ES2270772T3 - Dominio catalitico de la proteina quinasa de punto de control del ciclo celular efectora humana, chk1, materiales y procedimientos para la identificacion de inhibidores de la misma. - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un polinucleótido purificado y aislado constituido por las bases 35 a 830 de la Sec. Id. Nº 1.

Description

Dominio catalítico de la proteína quinasa de punto de control del ciclo celular efectora humana, ChK1, materiales y procedimientos para la identificación de inhibidores de la misma.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a quinasas de punto de control del ciclo celular que son esenciales en las respuestas al daño en el ADN celular y en la coordinación de la detención del ciclo celular. Las quinasas de punto de control juegan un papel en la vigilancia y en la respuesta al daño en el ADN. El daño puede producirse por fuerzas internas o externas. Tales fuerzas incluyen pero sin limitación errores en la replicación, daño en las bases del ADN, roturas en la cadena de ADN o exposición a radiación o productos químicos citotóxicos. Estas quinasas de punto de control son esenciales en las rutas regulatorias que conducen a la detención del ciclo celular y a apoptosis posterior a un daño en el ADN, dando a la célula aviso y tiempo para corregir las lesiones previamente al comienzo de la replicación y la separación de los cromosomas. La presente invención se refiere más específicamente al aislamiento y purificación del dominio catalítico de la proteína quinasa de punto de control efectora humana (hChk1) y su uso en el descubrimiento, identificación y caracterización de inhibidores de la misma.

Antecedentes

El crecimiento, la división y la muerte celular son esenciales en el ciclo de vida de organismos multicelulares. Estos procesos y su regulación son sorprendentemente similares a través de todas las especies eucarióticas. La división de células somáticas consiste en dos procedimientos secuenciales: replicación del ADN seguido por separación cromosómica. La célula pasa la mayoría de su tiempo preparándose para estos acontecimientos en un ciclo de crecimiento (interfase) que a su vez consiste en tres subfases: hueco inicial (G_{1}), síntesis (S) y hueco secundario (G_{2}). En G_{1}, la célula, cuyas rutas biosintéticas se retrasaron durante la mitosis, reanuda una alta tasa de biosíntesis. La fase S comienza cuando empieza la síntesis de ADN y finaliza cuando el contenido de ADN del núcleo se ha doblado. La célula entra después en G_{2}, que dura hasta que la célula entre en la fase final de división, mitosis (M). La fase M empieza con la rotura de la envuelta nuclear, la condensación de los cromosomas y la formación de dos conjuntos idénticos de cromosomas que se separan en dos nuevos núcleos. A esto le sigue división celular (citoquinesis) en la que cada núcleo se separa en dos células hijas, lo que finaliza la fase M y marca el comienzo de la interfase para las dos nuevas células.

La secuencia en la que los acontecimientos del ciclo celular transcurren está estrictamente regulada de forma que el comienzo de un acontecimiento del ciclo celular depende de la finalización satisfactoria del anterior acontecimiento del ciclo celular. El procedimiento de control de la integridad del genoma y de prevención del progreso del ciclo celular en el caso de daño en el ADN se ha descrito como un "punto de control del ciclo celular" (Hartwell, LH y col., Science, 246:629-634 (1989); Weinert y col., Genes and Dev., 8:652 (1994)]. Los puntos de control del ciclo celular consisten en cascadas de transducción de señales que acoplan la detección del daño en el ADN con la progresión del ciclo celular. Los puntos de control son sistemas de control que coordinan la progresión del ciclo celular influenciando la formación, activación y posterior inactivación de quinasas dependientes de ciclinas. Las enzimas de punto de control son responsables de mantener el orden y la fidelidad de los acontecimientos del ciclo celular bloqueando la mitosis en respuesta a ADN no replicado o dañado. Estas enzimas previenen la progresión del ciclo celular en momentos inapropiados, mantienen el equilibrio metabólico de las células mientras la célula está detenida y en algunos casos pueden inducir apoptosis (muerte celular programada) cuando los requerimientos del punto de control no se han cumplido. (O'Connor, PM, Cancer Surveys, 29, 151-182 (1997); Nurse, P. Cell, 91, 865-867 (1997); Hartwell, LH y col., Science, 266, 1821-1828 (1994); Hartwell, LH y col., Science, 246, (1989) supra).

Una serie de puntos de control controlan la integridad del genoma. Tras detectar el daño en el ADN, estos "puntos de control del daño en el ADN" bloquean la progresión del ciclo celular en la fases G_{1} y G_{2}, y retrasan la progresión a la fase S (O'Connor, PM, Cancer Surveys, 29 (1997), supra; Hartwell, LH y col., Science, 266, (1994), supra). Esta acción permite que la reparación del ADN se complete antes de la replicación del genoma y se realice la separación de este material genético en dos nuevas células hijas.

Diversas mutaciones asociadas con tumores malignos afectan a la capacidad de las células cancerígenas de regular los puntos de control, permitiendo a las células con daño en el ADN aumentar la probabilidad de continuar la replicación y escapar de la apoptosis mediada por el daño. Estos factores contribuyen a la inestabilidad genómica que dirige la evolución genética de cánceres humanos y contribuye a la resistencia de las células cancerígenas a la mayoría de las intervenciones de quimioterapia y radioterapia actuales.

Debido a anormalidades en la ruta supresora de tumores p53, la mayoría de las células cancerígenas carecen de un sistema de control del punto de control de G_{1} funcional. Esto las hace particularmente vulnerables a la anulación de la última barrera restante que las protege de los efectos mortales cancerígenos de los agentes que dañan el ADN: el punto de control de G_{2}. El punto de control del daño en el ADN de G_{2} asegura el mantenimiento de la viabilidad celular retrasando la progresión de la mitosis en células que han padecido daño genómico. El punto de control de G_{2} se controla por rutas de punto de control del ciclo celular que inhiben la mitosis si los acontecimientos previos están incompletos o si el ADN está dañado. Este sistema de control de la regulación se ha conservado desde levaduras hasta seres humanos. Es importante en este sistema conservado una quinasa, Chk1 (o p56Chk1), que transduce las señales del complejo sensorial del daño en el ADN inhibiendo la activación de la ciclina quinasa B/Cdc2, que promueve la entrada en mitosis. (Peng, CY y col., Science, 277, 1501-1505 (1997); Sánchez Y, y col., Science, 277, 1497-1501 (1997; Walworth, N y col., Nature, 363 (6427), 368-71 (27 de mayo de 1993); al-Khodairy y col., Mol Biol Cell, 5(2):147-60 (febrero, 1994); Carr y col., Curr Bio., 5(10): 1179-90 (1 de octubre de 1995)). La quinasa de punto de control de la reparación, Chk1, regula a Cdc25, una fosfatasa que activa a Cdc2. Por lo tanto, Chk1 sirve como la unión directa entre el punto de control de G_{2} y la regulación negativa de Cdc2.

Se ha mostrado que la inactivación de Chk1 tanto anula la detención de G_{2} inducida por daño en el ADN infligido por agentes anticancerígenos o daño endógeno en el ADN, como produce mortalidad preferente de las células defectuosas en el punto de control resultante (Nurse, P, Cell, 91 (1997), supra; Weinert, T, Science, 277, 1450-1451 (1997); Walworth, N y col., Nature, 363, (1993) supra, Al-khodairy y col., Molec. Biol. Cell, 5, (1994), supra; Wan, S y col., Yeast, 15(10A), 821-8 (Julio, 1999)).

El hecho de que se haya mostrado que las células cancerígenas son más vulnerables a la anulación del punto de control de G_{2} ha estimulado la búsqueda de fármacos que anulen el punto de control de G_{2} (Wang, Q y col., PNAS 96: 3706-3711 (1999); Fan, S y col., Cancer Res., 55, 1649-1654 (1995); Powell, SN y col., Cancer Res., 55, 1643-1648 (1995); Russel, KJ y col., Cancer Res., 55, 1649-1642 (1995); Wang, G y col., J. Natl Cancer Inst., 88, 956-967 (1996)). Tales fármacos que anulan el punto de control podrían mejorar la mortalidad de tumores expuestos a acontecimientos que dañan el ADN incluyendo los infligidos por agentes terapéuticos, estrés hipóxico inducido debido a un suministro de sangre limitado (agentes anti-angiogénicos), o daño endógeno en el ADN que surge como una consecuencia de una inestabilidad genómica inherente de las células cancerígenas. La manipulación selectiva del control del punto de control en células cancerígenas puede permitir utilización amplia en regímenes quimioterapéuticos y de radioterapia del cáncer y además puede ofrecer un contraste común de la "inestabilidad genómica" del cáncer humano para explotar como la base selectiva de la destrucción de las células cancerígenas.

Una serie de pruebas sitúan a Chk1 como una diana central en el control del punto de control del daño en el ADN. Sin embargo, Chk1 es una enzima difícil de estudiar debido a que la proteína de longitud completa no es la forma más activa de Chk1. Mientras que otros han examinado las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la quinasa de punto de control de longitud completa y estimaron la localización del dominio quinasa, existe una necesidad de aislar y purificar el dominio quinasa de Chk1 y de mantener su conformación catalíticamente activa.

Sumario de la invención

Se describe en este documento la generación, caracterización cinética y determinación de la estructura del dominio quinasa de la proteína Chk1 humana. El dominio comienza entre los restos 1 y 16 y finaliza entre los restos 265 y 291 de la proteína de longitud completa [SEC ID Nº 2] que comprende 476 aminoácidos. El dominio se extiende preferiblemente entre los restos 1-265, más preferiblemente entre los restos 1-289.

La invención se refiere a un polinucleótido aislado y purificado que codifica la conformación activa del dominio quinasa de la Chk1 humana. El polinucleótido puede ser natural o recombinante.

La invención se refiere también a un polipéptido catalíticamente activo, aislado y soluble constituido por la conformación activa del dominio quinasa de la Chk1 humana.

La invención abarca tanto el polipéptido per se como sales del mismo. Como se analiza con detalle a continuación, se usa en este documento una alta concentración de sal en el tampón (aproximadamente 500 mM) para prevenir la agregación del péptido durante la purificación y el almacenamiento.

La invención se refiere también a una estructura cristalina de la quinasa Chk1 humana en la conformación activa resuelta a al menos 2,5 \ring{A}, preferiblemente 2,0 \ring{A}, más preferiblemente 1,7 \ring{A}. Esta estructura proporciona una descripción tridimensional de la diana (Chk1 humana) para el diseño basado en la estructura de pequeñas moléculas inhibidoras de la misma como agentes terapéuticos.

La invención se refiere además a un vector de expresión para producir el dominio quinasa de la Chk1 humana catalíticamente activo en una célula hospedadora.

La invención se refiere además a una célula hospedadora transformada y transfectada de forma estable con un polinucleótido codificante del dominio quinasa de la Chk1 humana de una manera que permite la expresión del dominio quinasa de la Chk1 humana en la configuración activa.

La presente invención describe además procedimientos para detectar compuestos candidatos usando la estructura molecular de los datos de cristalografía de rayos x para modelar la unión de los compuestos candidatos.

La invención proporciona además un procedimiento para diseñar y seleccionar compuestos potencialmente terapéuticos para el tratamiento de enfermedades hiper-proliferativas o relacionadas con la proliferación, incluyendo pero sin limitación cáncer e infección por VIH. Los terapéuticos supuestos pueden seleccionarse para actividades tales como (1) potenciación de la citotoxicidad de los agentes que dañan el ADN tales como agentes quimioterapéuticos sintéticos o naturales y radiación ionizante o de neutrones; (2) potenciación de la citotoxicidad de inhibidores de la síntesis de ADN incluyendo antimetabolitos, terminadores de la cadena de ADN u otros mecanismos que conducirían a la inhibición de la síntesis de ADN; (3) potenciación de la citotoxicidad de la hipoxia como ocurriría dentro de los tumores debido a un suministro de sangre limitado; y (4) inhibición de la capacidad de VIH de detener la progresión del ciclo celular tal como la inducida por la proteína VPR. Pueden usarse compuestos que inhiben la actividad de la quinasa Chk1 humana o anulan el punto de control de G_{2} para tratar o prevenir la hiperproliferación asociada con cáncer y VIH.

La presente invención proporciona procedimientos para identificar inhibidores potenciales de la proteína quinasa Chk1 humana por el diseño de novo de nuevas moléculas del fármaco candidatas que se unan e inhiban la actividad de la proteína quinasa Chk1 humana, o que mejoren su potencia. Las coordenadas cristalográficas de rayos x descritas en este documento permiten la generación de modelos tridimiensionales del sitio catalítico y del sitio de unión del fármaco de la proteína Chk1 humana. El diseño de novo comprende la generación de moléculas por medio de programas de ordenador que construyen y unen fragmentos o átomos en un sitio basándose en complementariedad estérica y electrostática, sin referencia a estructuras análogas de sustrato. El proceso de diseño del fármaco comienza después de que se resuelva la estructura de la diana (quinasa Chk1 humana) a al menos una resolución de 2,5 \ring{A}. El refinamiento de la estructura a una resolución de 2,0 \ring{A} o mejor con moléculas de agua fijas en su lugar proporciona condiciones más óptimas para emprender el diseño del fármaco.

La invención proporciona además un procedimiento para el modelado computacional del dominio quinasa de Chk1 humana, siendo tal modelo útil en el diseño de compuestos que interactúan con este dominio. El procedimiento implica cristalizar la quinasa Chk1 en la configuración catalíticamente activa; resolver la estructura de rayos x de dicha quinasa activa, particularmente el dominio quinasa y el sitio de unión de Chk1 activa; y aplicar los datos generados por la resolución de la estructura de rayos x a un algoritmo de ordenador capaz de generar un modelo tridimensional del dominio quinasa y del sitio de unión adecuado para usar en el diseño de moléculas que actuarán como agonistas o antagonistas del polipéptido. Puede aplicarse después un proceso iterativo a diversas estructuras moleculares usando el modelo generado por ordenador para identificar potenciales agonistas o antagonistas de la quinasa Chk1. Los inhibidores de la quinasa pueden servir como compuestos de avance para el diseño de compuestos potencialmente terapéuticos para el tratamiento de enfermedades o trastornos asociados con hiperproliferación o relacionados con proliferación, tales como cáncer y VIH.

La invención proporciona además un procedimiento en el que la proteína Chk1 humana se modifica por deleción de la porción C-terminal de la proteína de forma que transmite características físicas favorables del polipéptido resultante. El dominio quinasa es adecuado para analizar por resonancia magnética nuclear, detección de alta capacidad, caracterizaciones bioquímicas, cristalografía de rayos x, colorimetría y otros medios de diagnóstico. El fragmento de deleción más preferido se extiende desde el resto 1 hasta el resto 289.

La invención proporciona además procedimientos de detección para usar en el proceso de diseño del fármaco de agentes potenciales a la proteína quinasa Chk1 humana por el diseño de novo de nuevas moléculas candidatas de fármacos con eficacias potencialmente nanomolares. Las coordenadas cristalográficas de rayos x descritas basándose en el dominio quinasa de la proteína Chk1 humana permitirán la generación de modelos tridimensionales de los sitos de unión activos de la proteína Chk1 humana.

La invención proporciona además un procedimiento de detección rápida de compuestos para identificar aquellos compuestos que inhiben la quinasa Chk1 o una estructura núcleo para el diseño de inhibidores de Chk1 adicionales. El ensayo de detección de alta capacidad es capaz de automatizarse completamente en estaciones de trabajo robóticas. El ensayo puede ser radiactivo. Sin embargo, en una realización preferida el ensayo es un ELISA no radiactivo. En una realización más preferida, el ensayo es un ELISA que utiliza un anticuerpo nuevo, de conejo, anti-fosfosyntide, para detectar específicamente el producto de reacción de la quinasa Chk1 en la que el sustrato es biotin-syntide. Sin embargo, la base del ensayo incluye la capacidad de usar otros sustratos detectables por anticuerpos anti-fosfopéptido/proteína. El ensayo puede usarse para explorar grandes colecciones de bibliotecas de compuestos para descubrir inhibidores de la quinasa Chk1 y compuestos de avance potenciales para el desarrollo de compuestos anticancerígenos selectivos de la quinasa Chk1. El ensayo encuentra utilidad en la detección de otras reacciones de quinasas con sustrato syntide que implican quinasas de actividad análoga a Chk1.

En una realización preferida la invención proporciona un procedimiento para identificar un inhibidor de la quinasa Chk1 determinando las interacciones de unión entre un compuesto orgánico y el sitio de unión de la quinasa Chk1 en la conformación activa, estando constituido el dominio quinasa de la chk1 humana activa por los AA1-AA289, estando dichos sitios de unión definidos por las coordenadas cristalinas proporcionadas en la Figura 11, comprendiendo dicho método:

(a)

generar la cavidad de unión definida por el sitio de unión en una pantalla de ordenador;

(b)

generar compuestos con su estructura espacial; y

(c)

ensayar para ver si los compuestos se unen al sitio de unión de Chk1;

en el que aquellos compuestos que se unen al sitio de unión de Chk1 pueden identificarse como inhibidores de Chk1.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. El mecanismo de punto de control del daño en el ADN de G_{2} en levaduras de fisión (Furnari y col., Science, 277: 1495-1497 (5 de septiembre de 1997)).

Figura 2. Alineamiento de secuencia de los dominios quinasa de Chk1 de seres humanos (hs) (SEC ID Nº 2), ratón (mm) (SEC ID Nº 18), Xenopus (xl) (SEC IDE Nº: 19), mosca de la fruta (dm) (SEC IDE Nº 20), C. elegans (ce) (SEC ID Nº 21), S. cerevisiae (sc) (SEC ID Nº 22), y S. pombe (sp) (SEC ID Nº 23). Se muestran por encima del alineamiento elementos estructurales secundarios de Chk1 humana. Los números de los aminoácidos se muestran a la derecha. Los restos que invariables entre estas especies están en rojo y los restos de Chk1 humana que se conservan también en otras especies están en cian.

Figura 3. Modelo de homología de la quinasa Chk1 que describe el bucle de activación y su relación con el bucle catalítico y la hélice C. Se muestran los lóbulos N y C-terminal de Chk1. Los fragmentos correspondientes a la hélice C de Chk1 son los restos 50-58; los restos del bucle catalítico de Chk1 son los restos 129-132; y los restos del bucle de activación de Chk1 son los restos 148-170.

Figura 4. Esquema de purificación del dominio quinasa 1-289 de Chk1.

Figura 5. Estructura del dominio quinasa de la Chk1 humana identificada usando el cristal resulto a 1,7 \ring{A}. Un diagrama de cintas de la estructura del complejo binario de Chk1 con AMP-PNP que muestra los elementos estructurales secundarios y los bucles analizados en el texto. Las hélices \alpha se muestran en azul, las cadenas \beta en cian, el bucle catalítico en naranja, el bucle de activación en rojo. El AMP-PNP e ion sulfato se muestran como modelos de puntos y barras. Los extremos se denotan por N y C.

Figura 6. Sitio catalítico de Chk1. Sección transversal del sitio catalítico de la Chk1 humana con AMP-PNP. Se muestran representaciones de la cinta \alpha de la proteína C en púrpura para Chk1. Las cadenas laterales de los restos del sitio catalítico se muestran como modelos de puntos y barras y están codificados con colores por tipo de átomo: carbono, verde; nitrógeno, azul, oxígeno, rojo. Se muestran las distancias (A) a lo largo de las líneas de puntos entre los restos del sitio catalítico.

Figura 7. Superficie molecular de la Chk1 con el péptido CDC25C modelado. La superficie molecular de Chk1 se colorea como sigue: las cadenas laterales básicas se muestran en azul, las cadenas laterales ácidas en rojo, y las cadenas laterales no polares en violeta. Se muestra el péptido CDC25C (restos 211-219) como un modelo de barras y codificado con colores por tipo de átomo: carbono, verde; nitrógeno, azul, oxígeno, rojo; azufre, amarillo.

Figura 8. Vista estereoscópica del mapa de densidad electrónica representativo. La figura 8A muestra una vista estereoscópica de una porción representativa de la densidad experimental a 1,5 \ring{A} calculada a 3,0 \ring{A} con el uso de fases después de la nivelación del disolvente. El modelo refinado final se superpone sobre la densidad. La figura 8B muestra un mapa Fourier de diferencia calculado con las fases derivadas del modelo nativo y los coeficientes [FO(AMP-PNP)]-[FO(nativa/apoenzima)] a la difracción de 1,7 \ring{A} y contado a 2,5 \ring{A}. El resto trifostafo AMP-PNP se desordena y se omite del modelo. No se observan iones Mg^{2+}.

Figura 9. Representación de los sitios de unión de Chk1, mostrando específicamente el bolsillo de especificidad, el sitio de unión de ATP y el motivo de unión del donador-aceptor-donador.

Figura 10. Protocolo de ELISA de alta capacidad.

Figura 11. Coordenadas del cristalinas de Chk1 para el apoenzima (Chk1 activa aislada - Figura 11A) y el complejo binario (Chk1 formando un complejo con AMP-PNP, un análogo del ATP - Figura 11B) incluyendo las coordenadas de las moléculas de agua fijas.

Descripción detallada de la invención

El daño en el ADN induce la detención del ciclo celular en el punto de control de G_{2}. El punto de control del daño en el ADN de G_{2} asegura el mantenimiento de la viabilidad celular retrasando la progresión de la mitosis en células que han padecido daño genómico. El punto de control de G_{2} se controla por rutas de punto de control del ciclo celular, que se han estudiado de forma amplia (Hartwell, LH y col., Science, 246 (1989), supra; Nurse, P y col., Nat Med, 4 (10): 1103-6 (octubre de 1998); Peng y col., Science, 277, (1997), supra; Furnari y col., Science, 277: 1495-1497 (5 de septiembre de 1997); Zeng y col., Nature 395 (6701):507-510 (1 de octubre de 1998); Martinho y col., EMBO J, 17 (24):7239-49 (15 de diciembre de 1998); Nakajo y col., Dev. Biol. 207(2):432-44 (15 de Marzo de 1999); Carr y col., Curr Biol., 5 (1995), supra). Se muestra en la figura 1 el modelo del mecanismo de punto de control en levaduras de fisión, Furnari y col., Science, (1997), supra. Como se ha mencionado anteriormente, el sistema de control de la regulación está altamente conservado desde las levaduras hasta los seres humanos.

El daño en el ADN activa la ruta de punto de control inhibiendo la desfosforilación de la quinasa mitótica Cdc2 en el resto de tirosina 15 [Cdc2 (Y^{15}-PO4)], inhibiendo de ese modo su actividad de iniciación mitótica y deteniendo el ciclo celular. A este procedimiento nos referimos como fosforilación inhibitoria. Para que la mitosis transcurra, Cdc2 debe estar desfosforilada, volviendo a su forma activa. Cdc2 fosforilada es el sustrato de Cdc25. Cdc25 es una proteína fosfatasa de especificidad dual que controla la entrada en mitosis desfosforilando la proteína quinasa Cdc2. En levaduras de fisión, el daño en el ADN produce también la activación de Rad3, una quinasa relacionada con las proteínas ATM/ATR. Rad3 inicia la respuesta de Chk1; la fosforilación de Chk1 es un proceso dependiente de Rad3 (Martinho y col., EMBO J, 17 (1998), supra; Furnari y col., Science, 277 (1997), supra). Chk1 fosforilada (activa) fosforila el inductor mitótico Cdc25 en el resto de serina 216 de la Cdc25 humana [Cdc25 (S^{216}-PO_{4})]. La fosforilación de Cdc25 inhibe la función de la fosfatasa en la desfosforilación de Cdc2, un acontecimiento requerido para que la mitosis transcurra. Durante toda la interfase pero no en la mitosis, Cdc25 está fosforilada en el resto de serina 216 y unida a miembros de la familia de proteínas 14-3-3 altamente conservadas y expresadas ubicuamente. La prevención de la fosforilación de la serina 216 previene la unión a 14-3-3, perturbando el ritmo mitótico y permitiendo a las células escapar de la detención del punto de control de G_{2} inducida por ADN no replicado o daño inducido por radiación.

Una mayoría de los tratamientos de cáncer aceptados actualmente implican la inducción de daño en el ADN incluyendo la administración de agentes anticancerígenos, agentes quimioterapéuticos y terapia de radiación. Las células cancerígenas frecuentemente se hacen resistentes a tales terapias. Se sospecha que tal resistencia está relacionada con la capacidad innata de las células cancerígenas de detener y reparar el daño inducido. Si la célula cancerígena fuese incapaz de detenerse y repararse, la mitosis transcurriría con el daño en el ADN intacto. El resultado posterior sería presumiblemente muerte celular como resultado del daño en el ADN.

Los tratamientos que incluyen un mecanismo para anular la ruta de punto de control endógena y los procedimientos de reparación serían presumiblemente más eficaces en células cancerígenas mortales. Ya que muchas células cancerígenas carecen ya de un sistema de control del punto de control de G_{1}, una terapia que implique la inhibición del punto de control de G_{2} forzaría presumiblemente a las células cancerígenas a proseguir en la mitosis sin ningún proceso de detención y reparación de retroalimentación. Por lo tanto, existe una utilidad clara de la inhibición de la actividad de Chk1, una quinasa central en la ruta de punto de control de G_{2}. Como muchos de los mismos acontecimientos que regulan la detención en G_{2} posterior al daño en el ADN también regulan el retraso de la fase S posterior al daño en el ADN, la inhibición de Chk1 encuentra utilidad también en la regulación de la fase S.

La secuencia de aminoácidos 1 a 476 de la Chk1 humana está disponible por GenBank. Se amplificaron por PCR de forma separada la longitud completa o segmentos de ADNc de Chk1 humana correspondientes a los codones 1-427, 1-265 y 1-289. Cada uno se marcó en su extremo 3' con seis codones de histidina y se clonaron en un plásmido de expresión para la producción de proteínas usando un sistema de expresión Baculovirus/células de insecto. La proteína se expresó en células Hi-5 de insecto y se purificó con una combinación de cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de columna de afinidad. Se descubrió que se requería una alta concentración de sal (niveles de \sim500 mM) para evitar que el dominio quinasa de Chk1 purificada formase un precipitado.

La actividad quinasa de la hChk1 se determinó controlando la producción de ADP por acciones enzimáticas de la piruvato quinasa y la lactato deshidrogenasa. El dominio quinasa de Chk1 que contiene los aminoácidos 1-289 mostró mayor actividad enzimática que la proteína de longitud completa. A diferencia de otras formas de Chk1 con las que se ha demostrado que es difícil trabajar (aislar, purificar, cristalizar, etc), la forma del dominio quinasa 1-289 de la enzima Chk1 humana facilitaba la cristalografía, la caracterización de la enzima y la determinación de alta capacidad de inhibidores. En particular, se usó el dominio quinasa de Chk1 para determinar su estructura tridimensional, lo que proporcionó información estructural única para el diseño de inhibidores de desarrollo terapéutico.

Como se usa en este documento, la abreviatura "hChk1" se refiere al polinucleótido que codifica la quinasa de punto de control efectora humana que sirve como una quinasa de punto de control del daño en el ADN/replicación. Sanchez y col. publicaron en Science la secuencia de ácidos nucleicos del polinucleótido que codifica la proteína de longitud completa de la Chk1 humana (Science, 277 (5331): 1497-1501 (1997)) y la publicaron en GenBank el 9 de septiembre de 1997 (AF016582). La secuencia de ácidos nucleicos descrita allí se proporciona en este documento, mostrada en la SEC ID Nº 1. La secuencia peptídica correspondiente de la proteína de longitud completa se proporciona en este documento, mostrada en la SEC ID Nº 2. Esta secuencia peptídica la presentaron en GenBank Flaggs y col. el 3 de noviembre de 1997 y se liberó el 3 de diciembre de 1997 (AF032874). Flaggs y col. describieron adicionalmente la proteína quinasa en Current Biology (Curr. Biol., 7(12):977-986, (1997)).

Usando herramientas de homología para examinar las secuencias de nucleótidos y péptidos de Chk1, los científicos han intentado estimar la localización del dominio quinasa. Sin embargo, ha sido difícil determinar experimentalmente la localización exacta del dominio quinasa catalíticamente activo, principalmente ya que nadie ha comunicado nunca el aislamiento del dominio quinasa en su configuración activa. Las publicaciones previas han indicado que el dominio quinasa se extiende desde el AA 16 hasta el AA 264 (documento WO99/111795, publicado el 11 de marzo de 1999, en la página 7, línea 3) de la SEC ID Nº 2.

Los autores han descubierto que el dominio quinasa catalítico comienza entre el AA 1 y 16 y finaliza entre el AA 265 y el AA 291 de la SEC ID Nº. 2. Han descubierto además que el rendimiento de la proteína dirigida por el vector aumenta espectacularmente cuando se usa un fragmento que se extienda desde el AA 1 a el AA 289 (KH289 doblado).

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Existen 22 aminoácidos conocidos pero 64 permutaciones posibles de tripletes de ácidos nucleicos, llamados "codones". Muchos aminoácidos se especifican por más de un codón, un fenómeno llamado degeneración. Debido a la degeneración del código genético, existen muchas secuencias de ácidos nucleicos funcionalmente equivalentes que pueden codificar la misma proteína. La quinasa Chk1 humana activa expuesta en la SEC ID Nº 2 puede codificarse claramente por múltiples secuencias de nucleótidos y no se limita a la secuencia de ADNc expuesta en la SEC ID Nº 1. Por ejemplo, tanto UUU como UUC codifican una fenilalanina mientras que la serina se codifica por UCU, UCC, UCA, UCG, AGU y AGC [Molecular Biology of the Gene, 4ª Edición, Watson, J.D. y col., editores (1987) en las páginas 437-438]. Pueden prepararse fácilmente secuencias funcionalmente equivalentes usando procedimientos conocidos tales como PCR con cebador modificado, mutagénesis dirigida al sitio y síntesis química. Tales equivalentes funcionales están dentro del alcance de esta invención.

En los ejemplos de la presente invención, nos referimos a la forma de longitud completa de la proteína quinasa Chk1 humana (AA 1-476) como KH476. Los fragmentos de la misma se identifican por la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, nos referimos al dominio quinasa de la Chk1 humana (AA 1-289) como KH289. Nos referimos a otras secuencias de dominios quinasa por la numeración de los aminoácidos de una manera similar.

A. Péptidos, proteínas y anticuerpos

Como se usa en este documento, los términos "quinasa" y "proteína quinasa" se refieren a enzimas que catalizan la transferencia de un resto fosfato desde un nucleósido trifosfato a una cadena lateral de un aminoácido en dianas seleccionadas. La fosforilación covalente a su vez regula la actividad de la proteína diana. Además, la fosforilación actúa frecuentemente como la señal que dispara un proceso o reacción particular, jugando una parte esencial en regulación celular y mecanismos de control. Claramente, la fosforilación inapropiada o no regulada puede producir errores en la señalización celular, en el ciclo celular asociado y en los procedimientos de regulación. La mayoría de las proteínas quinasa son altamente específicas de sustrato.

Como se usa en este documento, se dice que un péptido está "asilado" o "purificado" cuando está sustancialmente libre de material celular homólogo o precursores químicos u otros productos químicos. Los péptidos de la presente invención pueden purificarse hasta la homogeneidad y otros grados de pureza. El nivel de purificación se basará en el uso pretendido.

En algunos usos, "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones del péptido que tienen menos de aproximadamente el 30% (en peso seco) de otras proteínas (es decir, proteínas contaminantes), menos de aproximadamente el 20% de otras proteínas, menos de aproximadamente el 10% de otras proteínas, o menos de aproximadamente el 5% de otras proteínas. Cuando el péptido se produce de manera recombinante, puede estar también sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20% del volumen de la preparación de proteína.

La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos y otros productos químicos" incluye preparaciones del péptido en las que está separado de precursores químicos u otros productos químicos implicados en su síntesis. En una realización, la expresión ``sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos incluye preparaciones del péptido quinasa que tienen menos de aproximadamente el 30% (en peso seco) de precursores químicos u otros productos químicos, preferiblemente menos de aproximadamente el 20% de precursores químicos u otros productos químicos, más preferiblemente menos de aproximadamente el 10% de precursores químicos u otros productos químicos, o lo más preferible menos de aproximadamente el 5% de precursores químicos u otros productos químicos.

La quinasa aislada descrita en este documento puede purificarse a partir de células que la expresan de forma natural, purificarse a partir de células que se han alterado para que la expresen (recombinación), o sintetizarse usando procedimientos de síntesis de proteínas conocidos. Por ejemplo, se clona en un vector de expresión una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína quinasa, el vector de expresión se introduce en una célula hospedadora y la proteína se expresa en la célula hospedadora. La proteína puede aislarse después de las células con un esquema de purificación apropiado usando técnicas de purificación de proteínas convencionales. Muchas de esas técnicas se describen con detalle a continuación.

La presente invención proporciona también variantes catalíticamente activas de los péptidos de la presente invención, tales como variantes alélicas/de secuencia de los péptidos, variantes de los péptidos derivadas de manera recombinante que no ocurren de manera natural, y ortólogos y parálogos de los péptidos. Tales variantes pueden generarse usando técnicas conocidas por los especialistas en los campos de tecnología de ácidos nucleicos recombinantes y bioquímica de proteínas.

Tales variantes pueden identificarse/fabricarse fácilmente usando técnicas moleculares y la información de secuencia descritas en este documento. Además, tales variantes pueden distinguirse fácilmente de otros péptidos basándose en homología de secuencia y/o estructural con los péptidos de la presente invención. El grado de homología/identidad presente se basará principalmente en si el péptido es una variante funcional (activa) o no funcional (inactiva), la cantidad de divergencia presente en la familia paráloga y la distancia evolutiva entre los ortólogos.

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Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en uno o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para alineamiento óptimo y puede hacerse caso omiso de secuencias no homólogas para propósitos de comparación). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o el 90% o más de la longitud de la secuencia de referencia. Se comparan después los restos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de los aminoácidos o en las posiciones de los nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en este documento la "identidad" de aminoácidos o ácidos nucleicos es equivalente a la "homología" de aminoácidos o ácidos nucleicos''. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad y similaridad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático. (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Secuence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). En una realización preferida, se determina el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que se ha incorporado en programas de ordenador disponibles en el mercado, tales como GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y una penalización de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y una penalización de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. Todavía en otra realización preferida, puede determinarse el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos usando los programas de ordenador disponibles en el mercado que incluyen el programa GAP en el paquete de software GCG (Devereux, J. y col., Nucleic Acids Res. 12(1)387 (1984), la matriz NWS gap DNA CMP y una penalización de hueco de 40, 50, 60, 70 ó 80 y una penalización de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra realización, se determina el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) que se ha incorporado en programas de ordenador disponibles en el mercado, tales como LIGN (versión 2.0), usando una tabla de peso de restos PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.

Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas de la presente invención pueden usarse además como una "secuencia interrogante" para realizar una búsqueda en bases de datos de secuencias para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden realizarse usando motores de búsqueda disponibles en el mercado, tales como los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, y col., (J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)). Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos con tales programas para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácidos nucleicos de la invención. Pueden realizarse búsquedas de proteínas con tales programas para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las proteínas de la invención. Para obtener alineamientos con huecos para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST descrito en Altschul y col., (Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997)).

Pueden identificarse fácilmente clones de longitud completa que comprenden uno de los péptidos de la presente invención al tener identidad de secuencia completa con una de las quinasas de la presente invención así como al ser codificada por el mismo locus genético que la quinasa proporcionada en este documento.

Pueden identificarse fácilmente variantes alélicas de un péptido al tener un alto grado (significativo) de homología/identidad de secuencia con al menos una porción del péptido así como al ser codificada por el mismo locus genético que el péptido quinasa proporcionado en este documento. Como se usa en este documento, dos proteínas (o una región de las proteínas) tienen homología significativa cuando las secuencias de aminoácidos son típicamente al menos aproximadamente el 70-75%, el 80-85% y más típicamente al menos aproximadamente el 90-95% o más homólogas. Una secuencia de aminoácidos homóloga de manera significativa, de acuerdo con la presente invención, estará codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridará con una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido en condiciones rigurosas como se describe a continuación de manera más completa.

Pueden identificarse fácilmente parálogos de un péptido al tener algún grado de homología/identidad de secuencia significativa con al menos una porción del péptido quinasa, al ser codificados por un gen de Drosophila, y al tener actividad o función similar. Dos proteínas se considerarán típicamente parálogas cuando las secuencias de aminoácidos son típicamente al menos aproximadamente el 70-75%, el 80-85% y más típicamente al menos aproximadamente el 90-95% o más homólogas en una región o dominio dada. Tales parálogos se codificarán con una secuencia de ácidos nucleicos que hibridará con una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido quinasa en condiciones rigurosas como se describe a continuación de manera más completa.

Pueden identificarse fácilmente ortólogos de un péptido quinasa al tener algún grado de homología/identidad de secuencia significativa con al menos una porción del péptido quinasa así como al ser codificados por un gen de otro organismo. Los ortólogos preferidos se aislarán de mamíferos, preferiblemente seres humanos, para el desarrollo de dianas terapeúticas humanas y agentes, o de otros invertebrados, particularmente insectos de importancia económica o en agricultura, por ejemplo miembros de los órdenes de lepidópteros y coleópteros, para el desarrollo de insecticidas y dianas insecticidas. Tales ortólogos se codificarán por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridará con una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido quinasa en condiciones moderadas a rigurosas, como se describe a continuación de manera más completa, dependiendo del grado de relación de los dos organismos que producen las proteínas.

Pueden generarse fácilmente variantes de las quinasas de la presente invención que no ocurren de forma natural usando técnicas recombinantes. Tales variantes incluyen, pero sin limitación, deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia de aminoácidos de la quinasa. Por ejemplo, una clase de sustituciones es sustitución de aminoácidos conservados. Tales sustituciones son las que sustituyen un aminoácido dado en un péptido quinasa por otro aminoácido de características similares. Son sustituciones típicamente vistas como conservadas los reemplazamientos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu y Ile; el intercambio de los restos hidroxilo Ser y Thr; el intercambio de los restos ácidos Asp y Glu; la sustitución entre restos amida Asn y Gln; el intercambio de los restos básicos Lys y Arg; y reeemplazamientos entre los restos aromáticos Phe, Tyr. En Bowie y col., Science 247:1306-1310 (1990) se encuentra una directriz que se refiere a qué cambios de aminoácidos es probable que sean fenotípicamente silenciosos.

Las variantes de las quinasas pueden ser completamente funcionales o pueden carecer de función en una o más actividades. Las variantes completamente funcionales contienen típicamente sólo variación conservada o variación en restos no críticos o en regiones no críticas. Las variantes funcionales pueden contener también sustitución de aminoácidos similares, que no produce cambio o un cambio no significativo en la función. Como alternativa, tales sustituciones pueden afectar la función de manera positiva o negativa en algún grado.

Las variantes no funcionales contienen típicamente una o más sustituciones de aminoácidos no-conservados, deleciones, inserciones, inversiones o truncamiento o una sustitución, inserción, inversión o deleción en un resto crítico o región crítica.

Pueden identificarse los aminoácidos que son esenciales para la función por procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de detección de alanina (Cunningham y col., Science 244:1081-1085 (1989)). El último procedimiento introduce mutaciones de alanina únicas en cada resto de la molécula. En las moléculas mutantes resultantes se ensaya después la actividad biológica tal como unión al receptor o actividad proliferativa in vitro. Pueden determinarse también los sitios que son críticos para la unión por análisis estructural tal como cristalografía de rayos x, resonancia magnética nuclear o marcaje de fotoafinidad (Smith y col., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992); de Vos y col., Science 255:306-312 (1992). Por consiguiente, las proteínas quinasas de la presente invención abarcan también derivados o análogos en los que un resto de aminoácido sustituido no está codificado por el código genético; en los que se incluye un grupo sustituyente; en los que se fusiona el polipéptido maduro con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semi-vida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol); o en los que los aminoácidos adicionales se fusionan con el polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretoria o una secuencia para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de pro-proteína.

La presente invención proporciona además fragmentos funcionales y activos del dominio quinasa de Chk1. Como se usa en este documento, un fragmento comprende al menos 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la proteína quinasa. Tales fragmentos pueden elegirse basándose en la capacidad de retener una o más actividades biológicas de la quinasa o podrían elegirse por la capacidad de realizar una función, por ejemplo actuar como un inmunógeno. Son fragmentos particularmente importantes los fragmentos catalíticamente activos, péptidos que tienen, por ejemplo aproximadamente 8 o más aminoácidos de longitud. Tales fragmentos comprenderán típicamente un dominio o motivo de la quinasa, por ejemplo un sitio activo o un sitio de unión. Los fragmentos adicionales contemplados por la presente invención incluyen, pero sin limitación, fragmentos que contienen dominios o motivos, fragmentos de péptidos solubles y fragmentos que contienen estructuras inmunogénicas. Los dominios predecidos y los sitios funcionales están disponibles para los especialistas en la técnica (por ejemplo, por análisis PROSITE).

Los polipéptidos contienen a menudo otros aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos a los que nos referimos comúnmente como los 20 aminoácidos que se encuentran de manera natural. Además, muchos aminoácidos, incluyendo los aminoácidos terminales, pueden modificarse por procesos naturales, tales como procesamiento y otras modificaciones post-traduccionales, o por técnicas de modificación química conocidas en la técnica. Las modificaciones comunes que ocurren de manera natural en polipéptidos se describen en textos básicos, monografías detalladas y la bilbiografía de investigación, y son conocidas por los especialistas en la técnica.

Las modificaciones conocidas incluyen, pero sin limitación, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o un derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o un derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclas de GPI, hidroxilación, yodización, metilación, miristilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, fenilación, racemización, selenolización, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia tal como arginilización, y ubiquitinización. Tales modificaciones son conocidas por los especialistas en la técnica y se han descrito con gran detalle en la blibliografía científica. Varias modificaciones particularmente comunes, glicosilación, unión de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de restos de ácidos glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, por ejemplo, se describen en la mayoría de los textos básicos, tal como Proteíns - Structure and Molecular Properties, 2ª Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman y compañía, New York (1993). Están disponibles muchos análisis detallados sobre este tema, tal como el de Wold, F., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. johnson, Ed., Academic Press, New York 1-12 (1983); Seifter y col., (Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990)) y Rattan y col., (Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)).

Los péptidos de la presente invención pueden unirse a secuencias heterólogas para formar proteínas quiméricas o de fusión. Tales proteínas quiméricas o de fusión comprenden un péptido unido de manera funcional a una proteína heteróloga que tienen una secuencia de aminoácidos no sustancialmente homóloga al péptido quinasa. "Unido funcionalmente" indica que el péptido y la proteína heteróloga están fusionados en fase de lectura. La proteína heteróloga puede fusionarse al extremo N-terminal o C-terminal del péptido quinasa. Los dos péptidos unidos en un péptido de fusión derivan típicamente de dos fuentes independientes, y por lo tanto un péptido de fusión comprende dos péptidos unidos que normalmente no se encuentran unidos en la naturaleza. Los dos péptidos pueden ser del mismo o diferente genoma.

En algunos usos, la proteína de fusión no afecta a la actividad del péptido per se. Por ejemplo, la proteína de fusión puede incluir, pero sin limitación, proteínas de fusión enzimáticas, por ejemplos fusiones de beta-galactosidasa, fusiones de dos híbridos GAL de levaduras, fusiones poli-His, MYC-marcadas, Hl-marcadas y fusiones de Ig. Tales proteínas de fusión, particularmente fusiones de poli-His, pueden facilitar la purificación del péptido quinasa recombinante. En ciertas células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras de mamíferos), puede aumentarse la expresión y/o secreción de una proteína usando una secuencia señal heteróloga.

Puede producirse una proteína quimérica o de fusión por técnicas de ADN recombinante convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de proteínas se unen juntas en fase de lectura de acuerdo con técnicas convencionales. En otra realización, puede sintetizarse el gen de fusión por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Como alternativa, puede realizarse amplificación por PCR de fragmentos del gen usando cebadores ancla que pueden hacer surgir salientes complementarios entre dos fragmentos del gen consecutivos que pueden hibridarse posteriormente y reamplificarse para generar una secuencia de gen quimérica (Véase Ausubel y col., Current protocols in molecular Biology, 1992). Además, están disponibles en el mercado muchos vectores de expresión que codifican ya un resto de fusión (por ejemplo, una proteína GST). Puede clonarse un ácido nucleico que codifica el péptido quinasa en tal vector de expresión de forma que el resto de fusión se une en fase de lectura al péptido quinasa.

En este documento, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos que comprenden al menos un sitio de combinación de anticuerpos o un dominio de unión, estando formado dicho dominio de unión o sitio de combinación a partir del pliegue de dominios variables de una molécula de anticuerpo para formar espacios de unión tridimensionales con una forma de superficie interna y una distribución de carga complementaria a las características de un epítope de un antígeno. El término abarca moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, tales como moléculas que contienen un sitio de combinación de anticuerpos o parátope. Son moléculas de anticuerpo ejemplares moléculas de inmunoglobulinas intactas, moléculas de inmunoglobulinas sustancialmente intactas y porciones de una molécula de inmunoglobulina, incluyendo las conocidas en la técnica como Fab, FabB, F(abB)_{2} y F(v).

B. Ácidos nucleicos y polinucleótidos

La presente invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos aislados que codifican las quinasas funcionales y activas de la presente invención. Tales moléculas de ácidos nucleicos consistirán, consistirán esencialmente o comprenderán una secuencia de nucleótidos que codifica uno de los péptidos quinasa de la presente invención, una variante alélica de los mismos, o un ortólogo o parálogo de los mismos.

Como se usa en este documento, una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que está separada de otros ácidos nucleicos presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias situadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico o ADNc del organismo del cual se deriva el ácido nucleico. Sin embargo, puede haber algunas secuencias de nucleótidos flanqueantes, por ejemplo de hasta aproximadamente 5 KB, particularmente secuencias que codifican péptidos contiguos y secuencias que codifican péptidos dentro del mismo gen pero separadas por intrones en la secuencia genómica. El punto importante es que el ácido nucleico está aislado de secuencias flanqueantes remotas y sin importancia de forma que puede someterse a las manipulaciones específicas descritas en este documento tales como expresión recombinante, preparación de sondas y cebadores, y otros usos específicos de las secuencias de ácidos nucleicos.

Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o de precursores químicos u otros productos químicos cuando se síntetiza de forma química. Sin embargo, la molécula de ácido nucleico puede fusionarse con otras secuencias codificantes o regulatorias y puede considerarse todavía aislada.

Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas. Los ejemplos adicionales de moléculas de ADN aisladas incluyen moléculas de ADN recombinante mantenidas en células hospedadoras o moléculas de ADN purificadas (parcialmente o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcriptos de ARN in vivo o in vitro de las moléculas de ADN aisladas de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de acuerdo con la presente invención incluyen además tales moléculas producidas de forma sintética.

Las clases preferidas de moléculas de ácidos nucleicos que están constituidas por las secuencias de nucleótidos de la presente son moléculas y genes de ADNc de longitud completa y clones genómicos ya que algunas de las moléculas de ácidos nucleicos proporcionadas en la SEC. ID Nº 1 son fragmentos del gen completo que existe en la naturaleza. Se proporciona en este documento una descripción breve de cómo se pueden fabricar/aislar fácilmente diversos tipos de estas moléculas de ácidos nucleicos.

Pueden clonarse genes de longitud completa a partir de secuencias conocidas usando uno cualquiera de varios de los procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse un procedimiento que emplea XL-PCR (Perkin-Elmer, Foster City, Calif) para amplificar piezas largas de ADN. Se conocen en la técnica otros procedimientos para obtener secuencias de longitud completa.

Las moléculas de ácidos nucleicos aisladas pueden codificar la quinasa activa y funcional más aminoácidos adicionales del extremo amino o carboxilo terminal, tal como los que facilitan el tráfico de la proteína, prolongan o acortan la semivida de la proteína o facilitan la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas. Las moléculas de ácidos nucleicos aisladas incluyen, sin limitación, la secuencia que codifica la quinasa activa sola o en combinación con secuencias codificantes, tales como una secuencia líder o secretoria (por ejemplo, una secuencia pre-pro o pro-proteína), la secuencia que codifica la quinasa activa, con o sin las secuencias codificantes adicionales, más secuencias no codificantes adicionales, por ejemplo intrones u secuencias 5' y 3' no codificantes tales como secuencias transcritas pero no traducidas que juegan un papel en la transcripción, procesamiento del ARNm (incluyendo corte y empalme y señales de poliadenilación), unión de ribosomas y estabilidad del ARNm. Además, la molécula de ácido nucleico puede fusionarse con una secuencia marcadora codificante, por ejemplo, un péptido que facilita la purificación.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, o en forma de ADN, incluyendo ADNc y ADN genómico, obtenidas por clonación o producidas por técnicas de síntesis química o por una combinación de las mismas. El ácido nucleico, especialmente el ADN, puede ser de doble cadena o de cadena única. El ácido nucleico de cadena única puede ser la cadena codificante (cadena con sentido) o la cadena no codificante (cadena anti-sentido).

La invención proporciona además moléculas de ácido nucleico que codifican fragmentos funcionales o variantes de las quinasas activas de la presente invención. Tales moléculas de ácido nucleico puede estar de forma natural, tal como variantes alélicas (mismo locus), parálogos (locus diferentes), y ortólogos (organismos diferentes), o pueden construirse por procedimientos de ADN recombinante o por síntesis química. Las variantes que no ocurren de forma natural pueden fabricarse por técnicas de mutagénesis, incluyendo las aplicadas a moléculas de ácidos nucleicos, células u organismos. Por consiguiente, como se ha analizado anteriormente, las variantes pueden contener sustituciones de nucleótidos, deleciones, inversiones e inserciones. La variación puede ocurrir en cualquiera o ambas regiones codificantes y no codificantes. Las variaciones pueden producir tanto sustituciones de amino ácidos conservados como no conservados.

Un fragmento comprende una secuencia de nucleótidos contigua mayor de 12 o más nucleótidos. Además, un fragmento puede ser tener al menos 30, 40, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud. La longitud del fragmento se basará en su uso pretendido. Por ejemplo, el fragmento puede codificar regiones del péptido que soportan epítopes, o pueden ser útiles como sondas de ADN y cebadores. Tales fragmentos pueden aislarse usando la secuencia de nucleótidos conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótidos. Puede usarse después una sonda marcada para explorar una biblioteca de ADNc, una biblioteca de ADN genómico o ARNm para aislar ácido nucleico correspondiente a la región codificante. Además, pueden usarse cebadores en reacciones de PCR para clonar regiones específicas del
gen.

Una sonda/cebador comprende típicamente un oligonucleótido sustancialmente purificado o un par de oligonucleótidos. El oligonucleótido comprende típicamente una región de secuencia de nucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 12, 20, 25, 40, 50 o más nucleótidos consecutivos.

Pueden identificarse los ortólogos, homólogos y variantes alélicos usando procedimientos conocidos en la técnica. Como se ha descrito anteriormente, estas variantes comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican un péptido que es típicamente el 60-65%, 70-75%, 80-85%, y más típicamente al menos aproximadamente el 90-95% o más homóloga a la secuencia de nucleótidos proporcionada en la SEC ID Nº 1 o un fragmento de esta secuencia. Tales moléculas de ácidos nucleicos pueden identificarse fácilmente al ser capaces de hibridar en condiciones moderadas a rigurosas, con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 1 o un fragmento de la secuencia.

Como se usa en este documento, la expresión "hibridar en condiciones rigurosas" pretende describir condiciones de hibridación y lavado en las que las secuencias de nucleótidos que codifican un péptido al menos el 50-55% homólogas entre ellas se mantienen típicamente hibridadas una con otra. Las condiciones pueden ser tales que las secuencias al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 75% o más homólogas entre ellas se mantienen hibridadas una con otra. Tales condiciones rigurosas las conocen los especialistas en la técnica y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1.-6.3.6. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es hibridación en cloruro sódico/citrato sódico 6X (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 1% a 50-65ºC.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención son útiles para sondas, cebadores, intermedios químicos y en ensayos biológicos. Las moléculas de ácidos nucleicos son útiles como una sonda de hibridación para ADNc y ADN genómico para aislar clones de ADNc de longitud completa y genómicos que codifican el péptido descrito en este documento y para aislar clones de ADNc y genómicos que corresponden a variantes (alelos, ortólogos, etc.) que producen los mismos péptidos o relacionados descritos en este documento.

Las moléculas de ácidos nucleicos son también útiles como cebadores de PCR para amplificar cualquier región dada de una molécula de ácido nucleido y son útiles para sintetizar moléculas antisentido de longitud y secuencia deseada.

Las moléculas de ácidos nucleicos son también útiles para construir vectores recombinantes. Tales vectores incluyen vectores de expresión que expresan una porción o toda la secuencia peptídica. Los vectores incluyen también vectores de inserción, usados para integrarse dentro de otra secuencia de molécula de ácido nucleico, tal como dentro del genoma celular, para alterar la expresión in situ de un gen y/o un producto del gen. Por ejemplo, puede reemplazarse una secuencia codificante endógena por medio de recombinación homóloga con toda o parte de la región codificante que contiene una o más mutaciones introducidas de forma específica.

Las moléculas de ácidos nucleicos son también útiles para expresar porciones antigénicas de las proteínas.

Las moléculas de ácidos nucleicos son también útiles como sondas para determinar las posiciones cromosómicas de las moléculas de ácidos nucleico por medio de procedimientos de hibridación in situ.

Las moléculas de ácidos nucleicos son también útiles para diseñar ribozimas que corresponden a todo, o una parte, del ARNm producido a partir de las moléculas de ácidos nucleicos descritas en este documento.

Las moléculas de ácidos nucleicos son también útiles para construir células hospedadoras que expresen una parte o todas, de las moléculas de ácidos nucleicos y péptidos.

Las moléculas de ácidos nucleicos son también útiles para construir animales transgénicos que expresen todas, o una parte, de las moléculas de ácidos nucleicos y péptidos.

Las moléculas de ácidos nucleicos son también útiles para fabricar vectores que expresen parte o todos los péptidos.

Las moléculas de ácidos nucleicos son también útiles como sondas de hibridación para determinar la presencia, nivel, forma y distribución de la expresión de ácidos nucleicos. Por consiguiente, las sondas pueden usarse para detectar la presencia, o para determinar los niveles de una molécula de ácido nucleico específico en células, tejidos y en organismos. El ácido nucleico cuyo nivel se determina puede ser ADN o ARN. Por consiguiente, las sondas correspondientes a los péptidos descritos en este documento pueden usarse para valorar la expresión y/o número de copias del gen en una célula dada, tejido u organismo. Estos usos son relevantes para diagnóstico de trastornos que implican un aumento o disminución en la expresión de la proteína quinasa en relación con los resultados normales.

Las técnicas in vitro para detectar ARNm incluyen hibridaciones Nothern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para detectar ADN incluyen hibridaciones Southern e hibridación in situ.

Pueden usarse sondas como una parte de un kit de ensayo diagnóstico para identificar células o tejidos que expresan una proteína quinasa, tal como midiendo un nivel de un ácido nucleico que codifica un receptor en una muestra de células de un sujeto, por ejemplo ARNm o ADN genómico, o determinar si un gen del receptor ha mutado.

C. Vectores y células hospedadoras

La invención proporciona también vectores que contienen las moléculas de ácidos nucleicos descritas en este documento. El término "vector" se refiere a un vehículo, preferiblemente a una molécula de ácido nucleico, que puede transportar las moléculas de ácidos nucleicos. Cuando el vector es una molécula de ácido nucleico, las moléculas de ácidos nucleicos se unen covalentemente al vector de ácido nucleico. En este aspecto de la invención, el vector incluye un plásmido, un fago de hélice única o doble, un ARN de hélice única o doble, un vector viral de ADN o un cromosoma artificial, tal como BAC, PAC, YAC, o MAC. Pueden usarse diversos vectores de expresión para expresar polinucleótidos que codifican la quinasa hChk1 activa.

Puede mantenerse un vector como un elemento extracromosómico en una célula hospedadora donde se replica y produce copias adicionales de las moléculas de ácidos nucleicos. Como alternativa, el vector puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora y producir copias adicionales de las moléculas de ácidos nucleico cuando la célula hospedadora se replica.

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La invención proporciona vectores para el mantenimiento (vectores de clonación) o vectores para la expresión (vectores de expresión) de las moléculas de ácidos nucleicos. Los vectores pueden funcionar en células procarióticas o eucarióticas o en ambas (vectores lanzadera).

Los vectores de expresión contienen regiones regulatorias que actúan en cis que están unidos funcionalmente en el vector a las moléculas de ácidos nucleicos de forma que se permite la transcripción de las moléculas de ácidos nucleicos en una célula hospedadora. Las moléculas de ácidos nucleicos pueden introducirse en la célula hospedadora con una molécula de ácido nucleico separada capaz de afectar a la transcripción. Por lo tanto, la segunda molécula de ácido nucleico puede proporcionar un factor que actúa en trans que interacciona con la región de control regulatoria en cis para permitir la transcripción de las moléculas de ácidos nucleicos del vector. Como alternativa, la célula hospedadora puede suministrar un factor que actúa en trans. Finalmente, puede producirse un factor que actúa en trans a partir del mismo vector. Se entiende, sin embargo, que en algunas realizaciones, la transcripción y/o traducción de las moléculas de ácidos nucleicos pueden ocurrir en un sistema libre de células.

La secuencia regulatoria a la cual las moléculas de ácidos nucleicos descritas en este documento pueden unirse funcionalmente incluye promotores para dirigir la trascripción de ARNm. Estos incluyen, pero sin limitación, el promotor izquierdo del bacteriofago \lambda, los promotores lac, TRP y TAC de E. coli, los promotores tempranos y tardíos de SV40, el promotor temprano inmediato de CMV, los promotores temprano y tardío del adenovirus y las repeticiones terminales largas del retrovirus.

Además de regiones de control que promueven la transcripción, los vectores de expresión pueden incluir también regiones que modulan la transcripción, tal como sitios de unión de represores y potenciadores. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40, el potenciador temprano inmediato del citomegalovirus, el potenciador del polioma, potenciadores de adenovirus, y potenciadores del retrovirus LTR.

Además de contener sitios para la iniciación de la transcripción y de control, los vectores de expresión pueden contener también secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y un sitio de unión de ribosomas para traducción en la región transcrita. Otros elementos de control regulatorio para la expresión incluyen codones de iniciación y terminación así como señales de poliadenilación. El especialista en la técnica será consciente de las numerosas secuencias regulatorias que son útiles en vectores de expresión. Tales secuencias regulatorias se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cols Spring Harbor, NY, (1989)).

Se pueden usar una diversidad de vectores de expresión para expresar una molécula de ácido nucleico. Tales vectores incluyen vectores derivados de cromosomas, episomas y virus, por ejemplo vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de episomas de levaduras, de elementos cromosómicos de levaduras, incluyendo cromosomas artificiales de levaduras, de virus tales como baculovirus, papovavirus tales como SV40, virus Vaccinia, adenovirus, poxivirus, virus de la seudorrabia y retrovirus. Los vectores pueden derivarse también de combinaciones de estas fuentes tales como los derivados de plásmidos y elementos genéticos de bacteriófagos, por ejemplo cósmidos y fagémidos. Se describen vectores de clonación y expresión apropiados para hospedadores procarióticos y eucarióticos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989).

La secuencia regulatoria puede proporcionar expresión constitutiva en una o más células hospedadoras (es decir, específica de tejido) o puede proporcionar expresión inducible en uno o más tipos de células tal como por temperatura, aditivos nutritivos, o por un factor exógeno tal como una hormona u otro ligando. Los especialistas en la técnica conocen una diversidad de vectores que proporcionan expresión constitutiva e inducible en hospedadores procarióticos y eucarióticos.

Las moléculas de ácidos nucleicos pueden insertarse en el vector de ácidos nucleicos por metodologías bien conocidas. En general, la secuencia de ADN que se expresará finalmente se une a un vector de expresión cortando la secuencia de ADN y del vector de expresión con una o más enzimas de restricción y después ligando los fragmentos juntos. Los especialistas en la técnica conocen los procedimientos de digestión con enzimas de restricción y ligación.

El vector que contiene la molécula de ácido nucleico apropiada puede introducirse en una célula hospedadora apropiada para la propagación o expresión usando técnicas bien conocidas. Las células bacterianas incluyen, pero sin limitación, E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium. Las células eucarióticas incluyen, pero sin limitación, células de insecto tales como de Drosophila, células de animales tales como células COS y CHO, y células de plantas.

Como se ha descrito en este documento, puede ser deseable expresar un péptido de la presente invención como una proteína de fusión. Por consiguiente, la invención proporciona vectores de fusión que permiten la producción de tales péptidos. Los vectores de fusión pueden aumentar la expresión de una proteína recombinante, aumentar la solubilidad de la proteína recombinante, y ayudar en la purificación de la proteína actuando por ejemplo como un ligando para purificación por afinidad. Puede introducirse un sitio de corte proteolítico en la unión del resto de fusión de forma que el péptido deseado pueda separarse finalmente del resto de fusión. Las enzimas proteolíticas incluyen, pero sin limitación, el factor Xa, trombina y enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Smith y col., Gene 67:31-40 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E o proteína A, respectivamente, con la proteína recombinante diana. Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli no fusionables inducibles adecuados incluyen pTrc (Amann y col., Gene 69:301.315 (1988)) y pET 11d (Studier y col., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185:60-89 (1990)).

Puede maximizarse la expresión de la proteína recombinante en una bacteria hospedadora proporcionando un antecedente genético en el que la célula hospedadora tiene una capacidad alterada de cortar proteolíticamente la proteína recombinante. (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Como alternativa, la secuencia de la molécula de ácido nucleico de interés puede alterarse para proporcionar un uso del codón preferencial para una célula hospedadora específica, por ejemplo E. coli. (Wada y col., Nucleic Acids Res. 20:2111-2118 (1992)).

Las moléculas de ácidos nucleicos pueden expresarse también con vectores de expresión que son funcionales en levaduras. Los ejemplos de vectores de expresión en levaduras, por ejemplo S. cerevisiase, incluyen pYepSec1 (Baldari y col., EMBO J. 6:229-234 (1987)), pMFa (Kurjan y col., Cell 30:933-943 (1982)), pJRY88 (Schultz y col., Gene 54:113-123 (1987)) y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).

Las moléculas de ácidos nucleicos pueden expresarse también en células de insectos usando, por ejemplo, vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insectos cultivadas (por ejemplo, células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith y col., Mol. Cell Biol. 3:2156 (1983)) y la serie pVL (Lucklow y col., Virology 170:31-39 (1989)).

En ciertas realizaciones de la invención, las moléculas de ácidos nucleicos descritas en este documento se expresan en células de mamíferos usando vectores de expresión de mamíferos. Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, B. Nature 329:840 (1987) y pMT2PC (Kaufman y col., EMBO J. 6:187-195 (1987)).

Los vectores de expresión enumerados en este documento se proporcionan a modo de ejemplo sólo de los vectores bien conocidos disponibles para los especialistas en la técnica que serían útiles para expresar las moléculas de ácidos nucleicos. Los vectores preferidos incluyen el pET28a (Novagen, Madison, WI), pAcSG2 (Pharmingen, San Diego, CA) y pFastBac (Life Technologies, Gaithersburg, MD). El especialista en la técnica será consciente de otros vectores adecuados para mantener la propagación o expresión de las moléculas de ácidos nucleicos descritas en este documento. Éstos se encuentran por ejemplo en el documento Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

La invención abarca también vectores en los que las secuencias de ácidos nucleicos descritas en este documento se clonan en el vector en orientación inversa, pero se unen funcionalmente a una secuencia regulatoria que permite la transcripción de ARN antisentido. Por lo tanto, puede producirse un transcrito antisentido en toda o una porción de las secuencias de moléculas de ácidos nucleicos descritas en este documento, incluyendo tanto regiones codificantes como no codificantes. La expresión de este ARN antisentido se somete a cada parámetro descrito anteriormente en relación con la expresión de ARN con sentido (secuencias regulatorias, expresión constitutiva o inducible, expresión específica de tejido).

La invención se refiere también a células hospedadoras recombinantes que contienen los vectores descritos en este documento. Las células hospedadoras incluyen por lo tanto células procarióticas, células eucarióticas inferiores tales como levaduras, otras células eucarióticas tales cómo células de insectos y células eucarióticas superiores tales como células de mamíferos. Las células hospedadoras preferidas de la invención del momento incluyen E. coli y Sf9.

Las células hospedadoras recombinantes se preparan introduciendo las construcciones del vector descrito en este documento en las células por técnicas fácilmente disponibles para el especialista en la técnica. Éstas incluyen, pero sin limitación, transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección, lipofección, y otras técnicas tales como las que se encuentran en el documento de Sambrook y col., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Las células hospedadoras pueden contener más de un vector. Por lo tanto, las diferentes secuencias de ácidos nucleicos pueden introducirse en diferentes vectores de la misma célula. De forma similar, las moléculas de ácidos nucleicos pueden introducirse solas o con otras moléculas de ácidos nucleicos que no están relacionadas con las moléculas de ácidos nucleicos tal como las que proporcionan factores que actúan en trans para la expresión de vectores. Cuando se introduce más de un vector en una célula, los vectores pueden introducirse de forma independiente, co-introducirse o unirse al vector de la molécula de ácido nucleico.

En el caso de vectores de bacteriófagos y virales, estos pueden introducirse en las células como virus empaquetados o encapsulados por procedimientos convencionales de infección y transducción. Los vectores virales pueden ser competentes en replicación o deficientes en replicación. En el caso en el cual la replicación viral es deficiente, la replicación ocurrirá en células hospedadoras que proporcionan funciones que complementan los defectos.

Los vectores incluyen en general marcadores seleccionables que permiten la selección de la subpoblación de células que contienen las construcciones del vector recombinante. El marcador puede contenerse en el mismo vector que contiene las moléculas de ácidos nucleicos descritas en este documento o puede estar en un vector separado. Los marcadores incluyen genes de resistencia a tetraciclina o ampicilina para células hospedadoras procarióticas y de resistencia a la dihidrofolato reductasa o neomicina para células hospedadoras eucarióticas. Sin embargo, será eficaz cualquier marcador que proporcione selección de un rasgo fenotípico.

Mientras que la proteína quinasa activa puede producirse en bacterias, levaduras, células de mamíferos y otras células bajo el control de las secuencias regulatorias apropiadas, pueden usarse también sistemas de transcripción y traducción libres de células para producir estas proteínas usando ARN derivado de las construcciones de ADN descritas en este documento.

Si se desea la secreción del péptido, se incorporan señales de secreción apropiadas el vector. La secuencia señal puede ser endógena a los péptidos o heteróloga a estos péptido.

Se entiende también que dependiendo de la célula hospedadora en la producción recombinante de los péptidos descritos en este documento, los péptidos pueden tener diversos patrones de glicosilación, dependiendo de las células, o quizá pueden no estar glicosilados como cuando se producen en bacterias. Además, los péptidos pueden incluir una metionina modificada inicial en algunos casos como resultado de un proceso mediado por el hospedador.

Las células hospedadoras recombinantes que expresan los péptidos descritos en este documento tienen una diversidad de usos. Primero, las células son útiles para producir una proteína o péptido quinasa que puede purificarse adicionalmente para producir cantidades deseadas de proteínas quinasas o fragmentos. Por lo tanto, las células hospedadoras que contienen los vectores de expresión son útiles para la producción de péptidos.

Las células hospedadoras son también útiles para dirigir ensayos basados en células que implican a la proteína quinasa o a fragmentos de la proteína quinasa. Por lo tanto, una célula hospedadora recombinante que expresa una proteína quinasa nativa es útil para ensayar compuestos que estimulan o inhiben la función de la proteína quinasa.

Las células hospedadoras son también útiles para identificar mutantes de la proteína quinasa en las que estas funciones están afectadas. Si los mutantes ocurren de forma natural y dan lugar a una patología, las células hospedadoras que contienen las mutaciones son útiles para ensayar compuestos que tienen un efecto deseado sobre la proteína quinasa mutante (por ejemplo, estimular o inhibir la función) que no puede señalarse por su efecto sobre la proteína quinasa nativa.

Los siguientes ejemplos se proporcionan con propósitos de ilustración.

Ejemplos 1. Identificación de la secuencia del dominio catalítico

Se concibió un modelo de homología para el dominio quinasa de la proteína Chk1 a partir de la secuencia de la proteína completa de la quinasa efectora de punto de control humana (Chk1, 476 restos) disponible por GenBank, usando alineamiento de secuencia y estructuras de otras quinasas (véase la Figura 3).

Todas las proteínas quinasas utilizan ATP para fosforilar sus sustratos, que implica la transferencia de un gamma fosfato a un grupo hidroxilo del sustrato. Cada quinasa se une al ATP con su propia fuerza, una propiedad que se correlaciona midiendo la Ki/CI50. La molécula de ATP consiste en restos de adenina, ribosa y trifosfato. Cada uno de estos restos se una a la proteína en el sitio de unión a ATP (o bolsillo de ATP). El resto de adenina se une siempre a la cadena principal de la proteína formando dos o tres enlaces de hidrógeno. El resto de ribosa forma de uno a dos enlaces de hidrógeno con las cadenas laterales de aminoácidos de la proteína que quedan por fuera del bolsillo de ATP. El resto trifosfato interactúa con los aminoácidos catalíticos de la quinasa que son uniformes en general a través de toda la familia de proteínas quinasas. Existe una especificidad limitada para cada quinasa dentro de la ranura de unión a ATP. Nos referimos a esta región como bolsillo de especificidad. Usando el modelo de homología, se desarrolló un esquema del sitio de unión de Chk1, identificando el sitio de unión a ATP, el motivo de unión al donador-aceptor-donador y el bolsillo de especificidad (Véase la Figura 9). Este sitio de unión es la diana para el desarrollo de inhibidores, por ejemplo el desarrollo de compuestos o moléculas que se unan a este sitio hasta el grado de que la actividad quinasa de la proteína Chk1 se bloquee o se inhiba. El color negro y rojo en la Figura 9 representa la ranura de unión a ATP; como apunte, la Ser 147 puede contribuir a la unión del inhibidor. El área designada por el color azul representa la región exterior del bolsillo de ATP que puede usarse para potenciar la especificidad de la unión. Finalmente, el área en rosa representa el "bolsillo de especificidad", una región que es muy diferente de una proteína a otra. Este sitio no contribuye a la unión de ATP pero puede usarse para diseñar inhibidores específicos. En otras palabras, utilizando la región del sitio de unión de Chk1 que es única de Chk1 (el bolsillo de especificidad), se pueden diseñar compuestos que inhiban específicamente a Chk1 sin inhibir también las diversas otras moléculas quinasa que pueden no ser las dianas de la terapia de inhibición.

El análisis del extremo C-terminal de la quinasa sugirió que los aminoácidos más allá del resto 265 potenciarían niveles altos de expresión y/o mantendrían la estructura cristalina apropiada. El modelo de homología mostró que esta región es flexible, de forma que terminar la construcción del dominio quinasa con esta región puede prevenir la alteración de estructuras secundarias potenciales. Específicamente, el corte de la proteína Chk1 en cualquier lugar entre los restos de aminoácidos 263 y 265 produciría la destrucción de interacciones helicoidales en el extremo distal. El modelo de homología predijo además que el segmento quinasa debería extenderse hasta al menos los restos 272 a 275 y podría extenderse adicionalmente hasta los restos 289-291.

Además, la inclusión de la región prolongada en la construcción previene que la señal de histidina del extremo C-terminal interactúe con el dominio quinasa, haciéndola accesible para cromatografía de afinidad. Basándose en estos análisis, se diseñó la construcción KH289 para la expresión del dominio quinasa de Chk1 de los restos 1-289 con una señal de His6x en su extremo C-terminal. Se fabricó también una construcción correspondiente sin la señal de His6x. Se diseñaron otras dos construcciones basándose en el modelo de homología: (1) dominio quinasa de los restos 1-210 (KH210) y (2) dominio quinasa de los restos 1-248 (KH248).

2. Clonación

Se clonó el ADNc de la Chk1 humana por PCR usando polimerasa Vent (New England Biolabs, Beverly, MA) del timo humano y ADNc Marathon-Ready de testículos (Clontech, Palo Alto, CA) con cebadores sintetizados (Gensen, La Jolla, CA) basándose en la secuencia publicada [SEC ID Nº 1] (Número de acceso en GenBank AF1016582) [Sánchez, Science (1997), supra], siguiendo las instrucciones de los vendedores. Se amplificaron de forma independiente dos secuencias solapantes, una contenía la secuencia de nucleótidos 35-830 de la, y otra contenía la secuencia de nucleótidos 678-1480 de la SEC ID Nº 1. Estas secuencias solapantes cubren la secuencia codificante completa de Chk1 más 16 pares de bases (pbs) de la región no traducible de 3'. El ADNc de 35-830 codifica el dominio quinasa de los restos 1-265.

Las secuencias de los cebadores de oligonucleótidos de la PCR se enumeran en la Tabla 1. Se sometieron a estudio técnico en los cebadores de la PCR los sitios de restricción para clonación, los codones para la señal de His6x y el codón de parada. El sitio de restricción StuI precedía al sitio Ncol que se superponía sobre el codon de iniciación. El sitio SacI seguía al codón de parada. Cuando se incluían, los codones de la señal de Hix6x precedían al codón de parada, de forma que una proteína expresada tendría una señal de His6x en su extremo C-terminal.

El ADNc amplificado se clonó en el módulo de expresión pCR-TOPO (plásmido de Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del vendedor y las secuencias se verificaron secuenciando ambas cadenas (Retrogen, San Diego, CA). La secuencia de ADNc amplificada era idéntica a la secuencia depositada en GenBank citada anteriormente. El ADNc de Chk1 de longitud completa se construyó a partir de estos dos ADNc solapantes, ligándose a través del sitio de restricción Clal en los restos 734-739. Este ADNc de longitud completa se usó como molde de PCR para generar fragmentos de ADNc para expresar o directamente para generar el vector de expresión de Chk1 de longitud completa. Todos los productos de PCR se clonaron en pCR-TOPO para la secuenciación. Se fabricaron construcciones para la expresión de Chk1 de longitud completa y diversas longitudes de dominio quinasa con o sin señal de His6x.

TABLA 1 Cebadores de PCR*

1

3. Anticuerpos de Chk1

Se seleccionó el péptido NRVTEEAVAVKIVDMKRAVD (restos 28-47 de la SEC ID Nº 2) para generar anticuerpos contra el extremo N-terminal de la Chk1 humana. Se seleccionó el péptido DDKILVDFRLSKGDGLE (restos 434-450 de la SEC ID Nº 2) para generar anticuerpos contra el extremo C-terminal de la Chk1 humana. Se pidieron anticuerpos policlonales de conejo a través del servicio de producción de anticuerpos a petición del cliente de Research Genetics, Inc (Huntsville, AL). Ambos anticuerpos detectaban Chk1 humana recombinante o endógena como se esperaba.

4. Fermentación

El esquema general fue el siguiente. Los cebadores de PCR 3' se diseñaron para codificar tanto proteínas no marcadas como marcadas (con la señal de histidina-6). El segmento de ADNc de 1-289 se clonó en un plásmido pFastBac (obtenido de Life Technologies) y se introdujo un sitio Ndel. Se generó un baculovirus recombinante usando el sistema Bacmid (obtenido de Life Technologies). La proteína (KH289) se expresó en células de insecto Hi-5 y se purificó por una combinación de cromatografía de intercambio iónico y de afinidad. Los segmentos de ADNc de la Chk1 de longitud completa (1-476 AA) y el dominio quinasa de Chk1 (1-265 AA) se clonaron un plásmido pAcSG2 y se generó un baculovirus recombinante usando ADN viral BaculoGold (obtenido de Invitrogen) y un protocolo de transfección con CellFectin modificado (obtenido de Life Technologies) y selección de placas (obtenido de Novagen). La proteína expresada se purificó usando el esquema de cromatografía descrito anteriormente. Se descubrió que se requería alta concentración de sal en los tampones para prevenir la precipitación de las proteínas purificadas. Los detalles del protocolo se analizan a continuación.

Generación de plásmidos de expresión

Se modificó el plásmido pFastBac-Nde a partir del vector pFastBac1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) por mutagénesis dirigida al sitio in vitro usando el kit de mutagénesis in vitro Muta-Gene (Bio-Rad, Hercules, CA) siguiendo las instrucciones del suministrador. Se sustituyeron dos nucleótidos en pFastBac1 usando el siguiente oligonucleótido:

TGA TAT ATC CGG CAT ATG TAT AGG TTT TTT

[SEC ID Nº 14]

Esto creó un sitio Ndel único en el sitio de inicio de la traducción original para la proteína polihedrina.

Los fragmentos de ADNc amplificados se digirieron con las enzimas de restricción StuI y SacI y se clonaron en plásmidos pET28a (Novagen, Madison, Wi), pAcSG2 (Pharmingen, San Diego, CA) o pFastBac-Nde. Se usó el vector pET28a para la expresión de la proteína en E. coli y se usaron pAcSG2 y pFastBac-Nde para la expresión de la proteína en células de insecto. Para clonar los fragmentos de ADNc que codifican el dominio quinasa de Chk1 con los aminoácidos 1-289 (construcción KH289) en el pFastBac-Nde, el fragmento de ADNc se escindió del plásmido pCR-TOPO con las enzimas de restricción StuI y SacI, y se ligó entre el sitio Ndel acabado en punta y el sitio SacI. Se analizaron los plásmidos con inserción correcta con enzimas de restricción. Se clonaron la Chk1 de longitud completa y el dominio quinasa de los residuos 1-265 (KH265) con o sin la señal His6x en el extremo C-terminal en pAcSG2 usando los sitios de restricción de StuI y SacI. Los vectores de expresión para el dominio quinasa de los restos 1-210 (KH210) y el dominio quinasa de los restos 1-248 (KH248) se fabricaron en pFastBac-Nde.

La expresión en E. coli se hizo siguiendo las instrucciones suministradas con el vector pET28a. Las proteínas expresadas en forma de Chk1 de longitud completa o dominio quinasa de los restos 1-265 o dominio quinasa de los restos 1-289 estaban en la fracción insoluble cuando se analizaron con el kit de preparación de proteínas ReadyPreps (Epicentre Technologies, Madison, WI).

Generación de virus recombinantes

Se usó el sistema Bac-to-Bac (Life Technologies) para generar baculovirus recombinante para la expresión del dominio quinasa de Chk1 marcado en el extremo C-terminal con His6x (aminoácidos 1-289, KH289) según las instrucciones. Se confirmó la presencia de la inserción de ADNc de Chk1 por PCR. La expresión de la proteína se confirmó por SDS-PAGE o transferencia Western con los anticuerpos policlonales de Chk1. La expresión de KH289 parecía ser la más alta entre todas las construcciones. Se generaron reservas de título alto del virus recombinantes por 2 a 3 rondas de amplificación usando células de insecto Sf21.

Se generaron virus recombinantes par la expresión de la Chk1 de longitud completa y del dominio quinasa de los restos 1-265 por cotransfección de células Sf21 con el vector pAcSG2 y BaculoGold (PharMingen, San Diego, CA).

Expresión en células de insecto

La producción de proteína soluble activa obtenida en la fermentación de E. coli descrita anteriormente era poco práctica para experimentación a gran escala. Por lo tanto, se desarrolló un sistema de fermentación alternativo. Se adaptaron células de insecto Sf9 para amplificación viral y células Hi-5 para producción de proteína (ambas de Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) para crecer en medio de insecto que contenía suero fetal bovino al 1% (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Las células se propagaron y se mantuvieron en cultivo de suspensión a 27ºC en matraces de agitación Erlenmeyer (Corning Nº 430183) o en un frasco rotativo erguido (Corning Inc., Corning, NY, USA Nº 2590-17000) con un tapón aflojado para aireación. Los matraces se situaron en una agitador refrigerado recíproco (Innova 4343, New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA) a 120 rpm. La densidad celular se mantuvo entre 5 x 10^{5} a 2 x 10^{6} células/ml diluyendo la suspensión de células cultivadas con un medio nuevo precalentado (27ºC). La viabilidad de las células de insecto se mantuvo al 98%. La viabilidad de las células de insecto se determinó por contaje microscópico de células totales teñidas con trypan blue frente el número total de células en un hemocitómetro.

Se usaron células de insecto Sf9 para amplificar la reserva de virus recombinante. Se recogió el baculovirus recombinante de una placa única con una punta de pipeta y se añadió a monocapas de células Sf9 en matraces T-25 (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA) con 10 ml de medio SF900II y 1% de suero fetal bovino (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) y se incubaron a 27ºC. Después de 6 días, el sobrenadante del cultivo se usó como una primera generación de reserva de virus (P1) para la amplificación adicional de las reservas de virus P2 y P3 a 2-3 l. Para la amplificación a gran escala de las reservas de virus P2 y P3, se añadió la reserva de virus P1 o P2 a células sf9 a una densidad celular de 1 x 10^{6} células/ml, la infección se realizó con una Multiplicidad de Infección (MOI) de 0,1, las células se crecieron en suspensión en 500 ml de SF900II en frascos rotativos de 2 l (Corning Inc., Corning, NY, USA) que estaban erguidos en un incubador de agitación a 120 rpm a 27ºC durante 6 días. Este procedimiento se repitió hasta que se obtuvieron 2-3 l de reserva de virus (P3). El título de esta reserva de virus era de 1 a 5 x 10^{8} u.f.p/ml. El título del virus se determinó por el procedimiento de ensayo de placa, con diluciones seriadas en base 10 hasta 10^{8}. La reserva de virus se almacenó a 10ºC, y se usó para producción de proteína a gran escala en 2 meses para evitar inestabilidad viral. Se usaron para la producción de proteínas células de insecto Hi-5 (derivadas de células de Trichoplusia.ni) que se han adaptado para crecer en medio Ex-cell 401 (JRH Bioscience, Lenexa, KS, USA) con 1% de suero fetal bovino. Las células se crecieron en frascos rotatorios erguidos hasta una densidad celular de 2 x 10^{6} células/ml; y se usaron como células semilla para cultivo en biorreactor. Las células se crecieron en un biorreactor de 20 l con un volumen de trabajo de 18 l (Applikon Inc., Foster City, CA, USA). La velocidad de flujo de aire funcionó a aproximadamente 10 ml por minuto por litro de fluido de cultivo. El aire se fortaleció con oxígeno puro para mantener el oxígeno disuelto (DO2) al 50% de la saturación del aire. Se mantuvo la agitación a 200 rpm durante todo el cultivo. La densidad celular de partida era de aproximadamente 5 x 10^{5} células/ml y las células se infectaron cuando la densidad alcanzó 2 x 10^{6} células/ml. La MOI era de 3 y la infección se realizó durante 48 h. Después de 48 h de infección, se recolectaron las células infectadas por centrifugación a 3.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC con una centrífuga refrigerada (modelo PR-7000M, IEC, Needham Heights, MA, USA). Los sedimentos celulares se recogieron y se almacenaron a -80ºC.

5. Purificación KH289 marcada con His-6x

El esquema básico de purificación se representa en la Figura 4. Se descongelaron los sedimentos celulares congelados, se suspendieron en tampón de lisis enfriado con hielo y se lisaron con un microfluidizador (Microfluidics Corporationm Newton, MA). El tampón de lisis contenía Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM y \beta-mercaptoetanol 14 mM. El lisado se centrifugó durante 40 minutos a 40.000 rpm en un rotor Ti45 de una ultracentrífuga Beckman L8-70M. La fracción soluble fluyó a través de una columna de intercambio aniónico Q-Sepharose FastFlow de 150 ml (Pharmacia, Piscataway, NJ), luego se cargó en una columna se agarosa Ni-NTA de 40 ml (Quiagen, Santa Clarita, CA). Después de lavados exhaustivos con el tampón de lisis, la columna se eluyó con 240 ml de gradiente de imidazol de 20 mM a 300 mM en tampón de lisis. Las fracciones que contenían el dominio quinasa de Chk1 (KH289) se identificaron por SDS-PAGE y se agruparon. Las fracciones agrupadas se dializaron en Tris-HCl 25 mM, NaCl 500 mM, EDTA 0,5 mM y DTT 5 mM durante toda la noche. El conjunto dializado se diluyó con 1,5 volúmenes de Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 20 mM, glicerol al 8%, DTT 5 mM y se cargó inmediatamente en una columna de ATP-Sepharose de 40 ml. La columna se eluyó con 200 ml de Tris-HCl 25 mM, pH 5,5, NaCl 500 mM, DTT 5 mM y glicerol al 5%. Las fracciones que contenían KH289 se agruparon y concentraron en un agitador celular Millipore en 0,42 MPa de N_{2} y se cargaron en una columna de filtración en gel HiPrep Sephacryl de 320 ml y se eluyeron con el mismo tampón. Las fracciones agrupadas se concentraron a 7-7,5 mg/ml para la cristalografía o \sim3 mg/ml para la HTS. La proteína se congeló al instante en N_{2} líquido y se almacenó a -80ºC.

Se descubrió que mantener la concentración de sal aproximadamente a NaCl 500 mM incluyendo glicerol al 5% era crucial para prevenir la agregación de las proteínas Chk1 durante la purificación y el almacenamiento sin afectar al uso pretendido.

KH265 marcada con His-6x y Chk1 KH 476

Se usaron esencialmente los mismos procedimientos para purificar la Chk1 de longitud completa y el dominio quinasa de los restos 1-265 expresados en células de insectos. Los niveles de expresión de la proteína se midieron después de la cromatografía Ni-NTA o los rendimientos finales eran mucho más bajos que los de la KH289 (secuencia de longitud completa).

Se ha usado HPLC de filtración en gel como un medio de control de calidad. No se observaron diferencias significativas para las muestras almacenadas a temperatura ambiente, 4ºC ó -80ºC durante 4 días. El material eluyó a un volumen de vacío que era menor del 0,1%.

6. Cristalización, Cristalografía y análisis tridimensional

La proteína Chk1 de longitud completa (1-476 AA) había demostrado ser difícil de cristalizar hasta que se identificó el dominio quinasa activo (1-289 AA). Esta quinasa activa era capaz de expresarse en la concentración alta requerida para usar en HTS y cristalografía. El conjunto de datos de Chk1 se recogió en MarlP345 en criotemperatura con corriente de congelación. Se usó primero la preparación del dominio quinasa HB2-092 (1-289 AA). Se obtuvo el conjunto de datos inicial a 2,35 O con Rsym total del 4,6% y la mosaicidad total para el conjunto de datos es 1,2. Experimentos posteriores con la HB2-101 (también un clon de 1-289) alcanzaron una resolución de 1,2 O con una mosaicidad de 0,38 para el dominio quinasa usando un crecimiento de cristal en condiciones refinadas. Tanto el original como cristales posteriores tienen un grupo de espacio P21 con una molécula por unidad asimétrica. Los resultados del análisis cristalográfico se muestran en la Tabla 2 a continuación.

TABLA 2 Estadísticas de los análisis cristalográficos

2

3

Se crecieron los cristales a 13ºC usando un procedimiento de difusión de vapor de gota colgante. Dos estados de cristalización produjeron la misma forma exacta de cristales. El cristal Nat1 se obtuvo mezclando un volumen igual de solución de proteína (7 a 7,5 mg/ml de proteína) y solución de reserva de PEG 8000 al 13% (p/v), (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,115 M, NaCacodilato 0,1 M (pH 6,8), glicerol al 2%. El cristal Nat2 se cristalizó usando solución de reserva de PEG 8000 al 12% (p/v), isopropanol al 15%, Hepes 0,1 M (pH (7,5). Los cristales pertenecen al grupo de espacio P2_{1} y tienen unas dimensiones de célula unitaria a = 45,2 \ring{A}, b = 65,7 \ring{A}, c = 58,1 \ring{A}, d = 93,9º. Los cristales contenían una molécula por unidad asimétrica y tienen el 53% de disolvente en volumen. Los cristales del complejo binario con AMP-PNP se obtuvieron por co-cristalización primero en el mismo estado de cristalización que en el cristal Nat1 en presencia de AMP-PNP 1,25 mM y MgCl_{2} 2,5 mM, después los cristales resultantes se remojaron en líquido madre que contenía MgCl_{2} 5 mM y AMP-PNP 20 mM durante dos días. Los co-cristales tenían el grupo de espacio idéntico (P2_{1}) y las dimensiones celulares de los cristales nativos. Todos los datos de difracción se recogieron a -170ºC. Los cristales se introdujeron en solución crioprotectora que contenía su solución de reserva y glicerol al 20%. Para el co-cristal AMP-PNP, se incluyeron en la solución crioprotectora MgCl_{2} 10 mM y AMP-PNP adicionales. Los cristales se congelaron después al instante en una corriente de gas de nitrógeno a -170ºC. Toda la recolección de los datos se realizó con fuente inicial usando radiación \gamma CuK producida por un generador de rayos x FR5 de ánodo de rotación Rigalu equipado con espejos de enfoque y se midió con un detector de imagen de placa Mar 345. Todos los datos se procesaron con el paquete Denzo/HJL (Otwinowski, Z., "oscillation Data Reduction Program", Proceedings of the CCP4 Study Weekend: Data Collection and Processing, pp 56-62, compilado por: L. Sawyer y col., SERC Daresbury Laboratory, England (29-30 de enero de 1993)).

Se realizó la determinación de la estructura de la apoenzima inicial usando los datos del cristal Nat1 por reemplazamiento molecular (RM) usando la estructura de Cdk2 modificada (regiones bucle omitidas) (Russo, AA y col., Nature, 382(6589):325-31 (25 de julio de 1996)) como un modelo de investigación. Las funciones de rotación y translación usando el software A-MoRe (Navaza J, Acta Crystallographic, 50 (2): Sección A (marzo, 1994)) revelaron una solución usando los datos de Nat1 de 10 a 4 \ring{A}. El modelo de RM se refinó por hibridación simulada (X-plor). Sin embargo, después de rondas sucesivas de reconstrucción y refinamiento, los mapas de densidad electrónica 2Fo-Fc y Fo-Fc estaban pobremente definidos en las regiones bucle que se omitieron del modelo inicial. Para obtener información de fase adicional, se realizó reemplazamiento isomórfico múltiple con dos derivados de metales pesados: HgCl_{2} 0,5 mM (remojado durante 15 h) y Kau 5 mM (CN)_{2} (remojado durante 17 h). Se identificaron cinco sitios Hg y cinco sitios Au por síntesis Fourier de diferencia usando fases generadas a partir del modelo parcial de RM y eran consistentes con ambos mapas Patterson de diferencia isomorfo y anómalo. Los parámetros posicional y térmico y las ocupaciones relativas de los sitios de átomos pesados se refinaron usando los datos SIR a 3 \ring{A} y los datos anómalos a 3,5 \ring{A} con el programa PHASES (Furey, W y col., "Phases: a Package of Computer Programs Designed to Compute Phase Angles for Difraction Data from Macromolecular Crystals", American Crystallographic Association, Serie 2, 18:73 (1990)). Se realizaron después dieciséis ciclos de nivelación del disolvente usando fases calculadas a partir de las posiciones de Hg y Au refinadas. Los mapas de densidad electrónica resultantes mostraron una buena densidad de cadena principal y cadenas laterales bien definidas para la mayor parte de la proteína. La construcción del modelo utilizó el programa FRODO (Jones, T.A. J Appl Cryst, 11: 268-272 (1978)). Las regiones bucle perdidas se incorporaron al modelo usando tanto los mapas MIR como los mapas 2Fo-Fc escalonados del modelo. Se continuaron refinamientos adicionales en XPLOR (Brünger, A.T. y col., X-PLOR Versión 3.1; A System por X-ray Crystallography and NMR'' Yale University Press, (1992)) y después en CNS (Brünger, A.T. y col., Crystallography & NMR System, Acta Cryst., D54: 905-921 (1998)) tanto con minimización de gradiente conjugada como por hibridación simulada, seguido después por reconstrucción de forma manual.

El refinamiento de la estructura de Nat2 se realizó usando el modelo Nat1 refinado pero omitiendo los restos 153-170 así como SO_{4}. Los mapas F.-Fc mostraron densidades bien definidas para las regiones que se omiten y su conformación es exactamente la misma que la de Nat1.

El refinamiento del complejo binario con AMO-PNP transcurrió refinando la posición del modelo de apoenzima refinado (Nat1) como un cuerpo rígido frente los datos del complejo usando el programa CNS. Los mapas Fo-Fc con penalización \sigmaA (Read, R.J., Acta Cryst., A42 140-149 (1986)) mostraron densidad clara para los componentes de adenina y ribosa de AMP-PNP. La conformación de los restos que forman el bolsillo de unión se comprobó en mapas de supresión de hibridación simulada antes de incluir los componentes de adenina y ribosa de AMP-PNP.

El modelo de apo-enzima (Nat1) incluía todos los átomos de los restos 2 a 44 y 48 a 276, 183 moléculas de disolvente ordenadas y una molécula de SO4. La estructura de Nat2 refinada contenía el mismo número de restos y moléculas de disolvente pero no estaba presente la molécula de SO4. El complejo AMP-PNP refinado contenía el mismo número de restos que las estructuras apo, con 150 moléculas de disolvente ordenadas y una molécula de SO4. El resto trifosfato de AMP-PNP estaba desordenado y no eran visibles iones Mg2+. El modelo final tenía todos los restos en las regiones "más favorecidas" o "permitidas adicionalmente" de los gráficos de Ramachandran de acuerdo con PROCHECK (Laskowski RA y col., J. Appl. Cryst., 26: 283-291 (1993)), sin restos en las regiones "permitidas generosamente" o "no permitidas", indicando la naturaleza bien definida de las estructura cristalina identificada. Las expresiones "generosamente permitidas" y "no permitidas" son descripciones de la configuración de los ángulos Phi y Psi de la estructura de la proteína. Una estructura de proteína bien refinada no debería situar estos ángulos en las configuraciones no preferidas o que no ocurren de forma natural.

7. Estructura global de la quinasa

Las estructuras cristalinas del dominio quinasa de la Chk1 humana y de su complejo binario con un análogo del ATP, AMP-PNP, se han determinado con una resolución de 1,7 \ring{A}. Ambas estructuras contienen el dominio central de la quinasa (restos 2-267) y los restos de la región de engarce que conecta el dominio N-terminal de la quinasa con la región C-terminal de Chk1. El análisis cristalográfico se resume en la Tabla 2. Las coordenadas cristalinas de Chk1 para la apoenzima (Chk1 activa aislada) y el complejo binario (Chk1 formando un complejo con AMP-PNP, un análogo del ATP) se muestran en las Figuras 11A y 11B, respectivamente. Las coordenadas de las moléculas de agua fijadas se incluyen también allí.

El dominio quinasa de la Chk1 humana tiene un pliegue canónico en dos lóbulos de la quinasa, con la grieta de unión a ATP entre los dos lóbulos (Figura 5, modelo de estructura). El lóbulo N-terminal más pequeño contiene una hélice (aC) y 5 cadenas \beta (\beta1 a \beta5) que forman una lámina \beta antiparalela curvada. El lóbulo C-terminal más grande contiene un grupo de 7 hélices (\alphaD a \alphal), empaquetadas frente a 6 cadenas \beta (\beta6 a \beta11) que bordean la grieta. Una cadena \beta (\beta6') comprende la región bisagra que conecta los dos lóbulos. Tanto en la estructura del apoenzima como en la estructura binaria, el sitio de unión de ATP, los restos catalíticos y el bucle de activación están bien ordenados. La comparación con estructuras cristalinas de otras quinasas indica que el dominio quinasa de Chk1 está estrechamente relacionado con PhK (Lowe, ED y col., EMBO J, 16(22): 6646-58 (17 de nov de 1997)) (Véase la Figura 1A, 1B). El lóbulo N-terminal (Restos 2-90) se superpone con una derivación r.m.s. de átomos de C\alpha de 1,1 \ring{A}, mientras que el lóbulo C-terminal (restos 91-276) se superpone con una derivación r.m.s. de átomos de C\alpha de 0,9 \ring{A}. En el lóbulo C-terminal, las mayores diferencias se encuentran en la hélice aG, y en el bucle que conecta aG y \alphaH. Éstos no se incluyen en la superposición. La apoenzima Chk1 adopta una conformación más abierta comparada con PhK. El lóbulo N-terminal de Chk1 está rotado \sim15º en relación con el complejo ternario de PhK con sus sustratos. La comparación del complejo binario de Chk1 unido a AMP-PNP con la estructura de la apoenzima no muestra cambio conformacional. Un alto grado de homología de secuencia de los dominios quinasa de Chk1 de diferentes especies (Figura 2) sugiere que existe una conservación estructural global del dominio quinasa. Los restos que no están modelados en las estructuras actuales no están conservados en Chk1. Por ejemplo, hay una inserción de seis restos en el bucle que conecta \beta3 y \alphaC en Chk1 de S. pombe.

Los dos lóbulos se sujetan juntos por una red de enlaces de hidrógeno extensa en la interfaz de los lóbulos que implica el bucle que une \alphaC y \beta4 del lóbulo N-terminal, \beta6' de la región bisagra, y \beta7 y \beta8 del lóbulo C-terminal. Esta red se extiende desde la parte posterior de la proteína hasta la abertura frontal de la grieta de unión de ATP. Los restos implicados en esta red forman también parte del bolsillo que interactúa con el resto de adenina del AMP-PNP. La cadena \beta8 precede inmediatamente al motivo DFG conservado de la quinasa, en el que el Asp 148 es importante para el alineamiento de los grupos fosfatos del ATP. La única mutación comunicada en el dominio quinasa de Chk1 está en la interfaz del lóbulo. El reemplazamiento de la Glu 85 conservad por Asp conduce a un fenotipo sensible a la temperatura en levaduras de fisión en las que el mutante mantiene la detención del ciclo celular después de irradiación con UV pero altera el punto de control de la replicación del ADN a temperatura no permisiva (Francesconi, S y col., EMBO J, 16 (6):1322-41 (17 de marzo de 1997)). La cadena lateral de la Glu 85 en el extremo de la cadena \beta5 forma enlaces de hidrógeno con la cadena lateral de la Lys 145 conservada de la cadena \beta8 así como con la amida de la cadena principal de la Lys 69 conservada que precede a la cadena \beta4. Estas interacciones, junto con la red de enlaces de hidrógeno extensa en la interfaz del lóbulo, parece que juega un papel importante en el mantenimiento de la disposición correcta del lóbulo N-terminal y del bucle DFG durante el movimiento del lóbulo. La mutación de Glu a Asp, mientras que mantenga una carga similar, no sería suficientemente larga para formar esos enlaces de hidrógeno proporcionados por la Glu 85, debilitando de ese modo las interacciones de los lóbulos y produciendo que la proteína mutante sea menos estable a temperaturas más altas.

La mayoría de los restos invariables de las proteínas Chk1 se sitúan en el lóbulo C-terminal. Muchos de ellos están también conservados entre las ser/Thr quinasas y están implicados en estabilizar la conformación catalíticamente activa de la quinasa y en la unión al ATP. Estas posiciones de varios motivos invariables de las proteínas Chk1 son dignas de mención. Comparado con otras Ser/Thr quinasas, el motivo IEPDIG (restos 96-101) acorta la aD a una vuelta de hélice, ya que la Pro 98 inicia un giro cerrado entre aD y aE. Este giro interactúa con el extremos C-terminal de la hélice \alphaF a través de una cadena principal de enlaces de hidrógeno entre el Asp 99 y la Gly 204 invariable. En este giro, la Glu 97 forma enlaces de hidrógeno con la cadena principal de la Ile 100 y la Gly 101. La conformación única de este motivo parece ser importante para la interacción con el sustrato del péptido, ya que las cadenas laterales de la Ile 96 y la pro 98 forman parte de un bolsillo hidrofóbico que interactúa con el sustrato del péptido como se ha analizado anteriormente. La hélice \alphaE contiene un motivo conservado de AQXFFXQL (restos 107-114; SEC ID Nº 24), con los restos hidrofóbicos enterrados dentro del lóbulo C-terminal. La cadena lateral de la Gln 108 se proyecta hacia la región engarce que sigue al dominio central de la quinasa y forma enlaces de hidrógeno directamente o a través de una molécula de agua con los átomos de la cadena principal de la Lys 267, Leu 269 y Lys 270. Aunque las secuencias de Chk1 divergen en esta región engarce, estas interacciones de la cadena principal con la Gln 108 podrían conservarse todavía, sujetando el engarce contra el extremo N-terminal de \alphaE. La hélice aG se sitúa de manera diferente comparado con aG de PhK. Dos conjuntos de restos PW invariables (207 y 208, 230 y 231) que flanquean a aG, aunque separados por 21 restos, están en contacto por fuerzas de van der Waals y conectados al núcleo hidrofóbico del lóbulo C-terminal. Esto estabiliza la superficie para la interacción con el sustrato del péptido.

Activación y bucles catalíticos

Las características interesantes del dominio quinasa de Chk1 incluyen interacciones que estabilizan el bucle de activación. La estructura del bucle de activación determina el alineamiento de los restos que contactan con el ATP y realizan la catálisis en proteínas quinasas. Interactuando con el bucle catalítico, el bucle de activación orienta el Asp catalítico; interactuando con el lóbulo N-terminal, el bucle de activación cierra los lóbulos N y C terminales y alinea los restos que interactúan con los fosfatos del ATP. El bucle de activación se define como la región entre los motivos conservados de DFG y APE correspondientes a los restos 148 a 177 de Chk1. Los cambios conformacionales en el bucle de activación sirven como un mecanismo de regulación fundamental para la actividad quinasa. En las estructuras de la Chk1 humana, el bucle de activación está plegado en una conformación similar a la encontrada en estructuras de quinasas activas, coherente con la observación de que el dominio quinasa de Chk1 es activo de manera constitutiva. Esta conformación activa se estabiliza por características especiales de las estructuras secundarias de Chk1 y sus interacciones de cadena lateral (Figuras 3 y 5, modelo de homología y estructura cristalina).

El extremo N-terminal del bucle de activación interactúa con el bucle catalítico a través de la interacción de \beta6 y \beta9. Inmediatamente después de \beta9, \beta10 interactúa con \beta11 para formar un bucle \beta de doble cadena con un giro en la Asn 159. Este bucle \beta está empaquetado contra el extremo N-terminal del bucle catalítico y las posiciones altamente conservadas Arg 156 y Glu 161. La cadena lateral de la Arg 156 interactúa con el carbonilo de la His 122 invariable en el extremo de aE. La cadena lateral de His 122 conecta con la amida de Arg 129, adyacente al resto catalítico Asp 130, a través del Asp 190 invariable. El carboxilo de la Glu 161 forma un enlace de hidrógeno con el imidazol de la His 185 que precede a \alphaF. Estas interacciones anclan este extremo del bucle de activación al núcleo del lóbulo C-terminal. El centro del bucle de activación interactúa con el resto del lóbulo C-terminal a través de dos enlaces de hidrógeno de la cadena principal entre la Leu 164 y la Phe 184. El bucle de activación finaliza en su extremo C-terminal con un giro que se apoya en \alphaEF. En la Chk1 humana, \alphaEF está anclado en dos posiciones al núcleo del lóbulo C-terminal a través de dos pares iónicos, uno es el par iónico quinasa invariable entre la Glu 177 y la Arg 253, otro es entre la Lys 180 y la Glu 248 que es único de Chk1. Este par iónico extra limita el movimiento de \alphaEF, y a su vez el movimiento del extremo C-terminal del bucle de activación. El par de la Lys 180 y la Glu 248 está conservado solamente en Chk1 de vertebrados, sugiriendo flexibilidad potencial de \alphaEF y el bucle de activación de Chk1 en organismos inferiores tales como S. pombe.

Las estructuras cristalinas de las quinasas indican que la conformación del bucle de activación está influenciada por su carga negativa que neutraliza un grupo de restos cargados positivamente, aunque la interacción iónica puede no ser requerida en absoluto como en el caso de la caseína quinasa I de mamíferos. La carga negativa la proporciona un fosfato a través de fosforilación, el grupo carboxilo de la Glu o disolventes iónicos. En Chk1, está presente el grupo cargado positivamente de la Arg 129, Arg 162, Lys 166 y Lys 54, pero no se observa fosforilación. Tanto en la estructura de la apoenzima como en la del complejo binario determinado a 1,7 \ring{A}, un ion sulfato esta cercano a la posición del fosfato de la fosfotreonina (Thr 197) en PKA. Este ion sulfato interactúa con la Arg 129, Arg 162 y Thr 153. El sulfato está presente en la solución de cristalización y podría contribuir a la estabilidad del grupo cargado positivamente y del bucle de activación. Para clarificar el papel de este ion sulfato y entender mejor las interacciones que estabilizan el bucle de activación, los cristales se produjeron en condiciones libres de sulfato y se determinó la estructura a 2.1 \ring{A} (Tabla 2). Nos referimos a esta estructura de 2,1 \ring{A} como estructura Nat2, mientras que a la estructura de la apoenzima de 1,7 \ring{A} nos referimos como estructura Nat1. En la estructura Nat2, no está presente el ion sulfato.

La superposición de las estructuras Nat1 y Nat2 revelaron conformaciones similares para los bucles de activación correspondientes excepto para la cadena lateral de la Arg 162 que gira hacia el disolvente en la estructura Nat2. La cadena lateral de la Arg 162 es flexible en ambas estructuras como se indica por sus altos factores de temperatura. La Arg 162 es un resto invariable de Chk1 y su función no es fácilmente aparente a partir de la estructura. Tanto en la estructura Nat1 como Nat2, la cadena lateral de la Arg 129 forma enlaces de hidrógeno con tres oxígenos carbonilo de la cadena principal (Leu 151, Ala 152 y Lys 166) directamente o por medio de moléculas de agua. La carga positiva de Arg 129 podría neutralizarse con el grupo tiol de la Cys 168 que está en las cercanías de las cadenas alterales de la Lys 166 y la Arg 129. En este ambiente básico, este tiol podría convertirse en un ion tiolato. La Cys 168 es invariable en Chk1 y está conservada en muchas quinasas tales como PKA y PhK. Nuestros resultados descartan el papel del ion sulfato en la estabilización del bucle de activación de Chk1. En su lugar, el bucle de activación y el bucle catalítico se estabilizan por sus estructuras secundarias únicas y sus interacciones extensas de las cadenas laterales.

Una diferencia entre Chk1 y otras quinasas es las posiciones permutadas de la Lys 166 y la Thr 153 (Figura 2). La Lys 166 ocupa la posición equivalente a la Glu 182 de PhK y la Thr 197 fosforilada de PKA, mientras que la Thr 153 es equivalente a la Lys 189 de Pka. La cadena lateral de la Thr 153 forma un enlace de hidrógeno con la cadena lateral de la Lys 54 localizada en la hélice \alphaC. La Thr 153 está conservada en Chk1 (Thr o Ser) y es un candidato para la fosforilación en el bucle de activación. La posición permutada, sin embargo, hace improbable la fosforilación de Thr 153. El bucle de activación está todavía en una conformación activa en Chk1 y la fosforilación sería innecesaria. La Lys 54 está conservada en todos excepto en Chk1 de S. pombe y es adyacente a la Glu 55 que forma el par iónico invariable con la lys 38 en quinasas activas. La interacción entre la Thr 197 y la Lys 54, por lo tanto, parece jugar un papel similar a la interacción entre la His 87 y el fosfato de la Thr 197 de PKA. La cadena lateral de la Lys 166 apunta a la Cys 168 y su posición parece jugar un papel en la determinación de la especificidad de sustrato analizada anteriormente. En la Chk1 de S. pombe, el resto que se corresponde con la Lys 166 es Ser, sugiriendo una regulación potencial de la actividad de Chk1 de S. pombe por fosforilación. De forma concomitante, el bucle de activación de la Chk1 de S. pombe parece ser más flexible ya que sus sustituciones interrumpirían algunas de las interacciones que estabilizan el bucle de activación.

Restos catalíticos y de unión a AMP-PNP

El bucle rico en glicina que ancla los grupos fosfato del ATP en quinasas está pobremente ordenado en Chk1, como se evidencia por los altos factores B en esta región tanto para las estructuras del apoenzima como para la estructura del complejo binario unido a AMP-PNP. Los restos 18-21 en el vértice del bucle entre \beta1 y \beta2 son flexibles con densidad electrónica pobre. Estos restos están altamente conservados en quinasas y anclan el fosfato \beta del ATP en estructuras de quinasas unidas a ATP. La flexibilidad de este bucle podría jugar un papel en la regulación de la actividad de la quinasa Chk1, de hecho, la Tyr 20 presente en organismos superiores se corresponde estructuralmente con la Tyr 15 de Cdc2 que posteriormente a la fosforilación inhibe la actividad de Cdc2 (Coleman TR, y col., Curr Opin Cell Bio, 6(6):877-82 (diciembre, 1994); Russo, AA y col., Nature, (1996), supra).

Una característica notable entre los complejos ternarios activos tales como PKA y PHK es la estrecha similitud de la conformación de los restos del sitio activo, sus interacciones con el ATP y la coordinación de los iones metálicos. Los complejos binarios que se han resuelto no muestran tal conservación (Knighton DR, y col., J Mol Biol, 220(2):217-20 (20 de julio de 1991); Bossemeyer, D y col., EMBO J, 12(3): 849-59 (marzo de 1993); Zheng J, y col., Protein Sci, 2(10): 1559-73 (octubre de 1993); Owen DJ, y col., Structure, 3(5):467-82 (15 de mayo de 1995); Lowe, y col., EMBO J, (17 de noviembre de 1997), supra). Muchos de los restos del sitio activo en la estructura de Chk1 tienen interacciones bastante similares a las de los complejos ternarios de Phk y PKA (Figura 4A, 4B). En el lóbulo N-terminal, está presente el par iónico invariable de las quinasas activas entre la lys 38 y la Glu 55; la correspondiente Lys en PhK y PKS interactúa con los fosfatos \alpha y \beta del ATP. La hélice \alphaC está firmemente unida al resto del lóbulo N-terminal por interacciones hidrofóbicas y está en una posición activa en relación con el resto del lóbulo N-terminal. También interactúa con el bucle DFG en el lóbulo C-terminal la cadena lateral de la Glu 55 de los restos \alphaC por encima de la Gly 150. La posición relativa de las cadenas laterales de la Lys 38, Glu 55 y Asp 148 son similares a la de los restos correspondientes en los complejos ternarios de PKA y PhK. Tres restos en PKA y PhK, junto con el bucle rico en glicinas, coordinan un Mg2+ y anclan los fosfatos \alpha y \beta del ATP. En el lóbulo C-terminal, la conformación del bucle catalítico (restos 130-135) de Chk1 es casi idéntica a la de PHK con las cadenas laterales del Asp 130, Lys 132 y Asn 135 de Chk1 casi superponibles a los restos correspondientes del Asp 149, Lys 151 y Asn 154 en PhK en los que la Lys 151 se une al fosfato \gamma de AMP-PNP y la Asn 154 quela otro Mg2+ que se une a los fosfatos \beta y \gamma de AMP-PNP. La Thr 170 está conservada en todas las proteínas serina/treonina quinasas y parece que determina la especificidad de la Ser/The frente a la Tyr como fosfo-aceptor. La Thr 170 forma enlaces de hidrógeno con el Asp 130 y la Lys 132 análogos a la Thr 186 en PhK y estas interacciones son necesarias para posicionar el carbonilo del resto catalítico Asp 130. Los restos de Chk1, sin embargo, están separados de los del lóbulo N-terminal y el bucle DFG debido a la conformación del lóbulo un tanto abierta (Figura 6). El bucle DFG se posiciona más alto que sus partes contrarias en PKA y PhK. La Lys 38Ne está alejada 10 \ring{A} del Asp 130O\delta2, comparado con 8,2 \ring{A} en Phk y 7,8 \ring{A} en PKA. El asp 148O\delta1 está alejado 6 \ring{A} del Asp 130O\delta2, comparado con 3,8 \ring{A} en PhK y 4,8 \ring{A} en PKA. En Chk1, se sitúa una molécula de agua entre el Asp 148 y el Asp 130 y está unida por un enlace de hidrógeno al Asp 130O\delta2 así como a la Asn 135O\delta1. La cadena lateral de la Asn 135 está alejada por encima de 1 \ring{A} del Asp 148 en relación a la conformación activa en PhK. Los restos que son necesarios para la unión del fosfato del ATP y la catálisis están agrupados en dos partes separadas, aunque mantienen sus interacciones locales. La carencia de densidad electrónica de los restos trifosfato de AMP-PNP en el complejo binario de Chk1 produce probablemente falta de alineamiento de estos restos así como flexibilidad en el bucle rico en glicina.

Los restos de adenina y ribosa se definen claramente es nuestro modelo actual. Como en todas las estructuras de quinasas con ATP, la base de adenina está casi completamente enterrada en un bolsillo hidrofóbico entre los dos lóbulos, y se forman enlacen de hidrógeno entre el N6 de la adenina y el carbonilo de la cadena principal de la Glu 85, y entre el N1 y una amida de la Cys 87. Como en PhK, el N7 de Chk1 interactúa con la cadena lateral de la Ser 147 por medio de una molécula de agua en Chk1. Sin embargo, el anillo de ribosa adopta una conformación C2'-endo similar a la de la forma inactiva de Cdk2 (código PDB ID 1HCK, (De Brondt HL, y col., Nature, 363(6430):595-602 (17 de junio de 1993); Schulze-Gahmen U y col., J Med Chem, 39(23):4540-6 (8 de noviembre, 1996)), uniéndose por enlaces de hidrógeno el O2' a la Glu 91, y uniéndose por enlaces de hidrógeno el O3' al carbonilo de la Leu 15 en el bucle rico en glicinas. En comparación, los anillos de ribosa tienen fruncimiento en C3'-endo en los complejos ternarios activos de PKA y PhK.

Especificidad de sustrato e interacciones que estabilizan la conformación cerrada

El bucle de activación estructurado de Chk1 proporciona una oportunidad de explorar la base de la especificidad del sustrato peptídico. La semejanza estrecha de Chk1 con PhK y las estructuras disponibles de PhK con y sin sustrato peptídico nos permiten modelar las interacciones del sustrato peptídico con Chk1. Se ha analizado para tres quinasas la interacción de las quinasas con sus sustratos peptídicos, PKA con un péptido inhibidor de PKI (código PDB 1ATP, (Knighton DR, J Mol Biol, (20 de julio de 1991), supra), PhK con el péptido MC (Código PDB 2 PHK, (Lowe, y col., EMBO J, (17 de noviembre de 1997), supra), y la tirosina quinasa del receptor de insulina con un sustrato peptídico (código PDB 1IR3, (Hubbard SR, EMBO J, 16(18):5572-81 (15 de septiembre, 1997)). En todas estas tres estructuras complejas terciarias, las cadenas principales de los sustratos peptídicos alrededor de los restos aceptores de fosfato adoptan una conformación extendida e interactúan principalmente con los lóbulos C-terminales.

El sustrato conocido de la quinasa Chk1 es la proteína fosfatasa Cdc25C. Se han identificado varios restos de Ser aceptores de fosfato en la secuencia de la proteína Cdc25C. Se pueden derivar características consenso de secuencias que rodean a la Ser aceptora de fosfato (posición P): La posición P-3 N-terminal es una Arg conservada, las posiciones P-5 prefieren restos hidrofóbicos abultados, y la P-2 es Ser o Thr. Se requiere la fosforilación de la Ser 216 de la Cdc25C humana para la detención en G_{2} inducida por daño en el ADN y Chk1 fosforila in vitro la Ser 216 (Peng y col., Science (1997), supra; Sánchez y col., Science (1997), supra). Por lo tanto, se usó el péptido LYRSPSMPE que se extiende sobre los restos 211-219 de la Cdc25C humana para modelar la interacción del sustrato peptídico con Chk1, basándose en el complejo ternario de Phk con el péptido MC.

El péptido de Cdc25C modelado encaja fácilmente en una ranura del lóbulo C-terminal de Chk1, siguiendo un camino muy similar al del péptido MC unido a PhK (Figura 7). El átomo O\gamma de la Ser(p), el nucleófilo presumido en la reacción de transferencia de fosfato, está muy cercano a una molécula de agua ordenada en las estructuras de Chk1. Esta molécula de agua se une por enlace de hidrógeno tanto al Asp 130O\delta2 como a la Lys 132N\varepsilon. La superposición de Chk1 y PhK muestra que esta molécula de agua estaría a 3,4 \ring{A} del átomo de fósforo \gamma del AMP-PNP en PhK. La posición de esta molécula de agua indica probablemente la situación aproximada del hidroxilo de la Ser durante la catálisis.

La cadena lateral hidrofóbica de la Leu (P-5) encaja dentro del bolsillo hidrofóbico formado por la Phe 93, Ile 96, Pro 98 y Leu 206. Todos estos restos excepto la Leu 206 son invariables en proteínas Chk1. La cadena lateral de la Arg (P-3) apunta hacia la Glu 91 de Chk1. Sin embargo, en su conformación extendida, el grupo guanidina de esta Arg puede formar sólo un enlace de hidrógeno (3 \ring{A}) con el carboxilo de la Glu 91. Tanto en PKA como en PhK, la guanidina de la Arg (P-3) forma un puente salino (2,5 \ring{A}) con el carboxilo del resto de Glu correspondiente. Como se ha analizado anteriormente, la interacción iónica de la Arg y la Glu 91 podría establecerse después del cierre de los lóbulos.

La cadena lateral de la Ser (P-2) podría hacer un enlace de hidrógeno con el oxígeno carbonilo de la cadena principal de la Pro (P-1). En PhK, la Gln (P-2) del péptido Mc interactúa con la Ser 188. Esta interacción no está disponible para Chk1 ya que tiene una Pro 172 invariable en la posición correspondiente de la Ser 188 en PhK. La Pro 172, entonces, puede contribuir a la especificidad de Chk1 para Ser o Thr en la posición P-2 y el enlace de hidrógeno interno proporcionado por la Ser o Thr en la posición P-2 puede jugar un papel en el mantenimiento de la conformación de la cadena principal del sustrato en su extremo N-terminal.

La cadena lateral hidrofóbica de Met (P+1) se proyecta dentro de un bolsillo hidrofóbico formado por los restos de Leu 171, Val 174, Leu 178, Leu 179 y Met 167. La posición P+2 puede acomodar solamente una cadena lateral pequeña o un giro debido a la posición única de la Lys 166. La Lys 166 se conserva entre proteínas Chk1 de vertebrados. Por consecuencia, la Pro se encuentra en las posiciones P+2 de los sustratos de Cdc25. La Pro (p+2) crea una sitio de unión de 14-3-3 consenso una vez que la ser (P) se fosforila. La Lys 166 de la Chk1 humana es un resto de Ser en Chk1 de S. pombe. La cadena lateral de la Chk1 de S. pombe puede estar fosforilada y apuntar a la posición correspondiente al ion sulfato en la estructura de la Chk1 humana. Por consecuencia, están presentes cadenas laterales abultadas en la posición P+2 de los sustratos de la Chk1 de S. pombe.

La fosforilación de Cdc25 C por Chk1 es muy específica de forma que la Ser (P-2) no está fosforilada. Esto es importante para la regulación de Cdc25C ya que la fosforilación en la posición P-2 destruiría el sitio de unión de 14-3-3. Nuestro modelo indica claramente los determinantes de la especificidad de sustrato de Chk1: interacción hidrofóbica a través de P-5 y P+1, interacción iónica a través de P-3, Ser/Thr en P-2, y cadenas laterales pequeñas de los aminoácidos en la posición P+2.

Aunque el dominio quinasa de Chk1 recombinante es activo cuando se ensaya en solución, la estructura revela que no es una conformación catalíticamente activa cerrada en la apoenzima o la estructura cristalina binaria. Este resultado sugiere que el apoenzima y el complejo binario unido a ATP favorecen la conformación abierta. El movimiento del lóbulo es común en dominios quinasa y la catálisis requiere una conformación cerrada (Cox S, y col., Curr Opin Struct Bio, 4(6): 893-901 (diciembre de 1994); Gangal M, y col., Biochemistry, 37(39):13728-35 (29 de septiembre de 1998)). En informes previos no se han abordado las interacciones que estabilizan la conformación activa cerrada. Nuestro modelo sugiere que una interacción clave en Chk1 es la interacción del par iónico entre la Glu 91 y la
Arg(P-3) del sustrato peptídico.

La superposición de las estructuras de Chk1 y Phk indica que el cierre del lóbulo de Chk1 puede lograrse por una rotación sencilla del lóbulo N-terminal \sim15º alrededor del resto de Glu 91. Esta rotación situaría a la Glu 91 más cercana a la Arg (P-3) y establecería un par iónico entre el grupo carboxilato de la Glu 91 y el grupo guanidina de la Arg (P-3). El cierre del lóbulo podría cambiar también la conformación de la ribosa del AMP-PNP a una conformación C3'-endo a partir de la conformación C2'-endo en el complejo binario. Las estructuras del complejo ternario de la quinasa catalíticamente activa presentadas hasta la fecha tienen sus respectivos anillos de ribosa fruncidos en una conformación C3'-endo. Para la Chk1, cuando la ribosa se modela en una conformación C3'-endo, pueden formarse dos enlaces de hidrógeno entre el grupo carboxilo de la Glu 91 y el O2' y O3' de la ribosa. En comparación, el complejo binario de Chk1 con AMP-PNP tiene sólo un enlace de hidrógeno entre la Glu 91 y la ribosa. El dominio quinasa de Chk1 en solución probablemente se desplaza dinámicamente ("respira") entre la conformación abierta y cerrada. Las estructuras de Chk1 actuales tienen conformaciones abiertas y han revelado que la grieta de unión a ATP es accesible a la solución. En la conformación cerrada, los restos para la unión del fosfato y la catálisis van juntos y se alinean con el fosfato para la transferencia. La interacción adicional de la Glu 91 con la Arg (P-3) del sustrato del péptido y con la ribosa del ATP desplazaría el equilibrio con la conformación activa cerrada. Por lo tanto, los sustratos del péptido ganan especificidad parcialmente debido a su capacidad de estabilizar la conformación catalíticamente activa cerrada de Chk1.

8. Regulación de la actividad quinasa de Chk1

La fosforilación del sustrato de Chk1, Cdc25 y la detención del ciclo celular resultante se ha correlacionado con la activación de Chk1 después del daño en el ADN. No está claro si la fosforilación de Chk1 regula su actividad quinasa. La estructura de la Chk1 humana sugiere que su actividad no está regulada por fosforilación del bucle de activación. En su lugar, el bucle de activación de Chk1 parece estar anclado por interacciones extensas a través de estructuras secundarias rígidas y por sus cadenas laterales. De manera interesante, podría ocurrir la fosforilación del bucle de activación en Chk1 de S. pombe que tiene una sustitución de una Ser en la posición de la Lys 166. Si la Chk1 se regula de manera diferente en S. pombe y mamíferos requiere la identificación de los restos que están fosforilados después del daño en el ADN.

La estructura del dominio quinasa de Chk1 y su complejo binario con AMP-PNP proporcionan una nueva percepción de su mecanismo de activación. Primero, las estructuras revelan una disposición única de los restos para la unión de fosfato y la catálisis. Específicamente, los restos para la unión de los fosfatos \alpha y \beta están separados de los de la unión para el fosfato \gamma y la catálisis. Se logra el alineamiento de estos restos en una conformación cerrada que se estabiliza con el sustrato peptídico. Nuestro modelo predice una baja actividad ATPasa de Chk1 y favorece un mecanismo cinético ordenado en el que la unión del ATP precede a la unión del sustrato peptídico. Segundo, las estructuras excluyen un papel del bucle de activación de la Chk1 humana en la regulación de la conformación del dominio quinasa. El bucle de activación se mantiene más probablemente por estructuras secundarias rígidas y por las interacciones extensas de sus cadenas laterales. Sin embargo, existe una posibilidad de mecanismos regulatorios diferentes para Chk1 de S. pombe, que pueden reflejar su procedimiento de ciclo celular diferente y mecanismos de reparación del daño en el ADN diferentes. Además, se han identificado las interacciones que estabilizan la conformación activa de la quinasa. La presencia de Glu en muchas regiones bisagra de la quinasa y Arg en la posición P-3 de sus sustratos sugiere un papel general de esta interacción en el mantenimiento de la conformación cerrada de Ser/Thr quinasas. Las interacciones que determinan la especificidad del sustrato peptídico sugieren una secuencia consenso que es útil para identificar potenciales sustratos de Chk1. Finalmente, la estructura del dominio quinasa de Chk1 proporciona una guía para su futura caracterización así como para el diseño de inhibidores específicos que podrían anular el control del punto de control para terapia de cáncer.

9. Actividad enzimática de Chk1

La actividad enzimática de una quinasa se mide por su capacidad de catalizar la transferencia de un resto fosfato desde un nucleósido trifosfato hasta una cadena lateral de un aminoácido en una proteína diana seleccionada. La conversión de ATP a ADP acompaña generalmente la reacción catalítica. En este documento, se utilizó un péptido sustrato sintético, Syntide-2, que tenía una secuencia de aminoácidos PLARTLSVAGLPGKK (SEC ID Nº 11). La producción de ADP a partir de ATP que acompaña a la transferencia de fosfato al sustrato se acopló a la oxidación de NADH usando fosfoenolpiruvato (PEP) por las acciones de la piruvato quinasa (PK) y de la lactato deshidrogenasa (LDH). Se controló la oxidación de NADH siguiendo la disminución de la absorbancia a 340 nm (e340=6,22 cm-1 mM-1) usando un espectrofotómetro HP8452. Las soluciones de reacción típicas contenían: PEP 4 mM, NADH 0,15 mM, 28 unidades de LDH/ml, 16 unidades de PK/ml, DTT 3 mM, Syntide-2 0,125 mM, ATP 0,15 mM y MgCl_{2} 25 mM en TRIS 50 mM pH 7,5; NaCl 400 mM. Los ensayos se iniciaron con 10 nM de dominio quinasa de Chk1, KH289. Se determinaron los valores K_{i} midiendo la actividad inicial de la enzima en presencia de concentraciones variables de inhibidores. Los datos se analizaron usando el software Enzime Kinetic y Kaleidagraph.

La tabla a continuación (Tabla 3) compara tres preparaciones diferentes de Chk1. La primera preparación es la forma de longitud completa, que comprende los aminoácidos 1-476 de la SEC ID Nº 2. La siguiente preparación contiene fragmentos cortados proteolíticamente, una mezcla de fragmentos de proteína Chk1 obtenidos a partir de la proteína de longitud completa durante la fermentación. No se conocen las enzimas exactas implicadas y el sitio de corte generado por estos fragmentos. Sin embargo, el análisis de los fragmentos indicó que uno de ellos era similar en tamaño al 1-289. La tercera preparación es el dominio quinasa de los aminoácidos 1-289 de la SEC ID Nº 2 (KH289). Como se ha mencionado anteriormente, el ensayo usado detecta el producto ADP acoplando las acciones enzimáticas de la piruvato quinasa y la lactato deshidrogenasa.

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TABLA 3

4

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Se realizaron experimentos adicionales de comparación de actividad usando nuevas preparaciones de Chk1 de longitud completa, Chk1 cortada proteolíticamente y dominio quinasa de Chk1. Las condiciones de la preparación fueron como se ha descrito anteriormente. Una vez mas, la preparación cortada era 38 veces más activa que la preparación no cortada.

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Detecciones de alta producción

En los siguientes sustratos se ensayó el contenido en péptidos y la actividad:

TABLA 4 Sustratos peptídicos

5

Como se describe con detalle a continuación, un aspecto de la invención implica un ensayo basado en ELISA no radiactivo adecuado para detección de alta capacidad (HTS). El desarrollo del ensayo HTS de la quinasa Chk1 basado en ELISA comenzó en un principio con un anticuerpo anti-fosfoserina monoclonal llamado Clone PSR-45, suministrado por Sigma. Se sintetizaron nuevos sustratos peptídicos de Chk, análogos de Syntide-2, para validar este ensayo. Estos péptidos se enumeran en la Tabla 4. Se sintetizaron para el desarrollo del ensayo Biotin-Syntide 2 (SEC ID Nº 12), Syntide 2 acetilado en su extremo N-terminal (SEC ID Nº 13) y los productos peptídicos esperados después de la fosforilación de CHK, Syntide 2 fosforilado en una serina (SEC ID Nº 15) y biotin-Syntide 2 fosforilado en una serina (SEC ID Nº 16). Aunque el ensayo funcionó bien en solución con estos péptidos, no funcionó cuando el péptido (Syntide 2 fosforilado en una serina - SEC ID Nº 15) se inmovilizó sobre placas de 96 pocillos DNA BIND (Costar). Este anticuerpo tampoco funcionó bien cuando el péptido marcado con biotina se inmovilizó usando placas de 96 pocillos revestidas con Neutravidina (Pierce). Para salvar estas cuestiones, se cultivó en conejos un anticuerpo policlonal dirigido específicamente contra Syntide-2 fosforilado (SEC ID Nº 15). Se descubrió que el anticuerpo anti-fosfosyntide policlonal de conejo reconocía cuantitativamente y específicamente la fosfoserina tanto en Syntide 2-Ser-PO3 (ensayo sobre placas DNA BIND) o en biotin-Syntide 2-SER-PO3 (ensayado sobre placas de 96 pocillos revestidas con Neutroavidina) cuando se compara con el péptido no fosforilado equivalente. Se desarrolló un ELISA para el ensayo HTS de Chk1 modificado usando quinasa Chk1 KH289 marcada con His, sustrato biotin-syntide ensayado sobre placas de 96 pocillos revestidas con Neutroavidina, y el anticuerpo anti-fosfosyntide de conejo para detectar el producto fosforilado.

Este HTS ELISA de la quinasa Chk1 permitió la exploración robótica de bibliotecas de compuestos. En este documento, se usó la estación robótica Beckman. Primero, se ensayó la quinasa Chk1 en placas de 96 pocillos revestidas con Neutroavidina con 100 \mul/pocillo de mezcla de reacción. La mezcla de reacción comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 10 mM, DTT 3 mM, NaCl 400 mM, ATP 50 \muM, sustrato peptídico biotin-Syntide 2 10 \muM y quinasa Chk1 (KH289) 10 nM. El ensayo se realizó tanto con compuesto de ensayo 20 \muM como sin él. En este documento, el sustrato biotin Syntide 2 tenía la siguiente secuencia: PLARTLSVAGLPGK-biotin-K (SEC ID Nº 12).

El ensayo se describe en la Figura 10. En la etapa A, se añaden 93 \mul de mezcla de reacción (menos la quinasa Chk1 y el biotin-syntide), seguido por la adición de 2 \mul de compuesto de ensayo (20 \muM final). Se inicia la reacción quinasa por la adición de 5 \mul de reserva del sustrato de la enzima (quinasa Chk1 200 nM y biotin-syntide 200 \muM). Se permite que la reacción quinasa transcurra durante 10 minutos a temperatura ambiente (\cong 22ºC) como se muestra en la etapa B. Posteriormente a los 10 minutos de la reacción quinasa se unen a la placa revestida con Neutroavidina tanto el biotin-syntide fosforilado como el no fosforilado. En la etapa C, las placas se lavan con PBS/Tween-20 para terminar la reacción quinasa y para eliminar el biotín-syntide 2 fosforilado o no fosforilado no unido. En la etapa D, las placas se incuban a temperatura ambiente durante 60 minutos con anticuerpo anti-fosfosyntide de conejo (dilución 1:40.000, 100 \mul/pocillo). El anticuerpo anti-fosfosyntide se une específicamente al biotin-syntide 2 fosforilado en una serina. El anticuerpo no unido se elimina con lavados de PBS/Tween-20). Las placas se incuban después a temperatura ambiente durante 60 minutos con anticuerpo de cabra anti IgG de conejo (Fc)-HRP (peroxidasa de rábano rusticante). En la etapa E, las placas se lavan con PBS/Tween para eliminar el anticuerpo secundario no unido. Después, se añaden 100 \mul/pocillo de colorante cromogénico ABTS (sustrato de la HRP). Se deja que se desarrolle el color, resultante de la reacción de HRP, durante 18 minutos. A esto le sigue la medida de la absorbancia a 405 nm en un lector de placas de 96 pocillos. La actividad que la quinasa Chk1 es directamente proporcional a la densidad óptica del color formado.

Todas las referencias citadas en este documento se incorporan como referencia en su totalidad.

Mientras que la invención se ha descrito en conjunción con los ejemplos de la misma, se entiende que la descripción precedente es ejemplar y aclaratoria por naturaleza, y pretende ilustrar la invención y sus realizaciones preferidas. Por la experimentación rutinaria, el técnico reconocerá modificaciones aparentes y variaciones que pueden hacerse sin apartarse del espíritu de la invención. Por lo tanto, la invención pretende definirse no por la descripción anterior, sino por las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.

SEC ID Nº 1 - Chk1 humana de longitud completa (secuencia de nucleótidos - 1933 pares de bases)

SEC ID Nº 2 - Chk1 humana de longitud completa (secuencia peptídica - 476 AA).

SEC ID Nº 3 - Cebador de PCR (chk6w)

SEC ID Nº 4 - Cebador de PCR (KH289)

SEC ID Nº 5 - Cebador de PCR (K289)

SEC ID Nº 6 - Cebador de PCR (Chk11)

SEC ID Nº 7 - Cebador de PCR (K210)

SEC ID Nº 8 - Cebador de PCR (KH210)

SEC ID Nº 9 - Cebador de PCR (K248)

SEC ID Nº 10 - Cebador de PCR (KH248)

SEC ID Nº 11 - Péptido sustrato sintético, Syntide-2

SEC ID Nº 12 - Péptido sustrato sintético, Syntide-3

SEC ID Nº 13 - Péptido sustrato sintético, Syntide-4

SEC ID Nº 14 - Cebador de oligonucleótidos

SEC ID Nº 15 - Syntide-2 fosforilado en una serina

SEC ID Nº 16 - Biotin Syntide-2 fosforilado en una serina

SEC ID Nº 17 - Secuencia peptídica de la proteína fosfatasa Cdc25

SEC ID Nº 18 - Secuencia peptídica del dominio quinasa de la Chk1 de raton (mm)

SEC ID Nº 19 - Secuencia peptídica del dominio quinasa de la Chk1 de Xenopus (xl)

SEC ID Nº 20 - Secuencia peptídica del dominio quinasa de la Chk1 de la mosca de la fruta (dm)

SEC ID Nº 21 - Secuencia peptídica del dominio quinasa de la Chk1 de C. elegans (ce)

SEC ID Nº 22 - Secuencia peptídica del dominio quinasa de la Chk1 de S. cerevisiae (sc)

SEC ID Nº 23 - Secuencia peptídica del dominio quinasa de la Chk1 de S. pombe (sp)

SEC ID Nº 24 - Motivo conservado AQXFFXQL del dominio quinasa de Chk1, hélice aE (restos 107-114).

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> Agouron Pharmaceuticals, Inc.

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<120> Dominio catalítico de la proteína quinasa de punto de control del ciclo celular efectora humana, Chk1, materiales y procedimientos para la identificación de inhibidores de la misma

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<130> 30189

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<150> 60/162.887

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<151> 01-11-1999

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<150> 09/460.421

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<151> 14-12-1999

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<160> 24

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1821

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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6

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<210> 2

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<211> 476

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

7

8

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<210> 3

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador de PCR

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<400> 3

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gagctcagta ccatctatct tttttgatgt ctgg

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34

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<210> 4

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<211> 47

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador de PCR

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<400> 4

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gagctcagtt ggtggtggtg gtggtgtcca ctgggagact ctgacac

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47

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<210> 5

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador de PCR

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<400> 5

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gagctcatcc actgggagac tctgacac

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<210> 6

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador de PCR

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<400> 6

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ccatggagct caagaaaggg gcaaaaagg

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29

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<210> 7

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador de PCR

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<400> 7

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gagctcattg gtcccatggc aattctcc

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<210> 8

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<211> 46

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador de PCR

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<400> 8

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gagctcagtg gtggtggtgg tggtggtggt cccatggcaa ttctcc

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46

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<210> 9

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador de PCR

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<400> 9

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gagctcactc aactaagatt ttatgcagca g

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<210> 10

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<211> 49

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador de PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagctcagtg gtggtggtgg tggtgctcaa ctaagattt atgcagcag

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Leu Ala Arg Thr Leu Ser Val Ala Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Lys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Gly Ala Gly Pro Leu Ala Arg Thr Leu Ser Val Ala Gly Leu}

\sac{Pro Gly Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Leu Ala Arg Thr Leu Ser Val Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gly Ala}

\sac{Gly Ala Gly Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador de oligonucleótidos

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgaataatcc ggcatatgta taggttttt

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Serina fosforilada

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Leu Ala Arg Thr Leu Ser Val Ala Gly Leu Pro Gly Lys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Serina fosforilada

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Leu Ala Arg Thr Leu Ser Val Gly Ala Leu Pro Gly Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 473

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

12

1200

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

13

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 305

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

15

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 299

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> C. elegans

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

17

170

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> S. cerevisiae

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 295

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> S. pombe

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Motivo conservado

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> resto variable

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> resto variable

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Gln Xaa Phe Phe Xaa Gln Leu}

Claims (24)

1. Una composición que comprende un polinucleótido purificado y aislado constituido por las bases 35 a 830 de la Sec. Id. Nº 1.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho polinucleótido codifica la forma activa del dominio quinasa de la Chk1 humana, constituido dicho dominio quinasa de la Chk1 humana activa por los AA1-AA289 de la Sec. Id. Nº 2.

3. Un polipéptido en una forma cristalizada que comprende la forma catalíticamente activa de la quinasa Chk1 humana, en la que la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido consiste en los aminoácidos 1 a 289 de la SEC ID Nº 2.

4. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicho polipéptido comprende además el sitio de unión del inhibidor de la forma catalíticamente activa de la quinasa Chk1 humana.

5. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en las que dicho polipéptido comprende además una señal de seis histidinas en el extremo C-terminal del mismo.

6. Un polipéptido catalíticamente activo, aislado y soluble, que comprende la forma activa del dominio quinasa de la Chk1 humana, en la que dicho polipéptido consiste en los aminoácidos 1 a 289 de la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 2.

7. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende la proteína Chk1 humana de longitud completa que tiene la porción C-terminal de la misma suprimida para producir el dominio quinasa de Chk1 humana en su configuración activa.

8. Un vector de expresión para producir la quinasa Chk1 activa en una célula hospedadora, comprendiendo el vector: un polinucleótido que codifica los AA1-AA289 de la SEC. ID. Nº 2 de la forma activa de la quinasa Chk1 humana; secuencias funcionales regulatorias transcripcionales y traduccionales en dicha célula hospedadora unidas de forma funcional a dicho polinucleótido que codifica la quinasa Chk1 humana; y un marcador seleccionable.

9. El vector de acuerdo con la reivindicación 8 en el que dicho polinucleótido codifica la quinasa Chk1 humana activa, estando constituida dicha quinasa activa por las bases 35 a 830 de la SEC ID Nº 1.

10. El vector de acuerdo con la reivindicación 8 en el que dicho vector se selecciona entre el grupo constituido por pET28a, pAcSG2 y pFastBac.

11. El vector de acuerdo con la reivindicación 8 en la que dicho vector es pFastBac, que comprende un sitio Ndel único en el sitio stent de traducción original para la proteína polihedrina.

12. El vector de acuerdo con la reivindicación 8 en la que dicho marcador seleccionable se selecciona entre el grupo constituido por beta galactosidasa, proteína fluorescente verde y luciferasa.

13. Una célula hospedadora transformada de forma estable y transfectada con un polinucleótido que codifica los AA1-AA289 de la SEC. ID. Nº 2 de la forma activa de la quinasa Chk1 humana de una manera que permite la expresión en dicha célula hospedadora de la quinasa Chk1 humana.

14. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 13, en la que dicho polinucleótido codifica la quinasa hChk1 activa, estando constituida dicha quinasa activa por las bases 35 a 830 de la SEC. ID. Nº 1.

15. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 13 en la que dicho hospedador es E. coli.

16. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 13 en la que dicho hospedador es un baculovirus recombinante.

17. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 13 en la que dicho hospedador es una célula de insecto.

18. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 17 en la que dicha célula de insecto es Sf9.

19. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 13 en la que dicha célula hospedadora se transforma y se transfecta con dicho polinucleótido por medio de un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido; unas secuencias regulatorias transcripcionales y traduccionales funcionales en dicha célula hospedadora unidas de forma funcional a dicho polinucleótido que codifica la quinasa nChk1; y un marcador seleccionable.

20. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 19 en la que dicho vector de expresión se selecciona entre el grupo constituido por pET28a, pAcSG2 y pFastBac.

21. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 19 en la que dicho vector de expresión es pFastBac, que comprende un sitio Ndel único del sitio de comienzo de la traducción original para la proteína polihedrina.

22. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 19 en la que dicho marcador seleccionable se selecciona entre el grupo constituido por beta galactosidasa, proteína fluorescente verde y luciferasa.

23. Un procedimiento para ensayar un compuesto candidato por su capacidad de interactuar con la Chk1 humana que comprende:

(a)

expresar una secuencia de ADN aislada o variantes de la misma que codifican los AA1-AA289 de la SEC. ID. Nº 2 del dominio quinasa de dicha Chk1 humana en un hospedador capaz de producir dicha quinasa en la configuración catalíticamente activa, estando dicha quinasa en una forma que en la que puede ensayarse la interacción de dicha quinasa con dicho compuesto candidato;

(b)

exponer dicha quinasa a dicho compuesto candidato; y

(c)

evaluar la interacción de dicha quinasa con dicho compuesto candidato.

24. Un procedimiento para identificar un inhibidor de la quinasa Chk1 determinando las interacciones de unión entre un compuesto orgánico y el sitio de unión de AA1-AA289 de la SEC. ID. Nº 2 de la quinasa Chk1 en la conformación activa, estando dichos sitios de unión definidos por las coordenadas cristalinas proporcionadas en la Figura 11, comprendiendo dicho procedimiento:

(a)

generar la cavidad de unión definida por el sitio de unión en una pantalla de ordenador;

(b)

generar compuestos con su estructura espacial; y

(c)

ensayar para ver si los compuestos se unen al sitio de unión de Chk1;

en el que aquellos compuestos que se unan al sitio de unión de Chk1 pueden identificarse como inhibidores de Chk1.