaje con moléculas informadoras individuales es una posibilidad. Las moléculas informadoras podrían generar directa o indirectamente señales detectables y, preferiblemente medibles. La unión de moléculas informadoras podría ser directa o indirectamente covalente, por ejemplo, a través de un enlace peptídico, o no covalente. La unión a través de un enlace peptídico podría ser el resultado de la expresión recombinante de un gen de fusión que codifica el anticuerpo y la molécula informadora.

Un modo favorecido es mediante unión covalente de cada anticuerpo con un fluorocromo, colorante fosforescente o de láser individual, con características de absorción o emisión aisladas. Los fluorocromos apropiados incluyen la fluoresceína, la rodamina, la ficoeritrina, y el rojo de Tejas. Los colorantes cromogénicos apropiados incluyen la diaminobencidina.

Otros informadores incluyen partículas coloidales macromoleculares, o material discreto tal como cuentas de látex que están coloreadas, magnéticas o paramagnéticas, y agentes activos biológica o químicamente que pueden directa o indirectamente causar señales detectables que sean visualmente observables, detectables electrónicamente, o registradas de otra forma. Estas moléculas podrían ser enzimas que catalizan reacciones que, por ejemplo, desarrollan o cambian colores, o causan cambios en las propiedades eléctricas. Éstas podrían ser molecularmente excitables, tales como transiciones electrónicas entre estados de energía que resultan en un absorciones o emisiones espectrales características. Éstas podrían incluir entidades químicas usadas conjuntamente con biosensores. Podrían emplearse los sistemas de detección biotina/avidina, o biotina/estreptoavidina, y fosfatasa alcalina.

El modo de determinar la unión no es una característica de la presente invención, y aquéllos especialistas en la técnica son capaces de escoger un modo apropiado de acuerdo con sus preferencias y conocimientos generales.

Los anticuerpos también podrían usarse para purificar y/o aislar un polipéptido o péptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, a continuación de la producción de un polipéptido o péptido mediante expresión a partir de un ácido nucleico que lo codifica. Los anticuerpos podrían ser útiles en un contexto terapéutico (el cual podría incluir la profilaxis) para interrumpir la interacción XRCC4/ligasa IV de ADN con vistas a inhibir su actividad. Los anticuerpos pueden, por ejemplo, microinyectarse en células, por ejemplo, en el sitio de un tumor. Los anticuerpos podrían emplearse de acuerdo con la presente invención para otros propósitos terapéuticos y no terapéuticos, los cuales se discuten en otros sitios en ésta.

Otros compuestos inhibidores candidatos podrían basarse en modelar la estructural tridimensional de un fragmento de polipéptido o péptido, y usar el diseño racional de drogas para proporcionar compuestos inhibidores potenciales con unas particulares características de forma, tamaño y carga.

Un compuesto que se halle que tiene la capacidad de afectar la actividad de la XRCC4 y/o de la ligasa IV de ADN tiene un potencial terapéutico y otros en un cierto número de contextos, tal como se discute. Para el tratamiento terapéutico, un compuesto tal podría usarse en combinación con cualquier otra sustancia activa, por ejemplo, para terapia anti-tumoral con otro compuesto o terapia anti-tumoral, tal como radioterapia o quimioterapia. En un caso tal, el ensayo de la invención, cuando se realiza in vivo, no necesita medir el grado de inhibición de la unión o de la modulación de la actividad de la ligasa IV de ADN causada por el compuesto que se está ensayando. En cambio, podría medirse el efecto sobre la reparación del ADN, la recombinación homóloga, la viabilidad de las células, la muerte de células (por ejemplo, en presencia o ausencia de la radio- y/o quimioterapia), la integración retroviral, y demás. Pudiera ser que un ensayo modificado tal se realice en paralelo con, o subsiguientemente al ensayo principal de la invención con objeto de confirmar que cualquiera de tales efectos es un resultado de la inhibición de la unión o interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN causada por dicho compuesto inhibidor, y no meramente un efecto tóxico general.

Hay que recordarse que los inventores han encontrado la interacción entre la XRCC4 y la DNA-PKcs/Ku, y que afectar esta interacción es una parte de los varios aspectos de la presente invención en forma análoga a afectar la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN. El hallazgo de los presentes inventores en este aspecto está confirmado por Leber et al., ``El producto del gen XRCC4 es una diana para e interacciona con la quinasa de proteínas dependiente de ADN'', J. Biol. Chem. 16 de enero, 273(3):1794, de acuerdo con la información disponible en el World Wide Web en 12 de enero de 1998.

Un agente identificado usando uno o más análisis primarios (por ejemplo, en un sistema carente de células) como poseedor de la capacidad de unir la XRCC4 y/o la ligasa IV de ADN, y/o modular la actividad de la XRCC4 y/o la ligasa IV de ADN, podría verificarse más aún usando uno o más análisis secundarios. Un análisis secundario podría implicar ensayar la radiosensibilización celular y/o la sensibilización a drogas radiomiméticas, ensayar el impedimento de la recombinación V(D)J en un ensayo de transfección, y/o ensayar la capacidad de potenciar el apuntamiento a un gen mediado por recombinación homóloga. Éste podría ensayarse directamente y/o usando un ensayo de transfección que da una lectura sólo después de que haya ocurrido la recombinación homóloga, (por ejemplo, implicando la co-transformación o co-transfección de un sistema celular con dos plásmidos que deben presentar recombinación homóloga para rendir un gen informador activo (tal como una proteína luciferasa o fluorescente verde), o la integración homóloga del ADN transfectado en el genoma.

A continuación de la identificación de una sustancia o agente que modula o afecta la actividad de la XRCC4 y/o ligasa IV de ADN, la sustancia o agente podrían investigarse más. Además, podría fabricarse y/o usarse en la preparación, es decir, en la fabricación o formulación, de una composición tal como un medicamento, composición o droga farmacéutica. Estos podrían administrarse a individuos, por ejemplo, para cualquiera de los propósitos discutidos en otras partes en ésta.

Tal como se ha destacado, el agente podría ser peptídico, por ejemplo, un péptido que incluya una secuencia como se ha recitado más arriba, o podría ser un análogo funcional de tal péptido.

Tal como se usa en ésta, la expresión ``análogo funcional'' se refiere a variantes de péptido o compuestos orgánicos que tienen la misma actividad funcional que el péptido en cuestión, la cual podría interferir con la unión entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN. Los ejemplos de tales análogos incluyen compuestos químicos que se modelan para parecerse a la estructura tridimensional del dominio de la XRCC4 o ligasa IV de ADN en el área de contacto, y, en concreto, la disposición de los residuos aminoácidos claves tal como aparecen en la XRCC4 o ligasa IV de ADN.

En un aspecto ulterior, la presente invención proporciona el uso de las sustancias anteriores en procedimientos de diseño o búsqueda de imitaciones de las sustancias.

En consecuencia, la presente invención proporciona un procedimiento para diseñar imitaciones de la XRCC4 y de la ligasa IV de ADN que tienen la actividad biológica de la ligasa IV de ADN, o la unión o inhibición de la XRCC4, la actividad de inhibición alostérica de la ligasa IV de ADN o de la XRCC4, y/o la actividad de modulación, por ejemplo, inhibición, de la interacción de la XRCC4/ligasa IV de ADN, comprendiendo dicho procedimiento;

(a): analizar una sustancia que tiene la actividad biológica para determinar los residuos aminoácidos esenciales e importantes para la actividad para definir un farmacóforo; y,

(b): modelar el farmacóforo para diseñar y/o buscar imitaciones candidatas que tienen la actividad biológica.

Las técnicas de modelado apropiadas son conocidas en la técnica. Esto incluye el diseño de las denominadas ``imitaciones'', que implica el estudio de las interacciones funcionales fluorogénicas con oligonucleótidos de las moléculas, y el diseño de compuestos que contienen grupos funcionales dispuestos de tal forma que podrían reproducir esas interacciones.

El diseño de imitaciones para un compuesto farmacéuticamente activo conocido es una estrategia conocida para el desarrollo de fármacos basados en un compuesto ``líder''. Esto podría ser deseable cuando sintetizar el compuesto activo es difícil o caro, o cuando es inapropiados para un procedimiento de administración determinado, por ejemplo, los péptidos no son apropiados como agentes activos para composiciones orales puesto que tienden a ser rápidamente degradados por proteasas en el tracto alimenticio. El diseño, la síntesis y el ensayo de imitaciones podrían usarse para evitar analizar aleatoriamente un gran número de moléculas en busca de una propiedad determinada.

Hay varios pasos que se toman comúnmente en el diseño de una imitación a partir de un compuesto que tiene una propiedad diana. En primer lugar, se determinan las partes particulares del compuesto que son críticas y/o importantes en la determinación de la propiedad diana. En el caso de un péptido, esto puede hacerse variando sistemáticamente los residuos aminoácidos en el péptido, por ejemplo, sustituyendo un residuo cada vez. Esas partes o residuos que constituyen la región activa del compuesto se conocen como su ``farmacóforo''.

Una vez se ha hallado el farmacóforo, se modela su estructura de acuerdo con sus propiedades físicas, por ejemplo, estereoquímica, enlaces, tamaño y/o carga, usando datos procedentes de una diversidad de fuentes, por ejemplo, técnicas espectroscópicas, datos de difracción de rayos X y RMN. En este proceso de modelado pueden utilizarse el análisis computacional, el mapado de similitudes (que modela la carga y/o volumen de un farmacóforo, en vez de la unión entre átomos), y otras técnicas.

En una variante de esta estrategia, se modelan la estructura tridimensional del ligando y su pareja de unión. Esto puede ser especialmente útil cuando el ligando y/o la pareja de unión cambian de conformación al unirse, permitiendo que el modelo tenga esto en consideración al diseñar la imitación.

A continuación se selecciona una molécula plantilla sobre la que pueden injertarse los grupos químicos que imitan el farmacóforo. La molécula plantilla y los grupos químicos injertados sobre la misma pueden seleccionarse convenientemente de manera que la imitación sea fácil de sintetizar, es probable que sea farmacológicamente aceptable, y no se degrade in vivo, a la vez que retiene la actividad biológica del compuesto líder. La imitación o imitaciones halladas mediante esta estrategia pueden analizarse para ver si tienen la propiedad diana, o hasta que punto la presenten. A continuación puede realizarse la optimización o modificación ulterior puede realizarse para llegar a uno o más imitaciones finales para los ensayos in vivo o clínicos.

La imitación o imitaciones halladas mediante esta estrategia pueden analizarse para ver si tienen la propiedad diana, o hasta que punto la presenten. A continuación puede realizarse la optimización o modificación ulterior puede realizarse para llegar a uno o más imitaciones finales para los ensayos in vivo o clínicos.

Las imitaciones de este tipo, junto con su uso en terapia, forman un aspecto ulterior de la invención.

La presente invención proporciona además el uso de un péptido que incluye una secuencia como se describe, o un derivado, porción activa, análogo, variante o imitación de la misma, capaz de unir la XRCC4 o ligasa IV de ADN y/o modular, por ejemplo inhibir, la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, y/o modular, por ejemplo inhibir, la actividad de la XRCC4 y/o ligasa IV de ADN, en el análisis de una sustancia capaz de unir la ligasa IV de ADN y/o la XRCC4, y/o modular, por ejemplo inhibir, la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, y/o inhibir la actividad de la XRCC4 y/o la ligasa IV de ADN.

Generalmente, una sustancia tal, por ejemplo, un inhibidor, según la presente invención, se proporciona en un forma aislada y/o purificada, es decir, sustancialmente pura. Esto podría incluir estar en una composición en donde representa al menos aproximadamente el 90% del ingrediente activo, más preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 98%. No obstante, una composición tal podría incluir materiales portadores inertes u otros excipientes farmacéuticamente y fisiológicamente aceptables. Tal como se destaca más abajo, una composición de acuerdo con la presente invención podría incluir, además de un compuesto inhibidor como se descubre, una o más moléculas distintas de uso terapéutico, tales como un agente antitumoral.

La presente invención se extiende en varios aspectos, no sólo a una sustancia identificada como un modulador de la interacción de la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, y/o de la actividad, propiedad o vía mediada por la XRCC4 o ligasa IV de ADN, de acuerdo con lo que se descubre en ésta, sino también a una composición farmacéutica, medicamento, droga u otra composición que comprende una sustancia tal, un procedimiento que comprende la administración de una composición tal a un paciente, por ejemplo, con un propósito discutido en otras partes en ésta, el cual podría incluir un tratamiento preventivo, el uso de una sustancia tal en la fabricación de una composición para su administración, por ejemplo, con un propósito discutido en otras partes en ésta, y un procedimiento para preparar una composición farmacéutica que comprende mezclar una sustancia tal con un excipiente, vehículo o portador farmacéuticamente aceptable, y, opcionalmente, con otros gradientes.

Una sustancia según la presente invención, tal como un inhibidor de la interacción o unión de la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, podría proporcionarse para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia que afecta la reparación del ADN, u otra actividad mediada por la XRCC4 o la ligasa IV de ADN, en células, por ejemplo, en células tumorales. En otras partes en ésta se discuten otros propósitos de un procedimiento de tratamiento que emplea una sustancia según la presente invención.

Por tanto, la invención proporciona además un procedimiento para modular la actividad reparadora de ADN, particularmente la unión de extremos DSB, u otra actividad mediada por la XRCC4 y/o ligasa IV de ADN, por ejemplo, con un propósito discutido en otras partes en ésta, el cual incluye administrar un agente que modula, inhibe o bloquea la unión de la XRCC4 a la proteína ligasa IV de ADN, siendo útil un procedimiento tal en el tratamiento cuando es deseable tal modulación, inhibición o bloqueo.

La invención proporciona además un procedimiento de tratamiento que incluye administrar a un paciente un agente que interfiere con la unión de la XRCC4 a la ligasa IV de ADN. Los propósitos de ejemplo de tal tratamiento se discuten en otras partes en ésta.

Tanto si es un polipéptido, anticuerpo, péptido, molécula de ácido nucleico, molécula pequeña, imitación, u otro compuesto farmacéuticamente útil, según la presente invención, el que debe administrarse a un individuo, la administración está preferiblemente en una ``cantidad profilácticamente efectiva'' o en una ``cantidad terapéuticamente efectiva'' (como pudiera ser el caso, aunque la profilaxis podría considerarse terapia), siendo esto suficiente para mostrara un beneficia al paciente. La cantidad real administrada, y la velocidad y curso temporal de la administración, dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se esté tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre las dosis, etc., se hallan dentro de la responsabilidad del médico general y otros doctores médicos.

Una composición podría administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, bien simultánea o secuencialmente, dependiendo de la condición a tratar.

Las composiciones farmacéuticas según la presente invención, y para su uso según la presente invención, podrían incluir, además de un ingrediente activo, un excipiente, portador, tampón, estabilizante farmacéuticamente aceptable, u otros materiales bien conocidos por los especialistas en la técnica. Tales materiales no deberían ser tóxicos y no deberían interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la ruta de administración, la cual podría ser oral, o mediante inyección, por ejemplo, cutánea, subcutánea o intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral podrían estar en forma de tableta, cápsula, polvo o líquido. Una tableta podría incluir un portador sólido tal como la gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente incluyen un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral, o aceite sintético. Podrían incluirse la solución salina fisiológica, a solución de dextrosa y otros sacáridos, o glicoles tales como el etilenglicol, propilenglicol, o polietilenglicol.

Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el sitio de la lesión, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, la cual carece de pirógenos y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad apropiados. Aquellos especialistas en la técnica están capacitados para preparar soluciones apropiadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como la inyección de cloruro sódico, la inyección de Ringer, la inyección de lactato de Ringer. Según se precise, podrían incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes, y/o otros aditivos.

Los liposomas, particularmente los liposomas catiónicos, podrían usarse en formulaciones de portadores.

Pueden hallarse ejemplos de técnicas y protocolos mencionados más arriba en ``Remington's Pharmaceutical Sciences'', 16ª edición, ed. A. Osol, 1980.

El agente podría suministrarse de manera localizada al sitio de un tumor, u otro sitio deseado, o podría administrarse de una manera en la que apunta al tumor u otras células.

Podrían usarse terapias de apuntamiento para suministrar el agente activo más específicamente a ciertos tipos de células, mediante el uso de sistemas de apuntamiento tales como anticuerpos o ligandos específicos para células. El apuntamiento podría ser deseable por una variedad de razones, por ejemplo, si el agente es inaceptablemente tóxico, o si de otro modo requeriría una dosis demasiado elevada, o si de otro modo no sería capaz de entrar en las células diana.

En vez de administrar estos agentes directamente, estos podrían producirse en las células diana mediante la expresión a partir de un gen codificante introducido en las células, por ejemplo, en un vector viral (una variante de la técnica VDEPT - ver más abajo). El vector podría apuntarse hacia las células específicas a tratar, o podría contener elementos reguladores que son activados más o menos selectivamente por las células diana.

El agente (por ejemplo, molécula pequeña, imitación) podría administrarse en una forma precursora, para su conversión a la forma activa por un agente activador producido en, o apuntado a, las células a tratar. Este tipo de estrategia se conoce a veces como ADEPT o VDEPT, implicando la primera apuntar el activador hacia las células mediante conjugación con un anticuerpo específico para las células, mientras que el último implica producir el activador, por ejemplo, un enzima, en un vector mediante expresión a partir de ADN codificante en un vector viral (ver, por ejemplo, EP-A-415.731 y WO-90/07.936).

Un agente podría administrarse en una forma que es inactiva, pero que se convierte en una forma activa en el cuerpo. Por ejemplo, el agente podría estar fosforilado (por ejemplo, para mejorar su solubilidad) cortándose el fosfato para proporcionar una forma activa del agente en el cuerpo.

Una composición podría administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, bien simultánea o secuencialmente, dependiendo de la condición a tratar, tal como cáncer, infección vírica, o cualquier otra condición en el que es deseable un efecto mediado por la XRCC4 o ligasa IV de ADN.

El ácido nucleico según la presente invención, codificando un polipéptido o péptido capaz de modular, por ejemplo, interferir con, la interacción o unión de la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, y/o inducir o modular la actividad u otra vía o función celular mediada por la XRCC4 o ligasa IV de ADN, podría usarse en procedimientos de terapia génica, por ejemplo, en el tratamiento de individuos, por ejemplo, con el objetivo de prevenir o curar (total o parcialmente) una alteración, o con otro propósito tal como se discute en otras partes en ésta.

Los vectores, tales como los vectores virales, se han usado en la técnica previa para introducir ácido nucleico en una amplia variedad de diferentes células diana. Típicamente, los vectores se exponen a las células diana, de forma que la transfección puede tener lugar en una proporción suficiente de células para proporcionar un efecto terapéutico o profiláctico a partir de la expresión del polipéptido deseado. El ácido nucleico transfectado podría incorporarse permanentemente en el genoma de cada célula apuntada, proporcionando un efecto de larga duración, o, alternativamente, el tratamiento podría tener que repetirse periódicamente.

En la técnica se conocen una variedad de vectores, tanto vectores virales como vectores plasmídicos, ver la patente estadounidense nº 5.252.479 y la WO-93/07.282. En particular, se han usado un cierto número de virus como vectores de transferencia de genes, incluyendo los papovavirus, tales como el SV40, el virus de la viruela vacuna, los herpesvirus, incluyendo el HSV y el EBV, y retrovirus. Muchos protocolos de terapia génica en la técnica previa han usando retrovirus desactivados de ratón.

Como una alternativa al uso de vectores virales, otros procedimientos conocidos para introducir ácido nucleico en células incluyen la electroporación, la co-precipitación con fosfato cálcico, técnicas mecánicas como la microinyección, la transferencia mediada por liposomas, y la toma directa de ADN y la transferencia de ADN mediada por receptor.

La transferencia de genes mediada por receptor, en la que el ácido nucleico se une a un ligando de proteína a través de una polilisina, siendo el ligando específico para un receptor presente sobre la superficie de la célula diana, es un ejemplo de una técnica para apuntar específicamente ácido nucleico hacia células concretas.

Un polipéptido, péptido, u otra sustancia capaz de modular o interferir con la interacción del polipéptido, péptido u otra sustancia relevante, tal como se descubre en ésta, o una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula peptídica tal, podría proporcionarse en equipo, por ejemplo, sellado en un contenedor apropiado, el cual protege su contenido del entorno externo. Un equipo tal podría incluir instrucciones para su uso.

Ejemplo 1

Determinación de la actividad biológica de la XRCC4 Generación de antisuero que reconoce la XRCC4

Con el objetivo de formarse una idea del mecanismo de acción de la XRCC4, se decidió intentar caracterizar bioquímicamente la proteína humana. Con este objetivo se expresaron en Escherichia coli la XRCC4 humana de longitud completa y la región C-terminal de la XRCC4 que comprende los residuos 201-344 como proteínas marcadas con seis histidinas. Después de su purificación hasta la homogeneidad, se usó cada antígeno a continuación para generar antisuero policlonal en conejos.

En el curso de estos estudios, observamos que la XRCC4 de longitud completa recombinante corría anómalamente en SDS-PAGE, con una masa molecular aparente de \sim55 kDa, la cual es considerablemente superior al peso molecular predicho de 38 kDa. Se encontró que las versiones sin marcar y marcada con His se comportaban similarmente. Aunque la razón de esto no está actualmente clara, podría reflejar el hecho de la XRCC4 contiene una inusualmente elevada proporción de residuos del aminoácido ácido glutámico, incrementándose la carga negativa de la proteína. Un posible resultado de esto sería una disminución neta en la cantidad de SDS unido a la proteína, lo que disminuiría la movilidad de la XRCC4 en los análisis de SDS-PAGE.

Los análisis de transferencia Western revelaron que cada uno de los antisueros anti-XRCC4 generados era capaz de reconocer menos de 1 ng de proteína XRCC4 recombinante. Para establecer si estos antisueros eran capaces de detectar la XRCC4 endógena en lisados de células de mamífero, se sometieron extractos nucleares crudos de HeLa a SDS-PAGE seguida por análisis de inmunotransferencia Western.

De forma importante, se halló que cada antisuero, pero ninguno de los sueros pre-inmunes, reconocía una proteína de las células HeLa de 55-60 kDa, lo que está en conformidad con el tamaño de la XRCC4 recombinante. Además, cada suero inmune también detecta débilmente otros varios polipéptidos. Aunque las identidades de estos no se han establecido, algunos podrían corresponder a formas alternativas de la XRCC4 o a sus productos de degradación proteolítica. Por ejemplo, es probable que una banda en particular represente un producto proteolítico N-terminal de la XRCC4, porque es reconocida por todos los sueros generados contra la proteína de longitud completa, pero no por el suero SJ5 que se generó contra la región C-terminal de la XRCC4. De forma interesante, a pesar del alto grado de conservación de la secuencia entre la XRCC4 en roedores y humanos (Li et al., 1995), hemos sido incapaces de detectar la XRCC4 en extractos de células de ratón o hámster mediante transferencia Western directa usando estos anticuerpos. Esto podría reflejar en parte la baja reactividad inmunológica cruzada entre las proteínas de roedor y humana. No obstante, dada la conservación evolutiva de la XRCC4, el modelo que actualmente favorecemos es que, como es el caso para otros factores de reparación de DSB de ADN, tales como la Ku y la DNA-PKcs (Blunt et al., 1995; Finnie et al., 1995; Danska et al., 1996), la XRCC4 se expresa en niveles mucho más inferiores en células de roedores que en células humanas (ver también más abajo).

Para mejorar aún más la especificidad del antisuero SJ4B anti-XRCC4, éste se sometió a cromatografía de inmunoafinidad usando XRCC4 que había sido unida covalentemente a partículas de Sepharose. Significativamente, mientras que el suero crudo reconoce un cierto número de polipéptidos en los extractos de células HeLa completas, además de la XRCC4 de longitud completa, mucha de la reactividad hacia las otras proteínas se recupera en las fracciones que fluyen a través, lo que resulta en que el material de anticuerpo purificado por afinidad (eluido) tiene una especificidad y selectividad mejorada en comparación con el suero sin fraccionar.

La XRCC4 es una fosfoproteína nuclear y sirve como un sustrato efectivo de la DNA-PK in vitro

Como un primer paso para establecer la función bioquímica de la XRCC4, decidimos intentar determinar su ubicación subcelular. Se prepararon fracciones citosólicas de células HeLa y se sometieron a análisis de transferencia Western usando anticuerpo SJ4B contra XRCC4 purificado mediante afinidad. La integridad de las fracciones se estableció sondeando también con antisueros contra la Sp1, que está localizada predominantemente en la fracción nuclear.

Notablemente, estos estudios revelaron que la XRCC4 está presente en el extracto nuclear, existiendo pequeñas cantidades detectables en la fracción citosólica. Por tanto, estos datos revelan que la XRCC4 es una proteína nuclear y son consistentes con modelos en los que la XRCC4 sirve como parte de un aparato de reparación de DSB de ADN, por ejemplo, como se ilustra en la Figura 5.

En este modelo (que se propone sin que en modo alguno limite la naturaleza o ámbito de ningún aspecto de la presente invención o realización de la misma), la Ku se une a los extremos libres del ADN y recluta DNA-PKcs, activando la función catalítica quinasa de esta última. A continuación se recluta un complejo ligasa IV de ADN/XRCC4 para la DSB de ADN. Podrían estar implicados uno o más componentes adicionales: se indican algunas posibilidades por medio de signos de interrogación. La DNA-PK activa también podría activar sucesos de señalización de lesión del ADN o podría fosforilar otros componentes de reparación de la DSB, tales como la XRCC4 como ha sido demostrado por los inventores, regulando, por tanto, su actividad. La estequiometría del complejo XRCC4-ligasa IV de ADN tiene tan sólo propósitos ilustrativos. La XRCC4 podría interaccionar con la ligasa IV de ADN en cualquier lugar entre los residuos 550-584 de la ligasa IV de ADN humana, por ejemplo, en o entre los dominios BRCT.

Durante el curso de los estudios anteriores, observamos que la XRCC4 de las células HeLa migra reproduciblemente más lentamente que la XRCC4 recombinante en SDS-PAGE, sugiriendo que la XRCC4 humana es modificada posteriormente a su traducción. El extracto nuclear de HeLa o se trató de forma simulada, o se trató con la fosfatasa de proteína \lambda, o se trató con fosfatasa \lambda en presencia de inhibidores de la fosfatasa.

Significativamente, el análisis Western de estas muestras reveló que la fosfatasa \lambda incrementa la movilidad en SDS-PAGE de la XRCC4 de HeLa, de forma que ahora es equivalente a la de la proteína recombinante, mientras que este efecto es suprimido por los inhibidores de la fosfatasa. Por tanto, estos datos revelan que la XRCC4 está fosforilada hasta una estequiometría elevada en extractos de células HeLa, y sugiere que esta modificación es usa para modular la actividad de la XRCC4 in vivo.

A la luz de esto, y puesto que las células deficientes en XRCC4 tienen fenotipos muy similares al de aquéllas deficientes en componentes de la DNA-PK, ensayamos si la DNA-PK es capaz de fosforilar la XRCC4 in vitro. La XRCC4 sirve como un sustrato efectivo para la fosforilación dependiente de ADN por parte de la DNA-PK, por tanto, la DNA-PK podría controlar la actividad de la XRCC4 dentro de la célula.

La XRCC4 endógena parece estar complejada con otra(s) proteína(s)

Hay varias vías en las que la XRCC4 podría funcionar en la reparación de las DSB del ADN y en la recombinación V(J)D.

Una posibilidad que consideraron los inventores es que interaccione directamente con el ADN y juegue un papel en la reparación del daño del ADN o señale su presencia a la célula. Sin embargo, hemos sido incapaces de detectar la unión de la XRCC4 recombinante a varias especies de ADN en ensayos de desplazamiento de la movilidad electroforética. Más aún, cuando los extractos nucleares de HeLa se pasan a través de columnas de ADN-agarosa en concentraciones de sales en las que se retienen muchas proteínas unidoras del ADN, la mayoría de XRCC4 endógena fluye a través.

Por tanto, estos datos argumentan que la XRCC4 no se une ávidamente al ADN.

Otro posible papel para la XRCC4 considerado por los inventores es que reaccione con otro componente del aparato de reparación de DSB de ADN. Como una estrategia para verificar esta idea, investigamos el fraccionamiento bioquímico de la XRCC4 y otros factores de reparación de DSB de ADN conocidos y potenciales a partir de la cromatografía de filtración en gel sobre Superose-6. Para eliminar posibles asociaciones proteína-proteína no específicas, tales experimentos se realizaron bajo condiciones estrictas de NaCl 1 M.

Estos estudios revelaron que la XRCC4 recombinante sin marcar eluye de manera consistente con un peso de justo por encima de 66 kDa, que es superior al peso molecular predicho del monómero de XRCC4 (Li et al., 1995) y su masa aparente determinada mediante SDS-PAGE. Esto sugiere que, o la XRCC4 es una proteína monomérica con características de forma que causan que se comporte anómalamente en filtración en gel, o existe en solución como un multímero, más probablemente como dímero.

Más significativamente, el análisis de filtración en gel de extracto nuclear de HeLa en presencia de NaCl 1 M revela que la XRCC4 endógena se fracciona de manera consistente con una masa molecular a aproximadamente 200 kDa, la cual es marcadamente superior a la de la XRCC4 recombinante. Por tanto, estos datos sugieren fuertemente que la XRCC4 de HeLa está asociada con otra(s) proteína(s). Nosotros tomamos el mismo conjunto de fracciones de filtración en gel ensayado más arriba para la XRCC4, y las examinamos por la presencia de Ku, DNA-PKcs, y ligasas I, III y IV de ADN.

De forma significativa, aunque fue evidente cierto solapamiento en cada caso, el perfil de elución de la XRCC4 no siguió en paralelo los exhibidos por la ligasa I de ADN, Ku o DNA-PKcs. Por tanto, la ligasa I tuvo un pico a \sim150 kDa, que es ligeramente superior al peso molecular predicho de 1-2 kDa del monómero, la DNA-PKcs (465 kDa) eluyó a aproximadamente 200 kDa, lo que podría indicar que la estructura terciaria de la DNA-PK está alterada en estas condiciones, y la elución de Ku tuvo un pico a \sim150 kDa, consistente con el tamaño predicho de un heterodímero Ku70/Ku80.

En marcado contraste, se halló que el perfil de elución de la XRCC4 era virtualmente idéntico a los de las ligasas III y IV de ADN. Por tanto, estos resultados plantearon la posibilidad de que la XRCC4 exista en asociación estable con la ligasa III o IV de ADN.

La XRCC4 de HeLa co-precipita con la ligasa IV de ADN

Para ensayar aún más las posibles interacciones entre la XRCC4 y los factores descritos más arriba, inmunoprecipitamos la XRCC4 a partir de sus fracciones pico de la filtración en gel en presencia de NaCl 1 M y 50 \mug/ml de bromuro de etidio (para suprimir la interacción no específica mediada por el ADN), y ensayamos el material precipitado resultante en busca de la presencia de Ku, DNA-PKcs, y ligasas I, III y IV. Significativamente, los análisis de inmunoprecipitación Western revelaron que la DNA-PKcs, la Ku y la ligasa I de ADN que estaban presentes en las fracciones de XRCC4 no se co-inmunoprecipitaban con la XRCC4, confirmando que la XRCC4 no interacciona de forma estable con ninguno de estos factores bajo estas condiciones de ensayo. Hay que destacar, sin embargo, que, como se discute en otras partes en ésta, los inventores han establecido que la DNA-PKcs/Ku es capaz de interaccionar con la XRCC4 en otras condiciones. Ellos han mostrado también que ésta fosforila la XRCC4, los cual, por supuesto, requiere cierta interacción entre las proteínas. Esto es confirmado por Leber et al., ``El producto del gen de la XRCC4 es una diana para, e interacciona con la quinasa de proteína dependiente de ADN'' J. Biol. Chem. 16 de enero, 273(3):1794 (1998) - de acuerdo con información disponible en el World Wide Web el 12 de enero de 1998.

Para ensayar en busca de posibles interacciones entre la XRCC4 y el enzima ligasa de ADN, empleamos el hecho de que las ligasas de ADN de mamíferos forma complejos de adenilato covalentemente unidos (Tomkinson et al., 1991; Wei et al., 1995; Danska et al., 1996; Robins y Lindahl, 1996). Cuando la fracción de filtración en gel que contenía la XRCC4 se incubó con [\alpha-^{32}P]-ATP y se examinó a continuación mediante SDS-PAGE seguida por autoradiografía, se detectaron proteínas adeniladas de aproximadamente 120 kDa y 100 kDa, las cuales corresponden respectivamente a la ligasa I de ADN y una mezcla de las ligasas III y IV de ADN.

Para ver si alguna de estas ligasas se asociaba con la XRCC4, se incubó extracto sin marcar con antisueros pre-inmune o anti-XRCC4 en presencia de NaCl 1 M, a continuación, después de lavado en condiciones rigurosas, se incubó el material inmunoprecipitado con [\alpha-^{32}P]-ATP y se ensayó en busca de proteínas adeniladas marcadas radiactivamente.

Significativamente, estos estudios revelaron que una especie de proteína adenilada, de \sim100 kDa, correspondiente a la ligasa III y/o ligasa IV de ADN, era inmunoprecipitada eficientemente por el antisuero contra XRCC4 purificado mediante afinidad, pero no por el antisuero pre-inmune. Por contra, no se recupera la especie adenilada correspondiente a la ligasa I de ADN. De forma importante, y consistente con el hecho de que la porción adenilato de los complejos adenilato-ligasa de ADN está descargada en presencia de sustratos de polinucleótido ligables, el radiomarcaje asociado con el XRCC4-material precipitado se pierde a partir de su incubación en presencia de ADN en el que se han hecho muescas mediante tratamiento con DNasa I.

Para descartar la posibilidad de que la ligasa inmunoprecipitada fuera reconocida directamente por el antisuero anti-XRCC4, realizamos reacciones de inmunoprecipitación en paralelo con extractos derivados de las líneas celulares K1 y XR-1 de hámster, las cuales contienen y carecen respectivamente de la proteína XRCC4. De forma importante, la especie de ligasa adenilada de \sim100 kDa se recupera de los extractos de K1, pero no de los extractos de XR-1. Por tanto, estos datos revelan que la ligasa no es reconocida directamente por el antisuero y que, en cambio, es inmunoprecipitada a través de su asociación con la XRCC4.

Tomados conjuntamente, los resultados anteriores revelan que la XRCC4 forma un interacción estrecha, estable a las sales, con la ligasa III y/o ligasa IV de ADN. Para establecer cual de estos dos enzimas es asocia con la XRCC4, tomamos ventaja del hecho que las ligasas III y IV tienen diferentes capacidades para unir cortes de hebra única en sustratos de polinucleótidos conteniendo un hebra de ADN y una hebra de ARN. Por tanto, mientras que la ligasa III puede catalizar la unión en ambos sustratos, oligo(rA)\cdotpoli(dT) y oligo(dT)\cdotpoli(rA), la ligasa IV sólo es capaz de mediar la unión del último (Robins, 1996).

A la luz de esto, realizamos ensayos de adenilación sobre material inmunoprecipitado con XRCC4 y a continuación incubamos los inmunoprecipitados marcados con oligo(rA)\cdotpoli(dT) o con oligo(dT)\cdotpoli(rA). Notablemente, sólo oligo(dT)\cdotpoli(rA) resultó en la disociación del grupo adenilato de la ligasa inmunoprecipitada con la XRCC4.

Por tanto, estos resultados sugieren fuertemente que la XRCC4 interacciona estrecha y específicamente con la ligasa IV de ADN, pero no con la ligasa III de ADN.

La XRCC4 y la ligasa IV se co-purifican extensivamente

Para confirmar la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, y para obtener conocimientos sobre qué proporción de las dos proteínas existe en este complejo, purificamos ligasa IV de ADN usando protocolos establecidos (Robins, 1996) y ensayamos en busca de la presencia de ligasa IV y XRCC4 mediante análisis de inmunotransferencia Western en cada etapa cromatográfica.

Las fracciones recogidas de las columnas cromatográficas se analizaron en geles de SDS-poliacrilamida, y se detectó la unión específica de anticuerpos mediante inmunotransferencias. La cantidad de proteína especificada en cada fracción se cuantificó a partir de barridos densitométricos de los geles. La cantidad de cada proteína en las fracciones analizadas, como una proporción de su cantidad total, se representó para las muestras separadamente mediante fraccionamiento con cromatografía en gel (Figura 1A) seguida por una columna Mono S (Figura 1B).

Como demostramos previamente, observamos que las ligasas III y IV de ADN co-eluían durante la cromatografía de filtración en gel (Figura 1A), pero se separaban la una de la otra mediante cromatografía en Mono-S (Figura 1B). Significativamente, la XRCC4 sigue con la ligasa IV a lo largo de estos procedimientos, pero, por contra, se separa de la ligasa III de ADN en el paso de cromatografía con Mono-S (Figuras 1A y 1B). Más aún, la XRCC4 está presente incluso en muestras más altamente purificadas de ligasa IV de ADN generadas a través de subsiguiente cromatografía en Mono Q, y el análisis mediante inmunotransferencia de preparaciones de ligasa IV prácticamente homogénea, que habíamos preparado previamente, demuestra la existencia de XRCC4. Las muestras aún más purificadas sobre una columna Mono Q (Robins, 1996) se analizaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 10% ensayando mediante inmunotransferencias la presencia de XRCC4 o ligasa IV de ADN. Los pesos moleculares se estimaron a partir de la migración de marcadores caleidoscópicos pre-teñidos.

También hemos observado, en estudios adicionales, que la XRCC4 y la ligasa IV de ADN se co-purifican en fenil-Sepharose. Más aún, con excepción de la incubación con detergentes iónicos fuertes, todavía hemos de encontrar un procedimiento para separar estas dos proteínas.

De forma interesante, la XRCC4 que co-purifica con la ligasa IV corresponde a la forma fosforilada de la proteína, como se evidencia por su movilidad en SDS-PAGE y por el hecho de que su movilidad incrementa con el tratamiento con fosfatasa.

Finalmente, es particularmente digno de mención que la XRCC4 y la ligasa IV de ADN co-purifican casi cuantitativamente la una con la otra, y que no son evidentes ``pooles'' libres de ningún factor (por ejemplo, ver Figuras 1A y 1B). Por tanto, esto sugiere que la XRCC4 y la ligasa IV de ADN están presentes en niveles similares en la célula y que virtualmente la totalidad de cada polipéptido existe en un complejo con su pareja.

La XRCC4 interacciona con la porción C-terminal de la ligasa IV de ADN que comprende dos dominios de homología BRCT

Para obtener información sobre las bases de la unión altamente específica de la ligasa IV de ADN a la XRCC4, decidimos intentar determinar qué región(es) de la ligasa IV están implicadas en esta interacción.

Las ligasas I, III y IV de ADN presentan niveles elevados de similitud de secuencia las unas con las otras dentro de una sección que ha sido definida como el núcleo del dominio catalítico de las ligasas (Wei et al., 1995). Además, cada ligasa posee extensiones discretas N- y/o C-terminales que se ha propuesto confieren propiedades únicas a los tres enzimas. Significativamente, aunque las extensiones C-terminales de las ligasas III y IV de ADN muestran muy poca homología entre ellas al nivel de secuencia primaria, ellas poseen respectivamente una y dos copias del dominio de homología BRCT recientemente identificado (Koonin et al., 1996; Callebaut y Mornon, 1997); ver la Discusión más adelante).

Con objeto de encontrar qué región(es) de la ligasa IV interaccionan con la XRCC4, dividimos el polipéptido de la ligasa IV en tres porciones - una región N-terminal (correspondiente a los residuos aminoácidos 1-198) que presenta homología con la ligasa I y III, una región central (residuos 199-549) que presenta los niveles más elevados de homología con la ligasa I y III y que contiene el sitio catalítico de la ligasa, y una región C-terminal (residuos 550-844) que contiene los dos dominios de homología BRCT. Después de transcribir y traducir las tres regiones de forma separada in vitro, se ensayó su capacidad de unirse a cuentas de Sepharose o a cuentas de Sepharose que contenían XRCC4 unida covalentemente. Se aplicaron muestras de LigIV(1-198), LigIV(199-549), LigIV(550-844) y de luciferasa a cuentas de Sepharose-XRCC4 o cuentas control negativas (ON), y se recolectaron las proteínas no unidas. Después de lavados uno de NaCl 0,1 y 1,0 M, se eluyeron las proteínas unidas con tampón de carga de geles (SDS). Después de la SDS-PAGE, los fragmentos de [^{35}S]metionina se detectaron mediante autoradiografía.

Los fragmentos N-terminal y central de la ligasa IV de ADN con consiguieron unirse de forma detectable a las cuentas de XRCC4, como es el caso para la proteína luciferasa que se empleó como control. En marcado contraste, el fragmento C-terminal de la ligasa IV fue retenido casi cuantitativamente sobre las cuentas de XRCC4, pero no sobre las cuentas control que carecían de XRCC4. Más aún, la unión de la porción C-terminal de la ligasa IV a la XRCC4 parecer ser muy fuerte, como se evidenció por el hecho de que la región C-terminal de la ligasa IV no se eluye lavando con NaCl 1 M, y tan sólo se recupera a continuación de la adición del detergente iónico SDS.

Finalmente, para tratar aún más la especificidad de la interacción anterior, verificamos si las cuantas que contenían XRCC4 podían usarse para purificar la región C-terminal de la ligasa IV a partir de lisados bacterianos crudos. Para hacerlo, se incubó un extracto sin fraccionar de E. coli, que expresaba esta región (LIGIV (550-844)) con niveles bastante bajos, con cuentas de Sepharose que contenían XRCC4 y se recolectaron las proteínas no unidas. A continuación se eluyó el material unido con incrementos paso a paso de la concentración de sal, seguidos por una elución final en presencia de tampón de carga del gel, SDS.

Sorprendentemente, tal como se mostró mediante tinción total de proteínas con azul de Coomassie de un gel de poliacrilamida-SDS que contenía estas fracciones, este procedimiento resulta en que la región C-terminal de la ligasa IV se purifica hasta su virtual homogeneidad en un único paso. La identidad de este polipéptido como el extremo C-terminal de la ligasa IV se confirmó mediante análisis de transferencia Western, y esta proteína no fue retenida por las cuentas de Sepharose sola.

Tomados conjuntamente, estos resultados atestiguan la extrema intensidad y especificidad de la interacción entre la región C-terminal de la ligasa IV y la XRCC4.

Materiales y procedimientos Enzimas, anticuerpos y ADN

pET-30b y pQE-30 se obtuvieron respectivamente de Novagen y Qiagen. El anticuerpo monoclonal de ratón purificado MRGS.His (Qiagen) que reconoce proteínas marcadas con His derivada de pQE-30 se usó según las instrucciones del fabricante. La Ku70, Ku80, y el antisuero contra DNA-PKcs se usaron como se ha descrito previamente (Hartley et al., 1995; Finnie et al., 1996). Los anticuerpos contra la ligasa I (TL5), ligasa III (TL25), y ligasa IV (TL18) se usaron como se ha descrito (Lasko et al., 1990; Robins y Lindahl, 1996). Los complejos antígeno-anticuerpo se detectaron mediante quimioluminiscencia potenciada (Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El extracto nuclear de HeLa se obtuvo de Computer Cell Culture Centre, Mons, Bélgica. Todas las construcciones de plásmidos se verificaron mediante secuenciación automatizada del ADN.

Expresión y purificación de derivados de la XRCC4

Para generar XRCC4 recombinante sin marcar se amplificó la región codificante de la XRCC4 de longitud completa mediante PCR a partir de pBlueScript que contenía el gen XRCC4 humano, y se insertó en pET-30a (Novagen) digerido con NdeI/SalI de tal forma que las marcas N-terminales His/S no estuvieran presentes, y de forma que el codón de detención de XRCC4 impide la adición de la marca His C-terminal. Para la expresión de la proteína, se cultivaron células BL21 (DE3) que albergaban el plásmido resultante (pET30XRCC4) en cultivos de 500 ml de LB/kanamicina (50 \mug/ml) hasta la mitad de la fase log antes de la inducción con IPTG 0,4 mM durante 4 horas a 37ºC. Después de lisar el precipitado celular recolectado mediante sonicación, se añadieron lentamente 30,2 g de sulfato amónico por cada 100 ml de sobrenadante, y se incubaron con agitación a 4ºC durante 30 minutos. Después de su centrifugación, se resuspendió el precipitado en TED (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, DTT 2 mM, y EDTA 1 mM) y se dializó extensamente frente a TED. A continuación se cargó la proteína en una columna de heparina-Sepharose pre-equilibrada con TED y se eluyó la proteína con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,6 M. Las fracciones que contenían XRCC4 se juntaron y se dializaron frente a TED conteniendo sulfato amónico 1,0 M, y entonces se cargaron en una columna de fenil-Sepharose pre-equilibrada. Las proteínas se eluyeron con 100 ml de un gradiente lineal de (NH_{4})_{2}SO_{4} de 1,0 a 0 M. Las fracciones conteniendo XRCC4, que eluían a (NH_{4})_{2}SO_{4} \sim0,2 M, se juntaron y dializaron frente a Tris.HCl 50 mM, pH 7,5, DTT 2 mM, EDTA 1 mM y 10% (p/v) de glicerol, y se almacenaron a -80ºC.

Producción y purificación de anticuerpo anti-XRCC4

Las regiones del gen XRCC4 se amplificaron mediante PCR a partir del pBlueScript que contenía el gen XRCC4 humano, y a continuación se insertaron en pauta cadena abajo respecto la marca hexa-histidina (His) del pQE-30 (Qiagen, Estados Unidos), y se expresaron y purificaron, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a partir de las fracción soluble de los lisados bacterianos. Los anticuerpos contra las proteínas recombinantes solubles se generaron en conejos usando procedimientos estándares (Harlow y Lane, 1988), y están disponibles comercialmente en Serotec, Reino Unido. Los análisis de inmunotransferencia Western se realizaron como se ha descrito previamente (Harlow y Lane, 1988) y las transferencias se revelaron mediante quimioluminiscencia potenciada (Amersham). La XRCC4 recombinante de longitud completa marcada con His se unió a Sulfolink Coupling Gel (Pierce, Estados Unidos) y se usó para purificar mediante inmunoafinidad anticuerpos anti-XRCC4 del suero SJ4 crudo tal como se ha descrito previamente (Lakin et al., 1996).

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Tratamiento con fosfatasa de extractos de células HeLa

Para analizar la fosforilación de la XRCC4, se trató extracto nuclear de HeLa (50 \mug) con fosfatasa de proteína \lambda (New England Biolabs) en presencia de MnCl_{2} 2 mM, y se incubó durante 30 minutos a 30ºC antes de su SDS-PAGE y transferencia Western.

Ensayos de co-inmunoprecipitaciones y adenilación de ligasas

La XRCC4 se inmunoprecipitó a partir de extracto nuclear de HeLa usando anti-XRCC4 policlonal y un control pre-inmune. Específicamente, el extracto nuclear de HeLa se dializó en tampón D* (HEPES-KOH 20 mM, 20% (p/v) de glicerol, KCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, EDTA 0,2 mM, DTT 1 mM, PMSF 0,5 mM, metabisulfito sódico 1 mM, y NP-40 0,1%), y se incubó a continuación con suero pre-inmune o inmune durante 1 hora a 4ºC en presencia de 50 \mug/ml de bromuro de etidio para impedir las interacciones no específicas (Lai y Herr, 1992). Los complejos inmunes se unieron a cuentas de Proteína A-Sepharose (Pharmacia), seguida por lavado extensivo con tampón D* que contenía NaCl 0,15-1 M. Las cuentas de Proteína A-Sepharose se lavaron finalmente en tampón D* que contenía NaCl 0,15 M antes del análisis. A continuación se ensayaron las muestras por su capacidad para formar complejos ligasa de ADN-adenilato tal como se ha descrito previamente (Robins y Lindahl, 1996). Los sustratos polinucleótidos oligoT\cdotpolirA y oligorA\cdotpolidT se prepararon como se ha descrito (Tomkinson et al., 1991). La reactividad de los intermediarios enzima-adenilato formados se examinaron añadiendo 0,8 g de oligoT\cdotpolirA y oligorA\cdotpolidT sin marcar durante 1 hora a 30ºC. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de tampón de muestras SDS y las proteínas adeniladas se detectaron mediante autoradiografía a continuación de SDS-PAGE.

Cromatografía de filtración en gel

El extracto nuclear de HeLa se dializó extensivamente frente a tampón A (Tris.HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 0,5 mM, 10% (p/v) de glicerol) conteniendo NaCl 1 M. A continuación se cargó la proteína en una columna de Superose 6 (Pharmacia) (60 \times 1,5 cm) pre-equilibrada con tampón A conteniendo NaCl 1 M. En un análisis idéntico de filtración en gel se analizaron 0,2 mg de XRCC4 recombinante pura sin marcar en tampón A conteniendo NaCl 1 M.

Purificación de la ligasa IV de ADN de células HeLa

La ligasa IV de ADN se purificó a partir de células HeLa como se ha descrito previamente (Robins, 1996). La fracciones recolectadas de cada una de las columnas se analizaron mediante inmunotransferencias con anticuerpos específicos para las ligasas III y IV de ADN, y la XRCC4.

Expresión de los derivados de la ligasa IV recombinante

Para la generación de derivados recombinantes de la ligasa IV, se amplificaron fragmentos de la región codificante del gen de la ligasa IV humana, mediante PCR, a partir de ARN de HeLa. Cada producto de la PCR incluía un sitio BamHI en el extremo 5' y un codón de paro seguido por un sitio SalI en el extremo 3', y después de su digestión se ligaron en un pET30b digerido con BamHI/SalI. También se clonó el fragmento 550-844 de la ligasa IV en pQE-30, y el clon resultante se expresó en E. coli M15(Rep4). Para la transcripción y traducción in vitro de los fragmentos de la ligasa IV, se transcribieron in vitro y se tradujeron 1 \mug de pET30LigIV(1-198), pET30LigIV(199-549), pET30LigIV(550-844), o un control de luciferasa (Promega) usando el equipo TnT lisado de reticulocito de conejo (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los productos resultantes marcados de forma N-terminal con His se purificaron mediante cromatografía con agarosa Ni^{2+}-NTA.

En resumen, se pre-equilibraron 100 \mul de volumen de lecho de agarosa Ni^{2+}-NTA de Qiagen en tampón de lavado (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, imidazolio 20 mM, 10% (p/v) de glicerol, y NaCl 0,5 M) antes de la adición de 20 \mul del crudo de fragmento de ligasa traducido in vitro marcado con [^{35}S]-metionina. Las proteínas no unidas se suprimieron después de centrifugación a baja velocidad, y la resina se lavó 3 veces con tampón de lavado para suprimir proteínas unidas no específicamente. Finalmente, las proteínas de ligasa IV se eluyeron con 100 \mul de tampón de elución consistente en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, imidazolio 100 mM y 10% (p/v) de glicerol.

Ensayos de interacción entre la XRCC4 recombinante y los derivados de la ligasa IV

La XRCC4 de longitud completa se inmovilizó sobre cuentas de gel de Sepharose-4B (Pharmacia) usando el procedimiento del ciano-gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como control negativo, el enlace también se realizó sin proteína XRCC4. Un volumen de lecho de 30 \mul (con y sin XRCC4) se pre-equilibró con tampón de unión (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, DTT 2 mM, EDTA 1 mM, 10% (p/v) de glicerol, 0,1% de NP-40, y 0,36 mg/ml de BSA) antes de la adición de estos productos de ligasa traducidos in vitro y marcado con His, o de luciferasa. El material no unido se recolectó después de su centrifugación y las cuentas se lavaron con tampón de unión conteniendo NaCl 0,1 M y NaCl 1,0 M. La cuentas se resuspendieron en tampón de carga de gel y se hirvieron como preparación para su análisis mediante SDS-PAGE. Finalmente, los geles de SDS-PAGE se fijaron en ácido acético al 10% durante 30 minutos y se secaron, y las proteínas marcadas se detectaron mediante autoradiografía. La capacidad del fragmento C-terminal recombinante de la ligasa IV (residuos 550-844) para unir cuentas de XRCC4-Sepharose se ensayó como más arriba, excepto que el análisis fue mediante tinción con azul brillante de Coomassie y la inmunotransferencia con anticuerpo anti-ligasa IV.

Ejemplo 2 Determinación de la actividad biológica de la ligasa IV de ADN Identificación de una segunda, y hasta la fecha no caracterizada, ligasa de ADN de levadura

Usando una secuencia consenso del dominio catalítico principal de todas las ligasas de ADN publicadas, los actuales inventores buscaron a través del genoma de S. cerevisiae recientemente publicado (Goffeau et al., 1996).

Además de detectar el CDC9, que codifica la ligasa I de ADN, estas búsquedas identificaron un ORF (YOR005c) presente en el cromosoma XV como un hito altamente significativo.

Este ORF codifica un polipéptido de 944 residuos aminoácidos, de masa molecular predicha de 109 kDa, que presenta una extensa similitud (24% de identidad, 43% de similitud) en su región central con el dominio ``nuclear'' conservado de ligasa de la ligasa I de ADN (Figura 2).

Los análisis filogenéticos de los alineamientos de proteínas a lo largo de esta región revelan que el YOR005c está considerablemente más relacionado con las ligasas de ADN de las eucariotas y los virus de eucariotas que con aquéllas de procariotas, y en particular, que está más estrechamente relacionado con la ligasa IV humana. Se generó un fenograma usando el paquete PHYLIP con la secuencia conservada ``nuclear'' alineada de cada proteína, tal como se denominan en la Figura 2, usando el procedimiento UPGMA. Los números de acceso son como sigue: I de A. thaliana (X97924); C. albicans (X95001); I de C. elegans (Z73970), virus de la viruela de la gallina (U00761); I de H. sapiens I (M36067), III (X84780) y IV (X83411); I de M. musculus (U04674); virus del fibroma del conejo (Z29716); I de S. cerevisiae (X03246), IV (Z74913); I de S. pombe (X05107); bacteriófago T7 (P00969); virus de la viruela vacuna (X16512); I de X. laevis (L43496).

Consistente con esto, el YOR005c comparte una extensión N-terminal con los enzimas de mamíferos que está ausente en las ligasas de ADN de procariotas. Más aún, posee una extensión C-terminal adicional que es homóloga a lo largo de su longitud con la de la ligasa IV de mamíferos. Por tanto, concluimos que el YOR005c codifica un homólogo de la ligasa IV de ADN de mamíferos, y denominamos este locus LIG4.

La alteración de LIG4 no conduce a una marcada hipersensibilidad a una variedad de agentes que lesionan el ADN

Para estudiar la función de LIG4, desactivamos este gen el la cepa haploide W303\alpha de levadura mediante una interrupción de un paso del gen.

Notablemente, los mutantes lig4 resultantes no tienen defectos de crecimiento fácilmente observables cuando se propagan a temperaturas que oscilan entre 18ºC y 37ºC. Esto contrasta marcadamente con el CDC9, el gen que codifica la ligasa I de ADN, cuya interrupción resulta letal debido a una incapacidad para progresar a lo largo de la fase S (Johnston y Nasmyth, 1979). Por tanto, se concluye que el LIG4 no juega un papel esencial en la replicación del ADN, y que la ligasa I del ADN es la única ligasa requerida para este proceso.

A continuación ensayamos si la levadura mutante lig4 era defectuosa en alguna de las vías predominantes de reparación del ADN, verificando su sensibilidad a la muerte por parte de varios agentes que dañan el ADN. De forma notable, las cepas mutantes lig4 no son hipersensibles al daño del ADN inducido por la exposición a radiación ultravioleta, mostrando que no es esencial en la reparación de cortes de nucleótidos. Además, las cepas con el LIG4 interrumpido no son hipersensibles a un rango de concentraciones de la droga radiomimética metilmetanosulfonato (MMS) en el medio de cultivo. Finalmente, las levaduras mutantes LIG4 tampoco presentan una sensibilidad significativamente elevada a la muerte por radiación ionizante en un rango de dosis (0-45 kRad). A diferencia de los mutantes rad52, la levadura mutante lig4 es tan resistente a la radiación ionizante como sus cepas progenitoras; los mutantes lig4 no fueron significativamente más sensible ni siquiera a las dosis más elevadas (hasta 45 kRad) (Figura 3A).

Puesto que las roturas de la doble hebra (DSB) del ADN inducidas por radiación son reparadas en S. cerevisiae principalmente mediante recombinación homóloga, estos datos sugieren que LIG4 no es esencial para este último proceso. Consistente con esto, hallamos que la eficiencia de la integración apuntada mediada por recombinación homóloga en varios loci del genoma de levadura es indistinguible entre las cepas del tipo salvaje y la mutante lig4.

LIG4 funciona en la vía NHEJ, dependiente de Ku, de reparación de cortes de la doble hebra de ADN

En S. cerevisiae, los cortes de la doble hebra (DSB) de ADN inducidos por radiación se reparan principalmente mediante recombinación homóloga, la cual es mediada por genes en el grupo de epistasis RAD52 (Friedberg et al., 1995). Por tanto, la interrupción de RAD52 sensibiliza a las células de levadura a las radiaciones ionizantes (Figura 3A). No obstante, las células eucariotas también pueden reparar los DSB de ADN mediante una segunda vía, la unión de extremos no homóloga (NHEJ), que utiliza productos de genes distintos de los empleados en la recombinación homóloga. Tanto en levaduras como en mamíferos, uno de estos componentes es la proteína unidora de ADN Ku, que comprende subunidades de \sim70 kDa y \sim80 kDa [Ku70 y Ku80 en mamíferos (Jackson y Jeggo, 1995); Yku70p/Hdf1p y Yku80p/Hdf2p en levaduras (Feldmann y Winnacker, 1993; Boulton y Jackson, 1996a; 1996b; Feldmann et al., 1996; Mages et al., 1996; Milne et al., 1996; Siede et al., 1996; Tsukamoto et al., 1996)]. NHEJ parece ser la vía predominante para la reparación del ADN en mamíferos, pero representa una vía menor en levaduras; en consecuencia, la interrupción del YKU70 o YKU80 en S. cerevisiae resulta en una sensibilidad incrementada a la radiación ionizante o MMS sólo cuando la recombinación homóloga no está operativa (Boulton y Jackson, 1996a; 1996b; Milne et al., 1996; Siede et al.).

Hemos hallado que los mutantes dobles lig4/rad52 son considerablemente más radiosensibles que las cepas interrupción sólo en el RAD52 (Figura 3B). Como en el caso para YKU70 (mutante en la subunidad Ku70 de la Ku de levadura), la interrupción de LIG4 hipersensibiliza la levadura a las radiaciones ionizantes en los mutantes rad52. Más aún, los mutantes triples lig4/yku70/rad52 no son apreciablemente más radiosensibles que las cepas del mutante doble yku70/rad52 o del mutante doble lig4/rad52, indicando que la Lig4p y Yku70p funcionan sobre la misma vía de reparación independiente del RAD52. Esto proporciona indicación de que LIG4 está implicado en la reparación del daño del ADN inducido por radiaciones ionizantes, y que funciona en una vía independiente a RAD52.

Puesto que los efectos de interrumpir el LIG4 son similares a los obtenidos interrumpiendo el YKU70 o YKU80, hemos verificado la radiosensibilidad de los mutantes triples lig4/yku70/rad52. Tales cepas mutantes no son más sensibles a la radiación ionizante que las cepas mutantes lig4/rad52 o yku70/rad52 (Figura 3B).

Tomados conjuntamente, estos datos proporcionan indicación de que Ku y LIG4 funcionan en la misma vía de reparación del ADN.

Los trabajos previos han mostrado que Ku funciona en el NHEJ del ADN, y que este proceso se puede medir a través del empleo de un ensayo de reparación de plásmido in vivo (Boulton y Jackson, 1996a; 1996b; Milne et al., 1996). En este ensayo, se linealiza un plásmido pBTM116 de lanzadera levadura-E. coli (Boulton y Jackson, 1996a; 1996b) mediante digestión con enzima de restricción, a continuación se introduce en S. cerevisiae mediante transformación. El plásmido contiene el marcador TRP1 seleccionable en levadura, el gen de la \beta-lactamasa, el promotor ADH1, y sitios de restricción para EcoRI y PstI. Puesto que el plásmido debe recircularizarse para propagarse, el número de colonias de levaduras transformantes obtenidas cuantifica la capacidad de la cepa para reparar el plásmido. Más aún, puesto que los DSB de ADN generados en estos estudios residen en una región que no es homóloga al genoma de levadura, la recombinación homóloga está suprimida y la reparación opera predominantemente a través de la NHEJ.

Por tanto, analizamos la capacidad de levaduras mutantes lig4 de reparar el pBTM116 después de su corte con varias endonucleasas de restricción. Se usaron las cepas del tipo salvaje, lig4, yku70, y lig4/yku70. Las células de cada cepa se transformaron en paralelo con pBTM116 superenrollado o con una cantidad equivalente de pBTM116 que había sido digerido hasta su conclusión con EcoRI (panel izquierdo de la Figura 4) o PstI (panel derecho de la Figura 4). Para cada experimento, el valor representado es el número de transformantes obtenidos con el plásmido lineal expresado como un porcentaje del número obtenido para el ADN superenrollado. Cada experimento se repitió al menos tres veces y, en cada caso, las células se sembraron y contaron por duplicado.

Al igual que con las células interrumpidas para YKU70 o YKU80, las cepas mutantes lig4 estaban gravemente impedidas en el NHEJ del plásmido, y esto se observó con ambos extremos 5' ó 3' en alero. De forma interesante, estos estudios revelan que el efecto de las mutaciones lig4 es menos acusado con los extremos 3' del ADN en alero que con los extremos 5' en alero. Aunque existen otras alternativas, es posible que esto refleje diferencias en los mecanismos por los que pueden ser reparados los dos tipos de extremos de ADN, o es debido a diferentes sensibilidades de las diferentes estructuras finales al ataque de nucleasas. Notablemente, la reparación del ADN no está más impedida en las cepas del mutante doble yku70/lig4 (Figura 4). Además, aunque todavía no se conoce la razón exacta de este efecto, como lo es en el caso de los mutantes yku70 o yku80, hemos hallado que las levaduras mutantes lig4 tienen una capacidad ligeramente elevada para reunir pBTM116 portadores de extremos romos.

Tomados conjuntamente, estos resultados revelan que la Lig4p juega un papel crucial en la reparación moléculas de de plásmidos que tienen cortes de la doble hebra de ADN cohesivos in vivo. En segundo lugar, muestran que, aunque se ha observado que la ligasa I de ADN purificada (CDC9) es capaz de catalizar la unión de DSB in vitro (Tomkinson et al., 1992), este enzima no juega un papel importante en esta vía, tal como se ha ensayado mediante la reunión in vivo de DBS de plásmido, y que es incapaz de sustituir eficientemente a la Lig4p en este proceso. Finalmente, estos resultados también muestran que la Lig4p juega un papel importante en la vía NHEJ dependiente de Ku.

Aunque la reparación de plásmido se reduce dramáticamente en las cepas mutantes lig4, no está suprimida. Para determinar precisamente los tipos de sucesos de reparación del ADN que son dependientes o independientes de LIG4, se recuperaron los plásmidos reparados y se analizaron a continuación mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN. En ausencia de LIG4 funcional, los extremos de ADN cohesivos son reparados por un vía ineficaz de reparación del ADN que tiende al error. El plásmido pBTM116 contiene el promotor ADH1 y algunos productos de reparación se generaron mediante el proceso de reparación del hueco que implica el gen ADH1 cromosómico. Del gran número de plásmidos recuperados de las cepas progenitoras, todos habían sido reparados mediante ligación directa de los extremos cohesivos del ADN, generando por tanto el sitio de corte del enzima de restricción (Boulton y Jackson, 1996a; 1996b). No obstante, se encontró que los productos de reparación del plásmido recuperados de las cepas mutantes yku70 o lig4 entraban dentro de varias categorías. Algunos de estos correspondían a productos de ``reparación del hueco'' que hemos mostrado se generan a través de la recombinación homóloga dependiente de RAD52 con el ADN genómico (el análisis de la secuencia reveló que las recombinación homóloga se emplea en la generación de estos productos y que su producción es suprimida por la interrupción del RAD52; Boulton y Jackson, 1996a; 1996b, y datos no mostrados). Por tanto, esto proporciona evidencia extra de que LIG4, al igual que YKU70 y YKU80, no juega un papel crucial en los procesos de recombinación homóloga. En las cepas mutantes yku70 ó yku80, se encontró que virtualmente todos los productos de reparación residual habían sufrido supresiones (Boulton y Jackson, 1996a; 1996). Por contra, aunque muchos de los productos de reparación residuales generados en mutantes lig4 habían sufrido también la supresión de secuencias terminales, algunos fueron reunidos de forma precisa.

Conjuntamente, estos resultados proporcionan conocimiento sobre los distintos roles desempeñados por Lig4p y Ku en la NHEJ del ADN (ver Discusión más abajo).

Lig4p, a diferencia de Ku, no parece funcionar en el mantenimiento de la longitud del telómero

Los telómeros se dan en los extremos de los cromosomas de eucariotas, como estructuralmente distintos, y tiene intermediarios de replicación inusuales para los que no está claro si es necesaria una ligasa de ADN distinta (Blackburn, 1991; Zakian, 1995; Lundblad y Wright, 1996). Trabajos recientes han demostrado que Ku funciona en la homeostasis del telómero, puesto que la interrupción de YKU70 o YKU80 resulta en una dramática reducción en la longitud del telómero (Boulton y Jackson, 1996b; Porter et al., 1996).

Dado que Lig4p y Ku funcionan juntas en la NHEJ de ADN, ensayamos si LIG4 está implicado en el control de la longitud del telómero.

Para hacer esto, se digirió el ADN genómico con el enzima de restricción XhoI, el cual en las cepas salvajes produce un fragmento predominantemente telomérico de \sim1,3 kDa, que se detecta mediante hibridación Southern a una sonda oligonucleotídica que se une a las secuencias teloméricas repetitivas, incluyendo \sim400 p.b. de la secuencia repetitiva (C_{1-3A}), y se detecta mediante hibridación Southern usando un oligonucleótido poli(GT)_{20} radiomarcado. Notablemente, mientras que la interrupción de YKU70 resultan en un acortamiento telomérico, la pérdida de la función LIG4 no tiene un efecto detectable.

Por tanto, estos datos revelan que, aunque Ku i Lig4p funcionan juntas en la reparación de DSB del ADN, Ku, pero no Lig4p, tiene una función esencial adicional en la homeostasis de la longitud del telómero.

Materiales y procedimientos Interrupciones de genes

Se amplificó el LIG4 de longitud completa mediante PCR con los cebadores LIG4-1 y LIG4-2 (respectivamente 5' TCA GTA GTT GAC TAC GGG AAA GTC T 3' y 5' ATG ATA TCA GCA CTA GAT TCT ATA C 3') usando la polimerasa de ADN Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim). Después de clonarlo en pGME-T (Promega), se digirió el plásmido resultante con EcoRI, se trató con la polimerasa de ADN Pfu, y se digirió a continuación con XbaI. Se insertó el marcador HIS3 para remplazar el ORF de LIG4 entre los residuos 289 y 592. El fragmento de interrupción se cortó con SphI y SpeI, y se usó para transformar las cepas de levadura apropiadas hasta His+. La interrupción del gen se verificó usando cebadores de LIG4 y HIS3 en la PCR. Dos construcciones de interrupción del RAD52 fueron proporcionada por el Dr. Weaver y tienen respectivamente selección triple de TRP1 y URA3.

Verificación de la sensibilidad a la temperatura de los agentes que dañan el ADN

Se puntearon alícuotas (15 \mul) de diluciones de 5 veces en serie de cultivos de levaduras en la mitad de la fase log, y se hicieron crecer durante 36 h a 30ºC o 37ºC. Las cepas en una placa es expusieron a 50 J/m^{2} de radiación ultravioleta (UV-C) (Stratalinker, Stratagene). En otra placa, el medio YPDA contenía un 0,0025% de metilmetanosulfonato. En otros estudios, las cepas mutantes lig4 no mostraron hipersensibilidad al MMS (0,0005% y 0,005% en el medio de cultivo) ni a la UV-C (20-150 J/m^{2}).

Ensayos de supervivencia a la radiación ionizante

Se inocularon tres aislados independientes de cada cepa o en medio mínimo que carecía de los aminoácidos apropiados o en YPDA, y se cultivaron durante la noche a 30ºC. Los cultivos se diluyeron en agua estéril hasta un valor de OD_{600nm} equivalente a 1 \times 10^{7} células/ml, y se irradiaron alícuotas de 1 ml usando una fuente de ^{137}Cs a una dosis de 0,18 kRad/min. Las muestras irradiadas y los controles no irradiados de diluyeron a continuación y se sembraron por duplicado usando un sembrador en placa en espiral automático (Whitley) sobre YPDA o medio mínimo. El número de colonias se verificó después de su incubación a 30ºC durante 3-4 días.

Ensayo de reparación del plásmido

Los ensayos de reparación de plásmido se realizaron como se ha descrito previamente (Boulton y Jackson, 1996a; 1996b). En resumen, el plásmido pBTM116 (2-5 \mug) de lanzadera levadura-E. coli, que contiene TRP1 para su selección en levaduras, se digirió con el enzima de restricción apropiado hasta su terminación, y se desactivó el enzima mediante tratamiento a 65ºC durante 20 minutos. El ADN linealizado se usó entonces para transformar levaduras mediante el procedimiento del acetato de litio (Ausubel et al., 1987). Se realizaron transformaciones en paralelo con una cantidad equivalente de plásmido sin cortar para permitir la normalización de diferencias en la eficiencia de la transformación. Se sembraron muestras diluidas por duplicado en medio mínimo que carecía de los aminoácidos apropiados, y se contaron las colonias después de su incubación a 30º durante 3-4 días. Para analizar los productos de reparación del plásmido se aisló el ADN de transformantes de levadura único mediante el equipo de Aislamiento del ADN de Levaduras (Stratagene), y se usó para transformar células de E. coli XL1-Blue (Stratagene) en resistentes a la ampicilina. A continuación se aisló el ADN del plásmido y se analizó mediante digestión con enzimas de restricción y mediante secuenciación del ADN.

Extracción del ADN de levadura y análisis del ADN telomérico

Se aisló ADN genómico de S. cerevisiae esencialmente tal como se ha descrito (Ausubel et al., 1987). Para el análisis de telómeros se digirieron 2 \mug de ADN genómico con 30 U de XhoI (Boehringer Mannheim) a 37ºC durante la noche. El ADN digerido se separó entonces en un gel de agarosa al 1,2% y 1 \times TAE, y se transfirió a una membrana Hybond Nfp+ (Amersham) mediante transferencia capilar en 20 \times SSC, tal como sugería el fabricante. Las membranas se pre-hibridaron en fosfato sódico 0,5 M, pH 7,2, 1% de SDS, y se hibridaron a continuación con 3 ng/ml de oligonucleótido poli(GT)_{20} marcado con ^{32}P en su extremo (actividad específica > 10^{9}/\mug) en un tampón basado en Church (fosfato sódico 0,2 M, pH 7,2, 1% de BSA, 6% de polietilenglicol 6000, 1% de SDS) durante la noche a 62ºC. Finalmente, las membranas se lavaron dos veces a temperatura ambiente, durante 30 minutos, en fosfato sódico 0,2 M, 0,1% de SDS, y se expusieron a continuación a película para rayos X pre-flasheada a -70ºC.

Discusión

El trabajo de los inventores con la XRCC4 indica que es predominantemente una proteína nuclear. Más aún, a través de una variedad de estrategias, hemos demostrado que la XRCC4 media interacciones extremadamente fuertes y específicas con la ligasa IV de ADN. Por ejemplo, estos dos componentes co-inmunoprecipitan de forma altamente específica el uno con el otro a partir de extractos de células HeLa, incluso en presencia de NaCl 1 M. Además, tales interacciones no son suprimidas por el bromuro de etidio, indicando que la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV no está mediada por un intermediario de ADN. Más aún, mostramos que la XRCC4 expresada en bacterias y la ligasa IV también se unen la una con la otra estrechamente, revelando que su interacción es directa. Además, la XRCC4 y la ligasa IV se co-purifican en cada procedimientos de fraccionamiento cromatográfico que hemos empleado, incluyendo la filtración en gel en presencia de NaCl 1 M, la cromatografía de intercambio aniónico y catiónico, y la cromatografía de interacción hidrofóbica. Más aún, hasta ahora solo hemos resuelto estas dos proteínas mediante la adición de detergentes iónicos fuertes.

El hecho de que la XRCC4 interacciona estrechamente con la ligasa IV, pero no con las otras ligasas de ADN que hemos analizado, nos ha conducido a investigar las bases para estas especificidad de unión. Notablemente, aunque todas las ligasas de ADN de mamíferos caracterizadas contienen una región catalítica núcleo altamente relacionada, cada una posee extensiones N- y/o C-terminales únicas. Hemos hallado que es el dominio C-terminal único, y no la región catalítica de ligasas, de la ligasa IVel que interacciona con la XRCC4. Interesantemente, esta región de la ligasa IV contiene dos copias en tándem del dominio de homología BRCT débilmente conservadas (Koonin et al., 1996; Callebaut y Mornon, 1997), haciendo que une especule que es uno o ambos de estos dominios el que media la interacción con la XRCC4. Los dominios BRCT también existen en una variedad de otros factores, y son necesarios para que esos factores interaccionen (Mackey et al., 1997; Nash et al., 1997), sugiriendo que el dominio BRCT de una proteína interacciona con un dominio BRCT de la otra. Por tanto, a la luz de que nuestro trabajo muestra la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, podría esperarse que la XRCC4 poseyera también una o más copias del BRCT consenso. Aunque la XRCC4 no ha sido identificada como una proteína contenedora de un dominio BRCT mediante análisis previos, nosotros hemos usado inspecciones manuales y por ordenador de la secuencia de la XRCC4 para revelar homologías limitadas con otros dominios BRCT, que sugieren que la XRCC4 podría contener una o más copia divergentes de esta putativa unidad estructural de proteínas.

Dado que la XRCC4 funciona claramente en el NHEJ de ADN, nuestros datos indican que la ligasa IV también juega un papel crucial en este proceso. La XRCC4 podría servir como puente molecular para apuntar la ligasa IV hacia DSB de ADN, quizá a través de que la XRCC4 interaccione también con otros componentes del aparato de NHEJ de ADN (Figura 5). A la vista de una función puente putativa tal para la XRCC4, vale la pena destacar que los estudios de inmunoprecipitación sugieren que la XRCC4 puede interaccionar con la Ku y/o DNA-PKcs, aunque estas interacciones sólo ocurren en concentraciones bajas de sal y, por tanto, son débiles comparadas con aquéllas exhibidas entre la XRCC4 y la ligasa IV. Un posible enlace físico entre la XRCC4 y la DNA-PKcs es atractivo a la luz del hecho de que hemos mostrado que la XRCC4 de células de HeLa es una fosfo-proteína, y que es un sustrato efectivo para la DNA-PK in vitro. Puesto que la XRCC4 posee un motivo consenso para la quinasa DNA-PK (Li et al., 1995), la mutación de este sitio podría afectar la función de la XRCC4 in vivo.

Consistente con la propuesta de que la ligasa IV juega un papel importante en la reparación de DSB de ADN, hemos identificado una ligasa IV de ADN homóloga de S. cerevisiae (que presenta una extensiva similitud de secuencia a lo largo de su longitud con la ligasa IV de mamíferos), y hemos mostrado que la desactivación de este factor debilita el NHEJ de ADN en una manera que es epistática con mutaciones en las homólogas de Ku70 y Ku80 en levadura (Boulton y Jackson, 1996; Boulton y Jackson, 1996; Teo y Jackson, 1997). Por contra, hallamos que la ligasa IV de ADN no parece jugar un papel esencial en la reparación de daño del ADN inducido por luz ultravioleta, ni en la reparación de DSB del ADN mediante recombinación homóloga (Teo y Jackson, 1997). Tomados en conjunto con los datos sobre la XRCC4, esto proporciona indicación de que la ligasa IV está dedicada al NHEJ del ADN, y que esta función se conserva a lo largo del reino eucariota.

El gen de la levadura, que hemos denominado LIG4, no es esencial para la replicación del ADN, la recombinación homóloga dependiente de RAD52, ni las vías de reparación de cortes de nucleótidos y de reparación de cortes de bases. En cambio, hemos observado que LIG4 esta implicado específicamente en juntar de nuevo cortes de la doble hebra del ADN mediante el proceso de NHEJ de ADN, el cual no precisa de homología entre las dos moléculas de ADN recombinantes, y no requiere el RAD52. Notablemente, los experimentos de epistasis génica revelan que LIG4 actúa en la misma vía de reparación que Ku, una proteína nuclear que reconoce específicamente cortes en la hebra de ADN. Por tanto, hemos identificado una nueva ligasa de ADN de S. cerevisiae y hemos mostrado que está implicada específicamente en la vía NHEJ, dependiente de Ku, de la reparación de DBS de ADN.

A la luz de esto, y dado que las mutaciones en YKU70 o YKU80 resultan en el acortamiento dramático de telómeros en levaduras (Boulton et al., 1996b; Porter et al., 1996), hemos verificado también la potencial implicación del LIG4 en la homeostasis de la longitud del telómero. Los telómeros son las estructuras de proteína-ADN en los extremos de los cromosomas eucariotas que aseguran la completa replicación de los extremos de los cromosomas, protegen estos extremos de su degradación, e impiden que los extremos de los cromosomas activen las vías de señalización de daño del ADN o se enzarcen en reacciones de fusión y recombinación con otros loci [para revisiones ver, Blackburn, 1991; Zakian, 1995; Lundblad y Wright, 1996]. En la mayoría de organismos, los telómeros están compuestos de números variables de secuencias repetitivas sencillas y, al menos en S. cerevisiae, la longitud de estas series de secuencias se mantiene mediante una combinación de actividad telomerasa y recombinación dependiente e independiente de RAD52. En las levaduras, las deficiencias en Ku resultan en una reducción aproximada del 70% del número de secuencias repetitivas teloméricas (Boulton et al., 1996b; Porter et al., 1996). Dado que la Ku se une a los extremos de la doble hebra de ADN (Mimori y Hardin, 1986; Paillard y Strauss, 1991), una posibilidad es que la Ku podría interaccionar directamente con los extremos de ADN teloméricos y potenciar el alargamiento del telómero protegiendo los extremos de ADN teloméricos de las nucleasas, o aumentando el reclutamiento de telomerasa. Una explicación alternativa es que el efecto de la inactivación de Ku sobre la longitud del telómero es indirecto tal vez los defectos de la reparación del ADN que están asociados con una Ku deficiente en levaduras se traducen en cambios en la fisiología celular que inciden directamente en el control de la longitud del telómero. Aunque no nos es posible actualmente identificar precisamente como afecta la Ku la longitud del telómero, el hecho de que mutaciones de LIG4 tengan esencialmente el mismo defecto de la reparación del ADN que tienen la Ku, pero que no alteren la longitud del telómero, argumenta a favor de un papel específico para la Ku en la homeostasis del telómero, que es distinto de sus actividades en la reparación de DSB de ADN. En relación a esto, será interesante ver si pueden generarse derivados mutados de Ku que no tengan efecto sobre la reparación del ADN pero que sí resulten en un mantenimiento telomérico defectuoso.

Las células de levadura mutadas en LIG4 tienen defectos acusados en el NHEJ de ADN, mostrando que la Lig4p juega un papel crucial en este proceso, que no puede ser complementado eficientemente por la ligasa I de ADN. De forma inversa, los mutantes del CDC9 y de la ligasa I de ADN humana son deficientes en la replicación del ADN, y, al menos in vitro, esta función no es realizada eficientemente por otros enzimas. Esto indica que las ligasas I y IV de ADN tienen funciones celulares distintas y altamente separadas, y que no pueden sustituirse efectivamente entre ellas. Por tanto, la ligasa I de ADN juega un papel crucial en la replicación del ADN, y también parece sellar las roturas de la hebra única de ADN que son los productos finales de la reparación de los cortes de nucleótidos y bases, y además, es probable que complete los sucesos de recombinación entre moléculas de ADN dúplex homólogas. Hay también datos que sugieren que la ligasa III de ADN de mamíferos está especializada en funciones particulares. Una variante de empalme (ligasa III-\alpha de ADN) podría operar en una vía distinta para la reparación de cortes de bases, mientras que otra variante (ligasa III-\beta de ADN) ha sido implicada en la recombinación meiótica. Notablemente, en S. cerevisiae no hay homólogos evidentes de la ligasa II/III de mamíferos. No obstante, los análisis de secuencias (Figura 1; Colinas et al., 1990; Kerr et al., 1991; Husain et al., 1995) revelan que estas ligasas están relacionadas más estrechamente con las ligasas de ADN codificadas por virus de viruelas citoplásmicos que no con la ligasa I de ADN, sugiriendo que las ligasas II y III podrían haber surgido bastante recientemente en la evolución de los vertebrados. De forma interesante, y altamente consistente con las funciones propuestas para la ligasa III de mamíferos, la desactivación de la ligasa de ADN de virus de viruelas no afecta la replicación o recombinación del ADN viral, pero hace a los virus mutantes más sensibles a las lesiones del ADN inducidas por UV o bleomicina (Colinas et al., 1990; Kerr et al., 1991). Conjuntamente, estos datos sugieren que la ligasa I de ADN y, tal vez, la ligasa II/III de ADN están implicadas predominantemente en unir de nuevo las muescas en hebras únicas, mientras que la ligasa IV de ADN es el principal enzima que cataliza la unión de roturas de dobles-hebras.

A la luz de estos puntos, y dado que LIG4 funciona en la vía NHEJ dependiente de Ku altamente conservada evolutivamente, se indica que la ligasa IV de ADN de mamíferos tiene un papel clave en la reunión de DSB de ADN dependiente de Ku. Como es el caso para Ku (revisado en Jackson y Jeggo, 1995), la deficiencia en ligasa IV de mamíferos podría resultar en radiosensibilidad celular y una incapacidad para reunir intermediarios de recombinación V(J)D específica para un sitio.

Aunque los datos disponibles sugieren la diversificación de la función de las diferentes ligasas de ADN eucariotas, no está claro si esta surge a partir de diferencias intrínsecas en la actividad catalítica o a partir de diferencias conferidas, por ejemplo, por las distintas extensiones C- y N-terminales de los enzimas. Al menos in vitro, las ligasas I, III y IV de ADN humanas muestran capacidades diferentes para unir cortes en hebras únicas en sustratos de polinucleótidos híbridos (Arrand et al., 1986; Tomkinson et al., 1991; Robins y Lindahl, 1996). Además, las ligasas de ADN de mamíferos purificadas difieren en sus capacidades para reunir DSB de ADN. No obstante, vale la pena destacar que, en contraste con los datos in vivo disponibles, estos estudios muestran que la ligasa I purificada, pero no otras ligasas de ADN de mamíferos, es capaz de catalizar la unión de extremos romos de ADN efectivamente in vitro (Arrand et al., 1986; Tomkinson et al., 1991; Tomkinson et al., 1992; Robins y Lindahl, 1996). Una posible explicación de esta discrepancia entre los datos in vitro e in vivo es que al menos algunas de las ligasas de ADN eucarióticas podrían no tener una afinidad intrínseca por el ADN y, dentro de la célula, son dirigidas hacia lesiones del ADN apropiadas por factores accesorios. La identificación en esta de la fuerte interacción entre la ligasa IV de ADN y la XRCC4 es consistente con esto.

Tanto la desactivación de la Ku como la de la Lig4p de levadura resulta en una reducción dramática similar de los NHEJ en el ensayo de reparación in vivo de DSB de ADN de plásmido. A consecuencia de esto, y puesto que el nivel de reparación de ADN no decae más en cepas de levadura defectuosas en ambas, Ku y Lig4p, concluimos que estos dos factores funcionan en la misma vía de recombinación ilegítima. No obstante, es evidente que Ku y Lig4p tienen funciones distintas en la NHEJ de ADN, tal como se evidencia por los diferentes espectros de productos de reparación del plásmido residuales que son generados en las respectivas cepas mutantes. Por tanto, mientras que casi todos los productos de reparación del plásmido residuales que surgen en los mutantes yku70 padecen supresiones, en las cepas mutantes lig4 estas corresponden a una mezcla de productos de supresión y productos generados por la unión precisa de extremos del ADN. Conjuntamente, estos resultados sugieren que la Ku podría funcionar al menos de dos formas para potenciar la reparación del ADN. En primer lugar, podría proteger los extremos expuestos del ADN del ataque por nucleasas. En segundo lugar, podría servir para reclutar específicamente Lig4p, directa o indirectamente, hacia los sitios de lesión del ADN, tal vez a través de la extensión C-terminal de la Lig4p que está ausente en la ligasa I de ADN. En consecuencia, los fenotipos de hebras defectuosas en la Ku o Lig4p pueden explicarse como el resultado de una incapacidad de apuntar eficientemente la ligasa hacia los DSB de ADN. En las cepas deficientes en Ku, el fácil acceso de las nucleasas a los extremos del ADN podría conducir a supresiones en virtualmente todos los productos de reparación del NHEJ, lo que presumiblemente se origina a través de una unión ineficiente al extremo del ADN de ligasa I o Lig4p no apuntadas. Por contra, cuando la Lig4p está ausente, Ku es todavía capaz de proteger los extremos del ADN, y esto puede explicar como puede ocurrir todavía cierta reparación precisa - estando ésta presumiblemente mediada por la ligasa I de ADN. No obstante, la reducida cinética de reparación en la levadura mutante lig4 podría significar que, incluso en presencia de Ku, las nucleasas podrían tener finalmente acceso a los extremos del ADN y causar supresiones en una gran proporción de productos de reparación residual. De forma consistente con el modelo anterior, hemos hallado que virtualmente todos los productos de NHEJ residuales generados en mutantes dobles yku70/lig4 tienen continuas supresiones terminales.

Interacción entre la XRCC4 y el complejo Ku/DNA-PKcs

La interacción de la XRCC4 con la DNA-PKcs/Ku se demostró mediante incubación de extracto nuclear de células HeLa con antisuero anti-XRCC4 o pre-inmune, con purificación de los inmunocomplejos resultantes mediante adsorción sobre Proteína A-Sepharose, y a continuación análisis mediante inmunotransferencia Western.

Ambas, la DNA-PKcs y las dos subunidades de Ku son inmunoprecipitadas por el antisuero anti-XRCC4, pero no por el suero pre-inmune.

En estos estudios, los inmunocomplejos se lavaron en condiciones relativamente suaves de NaCl 0,25 M y 0,1% de Nonidet-P40. Sin embargo, cuando se emplearon lavados más exigentes (por ejemplo, en presencia de NaCl 1 M,0,1% de Nonidet-P40, y 50 \mug/ml de bromuro de etidio) la interacción entre la XRCC4 y el complejo DNA-PKcs/Ku se suprimió.

Tomados conjuntamente, estos datos revelan que, aunque la interacción entre la DNA-PKcs/Ku y la XRCC4 parece ser específica, es relativamente débil.

La interacción podría inhibirse usando agentes apropiados, incluyendo fragmentos peptídicos de las respectivas proteínas. Tales agentes podrían identificarse y obtenerse usando procedimientos de ensayo, y usarse en contextos terapéuticos y otros, tal como se ha descubierto más arriba.

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Claims

1. Procedimiento de ensayo para un compuesto capaz de modular la interacción o unión entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, o la XRCC4 y la DNA-PK_{cs}/Ku, o la XRCC4, la ligasa IV de ADN y la DNA-PK_{cs}/Ku, incluyendo el procedimiento los pasos de:

(a): poner en contacto una sustancia que incluye la XRCC4, o un fragmento peptídico de la XRCC4, o un derivado, variante o análogo de la misma, capaz de unir la ligasa IV de ADN o la DNA-PK_{cs}/Ku, una sustancia que incluye la ligasa IV de ADN, o un fragmento peptídico de la ligasa IV de ADN, o una variante, derivado o análogo de la misma, capaz de unir la XRCC4, y/o que incluye la DNA-PK_{cs}/Ku, o un fragmento peptídico de la DNA-PK_{cs}/Ku, o una variante, derivado o análogo de la misma, capaz de unir la XRCC4, y un compuesto de ensayo, en condiciones en las que, en ausencia de dicho compuesto de ensayo sea un inhibidor de la interacción o de la unión entre dichas sustancias, dichas sustancias interaccionan o se unen; y

(b): determinar la interacción o unión entre dichas sustancias.

2. Procedimiento de ensayo para un compuesto capaz de modular la interacción o unión entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, o la XRCC4 y la DNA-PK_{cs}/Ku, o la XRCC4, la ligasa IV de ADN y la DNA-PK_{cs}/Ku, incluyendo el procedimiento los pasos de:

(a): poner en contacto una sustancia que incluye la XRCC4, o un fragmento peptídico de la XRCC4, que interacciona con la ligasa IV de ADN o la DNA-PK_{cs}/Ku, o un derivado, variante o análogo de la misma que interacciona con la ligasa IV de ADN o la DNA-PK_{cs}/Ku, o que incluye la ligasa IV de ADN o la DNA-PK_{cs}/Ku, o un fragmento peptídico de la ligasa IV de ADN o la DNA-PK_{cs}/Ku, que interacciona con la XRCC4, o un derivado, variante o análogo de la misma que interacciona con la XRCC4, y un compuesto de ensayo; y

(b): determinar la interacción entre dichas sustancias y el compuesto de ensayo.

3. Procedimiento de ensayo para un compuesto capaz de afectar la actividad de la ligasa IV de ADN cuando interacciona con la XRCC4, incluyendo el procedimiento los pasos de:

(b): determinar la actividad de la ligasa de ADN.

4. Procedimiento de ensayo según la reivindicación 3, en donde la actividad de la ligasa de ADN se determina por su adenilación o marcado usando un análogo de ATP, o por su capacidad para unir hebras de ADN o análogos de ADN.

5. Procedimiento de ensayos que incluye;

(a): poner en contacto una sustancia que incluye la DNA-PK_{cs}/Ku, o fragmentos peptídicos apropiados de la DNA-PK_{cs}/Ku, o un derivado, variante o análogo de la misma capaz de fosforilar la XRCC4, una sustancia que incluye la XRCC4, o un fragmento peptídico de la XRCC4, o un derivado, variante o análogo de la misma incluyendo un sitio fosforilado por la DNA-PKcs, y un compuesto de ensayo; y

(b): determinar la fosforilación en dicho sitio.

6. Fragmento peptídico de la ligasa IV de ADN capaz de modular la interacción entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, o la XRCC4 y la ligasa IV de ADN y la DNA-PK_{cs}/Ku, que tiene una secuencia hallada en la ligasa IV de ADN humana entre los residuos aminoácidos 677-727 de la secuencia de la ligasa IV de ADN humana mostrada en la Figura 2.

7. Ácido nucleico aislado que codifica un péptido de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Fragmento peptídico o ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 6 ó reivindicación 7, para su utilización en un procedimiento de tratamiento mediante terapia que implica modular la actividad de reparación del ADN celular.

9. Utilización de un fragmento peptídico o ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 6 ó reivindicación 7, para la fabricación de un medicamento destinado a la modulación de la actividad de reparación del ADN celular.

10. Procedimiento según la reivindicación 1 ó reivindicación 2 que además incluye, a continuación de obtener un compuesto capaz de modular la interacción o unión entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, o la XRCC4 y la DNA-PK_{cs}/Ku, o la XRCC4 y la ligasa IV y la DNA-PK_{cs}/Ku, formular el compuesto en una composición que incluye un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Procedimiento según la reivindicación 1 ó reivindicación 2 que además incluye, a continuación de obtener un compuesto capaz de modular la interacción o unión entre la XRCC4 y la ligasa IV de ADN, o la XRCC4 y la DNA-PK_{cs}/Ku, o la XRCC4 y la ligasa IV y la DNA-PK_{cs}/Ku, proporcionar el compuesto a una célula para modular la actividad de reparación del ADN celular, célula que no es parte de un cuerpo humano o animal.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3 ó reivindicación 4 que además incluye, a continuación de obtener un compuesto capaz de afectar la actividad de la ligasa IV de ADN, formular el compuesto en una composición que incluye un excipiente farmacéuticamente aceptable.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3 ó reivindicación 4 que además incluye, a continuación de obtener un compuesto capaz de afectar la actividad de la ligasa IV de ADN, proporcionar el compuesto a una célula para modular la actividad de reparación del ADN celular, célula que no es parte de un cuerpo humano o animal.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 que además incluye, a continuación de obtener un compuesto capaz de afectar la fosforilación de la XRCC4 por parte de la DNA-PK_{cs}/Ku, formular el compuesto en una composición que incluye un excipiente farmacéuticamente aceptable.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 que además incluye, a continuación de obtener un compuesto capaz de afectar la fosforilación de la XRCC4 por parte de la DNA-PK_{cs}/Ku, proporcionar el compuesto a una célula para modular la actividad de reparación del ADN celular, célula que no es parte de un cuerpo humano o animal.