DE60030229T2

DE60030229T2 - Katalytische Domäne der menschlichen Effektor Zellzyklus Kontrollpunkt-proteinkinase Chk1, Materialien und Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren davon

Info

Publication number: DE60030229T2
Application number: DE60030229T
Authority: DE
Inventors: Ping San Diego Chen; Keck Graduate Inst. of A.L.S. Chen-Chen Claremont Kan; Chun Irvine Luo; Stephen Escondido Margosiak; Patrick San Diego O'Connor; Anna San Diego Tempczyk-Russel; Binh San Diego Nguyen; Jay Chand San Diego Sarup; Smita San Diego Gaur; Mark Brian Orinda Anderson; Ya-Li San Diego Deng; Karen San Diego Lundgren; James San Diego Register
Original assignee: Agouron Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Agouron Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1999-11-01
Filing date: 2000-10-31
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2020-11-01
Also published as: CA2325228A1; EP1096014A3; EP1096014A2; AU756175B2; ES2270772T3; DE60030229D1; AU756175C; KR100431564B1; EP1096014B1; ATE337401T1; US6670167B1; US20030235899A1; JP2001161387A; KR20010051660A; CA2325228C; AU6807900A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Zellzyklus-Checkpoint- bzw. Kontrollpunkt-Kinasen, welche essentiell für zelluläre DNA-Schädigungsreaktionen und die Koordination des Zellzyklusarrests sind. Die Kontrollpunkt-Kinasen spielen eine Rolle bei der Überwachung und Reaktion auf DNA-Schädigung. Die Schädigung kann von externen oder internen Einflüssen resultieren. Solche Einflüsse beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Fehler in der Replikation, DNA-Basenschädigung, DNA-Strangbrüche, oder Exposition gegenüber Strahlung oder zytotoxischen Chemikalien. Diese Kontrollpunkt-Kinasen sind integral in den regulatorischen Bahnen, die zum Zellzyklusarrest und zur Apoptose, der DNA-Schädigung folgend, führen, wobei der Zelle ein Hinweis und Zeit zur Korrektur der Läsionen vor der Einleitung der Replikation und der Chromosomenteilung gegeben wird. Die vorliegende Erfindung betrifft spezieller die Isolation und Reinigung der katalytischen Domäne der menschlichen Effektorkontrollpunktproteinkinase (hChk1) und deren Verwendung bei der Ermittlung, Identifikation und Charakterisierung von Inhibitoren derselben.
Hintergrund
Das Zellenwachstum, die Teilung und der Tod ist essentiell für den Lebenszyklus von mehrzelligen Organismen. Diese Prozesse bzw. Verfahren und ihre Regulation sind überraschend ähnlich bei allen eukariotischen Spezies. Die somatische Zellteilung besteht aus zwei aufeinander folgenden Prozessen: der DNA-Replikation gefolgt von der Chromosomenseparation. Die Zelle verbringt ihre meiste Zeit mit dem Vorbereiten dieser Ereignisse in einem Wachs tumszyklus (Interphase), welche wiederum aus drei Unterphasen besteht: dem initialem Spalt bzw. Gap (G₁), der Synthese (S), und dem sekundärem Gap (G₂). In G₁ nimmt die Zelle, deren biosynthetische Bahnen während der Mitose verlangsamt wurden, wieder eine hohe Geschwindigkeit der Biosynthese auf. Die S-Phase beginnt, wenn die DNA-Synthese startet und endet, wenn der DNA-Inhalt des Zellkerns sich verdoppelt hat. Die Zelle betritt dann G₂, was andauert, bis die Zelle in die finale Phase der Teilung eintritt, die mitotische (M). Die M-Phase beginnt mit einer Zellkernmembranaufspaltung, Chromosomkondensation und Bildung von zwei identischen Sätzen von Chromosomen, welche in zwei neue Zellkerne separiert werden. Dies wird gefolgt von einer Zellteilung (Zytokinese), in welcher jeder Zellkern in zwei Tochterzellen separiert wird, was die M-Phase abschließt und den Beginn der Interphase der neuen Zellen markiert.
Die Sequenz, in der die Zellzyklusereignisse vonstatten gehen, wird fest reguliert, derart, dass die Initiierung eines Zellzyklusereignisses abhängig von der erfolgreichen Komplettierung des vorherigen Zellzyklusereignisses ist. Das Verfahren der Überwachung der Genomintegrität und der Verhinderung von Zellzyklusfortschritt im Falle einer DNA-Schädigung wurde beschrieben als "Zellzyklus-Kontrollpunkt" (Hartwell, LH et al., Science, 246: 629–634 (1989); Weinert et al., Genes and Dev., 8: 652 (1994). Die Zellzykluskontrollpunkte bestehen aus Signaltransduktionskaskaden, welche eine DNA-Schädigungsdetektion an den Zellzyklusfortschritt koppeln. Kontrollpunkte sind Kontrollsysteme, die den Zellzyklusfortschritt koordinieren durch Beeinflussen der Bildung, Aktivierung und anschließenden Deaktivierung der Zyklin-abhängigen Kinasen. Kontrollpunktenzyme sind verantwortlich für die Aufrechterhaltung der Reihenfolge und Genauigkeit der Ereignisse des Zellzyklus durch Blockieren der Mitose in Antwort auf unreplizierte oder geschädigte DNA. Diese Enzyme verhindern einen Zellzyklusfortschritt zu unpassenden Zeiten, halten die metabolische Balance der Zellen aufrecht, während die Zelle arrestiert bzw. gehemmt wird, und kann in manchen Fällen Apoptose (programmierten Zelltod) induzieren, wenn die Anforderungen des Kontrollpunkts nicht erfüllt wurden (O'Connor, PM, Cancer Surveys, 29, 151–182 (1997); Nurse, P, Cell, 91, 865–867 (1997); Hartwell, LH et al., Science, 266, 1821–1828 (1994); Hartwell, LH et al., Science, 246, (1989), supra).
Eine Serie von Kontrollpunkten überwacht die Integrität des Genoms. Nach dem Spüren einer DNA-Schädigung blocken diese "DNA-Schädigungs-Kontrollpunkte" den Zellzyklusfortschritt in den G₁- und G₂-Phasen und verlangsamen die Progression durch die S-Phase (O'Connor, PM, Cancer Surveys, 29 (1997), supra; Hartwell, LH et al., Science, 266, (1994), supra). Diese Handlung ermöglicht es, dass die DNA-Reparatur vervollständigt wird, bevor die Replikation des Genoms und die anschließende Separation dieses genetischen Materials in eine neue Tochterzelle stattfindet.
Verschiedene Mutationen, assoziiert mit Malignität, betreffen die Fähigkeit der Krebszellen, Kontrollpunkte zu regulieren, was für Zellen mit einer DNA-Schädigung die erhöhte Wahrscheinlichkeit zulässt, das Replizieren fortzusetzen und der schädigungsvermittelten Apoptose zu entkommen. Diese Faktoren tragen zur Genominstabilität bei, welche die genetische Evolution von menschlichen Zellen antreibt und zur Widerstandsfähigkeit von Krebszellen gegenüber der jüngsten Chemotherapie und Radiotherapieintervention beiträgt.
Aufgrund der Abnormitäten in der p53-Tumorsuppressorbahn fehlt es den meisten Krebszellen an einem funktionierenden G₁-Kontrollpunktkontrollsystem. Dies macht sie insbesondere anfällig für eine Außerkraftsetzung der letzten verbleibenden Barriere, die sie vor den krebstötenden Effekten der DNA schädigenden Wirkstoffe schützt: dem G₂-Kontrollpunkt. Der G₂ DNA-Schädigungskontrollpunkt stellt die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit bereit durch Verzögern der Progression in die Mitose in Zellen, die eine Genomschädigung erlitten haben. Der G₂-Kontrollpunkt wird durch Zellzykluskontrollpunktbahnen kontrolliert bzw. gesteuert, die Mitose verhindern, wenn vorherige Ereignisse unvollständig sind oder wenn die DNA geschädigt ist. Dieses Regulationssteuerungssystem wurde bewahrt von der Hefe bis zum Menschen. Wichtig in diesem bewahrten System ist eine Kinase, Chk1 (oder p56Chk1), die Signale vom DNA-Schädigungssensorkomplex umwandelt, um die Aktivierung der Zyklin-B/Cdc2-Kinase zu hemmen, welche den mitotischen Eintritt fördert (Peng, CY et al, Science, 277, 1501–1505 (1997); Sanchez Y, et al., Science, 277, 1497–1501 (1997); Walworth, N et al., Nature, 363(6427), 368–71 (May 27, 1993); al-Khodairy et al., Mol Biol Cell, 5(2): 147–60 (Feb, 1994); Carr et al., CurrBiol., 5(10): 1179–90 (Oct. 1, 1995)). Die Reparaturkontrollpunktkinase Chk1 reguliert Cdc25, eine Phosphatase, die Cdc2 aktiviert. Folglich dient Chk1 als die direkte Verbindung zwischen dem G₂-Kontrollpunkt und der negativen Regulierung von Cdc2.
Für die Inaktivierung von Chk1 hat sich gezeigt, dass sie sowohl den G₂-Arrest außer Kraft setzt, induziert durch DNA-Schädigung, zugefügt entweder durch Antikrebs-Wirkstoffe oder endogene DNA-Schädigung, als auch in einer bevorzugten Tötung der resultierenden kontrollpunktdefekten Zellen resultiert (Nurse, P, Cell, 91, (1997), supra; Weinert, T, Science, 277, 1450–1451 (1997); Walworth, N et al., Nature, 363, (1993) supra; al-Khodairy et al., Molec. Biol. Cell, 5, (1994), supra; Wan, S et al., Yeast, 15(10A), 821–8 (Jul, 1999)).
Die Tatsache, dass sich für Krebszellen ebenfalls gezeigt hat, dass sie verwundbarer gegenüber G₂-Kontrollpunktaußerkraftsetzung sind, hat das Streben nach G₂-Kontrollpunktaußerkraftsetzungswirkstoffen gefördert (Wang, Q et al., PNAS96. 3706–3711 (1999); Fan, S et al., Cancer Res., 55, 1649–1654 (1995); Powell, SN et al., Cancer Res., 55, 1643–1648 (1995); Russell, KJ et al., Cancer Res., 55, 1639–1642 (1995); Wang, Q et al., J Natl Cancer Inst, 88, 956–967 (1996)). Solche Kontrollpunktaußerkraftsetzungsmedikamente könnten das Töten von Tumoren verbessern, die DNA schädigenden Ereignissen ausgesetzt sind, einschließend derer die durch therapeutischen Wirkstoffe, durch hypoxische Belastung induziert aufgrund einer eingeschränkten Blutversorgung (anti-angiogene Wirkstoffe), oder durch endogene DNA-Schädigung, auftretend als eine Folge der für Krebszellen inhärenten Genominstabilität, zugefügt sind. Die selektive Manipulation der Kontrollpunktsteuerung, in Krebszellen kann eine breite Verwendung in chemotherapeutischen und Radiotherapiekrebsbehandlungen erlauben und kann zusätzlich ein allgemeines Kennzeichen bieten, dass menschliche Krebs-"Genominstabilität" als die selektive Basis für die Zerstörung von Krebszellen verwendet wird.
Eine Anzahl von Beweisführungen platzieren Chk1 als Hauptziel in der DNA-Schädigungs-Kontrollpunktsteuerung. Chk1 ist jedoch ein schwierig zu untersuchendes Enzym, da das Pro tein der vollen Länge nicht die aktivste Form der Chk1 ist. Während andere die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der Kontrollpunktkinase vollständiger Länge untersucht und den Ort der Kinasedomäne geschätzt haben, besteht ein Bedarf an der Isolation und Reinigung der Kinasedomäne von Chk1 und der Aufrechterhaltung ihrer katalytisch aktiven Konformation.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erzeugung, kinetische Charakterisierung und Strukturbestimmung der Kinasedomäne des menschlichen Chk1 Proteins ist hierin offenbart. Die Domäne beginnt zwischen den Resten 1 und 16 und endet zwischen den Resten 265 und 291 des Proteins der gesamten Länge [SEQ ID Nr. 2], welche 476 Aminosäuren umfasst. Die Domäne erstreckt sich vorzugsweise von den Resten 1 bis 265, mehr bevorzugt von den Resten 1 bis 289.
Die Erfindung betrifft ein isoliertes gereinigtes Nukleotid, welches die aktive Konformation der menschlichen Chk1 Kinasedomäne codiert. Das Polynukleotid kann natürlich oder rekombinant sein.
Die Erfindung betrifft ferner ein isoliertes lösliches katalytisch aktives Polypeptid, bestehend aus der aktiven Konformation der menschlichen Chk1 Kinasedomäne.
Die Erfindung umfasst sowohl das Polypeptid per se als auch Salze davon. Wie unten im Detail diskutiert wird hierin eine hohe Salzkonzentration (ca. 500 mM) im Puffer verwendet, um die Aggregation des Peptids während der Reinigung und Speicherung zu verhindern.
Die Erfindung betrifft ferner eine Kristallstruktur der menschlichen Chk1 Kinase in der aktiven Konformation, aufgelöst auf zumindest 2,5 Å, vorzugsweise 2,0 Å, mehr bevorzugt 1,7 Å. Diese Struktur stellt eine dreidimensionale Beschreibung des Ziels (menschliche Chk1) für ein strukturbasiertes Design von kleinen Molekülinhibitoren davon als therapeutische Wirkstoffe bereit.
Die Erfindung betrifft ferner einen Expressionsvektor zum Herstellen der katalytisch aktiven menschlichen Chk1 Kinasedomäne in einer Wirtszelle.
Die Erfindung betrifft ferner eine Wirtszelle, stabil transformiert und transfiziert mit einem Polynukleotid, die menschliche Chk1 Kinasedomäne codierend, in einer Art und Weise, die die Expression der menschlichen Chk1 Kinasedomäne in der aktiven Konfiguration erlaubt.
Die vorliegende Erfindung offenbart ferner Verfahren für das Screenen von Kandidatenverbindungen unter Verwendung der molekularen Struktur der Röntgenstrahlenkristallographiedaten, um das Binden der Kandidatenverbindungen zu modellieren.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren für das Designen und Screenen von potentiell therapeutischen Verbindungen für die Behandlung von hyperproliferativen oder auf Proliferation bezogenen Krankheiten bereit, einschließend jedoch nicht beschränkt auf Krebs und HIV Infektion. Die mutmaßlichen Therapeutika können bezüglich Aktivitäten gescreent werden wie beispielsweise (1) Potenzierung der Zytotoxizität DANN-schädigender Wirkstoffe wie beispielsweise synthetische oder natürliche chemotherapeutische Wirkstoffe und ionisierende oder Neutronenbestrahlung; (2) Verbesserung der Zytotoxizität von DNA Syntheseinhibitoren einschließlich Antimetaboliten, DNA Kettenterminatoren oder andere Mechanismen, die zur Hemmung der DNA-Synthese führen würden; (3) Verbesserung der Zytotoxizität von Hypoxie, wie sie innerhalb von Tumoren aufgrund der eingeschränkten Blutversorgung auftreten würde; und (4) Hemmung der Fähigkeit von HIV, den Zellzyklusfortschritt aufzuhalten, wie beispielsweise den durch das VPR Protein induzierten. Verbindungen, die die menschliche Chk1 Kinaseaktivität inhibieren oder den G₂-Kontrollpunkt außer Kraft setzen, können verwendet werden, um die Hyperproliferation, verbunden mit Krebs und HIV, zu behandeln oder zu verhindern.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die Identifizierung von potentiellen Inhibitoren der menschlichen Chk1 Proteinkinase durch de novo Design von neuen Arzneimittelkandidatenmolekülen bereit, die an die menschliche Chk1 Proteinkinase binden und deren Aktivität hemmen, oder die deren Wirksamkeit verbessern. Die hierin offenbarten röntgenkristallographischen Koordinaten erlauben die Erzeugung von dreidimensionalen Modellen der katalytischen Stelle und der Arzneimittelbindungsstelle des menschlichen Chk1 Proteins. Das de novo Design umfasst die Erzeugung von Molekülen über die Verwendung von Computerprogrammen, welche Fragmente oder Atome an eine Stelle bilden und verbinden, basierend auf sterischen und elektrostatischen Komplementaritäten ohne Bezug auf das Substrat unter Strukturen. Das Arzneimitteldesignverfahren beginnt, nachdem die Struktur des Ziels (menschliche Chk1 Kinase) auf zumindest eine Auflösung von 2,5 Å aufgelöst ist. Das Verfeinern der Struktur auf eine Auflösung von 2,0 Å oder besser mit festen Wassermolekülen an Ort und Stelle stellt optimalere Bedingungen für die Unternehmung von Arzneimitteldesign bereit.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren für das computergestützte Modellieren der Kinasedomäne der menschlichen Chk1 bereit, wie beispielsweise ein Modell, das nützlich beim Design von Verbindungen ist, die mit dieser Domäne interagieren. Das Verfahren bezieht das Kristallisieren der Chk1 Kinase in der katalytisch aktiven Konfiguration; das Auflösen der Röntgenstruktur der aktiven Kinase, insbesondere der Kinasedomäne und der Bindungsstelle der aktiven Chk1; und das Anwenden der Daten, die vom Auflösen der Röntgenstruktur erzeugt wurden, auf einen Computeralgorithmus, der in der Lage ist, ein dreidimensionales Modell der Kinasedomäne und der Bindungsstelle zu erzeugen, geeignet für die Verwendung beim Designen von Molekülen, die als Agonisten oder Antagonisten bezüglich des Polypeptids agieren werden, ein. Ein iteratives Verfahren kann dann auf verschiedene molekulare Strukturen unter Verwendung des computererzeugten Modells angewendet werden, um potentielle Agonisten oder Antagonisten bezüglich der Chk1 Kinase zu identifizieren. Inhibitoren der Kinase können als Lead-Komponenten für das Design von potentiellen therapeutischen Verbindungen für die Behandlung von Krankheiten oder Störungen in Verbindung mit Hyperproliferation oder bezogen auf Proliferation, wie beispielsweise Krebs oder HIV, dienen.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit, bei dem die menschliche Chk1 Proteinkinase durch die Deletion des C-Terminalabschnitts des Proteins modifiziert wird, um gewünschte physikalische Charakteristiken des resultierenden Polypeptids zu verleihen. Die Kinasedomäne ist geeignet für die Analyse durch Kernspinresonanz, Hochdurchsatzscreening, biochemische Charakterisierungen, Röntgenkristallographie, Colorimetrie und andere diagnostische Mittel. Die am meisten bevorzugten Deletionsfragmente erstrecken sich von Rest 1 bis Rest 289.
Die Erfindung stellt ferner Screeningverfahren für die Verwendung in Arzneimitteldesignverfahren von potentiellen Wirkstoffen bezüglich der menschlichen Chk1 Proteinkinase durch das de novo Design von neuen Arzneimittelkandidatenmolekülen mit potentiell nanomolaren Potenzen bzw. Wirksamkeiten bereit. Die offenbarten röntgenkristallographischen Koordinanten, basierend auf der Kinasedomäne des menschlichen Chk1 Proteins, werden die Erzeugung von dreidimensionalen Modellen der aktiven Bindungsstellen des menschlichen Chk1 Proteins erlauben.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren für das schnelle Screenen von Verbindungen bereit, um jene Verbindungen zu identifizieren, die die Chk1 Kinase oder die Kernstruktur hemmen, für das weitere Chk1-Inhibitordesign. Der Hochdurchsatzscreening-Assay ist in der Lage, auf Roboterarbeitsstationen vollautomatisiert zu werden. Der Assay kann radioaktiv sein. In einer bevorzugten Ausführungsform jedoch ist der Assay ein nicht radioaktiver ELISA. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist der Assay ein ELISA, der einen neuen Antikörper, Kaninchen-Antiphosphosyntid, verwendet, um speziell das Produkt der Chk1 Kinasereaktion zu detektieren, in welcher Biotin-Syntid das Substrat ist. Die Basis des Assay jedoch beinhaltet die Fähigkeit, andere Substrate zu verwenden, die für Anti-Phospho-Peptid-/Proteinantikörper detektierbar sind. Der Assay kann verwendet werden, um große Sammlungen von Verbindungsbibliotheken zu screenen, um Chk1 Inhibitoren und potentielle Lead-Verbindungen für die Entwicklung von Chk1 Kinase-selektiven Antikrebsverbindungen zu ermitteln. Der Assay findet Verwendung beim Screening von anderen Syntid-Substrat-Kinasereaktionen, die Kinasen von analoger Aktivität zu Chk1 involvieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines Chk1 Kinaseinhibitors durch Bestimmen der Bindungsinteraktionen zwischen einer organischen Verbindung und der Bindungsstelle der Chk1 Kinase in der aktiven Konformation bereit, wobei die aktive menschliche Chk1 Kinasedomäne aus AA1 bis AA289 besteht, wobei die Bindungsstellen durch die in 11 bereitgestellten Kristallkoordinaten definiert sind, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Erzeugen der Bindungskavität, definiert durch die Bindungsstelle, auf einem Computerbildschirm;
(b) Erzeugen von Verbindungen mit deren räumlicher Struktur; und
(c) Prüfen, um zu sehen, ob die Verbindungen an der Chk1 Bindungsstelle binden; wobei jene Verbindungen, die an die Chk1 Bindungsstelle binden, als Chk1 Inhibitoren identifiziert werden können.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Der G₂-DNA-Schädigungskontrollpunktmechanismus in Spalthefe (Furnari et al., Science, 277: 1405–1497 (Sep. 5, 1997)).
2. Sequenzanordnung der Chk1 Kinasedomänen des Menschen (hs) (SEQ ID Nr: 2), Maus (mm) (SEQ ID Nr: 18), Xenopus (xl) (SEQ ID Nr: 19), Fruchtfliege (dm) (SEQ ID Nr: 20), C. Elegans (ce) (SEQ ID Nr: 21), S. Cerevisiae (sc) (SEQ ID Nr: 22), und S. Pombe (sp) (SEQ ID Nr: 23). Sekundäre Strukturelemente der menschlichen Chk1 sind oberhalb der Anordnung gezeigt. Die Nummern der Aminosäuren sind auf der rechten Seite gezeigt. Invariante Reste unter diesen Spezies sind in rot und menschliche Chk1 Reste, die auch in anderen Spezies erhalten werden, sind in cyan.
3. Das Homologiemodell der Chk1 Kinase, zeigend die Aktivierungsschleife und ihre Beziehung zur katalytischen Schleife und der C-Helix. Die Chk1-N- und C-terminalen Lobes bzw. Lappen sind gezeigt. Die zur Chk1-C-Helix korrespondierenden Fragmente sind die Reste 50 bis 58; die katalytische Schleife der Chk1 sind die Reste 129 bis 132; und die Aktivierungsschleife der Chk1 sind die Reste 148 bis 170.
4. Das Reinigungsschema für die Chk1 Kinasedomäne 1 bis 289.
5. Die Struktur der menschlichen Chk1 Kinasedomäne, identifiziert unter Verwendung des Kristalls, aufgelöst auf 1,7 Å. Ein Banddiagramm der binären Komplexstruktur des Chk1 mit AMP-PNP, zeigend die sekundären strukturellen Elemente und die im Text diskutierten Schleifen. Die α-Helices sind in Blau gezeigt, die β-Stränge in Cyan, die katalytische Schleife in Orange, die Aktivierungsschleife in Rot. Das AMP-PNP und das Sulfation sind als Ball- und Stift-Modelle gezeigt. Die Termini sind mit N und C bezeichnet.
6. Katalytische Stelle der Chk1. Querschnitt der katalytischen Stelle der menschlichen Chk1 mit AMP-PNP. Die Protein-C-α-Banddarstellungen sind in Violett für Chk1 gezeigt. Die Seitenketten der Reste der katalytischen Stelle sind als Ball- und Stift-Modelle gezeigt und sind nach Atomtyp farbcodiert: Kohlenstoff, grün; Stickstoff, blau; Sauerstoff, rot. Die Distanzen (Å) unter den gepunkteten Linien zwischen den Resten der katalytischen Stelle sind gezeigt.
7. Molekulare Oberfläche der Chk1 mit modelliertem CDC25C-Peptid. Die molekulare Oberfläche der Chk1 ist wie folgt eingefärbt: basische Seitenketten sind in Blau gezeigt, saure Seitenketten in Rot und nichtpolare Seitenketten in Violett. Das CDC25C-Peptid (Reste 211 bis 219) ist als Stäbchenmodell gezeigt und nach Atomtyp farbcodiert: Kohlenstoff, grün; Stickstoff, blau; Sauerstoff, rot; Schwefel, gelb.
8. Stereoansicht einer repräsentativen Elektronendichtekarte. 8A zeigt eine Stereoansicht eines repräsentativen Abschnitts der experimentellen Dichte bei 1,5 Å, berechnet auf 3,0 Å, mit der Verwendung von Phasen nach Flüssigkeitsverringerung übergelagert über die Dichte ist das letztendliche verfeinerte Modell. 8B zeigt eine Differenz-Fourierkarte, berechnet mit nativen modellabgeleiteten Phasen und Koeffizienten |FO(AMP-PNP)| – |FO(nativ/apoenzym)| auf die Diffraktion von 1,7 Å und umrissen bei 2,5 Å. Der Triphosphatrest des AMP-PNP ist ungeordnet und vom Modell ausgelassen. Keine Mg²⁺ Ionen wurden beobachtet.
9. Darstellung der Chk1-Bindungsstellen, zeigend insbesondere die Spezifizitätsausbuchtung, die ATP Bindungsstelle und das Donor-Akzeptor-Donor-Bindungsmotiv.
10. Das Hochdurchsatz ELISA-Protokoll.
11. Die Chk1 Kristallkoordinaten für das APO Enzym (isolierte aktive Chk1 – 11A) und der Binärkomplex Chk1 komplexiert mit AMP-PNP, einem ATP-Analogon – 11B), einschließend die Koordinaten der festen Wassermoleküle.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Eine DNA Schädigung induziert den Arrest bzw. die Hemmung des Zellzyklus beim G₂-Kontrollpunkt. Der G₂-DNA-Schädigungskontrollpunkt stellt die Aufrechterhaltung der Zellenlebensfähigkeit durch Verzögern der Progression in die Mitose in Zellen sicher, welche eine Genschädigung erlitten haben. Der G₂-Kontrollpunkt wird gesteuert durch Zellzykluskontrollpunktbahnen, welche ausgiebig untersucht wurden (Hartwell, LH et al., Science, 246 (1989), supra; Nurse, P et al., Nat Med, 4(10): 1103–6 (Oct 1998); Peng et al., Science, 277, (1997), supra; Furnari et al., Science, 277: 1495–1497 (Sep. 5, 1997); Zeng et al., Nature 395 (6701): 507–510 (Oct. 1, 1998); Martinho et al., EMBOJ, 17(24): 7239–49 (Dec. 15, 1998); Nakajo et al., Dev. Biol. 207(2): 432–44 (Mar. 15, 1999); Carr et al., CurrBiol., 5 (1995), supra). Das Modell des Kontrollpunktmechanismus in Spalthefe ist in 1, Furnari et al., Science, (1997), supra, gezeigt. Wie oben erwähnt ist das Regulationssteuerungssystem hochgradig von der Hefe zu Menschen bewahrt.
Eine DNA-Schädigung aktiviert die Kontrollpunktbahn durch Inhibieren der Dephosphorylierung der mitotischen Kinase Cdc2 am Tyrosion-15-Rest [Cdc2(Y¹⁵-PO₄)], wobei ihre mitotische initiierende Aktivität inhibiert wird und der Zellzyklus gehemmt wird. Dieser Prozess wird als inhibitorische Phosphorylierung bezeichnet. Damit die Mitose fortschreitet muss das Cdc2 die phosphoryliert werden, wobei es zu seiner aktiven Form zurückkehrt. Phosphoryliertes Cdc2 ist das Substrat von Cdc25. Cdc25 ist eine Dualspezifizitätproteinphosphatase, die den Eintritt in die Mitose durch Dephosphorylieren der Proteinkinase Cdc2 steuert. In Spalthefe resultiert eine DNA-Schädigung auch in der Aktivierung von Rad3, einer Kinase, die in Beziehung zu ATM/ATD-Proteinen steht. Rad3 initiiert die Chk1 Antwort; die Phosphorylierung von Chk1 ist ein Rad3 abhängiger Prozess (Martinho et al., EMBO J, 17 (1998), supra; Furnari et al, Science, 277 (1997), supra). Phosphorylierte (aktive) Chk1 phosphoryliert den mitotischen Inducer Cdc25 am Serin-216-Rest des menschlichen Cdc25 [Cdc25(S²¹⁶-PO₄)]. Die Phosphorylierung von Cdc25 inhibiert die Funktion der Phosphatase in der Dephosphorylierung von Cdc2, ein Ereignis, das für das Fortschreiten der Mitose erforderlich ist. Während der gesamten Interphase, jedoch nicht in der Mitose, wird Cdc25 beim Serin-216-Rest phosphoryliert und an Mitglieder der hochkonservierten und überall exprimierten Familie der 14-3-3-Proteine gebunden. Die Verhinderung der Serin-216-Phosphorylierung verhindert das 14-3-3-Binden, was das mitotische Timing stört und Zellen erlaubt, der G₂-Kontrollpunkt-Hemmung zu entkommen, induziert durch entweder unreplizierte DNA oder strahlungsinduzierte Schädigung.
Eine Mehrheit der gegenwärtig akzeptierten Krebsbehandlungen involviert die Induktion einer DNA-Schädigung, einschließend die Verabreichung von Antikrebsmitteln, chemotherapeutischen Mitteln und Strahlungstherapie. Krebszellen werden häufig resistent gegenüber solchen Therapien. Es wird vermutet, dass eine solche Resistenz in Bezug auf die angeborene Fähigkeit der Krebszellen steht, die induzierte Schädigung zu hemmen und zu reparieren. Wenn die Krebszelle nicht in der Lage wäre, zu hemmen und zu reparieren, würde die Mitose mit der intakten DNA-Schädigung fortschreiten. Das spätere Ergebnis wäre vermutlich ein Zelltod als ein Ergebnis der DNA-Schädigung.
Behandlungen, die einen Mechanismus für die Außerkraftsetzung der endogenen Kontrollpunktbahn und ein Reparaturverfahren beinhalten, würden vermutlich effektiver beim Töten von Krebszellen sein. Da vielen Krebszellen bereits ein G₁-Kontrollpunktsteuerungssystem fehlt, würde eine Therapie, die die Inhibition des G₂-Kontrollpunkt einschließen würde, vermutlich die Krebszellen dazu zwingen, durch die Mitose ohne Feedbackhemmung und Reparaturverfahren fortzuschreiten. Folglich ist ein klarer Nutzen für die Inhibition der Aktivität von Chk1, einer Hauptkinase in der G₂-Kontrollpunktbahn, gegeben. Da viele derselben Ereignisse, die die G₂-Hemmung nach einer DNA-Schädigung hemmen, auch die S-Phasenverzögerung, einer DNA-Schädigung folgend, regulieren, findet die Inhibition von Chk1 auch einen Nutzen in der Regulation der S-Phase.
Die menschliche Chk1 Sequenz der Aminosäuren 1 bis 476 ist verfügbar von GenBank. Die gesamte Länge oder Segmente der menschlichen Chk1 cDNA, korrespondierend zu Codon 1–427, 1–265 und 1–289, wurden separat durch PCR verstärkt. Jedes wurde an seinem 3'-Ende mit 6 Histidincodoneinheiten markiert und in ein Expressionsplasmid für die Proteinproduktion mittels eines Baculovirus/Insektenzellenexpressionssystems kloniert. Das Protein wurde in Hi-5-Insektenzellen exprimiert und durch eine Kombination von Ionenaustausch und Affinitätssäulenchromatographie gereinigt. Es wurde festgestellt, dass eine hohe Konzentration an Salz (~500 mM-Niveaus) benötigt wurden, um zu verhindern, dass die gereinigte Chk1 Kinasedomäne ein Präzipitat bildet.
Die Kinaseaktivität der hChk1 wurde bestimmt durch Überwachen der ADP Produktion durch enzymatische Handlungen von Pyrovat Kinase und Lactat-Dehydrogenase. Die Chk1 Kinasedomäne, die die Aminosäuren 1 bis 289 enthält, zeigte eine höhere enzymatische Aktivität als das Protein der gesamten Länge. Anders als die anderen Formen von Chk1, für welche es sich als schwierig erwiesen hat, damit zu arbeiten (isolieren, reinigen, kristallisieren etc.), erleichterte die 1 bis 289-Kinasedomänenform des menschlichen Chk1-Enzyms die Kristallographie, die Enzymcharakterisierung und das Hochdurchsatzscreening von Inhibitoren. Insbesondere wurde die Chk1 Kinasedomäne zur Bestimmung ihrer dreidimensionalen Struktur verwendet, was eine einzigartige strukturelle Information für das Inhibitordesign für die therapeutische Entwicklung bereitstellt.
Wie hierin verwendet bezieht sich die Abkürzung "hChk1" auf das Polynukleotid, das die menschliche Effektor-Kontrollpunkt-Kinase codiert, als DNA-Schädigungs/Replikationskontrollpunktkinase dienend. Die Nukleinsäuresequenz des Polynukleotids, die das Protein der menschlichen Chk1 in voller Länge codiert, wurde in Science von Sanchez et al. (Science 277 (5331): 1497–1501 (1997)) publiziert und in GenBank am 9. September 1997 (AF016582) publiziert. Die darin beschriebene Nukleinsäuresequenz wird hierin bereitgestellt, gezeigt in SEQ ID Nr: 1. Die korrespondierende Peptidsequenz des Proteins der vollständigen Länge bzw. des Volllängenproteins ist hierin bereitgestellt, gezeigt in SEQ ID Nr: 2. Diese Peptidsequenz wurde an GenBank übermittelt durch Flaggs et al. am 3. November 1997 und am 13. Dezember 1997 (AF032874) freigegeben. Die Proteinkinase wurde ferner von Flaggs et al. in Current Biology beschrieben (Curr. Biol. 7(12): 977 bis 986, (1977)).
Unter Verwendung von Homologiewerkzeugen, um die Nukleotid- und Peptidsequenz der Chk1 zu untersuchen, haben Wissenschaftler versucht, den Ort der Kinasedomäne zu schätzen. Der exakte Ort der katalytischen Kinasedomäne war jedoch schwer experimentell zu bestimmen, in erster Linie, da niemand jemals das Isolieren der Kinasedomäne in ihrer aktiven Konfiguration berichtet hat. Frühere Publikationen haben angedeutet, dass sich die Kinasedomäne von AA16 bis AA264 erstreckt (WO99/111795, veröffentlicht am 11. März 1999, auf Seite 7, Zeile 3) von SEQ ID NR: 2.
Wir haben festgestellt, dass die katalytische Kinasedomäne zwischen AA1 und 16 beginnt und zwischen AA265 und AA291 von SEQ ID NR: 2 endet. Wir haben ferner ermittelt, dass die vektorgetriebene Proteinausbeute dramatisch gesteigert wird, wenn ein Fragment verwendet wird, das sich von AA1 bis AA289 (genannt KH289) erstreckt.
Es existieren 22 bekannte Aminosäuren, jedoch 64 mögliche Permutationen von Nukleinsäuretriplets, genannt "Codone". Viele Aminosäuren werden spezifiziert durch mehr als ein Codon, ein Phänomen, das Degeneriertheit genannt wird. Aufgrund der Degeneriertheit des ge netischen Codes gibt es viele funktionell äquivalente Nukleinsäuresequenzen, die dasselbe Protein codieren können. Die in SEQ ID NR: 2 dargestellte aktive menschliche Chk1 Kinase kann klar durch mehrere Nukleotidsequenzen codiert werden und ist nicht beschränkt auf die cDNA Sequenz, die in SEQ ID NR: 1 dargestellt ist. Beispielsweise codieren sowohl UUU als auch UUC für ein Phenylanalin, während Serin durch UCU, UCC, UCA, UCG, AGU und AGC codiert wird [Molecular Biology of the Gerte, vierte Ausgabe, Watson, J. D. et al., Herausgeber (1987) auf Seiten 437 bis 438]. Funktionell äquivalente Sequenzen können leicht hergestellt werden unter Verwendung bekannter Verfahren wie beispielsweise modifizierte Starter-PCR, ortsdirigierte Mutagenese und chemische Synthese. Derartige funktionale Äquivalente liegen innerhalb des Bereichs dieser Erfindung.
In den Beispielen der vorliegenden Erfindung wird die Volllängenform der menschlichen Chk1 Proteinkinase (AA1-476) als KH476 bezeichnet. Fragmente davon werden identifiziert durch die Aminosäuresequenz. Beispielsweise wird die menschliche Chk1 Kinasedomäne (AA1-289) als KH289 bezeichnet. Andere Kinasedomänensequenzen werden mittels Aminosäurennummerierung in einer ähnlichen Art und Weise bezeichnet.
A. Peptide, Proteine und Antikörper
Wie hierin verwendet beziehen sich die Begriffe "Kinase" und "Proteinkinase" auf Enzyme, die den Transfer eines Phosphatrestes von einem Nukleosidtriphosphat auf eine Aminosäureseitenkette in ausgewählten Zielen katalysieren. Die kovalente Phosphorylierung wiederum reguliert die Aktivität des Zielproteins. Zusätzlich agiert die Phosphorylierung häufig als das Signal, das ein spezielles Verfahren oder Reaktion auslöst, was einen integralen Teil in zellulären Regulations- und Steuerungsmechanismen spielt. Klar kann eine ungeeignete oder unregulierte Phosphorylierung in Fehlern in der Zellensignalisierung und den assoziierten Zellzyklus- und Regulationsprozessen resultieren. Die meisten Proteinkinasen sind hochgradig substratspezifisch.
Wie hierin verwendet wird ein Peptid als "isoliert" oder "gereinigt" bezeichnet, wenn es im Wesentlichen frei von homologem zellulären Material oder chemischen Vorläufern bzw. Precursorn oder anderen Chemikalien ist. Die Peptide der vorliegenden Erfindung können auf Homogenität oder andere Reinheitsgrade gereinigt werden. Der Grad der Reinigung wird auf der beabsichtigten Verwendung basieren.
In manchen Verwendungen beinhaltet "im Wesentlichen frei von zellulärem Material" Präparationen des Peptids mit weniger als ca. 30% (an Trockengewicht) anderer Proteine (d. h. kontaminierendes Protein), weniger als 20% andere Proteine, weniger als 10% andere Proteine oder weniger als ca. 5% andere Proteine. Wenn das Peptid rekombinant hergestellt wird, kann es auch im Wesentlichen frei von Kulturmedium sein, d. h. Kulturmedium repräsentiert weniger als ca. 20% des Volumens der Proteinpräparation.
Der Ausdruck "im Wesentlichen frei von chemikalischen Precursorn und anderen Chemikalien" beinhaltet Präparationen des Peptids, in welchen es getrennt von chemischen Recursorn und anderen Chemikalien ist, die in seine Synthese involviert sind. In einer Ausführungsform beinhaltet der Begriff "im Wesentlichen frei von chemischen Precursorn oder anderen Chemikalien" Präparationen des Kinasepeptids mit weniger als ca. 30% (an Trockengewicht) chemischen Precursorn oder anderen Chemikalien, vorzugsweise weniger als ca. 20% chemischen Precursorn oder anderen Chemikalien, mehr bevorzugt weniger als ca. 10% chemischen Precursorn oder anderen Chemikalien oder am meisten bevorzugt weniger als ca. 5% chemischen Precursorn oder anderen Chemikalien.
Die hierin beschriebene isolierte Kinase kann gereinigt werden von Zellen, die sie natürlich exprimieren, gereinigt werden von Zellen, die verändert wurden, um sie zu exprimieren (Rekombination), oder synthetisiert werden unter Verwendung von bekannten Proteinsynthesemethoden. Beispielsweise wird ein Nukleinsäuremolekül, das die Proteinkinase codiert, in einen Expressionsvektor geklont, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle eingeführt und das Protein in der Wirtszelle exprimiert. Das Protein kann dann von den Zellen durch ein geeignetes Reinigungsschema unter Verwendung von Standardproteinreinigungstechniken isoliert werden. Viele dieser Techniken sind im Detail unten beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner katalytisch aktive Varianten der Peptide der vorliegenden Erfindung wie beispielsweise Allelen-/Sequenzvarianten der Peptide, nicht natürlich auftretende rekombinant abgeleitete Varianten der Peptide, und Orthologe und Paraloge der Peptide bereit. Solche Varianten können hergestellt werden unter Verwendung von Techniken, die Fachleuten im Gebiet der rekombinanten Nukleinsäuretechnologie und Proteinbiochemie bekannt sind.
Solche Varianten können leicht identifiziert/hergestellt werden mittels molekularer Techniken und die hierin offenbarten Sequenzinformationen. Ferner können solche Varianten leicht von anderen Peptiden unterschieden werden, basierend auf der Sequenz- und/oder Strukturhomologie zu den Peptiden der vorliegenden Erfindung. Der Grad der Homologie/Identität, der vorhanden ist, wird primär darauf basieren, ob das Peptid eine funktionale (aktive) Variante oder eine nichtfunktionale (inaktive) Variante ist, dem Grad der Divergenz, vorhanden in der Paralog-Familie, und der evolutorischen Distanz zwischen den Orthologen.
Um die prozentuale Identität von zwei Aminosäuresequenzen oder zwei Nukleinsäuresequenzen zu bestimmen, werden die Sequenzen für optimale Vergleichszwecke angeordnet (z. B. Lücken bzw. Gaps können eingeführt werden in eine oder beide einer ersten und einer zweiten Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz für die optimale Anordnung, und nicht homologe Sequenzen können zu Vergleichszwecken außer Acht gelassen werden). In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Länge einer Referenzsequenz, angeordnet für Vergleichszwecke, zumindest 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% oder mehr der Länge der Referenzsequenz. Die Aminosäurereste oder Nukleotide an korrespondierenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in der ersten Sequenz durch denselben Aminosäurerest oder dasselbe Nukleotid wie die korrespondierende Position in der zweiten Sequenz besetzt ist, dann sind die Moleküle an dieser Position identisch (wie hierin verwendet ist eine Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Identität" äquivalent zu Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Homologie"). Die prozentuale Identität zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl der identischen Positionen, wobei die Anzahl an Lü cken und die Länge von jeder Lücke, die für eine optimale Anordnung der zwei Sequenzen eingeführt werden müssen, berücksichtigt wird.
Der Vergleich von Sequenzen und die Bestimmung der prozentualen Identität oder Gleichheit zwischen zwei Sequenzen kann bewerkstelligt werden unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus. (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Herausg., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Herausg., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Herausg., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; und Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., Herausg., M Stockton Press, New York, 1991). In einer bevorzugten Ausführungsform wird die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444–453 (1970)) -Algorithmus bestimmt, der in kommerziell erhältliche Computerprogramme wie beispielsweise GAP im GCG-Softwarepaket eingearbeitet wurde, verwendend entweder eine Blossom 62-Matrix oder eine PAM250-Matrix sowie ein Spaltgewicht von 16, 14, 12, 10, 8, 6 oder 4 und einem Längengewicht von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann die prozentuale Identität zwischen zwei Nukleotidsequenzen bestimmt werden unter Verwendung der kommerziell erhältlichen Computerprogramme einschließend das GAP-Programm im GCG-Softwarepaket (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Res. 12(1): 387 (1984)), der NWS-Lücken-DNA-CMP-Matrix und einer Lückengewichtung von 40, 50, 60, 70 oder 80 und einer Längengewichtung von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6. In einer weiteren Ausführungsform wird die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen bestimmt unter Verwendung des Algorithmus von E. Meyers und W. Miller (CABIOS, 4: 11–17 (1998)), was in kommerziell erhältliche Computerprogramme wie beispielsweise ALIGN (Version 2.0) eingearbeitet wurde, verwendend eine PAM120-Gewichtsresttabelle, einen Lückenlängennachteil von 12 und einen Lückennachteil von 4.
Die Nukleinsäure- und Proteinsequenzen der vorliegenden Erfindung können ferner verwendet werden als eine "Abfragesequenz" um eine Suche gegenüber Sequenzdatenbanken durch zuführen, um beispielsweise andere Familienmitglieder oder verwandte Sequenzen zu identifizieren. Solche Suchanfragen können durchgeführt werden mittels kommerziell erhältlicher Suchmaschinen wie beispielsweise den NBLAST- und XBLAST-Programmen (Version 2.0) von Altschul, et al. (J. Mol. Biol. 215: 403–10 (1990)). Nukleotidsuchanfragen können durchgeführt werden mit solchen Programmen, um Nukleotidsequenzen zu erhalten, homolog zu den Nukleinsäuremolekülen der Erfindung. Proteinsuchanfragen können durchgeführt werden mit solchen Programmen, um Aminosäuresequenzen zu erzielen, homolog zu den Proteinen der Erfindung. Um mit Lücken versehene Anordnungen zu Vergleichszwecken zu erhalten, kann Gapped BLAST verwendet werden, wie beschrieben in Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25(17): 3389–3402 (1997)).
Volllängenklone, umfassend eines der Peptide der vorliegenden Erfindung, können leicht identifiziert werden als die vollständige Sequenzidentität mit einer der Kinasen der vorliegenden Erfindung aufweisend sowie durch denselben genetischen Ort wie die hierin bereitgestellte Kinase codiert.
Allelenvarianten eines Peptids können einfach identifiziert werden als einen hohen Grad (signifikant) an Sequenzhomologie/-Identität mit zumindest einem Teil des Peptids aufweisend sowie durch denselben genetischen Ort wie das hierin bereitgestellte Kinasepeptid codiert. Wie hierin verwendet weisen zwei Proteine (oder ein Bereich der Proteine) eine signifikante Homologie auf, wenn die Aminosäuresequenzen typischerweise zumindest 70 bis 75%, 80 bis 85% und typischer zumindest 90 bis 95% oder mehr homolog sind. Eine signifikant homologe Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung wird codiert werden durch eine Nukleinsäuresequenz, die zu einem peptidcodierenden Nukleinsäuremolekül unter stringenten Bedingungen hybridisieren wird, wie unten vollständiger beschrieben wird.
Paraloge eines Peptids können leicht identifiziert werden als einen gewissen Grad einer signifikanten Sequenzhomologie/-Identität zu zumindest einem Teil des Kinasepeptids aufweisend, wie von einem Gen von Drosophila codiert, und eine ähnliche Aktivität oder Funktion aufweisend. Zwei Proteine werden typischerweise als Paraloge erachtet, wenn die Aminosäure sequenzen typischerweise bei zumindest ca. 70 bis 75%, 80 bis 85% und typischer bei zumindest ca. 90 bis 95% oder mehr über eine gegebene Region oder Domäne homolog sind. Solche Paralogen werden codiert werden durch eine Nukleinsäuresequenz, die zu einem kinasepeptidcodierenden Nukleinsäuremolekül hybridisieren wird unter stringenten Bedingungen, wie unten vollständiger beschrieben.
Orthologe eines Kinasepeptids können einfach identifiziert werden als einen gewissen Grad einer signifikanten Sequenzhomologie/-Identität zu zumindest einem Teil des Kinasepeptids aufweisend sowie als durch ein Gen von einem anderen Organismus codiert. Bevorzugte Orthologe werden isoliert von Säugetieren, vorzugsweise dem Menschen, für die Entwicklung von menschlichen therapeutischen Targets bzw. Zielen und Wirkstoffen, oder anderen Wirbellosen, insbesondere Insekten von ökonomischer/landwirtschaftlicher Bedeutung, z. B. Mitgliedern der Lepidopteran- und Coleopteran-Ordnungen für die Entwicklung von Insektiziden und insektenvernichtenden Zielen. Solche Orthologe werden codiert werden durch eine Nukleinsäuresequenz, die zu einem kinasepeptidcodierenden Nukleinsäuremolekül hybridisieren wird unter moderaten bis stringenten Bedingungen, wie unten vollständiger beschrieben wird, in Abhängigkeit vom Grad der Bezogenheit der zwei Organismen, die die Proteine ergeben.
Nicht natürlich auftretende Varianten der Kinasen der vorliegenden Erfindung können leicht erzeugt werden unter Verwendung von rekombinanten Techniken. Solche Varianten beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf Deletionen, Additionen und Substitutionen in der Aminosäuresequenz der Kinase. Beispielsweise wird eine Klasse an Substitutionen eine Aminosäuresubstitution erhalten. Solche Substitutionen sind jene, die eine gegebene Aminosäure in einem Kinasepeptid durch eine weitere Aminosäure von ähnlichen Charakteristiken substitutieren. Typischerweise gesehen als konservative Substitutionen sind die Ersetzungen, eines für das andere, unter den aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile; der Austausch der Hydroxylreste Ser und Thr; der Austausch der Säurereste Asp und Glu; die Substitution zwischen den Aminoresten Asn und Gln; der Austausch der basischen Reste Lys und Arg; und Ersetzungen unter den aromatischen Resten Phe und Tyr. Anleitungen betreffend welche Aminosäureänderungen wahrscheinlich phenotypisch still sind, werden gefunden in Bowie et al., Science 247: 1306 bis 1310 (1990).
Variante Kinasen können vollständig funktional sein oder es kann eine Funktion in einer oder mehreren Aktivitäten fehlen. Vollfunktionale Varianten enthalten typischerweise nur konservative Variationen oder Variationen in nichtkritischen Resten oder in nichtkritischen Regionen. Funktionale Varianten können auch eine Substitution von ähnlichen Aminosäuren enthalten, welche in keiner Änderung oder einer nicht signifikanten Änderung in der Funktion resultieren. Alternativ können solche Substitutionen die Funktion positiv oder negativ zu einem gewissen Grad beeinflussen.
Nichtfunktionale Varianten enthalten typischerweise eine oder mehrere nichtkonservative Aminosäuresubstitutionen, -deletionen, -insertionen, -inversionen oder -trunkierungen oder eine Substition, Insertion, Inversion oder Deletion in einem kritischen Rest oder einer kritischen Region.
Aminosäuren, die für die Funktion essentiell sind, können identifiziert werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren wie beispielsweise Orts-dirigierte Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham et al, Science 244: 1081 bis 1085 (1989)). Das letztere Verfahren führt einzelne Alaninmutationen an jedem Rest im Molekül ein. Die resultierenden mutanten Moleküle werden dann auf ihre biologische Aktivität wie beispielsweise Rezeptorbindung oder in vitro proliferative Aktivität getestet. Stellen, die entscheidend für das Binden sind, können auch durch strukturelle Analyse wie beispielsweise Röntgenkristallographie, Kernspinresonanz oder Photoaffinitäts-Labaling bestimmt werden (Smith et al, J. Mol. Biol. 224: 899 bis 904 (1992); deVos et al, Science 255: 306 bis 312 (1992)). Folglich umfassen die Proteinkinasen der vorliegenden Erfindung auch Derivate oder Analoga, in welchen ein substituierter Aminosäurerest nicht einer ist, der durch den genetischen Code codiert ist; in welchem eine Substituentengruppe eingeschlossen ist; in welchem das fertige Polypeptid mit einer weiteren Verbindung verbunden bzw. kondensiert ist, wie beispielsweise einer Verbindung zum Erhöhen der Halbwertszeit des Polypeptids (beispielsweise Polyethylenglycol); oder in welchem die zusätzlichen Aminosäuren an das fertige Polypeptid gebunden bzw. kon densiert sind, wie beispielsweise eine leitende oder sekretorische Sequenz oder eine Sequenz für die Reinigung des fertigen Polypeptids oder eine Pro-Proteinsequenz.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner funktionale aktive Fragment der Chk1 Kinasedomäne bereit. Wie hierin verwendet umfasst ein Fragment zumindest acht oder mehr benachbarte Aminosäurereste von der Proteinkinase. Solche Fragmente können ausgewählt werden basierend auf der Fähigkeit, eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten der Kinase zu erhalten, oder sie können ausgewählt werden für ihre Fähigkeit, eine Funktion durchzuführen, z. B. als Immunogen zu agieren. Insbesondere wichtige Fragmente sind katalytisch aktive Fragmente, Peptide welche beispielsweise ca. 8 oder mehr Aminosäuren lang sind. Solche Fragmente werden typischerweise eine Domäne oder ein Motiv der Kinase, z. B. aktive Stelle oder Bindungsstelle, umfassen. Weitere von der vorliegenden Erfindung vorgeschlagene Fragmente enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf domänen- oder motiventhaltende Fragmente, lösliche Peptidfragmente und Fragmente enthaltend immunogene Strukturen. Vorhergesagte Domänen und funktionalen Stellen, verfügbar für Fachleute (z. B. durch PROSITE-Analyse).
Polypeptide enthalten häufig Aminosäuren anders als die zwanzig Aminosäuren, die allgemein als die zwanzig natürlich auftretenden Aminosäuren bezeichnet werden. Ferner können viele Aminosäuren, einschließlich der terminalen Aminosäuren, durch natürliche Prozesse bzw. Verfahren modifiziert werden, wie beispielsweise Verarbeitung und andere posttranslationale Modifikationen, oder durch im Stand der Technik bekannte chemische Modifikationstechniken. Gewöhnliche Modifikationen, die natürlich in Polypeptiden auftreten, sind in grundlegenden Texten, detaillierten Monographien und der Forschungsliteratur beschrieben und sie sind Fachleuten bekannt.
Bekannte Modifikationen beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf Acetylierung, Acrylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalante Anbindung von Flavin, kovalente Anbindung eines Häm-Restes, kovalente Anbindung eines Nukleotids oder eines Nukleotidderivats, kovalente Anbindung eines Lipids oder eines Lipidderivats, kovalente Anbindung von Phosphotidylinositol, Quervernetzung, Cyclisierung, Disulfidbindungs-Bildung, Demethylie rung, Bildung von kovalenten Querverbindungen, Bildung von Cystin, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, Gamma-Carboxylierung, Glycosylierung, GPI-Anker-Bildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidation, proteolytisches Verarbeiten, Phosphorylierung, Phenylierung, Racemisierung, Selenoylierung, Sulfation, Transfer-RNA-vermittelte Addition von Aminosäuren an Proteine wie beispielsweise Arginylierung und Ubiquitinierung. Solche Modifikationen sind Fachleuten bekannt und wurden im großen Detail in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Etliche besonders übliche Modifikationen, die Glycosylierung, Lipid-Anbindung, Sulfatierung, Gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten, Hydroxylierung und ADP-Ribosylierung, beispielsweise, sind beschrieben in den meisten grundlegenden Texten, wie beispielsweise Proteins – Structure and Molecular Properties, zweite Ausgabe, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993). Viele detaillierte Artikel sind auf diesem Gebiet verfügbar, wie beispielsweise von Wold, F., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Herausgeber, Academic Press, New York 1 bis 12 (1983); Seifter et al. (Meth. Enzymol. 182: 626 bis 646 (1990)) und Rattan et al. (Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48–62 (1992)).
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können an heterologe Sequenzen angebunden werden, um Chimär- oder Fusionsproteine zu bilden. Solche Chimär- oder Fusionsproteine umfassen ein Peptid, wirksam an ein heterologes Protein gebunden, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die nicht im Wesentlichen homolog zum Kinasepeptid ist. "Wirksam gebunden" zeigt an, dass das Peptid und das heterologe Protein im Gerüst verbunden bzw. kondensiert sind. Das heterologe Protein kann an den N-Terminus oder den C-Terminus des Kinasepeptids gebunden bzw. kondensiert sein. Die zwei Peptide, verbunden in einem Fusionspeptid, sind typischerweise abgeleitet von zwei unabhängigen Quellen und deshalb umfasst ein Fusionspeptid zwei verbundene Peptide, die normalerweise in der Natur nicht verbunden aufgefunden werden. Die zwei Peptide können vom selben oder von unterschiedlichen Genomen sein.
In manchen Verwendungen beeinflusst das Fusionsprotein nicht die Aktivität des Peptids per se. Beispielsweise kann das Fusionsprotein beinhalten, ist jedoch nicht beschränkt auf enzy matische Fusionsproteine beispielsweise Beta-Galactosidase-Fusionen, Hefe-zwei-Hybrid-GAL-Fusionen, Poly-His-Fusionen, MYC-Markierte, HI-Markierte und Ig-Fusionen. Solche Fusionsproteine, insbesondere Poly-His-Fusionen, können die Reinigung des rekombinanten Kinasepeptids erleichtern. In manchen Wirtszellen (z. B. Säugetier-Wirtszellen) kann die Expression und/oder Sekretion eines Proteins gesteigert werden durch Verwenden einer heterologen Signalsequenz.
Ein chimäres oder Fusionsprotein kann erzeugt werden durch Standardrekombinante DNA Techniken. Beispielsweise werden DNA Fragmente, codierend für die verschiedenen Proteinsequenzen, miteinander in Verbindung gebunden gemäß konventionellen Techniken. In einer weiteren Ausführungsform kann das Fusionsgen durch konventionelle Techniken, einschließend automatisierte DNA-Synthetisierer, synthetisiert werden. Alternativ kann eine PCR-Verstärkung von Genfragmenten ausgeführt werden unter Verwendung von Ankerstartern, welche Anlass geben zu komplementären Überhängen zwischen zwei aufeinander folgenden Genfragmenten, welche anschließend vergütet und erneut erweitert werden können, um eine chimäre Gensequenz zu erzeugen (siehe Ausubel et al. Current Protocols in Moleculare Biology, 1992). Darüber hinaus sind viele Expressionsvektoren kommerziell erhältlich, die bereits einen Fusionsrest codieren (z. B. ein GST-Protein). Eine kinasepeptidcodierende Nukleinsäure kann in solch einen Expressionsvektor kloniert werden, so dass der Fusionsrest in der Verbindung zum Kinasepeptid verbunden ist.
Hierin bezieht sich der Begriff "Antikörper" auf ein Polypeptid oder eine Gruppe von Polypeptiden, welche von zumindest einer antikörperkombinierenden Stelle oder bindenden Domäne umfasst sind, wobei die bindende Domäne oder kombinierende Stelle von den faltenden oder variablen Domänen eines Antikörpermoleküls gebildet sind, um dreidimensionale Bindungsräume mit einer internen Oberflächenform und Ladungsverteilung zu bilden, die komplementär zu den Merkmalen eines Antigen-Epitops ist. Der Begriff umfasst Immunoglobulin-Moleküle und immunologisch aktive Teile von Immunoglobulinmolekülen wie beispielsweise Moleküle, die eine antikörperkombinierende Stelle oder ein Paratop enthalten. Exemplarische Antikörpermoleküle sind intakte Immunoglobulinmoleküle, im Wesentlichen intakte Immunoglobulinmoleküle und Teile eines Immunoglobulinmoleküls, das jene im Stand der Technik als Fab, FabB, F(abB)₂ und F(v) bekannte enthält.
B. Nukleinsäuren und Polynukleotide
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuremoleküle bereit, die die funktionalen aktiven Kinasen der vorliegenden Erfindung codieren. Solche Nukleinsäurenmoleküle werden aus einer Nukleotidsequenz bestehen, im Wesentlichen daraus bestehen, oder diese umfassen, die eines der Kinasepeptide der vorliegenden Erfindung, eine Allelenvariante davon oder ein Orthologes oder Paraloges davon, codiert.
Wie hierin verwendet ist ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül ein Molekül, das von anderen in der natürlichen Quelle von Nukleinsäuren vorhandenen Nukleinsäuren abgetrennt ist. Vorzugsweise ist eine "isolierte" Nukleinsäure frei von Sequenzen, welche natürlich die Nukleinsäure flankieren (d. h. Sequenzen, angeordnet bei den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure) in der Genom-DNA oder c-DNA des Organismus, von welchem die Nukleinsäure abgeleitet ist. Es können jedoch manche flankierenden Nukleotidsequenzen, beispielsweise bis zu ca. 5 KB, insbesondere benachbarte peptidcodierende Sequenzen und peptidcodierende Sequenzen innerhalb desselben Gens jedoch separat von Intronen in der Genomsequenz, vorliegen. Der wichtige Punkt ist, dass die Nukleinsäure von entfernten und unwichtigen flankierenden Sequenzen derart isoliert ist, dass sie spezifischen Manipulationen unterworfen werden kann, die hierin beschrieben sind, wie beispielsweise rekombinante Expression, Präparation von Sonden und Startern, sowie andere Verwendungen, spezifisch für die Nukleinsäuresequenzen.
Darüber hinaus kann ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül", wie beispielsweise ein c-DNA Molekül, im Wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt ist, oder chemischen Precursorn oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wurde, sein. Das Nukleinsäuremolekül kann an andere codierende oder regulatorische Sequenzen gebunden bzw. kondensiert sein und immer noch als isoliert gelten.
Beispielsweise werden rekombinante DNA Moleküle, die in einem Vektor enthalten sind, als isoliert betrachtet. Weitere Beispiele von isolierten DNA Molekülen beinhalten rekombinante DNA Moleküle, Aufrechterhalten in heterologen Wirtszellen oder gereinigte (teilweise oder im Wesentlichen) DNA Moleküle in Lösung. Isolierte RNA Moleküle beinhalten in vivo oder in vitro RNA Transkriptionen der isolierten DNA Moleküle der vorliegenden Erfindung. Isolierte Nukleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten ferner solche Moleküle, die synthetisch hergestellt werden.
Die bevorzugten Klassen von Nukleinsäuremolekülen, die von den Nukleinsequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst sind, sind die c-DNA Moleküle und Gene und Genomklone der vollen Länge, da manche der Nukleinsäuremoleküle, bereitgestellt in SEQ ID NR: 1, Fragmente des kompletten Gens sind, das in der Natur existiert. Eine kurze Beschreibung wie verschiedene Typen dieser Nukleinsäuremoleküle einfach hergestellt/isoliert werden können, ist hierin bereitgestellt.
Gene der vollen Länge können von bekannten Sequenzen unter Verwendung eines Beliebigen einer Vielzahl von Verfahren kloniert werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Beispielsweise kann ein Verfahren, welches XL-PCR (Perkin-Elmer, Foster City, Kalifornien) zum Verstärken von langen Teilen der DNA eingesetzt wird, verwendet werden. Andere Verfahren zum Erzielen von Sequenzen der vollen Länge sind im Stand der Technik bekannt.
Die isolierten Nukleinsäuremoleküle können die funktionale aktive Kinase plus zusätzliche Amino- oder Carboxyl-Terminal-Aminosäuren codieren, wie beispielsweise jene, die unter anderem das Protein-Trafficking erleichtern, die Proteinhalbwertszeit verlängern oder verkürzen oder Manipulationen eines Proteins für die Analyse oder Produktion erleichtern. Die isolierten Nukleinsäuremoleküle beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf die Sequenz, die die aktive Kinase allein oder in Kombination mit codierenden Sequenzen codiert, wie beispielsweise einer leitenden oder sekretorischen Sequenz (z. B. eine Prä-Pro- oder Pro-Proteinsequenz), die Sequenz, die die aktive Kinase codiert, mit oder ohne dem zusätzlichen Codieren von Sequenzen, plus zusätzlichen nicht codierenden Sequenzen, beispielsweise Introne und nicht-codierende 5'- und 3'-Sequenzen wie beispielsweise transkribierte jedoch nicht translatierte Sequenzen, die eine Rolle in der Transkription, mRNA-Verarbeitung (einschließlich Splicing und Polyadenylierungssignale), Ribosombindung und Stabilität der mRNA spielen. Zusätzlich kann das Nukleinsäuremolekül an eine Markersequenz gebunden bzw. kondensiert sein, beispielsweise einem Peptid, das die Reinigung erleichtert.
Isolierte Nukleinsäuremoleküle können in der Form von RNA, wie beispielsweise mRNA, oder in der Form von DNA, einschließlich c-DNA oder Genom-DNA, erhalten durch Klonen oder erzeugt durch chemische synthetische Techniken oder durch eine Kombination davon, vorliegen. Die Nukleinsäure, insbesondere DNA, kann doppelsträngig oder einsträngig sein. Einsträngige Nukleinsäure kann der codierende Strang (Sense-Strand) oder der nichtcodierende Strang (Anti-Sense-Strand) sein.
Die Erfindung stellt ferner Nukleinsäuremoleküle bereit, die funktionale Fragmente oder Varianten der aktiven Kinasen der vorliegenden Erfindung codieren. Solche Nukleinsäuremoleküle können natürlich auftretende, wie beispielsweise Allelenvarianten (selber Lokus), Paraloge (unterschiedlicher Lokus) und Orthologe (unterschiedlicher Organismus) sein oder sie können durch rekombinante DNA Verfahren oder durch chemische Synthese konstruiert sein. Solche nicht natürlich auftretenden Varianten können hergestellt sein durch Mutagenesetechniken, einschließlich jene, die angewendet werden für Nukleinsäuremoleküle, Zellen oder Organismen. Folglich, wie hierin diskutiert, können die Varianten Nukleotidsubstitutionen, -deletionen, -inversionen und -insertionen enthalten. Eine Variation kann auftreten in jedem oder in beiden der codierenden und nichtcodierenden Regionen. Die Variationen können sowohl konservative als auch nicht konservative Aminosäuresubstitutionen erzeugen.
Ein Fragment umfasst eine angrenzende Nukleotidsequenz größer als 12 oder mehr Nukleotide. Ferner könnte ein Fragment zumindest 30, 40, 50, 100, 250 oder 500 Nukleotide lang sein. Die Länge des Fragments wird auf seiner beabsichtigten Verwendung basieren. Beispielsweise kann das Fragment Epitop-tragende Regionen des Peptids codieren, oder es kann nützlich als DNA Sonden und Starter sein. Solche Fragmente können mittels der bekannten Nukleotidsequenz isoliert werden, um eine Oligonukleotid-Sonde zu synthetisieren. Eine markierte Probe kann dann verwendet werden, um die c-DNA Bibliothek, Genom-DNA-Bibliothek oder mRNA zu screenen, um eine Nukleinsäuresäure korrespondierend zur codierenden Region zu isolieren. Ferner können Starter in PCR-Reaktionen verwendet werden, um spezifische Regionen des Gens zu klonieren.
Eine Sonde/ein Starter umfasst typischerweise im Wesentlichen ein gereinigtes Oligonukleotid oder Oligonukleotid-Paar. Das Olinukleotid umfasst typischerweise einen Bereich einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen zu zumindest ca. 12, 20, 25, 40, 50 oder mehr aufeinander folgenden Nukleotiden hybridisiert.
Orthologe, homologe und Allelen-Varianten können identifiziert werden unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren. Wie hierin beschrieben umfassen diese Varianten eine Nukleotidsequenz, die ein Peptid codiert, das typischerweise 60 bis 65%, 70 bis 75%, 80 bis 85% und typischer zumindest ca. 90 bis 95% oder mehr homolog zu der in SEQ ID NR: 1 bereitgestellten Nukleotidsequenz oder ein Fragment dieser Sequenz ist. Solche Nukleinsäuremoleküle können leicht identifiziert werden als fähig zum Hybridisieren unter moderaten bis stringenten Bedingungen zu der in SEQ ID NR: 1 gezeigten Sequenz oder einem Fragment der Sequenz.
Wie hierin verwendet soll der Begriff "Hybridisiert unter stringenten Bedingungen" Bedingungen für die Hybridisierung und das Waschen beschreiben, unter welchen Nukleotidsequenzen, codierend ein Peptid zu zumindest 50 bis 55% homolog zueinander, typischerweise miteinander hybridisiert bleiben. Die Bedingungen können derart sein, dass Sequenzen zumindest ca. 65%, zumindest ca. 70% oder zumindest ca. 75% oder mehr homolog zueinander, typischerweise hybridisiert zueinander bleiben. Solche stringenten Bedingungen sind Fachleuten bekannt und können gefunden werden in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N. Y. (1998), 6.3.1.–6.3.6. Ein Beispiel von stringenten Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung in 6×-Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei ca. 45°C, gefolgt von einer oder mehreren Waschungen in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C.
Die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung sind nützlich für Sonden, Starter, chemische Zwischenprodukte und in biologischen Assays. Die Nukleinsäuremoleküle sind nützlich als eine Hybridisierungssonde für c-DNA und Genom-DNA, um c-DNA der vollen Länge und Genomklone zu isolieren, die das hierin beschriebene Peptid codieren, und um c-DNA und Genomklone zu isolieren, die mit Varianten (Allelen, Orthologen, etc.) korrespondieren, die dieselben oder verwandte Peptide, wie hierin beschrieben, produzieren.
Die Nukleinsäuremoleküle sind nützlich als Starter für PCR, um eine beliebige gegebene Region eines Nukleinsäuremoleküls zu verstärken, und sind nützlich, Antisense-Moleküle von gewünschter Länge und Sequenz zu synthetisieren.
Die Nukleinsäuremoleküle sind auch nützlich zum Konstruieren von rekombinanten Vektoren. Solche Vektoren beinhalten Expressionsvektoren, die einen Teil oder alle der Peptidsequenzen exprimieren. Vektoren beinhalten ferner Insertionsvektoren, verwendet zum Integrieren in eine andere Nukleinsäuremolekülsequenz, wie beispielsweise in das zelluläre Genom, um die in situ Expression eines Gens und/oder Genprodukts zu verändern. Beispielsweise kann eine endogene Codierungssequenz ersetzt werden über homologe Rekombination mit allen oder einem Teil der codierenden Regionen, enthaltend eine oder mehrere speziell eingeführte Mutationen.
Die Nukleinsäuremoleküle sind ferner nützlich für die Exprimierung von Antigen-Teilen der Proteine.
Die Nukleinsäuremoleküle sind ferner nützlich als Sonden zum Bestimmen der Chromosompositionen der Nukleinsäuremoleküle mittels in situ Hybridisierungsverfahren.
Die Nukleinsäuremoleküle sind ferner nützlich für das Designen von Ribozymen korrespon dierend zur gesamten oder einem Teil der mRNA, hergestellt von den hierin beschriebenen Nukleinsäuremolekülen.
Die Nukleinsäuremoleküle sind ferner nützlich für das Konstruieren von Wirtszellen, die einen Teil oder alle der Nukleinsäuremoleküle und Peptide exprimieren.
Die Nukleinsäuremoleküle sind ferner nützlich für das Konstruieren von transgenen Tieren, die alle oder einen Teil der Nukleinsäuremoleküle und Peptide exprimieren.
Die Nukleinsäuremoleküle sind ferner nützlich für das Herstellen von Vektoren, die einen Teil oder alle der Peptide exprimieren.
Die Nukleinsäuremoleküle sind ferner nützlich als Hybridisierungssonden für das Bestimmen der Anwesenheit, des Grads der Form und der Verteilung von Nukleinsäureexpression. Folglich können die Sonden verwendet werden, um die Anwesenheit eines speziellen Nukleinsäuremoleküls zu detektieren oder den Grad zu bestimmen, in Zellen, Geweben und in Organismen. Die Nukleinsäure, deren Grad bestimmt wird, kann DNA oder RNA sein. Folglich können Sonden, korrespondierend zu den hierin beschriebenen Peptiden, verwendet werden, um die Expression und/oder Genkopienummer in einer gegebenen Zelle, einem Gewebe oder einem Organismus zu bewerten. Diese Verwendungen sind relevant für die Diagnose von Störungen, involvierend eine Zunahme oder Abnahme in der Kinaseproteinexpression, relativ zu normalen Ergebnissen.
In vitro-Techniken für die Detektion von mRNA beinhalten die Northern-Hybridisierung und in situ-Hybridisierungen. In vitro-Techniken für das Detektieren von DNA beinhalten Southern-Hybridisierungen und in situ-Hybridisierungen.
Sonden können verwendet werden als ein Teil eines diagnostischen Testsatzes für das Identifizieren von Zellen oder Geweben, die ein Kinaseprotein exprimieren, beispielsweise durch Messen eines Grads einer rezeptorcodierenden Nukleinsäure in einer Probe von Zellen von einem Subjekt, z. B. mRNA oder Genom-DNA, oder bestimmen, ob ein Rezeptorgen mutierte.
C. Vektoren und Wirtszellen
Die Erfindung stellt ferner Vektoren bereit, die die hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle enthalten. Der Begriff "Vektor" bezieht sich auf ein Vehikel, vorzugsweise ein Nukleinsäuremolekül, das die Nukleinsäuremoleküle transportieren kann. Wenn der Vektor ein Nukleinsäuremolekül ist, sind die Nukleinsäuremoleküle kovalent an die Vektornukleinsäure gebunden. Mit diesem Aspekt der Erfindung beinhaltet der Vektor ein Plasmid, einzel- oder doppelsträngige Phage, einen einzel- oder doppelsträngigen RNA- oder DNA-viralen Vektor oder ein künstliches Chromosom wie beispielsweise BAC, PAC, YAC oder MAC. verschiedene Expressionsvektoren können verwendet werden, um die Polynukleotide zu exprimieren, die die aktive hChk1 Kinase codieren.
Ein Vektor kann in einer Wirtszelle als ein extrachromosales Element aufrechterhalten werden, wo es zusätzliche Kopien der Nukleinsäuremoleküle repliziert und produziert. Alternativ kann der Vektor in das Wirtszellengenom integriert werden und zusätzliche Kopien der Nukleinsäuremoleküle produzieren, wenn sich die Wirtszelle repliziert.
Die Erfindung stellt Vektoren für die Aufrechterhaltung (Klonierungsvektoren) oder Vektoren für die Expression (Expressionsvektoren) der Nukleinsäuremoleküle bereit. Die Vektoren können in prokariotischen oder eukariotischen Zellen oder in beiden (Shuttle-Vektoren) funktionieren.
Expressionsvektoren beinhalten cis-agierende regulatorische Regionen, die wirksam in den Vektor an die Nukleinsäuremoleküle derart gebunden sind, dass die Transkription der Nukleinsäuremoleküle in einer Wirtszelle erlaubt wird. Die Nukleinsäuremoleküle können in die Wirtszelle mit einem separaten Nukleinsäuremolekül eingeführt werden, das geeignet ist, die Transkription zu bewirken. Folglich kann das zweite Nukleinsäuremolekül einen trans- agierenden Faktor bereitstellen, interagierend mit der cis-regulatorischen Steuerungsregion, um die Transkription der Nukleinsäuremoleküle vom Vektor zu erlauben. Alternativ kann ein trans-agierender Faktor von der Wirtszelle geliefert werden. Zuletzt kann ein trans-agierender Faktor vom Vektorfeld erzeugt werden. Es versteht sich jedoch, dass in manchen Ausführungsformen die Transkription und/oder Translation der Nukleinsäuremoleküle in einem zel lenfreien System auftreten kann.
Die regulatorische Sequenz, an welche die hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle wirksam gebunden werden können, beinhalten Promotoren für das Lenken der mRNA Transkription. Diese beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf den linken Promotor von Bakteriophage λ, das Lac, TRP und TAC-Promotoren von E. Coli, und die frühen und späten Promotoren von SV40, dem Immediat-Früh-CMV-Promotor, die Früh- und Spät-Adenoviruspromotoren und Retrovirus-Langterminalwiederholungen.
Zusätzlich zu Steuerungsregionen, die die Transkription fördern, können Expressionsvektoren auch Regionen beinhalten, die die Transkription modulieren, wie beispielsweise Repressor-Bindungsstellen und Enhancers. Beispiele beinhalten den SV40 Enhancer, den frühen Zytomegalovirus-Immediat Enhancer, Polyoma Enhancer, Adenovirus Enhancer und Retorvirus-LTR Enhancer.
Zusätzlich zum Enthalten von Stellen für die Transkriptionsinitiierung und -steuerung können Expressionsvektoren auch Sequenzen beinhalten, die notwendig für die Transkriptionsterminierung sind und, in der transkribierten Region, eine Ribosombindungsstelle für die Translation. Andere regulatorische Steuerungselemente für die Expression beinhalten Initiierung und Terminierung von Codonen sowie Polyadenylierungssignale. Der Fachmann wäre sich der vielzähligen regulatorischen Sequenzen bewusst, die in Expressionsvektoren nützlich sind. Solche regulatorischen Sequenzen sind beispielsweise beschrieben in Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)).
Eine Vielzahl von Expressionsvektoren kann verwendet werden, um ein Nukleinsäuremolekül zu exprimieren. Solche Vektoren beinhalten chromosom-episom und virusabgeleitete Vektoren, beispielsweise Vektoren, abgeleitet von bakteriellen Plasmiden, von Bakteriophagen, von Hefeepisomen, von Hefechromosomelementen, beinhaltend künstliche Hefechromosome, von Viren wie beispielsweise Baculoviren, Papavaviren wie beispielsweise SV40, Vacciniaviren, Adenoviren, Pockenviren, Pseudorabies- bzw. Pseudolyssaviren und Retroviren. Vektoren können auch abgeleitet sein von Kombinationen dieser Quellen, wie beispielsweise jenen, die von Plasmid- und Bakteriophage-genetischen Elementen, z. B. Cosmiden und Phagimiden, abgeleitet sind. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für prokariotischen und eukarotische Wirte sind beschrieben in Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)).
Die regulatorische Sequenz kann eine konstitutive Expression in einer oder in mehreren Wirtszellen (d. h. gewebespezifisch) bereitstellen oder sie kann eine induzierbare Expression in einem oder in mehreren Zelltypen bereitstellen, wie beispielsweise durch Temperatur, Nährstoffadditive oder exogene Faktoren wie beispielsweise ein Hormon oder ein anderer Ligand.
Eine Vielzahl von Vektoren, die eine konstitutive und eine induzierbare Expression in prokariotischen und eukariotischen Wirten bereitstellen, sind Fachleuten bekannt.
Die Nukleinsäuremoleküle können in die Vektornukleinsäure mittels einer gut bekannten Verfahrensweise eingefügt werden. Im Allgemeinen wird die DNA Sequenz, die zuletzt exprimiert wird, an einen Expressionsvektor mittels Spalten der DNA Sequenz und des Expressionsvektors mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen und anschließendes miteinander ligieren der Fragmente verbunden. Verfahren für die Restriktionsenzymdigestion und -ligatur sind Fachleuten bekannt.
Der Vektor, der das geeignete Nukleinsäuremolekül enthält, kann in eine geeignete Wirtszelle eingefügt werden zur Reproduktion oder Expression unter Verwendung gut bekannter Tech niken. Bakterienzellen beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf E. Coli, Streptomyces, und Salmonella Typhimurium. Eukariotische Zellen beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf Hefe, Insektenzelle wie beispielsweise Drosophila, tierische Zellen wie beispielsweise COS und CHO-Zellen und Pflanzenzellen.
Wie hierin beschrieben kann es wünschenswert sein, ein Peptid der vorliegenden Erfindung als ein Fusionsprotein zu exprimieren. Folglich stellt die Erfindung Fusionsvektoren bereit, die die Produktion solcher Peptide gestatten. Fusionsvektoren können die Expression eines rekombinanten Proteins steigern, die Löslichkeit des rekombinanten Proteins steigern und bei der Reinigung des Proteins helfen durch Wirken als beispielsweise ein Ligand für Affinitätsreinigung. Eine proteolytische Teilungsstelle kann eingeführt werden an der Verbindung des Fusionsrestes, so dass das gewünschte Peptid letztendlich vom Fusionsrest getrennt werden kann. Proteolytische Enzyme beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase. Typische Fusionsexpressionsvektoren beinhalten pGEX (Smith et al., Gene 67: 31–40 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Priscataway, NJ), welche jeweils Gluthation-S-Transferase (GST), Maltose-E-Bindungsprotein oder Protein-A an das rekombinante Zielprotein binden. Beispiele geeigneter induzierbarer Nichtfusions-E. Coli Expressionsvektoren beinhaltend pTrc (Amann et al., Gene 69: 301–315 (1988)) und pET11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185: 60–89 (1990)).
Rekombinante Proteinexpression kann maximiert werden in einer Wirtsbakterie durch Bereitstellen eines genetischen Hintergrunds, worin die Wirtszelle eine verschlechterte Kapazität aufweist, um das rekombinante Protein proteolytisch zu spalten. (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119–128). Alternativ kann die Sequenz des Nukleinsäuremoleküls von Interesse verändert werden, um eine bevorzugte Codon-Verwendung für eine spezifische Wirtszelle beispielsweise E. Coli, bereitzustellen. (Wada et al., Nucleic Acids Res. 20: 2111–2118 (1992)).
Die Nukleinsäuremoleküle können auch durch Expressionsvektoren exprimiert werden, die in Hefe wirksam sind. Beispiele von Vektoren für die Expression in Hefe, z. B. S. cerevisiae beinhalten pYepSed (Baldari, et al., EMBO J. 6: 229–234 (1987)), pMFa (Kurjan et al., Cell 30: 933–943 (1982)), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54: 113–123 (1987)), und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
Die Nukleinsäuremoleküle können auch in Insektenzellen exprimiert werden, verwendend beispielsweise Baculovirusexpressionsvektoren. Baculovirusvektoren, die für die Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (z. B. Sf9-Zellen) verfügbar sind, beinhalten die pAc-Serie (Smith et al., Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165 (1983)) und die pVL series (Lucklow et al., Virology 770: 31–39 (1989)).
In manchen Ausführungsformen der Erfindung sind die hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle in Säugetierzellen exprimiert unter Verwendung von Säugetierexpressionsvektoren. Beispiele von Säugetierexpressionsvektoren beinhalten pCDM8 (Seed, B. Nature 329: 840 (1987)) und pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. 6: 187–195 (1987)).
Die hierin aufgelisteten Expressionsvektoren sind lediglich beispielhalber aus den gut bekannten Vektoren bereitgestellt, die Fachleuten verfügbar sind und die nützlich wären zum Exprimieren der Nukleinsäuremoleküle. Bevorzugte Vektoren beinhalten pET28a (Novagen, Madison, WI), pAcSG2 (Pharmingen, San Diego, CA), und pFastBac (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Der Fachmann würde erkennen, dass andere Vektoren für die Aufrechterhaltung der Reproduktion oder Expression der hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle geeignet sind. Diese finden sich beispielsweise in Sambrook, J., Fritsh, E. F., und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Die Erfindung umfasst auch Vektoren, in welchen die hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen in den Vektor in umgekehrter Orientierung kloniert, jedoch wirksam an eine regulatorische Sequenz verbunden sind, die die Transkription der Antisense-RNA erlaubt. Folglich kann eine Antinsense-Transkription bezüglich allen oder bezüglich eines Teils der hierin be schriebenen Nukleinsäuremolekülsequenzen produziert werden, einschließend sowohl codierende als auch nichtcodierende Regionen. Expressionen dieser Antisense-RNA ist Gegenstand von jedem der hierin. beschriebenen Parameter in Bezug zur Expression der Sense-RNA (regulatorische Sequenzen, konstitutive oder induzierbare Expression, gewebespezifische Expression).
Die Erfindung betrifft ferner rekombinante Wirtszellen, die die hierin beschriebenen Vektoren enthalten. Wirtszellen beinhalten deshalb prokariotische Zellen, niedrigere eukariotische Zellen wie beispielsweise Hefe, andere eukariotische Zellen wie beispielsweise Insektenzellen und höhere eukariotische Zellen wie beispielsweise Säugetierzellen. Bevorzugte Wirtszellen der vorliegenden Erfindung beinhalten E. Coli und Sf9.
Die rekombinanten Wirtszellen werden präpariert durch Einführen des hierin beschriebenen Vektorkonstrukts in die Zellen durch Techniken, die dem Fachmann leicht verfügbar sind. Diese beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, kationische Lipid-vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Infektion, Lipofektion und andere Techniken wie beispielsweise jene die sich finden in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989))..
Wirtszellen können mehr als einen Vektor enthalten. Folglich können verschiedene Nukleotidsequenzen auf verschiedene Vektoren derselben Zelle eingefügt werden. Gleichsam können die Nukleinsäuremoleküle entweder allein oder mit anderen Nukleinsäuremolekülen eingeführt werden, die nicht in Bezug auf die Nukleinsäuremoleküle stehen, wie beispielsweise jene, die trans-agierende Faktoren oder Expressionsvektoren bereitstellen. Wenn mehr als ein Vektor in eine Zelle eingefügt wird, können die Vektoren unabhängig voneinander eingefügt werden, gemeinsam eingefügt werden oder verbunden werden an den Nukleinsäuremolekülvektor.
Im Falle der Bakteriophage und viralen Vektoren können diese in Zellen eingefügt werden als gepackter oder verkapselter Virus durch Standardverfahren für die Infektion und Transduktion. Virale Vektoren können replikationsfähig oder replikationsdefektiv sein. In dem Fall, in dem die virale Replikation defektiv bzw. gestört ist wird die Replikation in Wirtszellen auftreten, Funktionen bereitstellend, die die Defekte ergänzen.
Vektoren beinhalten im Allgemeinen selektierbare Marker, die die Selektion der Subpopulation der Zellen ermöglichen, die die rekombinanten Vektorkonstrukte enthalten. Der Marker kann im selben Vektor enthalten sein, der die hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle enthält, oder er kann auf einem separaten Vektor vorliegen. Marker beinhalten Tetracyclin- oder Ampicillinresistenzgene für prokariotische Wirtszellen und Dihydrofolatreduktase oder Neomycinresistenz für eukariotische Wirtszellen. Es wird jedoch jeder beliebige Marker, der eine Selektion für eine phenotypische Eigenschaft bereitstellt, effektiv sein.
Während die aktiven Proteinkinasen in Bakterien, Hefe, Säugetierzellen und anderen Zellen unter der Steuerung der geeigneten regulatorischen Sequenzen hergestellt werden können, können die zellenfreien Transkriptions- und Translationssysteme auch verwendet werden, um diese Proteine herzustellen, unter Verwendung von RNA, abgeleitet von dem hierin beschriebenen DNA Konstrukten.
Wo die Sekretion des Peptids gewünscht ist, werden geeignete Sektretionssignale in den Vektor eingearbeitet. Die Signalsequenz kann endogen bezüglich der Peptide oder hereolog bezüglich dieser Peptide sein.
Es versteht sich ferner, dass in Abhängigkeit von der Wirtszelle in der rekombinanten Produktion der hierin beschriebenen Peptide die Peptide verschiedene Glycosylierungs-Muster aufweisen, abhängig von der Zelle, oder sie können nicht glycosyliert sein, wie wenn in Bakterien produziert. Zusätzlich können die Peptide ein initialmodifiziertes Methionin in manchen Fällen aufweisen, als ein Ergebnis eines Wirt-vermittelten Prozesses.
Die rekombinanten Wirtszellen, die die hierin beschriebenen Peptide exprimieren, weisen eine Vielzahl von Verwendungen auf. Zuerst sind diese Zellen nützlich für die Produktion eines Kinaseproteins oder Peptids, das weiter gereinigt werden kann, um gewünschte Mengen von Kinaseprotein oder Fragmenten zu erzeugen. Folglich sind die die Expressionsvektoren enthaltenden Zellen nützlich für die Peptidproduktion.
Wirtszellen sind ferner nützlich für die Durchführung von zellbasierten Assays, einschließend das Kinaseprotein oder Kinaseproteinfragmente. Folglich ist eine rekombinante Wirtszelle, die ein natives Kinaseprotein exprimiert, nützlich für das Bewerten von Komponenten, die die Kinaseproteinfunktion stimulieren oder hemmen.
Wirtszellen sind ferner nützlich für die Identifizierung von Kinaseproteinmutationen, in welchen diese Funktionen betroffen sind. Wenn die Mutanten natürlich auftreten und Anlass zu einer Pathologie geben, sind Wirtszellen, die die Mutationen enthalten, nützlich zum Bewerten von Verbindungen, die einen gewünschten Effekt auf das mutierte Kinaseprotein haben (beispielsweise eine stimulierende oder inhibierende Funktion), welche nicht durch ihren Effekt auf das native Kinaseprotein angezeigt sind.
Die folgenden Beispiele sind für Illustrationszwecke bereitgestellt.
Beispiele
1. Identifikation der Sequenz der katalytischen Domäne
Von der vollständigen Proteinsequenz für die menschliche Kontrollpunkteffektorkinase (Chk1, 476 Reste), verfügbar durch GenBank, unter Verwendung von Sequenzanordnung und -strukturen für andere Kinasen, wurde ein Homologiemodell für die Kinasedomäne des Chk1 Proteins ersonnen (siehe 3).
Alle Proteinkinasen verwenden ATP um ihre Substrate zu phosphorylieren, involvierend den Transfer eines Gammaphosphats zu einer Substrat-Hydroxylgruppe. Jede Kinase bindet ATP mit ihrer eigenen Stärke, eine Eigenschaft, die korreliert ist durch Messen von K_i/IC50 Das ATP Molekül besteht aus Adenin, Ribose und Triphosphatresten. Jeder dieser Reste bindet an das Protein an der ATP Bindungsstelle (oder ATP-Ausbuchtung bzw. -Tasche). Der Adeninrest bindet immer an das Protein-Backbone durch Bildung von zwei oder drei Wasserstoff bindungen. Der Riboserest bildet eine oder zwei Wasserstoffbindungen mit den Proteinseitenketten der Aminosäuren, die außerhalb der ATP Ausbuchtung liegen. Der Triphosphatrest interagiert mit jenen katalytischen Aminosäuren der Kinase, die im Allgemeinen konsistent über die gesamte Proteinkinasefamilie sind. Es besteht eine beschränkte Spezifität für jede Kinase innerhalb der ATP Bindungsfuge. Diese Region wird als die Spezifitätsausbuchtung bezeichnet. Unter Verwendung des Homologiemodells wurde ein Schema der Chk1 Bindungsstelle entwickelt, das die ATP Bindungsstelle, das Donor-Akzeptor-Donor-Bindungsmotiv und die Spezifitätsausbuchtung identifiziert (siehe 9). Diese Bindungsstelle ist das Ziel für die Inhibitorentwicklung, z. B. die Entwicklung von Verbindungen oder Molekülen, die an diese Stelle in dem Ausmaß binden, dass die Kinaseaktivität des Chk1 Proteins blockiert oder inhibiert ist. Die schwarze und die rote Farbe in 9 repräsentiert die ATP Bindungsfuge; man beachte Ser147 kann zur Bindung des Inhibitors beitragen. Der Bereich, der durch die blaue Farbe bezeichnet ist, repräsentiert die Region außerhalb der ATP Ausbuchtung, die verwendet werden kann für die Verbesserung der Spezifität der Bindung. Zuletzt repräsentiert der Bereich in Violett die "Spezifitätsausbuchtung", die Region, die sehr unterschiedlich von einem Protein zum anderen ist. Diese Stelle trägt nicht zur ATP Bindung bei, kann jedoch verwendet werden für das Design von spezifischen Inhibitoren. In anderen Worten kann man durch Verwenden der Region der Chk1 Bindungsstelle, die eindeutig für Chk1 ist (der Spezifitätsausbuchtung), Verbindungen designen, die spezifisch Chk1 inhibieren, ohne auch die verschiedenen anderen Kinasemoleküle zu inhibieren, die nicht Ziele der Inhibitionstherapie sein können.
Die Analyse der C-Termini der Kinase legt nahe, dass Aminosäuren jenseits von Rest 265 eine Expression auf hohem Niveau fördern würden und/oder die geeignete Kristallstruktur aufrechterhalten würden. Das Homologiemodell zeigte, dass diese Region flexibel ist, derart dass das Beenden des Kinasedomänenkonstrukts innerhalb dieser Region die Disruption von potentiellen Sekundärstrukturen verhindern kann. Speziell würde das Spalten des Chk1 Proteins irgendwo zwischen den Aminosäureresten 263 und 256 in der Zerstörung der helicalen Interaktionen am distalen Ende resultieren. Das Homologiemodell sagte ferner voraus, dass das Kinasesegment sich zumindest bis Rest 272 bis 275 erstrecken sollte und sich ferner bis zu Rest 289 bis 291 erstrecken kann.
Zusätzlich verhindert das Einschließen der sich erstreckenden Region in das Konstrukt, dass die C-Terminal-Histidinmarkierung mit der Kinasedomäne interagiert, was diese zugänglich für Affinitätschromatographie macht. Basierend auf diesen Analysen wurde das Konstrukt KH289 entworfen für die Expression der Chk1 Kinasedomäne von Rest 1 bis 289 mit 6 × His-Markierung am C-Terminus. Ein korrespondierendes Konstrukt ohne die 6 × His-Markierung wurde ebenfalls hergestellt. Zwei andere Konstrukte wurden entworfen basierend auf dem Homologiemodell: (1) Kinasedomäne der Reste 1 bis 210 (KH210) und (2) Kinasedomäne der Reste 1 bis 248 (KH248).
2. Klonierung
Die menschliche Chk1 cDNA wurde kloniert mittels PCR unter Verwendung von Vent Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA) von menschlichem Thymus und Testis-Marathon-Ready cDNA (Clontech, Palo Alto, CA) mit Startern synthesisiert (Genset, LaJolla, A) basierend auf der veröffentlichten Sequenz [SEQ ID NO. 1] (GenBank Accession Nummer AF1016582) [Sanchez, Science (1997), supra.], folgend den Instruktionen der Verkäufer. Zwei überlappende Sequenzen wurden unabhängig verstärkt, eine enthielt die Sequenz der Nukleotide 35 bis 830 von SEQ ID NR: 1 und die andere enthielt der Sequenz der Nukleotide 678 bis 1480 von SEQ ID NR: 1. Diese überlappenden Sequenzen decken die gesamte codierende Sequenz des Chk1 plus 16 Basenpaare (bps) der 3'-nichttranslationalen Region ab. Die cDNA von 35 bis 830 codiert die Kinasedomäne der Reste 1 bis 265.
Die PCR-Oligonukleotid-Starter-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgelistet. Restriktionsstellen für das Klonieren, Codone für die 6 × His-Markierung, und das Stoppcodon wurden in den PCR-Startern verarbeitet. Die Restriktionsstelle StuI ging der NcoI Stelle voraus, welche das Initiationscodon überlappte. Die SacI Stelle folgte dem Stoppcodon. Wenn eingeschlossen folgten Codone für die 6 × His-Markierung dem Stoppcodon, so dass ein exprimiertes Protein eine 6 × His-Markierung an seinem C-Terminus aufweisen würde.
Die verstärkte cDNA wurde in die Expressionskassette pCR-TOPO (Plasmid von Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert, folgend den Instruktionen des Zulieferers, und die Sequenzen wurden verifiziert durch Sequenzieren von beiden Strängen (Retrogen, San Diego, CA). Die verstärkte cDNA-Sequenz war identisch mit der in der oben bezeichneten bei GenBank hinterlegten Sequenz. Die Volllängen-Chk1-cDNA wurde konstruiert von diesen zwei überlappenden cDNAs, ligierend durch die ClaI-Restriktionsstelle bei 734 bis 739. Diese Volllängen cDNA wurde verwendet als PCR-Template um cDNA Fragmente für die Expression zu erzeugen oder direkt zum Erzeugen des Volllängen Chk1 Expressionsvektors. Alle die PCR-Produkte wurden in die pCR-TOPO für das Sequenzieren kloniert. Konstrukte wurden hergestellt für die Expression der Volllängen Chk1 und verschiedene Längen der Kinasedomäne mit oder ohne 6 × His-Markierung.
Tabelle 1: PCR-Starter*
3. Chk1-Antikörper
Das Peptid NRVTEEAVAVKIVDMKRAVD (Reste 28–47 of SEQ ID Nr. 2) wurde ausgewählt für die Erzeugung von Antikörpern gegen N-Terminus der menschlichen Chk1. Das Peptid DDKILVDFRLSKGDGLE (Reste 434–450 of SEQ ID NO. 2) wurde ausgewählt für das Erzeugen von Antikörpern gegen den C-Terminus der menschlichen Chk1. Polyklonale Antikörper von Kaninchen wurden bestellt über die Custom Antibody Production Services von Research Genetics, Inc. (Huntsville, AL). Beide Antikörper detektierten rekombinante oder endogene menschliche Chk1 wie erwartet.
4. Fermentation
Das Gesamtschema war wie folgt. Die 3'-PCR Starter wurden angelegt, sowohl unmarkierte als auch markierte (mit 6-Histidin-Markierung) Proteine zu codieren. Das Segment von cDNA für 1 bis 289 wurde kloniert in ein pFastBac Plasmid (erhalten von Life Technologies) und eine NdeI-Stelle wurde eingeführt. Ein rekombinantes Baculovirus wurde erzeugt mittels des Bacmidsystems (erhalten von Life Technologies). Das Protein (KH289) wurde exprimiert in Hi-5-Insektenzellen und gereinigt durch eine Kombination von Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie. Die Segmente der cDNA für die Volllängen Chk1 (1 bis 476 AA) und die Chk1 Kinasedomäne (1 bis 265 AA) wurden in pAcSG2 Plasmid kloniert und ein rekombinantes Baculovirus wurde erzeugt mittels Baculogoldviral DNA (erhalten von Invitrogen) und eine modifizierte Cellfectin-Transfektion (erhalten von Life Technologies) und Plaque Selektion (erhalten von Novagen)-Protokoll. Das exprimierte Protein wurde gereinigt mittels des unten beschriebenen Chromatographieschemas. Es wurde herausgefunden dass eine hohe Salzkonzentration in Puffern nötig war, um die Präzipitation der gereinigten Proteine zu verhindern. Die Details des Protokolls sind unten diskutiert.
Erzeugung von Expressionsplasmiden
Plasmid-pFastBac-Nde wurde modifiziert vom pFastBac1 Vektor (Life Technologies, Gaithersburg, MD) durch in vitro-ortsdirigierte Mutagenese mittels des Muta-Gen-In vitro-Mutagenesesatzes (Bio-Rad, Hercules CA) folgend der Instruktion des Lieferanten. Zwei Nukleotide wurden in pFastBac1 mittels des folgenden Oligonukleotids substituiert:
Dies erzeugte eine eindeutige NdeI-Stelle an der Originaltranslationsstartstelle für das Polyhydrinprotein.
Die verstärkten cDNA Fragmente wurden mit den Restriktionsenzymen StuI und SacI digestiert und zu Plasmiden pET28a (Novagen, Madison, WI), PAcSG2 (Pharmingen, San Diego, CA) oder pFastBac-Nde kloniert. Der pET28a Vektor wurde verwendet für die Proteinexpression in E. Coli und pAcSG2, und pFastBac-Nde wurde verwendet für die Proteinexpression in Insektenzellen. Um die cDNA Fragmente, codierend die Chk1 Kinasedomäne mit Aminosäuren 1 bis 289 (Konstrukt KH289) in pFastBac-Nde zu klonieren wurde das cDNA Fragment von dem pCR-TOPO Plasmid mit den Restriktionsenzymen StuI und SacI exzidiert, zwischen die stumpfendige NdeI Stelle und SacI Stelle ligiert. Plasmide mit korrekter Insertion wurden analysiert durch Restriktionsenzymdigestion. Die Volllängen-Chk1 und die Kinasedomäne der Reste 1 bis 265 (KH265) mit oder ohne C-terminaler 6 × His-Markierung wurden kloniert in pAcSG2 mittels der Restriktionsstellen von StuI und SacI. Expressionsvektoren für die Kinasedomäne der Reste 1 bis 210 (KH210) und Kinasedomäne der Reste 1 bis 248 (KH248) wurden hergestellt in pFastBac-Nde.
Die Expression in E. Coli wurde durchgeführt folgend den Instruktionen, die mit dem pET28a Vektor geliefert wurden. Proteine, die in der Form der Volllängen-Chk1 oder Kinasedomäne der Reste 1 bis 265 oder Kinasedomäne der Reste 1 bis 289 exprimiert wurden, waren in der unlöslichen Fraktion, wenn analysiert mittels des ReadyPreps Proteinpräparationssatzes (Epicentre Technologies, Madison, WI).
Erzeugung von rekombinanten Viren
Das Bac-zu-Bac System (Life Technologies) wurde verwendet, um das rekombinante Baculovirus für die Expression der C Terminalen 6 × His-markierten Chk1 Kinasedomäne (Aminosäuren 1 bis 289, KH289) wie instruiert zu erzeugen. Rekombinante Viren wurden bestätigt mittels PCR bezüglich der Anwesenheit der Chk1-cDNA-Insertion. Die Proteinexpression wurde bestätigt durch SDS-PAGE oder Western Blot mit dem Chk1 polyklonalen Antikörpern. Die Expression von KH289 erschien als die höchste unter all den Konstrukten. Hohe Titer-Blöcke von rekombinanten Viren wurden erzeugt durch zwei bis drei Runden der Verstärkung mittels Sf21 Insektenzellen.
Rekombinante Viren für die Expression der Volllängen Chk1 und Kinasedomäne der Reste 1 bis 265 wurden erzeugt durch Kotransfektion von SF21 Zellen mit pAcSG2 Vektor und BaculoGold (PharMingen, San Diego, CA).
Expression in Insektenzellen
Die Ausbeute an aktivem löslichen Protein, enthalten in der oben beschriebenen E. Coli Fermentation war nicht anwendbar für eine umfangreiche Experimentierung. Deshalb wurde ein alternatives Fermentationssystem entwickelt. Insektenzellen Sf9 für die virale Verstärkung und Hi-5 Zellen für die Proteinproduktion (beide von Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) wurden angepasst, um in Insektenmedium, enthaltend 1% Fötalbovinserum (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) zu züchten. Zellen wurden reproduziert und in Suspensionskultur bei 27°C in entweder einem Erlenmeyerschüttelkolben (Corning #430183) oder in einer aufrechten Rollerflasche (Corning Inc., Corning, NY, USA #25290-17000) mit einer losen Abdeckung für Ventilation gehalten. Die Kolben wurden in in einem reziproken gekühlten Schüttler (Innova 4343, New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA) bei 120 U/min plat ziert. Die Zellendichte wurde aufrechterhalten bei zwischen 5·10⁵ bis 2·10⁶ Zellen pro Millimeter durch Verdünnen der kultivierten Zellsuspension mit einem frischen vorgewärmten (27°C) Medium. Die Lebensfähigkeit von Insektenzellen wurde bei 98% gehalten. Die Lebensfähigkeit von Insektenzellen wurde bestimmt durch mikroskopische Zählung der gesamten gefärbten Zellen durch Trypanblau gegen die gesamte Zellenanzahl in einem Hämocytometer.
Sf9 Insektenzellen wurden verwendet für die Verstärkung für den rekombinanten Virusblock. Das rekombinante Baculovirus von einer einzelnen Plaque wurde mit einer Pipettenspitze aufgenommen und zu einer Sf9 Zellenmonoschicht in einen T-25-Kolben (Becton Dickenson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA) mit 10 ml Medium SF900II und 1% Fötalbovinserum (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) hinzugefügt und bei 27°C inkubiert. Nach sechs Tagen wurde der Kulturüberstand als erste Generation des Virusblocks (P1) für die weitere Verstärkung von P2 und P3 Virusblöcken auf 2 bis 3 l verwendet. Für eine umfangreiche Verstärkung des P2- und P3-Virusblocks wurde der P1- oder P2-Virusblock zu Sf9 Zellen bei einer Zellendichte von 1·10⁶ Zellen/ml hinzugegeben, die Infektion wurde ausgeführt mit Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,1, die Zellen wurden in Suspension in 500 ml SF900II in einer 2 l Rollerflasche (Corning Inc., Corning, NY, USA) vermehrt, aufrechtstehend in einem Schüttelinkubator bei 120 U/min bei 27°C für sechs Tage.
Dieses Verfahren wurde wiederholt bis 2 bis 3 l Virusblock (P3) erhalten wurden. Der Titer dieses Virusblocks war 1 bis 5·10⁸ p.f.u/ml. Die virale Titration wurde bestimmt durch das Plaque-Bewertungsverfahren mit serieller zehnfacher Verdünnung bis 10⁸-fach. Der virale Block wurde gespeichert bei 10°C und für die umfangreiche Proteinproduktion innerhalb zwei Monaten verwendet, um eine virale Instabilität zu vermeiden.
Die Hi-5 Insektenzellen (abgeleitet von Trichoplusia.ni-Zellen), welche angepasst wurden, in Medium Ex-CELL 401 (JRH Biosciences, Lenexa, KS, USA) mit 1% Fötalbovinserum zu wachsen, wurden für die Proteinproduktion verwendet. Die Zellen wurden in einer aufrechten Rollerflasche bis zu einer Zellendichte von 2·10⁶ Zellen/ml vermehrt; und sie wurden als Aussaatzellen für eine Bioreaktorkultur verwendet. Die Zellen wurden in einem 20 Liter gerührten Bioreaktor mit Arbeitsvolumen bei 18 Liter (Applikon Inc. Foster City, CA, USA) vermehrt. Die Luftflussrate wurde bei ca. 10 ml pro Minute pro Liter Kulturflüssigkeit betrieben. Die Luft wurde durch reinen Sauerstoff verstärkt, um die gelöster Sauerstoff (DO₂-Rate bei 50% der Luftsättigung zu halten. Das Rühren wurde bei 200 U/min gehalten während der gesamten Kultivierung. Die Zellendichte wurde gestartet bei ca. 5·10⁵ Zellen/ml und die Zellen wurden infiziert, wenn die Dichte 2·10⁶ Zellen/ml erreichte. Die MOI war 3 und die Infektion wurde ausgeführt für 48 Stunden. Nach 48 Stunden der Infektion wurden die infizierten Zellen durch Zentrifugieren bei 3000 U/min für zehn Minuten bei 4°C mittels einer gekühlten Zentrifuge (Modell PR-7000M, IEC, Needham Heights, MA, USA) geerntet. Die Zellenkügelchen wurden eingesammelt und bei –80°C gelagert.
5. Reinigung
6×-His-markiertes KH289
Das grundlegende Reinigungsschema ist in 4 abgebildet. Gefrorene Zellenkügelchen wurden aufgetaut, in eiskaltem Lysispuffer suspendiert und durch einen Mikrofluidisator (Microfluidics Corporation, in Newton, MA) aufgelöst. Der Lysispuffer enthielt 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol und 14 mM Beta-Mercaptoethanol. Das Lysat wurde zentrifugiert für 40 Minuten bei 40000 U/min in einem Ti45-Rotor in einer Beckman L8-70M Ultrazentrifuge. Die lösliche Fraktion wurde durch eine 150 ml Q-Sepharose FastFlow Anionenaustauschsäule (Pharmacia, Piscataway, NJ) gesäult, dann auf eine 40 ml Ni-NTA-Agarosesäule (Qiagen, Santa Clarita, CA) geladen. Nach ausgiebigem Waschen mit dem Lysispuffer wurde die Säule mit 240 ml von 20 mM bis 300 mM Imidazolgradient im Lysispuffer eluiert. Fraktionen, die die Chk1 Kinasedomäne (KH289) enthielten, wurden identifiziert durch SDS-PAGE und verteilt. Die verteilten Fraktionen wurden in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM HCl, 0,5 mM EDTA und 5 mM DTT über Nacht dialysiert. Die dialysierte Verteilung wurde verdünnt mit 1,5 Volumina 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM MgCl₂, 8% Glycerol, 5 mM DTT und sofort auf eine 40 ml ATP-Sepharosesäule geladen. Die Säule wurde mit 200 ml von 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM DTT und 5% Glycerol eluiert. Fraktionen, die KH289 enthielten, wurden verteilt und konzentriert in einer gerührten Milliporzelle unter 60 psi N₂ und auf eine 320 ml HiPrep-Sephacryl-Gelfiltrationssäule geladen und mit demselben Puffer eluiert. Die verteilten Fraktionen wurden konzentriert auf 7 bis 7,5 mg pro ml für die Kristallographie oder auf ~3 mg pro ml für HTS. Das Protein wurde in flüssigem N₂ schockgefroren und bei –80°C gespeichert.
Das Aufrechterhalten der Salzkonzentration bei ca. 500 mM NaCl einschließend 5% Glycerol wurde als entscheidend für das Verhindern von Aggregation der Chk1 Proteine während der Reinigung und Speicherung ohne Beeinflussen der beabsichtigten Verwendung gefunden.
6×-His-markierte KH265 und KH476-Chk1
Im Wesentlichen dieselben Verfahren wurden verwendet, um die Volllängen Chk1 und die Kinasedomäne der Reste 1 bis 265, exprimiert in Insektenzellen, zu reinigen. Die Expressionsproteinniveaus, wie gemessen nach der Ni-NTA Chromatographie, oder die letztendlichen Ausbeuten waren viel geringer als die des KH289 (Volllängensequenz).
Eine Gelfiltrations-HPLC wurde verwendet als ein Mittel der Qualitätskontrolle. Keine signifikante Abweichung wurde beobachtet für Proben, die bei Raumtemperatur, 4°C oder –80°C für vier Tage gespeichert wurden. Das Material wurde bei einem Ausscheidungsvolumen eluiert, das weniger als 0,1% war.
6. Kristallisierung, Kristallographie und dreidimensionale Analyse
Das Volllängen Chk1 Protein (1 bis 476 AA) hat sich als schwierig zu kristallisieren herausgestellt, bis die aktive Kinasedomäne (1 bis 289 AA) identifiziert wurde. Diese aktive Kinase war in der Lage, bei einer hohen Konzentration exprimiert zu werden, benötigt für die Verwendung in HTS und Kristallographie. Der Chk1 Datensatz wurde gesammelt auf einem MarIP345 unter Kryotemperatur mit Stromfrieren. Die HB2-092 Kinasedomänenpräparation (1 bis 289 AA) wurde zuerst verwendet. Der anfängliche Satz bei 2,35 Å wurde erhalten mit Gesamt-Rsym von 4,6% und Gesamtmosaikartigkeit für den Datensatz ist 1,2. Anschließende Experimente mit dem HB2-101 (auch ein 1-289-Klon) erreichten eine 1,7 Å Auflösung mit einer Mosaikartigkeit von 0,38 für die Kinasedomäne unter Verwendung einer Kristallgewachsenen in verfeinerten Bedingungen. Sowohl die Original- als auch die nachfolgenden Kristalle haben eine Raumgruppe P21 mit einem Molekül pro asymmetrischer Einheit. Die Ergebnisse von der kristallographischen Analyse sind in Tabelle 2 unten gezeigt.
Tabelle 2: Statistiken für die kristallographische Analyse
Daten für die äußerste Auflösungsschale sind in Kammern angegeben.

¹
wobei I(h)i die Ith-Messung der Reflexion h ist und I(h) der Mittelwert der N-äquivalenten Reflexionen ist.
² Rcullis = •||FPH +/– FP| – FH(calc)|/•|FPH +/– FP| für alle zentrischen Reflexionen
³ Phasing-Leistung = r. m. s. (|FH|/E), wobei |FH| die Schweratomstrukturfaktoramplitude ist und E das verbleibende Fehler der Schließung ist.
⁴ Anzahl der im Arbeitsaufbau verwendeten Reflexionen.
⁵ Rcryst = •||Fobs| – ||Fcalc||/ – |Fobs|, wobei die Summierung über die in der Verfeinerung verwendeten Daten erfolgt.
⁶ Rfree ist dieselbe Berechnung einschließöich der 10% der von allen Verfeinerungen ausgeschlossenen Daten.

Kristalle wurden gezüchtet bei 13°C unter Verwendung eines Hängetropfen-Dampfdiffusionsverfahrens. Zwei Kristallisationsbedingungen erzeugten die exakt selbe Form von Kristallen. Die Nat1 Kristalle wurden erzielt durch Mischen eines gleichen Volumens von Proteinlösung (7 bis 7,5 mg/ml Protein) und Reservoirlösung von 13% PEG 8000 (w/v), 0,11 M (NH₄)₂SO₄ 0,1 M Na-Kakodylat (pH 6,8), 2% Glycerol. Die Nat2 Kristalle wurden kristallisiert unter Verwendung von Reservoirlösung von 12% PEG8000 (w/v), 15% Isopropanol, 0,1 M Hepes (pH 7,5). Die Kristalle gehören zur Raumgruppe P2₁ und weisen Elementarzelldimensionen von a = 45,2 Å, b = 65,7 Å, c = 58,1 Å, d = 93,9° auf. Die Kristalle enthielten ein Molekül pro asymmetrischer Einheit und sind 53% flüssig pro Volumen. Die Kristalle des Binärkomplex mit AMP-PNP wurden erzielt durch Co-Kristallisierung zuerst unter denselben Kristallisationsbedingungen wie Nat1 Kristall in der Anwesenheit von 1,25 mM AMP-PNP und 2,5 mM MgCl₂, dann wurden die resultierenden Kristalle in Mutterlauge, enthaltend 5 mM MgCl₂ und 20 mM AMP-PNP für zwei Tage eingeweicht. Die Co-Kristalle hatten dieselbe Raumgruppe (P2₁) und Zelldimensionen wie die nativen Kristalle. Alle Diffraktionsda ten wurden gesammelt bei –170°C. Kristalle wurden in Kryoprotektivlösung enthaltend ihre Reservoirlösung und 20% Glycerol eingeführt. Für den AMP-PNP Co-Kristall wurden zusätzlich 10 mM MgCl₂ und AMP-PNP in die Kryoprotektivlösung eingeschlossen. Kristalle wurden dann in einem Strom von Stickstoffgas bei –170°C schockgefroren. Alle Datensammlungen wurden ausgeführt mit Heimatquelle unter Verwendung von CuK Gammastrahlung, erzeugt durch einen Rigalu-Rotationsanoden-FRS-Röntgengenerator, ausgerüstet mit fokussierenden Spiegeln und gemessen mit einem Mar345-Bildplattendetektor. Alle Daten wurden verarbeitet mit dem Denzo/HKL Paket (Otwinowski, Z., "Oscillation Data Reduction Program", Proceedings of the CCP4 Study Weekend: Data Collection and Processing, S. 56–62, kompiliert von: L. Sawyer, et al., SERC Daresbury Laboratory, England (January 29–30, 1993)).
Die anfängliche Apoenzymstrukturbestimmung unter Verwendung von Nat1 Kristalldaten wurde ausgeführt durch Molekularersetzung (MR) unter Verwendung einer modifizierten CdK2-Struktur (ausgelassene Schleifenregionen) (Russo, AA et al., Nature 382(6589): 325–31 (Jul 25, 1996)) als ein Suchmodell. Rotations- und Translationsfunktionen verwendend die A-MoRe Software (Navaza J, Acta Crystallographic, 50(2): Section A (March, 1994)) ergaben eine Lösung verwendend Nat1 Daten von 10 bis 4 Å. Das MR Modell wurde verfeinert durch simuliertes Glühen (X-tlor). Nach aufeinander folgenden Runden der Wiedererstellung und Verfeinerung jedoch waren die zwei Fo-Fc und Fo-Fc-Elektronendichtekarten schlecht bei den Schleifenregionen definiert, welche vom anfänglichen Modell ausgelassen wurden. Um zusätzliche Phaseninformationen zu erhalten wurde eine mehrfache isomorphe Ersetzung mit zwei Schwermetallderivaten ausgeführt: 0,5 mM HgCl₂ (eingeweicht für 15 Stunden) und 5 mM Kau (CN)₂ eingeweicht für 17 Stunden). 5 Hg-Stellen und 5 Au-Stellen wurden identifiziert durch Differenzfouriersynthese unter Verwenden von Phasen, erzeugt vom MR-Teilmodell und waren konsistent mit sowohl den isomorphen als auch den anomalen Differenz-Patterson-Karten. Die Positions- und Wärmeparameter und relative Belegungen für die Schweratomstellen wurden verfeinert unter Verwendung von SIR-Daten bei 3 Å und anomalen Daten bei 3,5 Å durch das Programm PHASES (Furey, W et al. "Phases: a Package of Computer Programs Designed to Compute Phase Angles for Diffraction Data from Macromo lecular Crystals", American Crystallographic Association, Series 2, 18: 73 (1990)). 16 Zyklen der Lösungsmittelabflachung wurden dann durchgeführt unter Verwendung von Phasen, berechnet von verfeinerten Hg- und Au-Positionen. Die resultierenden Elektronendichtekarten zeigten eine gute Backbone-Dichte und gut definierte Seitenketten für den größten Teil des Proteins. Die Modellbildung verwendete das Programm FRODO (Jones, T. A., J Appl Cryst, 11: 268–272 (1978)). Die fehlenden Schleifenregionen wurden in das Modell eingearbeitet unter Verwendung sowohl von MIR-Karten als auch modellabgestimmte zwei Fo-Fc Karten. Eine weitere Verfeinerung im XPLOR (Brunger, AT. et al., X-PLOR Version 3.1: A System for X-ray Crystallography and NMR", Yale University Press, (1992)) und dann CNS (Brunger, AT. et al., Crystallography & NMR System, Acta Cryst., D54: 905–921 (1998)) wurde fortgeführt mit sowohl konjugierter Gradientenminimierung und simulierten Ausglühen, dann gefolgt von manuellem Wiederherstellen.
Die Verfeinerung der Nat2 Struktur wurde ausgeführt durch Verwenden eines verfeinerten Nat1 Modells, jedoch die Reste 153 bis 170 sowie SO₄ auslassend. Die Fo-Fc-Karten zeigten gut definierte Dichten für die fehlende Region und ihre Konformation ist exakt gleich der in Nat1.
Die Verfeinerung des Binärkomplex mit AMP-PNP wurde fortgeführt mit der Verfeinerung der Position des verfeinerten Apo-Enzymmodells (Nat1) als starren Körper gegen die Komplexdaten unter Verwendung des CNS-Programms. Fo-Fc-Karten mit einer σA (Read, R. J., Acta Cryst., A42: 140–149 (1986))-Gewichtung zeigten eine klare Dichte für die Adenin- und Ribosekomponenten des AMP-PNP. Die Konformation der Reste, die die Bindungsausbuchtung bilden, wurde in simulierten Ausglühauslassungskarten überprüft, bevor die Adenin- und Ribosekomponenten des AMP-PNP eingeschlossen wurden.
Das Apo-Enzymmodell (Nat1) beinhaltete alle Atome für die Reste 2 bis 44 und 48 bis 276, 183 geordnete Lösungsmittelmoleküle und ein So4 Molekül. Die verfeinerte Nat2 Struktur enthielt dieselbe Anzahl an Resten und Lösungsmittelmolekülen, jedoch war das SO₄ Molekül nicht vorhanden. Der verfeinerte AMP-PNP Komplex enthielt dieselbe Anzahl an Resten wie die Apostrukturen mit 150 geordneten Lösungsmittelmolekülen und einem SO₄ Molekül. Der Triphosphatrest des AMP-PNP war ungeordnet und keine Mg²⁺ Ionen waren sichtbar. Das letztendliche Modell hatte alle Reste in "am meisten bevorzugt" oder "zusätzlich erlaubt"-Regionen des Ramahandran-Plot gemäß PROCHECK (Laskowski RA et al., J. Appl. Cryst, 26: 283–291 (1993)), wobei keine Reste in "großzügig erlaubt" oder "nicht erlaubt"-Regionen vorlagen, was die gut verfeinerte Natur der identifizierten Kristallstruktur anzeigt. Die Begriffe "großzügig erlaubt" und "nicht erlaubt" sind Beschreibungen der Konfiguration der Phi und Psi-Winkel der Proteinstruktur. Eine gut verfeinerte Proteinstruktur sollte diese Winkel nicht in nicht bevorzugten oder nicht natürlich auftretenden Konfigurationen platzieren.
7. Die Gesamtkinasestruktur
Die Kristallstrukturen der Kinasedomäne der menschlichen Chk1 und ihr binärer Komplex mit einem ATP-Analogon, AMP-PNP, wurden auf 1,7 Å Auflösung bestimmt. Beide Strukturen enthalten die Kinasekerndomäne (Reste 2 bis 367) und die Reste der Linkerregion, die die N-terminale Kinasedomäne mit der C-terminalen Region der Chk1 verbindet. Die kristallographische Analyse ist in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Chk1 Kristallkoordinaten für das Apoenzym (isolierte aktive Chk1) und den Binärkomplex (Chk1 komplexiert mit AMP-PNP, einen ATP-Analogon) sind in den 11A und 11B jeweils gezeigt. Die Koordinaten der festen Wassermoleküle sind ebenfalls darin enthalten.
Die Kinasedomäne der menschlichen Chk1 weist eine kanonische Kinase Zwei-Lappen-Faltung auf mit der ATP-Bindung gespalten zwischen den zwei Lappen (5, Strukturmodell. Der kleinere N-terminale Lappen enthält eine Helix (αC) und fünf β-Stränge (β1 bis β5), die ein gekrümmtes antiparalleles β-Blatt formen. Der größere C-terminale Lappen enthält einen Cluster von sieben Helices (αD bis αI), gepackt gegen sechs β-Stränge (β6 bis β11), welche den Spalt begrenzen. Ein Betastrang (β6') umfasst die Gelenkregion, die die zwei Lappen verbindet. Sowohl in Apoenzym als auch in Binärstrukturen sind die ATP Bindungsstelle, die katalytischen Reste und die Aktivierungsschleife gut geordnet. Vergleiche mit Kristallstrukturen anderer Kinasen zeigt, dass die Chk1 Kinasedomäne eng mit PhK (Lowe, ED et al., EMBOJ, 16(22): 6646–58 (Nov 17, 1997)) verwandt ist (siehe 1A, 1B). Der N-terminale Lappen (Reste 2 bis 90) überlagert mit einem r. n. s. Derivat von Cα Atomen von 1,1 Å, während der C-terminale Lappen (Reste 91 bis 276) mit einem r. n. s. Derivat für Cα Atome von 0,9 Å überlagert. Im C-terminalen Lappen werden große Differenzen in der Helix αG und der Verbindungsschleife zwischen αG und αH gefunden. Diese sind nicht in der Überlagerung enthalten. Das Chk1 Apoenzym nimmt eine offenere Konformation im Vergleich zu PhK an. Der N-terminale Lappen der Chk1 ist ~15° relativ zum ternären Komplex von PhK mit deren Substraten gedreht. Ein Vergleich des AMP-PNP gebundenen Chk1 Binärkomplexes mit der Apoenzymstruktur zeigt keine Änderung in der Konformation. Ein hoher Grad an Sequenzhomologie für die Chk1 Kinasedomänen von verschiedenen Spezies (2) schlägt vor, dass eine umfassendere strukturelle Konservierung der Kinasedomäne vorliegt. Reste, die nicht in den gegenwärtigen Strukturen modelliert sind, sind nicht im Chk1 konserviert. Beispielsweise besteht eine 6-Rest-Insertion in der Schleife, die β3 und αC in S. Pombe-Chk1 verbindet.
Die zwei Lappen werden zusammengehalten durch ein ausgedehntes Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk an der Lappenschnittstelle, welche die Schleife einbezieht, die αC und β4 des N-terminalen Lappens, β6' der Gelenkregion und β7 und β8 des C-terminalen Lappens verbindet. Dieses Netzwerk erstreckt sich von der Hinterseite des Proteins zur vorderen Öffnung des ATP-Bindungsspalts. Die Reste, die in dieses Netzwerk einbezogen sind, bilden auch einen Teil der Ausbuchtung, die mit dem Adeninrest von AMP-PNP interagiert. Der Strang β8 geht unmittelbar dem kinasekonservierten DFG-Motiv voran, in welchem Asp148 wichtig für die Anordnung der Phosphatgruppen des ATP ist. Die einzige berichtete Mutation in der Chk1 Kinasedomäne ist bei der Lappenschnittstelle. Eine Ersetzung des konservierten Glu85 durch Asp führt zu einem temperatursensitiven Phenotyp in Spalthefe, in welchem der Mutant einen Zellzyklusarrest nach UV Bestrahlung aufrechterhält, jedoch den DNA Replikationskontrollpunkt bei einer nicht-permisiven Temperatur beeinträchtigt (Francesconi, S et al., EMBOJ, 16(6): 1332–41 (Mar 17, 1997)). Die Seitenkette von Glu85 am Ende des Strangs β5 bildet Wasserstoffbrücken mit der Seitenkette des konservierten Lys145 von Strang β8 sowie mit dem Hauptkettenamid von konserviertem Lys69, das dem Strang β4 vorausgeht. Diese Interaktionen, zusammen mit dem ausgeprägten Wasserstoffbrückennetzwerk an der Lappenschnittstelle, scheinen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der korrekten Disposition des N-terminalen Lappens und der DFG-Schleife während der Lappenbewegung zu spielen. Die Mutation Glu zu Asp würde, während eine gleiche Ladung aufrechterhalten wird, nicht lange genug sein, um jene Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden, die durch Glu85 bereitgestellt werden, wobei die Lappeninteraktionen geschwächt und das Mutationsprotein weniger stabil bei einer höheren Temperatur wird.
Die meisten der invarianten Reste der Chk1 Proteine sind beim C-terminalen Lappen angeordnet. Viele von ihnen sind auch konserviert unter den Ser/Thr-Kinasen und sind involviert in die Stabilisierung der katalytisch aktiven Kinasekonformation und in die Bindung von ATP. Die Positionen vieler invarianter Motive von Chk1 Proteinen sind erwähnenswert. Verglichen mit anderen Ser/Thr-Kinasen verkürzt das IEPDIG-Motiv (Reste 96 bis 101) αD auf eine Helix mit einer Windung, da Pro98 eine enge Windung zwischen αD und αE initiiert. Diese Windung interagiert mit dem C-Terminus der Helix αF durch eine Backbone-Wasserstoffbrückenbindung zwischen Asp99 und dem Invarianten Gly204. In dieser Windung bildet Glu97 Backbone-Wasserstoffbrückenbindungen mit Ile100 und Gly101. Die eindeutige Konformation dieses Motivs scheint wichtig zu sein für die Peptidsubstratinteraktion, da die Seitenketten von Ile96 und Pro98 einen Teil der hydrophoben Ausbuchtung bilden, die mit dem Peptidsubstrat interagiert, wie unten diskutiert. Die Helix αE enthält ein konserviertes Motiv von AQXFFXQL (Reste 107 bis 114; SEQ ID NR: 24), wobei die hydrophoben Reste innerhalb des C-terminalen Lappens versenkt sind. Die Seitenkette von Gln108 ragt in Richtung der Linkerregion hervor, die der Kinasekerndomäne folgt, und bildet Wasserstoffbrückenbildungen direkt oder durch ein Wassermolekül an die Backboneatome von Lys267, Leu269 und Lys270. Obwohl die Chk1 Sequenzen in dieser Linkerregion divergieren, konnten diese Backbone-Interaktionen mit Gln108 noch konserviert werden, den Linker gegen den N-Terminus von αE haltend. Die Helix αG ist unterschiedlich positioniert, verglichen mit αG von PhK. Zwei Sätze von Invarianten PW Resten (207 und 208, 230 und 231), flankierend αG, obwohl durch 21 Reste getrennt, stehen im van der Waals Kontakt und sind verbunden zum hydrophoben Kern des C-terminalen Lappens. Dies stabilisiert die Oberfläche für die Peptidsubstratinteraktion.
Aktivierung und katalytische Schleifen
Interessante Merkmale der Chk1 Kinasedomäne beinhalten Interaktionen, die die Aktivierungsschleife stabilisieren. Die Struktur der Aktivierungsschleife bestimmt die Anordnung der Reste, kontaktierend ATP und eine Katalyse in Proteinkinasen durchführend. Interagierend mit der katalytischen Schleife orientiert die Aktivierungsschleife das katalytische Asp; interagierend mit dem N-terminalen Lappen schließt die Aktivierungsschleife die N- und C-terminalen Lappen und ordnet Reste an, die mit den Phosphaten des ATP interagieren. Die Aktivierungsschleife ist definiert als die Region zwischen den konservierten Motiven von DFG und APE, korrespondierend zu Resten 148 bis 177 von Chk1. Änderungen in der Konformation in der Aktivierungsschleife dienen als Hauptregulationsmechanismus für die Kinaseaktivität. In den menschlichen Chk1 Strukturen ist die Aktivierungsschleife gefaltet in eine Konformation ähnlich jener, die in Strukturen von aktiven Kinasen gefunden wird, konsistent mit der Beobachtung, dass die Chk1 Kinasedomäne grundlegend aktiv ist. Diese aktive Konformation wird stabilisiert durch spezielle Merkmale der Chk1 Sekundärstrukturen und deren Seitenketteninteraktionen (3 und 5, Homologiemodell und Kristallstruktur).
Der N-Terminus der Aktivierungsschleife interagiert mit der katalytischen Schleife durch die Interaktion von β6 und β9. Unmittelbar folgend β9, interagiert β10 mit β11, um eine zweisträngige Betaschleife mit einer Windung bei Asn159 zu bilden. Diese Beta-Schleife ist gepackt gegen den N-Terminus der katalytischen Schleife und positioniert die hochkonservierten Arg156 und Glu161. Die Seitenkette von Arg156 interagiert mit dem Carbonyl des invarianten His122 am Ende von αE. Durch das invariante Asp190 ist die Seitenkette von His122 verbunden mit dem Amid von Arg129, benachbart zum katalytischen Rest Asp130. Das Carboxyl von Glu161 bildet eine Wasserstoffbrückenbindung mit dem Imidazol von His185, das αF vorangeht. Diese Interaktionen verankern dieses Ende der Aktivierungsschleife an den Kern des C-terminalen Lappens. Das Zentrum der Aktivierungsschleife interagiert mit dem Rest des C-terminalen Lappens durch zwei Backbone-Wasserstoffbrückenbindungen zwi schen Leu164 und Phe184. Die Aktivierungsschleife endet an ihrem c-Terminus mit einer Windung, welche von αEF getragen wird. In menschlicher Chk1 ist αEF verankert an zwei Positionen an den Kern des C-terminalen Lappens durch zwei Ionenpaare, eines ist das Invariante Kinaseionenpaar zwischen Glu177 und Arg253, das andere ist zwischen Lys180 und Glu248, was einzigartig für Chk1 ist. Dieses Extraionenpaar beschränkt die Bewegung von αEF und wiederum die Bewegung des C-terminalen Endes der Aktivierungsschleife. Das Paar von Lys180 und Glu248 wird lediglich in Vertebrat-Chk1 konserviert, eine potentielle Flexibilität von αEF und der Aktivierungsschleife von Chk1 in niedrigeren Organismen wie beispielsweise S. Pombe vorschlagend.
Kristallstrukturen der Kinasen zeigen an, dass die Konformation der Aktivierungsschleife von ihrer negativen Ladung beeinflusst wird, welche ein Cluster von positiv geladenen Resten neutralisiert, obwohl die ionischen Interaktionen nicht absolut erforderlich sein können, wie im Fall von Säugetier-Kaseinkinase I. Die negative Ladung wird bereitgestellt durch Phosphat durch Phosphorylierung, Carboxylgruppe von Glu oder Lösungsmittelionen. In Chk1 ist das positiv geladene Cluster von Arg129, Arg162, Lys166 und Lys54 vorhanden, jedoch wird keine Phosphorylierung beobachtet. In sowohl den Apoenzym- als auch den Binärkomplexstrukturen, bestimmt auf 1,7 Å, war ein Sulfation nahe der Phosphatposition des Phosphotreonin (Thr197) in PKA. Dieses Sulfation interagiert mit Arg129, Arg162 und Thr153. Sulfat ist vorhanden in der Kristallisationslösung und könnte zur Stabilität des positiv geladenen Clusters und der Aktivierungsschleife beitragen. Um die Rolle dieses Sulfations zu klären und besser die Interaktionen zu verstehen, die die Aktivierungsschleife stabilisieren, wurden Kristalle unter sulfatfreier Bedingung hergestellt und die Struktur auf 2,1 Å bestimmt (Tabelle 2). Diese 2,1 Å Struktur wird als Nat2-Struktur bezeichnet, wohingegen die 1,7 Å Apoenzymstruktur als Nat1-Struktur bezeichnet wird. In der Nat2-Struktur ist kein Sulfation vorhanden.
Eine Überlagerung von Nat1 und Nat2 Strukturen zeigte ähnliche Konformationen für die korrespondierenden Aktivierungsschleifen mit der Ausnahme für die Seitenkette von Arg162, welche in Richtung des Lösungsmittels in der Nat2-Struktur dreht. Die Seitenkette von Arg 162 ist flexibel in beiden Strukturen, wie angedeutet durch ihre hohen Temperaturfaktoren. Arg162 ist ein invarianter Rest von Chk1 und seine Funktion ist nicht leicht aus der Struktur ersichtlich. Sowohl in der Nat1 als auch der Nat2 Struktur bildet die Seitenkette von Arg129 Wasserstoffbrückenbindungen an drei Hauptkettencarbonylsauerstoffe (Leu151, Ala152 und Lys166), direkt oder über Wassermoleküle. Die positive Ladung von Arg129 könnte neutralisiert werden durch die Thiolgruppe von Cys168, welche in der Nachbarschaft der Seitenkette von Lys166 und Arg129 ist. In dieser basischen Umgebung könnte dieses Thiol ein Thiolation werden. Cys168 ist invariant in Chk1 und ist konserviert in vielen Kinasen wie beispielsweise PKA und PhK. Unsere Ergebnisse schließen die Rolle des Sulfations in der Stabilisierung der Aktivierungsschleife von Chk1 aus. Statt dessen werden die Aktivierungsschleife und die katalytische Schleife stabilisiert durch ihre eindeutigen Sekundärstrukturen und deren ausgedehnte Seitenketteninteraktionen.
Ein Unterschied zwischen Chk1 und anderen Kinasen sind die permutierten Positionen von Lys166 und Thr153 (2). Lys166 besitzt die äquivalente Position wie Glu182 von Phk und das phosphorylierte Thr197 von PKA, wohingegen Thr153 äquivalent zu Lys189 von PKA ist. Die Seitenkette von Thr153 bildet eine Wasserstoffbrückenbindung mit der Seitenkette von Lys54, angeordnet in Helix αC. Thr153 wird konserviert in Chk1 (Thr oder Ser) und ist ein Kandidat für die Phosphorylierung in der Aktivierungsschleife. Die permutierte Position jedoch macht die Phosphorylierung des Thr153 unwahrscheinlich. Die Aktivierungsschleife ist bereits in einer aktiven Konformation in Chk1 und eine Phosphorylierung wäre unnötig. Lys54 wird konserviert in allen bis auf S. Pombe Chk1 und benachbart zu Glu55, welches das invariante Iionenpaar mit Lys38 in aktiven Kinasen bildet. Die Interaktion zwischen Thr153 und Lys54 scheint deshalb eine ähnliche Rolle zu spielen wie die Interaktion zwischen His87 des Phosphats von Thr97 von PKA. Die Seitenkette von Lys166 zeigt zu Cys168 und ihre Position scheint eine Rolle bei der Bestimmung der Substratspezifität wie unten diskutiert zu spielen. In S. Pombe Chk1 ist der Rest, der mit Lys166 korrespondiert, Ser, was eine potentielle Regulierung der Aktivität der S. Pombe Chk1 durch Phosphorylierung vorschlägt. Gleichzeitig scheint die Aktivierungsschleife von S. Pombe Chk1 flexibler zu sein, da ihre Substitutionen manche der Interaktionen unterbrechen würde, die die Aktivierungsschleife stabilisieren.
Katalytische Reste und AMP-PNP-Bindung
Die glycerinreiche Schleife, die die Phosphatgruppen des ATP in Kinasen verankert, ist schlecht in Chk1 geordnet, wie bewiesen durch die hohen B-Faktoren in dieser Region für sowohl die Apoenzymstrukturen als auch die AMP-PNP-gebundene Binärkomplexstruktur. Die Reste 18 bis 21 am Apex der Schleife zwischen β1 und β2 sind flexibel mit schlechter Elektronendichte. Diese Reste sind hoch konserviert in Kinasen und verankern das β-Phosphat von ATP in ATP gebundenen Kinasestrukturen. Die Flexibilität dieser Schleife könnte eine Rolle bei der Regulation der Chk1 Kinaseaktivität spielen, tatsächlich korrespondiert ein in höheren Organismen vorhandenes Tyr20 strukturell mit Tyr15 von Cdc2, welches einer Phosphorylierung folgend die Cdc2 Aktivität hemmt (Coleman TR, et al., Curr Opin Cell Bio, 6(6): 877–82 (Dec, 1994); Russo, AA et al., Nature, (1996), supra).
Ein bemerkenswertes Merkmal unter den aktiven ternären Komplexen wie beispielsweise PKA und PhK ist die enge Ähnlichkeit der aktiven Seitenrestkonformation, deren Interaktionen mit dem ATP und die Koordination der Metallionen. Die Binärkomplexe, die aufgelöst wurden, zeigen keine derartige Konservierung (Knighton DR, et al., J Mol Biol, 220(2): 217–20 (Jul 20, 1991); Bossemeyer, D et al., EMBOJ, 12(3): 849–59 (Mar 1993); Zheng J, et al., Protein Sci, 2(10): 1559–73 (Oct 1993); Owen DJ. et al., Structure, 3(5): 467–82 (May 15, 1995); Lowe, et al., EMBO J, (Nov 17, 1997), supra.). Viele der aktiven Seitenreste in der Chk1 Struktur weisen Interaktionen auf, die ziemlich ähnlich zu jenen in ternären Komplexen von PhK und PKA sind (4A, 4B). Im N-terminalen Lappen ist das invariante Ionenpaar von aktiven Kinasen zwischen Lys38 und Glu55 vorhanden; das korrespondierende Lys in PhK und PKA interagiert mit α und β Phosphaten von ATP. Die Helix αC ist fest an den Rest des N-terminalen Lappens durch hydrophobe Interaktionen gebunden und befindet sich in einer aktiven Position relativ zum Rest des N-terminalen Lappens. Sie interagiert ferner mit der DFG Schleife im C-terminalen Lappen, die Seitenkette von Glu55 von αC ruht oberhalb Gly150. Die relativen Seitenkettenpositionen von Lys38, Glu55 und Asp148 sind ähnlich zu jenen für die korrespondierenden Reste in den ternären Komplexen von PKA und PhK. Die Reste in PKA und PhK, zusammen mit der glycerinreichen Schleife, koordinieren ein Mg²⁺ und verankern die α- und β-Phosphate von ATP. Im C-terminalen Lappen ist die Konformation der katalytischen Schleife (Reste 130 bis 135) von Chk1 annähernd identisch zu der in PhK mit den Seitenketten von Asp130, Lys132 und Asn135 in Chk1 nahezu überlagerbar zu den korrespondierenden Resten Asp149, Lys151 und Asn154 in PhK, in welchem Lys151 an das γ-Phosphat von AMP-PNP bindet und Asn154 ein weiteres Mg²⁺ chelatiert, das an die β- und γ-Phosphate von AMP-PNP bindet. Tyr170 ist konserviert in allen Serin/Threoninproteinkinasen und scheint die Spezifität von Ser/Thr gegen Tyr als Phospho-Akzeptor zu bestimmen. Thr170 bildet Wasserstoffbrückenbindungen mit Asp130 und Lys132 analog zu Thr186 in PhK und diese Interaktionen werden benötigt für die Positionierung des Carbonyls des katalytischen Rests Asp130. Die Reste von Chk1 jedoch sind weit weg von jenen im N-terminalen Lappen und der DFG Schleife aufgrund zu einer in gewissem Maße offenen Lappenkonformation (6). die DFG Schleife ist höher als ihre Gegenstücke in PKA und PhK positioniert. Lys389Nε ist 10 Å entfernt von Asp130Oδ2, verglichen mit 8,2 Å in PhK und 7,8 Å in PKA. Asp148Oδ1 ist 6 Å entfernt von Asp130Oδ2, verglichen mit 3,8 Å in PhK und 4,8 Å in PKA. In Chk1 ist ein Wassermolekül angeordnet zwischen Asp148 und Asp130 und ist wasserstoffbrückengebunden an Asp130Oδ2 sowie Asn135Oδ1. Die Seitenkette von Asn135 ist über 1 Å weiter entfernt von Asp148 relativ zur aktiven Konformation in PhK. Die Reste, die notwendig für die ATP Phosphatbindung und Katalyse sind, sind in zwei separate Teile geclustert, obwohl sie ihre lokalen Interaktionen aufrechterhalten. Das Fehlen von Elektronendichte des Triphosphatrests des AMP-PNP im binären Komplex von Chk1 resultiert wahrscheinlich von der Fehlanordnung dieser Reste sowie der Flexibilität in der glycerinreichen Schleife.
Die Adenin- und Ribosereste sind klar definiert in unserem gegenwärtigen Modell. Wie in allen Strukturen von Kinasen mit ATP ist die Adeninbase beinahe vollständig in einer hydrophoben Ausbuchtung zwischen zwei Lappen versenkt, und Wasserstoffbrückenbindungen werden gebildet zwischen N6 von Adenin und dem Hauptkettencarbonyl von Glu85 und zwischen N1 und Amid des Cys87. Wie in PhK interagiert Chk1 N7 mit der Seitenkette von Ser147 über ein Wassermolekül in Chk1. Der Ribosering jedoch nimmt eine C2'-endo Konformation an, die ähnlich der in der inaktiven Form von Cdk2 ist (PDB ID code 1HCK, (De Bondt HL, et al., Nature, 363(6430): 595–602 (Jun 17 1993); Schulze-Gahmen U et al., J Med Chem, 39(23): 4540–6 (Nov 8, 1996)), mit der O2'-Wasserstoffbrückenbindung an Glu91 und O3'-Wasserstoffbrückenbindung an das Carbonyl von Leu15 in der glycerinreichen Schleife. Zum Vergleich haben die Riboseringe C3'-endo sich in den aktiven ternären Komplexen von PKA und PhK kräuselnd.
Substratspezifität und Interaktionen, die die geschlossenen Konformation stabilisieren.
Die strukturierte Aktivierungsschleife von Chk1 stellte eine Möglichkeit bereit, die Basis der Peptidsubstratspezifität zu erkunden. Die große Ähnlichkeit von Chk1 mit PhK und die verfügbaren Strukturen von PhK mit und ohne Peptidsubstrat ermöglichen uns, die Interaktionen des Peptidsubstrats mit Chk1 zu modellieren. Die Interaktion der Kinasen mit deren Peptidsubstraten wurde analysiert für drei Kinasen, PKA mit einem Inhibitorpeptid von PKI (PDB code 1 ATP, (Knighton DR, J Mol Biol, (Jul 20, 1991), supra.), PhK mit MC-Peptid (PDB Code 2PHK, (Lowe, et al., EMBO J, (Nov 17, 1997), supra.) und in Insulinrezeptortyrosinkinase mit einem Peptidsubstrat (PDB code 1IR3, (Hubbard SR, EMBO J, 16(18): 5572–81 (Sep 15,1997)). In allen drei tertiären Komplexstrukturen nehmen die Backbones der Peptidsubstrate um die Phosphatakzeptorreste herum eine ausgedehnte Konformation an und interagieren hauptsächlich mit den C-terminalen Lappen.
Das bekannte Chk1 Kinasesubstrat ist die Cdc25C Proteinphosphatase. Mehrere Phosphatakzeptor-Ser-Reste wurden identifiziert in der Cdc25C Proteinsequenz. Übereinstimmende Merkmale können abgeleitet werden von Sequenzen, die das Phosphatakzeptor-Ser (Position P) umgeben: Die N-terminale P-3-Position ist ein konserviertes Arg, die P-5-Position bevorzugt sperrige hydrophobe Reste und P – 2 ist Ser oder Thr. Die Phosphorylierung von Ser216 von menschlichem Cdc25C ist nötig für einen DNA schädigungsinduzierten G2-Arrest und Ser216 wird phosphoryliert durch Chk1 in vitro (Peng et al., Science (1997), supra.; Sanchez et al., Science (1997), supra.). Deshalb wurde das Peptid LYRSPSMPE, das die Reste 211 bis 219 des menschlichen Cdc25C umspannt, verwendet zum Modellieren der Interaktion des Peptidsubstrats mit Chk1, basierend auf dem ternären Komplex von PhK mit MC-Peptid.
Das modellierte Cdc25C Peptid passt einfach in einen Spalt auf dem C-terminalen Lappen von Chk1, folgend einem Pfad sehr ähnlich zu dem des an PhK gebundenen MC-Peptids (7). Das Oγ Atom von Ser (P), das angenommene Nukleophil in der Phosphattransferreaktion, ist sehr nahe an einem geordneten Wassermolekül in Chk1 Strukturen. Dieses Wassermolekül bindet über Wasserstoffbrückenbindung sowohl an das Asp130Oδ2 und Lys132Nε. Die Superposition von Chk1 und PhK zeigt, dass dieses Wassermolekül 3,4 Å von dem γ-Phosphoratom des AMP-PNP in PhK entfernt wäre. Die Position dieses Wassermoleküls zeigt wahrscheinlich den ungefähren Ort des Seryl-Hydroxyls während der Katalyse an.
Die hydrophobe Seitenkette des Leu (P – 5) passt in die hydrophobe Ausbuchtung, gebildet durch Phe93, Ile96, Pro98 und Leu206. Alle diese Reste mit Ausnahme von Leu206 sind invariant in den Chk1 Proteinen. Die Seitenkette von Arg (P – 3) zeigt in Richtung Glu91 von Chk1. In seiner ausgedehnten Konformation jedoch kann die Guanidingruppe dieses Arg lediglich eine Wasserstoffbrückenbindung (3 Å) mit dem Carbonyl von Glu91 eingehen. In sowohl PKA als auch PhK bildet das Guanidin von Arg (P – 3) eine Salzbrücke (2,5 Å) mit den Carboxyl der korrespondierenden Glu Reste. Wie oben diskutiert können Ioneninteraktionen von Arg und Glu91 nach einem Schließen des Lappens etabliert werden.
Die Seitenkette von Ser (P – 2) könnte eine Wasserstoffrückenbindung an den BackBone Carbonylwasserstoff von Pro (P – 1) eingehen. In PhK interagiert Gln (P – 2) des MK-Peptids mit Ser188. Diese Interaktion ist nicht verfügbar für Chk1, da sie ein invariantes Pro172 in der korrespondierenden Position von Ser188 in PhK aufweist. Pro172 kann dann zur Spezifität von Chk1 für Ser oder Tyr bei der P – 2 Position beitragen und die interne Wasserstoffrückenbindung, bereitgestellt durch Ser oder Thr bei der P – 2 Position, kann eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Konformation dieses Substrat Backbones an dessen N-Terminus spielen.
Die hydrophobe Seitenkette von Met (P + 1) ragt in eine hydrophobe Ausbuchtung vor, gebil det durch Reste von Leu171, Wal174, Leu178, Leu179 und Met167. Die P + 2 Position kann lediglich eine kleine Seitenkette oder eine Windung beherbergen aufgrund der einzigartigen Position von Lys166. Lys166 ist konserviert unter Wirbeltier-Chk1 Proteinen. Entsprechend ist Pro an der P + 2 Position der Cdc25 Substrate zu finden. Pro (P + 2) erzeugt eine Übereinstimmende 14-3-3 Bindungsstelle, sobald Ser (P) phosphoryliert ist. Das Lys166 von menschlicher Chk1 ist ein Ser Rest im S. Pombe-Chk1. Die Seitenkette von S. Pombe Chk1 könnte phosphoryliert sein und zur Position zeigen, die mit dem Sulfation in der menschlichen Chk1 Struktur korrespondiert. Entsprechend sind sperrige Seitenketten vorhanden bei der P + 2 Position der Substrate von S. Pombe Chk1.
Die Phosphorylierung von Cdc25C durch Chk1 ist sehr spezifisch derart, dass das Ser (P – 2) nicht phosphoryliert wird. Dies ist wichtig für die Cdc25 Regulierung, da die Phosphorylierung an der P – 2 Position die 14-3-3 Bindungsstelle zerstören würde. Unser Modell zeigt klar Determinanten für die Chk1 Substratspezifität an: hydrophobe Interaktion durch P – 5 und P + 1, ionische Interaktion durch P – 3, Ser-Thr bei P – 2 und kleine Aminosäureseitenketten bei P – 2 und kleine Aminosäureseitenketten bei der P + 2 Position.
Obwohl die rekombinante Chk1 Kinasedomäne aktiv ist wenn in Lösung untersucht, zeigt die Struktur, dass sie nicht in einer geschlossen katalytisch aktiven Konformation in entweder dem Apoenzym oder der binären Kristallstruktur vorliegt. Dieses Ergebnis schlägt vor, dass das Apoenzym und der ATP-gebundene Binärkomplex die offene Konformation bevorzugen. Eine Lappenbewegung ist üblich in Kinasedomänen und eine Katalyse erfordert eine geschlossene Konformation (Cox S, et al., Curr Opin Struct Biol, 4(6): 893–901 (Dec, 1994); Gangal M, et al., Biochemistry, 37(39): 13728–35 (Sep 29, 1998)). Interaktionen, die die geschlossene aktive Konformation stabilisieren, wurden nicht im Detail in den früheren Berichten adressiert. Unser Modell schlägt vor, dass eine Schlüsselinteraktion in Chk1 das Ionenpaar zwischen Glu91 mit Arg (P – 3) des Peptidsubstrats ist.
Die Superposition von Chk1 und PhK-Strukturen zeigt an, dass ein Schließen des Lappens von Chk1 erzielt werden kann durch einfache Rotation des N-terminalen Lappens um ~15° um Rest Glu91 herum. Diese Rotation würde Glu91 näher an Arg (P – 3) platzieren und ein Ionenpaar zwischen der Carboxylatgruppe von Glu91 und der Guanidingruppe des Arg (P – 3) etablieren. Ein Schließen des Lappens könnte auch die Ribosekonformation des AMP-PNP in eine C3'-endo Konformation von der C2'-endo Konformation im Binärkomplex verändern. Die katalytisch aktiven Kinaseternärkomplexstrukturen, die bis heute berichtet wurden, haben ihre jeweiligen Riboseringe in einer C3'-endo Konformation gefaltet. Für Chk1, wenn die Ribose in einer C3'-endo Konformation modelliert wird, können zwei Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der Carboxylgruppe von Glu91 und dem O2' und O3' der Ribose gebildet werden. Zum Vergleich weist der Binärkomplex von Chk1 mit AMP-PNP lediglich eine Wasserstoffbrückenbindung zwischen Glu91 und der Ribose auf. Die Chk1-Kinasedomäne in Lösung verschiebt sich leicht dynamisch ("atmet") zwischen der offenen und geschlossenen Konformation. Die gegenwärtigen Chk1 Strukturen weisen offene Konformationen auf und haben gezeigt, dass der ATP-Bindungsspalt zugänglich für Lösung ist. In der geschlossenen Konformation kommen die Reste für die Phosphatbildung und Katalyse zusammen und ordnen das Phosphat für den Transfer an. Die zusätzliche Interaktion von Glu91 mit Arg (P – 3) des Peptidsubstrats und mit der Ribose des ATP würde das Gleichgewicht zu der geschlossenen aktiven Konformation verschieben. Deshalb erreichen Peptidsubstrate eine Spezifität teilweise durch ihre Fähigkeit, die geschlossene katalytisch aktive Konformation von Chk1 zu stabilisieren.
8. Regulierung der Chk1 Kinaseaktivität
Die Phosphorylierung des Chk1 Substrats, Cdc25, und der resultierende Zellzyklusarrest wurde korreliert mit der Aktivierung von Chk1 nach DNA Schädigung. Ob die Phosphorylierung von Chk1 ihre Kinaseaktivität reguliert, ist unklar. Die Struktur von menschlicher Chk1 deutet darauf hin, dass ihre Aktivität nicht durch Phosphorylierung der Aktivierungsschleife reguliert wird. Stattdessen scheint die Aktivierungsschleife von Chk1 durch ausgiebige Interaktionen durch starre sekundäre Strukturen und deren Seitenketten verankert zu sein. Interessanterweise könnte eine Phosphorylierung der Aktivierungsschleife in S. Pombe Chk1 auftreten, welches eine Ser-Substitution an der Position von Lys166 aufweist. Ob Chk1 unterschiedlich in S. Pombe und Säugetieren reguliert ist, erfordert die Identifizierung der Reste, die nach einer DNA Schädigung phosphoryliert werden.
Die Struktur der Chk1 Kinasedomäne und ihr Binärkomplex mit AMP-PNP bieten einen Einblick in ihren Aktivierungsmechanismus. Zuerst zeigen die Strukturen eine einzigartige Anordnung der Reste für die Phosphatbindung und Katalyse. Speziell sind die Reste für α und β Phosphatbindung getrennt von jenen für γ Phosphatbindung und Katalyse. Die Anordnung dieser Reste wird erreicht in einer geschlossenen Konformation, welche durch das Peptidsubstrat stabilisiert wird. Unser Modell sagt eine niedrige ATPase Aktivität von Chk1 voraus und bevorzugt einen geordneten kinetischen Mechanismus, in welchem die ATP Bindung der Peptidsubstratbindung vorausgeht. Zweitens schließen die Strukturen eine Rolle für die Aktivierungsschleife in menschlicher Chk1 beim Regulieren der Kinasedomänenkonformation aus. Die Aktivierungsschleife ist höchstwahrscheinlich durch starre Sekundärstrukturen und die ausgiebigen Interaktionen ihrer Seitenketten aufrechterhalten. Es besteht jedoch eine Möglichkeit von verschiedenen regulatorischen Mechanismen für S. Pombe-Chk1, welche deren unterschiedliche Zellzyklusprozesse und unterschiedliche DNA Schädigungsreparaturmechanismen widerspiegeln können. Zusätzlich wurden die Interaktionen, die die aktive Kinasekonformation stabilisieren, identifiziert. Die Anwesenheit von Glu in vielen Kinase-Gelenkregionen und Arg an der P – 3 Position von deren Substraten deutet eine allgemeine Rolle für diese Interaktion bei der Aufrechterhaltung der geschlossenen Konformation für Ser/Thr Kinasen an. Interaktionen, die die Peptidsubstratspezifität bestimmen, deuten eine übereinstimmende Sequenz an, die nützlich ist zum Identifizieren eines potentiellen Chk1 Substrats. Zuletzt stellt die Chk1 Kinasedomänenstruktur eine Anleitung für ihre zukünftige Charakterisierung sowie das Design von speziellen Inhibitoren bereit, die die Kontrollpunktsteuerung außer Kraft setzen können für die Krebstherapie.
9. Enzymatische Aktivität von Chk1
Die enzymatische Aktivität einer Kinase wird gemessen durch ihre Fähigkeit, den Transfer eines Phosphatrests von einem Nukleosid-Triphosphat auf eine Aminosäureseitenkette in ei nem ausgewählten Proteinziel zu katalysieren. Die Umwandlung von ATP zu ADP begleitet im Allgemeinen die katalytische Reaktion. Hierin wurde ein synthetisches Substratpeptid, Syntid-2, eine Aminosäuresequenz PLARTLSVAGLPGKK (SEQ ID NR: 11) aufweisend, verwendet. Die Produktion von ADP von ATP, die den Phosphoryltransfer auf das Substrat begleitet, wurde an die Oxidation von NADH unter Verwendung von Phosphoenolpyrovat (PEP) durch die Aktionen von Pyrovat-Kinase (PK) und Lactatdehydrogenase (LDH) gekoppelt. Die Oxidation von NADH wurde überwacht durch Verfolgen der Abnahme der Absorption bei 340 Nanometer) e340 = 6,22 cm^–1mM^–1) unter Verwendung eines HP8452-Spektrometers. Die typischen Reaktionslösungen enthielten: 4 mM PEP, 0,15 mM NADH, 28 Einheiten von LDH/ml, 16 Einheiten von PK/ml, 3 mM DTT, 0,125 mM Syntid-2, 0,15 mM ATP und 25 mM MgCl₂ in 50 mM TRIS pH 7,5; 40 mM NaCl. Die Versuche wurden initiiert mit 10 nM der Kinasedomäne von Chk1, KH289. K_i-Werte wurden bestimmt durch Messen der anfänglichen Enzymaktivität in der Anwesenheit von variierenden Konzentrationen von Inhibitoren. Die Daten wurden analysiert unter Verwendung der Software Enzyme Kinetik und Kaleidagraph.
Die unten stehende Tabelle (Tabelle 3) vergleicht die drei unterschiedlichen Präparationen von Chk1. Die erste Präparation ist die Volllängenform, welche die Aminosäuren 1 bis 476 von SEQ ID NR: 2 umfasst. Die nächste Präparation enthält proteolytisch gespaltene Fragmente, eine Mischung von Chk1 Proteinfragmenten, erhalten vom Volllängenprotein während Fermentation. Die exakten involvierten Enzyme und Spaltungsstelle, erzeugt für diese Fragmente, ist unbekannt. Eine Analyse der Fragmente deutete jedoch an, dass eines von ihnen ähnlich in der Größe zu dem 1–289 ist. Die dritte Präparation ist die Kinasedomäne der Aminosäuren 1 bis 289 von SEQ ID NR: 2 (KH289). Wie oben erwähnt detektiert der verwendete Test das ADT Produkt durch Koppeln durch die enzymatischen Aktionen der Pyrofatkinase und Lactatdehydrogenase.
Tabelle 3:
Zusätzliche Aktivitätsvergleichsexperimente wurden durchgeführt unter Verwendung von neuen Präparationen von Volllängen Chk1, proteolytisch gespaltener Chk1 und Kinasedomänen Chk1. Die Präparationsbedingungen waren wie oben beschrieben. Erneut war die gespaltene Präparation 38 mal aktiver als die nichtgespaltene Präparation.
10. Hochdurchsatz-Screens
Die folgenden Substrate wurden auf ihren Peptidgehalt und ihre Aktivität getestet:
Tabelle 4: Peptidsubstrate
Wie im Detail unten beschrieben involviert ein Aspekt der Erfindung eine nichtradioaktive ELISA-basierende Untersuchung, geeignet für Hochdurchsatzscreening (HTS). Die Entwicklung der ELISA basierenden Chk1 Kinase HTS-Untersuchung wurde zuerst mit einem monoklonalen Anti-Phosphoserin-Antikörper, Klon PSR-45 genannt, geliefert von Sigma, initiiert. Neue Chk Peptidsubstrate, Analoge von Syntid 2, wurden synthetisiert, um diese Untersuchung zu validieren. Diese Peptide sind in Tabelle 4 aufgelistet. Biotin-Syntid-2 (SEQ ID NR: 12) und N-Terminus-acetyliertes Syntid-2 (SEQ ID NR: 13) und die erwarteten Peptid produkte nach CHK-Phosphorylierung, Serin-phosphoryliertes Syntid-2 (SEQ ID NR: 15), und Serin-phosporylierfes Biotin-Syntid-2 (SEQ ID NR: 16) wurden für die Untersuchungsentwicklung synthetisiert. Obwohl die Untersuchung gut in Lösung mit diesen Peptiden funktionierte, funktionierte sie nicht, wenn das Peptid (Serin-phosphoryliertes Syntid-2 – SEQ ID NR: 15) auf DNA-BIND-(Costar) 96-Well-Platten immobilisiert wurde. Dieser Antikörper funktionierte auch nicht gut, wenn das Biotin-markierte Peptid mittels Neutravidin-beschichtete 96-Well-Platten (Pierse) immobilisiert wurde. Um diese Begebenheiten zu umgehen wurde ein polyklonaler Antikörper, spezifisch gerichted gegen phosphoryliertes Syntid-2 (SEQ ID NR: 15), in Kaninchen gezüchtet. Für den polyklonalen Antiphosphosyntid-Antikörper der Kaninchen wurde gefunden, dass er Phoshorserin sowohl in Syntid-2-Ser-PO₃ (Untersuchung auf DNA-BIND-Platten) oder auf Biotin-Syntid-2-Ser-PO₃ (untersucht auf Neutravidin-beschichteten 96-Well-Platten) quantitativ und spezifisch erkennt, wenn verglichen mit den unphosphorylierten Peptidgegenstücken. Eine modifizierte Chk1 HTS-Untersuchung ELISA wurde entwickelt unter Verwendung von His-markierter KH289 Chk1 Kinase, Biotin-Syntid-Substrat, untersucht auf Neutravidin-beschichteten 96-Well-Platten, und dem Antiphosphosyntid-Antikörper der Kaninchen, um das phosphorylierte Produkt zu detektieren.
Dieses Chk1 Kinase ELISA-HTS berücksichtigte das Roboterscreening von Verbindungsbibliotheken. Hierin wurde die Beckman Roboterstation verwendet. Zuerst wurde die Chk1 Kinase in Neutravidin beschichteten 96-Well-Platten in 100 μl/Well von Reaktionsmischung untersucht. Die Reaktionsmischung umfasst 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 3 mM DTT, 400 mM NaCl, 50 μM ATP, 10 μm Biotion-Syntid-2-Peptidsubstrat und 10 nM Chk1 Kinase (KH289). Die Untersuchung wurde durchgeführt sowohl mit als auch ohne 20 μM Testverbindung. Hierin hatte das Biotin-Syntid-2-Substrat die folgende Sequenz: PLARTLSVAGLPGK-biotin-K (SEQ ID Nr. 12).
Die Analyse ist in 10 abgebildet. Im Schritt A wurde 93 μl der Reaktionsmischung (weniger sowohl der Chk1 Kinase als auch des Biotin-Syntids) zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 2 μl der Testverbindung (20 μM letztendlich). Die Kinasereaktion wurde initiiert durch die Zugabe von 5 μl Enzymsubstratblock (200 nM Chk1 Kinase und 200 μM Biotin Syntid). Der Kinasereaktion wurde erlaubt, für zehn Minuten bei Raumtemperatur (= 22°C) wie im Schritt B gezeigt fortzuschreiten. Folgend zehn Minuten der Kinasereaktion wurden sowohl phosphoryliertes als auch unphosphoryliertes Biotin-Syntid-2 an die Neutravidin-beschichtete Platte gebunden. In Schritt C wurden die Platten mit PBS/Tween-20 gewaschen, um die Kinasereaktion zu beenden und das ungebundene phosphorylierte oder nicht phosphoryliertes Biotion-Syntid-2 zu entfernen. In Schritt D wurden die Platten bei Raumtemperatur 60 Minuten mit Kaninchen-Antiphosphosyntid-Antikörper inkubiert (1:40000 Verdünnung; 100 Mykroliter/Well). Der Antiphosphosyntid-Antikörper bindet spezifisch an das Serin phosphorylierte Biotin-Syntid-2. Der ungebundene Antikörper wird entfernt mit Waschungen von PBS/Tween-20. Die Platten werden dann inkubiert bei Raumtemperatur für 60 Minuten mit Ziege-Anti-Kaninchen-IgG(Fc)-HPA (Meerrettichperoxidase)-Antikörper. In Schritt E wurden die Platten mit PBS/Tween gewaschen, um den ungebundenen sekundären Antikörper zu entfernen. Dann werden 100 μl/Well chromogener Farbstoff ABTS (HRP-Substrat) zugegeben. Der Farbreaktion, resultierend von der HRP-Reaktion, wird erlaubt, 18 Minuten stattzufinden. Dies wird gefolgt von einer Absorptionsmessung bei 405 nm in einem 96-Well-Plattenleser. Die Chk1 Kinaseaktivität ist direkt proportional zur optischen Dichte der gebildeten Farbe.
Alle hierin zitierten Referenzen sind in ihrer Gesamtheit durch Referenz eingearbeitet.
Während die Erfindung in Verbindung mit Beispielen davon beschrieben wurde, versteht sich, dass die vorherige Beschreibung exemplarisch und von erklärender Natur ist und die Erfindung und ihre bevorzugten Ausführungsformen verdeutlichen soll. Durch Routinenexperimentierung wird der Fachmann offensichtliche Modifikationen und Variationen erkennen, die durchgeführt werden können, ohne vom Gedanken der Erfindung abzuweichen. Folglich soll die Erfindung nicht durch die obige Beschreibung sondern durch die folgenden Ansprüche und ihre Äquivalente definiert sein.
SEQ ID Nr. 1 – menschliche Chk1 voller Länge (Nucleotidsequenz – 1933 Basenpaare)
SEQ ID Nr. 2 – menschliche Chk1 voller Länge (Peptidesequenz – 476 AA)
SEQ ID Nr. 3 – PCR Starter (chk6w)
SEQ ID Nr. 4 – PCR Starter (KH289)
SEQ ID Nr. 5 – PCR Starter (K289)
SEQ ID Nr. 6 – PCR Starter (Chk11)
SEQ ID Nr. 7 – PCR Starter (K210)
SEQ ID Nr. 8 – PCR Starter (KH210)
SEQ ID Nr. 9 – PCR Starter (K248)
SEQ ID Nr. 10 – PCR Starter (KH248)
SEQ ID Nr. 11 – Synthetisches Substratpeptid, Syntid-2
SEQ ID Nr. 12 – Synthetisches Substratpeptid, Syntid-3
SEQ ID Nr. 13 – Synthetisches Substratpeptid, Syntid-4
SEQ ID Nr. 14 – Oligonukleotid-Starter
SEQ ID Nr. 15 – Serin-phosphoryliertes Syntid-2
SEQ ID Nr. 16 – Serin-phosphoryliertes Biotin-Syntid-2
SEQ ID Nr. 17 – Peptidsequenz für Cdc25 Protein-Phosphatase
SEQ ID Nr. 18 – Peptidsequenz für Maus (mm) Chk1 Kinasedomäne
SEQ ID Nr. 19 – Peptidsequenz für Xenopus (xl) Chk1 Kinasedomäne
SEQ ID Nr. 20 – Peptidsequenz für Fruchtfliege (dm) Chk1 Kinasedomäne
SEQ ID Nr. 21 – Peptidsequenz für C. Elegans (ce) Chk1 Kinasedomäne
SEQ ID Nr. 22 – Peptidsequenz für S. Cerevisiae (sc) Chk1 Kinasedomäne
SEQ ID Nr. 23 – Peptidsequenz für S. Pombe (sp) Chk1 Kinasedomäne
SEQ ID Nr. 24 – konserviertes Motiv AQXFFXQL für Chk1 Kinasedomäne, Helix aE (Reste 107–114)
SEQUENCE LISTING

Claims

Zusammensetzung, umfassend ein isoliertes gereinigtes Polynukleotid, bestehend aus den Basen 35 bis 830 von SEQ. ID. Nr. 1.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei welcher das Polynukleotid die aktive Form der menschlichen Chk1-Kinasedomäne codiert, wobei die aktive menschliche Chk1-Kinasedomäne aus AA1 bis AA289 von SEQ. ID. Nr. 2 besteht.
Polypeptid in einer kristallisierten Form, umfassend die katalytisch aktive Form der menschlichen Chk1-Kinase, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids aus den Aminosäuren 1 bis 289 von SEQ. ID. Nr. 2 besteht.
Polypeptid nach Anspruch 3, bei welchem das Polypeptid ferner die Inhibitorbindungsstelle der katalytisch aktiven Form der menschlichen Chk1-Kinase umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 3 oder 4, bei welchem das Polypeptid ferner einen 6-Histidin-Tag am C-Terminus davon umfasst.
Isoliertes, lösliches, katalytisch aktives Polypeptid, umfassend die aktive Form der menschlichen Chk1-Kinasedomäne, wobei das Polypeptid aus den Aminosäuren 1 bis 289 der Sequenz, wie in SEQ. ID. Nr. 2 dargelegt, besteht.
Polypeptid nach Anspruch 6, umfassend das menschliche Chk1-Protein in voller Länge, aufweisend den C-Terminusabschnitt davon entfernt, um die menschliche Chk1-Kinasedomäne in ihrer aktiven Konfiguration zu erhalten.
Expressionsvektor für die Herstellung von aktiver menschlicher Chk1-Kinase in einer Wirtszelle, wobei der Vektor umfasst: ein Polynukleotid, codierend AA1 bis AA289 von SEQ. ID. Nr. 2 der aktiven Form der menschlichen Chk1-Kinase; transkriptionale und translationale regulatorische Sequenzen, funktional in der Wirtszelle, wirksam verlinkt an das menschliche Chk1-Kinase-codierende Polynukleotid; und einen wählbaren Marker.
Vektor nach Anspruch 8, bei welchem das Polynukleotid die aktive menschliche Chk1-Kinase codiert, wobei die aktive Kinase aus den Basen 35 bis 830 von SEQ. ID. Nr. 1 besteht.
Vektor nach Anspruch 8, bei welchem der Vektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus pET28a, pAcSG2, und pFastBac.
Vektor nach Anspruch 8, bei welchem der Vektor pFastBac ist, umfassend eine einzigartige NdeI-Stelle an der Original-Translationsstartstelle für das Polyhedrinprotein.
Vektor nach Anspruch 8, bei welchem der wählbare Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Beta-Galactosidase, grünem fluoreszierenden Protein und Luziferase.
Wirtszelle, stabil transformiert und transfiziert mit einem Polynukleotid, codierend AA1 bis AA289 von SEQ. ID. Nr. 2 der aktiven Form der menschlichen Chk1-Kinase in einer Weise, die die Expression der Wirtszelle der menschlichen Chk1-Kinase erlaubt.
Wirtszelle nach Anspruch 13, bei welcher das Polynukleotid die aktive hChk1-Kinase codiert, wobei die aktive Kinase aus den Basen 35 bis 830 von SEQ. ID. Nr. 1 besteht.
Wirtszelle nach Anspruch 13, bei welcher der Wirt E. coli ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, bei welcher der Wirt ein rekombinantes Bacculovirus ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, bei welcher der Wirt eine Insektenzelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 17, bei welcher die Insektenzelle Sf9 ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, bei welcher die Wirtszelle transformiert und transfiziert ist mit dem Polynukleotid über einen Expressionsvektor, umfassend das Polynukleotid; transkriptionale und translationale regulatorische Sequenzen, funktional in der Wirtszelle, wirksam verlinkt mit dem hChk1-Kinase-codierenden Polynukleotid; und einem wählbaren Marker.
Wirtszelle nach Anspruch 19, bei welcher der Expressionsvektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus pET28a, pAcSG2, und pFastBac.
Wirtszelle nach Anspruch 19, bei welcher der Expressionszelle pFastBac ist, umfassend eine einzigartige NdeI-Stelle an der Original-Translationsstartstelle für das Polyhedrinprotein.
Wirtszelle nach Anspruch 19, bei welcher der wählbare Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Beta-Galactosidase, grünem fluoreszierenden Protein und Luziferase.
Verfahren zur Untersuchung einer Kandidatenverbindung bezüglich ihrer Fähigkeit mit der menschlichen Chk1 zu interagieren, umfassend: (a) Exprimieren einer isolierten DNA-Sequenz oder Varianten davon, codierend AA1 bis AA289 von SEQ. ID. Nr. 2 der Kinasedomäne der menschlichen Chk1, in einem Wirt, fähig zur Erzeugung der Kinase in der katalytisch aktiven Konfiguration, wobei die Kinase in einer Form vorliegt, welche bezüglich einer Interaktion der Kinase mit der Kandidatenverbindung untersucht werden kann; (b) Aussetzen der Kinase der Kandidatenverbindung; und (c) Evaluieren der Interaktion der Kinase mit der Kandidatenverbindung.
Verfahren der Identifizierung eines Chk1-Kinaseinhibitors durch Bestimmen der Bindungsinteraktionen zwischen einer organischen Verbindung und der Bindungsstelle von AA1 bis AA289 von SEQ. ID. Nr. 2 der Chk1-Kinase in der aktiven Konformation, wobei die Bindungsstellen durch die Kristallkoordinaten, bereitgestellt in 11, definiert sind, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erzeugen des Bindungshohlraums, definiert durch die Bindungsstelle, auf einem Computerbildschirm; (b) Erzeugen von Verbindungen mit deren räumlicher Struktur; und (c) Prüfen um zu sehen, ob die Verbindungen an der Chk1-Bindungsstelle binden; wobei jene Verbindungen, die an die Chk1-Bindungsstelle binden, als Chk1-Inhibitoren identifiziert werden können.