ES2335478T3 - 32144, una hidrolasa humana de amidas de acidos grasos y sus usos. - Google Patents

Abstract

Un método para identificar un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, comprendiendo el método: a) poner en contacto una primera muestra obtenida de dicho sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico que hibrida específicamente una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3 como se muestra en el ejemplo 1; b) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la primera muestra que hibrida específicamente con la sonda; c) poner en contacto una segunda muestra obtenida de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3 como se muestra en el ejemplo 1; d) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la segunda muestra que hibrida específicamente con la sonda; e) comparar el nivel de los ácidos nucleicos que se hibridan con la sonda en la primera muestra con el nivel de los ácidos nucleicos que se hibridan con la sonda en la segunda muestra, en la que un nivel aumentado de ácidos nucleicos que hibridan en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica a un sujeto que tienen un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario.

Description

32144, una hidrolasa humana de amidas de ácidos grasos y sus usos.

Antecedentes de la invención

Las amidas de ácidos grasos representan una familia creciente de lípidos bioactivos con diversos efectos celulares y fisiológicos (Cravatt, B.F. et al. (1995), Science 268:1506-1509; Devane, W.A. et al. (1992), Science 258:1946-1949; Facci, L. et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. 92:3376-3380). Miembros de esta familia incluyen oleamida, un lípido inductor del sueño, y anandamida, un ligando endógeno en el receptor cannabinoide CB1 del cerebro (Cravatt, B.F. et al. (1995), supra; Cravatt, B.F. et al. (1996), J. Am. Chem. Soc. 118:580-590).

Además de sus propiedades inductoras del sueño, la oleamida ha mostrado que potencia la respuesta de los receptores 5-HT_{2} a la serotonina (Huidobro-Toro, J. et al. (1996), Proc. Natl. Acad, Sci, 93:8078-8082). La anandamida ha mostrado que tiene efectos analgésicos en ratas (Devane, W.A. et al. (1992), supra) y, a un nivel celular y molecular, se ha demostrado que regula la actividad quinasa de adhesión focal en cortes del hipocampo (Derkinderen, P. et al. (1996), Science 273:1719-1722) y que inhibe la proliferación celular inducida por la prolactina y/o el factor de crecimiento nervioso en las líneas celulares del cáncer de mama humano (DiMarzo et al. (2000), Prostaglandins Other Lipid Mediat, 61(1-2):43-61; DePetrocellis (1998), Proc Natl Acad Sci 95(14):8375-80). Además, la anandamida inhibe el canal de iones de 5-HT_{3} en neuronas del ganglio nodoso de rata (Fan, P. (1995), J. Neurophysiol. 73:907-910) y detiene el desarrollo de la preimplantación de embriones de ratón (Paria, B. C. et al. (1995), Proc. Natl. Acad Sci. 92:9460-9464), y se ha encontrado que tanto la oleamida como la anandamida bloquean la comunicación por conexión comunicante en las células gliales (Venance, L. et al. (1995), Nature 376:590-594). Otras amidas de ácido graso se han presentado por poseer actividades biológicas, también (Facci, L. et al. (1995), supra). En particular, se ha mostrado que la etanolamida de palmitoilo enlaza de forma selectiva sobre la anandamida al receptor cannabinoide periférico CB2, indicando quizás que los receptores CB1 y CB2 reconocen distintas amidas de ácido graso como sus respectivos ligandos (Barg, J. et al. (1995), Eur. J. Pharmacol. 287:145-152; Skaper, S.D. et al. (1996), Proc. Natl. Acad Sci. 93:3484-3989).

Los efectos neurofisiológicos tanto de la oleamida como de la anandamida, junto con el aislamiento de estos compuestos desde el fluido cerebroespinal y el tejido cerebral, respectivamente, sugieren que las amidas de ácidos grasos pueden cumplir importantes papeles neuromodulatorios en el sistema nervioso central. Asimismo, los efectos de la anandamida en la proliferación celular y la actividad quinasa de adhesión focal sugieren que las amidas de ácidos grasos pueden ser importantes agentes anti-cancerígenos.

Las amidas de ácidos grasos se hidrolizan por enzimas conocidas como hidrolasa de amida de ácidos grasos (Ueda et al. (2000), Chem Phys Lipids 108(1-2):107-21). Las hidrolasas de amidas de ácidos grasos (FAAHs) se han clonado del plasma de hígado de rata y se ha demostrado que hidrolizan tanto oleamida como anandamida, además de varias amidas de ácidos grasos distintas (Cravatt et al. (1996), Nature 384:83-7). Estudios de hibridación in situ han mostrado la expresión destacada de FAAH en una variedad de células neuronales de rata. También se han presentado hidrolasas de amida de ácidos grasos humanas y de ratón (Giang, D.K. y Cravatt (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2238-2242.

El documento WO 0151628 proporciona nuevos resultados, en los que cambios en los niveles de expresión de uno o más de los resultados están correlacionados con la presencia de cáncer de mama. El documento WO 0183524 proporciona métodos para diagnosticar, tratar o prevenir trastornos asociados con la expresión aberrante de las proteínas del metabolismo de ARN humano (RMEP).

Dado el papel crítico de los FAAHs en el metabolismo de las amidas de ácidos grasos, existe una necesidad de identificar y caracterizar nuevos miembros de esta familia de enzimas.

Compendio de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de un nuevo miembro de la familia de la hidrolasa de amida de ácidos grasos, denominada en este documento como "32144". La secuencia de nucleótidos de un cADN que codifica 32144 se muestra en la SEQ ID NO:1, y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido 32144 se muestra en SEQ ID NO:2. Además, las secuencias de nucleótidos de la región de codificación se representan en la SEQ ID NO: 3.

En un aspecto la invención proporciona un método para identificar un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, comprendiendo el método: a) poner en contacto una primera muestra obtenida de dicho sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico que hibrida de forma específica una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 como se muestra en el ejemplo 1; b) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la primera muestra que hibrida de forma específica la sonda; c) poner en contacto una segunda muestra obtenida de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico que hibrida de forma específica una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 como se muestra en el ejemplo 1; d) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la segunda muestra que hibrida específicamente la sonda; e) comparar el nivel de ácidos nucleicos que hibridan con la sonda en la primera muestra con el nivel de ácidos nucleicos que hibridan con la sonda en la segunda muestra, en la que un nivel aumentado de ácidos nucleicos que hibridan en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario.

En una realización, dicha sonda de hibridación está marcada de forma detectable. En una realización, dicha detección es por hibridación in situ.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, comprendiendo el método: a) poner en contacto una primera muestra obtenida de dicho sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con un cebador de primera y segunda amplificación, cada uno de los cuales hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en: i) una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1; y ii) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1; b) incubar la primera muestra en condiciones que permiten la amplificación del ácido nucleico; c) poner en contacto una segunda muestra obtenida de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con dicho cebador de primera y segunda amplificación; d) incubar la segunda muestra en condiciones que permiten la amplificación del ácido nucleico; y e) comparar el nivel de la amplificación de ácido nucleico en la primera muestra respecto al nivel de amplificación de ácido nucleico en la segunda muestra, en la que un nivel aumentado de amplificación de ácido nucleico en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario.

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En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, que comprende:

a) poner en contacto una primera muestra obtenida de dicho sujeto que comprende polipéptidos con un anticuerpo que enlaza específicamente a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1; y ii) un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1; b) detectar la presencia de un polipéptido en la primera muestra que se une al anticuerpo; c) poner en contacto una segunda muestra de un sujeto de control que comprende polipéptidos con el anticuerpo; d) detectar la presencia de un polipéptido en la segunda muestra que se une al anticuerpo; y e) comparar el nivel de anticuerpo que enlaza en la primera muestra respecto al nivel de anticuerpo que enlaza en la segunda muestra, en la que un nivel aumentado de anticuerpo que enlaza en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario.

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En una realización preferida, dicho anticuerpo está marcado de forma detectable.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar un compuesto capaz de tratar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, comprendiendo el método: analizar la capacidad del compuesto de ensayo para disminuir la expresión de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos idéntica al 95% a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1, o un complemento de la misma; ii) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntico en al menos en 95% de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1; iii) una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1; y iv) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1; identificando así un compuesto capaz de tratar el cáncer de pulmón, colon o de ovario.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar un compuesto capaz de tratar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, comprendiendo el método: analizar la capacidad del compuesto para disminuir la actividad de la hidrolasa de amida de ácidos grasos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: i) un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 95% al ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1; ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntico en al menos el 95% de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1; iii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1; y iv) un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1; identificando así un compuesto capaz de tratar el cáncer de pulmón, colon o de ovario.

En una realización, dicho ensayo es un ensayo basado en la célula. En una realización, dicho ensayo es un ensayo libre de células.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para evaluar la eficacia de un tratamiento para el cáncer de pulmón, colon o de ovario, en una muestra aislada de un sujeto que se trata con un protocolo en evaluación, que comprende: evaluar el nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos idéntica al 95% a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 como se muestra en el ejemplo 1; b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1; y c) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 como se muestra en el ejemplo 1; en el que una disminución en el nivel de expresión del ácido nucleico después del tratamiento, respecto al nivel antes del tratamiento, es indicativo de la eficacia del tratamiento de un cáncer de pulmón, colon o de ovario.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para evaluar la eficacia de un tratamiento para el cáncer de pulmón, colon o de ovario, en una muestra aislada de un sujeto que se trata con un protocolo en evaluación, que comprende: evaluar el nivel de expresión de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: i) un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 95% al ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1; ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntico en al menos 95% de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1; iii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1; y iv) un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1; en el que una disminución en el nivel de expresión del polipéptido después del tratamiento, respecto al nivel antes del tratamiento, es indicativo de la eficacia del tratamiento de un cáncer de pulmón, colon o de ovario.

La invención pone de relieve el uso de polipéptidos o ácidos nucleicos de 32144, por ejemplo, como reactivos o dianas en ensayos aplicables al tratamiento y diagnosis de trastornos mediados o relacionados con 32144, por ejemplo, trastornos de proliferación celular del pulmón, colon u ovario.

La invención proporciona métodos para explorar compuestos que modulan la expresión o actividad de los polipéptidos o ácidos nucleicos de 32144.

La invención proporciona métodos para evaluar la eficacia de un tratamiento de un trastorno, por ejemplo, un trastorno de proliferación. El método incluye: tratar a un sujeto, por ejemplo, a un paciente o un animal, con un protocolo bajo evaluación (por ejemplo, tratando a un sujeto con uno o más de: quimioterapia, radiación y/o un compuesto identificado usando los métodos descritos en este documento); y evaluar la expresión de un ácido nucleico o polipéptido 32144 antes y después del tratamiento. Un cambio, por ejemplo, una reducción o aumento en el nivel de un ácido nucleico (por ejemplo, ARNm) o polipéptido 32144 después de tratamiento, respecto al nivel de expresión antes del tratamiento, es indicativo de la eficacia del tratamiento del trastorno. El nivel de expresión de ácido nucleico o polipéptido 32144 puede detectarse por cualquier método descrito en este documento.

En una realización preferida, la etapa de evaluación incluye obtener una muestra (por ejemplo, una muestra de tejido, por ejemplo, una biopsia o una muestra de fluido) del sujeto, antes y después del tratamiento y comparar el nivel de expresión de un ácido nucleico (por ejemplo, ARNm) o polipéptido 32144 antes y después del tratamiento.

La invención proporciona métodos para evaluar la eficacia de un agente terapéutico o profiláctico (por ejemplo, un agente anti-neoplásico). El método incluye: poner en contacto una muestra con un agente (por ejemplo, un compuesto identificado usando los métodos descritos en este documento, un agente citotóxico) y evaluar la expresión de un ácido nucleico o polipéptido 32144 en la muestra antes y después de la etapa de contacto. Un cambio, por ejemplo, una reducción o aumento del nivel de ácido nucleico (por ejemplo, ARNm) o polipéptido 32144 en la muestra obtenida después de la etapa de contacto, respecto al nivel de expresión en la muestra antes de la etapa de contacto, indica la eficacia del agente. El nivel de expresión de ácido nucleico o polipéptido 32144 puede detectarse por cualquier método descrito en este documento. En una realización preferida, la muestra incluye células obtenidas de un tejido canceroso o un tejido de pulmón, colon u ovario. En otra realización, la muestra incluye células obtenidas de un tejido neural o células sanguíneas, por ejemplo, glóbulos blancos.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa un gráfico de hidropatía del 32144 humano. Los residuos hidrófobos relativos se muestran por encima de la línea horizontal de trazos, y los residuos hidrófilos relativos están por debajo de la línea horizontal de trazos. Se indican los números correspondientes a las posiciones en la secuencia de aminoácidos del 32144 humano. Los polipéptidos de la invención incluyen fragmentos que incluyen: todo o parte de una secuencia hidrófoba, es decir, una secuencia por encima de la línea de trazos, por ejemplo, la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 157 a 182, desde aproximadamente 388 a 414, y desde aproximadamente 471 a 491 de la SEQ ID NO:2; todo o parte de una secuencia hidrófoba, es decir, una secuencia por debajo de la línea de trazos, por ejemplo, la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 104 a 120, desde aproximadamente 183 a 201, y desde aproximadamente 415 a 438 de la SEQ ID NO:2.

La Figura 2A-C representa alineamientos de partes del dominio de la hidrolasa de amida de ácidos grasos del 32144 humano en consenso con secuencias de aminoácidos derivados de un modelo Markov escondido (HMM) de PFAM. Las dos secuencias de aminoácidos en consenso, distintas y no traslapadas, corresponden a partes del dominio PFAM amidasa, PF01425. La Figura 2A describe los resultados de los dos alineamientos individuales, además del resultado combinado para los dos alineamientos. La Figura 2B representa el primero de los dos alineamientos. La secuencia superior es la secuencia de aminoácidos consenso (SEQ ID NO:4) de una parte N-terminal del dominio amidasa, mientras que la secuencia de aminoácidos inferior corresponde a los aminoácidos 69 a 289 de la SEQ ID NO:2. La Figura 2C representa el segundo de los dos alineamientos. La secuencia superior es la secuencia de aminoácidos consenso (SEQ ID NO:5) de una parte C-terminal del dominio amidasa, mientras que la secuencia de aminoácidos inferior corresponde a los aminoácidos 419 a 513 de la SEQ ID NO:2.

Descripción detallada

La secuencia de 32144 humano (véase SEQ ID NO:1, como se enumera en el Ejemplo 1), que tiene aproximadamente 2007 nucleótidos de largo incluyendo regiones no traducidas, contiene una secuencia de codificación predicha iniciada por metionina de aproximadamente 1599 nucleótidos, que incluyen el codón de terminación. La secuencia de codificación codifica una proteína de 532 aminoácidos (véase SEQ ID NO:2, como se enumera en el Ejemplo 1).

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El 32144 humano contiene las siguientes regiones o características estructurales:

un dominio amidasa (Número de Acceso de PFAM PF01425) localizado aproximadamente en los residuos de aminoácidos 69 a 289 y 419 a 513 de la SEQ ID NO:2;

un motivo distintivo de amidasa (PS00571) localizado aproximadamente en los residuos de aminoácido 204 a 235 de la SEQ ID NO:2;

un dominio transmembrana localizado aproximadamente en los residuos de aminoácidos 11 a 33 de la SEQ ID NO:2;

ocho sitios predichos de fosforilación de la Proteína Quinasa C (PS00005) localizados aproximadamente en los residuos de aminoácidos 6 a 8 y 40 a 42, 129 a 131, 186 a 188, 230 a 232, 329 a 331, 365 a 367 y 434 a 436 de la SEQ ID NO:2;

tres sitios predichos de fosforilación de Caseina Quinasa II (PS00006) localizados aproximadamente en los residuos de aminoácidos 129 a 132, 207 a 210 y 320 a 323 de la SEQ ID NO:2;

once sitios predichos de N-miristoilación (PS00008) localizados aproximadamente en los residuos de aminoácidos 53 a 58, 125 a 130, 138 a 143, 172 a 177, 204 a 209, 211 a 216, 224 a 229, 248 a 253, 475 a 480, 481 a 486 y 495 a 500 de la SEQ ID NO:2;

dos sitios predichos de N-glicosilación (PS00001) en aproximadamente los aminoácidos 141 a 144 y 175 a 178 de la SEQ ID NO:2; y

una señal dirigida C-terminal de microcuerpos predicha (PS00342) en aproximadamente los aminoácidos 530 a 532 de la SEQ ID NO:2.

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Si se desea información general con respecto a los identificadores PFAM, números de identificación de dominio de prefijo PS y prefijo PF, véase Sonnhammer et al. (1997) Protein 28:405-420 y http://www.psc.edu/general/software/
packages/pfam/pfam.html.

La proteína 32144 contiene un número significativo de características estructurales en común con miembros de la familia de la amidasa. El término "familia", cuando hace referencia a las moléculas de proteína y de ácido nucleico de la invención, se refiere a dos o más proteínas o moléculas de ácido nucleico que tienen un dominio o motivo estructural común y que tienen una homología de secuencias de aminoácidos o de nucleótidos suficiente como se define en este documento. Estos miembros de la familia pueden darse de forma natural o no natural y pueden proceder de la misma especie o de especies diferentes. Por ejemplo, una familia puede contener una primera proteína de origen humano así como otras proteínas distintas de origen humano o, de forma alternativa, puede contener homólogos de origen no humano, por ejemplo, proteínas de rata o de ratón. Los miembros de una familia también pueden tener características funcionales comunes.

Una familia amidasa de proteína, denominada también como hidrolasas de amidasas de ácidos grasos (FAAH), se caracteriza por la capacidad de hidrolizar amidas de ácidos grasos, por ejemplo, amidas de ácidos grasos neuromodulatorios, tal como oleamida, anandamida y amida mirística. Amidasas representativas incluyen hidrolasas de amida de ácidos grasos (FAAH) del ser humano y del ratón (Giang, D.K. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 2238-2242). Típicamente, las amidasas poseen especificidad sobre el sustrato en base a la longitud de la cadena y el grado de saturación de las amidas de ácidos grasos. Las amidas de ácidos grasos, por ejemplo, oleamida y anandamida, se conocen por tener propiedades de inducción al sueño y analgésica, además de la capacidad de regular la proliferación celular. Esta familia de proteínas contiene típicamente una región altamente conservada rica en residuos de glicina, serina y alanina. Las hidrolasas de amida de ácidos grasos se han descrito en Ueda et al. (2000), supra, cuyos contenidos se incorporan en este documento por referencia.

Un polipéptido 32144 puede incluir al menos un "dominio amidasa" o "dominio hidrolasa de amida de ácidos grasos", que contiene uno y preferiblemente dos "subdominios amidasa" o regiones homólogas con un "dominio amidasa".

Como se usa en este documento, el término "subdominio amidasa" o "primer subdominio amidasa" incluye una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 100 a 500 residuos de aminoácidos de longitud y que tiene un pequeño resultado para el alineamiento de la secuencia al dominio amidasa (HMM) de al menos 100. Preferiblemente, un dominio amidasa incluye al menos aproximadamente de 150 a 450 aminoácidos, más preferiblemente aproximadamente de 200 a 300 residuos de aminoácidos, o aproximadamente de 220 aminoácidos y tiene un pequeño resultado para el alineamiento de la secuencia al dominio amidasa (HMM) de al menos 150, preferiblemente 200 o mayor: Al dominio amidasa (HMM) se ha asignado el Número de Acceso de PFAM PF01425 (http://genome.wustl.edu/Pfam/html). En la Figura 2B se representa un alineamiento del primer dominio amidasa (aminoácidos 69 a 289 de la SEQ ID NO:2) de 32144 humano con una secuencia consenso de aminoácidos derivado de un modelo oculto de Markov.

El término "subdominio amidasa" o "segundo subdominio amidasa" incluye una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 40 a 300 de longitud y que tiene un pequeño resultado para el alineamiento de la secuencia al dominio amidasa (HMM) de al menos 10. Preferiblemente, un dominio amidasa incluye al menos aproximadamente de 60 a 200 aminoácidos, más preferiblemente aproximadamente de 80 a 100 residuos de aminoácidos, o aproximadamente de 94 aminoácidos y tiene un pequeño resultado para el alineamiento de la secuencia al dominio amidasa (HMM) de al menos 20, preferiblemente 30 o mayor. Al dominio amidasa (HMM) se ha asignado el Número de Acceso de PFAM PF01425 (http://genome.wustl.edu/Pfam/html). En la Figura 3C se representa un alineamiento del segundo subdominio amidasa (residuos de aminoácidos 419 a 513) de 32144 humano con una secuencia consenso de aminoácidos derivado de un modelo oculto de Markov.

En una realización preferida, un polipéptido o proteína 32144 tiene al menos un "subdominio amidasa" o una región que incluye al menos los intervalos de tamaño descritos anteriormente y tiene al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de homología con un "dominio amidasa" por ejemplo, el subdominio amidasa de 32144 humano (por ejemplo, residuos 69 a 289 o 419 a 513 de la SEQ ID NO:2).

Para identificar la presencia de un dominio "amidasa" o "hidrolasa de amida de ácidos grasos" en una secuencia de proteína 32144, y realizar la determinación de que un polipéptido o proteína de interés tiene un perfil particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína puede someterse a una búsqueda frente a la base de datos PFAM de HMM (por ejemplo, la base de datos PFAM, versión 2.1) usando los parámetros por defecto (http://www.sanger.ac.uk/Software/
Pfam/HMM_search). Por ejemplo, el programa hmmsf, que está disponible como parte del paquete de programas de búsqueda HMMER, es una familia de programas por defecto específicos para MILPAT0063 y un valor de 15 es el valor umbral por defecto para determinar un acierto. De forma alternativa, el valor umbral para determinar un acierto puede reducirse (por ejemplo, a 8 bits). Puede encontrarse una descripción de la base de datos PFAM en Sonhammer et al. (1997) Proteins 28(3):405-420 y puede encontrarse una descripción detallada de HMM, por ejemplo, en Gribskov et al.(1990) Meth. Enzymol. 183:146-159; Gribskov et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358; Krogh et al.(1994) J. Mol. Biol. 235:1501-1531; y Stultz et al.(1993) Protein Sci. 2:305-314, cuyos contenidos se incorporan en este documento por referencia. Se llevó a cabo una búsqueda frente a la base de datos HMM que dio como resultado la identificación de un dominio "amidasa" en la secuencia de aminoácidos del 32144 humano, que incluye dos subdominios amidasa localizados aproximadamente en los residuos de aminoácido 69 a 289 y 419 a 513 de SEQ ID NO:2 (véase la Figura 2).

En una realización, una proteína 32144 incluye al menos un motivo distintivo de amidasa. Como se usa en este documento, un "motivo distintivo de amidasa" incluye una secuencia de al menos diecinueve residuos de aminoácido definidos por la secuencia: G-[G/A]-S-[G/S]-[G/S]-G-X-[G/S/A]-[G/S/A/V/Y]-X-[G/A]-X-[D/E]-X-[G/A]-X-S-[L/l/V/M]-R-X-P-[G/S/A/C] (SEQ ID NO:6). Un motivo distintivo de amidasa, como se define, puede estar implicado en la hidrólisis enzimática de una amida de ácidos grasos. Más preferiblemente, un motivo distintivo de amidasa incluye 25, 29, o incluso más preferiblemente 32 residuos de aminoácido. Los motivos distintivos de amidasa se han descrito en, por ejemplo, Mayaux et al. (1990), J Bacteriology 172:6764-73, cuyos contenidos se incorporan en este documento por referencia. La 32144 humana contiene una secuencia (aproximadamente los residuos de aminoácido 204-235 de la SEQ ID NO:2) que empareja la secuencia de un motivo distintivo de amida a la 18/19 de las posiciones conservadas. La única discrepancia se da en la posición 9 ([G/S/A/V/Y]) de la secuencia distintiva de la amidasa, donde hay una sustitución conservativa de cisteína (localizada en aproximadamente el residuo de aminoácido 212 de la SEQ ID NO:2) observada en el 32144 humano.

En una realización preferida, un polipéptido o proteína 32144 tienen al menos un motivo distintivo de amidasa, o una región que incluye al menos 19, 25, 29, o incluso 32 residuos de aminoácido y tiene al menos 70%, 80%, 90% o 100% de homología con un "motivo distintivo de amidasa" o el motivo distintivo de amidasa variante observado en el 32225 humano, por ejemplo, en aproximadamente los residuos de aminoácido 204 a 235 de la SEQ ID NO: 2.

Una molécula 32144 puede incluir adicionalmente una región transmembrana. Como se usa en este documento, el término "dominio transmembrana" incluye una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 14 residuos de aminoácido de longitud y que abarca una membrana de fosfolípidos. Más preferiblemente, un dominio transmembrana incluye aproximadamente al menos 14, 16, 18, 20, 22 o 24 residuos de aminoácido y abarca una membrana de fosfolípidos. Los dominios transmembrana son ricos en residuos hidrófobos y tienen típicamente una estructura en \alpha-hélice. En una realización preferida, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de los aminoácidos de un dominio transmembrana son hidrófobos, por ejemplo, leucinas, valinas, alaninas, fenilalaninas, metioninas, isoleucinas, tirosinas o triptófanos. Los dominios transmembrana se describen en, por ejemplo, Zagotta W.N. et al., (1996) Annual Rev. Neurosci. 19:235-63.

En una realización preferida, un polipéptido o proteína 32144 tiene al menos un dominio transmembrana o una región que incluye al menos 18, 19 o 20 residuos de aminoácido y tiene al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de homología con un "dominio transmembrana", por ejemplo, al menos un dominio transmembrana del 32144 humano (por ejemplo, de aproximadamente 11 a 33 residuos de aminoácido de la SEQ ID NO:2). En una realización, el dominio transmembrana de una molécula 32144 es capaz de interactuar con dominios transmembrana de otras moléculas, por ejemplo, otras moléculas 32144, tal como el 32144 que forma un oligómero, por ejemplo, un homo-oligómero. La auto-asociación de hidrolasas de amida de ácidos grasos por medio de dominios transmembrana N-terminal se ha descrito en Ueda et al. (2000), supra.

Un miembro de la familia 32144 puede incluir al menos uno, y preferiblemente dos subdominios amidasa. Además, un miembro de la familia 32144 puede incluir al menos un motivo distintivo de amidasa; al menos un dominio transmembrana; al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete y preferiblemente ocho sitios predichos de fosforilación de proteína quinasa C (PS00005); al menos uno, dos y preferiblemente tres sitios predichos de fosforilación de caseína quinasa II (PS00006); al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez y preferiblemente once sitios predichos de N-miristilación (PS00008); al menos uno y preferiblemente dos sitios predichos de N-glicosilación (PS00001); y al menos una señal dirigida C-terminal de microcuerpos predicha (PS00342).

Como los polipéptidos 32144 de la invención pueden modular las actividades mediadas por 32144, pueden ser útiles para el desarrollo de nuevos agentes de diagnóstico y terapéuticos para trastornos relacionados o mediados por 32144, como se describe más adelante.

Como se usa en este documento, una "actividad de 32144", "actividad biológica de 32144" o "actividad funcional de 32144" se refiere a una actividad ejercida por una proteína, polipéptido o molécula de ácido nucleico de 32144. Por ejemplo, una actividad de 32144 puede ser una actividad ejercida por 32144 en un medio fisiológico en, por ejemplo; una célula responsable de 32144 o en un sustrato de 32144, por ejemplo, un sustrato de proteína. Una actividad de 32144 puede determinarse in vivo o in vitro. En una realización, una actividad de 32144 es una actividad directa, tal como una asociación con una molécula diana de 32144. Una "molécula diana" o "compañero de unión" es una molécula con la cual se une o interacciona en la naturaleza una proteína 32144. En una realización ejemplar, 32144 es una enzima que hidroliza amidas de ácidos grasos, por ejemplo, anandamida o etanolamidas de ácidos oleico (por ejemplo, oleamida), linoleico o palmítico.

Una actividad de 32144 también puede ser una actividad indirecta, por ejemplo, una actividad de señalización celular mediada por la interacción de la proteína 32144 con un receptor de 32144. Las características de las moléculas de 32144 de la presente invención pueden proporcionar actividades biológicas similares a los miembros de la familia de la hidrolasa de amida de ácidos grasos. Por ejemplo, las proteínas 32144 de la presente invención pueden tener una o más de las siguientes actividades: (1) enlazar y catabolizar amidas de ácidos grasos; (2) regular la señalización neuronal; (3) regular la función del canal de iones, por ejemplo, la función del canal de iones 5-HT_{3}; (4) regular la señalización del receptor de cannabinoides; (5) regular la señalización de serotonina, por ejemplo, la respuesta de 5-HT_{2} a la serotonina; (6) regular la actividad de conexión comunicante; (7) regular la recepción del dolor; (8) regular el desarrollo; (9) regular la proliferación y/o migración celular; (10) regular la actividad de la adhesión focal de quinasa; o (11) regular la inducción del sueño.

Así, las moléculas de 32144 pueden actuar como nuevas dianas diagnósticas y agentes terapéuticos para controlar los trastornos de proliferación y/o diferenciación celular que incluyen los de origen en el colon, pulmón y ovario.

Como se usa en este documento, los términos "cáncer", "hiperproliferativo" y "neoplásico" se refieren a células que tienen la capacidad de crecimiento autónomo. Los ejemplos de estas células incluyen células que tienen un estado o condición anormal caracterizada por un crecimiento celular que prolifera rápidamente. Las patologías hiperproliferativas y neoplásicas pueden clasificarse como patológicas, es decir, que caracterizan o constituyen una patología, o pueden clasificarse como no patológicas, es decir, una desviación de lo normal pero no asociado con una patología. Se entiende que el término incluye todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos transformados por una tumor maligno, independientemente del tipo o etapa histopatológica de invasión. Las células "hiperproliferativas patológicas" se producen en patologías caracterizadas por un crecimiento tumoral maligno. Los ejemplos de células hiperproliferativas no patológicas incluyen la proliferación de células asociadas con la reparación de heridas.

Los términos "cáncer" o "neoplasmas" incluyen tumores malignos de los diversos sistemas de órganos, tales como las que afectan al pulmón, mama, tiroides, sistema linfoide, tracto gastrointestinal y tracto genitourinario, así como adenocarcinomas que incluyen tumores malignos tales como la mayoría de los cánceres de colon, carcinoma de células renales, cáncer de próstata y/o tumores testiculares, carcinoma de células no pequeñas del pulmón, cáncer del intestino delgado y cáncer de esófago.

El término "carcinoma" se reconoce en la técnica y se refiere a tumores malignos de tejidos epiteliales o endocrinos que incluyen carcinomas del sistema respiratorio, carcinoma del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carcinomas testiculares, carcinomas de mama, carcinomas prostáticos, carcinomas del sistema endocrino y melanomas. Los ejemplos de carcinomas incluyen los que se forman a partir de tejidos del cuello del útero, pulmón, próstata, mama, cabeza y cuello, colon y ovario. El término también incluye carcinosarcomas, por ejemplo, que incluyen tumores malignos compuestos de tejidos carcinomatosos y sarcomatosos. Un "adenocarcinoma" se refiere a un carcinoma derivado de un tejido glandular o en el cual las células tumorales forman estructuras glandulares reconocibles.

El término "sarcoma" se reconoce en la técnica y se refiere a tumores malignos de origen mesenquimal.

Ejemplos de trastornos proliferativos y/o diferenciadores celulares del colon incluyen, aunque no están limitados a, pólipos no neoplásicos, adenomas, síndromes familiares, carcinogénesis colorectal, carcinoma colorectal y tumores carcinoideos.

Ejemplos de trastornos proliferativos y/o diferenciadores celulares del pulmón incluyen, aunque no están limitados a, carcinoma broncogénico, que incluye síndromes paraneoplásicos, carcinoma bronquioloalveolar, tumores neuroendocrinos, tales como carcinoide bronquial, tumores varios y tumores metastáticos; patologías de la pleura, que incluyen derrames pleurales inflamatorios, derrames pleurales no inflamatorios, neumotórax y tumores pleurales, que incluyen tumores fibrosos solitarios (fibroma pleural) y mesotelioma maligno.

La proteína 32144, fragmentos de la misma y derivados y otras variantes de la secuencia en la SEQ ID NO:2 de la misma, se denominan de forma colectiva "polipéptidos o proteínas de la invención" o "polipéptidos o proteínas 32144". Las moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos o proteínas se denominan colectivamente "ácido nucleicos de la invención" o "ácidos nucleicos de 32144". Las moléculas de 32144 se refieren a ácidos nucleicos, polipéptidos y anticuerpos de 32144.

Como se usa en este documento, el término "molécula de ácido nucleico" incluye moléculas de ADN (por ejemplo, un ADNc o un ADN genómico), moléculas de ARN (por ejemplo, un ARNm) y análogos del ADN o ARN. Un análogo de ADN o ARN puede sintetizarse a partir de análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de hebra sencilla o doble hebra, aunque preferiblemente es un ADN de doble hebra.

El término "molécula aislada de ácido nucleico" o "molécula purificada de ácido nucleico" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas de otras moléculas de ácido nucleico presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con respecto al ADN genómico, el término "aislado" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas del cromosoma con el cual está asociado de forma natural el ADN genómico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" carece de secuencias que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y/o 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula aislada de ácido nucleico puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos 5' y/o 3' que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico. Además, una molécula "aislada" de ácido nucleico, tal como una molécula de ADNc, puede carecer esencialmente de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o carece esencialmente de precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente.

Como se usa en este documento, el término "hibrida en condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad media, alta rigurosidad o rigurosidad muy alta" describe condiciones de hibridación y lavado. Pueden encontrarse directrices para realizar reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. En esa referencia se describen métodos acuosos y no acuosos y pueden usarse ambos. Las condiciones de hibridación específicas a las que se hace referencia en este documento son las siguientes: 1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en cloruro sódico/citrato sódico (SSC) 6X a aproximadamente 45ºC, seguido de dos lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% al menos a 50ºC (la temperatura de los lavados puede aumentarse a 55ºC para condiciones de baja rigurosidad); 2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en SSC 6X a aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 60ºC; 3) condiciones de hibridación de rigurosidad alta en SSC 6X a aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 65ºC; y preferiblemente 4) condiciones de hibridación de rigurosidad muy alta son con fosfato sódico 0,5 M, SDS al 7% a 65ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 1% a 65ºC. Las condiciones de rigurosidad muy alta (4) son las condiciones preferidas y las que deben usarse a menos que se especifique otra cosa.

Preferiblemente, una molécula aislada de ácido nucleico que hibrida en unas condiciones de rigurosidad descritas en este documento con la secuencia de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3, corresponde a una molécula de ácido nucleico que se da de forma natural.

Como se usa en este documento, una molécula de ácido nucleico "que se da de forma natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se da en la naturaleza. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que se da de forma natural puede codificar una proteína natural.

Como se usa en este documento, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que incluyen al menos un marco de lectura abierto que codifica una proteína 32144. El gen puede incluir opcionalmente de forma adicional secuencias no codificadoras, por ejemplo, secuencias reguladoras e intrones. Preferiblemente, un gen codifica una proteína 32144 de mamífero o un derivado de la misma.

Un polipéptido o proteína "aislada" o "purificada" está esencialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes procedentes de la fuente celular o tisular de la que se deriva la proteína, o está esencialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente. "Esencialmente libre" significa que un preparado de proteína 32144 tiene una pureza de al menos 10%. En una realización preferida, el preparado de la proteína 32144 tiene menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% y más preferiblemente 5% (en peso seco) de proteína distinta de 32144 (también denominada en este documento como una "proteína contaminante") o de precursores químicos o agentes químicos que no son 32144. Cuando la proteína 32144 o la parte biológicamente activa de la misma se produce de forma recombinante, preferiblemente también está esencialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10% y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 5% del volumen del preparado de la proteína. La invención incluye preparados aislados o purificados de al menos 0,01, 0,1, 1,0 y 10 miligramos en peso seco.

Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede estar alterado con respecto a la secuencia de tipo silvestre de 32144 sin anular o alterar esencialmente la actividad de 32144. Preferiblemente, la alteración no altera esencialmente la actividad de 32144, por ejemplo, la actividad es al menos 20%, 40%, 60%, 70% u 80% del tipo silvestre. Un residuo de aminoácido "esencial" es un residuo que, cuando se altera con respecto a la secuencia de tipo silvestre de 32144, tiene como resultado la anulación de la actividad de 32144 de tal forma que está presente menos de 20% de la actividad de tipo silvestre. Por ejemplo, se prevé que los residuos de aminoácidos conservados de 32144 sean particularmente susceptibles a la alteración.

Una "sustitución conservativa de aminoácido" es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triftófano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De esta manera, un residuo de aminoácido no esencial predicho en una proteína 32144 se reemplaza preferiblemente por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. De forma alternativa, en otra realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia de codificación de 32144, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes puede explorarse por la actividad biológica de 32144 para identificar mutantes que retienen la actividad. Después de la mutagénesis de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, la proteína codificada se puede expresar de manera recombinante y se puede determinar la actividad de la proteína.

Como se usa en este documento, una "parte biológicamente activa" de una proteína 32144 incluye un fragmento de una proteína 32144 que participa en una interacción, por ejemplo, una interacción intramolecular o inter-molecular. Una interacción inter-molecular puede ser una interacción de unión específica o una interacción enzimática (por ejemplo, la interacción puede ser transitoria y se forma o se rompe un enlace covalente). Una interacción intermolecular puede ser entre una molécula de 32144 y una molécula que no es de 32144 o entre una primera molécula 32144 y una segunda molécula de 32144 (por ejemplo, una interacción de dimerización). Las partes biológicamente activas de una proteína 32144 incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas o derivadas de la secuencia de aminoácidos de la proteína 32144, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2, que incluye menos aminoácidos que las proteínas 32144 de longitud completa y presentan al menos una actividad de una proteína 32144. Típicamente, las partes biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína 32144, por ejemplo, la hidrólisis de amidas de ácidos grasos. Una parte biológicamente activa de una proteína 32144 puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, una longitud de 10, 25, 50, 100, 200 o más aminoácidos. Pueden usarse partes biológicamente activas de una proteína 32144 como dianas para el desarrollo de agentes que modulen una actividad mediada por 32144, por ejemplo, la modulación de señalización neuronal, inducción del sueño, percepción del dolor o proliferación y/o diferenciación celular.

Se llevan a cabo cálculos de homología o identidad de secuencia entre secuencias (los términos se usan indistintamente en este documento) como sigue.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de ácido nucleico, se alinean las secuencias con el fin de una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o tanto en la primera como en la segunda secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico para un alineamiento óptimo y pueden descartarse secuencias no homólogas con fines comparativos). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada con fines comparativos es al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, 60% e incluso más preferiblemente al menos 70%, 80%, 90% o 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Después se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o en las posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en este documento, "identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico).

El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que necesitan introducirse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete informático GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Aún en otra realización preferida, se determina el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos usando el programa GAP en el paquete informático GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CNV y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 o 80 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto de parámetros particularmente preferidos (y el que debería usarse a menos que se especifique otra cosa) son una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de hueco de 12, una penalización de extensión de hueco de 4, y una penalización de hueco de desplazamiento de fase de 5.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.

Las secuencias de ácido nucleico y de proteína descritas en este documento pueden usarse como "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas para identificar, por ejemplo, otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Estas búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a moléculas de ácido nucleico de 32144 de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a moléculas de proteína 32144 de la invención. Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Cuando se utilizan programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Polipéptidos 32144 particularmente preferidos tienen una secuencia de aminoácidos esencialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2. En el contexto de una secuencia de aminoácidos, el término "esencialmente idéntica" se usa aquí para hacer referencia a un primer aminoácido que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos que son i) idénticos a, o ii) sustituciones conservativas de residuos de aminoácidos alineados en una segunda secuencia de aminoácidos de tal forma que la primera y la segunda secuencias de aminoácidos pueden tener un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común que tiene una identidad de al menos aproximadamente 60% o 65%, probablemente una identidad de 75%, más probablemente una identidad de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la SEQ ID NO:2, se denominan esencialmente idénticas.

En el contexto de una secuencia de nucleótidos, el término "esencialmente idéntica" se usa en este documento para hacer referencia a una primera secuencia de ácido nucleico que contiene un número suficiente o mínimo de nucleótidos que son idénticos a nucleótidos alineados en una segunda secuencia de ácido nucleico de tal forma que la primera y segunda secuencias de ácido nucleico codifican un polipéptido que tiene una actividad funcional común, o codifican un dominio de polipéptido estructural común o una actividad de polipéptido funcional común. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos que tienen una identidad de al menos aproximadamente 60% o 65%, probablemente una identidad de 75%, más probablemente una identidad de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la SEQ ID NO:1 o 3, se denominan esencialmente idénticas.

"Expresión defectuosa o expresión aberrante", como se usa en este documento, se refiere a un patrón de expresión génica que no es de tipo silvestre a nivel del ARN o de la proteína. Incluye: expresión a niveles que no son de tipo silvestre, es decir, una expresión excesiva o insuficiente; un patrón de expresión que difiere del tipo silvestre en términos del momento o fase en la que se expresa el gen, por ejemplo, aumento o disminución de la expresión (en comparación con el tipo silvestre) en un periodo o fase del desarrollo predeterminado; un patrón de expresión que difiere del tipo silvestre en términos de expresión alterada, por ejemplo aumentada o disminuida (en comparación con el tipo silvestre) en un tipo celular o tipo tisular predeterminado; un patrón de expresión que difiere del tipo silvestre en términos del tamaño de corte y empalme, secuencia de aminoácidos traducida, modificación post-transicional o actividad biológica del polipéptido expresado; un patrón de expresión que difiere del tipo silvestre en términos del efecto de un estímulo ambiental o estímulo extracelular sobre la expresión del gen, por ejemplo, un patrón de aumento o disminución de la expresión (en comparación con el tipo silvestre) en presencia de un aumento o disminución en la intensidad del estímulo.

"Sujeto", como se usa en este documento, se refiere a animales humanos y no humanos. El término "animales no humanos" de la invención incluye todos los vertebrados, por ejemplo mamíferos tales como primates no humanos (particularmente primates superiores), ovejas, perros, roedores (por ejemplo ratón o rata), cobaya, cabra, cerdo, gato, conejos, vacas y no mamíferos, tales como pollos, anfibios, reptiles, etc. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano. En otra realización, el sujeto es un animal experimental o un animal adecuado como modelo de enfermedad.

Un "preparado purificado de células", como se usa en este documento, se refiere a un preparado in vitro de células. En el caso de células de organismos multicelulares (por ejemplo, plantas y animales), un preparado purificado de células es un subconjunto de células obtenidas a partir del organismo, no el organismo intacto entero. En el caso de microorganismos unicelulares (por ejemplo, células cultivadas y células microbianas), consiste en un preparado de al menos 10% y más preferiblemente 50% de las células objeto.

A continuación se describen con más detalle diversos aspectos de la invención.

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Moléculas aisladas de ácido nucleico

En este documento se describe una molécula de ácido nucleico aislada o purificada, que codifica un polipéptido 32144 descrito en este documento, por ejemplo una proteína 32144 de longitud completa o un fragmento de la misma, por ejemplo, una parte biológicamente activa de una proteína 32144. También se describe un fragmento de ácido nucleico adecuado para usar como sonda de hibridación que puede usarse, por ejemplo, para identificar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, ARNm de 32144 y fragmentos adecuados para usar como cebadores, por ejemplo cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico.

En un aspecto, una molécula aislada de ácido nucleico 32144 incluye la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una parte de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos. En una realización, la molécula de ácido nucleico incluye secuencias que codifican la proteína 32144 humana (es decir, "la región de codificación" de la SEQ ID NO:1, como se muestra en la SEQ ID NO:3), así como secuencias 5' no traducidas. De forma alternativa, la molécula de ácido nucleico puede incluir sólo la región de codificación de la SEQ ID NO:1 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 3) y, por ejemplo, ninguna secuencia flanqueante de las que normalmente acompañan a la secuencia objeto. En otra realización, la molécula de ácido nucleico codifica una secuencia que corresponde a un fragmento de la proteína de aproximadamente los residuos de aminoácido 34 a 532 de la SEQ ID NO:2.

En otro aspecto, una molécula aislada de ácido nucleico de 32144 incluye una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3, o una parte de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos. De forma alternativa, la molécula de ácido nucleico es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3, como para que pueda hibridar (por ejemplo en condiciones rigurosas descritas en este documento) con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1 o 3, formando de esta manera un dúplex estable.

En un aspecto, una molécula aislada de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente: 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogos a la longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, o una parte, preferiblemente de la misma longitud, de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos.

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Fragmentos de Ácido Nucleico de 32144

Una molécula de ácido nucleico de 32144 puede incluir sólo una parte de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 o 3. Por ejemplo, dicha molécula de ácido nucleico puede incluir un fragmento que puede usarse como sonda o cebador o un fragmento que codifica una parte de una proteína 32144, por ejemplo, una parte inmunogénica o biológicamente activa de una proteína 32144. Un fragmento pueden comprender los nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, que codifica un dominio de hidrolasa de amida de ácidos grasos de 32144 humano. La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen 32144 permite la generación de sondas y cebadores diseñados para usar en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia de 32144, o fragmentos de los mismos, así como homólogos de 32144, o fragmentos de los mismos, procedentes de otras especies.

En otro aspecto, un ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que incluye parte o toda la región de codificación y se extiende bien a la región de no codificación 5' o 3' (o a ambas). Otros aspectos incluyen un fragmento que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de aminoácidos descrito en este documento. Los fragmentos de ácido nucleico pueden codificar un dominio o sitio específico descrito en este documento o fragmentos del mismo, particularmente fragmentos del mismo que tienen al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 425, 450, 475, 500 o más aminoácidos de longitud. Preferiblemente, los fragmentos de ácido nucleico codifican un dominio específico o fragmento del mismo, en el que el dominio o fragmento tiene al menos 125, o más preferiblemente 140, 145, o incluso 150 aminoácidos de longitud. Los fragmentos también incluyen secuencias de ácido nucleico que corresponde a secuencias específicas de aminoácidos descritas anteriormente o fragmentos de las mismas. Los fragmentos de ácido nucleico no deben interpretarse como que abarcan los fragmentos que se habrían descrito antes de la invención.

Un fragmento de ácido nucleico puede incluir una secuencia que corresponde a un dominio, región o sitio funcional descrito en este documento. Un fragmento de ácido nucleico también puede incluir uno o más dominios, regiones o sitios funcionales descritos en este documento. Así, por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico de 32144 puede incluir una secuencia que corresponde a un dominio de hidrolasa de amida de ácidos grasos, un motivo distintivo de amidasa o un dominio transmembrana.

Se describen sondas y cebadores de 32144. Típicamente, una sonda/cebador es un oligonucleótido aislado o purificado. El oligonucleótido típicamente incluye una región de secuencia de nucleótidos que hibrida en las condiciones rigurosas descritas en este documento con al menos aproximadamente 7, 12 o 15, preferiblemente aproximadamente 20 o 25, más preferiblemente aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 75 nucleótidos consecutivos de una secuencia con sentido o antisentido de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3, o de una variante alélica que se da de forma natural o mutante de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3. Preferiblemente, un oligonucleótido tiene menos que aproximadamente 200, 150, 120, o 100 nucleótidos de longitud.

En una realización, la sonda o cebador se une a un soporte sólido, por ejemplo un soporte sólido descrito en este documento.

Un conjunto ejemplar de cebadores incluyen un cebador hacia adelante que templa a la hebra de codificación y un cebador inverso que templa la hebra que no se codifica. El cebador hacia delante puede templar el codón de partida, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica el residuo de aminoácido 1 de la SEQ ID NO:2. El cebador inverso puede templar el último codón, por ejemplo, el codón inmediatamente anterior al codón de terminación, por ejemplo, el codón que codifica el residuo de aminoácido 532 de la SEQ ID NO:2. En un aspecto preferido, las temperaturas de templado de los cebadores hacia delante e inverso difieren en no más de 5, 4, 3 o 2ºC.

Preferiblemente, el ácido nucleico es una sonda que tiene al menos 10, 12, 15, 18, 20 y menos que 200, más preferiblemente menos que 100, o menos que 50, nucleótidos de longitud. Debe ser idéntica o diferir en 1 o 2, o menos de 5 o 10 nucleótidos de una secuencia descrita en este documento. Si se necesita un alineamiento para esta comparación, las secuencias deben alinearse para una homología máxima. Se consideran diferencias las secuencias de "bucles" de supresiones o inserciones, o desapareamientos.

Una sonda o cebador puede derivarse de la hebra con sentido o antisentido de un ácido nucleico que codifica: un dominio de hidrolasa de amida de ácidos grasos o un fragmento de la misma de 32144 humano, por ejemplo, aproximadamente los residuos de aminoácidos 69 a 513, 69 a 289 o 419 a 513 de la SEQ ID NO:2; un motivo distintivo de amidasa de 32144 humano, por ejemplo, aproximadamente los residuos de aminoácidos 204 a 235 de la SEQ ID NO:2; o un dominio transmembrana de 32144 humano, por ejemplo, aproximadamente los residuos de aminoácido 11 a 33 de la SEQ ID NO:2.

En otro aspecto, se describe un conjunto de cebadores, por ejemplo, cebadores adecuados para usar en una PCR, que pueden usarse para amplificar una región seleccionada de una secuencia de 32144, por ejemplo, un dominio, región, sitio u otra secuencia descrita en este documento. Los cebadores deben tener una longitud de al menos 5, 10 o 50 pares de bases y una longitud menor de 100 o menor de 200 pares de bases de longitud. Los cebadores deben ser idénticos o difieren en una base de una secuencia descrita en este documento o de unas variantes que de dan de forma natural. Por ejemplo, se proporcionan cebadores adecuados para amplificar todo o parte de cualquiera de las siguientes regiones: un dominio de hidrolasa de amida de ácidos grasos o un fragmento del mismo, por ejemplo, de aproximadamente los aminoácidos 69 a 513, 69 a 289 o 419 a 513 de la SEQ ID NO:2; un motivo distintivo de amidasa, por ejemplo, aproximadamente en los residuos de aminoácido 204 a 235 de la SEQ ID NO:2; o un fragmento N-terminal, por ejemplo, aproximadamente los residuos de aminoácido 1 a 68 o 33 a 68 de la SEQ ID NO:2.

Un fragmento de ácido nucleico puede codificar un epítopo que lleva una región de un polipéptido descrito en este documento.

Un fragmento de ácido nucleico que codifica una "parte biológicamente activa de un polipéptido 32144" puede prepararse por aislamiento de una parte de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o 3, que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica de 32144 (por ejemplo las actividades biológicas de las proteínas 32144 se describen en este documento), que expresa la parte codificada de la proteína 32144 (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro) y que evalúa la actividad de la parte codificada de la proteína 32144. Por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico que codifica una parte biológicamente activa de 32144 incluye un dominio de hidrolasa de amida de ácidos grasos, por ejemplo, de aproximadamente los residuos de aminoácido 69 a 513 de la SEQ ID NO:2, o un dominio transmembrana, por ejemplo, de aproximadamente los residuos de aminoácidos 11 a 33 de la SEQ ID NO:2. Un fragmento de ácido nucleico que codifica una parte biológicamente activa de un polipéptido 32144, puede comprender una secuencia de nucleótidos con una longitud mayor de 300, 400, 500, 550 o más nucleótidos.

Preferiblemente, un ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que tiene una longitud de aproximadamente 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 o más nucleótidos e hibrida en condiciones rigurosas descritas en este documento con una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3.

Preferiblemente, un fragmento de ácido nucleico difiere en al menos 1, 2, 3, 10, 20 o más nucleótidos de la secuencia del número de acceso Genbank AA902127, AF086253, AI248721, AI457475, AI811051, AL158750, BE217829, BE504565, BE549648, BE671210, G37418 o Z83745, o la SEQ ID NO:3014 del documento WO 01/02568. Pueden incluirse diferencias que difieren en longitud o identidad de secuencia. Por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico puede: incluir uno o más nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3 localizados fuera de la región de nucleótidos 66 a 533, 999 a 1121 o 1415 a 1985; no incluyendo todos los nucleótidos de AA902127 o AI457475, por ejemplo, puede ser uno o más nucleótidos más corto (en uno o ambos extremos) que la secuencia de AI457475; o puede diferir uno o más nucleótidos en la región del sobrelapado.

Variantes de Ácido Nucleico de 32144

Se describen adicionalmente moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3. Dichas diferencias pueden deberse a la degeneración del código genético (y dar por resultado un ácido nucleico que codifica las mismas proteínas 32144 que las codificadas por la secuencia de nucleótidos descrita en este documento). De forma alternativa, la molécula aislada de ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere, al menos en 1, aunque menos de 5, 10, 20, 50 o 100 residuos de aminoácidos que se muestran en la SEQ ID NO:2. Si se necesita un alineamiento para esta comparación, las secuencias deben alinearse para una homología máxima. La proteína codificada puede diferir en no más que 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos. Se consideran diferencias las secuencias de "bucles" de supresiones o inserciones o desapareamientos.

Pueden elegirse ácidos nucleicos que tengan codones, que son preferidos o no preferidos, para un sistema particular de expresión. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser uno en el que al menos un codón, preferiblemente al menos 10% o 20% de los codones se han alterado de forma que la secuencia se optimiza para la expresión en E. coli, células de levadura, células humanas, células de insecto o células CHO.

Las variantes del ácido nucleico pueden darse de forma natural, tales como variantes alélicas (mismo locus), homólogos (diferente locus) y ortólogos (diferente organismo) o pueden no darse de forma natural. Las variantes que se dan de forma no natural pueden obtenerse por técnicas de mutagénesis, incluyendo las aplicadas a polinucleótidos, células u organismos. Las variantes pueden contener sustituciones, supresiones, inversiones e inserciones de nucleótidos. Puede producirse una variación en cualquiera o ambas regiones de codificación o de no codificación. Las variaciones pueden producir sustituciones de aminoácidos conservativas y no conservativas (en comparación con el producto codificado).

Preferiblemente, el ácido nucleico difiere del de la SEQ ID NO: 1 o 3, por ejemplo, como se indica a continuación: al menos en uno pero en menos de 10, 20, 30 o 40 nucleótidos; al menos en uno pero en menos de 1%, 5%, 10% o 20% de los nucleótidos en el ácido nucleico objeto. El ácido nucleico puede diferir no más que 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótido. Si es necesario para este análisis, las secuencias deben alinearse para conseguir una homología máxima. Se consideran diferencias las secuencias de "bucles" de supresiones o inserciones, o desapareamientos.

Pueden identificarse ortólogos, homólogos y variantes alélicas usando métodos conocidos en la técnica. Estas variantes comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que es idéntico al 50%, al menos aproximadamente 55%, típicamente al menos aproximadamente 70-75%, más típicamente al menos aproximadamente 80-85% y aún más típicamente al menos aproximadamente 90-95% o más a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:2 o un fragmento de esta secuencia. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden identificarse fácilmente por ser capaces de hibridar en condiciones de rigurosidad descritas en este documento, con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 2 o un fragmento de la secuencia. Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a ortólogos, homólogos y variantes alélicas de los ADNc de 32144 de la invención pueden aislarse adicionalmente por mapeo en el mismo cromosoma o locus que el gen de 32144.

Variantes preferidas incluyen las que se correlacionan con la capacidad de hidrolizar de forma enzimática amidas de ácidos grasos, por ejemplo, anandamida o etanolamidas de ácidos oleico (por ejemplo, oleamida), linoleico o palmítico.

Las variantes alélicas de 32144, por ejemplo 32144 humano, incluyen tanto proteínas funcionales como proteínas no funcionales. Variantes alélicas funcionales son variantes de la secuencia de aminoácidos que se dan de forma natural de la proteína 32144 en una población que mantiene la capacidad de enlazar y catabolizar amidas de ácidos grasos, por ejemplo, anandamida y etanolamidas de ácidos oleico (por ejemplo, oleamida), linoleico o palmítico. Las variantes alélicas funcionales típicamente contendrán sólo la sustitución conservativa de uno o más aminoácidos de la SEQ ID NO:2, o la sustitución, supresión o inserción de restos no críticos en regiones no críticas de la proteína. Variantes alélicas no funcionales son variantes de la secuencia de aminoácidos que se dan de forma natural de la proteína 32144, por ejemplo, 32144 humano, en una población que no tiene la capacidad de enlazar y catabolizar amidas de ácidos grasos, por ejemplo, anandamida y etanolamidas de ácidos oleico (por ejemplo, oleamida), linoleico o palmítico. Las variantes alélicas no funcionales contendrán típicamente una sustitución, supresión, o inserción no conservativas, o el truncamiento prematuro de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, o una sustitución, inserción, o supresión en residuos críticos o regiones críticas de la proteína.

Además, también se describen moléculas de ácido nucleico que codifican otros miembros de la familia de 32144 y, por lo tanto, que tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de las secuencias de 32144 de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3.

Moléculas de Ácido Nucleico Antisentido, Ribozimas y Moléculas de Ácido Nucleico de 32144 Modificadas

Se describe adicionalmente en este documento una molécula aislada de ácido nucleico que es antisentido con respecto a 32144. Un ácido nucleico "antisentido" puede incluir una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "en el sentido" que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria a la hebra de codificación de una molécula de ADNc de doble hebra o complementaria a una secuencia de ARNm. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una hebra que codifica la 32144 entera, o sólo a una parte de la misma (por ejemplo, la región de codificación de la 32144 humana correspondiente a la SEQ ID NO:3). En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido con respecto a una "región de no codificación" de la hebra de codificación de una secuencia de nucleótidos que codifica 32144 (por ejemplo, las regiones 5' y 3' no traducidas).

Un ácido nucleico antisentido puede diseñarse de tal forma que sea complementario a la región de codificación entera del ARNm de 32144, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido con respecto a solamente una parte de la región de codificación o no codificación del ARNm de 32144. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción del ARNm de 32144, por ejemplo, entre las regiones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del gen diana de interés. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 o más nucleótidos de longitud.

Un ácido nucleico antisentido puede construirse usando síntesis química y reacciones de unión enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos que se dan de forma natural o nucleótidos modificados de diversa forma diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y en el sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. El ácido nucleico antisentido también puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés, descrito adicionalmente en la siguiente subsección).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido se administran típicamente a un sujeto (por ejemplo, por inyección directa en un sitio de un tejido), o se generan in situ de tal forma que hibriden o se unan al ARNm celular y/o ADN genómico que codifica una proteína 32144 para inhibir de esta manera al expresión de la proteína, por ejemplo, por medio de la inhibición de la transcripción y/o la traducción. De forma alternativa, pueden modificarse moléculas de ácido nucleico antisentido para dirigirse a células seleccionadas y después administrarse sistémicamente. Para la administración sistémica, las moléculas antisentido pueden modificarse de tal forma que se unan específicamente a receptores o antígenos expresados en una superficie celular seleccionada, por ejemplo, por unión de las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores o antígenos de la superficie celular. Las moléculas de ácido nucleico antisentido también pueden administrarse a células usando los vectores descritos en este documento. Para conseguir suficientes concentraciones intracelulares de las moléculas antisentido, se prefieren construcciones de vec-
tores en las que la molécula de ácido nucleico antisentido se pone bajo el control de un promotor pol II o pol III fuerte.

En aún otro aspecto, la molécula de ácido nucleico antisentido es una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérico. Una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérico forma híbridos de hebra doble específicos con el ARN complementario en los que, a diferencia de las unidades \beta usuales, las hebras corren en paralelo (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2'-o-metilrribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).

En aún otro aspecto, el ácido nucleico antisentido es un ribozima. Un ribozima que tiene especificidad para el ácido nucleico que codifica 32144 puede incluir una o más secuencias complementarias a la secuencia de nucleótidos de un ADNc de 32144 descrito en este documento (es decir, la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3), y una secuencia que ha conocido la secuencia catalítica responsable de la rotura del ARNm (véase la Patente de EE.UU. núm. 5.093.246 o Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334:585-591). Por ejemplo, puede construirse un derivado del ARN L-19 IVS de Tetrahymena en el que la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos a escindir en un ARNm que codifica 32144. Véase, por ejemplo, Cech et al. Patente de EE.UU. núm. 4.987.071; y Cech et al. Patente de EE.UU. núm. 5.116.742. De forma alternativa, el ARNm de 32144 puede usarse para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad ribonucleasa específica de un grupo de moléculas de ARN. Véase, por ejemplo, Bartel, D. y Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418.

La expresión génica de 32144 puede inhibirse dirigiendo secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora de 32144 (por ejemplo, el promotor y/o potenciadores de 32144) para formar estructuras en triple hélice que evitan la transcripción del gen de 32144 en células diana. Véase, en general, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6:569-84; Helene, C. i (1992) Ann. N.Y. Acad Sci. 660:27-36; y Maher, L.J: (1992) Bioassays 14:807-15. Las secuencias potenciales que pueden fijarse como dianas para la formación de triples hélices pueden aumentarse creando una denominada molécula de ácido nucleico "cambiante". Las moléculas cambiantes se sintetizan de una forma 5'-3', 3'-5' alterna, de tal manera que forman pares de bases primero con una hebra de un dúplex y después con la otra, eliminando la necesidad de que esté presente un tramo considerable de purinas o pirimidinas en una hebra de un dúplex.

También se describen moléculas cebadoras y de sonda de oligonucleótidos marcados de forma detectable. Típicamente, estas marcas son quimioluminiscentes, fluorescentes, radiactivas o colorimétricas.

Una molécula de ácido nucleico de 32144 puede modificarse en el residuo de base, residuo de azúcar o esqueleto de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Para ejemplos no limitantes de oligonucleótidos sintéticos con modificaciones, véase Toulmé (2001) Nature Biotech. 19:17 y Faria et al. (2001) Nature Biotech. 19:40-44. Dichos oligonucleótidos de fosforamidita pueden ser eficaces agentes antisentido.

Por ejemplo, el esqueleto de desoxirribosa fosfato de las moléculas de ácido nucleico puede modificarse para generar ácidos nucleicos peptídicos (véase Hyrup B. et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4: 5-23). Como se usan en este documento, los términos "ácido nucleico peptídico" o "APN" se refieren a un mimético de ácido nucleico, por ejemplo un mimético de ADN, en el que el esqueleto de desoxirribosa fosfato se reemplaza por un esqueleto seudopeptídico y sólo se conservan las cuatro nucleobases naturales. El esqueleto neutral de un APN puede permitir la hibridación específica a ADN y ARN en condiciones de baja intensidad iónica. La síntesis de oligómeros de PNA puede llevarse a cabo utilizando protocolos convencionales de síntesis de péptidos en fase sólida como los descritos por Hyrup B. et al. (1996) supra y Perry-O'Keefe et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 93; 14670-675.

Pueden usarse APN de moléculas de ácido nucleico de 32144 en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, se pueden utilizar APN como agentes antisentido o antígenos para la modulación específica de la secuencia de la expresión génica, por ejemplo, induciendo la parada de la transcripción o de la traducción o inhibiendo la replicación. También se pueden utilizar APN de moléculas de ácido nucleico de 32144 en el análisis de mutaciones de un único par de bases en un gen, (por ejemplo, mediante pinzamiento por PCR dirigida por APN); como "enzimas artificiales de restricción" cuando se utilizan en combinación con otras enzimas (por ejemplo, nucleasas S1 (Hyrup, B. et al. (1996) supra)); o como sondas o cebadores para la secuenciación o hibridación del ADN (Hyrup, B. et al. (1996) supra; Perry-O'Keefe supra).

De forma alternativa, el oligonucleótido puede incluir otros grupos colgantes tales como péptidos (por ejemplo, para fijar como objetivo receptores de células huésped in vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; la publicación PCT núm. WO 88/09810) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, la publicación PCT núm. WO 89/10134). Además, se pueden modificar oligonucleótidos con agentes de escisión que se activan con la hibridación (véase, por ejemplo, Krol et al. (1988) Bio-Techniques 6:958-976) o agentes de intercalado. (Véase, por ejemplo, Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549). Para este fin, se puede conjugar el oligonucleótido con otra molécula (por ejemplo, un péptido, agente de reticulado activado por la hibridación, agente de transporte o agente de escisión activado por la hibridación).

También se describen moléculas sonda y cebador de oligonucleótidos con balizas moleculares que tienen al menos una región que es complementaria a un ácido nucleico de 32144 de la invención, dos regiones complementarias, teniendo una un fluoróforo y teniendo la otra un inactivador de tal forma que la baliza molecular sea útil para cuantificar la presencia del ácido nucleico de 32144 de la invención en una muestra. Se describen ácidos nucleicos de balizas moleculares, por ejemplo, en Lizardi et al., Patente de EE.UU. núm. 5.854.033; Nazarenko et al., Patente de EE.UU. núm. 5.866.336, y Livak et al., Patente de EE.UU. 5.876.930.

Polipéptidos 32144 Aislados

Se describe adicionalmente una proteína 32144 aislada, o un fragmento, por ejemplo, una parte biológicamente activa, para usar como inmunógenos o antígenos para inducir o ensayar (o más generalmente para unirse a) anticuerpos anti-32144. La proteína 32144 puede aislarse a partir de fuente celulares o tisulares usando técnicas de purificación de proteínas convencionales. La proteína 32144 o fragmentos de la misma pueden producirse por técnicas de ADN recombinantes o pueden sintetizarse químicamente.

Los polipéptidos incluyen los que se producen como resultado de la existencia de múltiples genes, acontecimientos alternativos de la transcripción, acontecimientos alternativos de corte y empalme de ARN y acontecimientos alternativos de traducción y post-traducción. El polipéptido puede expresarse en sistemas, por ejemplo, células cultivadas, que dan por resultado esencialmente las mismas modificaciones post-traduccionales presentes cuando se expresa el polipéptido en una célula nativa, o en sistemas que dan por resultado la alteración u omisión de modificaciones post-traduccionales, por ejemplo glicosilación o escisión, presentes cuando se expresa en una célula nativa.

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Preferiblemente, un polipéptido 32144 tiene una o más de las siguientes características:

(i)

tiene la capacidad de enlazar y catabolizar amidas de ácidos grasos;

(ii)

tiene un peso molecular, por ejemplo, un peso molecular deducido, ignorando preferiblemente cualquier contribución de modificaciones de post-traducción, composición de aminoácidos y otras características físicas de la SEQ ID NO:2;

(iii)

tiene una similitud de secuencia global de al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70, 80 90 o 95%, con un polipéptido de la SEQ ID NO:2;

(iv)

se puede encontrar en el pulmón, hígado, colon, mama, ovario, páncreas, riñón o cerebro.

(v)

tiene un dominio amidasa que es homólogo preferiblemente a aproximadamente 70%, 80%, 90% o 95% con los residuos de aminoácidos aproximadamente de 69 a 513 de la SEQ ID NO:2;

(vi)

tiene un motivo distintivo de amidasa o una secuencia que es homólogo preferiblemente a aproximadamente 70%, 80%, 90% o 95% con los residuos de aminoácidos aproximadamente de 204 a 235 de la SEQ ID NO:2;

(vii)

tiene un dominio transmembrana localizado de forma N-terminal, o una región que es aproximadamente 70%, 80%, 90% o 95% con los residuos de aminoácidos 11 a 33 de la SEQ ID NO:2;

(viii)

localiza a membranas celulares;

(ix)

tiene al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, preferiblemente ocho sitios predichos de fosforilación de proteína quinasa C (PS00005);

(x)

tiene al menos uno, dos, preferiblemente tres sitios predichos de fosforilación de caseína quinasa II (PS00006);

(xi)

tiene al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, preferiblemente once sitios predichos de N-miristoilación (PS00008);

(xii)

tiene al menos uno, preferiblemente dos sitios predichos de N-glicosilación (PS00001); y

(xiii)

tiene al menos una señal dirigida C-terminal de microcuerpos predicha (PS00342).

\vskip1.000000\baselineskip

Preferiblemente, la proteína 32144, o un fragmento de la misma, difiere de la secuencia correspondiente en la SEQ ID:2. En un aspecto, difiere en al menos uno pero menos de 15, 10 o 5 residuos de aminoácidos. En otra difiere de la secuencia correspondiente de la SEQ ID NO:2 en al menos un residuo pero menos de 20%, 15%, 10% o 5% de los residuos en ella difieren de la secuencia correspondiente de la SEQ ID NO:2. (Si esta comparación requiere un alineamiento de las secuencias, deben alinearse para una homología máxima. Las secuencias de "bucles" de supresiones o inserciones, o desapareamientos se consideran diferencias). Las diferencias son, preferiblemente, diferencias o cambios en un residuo no esencial o una sustitución conservativa. De forma alternativa, las diferencias no están en el dominio de la hidrolasa de amida de ácidos grasos, por ejemplo, aproximadamente en los aminoácidos 69 a 289 y 419 a 513 de la SEQ ID NO:2, De forma alternativa, una o más diferencias están en el dominio de hidrolasa de amida de ácidos grasos, por ejemplo, aproximadamente en los aminoácidos 69 a 289 y 419 a 513 de la SEQ ID NO:2.

También se describe una proteína que contiene uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, un cambio en un residuo de aminoácidos que no es esencial para la actividad. Dichas proteínas 32144 difieren en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, aunque retienen la actividad biológica.

En un aspecto, la proteína incluye una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más homóloga a la SEQ ID NO:2.

Se describe una proteína 32144 o un fragmento que varía de la secuencia de la SEQ ID NO:2 en regiones definidas por los aminoácidos aproximadamente 1 a 10, 34 a 68, 290 a 418 y 514 a 532 de al menos uno aunque menos que 15, 10 o 5 residuos de aminoácidos en la proteína o fragmento, pero que no difiere de la SEQ ID NO:2 en regiones definidas por los aminoácidos aproximadamente 11 a 33, 69 a 289 y 419 a 513. También se describe una proteína 32144 o fragmento que varía de la secuencia de la SEQ ID NO:2 en regiones definidas por los aminoácidos aproximadamente 1 a 33, 69 a 289 y 419 a 513 de al menos uno aunque menos que 15, 10 o 5 residuos de aminoácidos en la proteína o fragmento, pero que no difiere de la SEQ ID NO:2 en regiones definidas por los aminoácidos aproximadamente 1 a 10, 34 a 68, 290 a 418 y 514 a 532. (Si estas comparaciones requieren un alineamiento de las secuencias, deben alinearse para una homología máxima. Las secuencias de "bucles" de supresiones o inserciones, o desapareamientos se consideran diferencias). En algunas realizaciones, la diferencia está en un residuo no esencial o es una sustitución conservativa, mientras que en otras la diferencia está en un residuo esencial o es una sustitución no conservativa.

En un aspecto, una parte biológicamente activa de una proteína 32144 incluye un dominio de hidrolasa de amida de ácidos grasos o un dominio transmembrana. Además, pueden prepararse otras partes biológicamente activas, en las que se suprimen otras regiones de la proteína, por técnicas recombinantes y evaluarse con respecto a una o más de las actividades funcionales de una proteína 32144 nativa.

Preferiblemente, la proteína 32144 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2. De manera alternativa, la proteína 32144 es esencialmente idéntica a la SEQ ID NO: 2. De forma alternativa, la proteína 32144 es esencialmente idéntica a la SEQ ID NO:2 y conserva la actividad funcional de la proteína de la SEQ ID NO:2, como se describe con detalle en las subsecciones anteriores.

Preferiblemente, un fragmento difiere en al menos 1, 2, 3, 10, 20 o más residuos de aminoácidos codificados en la secuencia en AA902127, AF086253, AI248721, AI457475, AI811051, AL158750, BE217829, BE504565, BE549648, BE671210, G37418 o Z83745 o la SEQ ID NO:3014 del documento WO 01/02568. Pueden incluirse diferencias que difieren en longitud o identidad de secuencia. Por ejemplo, un fragmento puede: incluir uno o más residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 fuera de la región codificada por los nucleótidos 119 a 533, 999 a 1121 o 1467 a 1717; no incluir todos los residuos de aminoácidos de una secuencia en AA902127 o AI457475, por ejemplo, puede ser uno o más residuos de aminoácidos más corto (en uno o ambos extremos) que una secuencia en AA902127 o AI457475; o puede diferir en uno o más residuos de aminoácidos en la región del sobrelapado.

Variantes de Proteínas 32144

Se describe adicionalmente una variante de un polipéptido 32144, por ejemplo, que funciona como un agonista (mimético) o como un antagonista. Pueden generarse variantes de las proteínas 32144 por mutagénesis, por ejemplo por mutación puntual discreta, la inserción o supresión de secuencias o el truncamiento de una proteína 32144. Un agonista de las proteínas 32144 puede retener esencialmente las mismas, o un subconjunto de las actividades biológicas de la forma que se da de forma natural de una proteína 32144. Un antagonista de una proteína 32144 puede inhibir una o más de las actividades de la forma que se da de forma natural de la proteína 32144, por ejemplo, por modulación competitiva de una actividad mediada por 32144 de una proteína 32144. Por lo tanto, se pueden desencadenar efectos biológicos específicos mediante el tratamiento con una variante de función limitada. Preferiblemente, el tratamiento de un sujeto con una variante que tiene una subconjunto de las actividades biológicas de la forma que se da de forma natural de la proteína tiene menos efectos secundarios en un sujeto con respecto al tratamiento con la forma que se da de forma natural de la proteína 32144.

Pueden identificarse variantes de una proteína 32144 explorando en bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, de una proteína 32144 por actividad agonista o antagonista.

Pueden usarse bibliotecas de fragmentos, por ejemplo, fragmentos N terminales, C terminales o internos, de una secuencia que codifica la proteína 32144 para generar una población variada de fragmentos para la exploración y posterior selección de variantes de una proteína 32144. Se prefieren particularmente variantes en las que se añade o se suprime un residuo de cisteína o en las que se añade o se suprime un residuo que está glicosilado.

En la técnica se conocen métodos para explorar productos génicos de bibliotecas combinatorias obtenidas por mutaciones puntuales o truncamiento, y para la exploración de bibliotecas de ADNc para seleccionar productos génicos que tengan una propiedad seleccionada. Dichos métodos se adaptan para la rápida exploración de las genotecas generadas mediante mutagénesis combinatoria de las proteínas 32144. La mutagénesis recursiva en conjunto (REM), una nueva técnica que mejora la frecuencia de mutantes funcionales en las genotecas, se puede utilizar en combinación con los análisis de detección para identificar variantes de 32144 (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6:327-331).

Pueden explotarse ensayos basados en células para analizar una biblioteca de 32144 variada. Por ejemplo, una biblioteca de vectores de expresión puede introducirse por transfección en una línea celular, por ejemplo, una línea celular que responde normalmente a 32144 de una manera dependiente del sustrato. Las células transfectadas se ponen entonces en contacto con 32144 y el efecto de la expresión del mutante en la señalización por el sustrato de 32144 puede detectarse, por ejemplo, midiendo la señalización de serotonina, la actividad del canal de iones, la actividad de la adhesión focal de quinasa o la proliferación o migración celular. Puede entonces recuperarse el ADN plasmídico de las células que reflejan la inhibición o, alternativamente, la potenciación de la señalización por el sustrato de la proteína 32144, y caracterizar adicionalmente los distintos clones individuales.

Se describe adicionalmente un método para obtener un polipéptido 32144, por ejemplo un péptido que tiene una actividad de tipo no silvestre, por ejemplo, un antagonista, agonista o superagonista de un polipéptido 32144 que se da de forma natural, por ejemplo un polipéptido 32144 que se da de forma natural. El método incluye: alterar la secuencia de un polipéptido 32144, por ejemplo, alterando la secuencia, por ejemplo, por sustitución o supresión de uno o más residuos de una región no conservada, un dominio o residuo descrito en este documento, y ensayando en el polipéptido alterado para la actividad deseada.

También se describe un método para obtener un fragmento o análogo de un polipéptido 32144 con una actividad biológica de un polipéptido 32144 que se da de forma natural. El método incluye: alterar la secuencia, por ejemplo, por sustitución o supresión de uno o más residuos, de un polipéptido 32144, por ejemplo, alterando la secuencia de una región no conservada, o un dominio o residuo descrito en este documento, y ensayando en el polipéptido alterado para la actividad deseada.

Anticuerpos Anti-32144

Se describe adicionalmente un anticuerpo anti-32144, o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento que enlaza un antígeno del mismo). El término "anticuerpo" como se usa en este documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina o a una parte inmunológicamente activa de la misma, es decir, una parte de unión a antígeno. Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" se refiere a una proteína que comprende al menos una, y preferiblemente dos, regiones variables de cadena pesada (H) (abreviadas en este documento como VH), y al menos una y preferiblemente dos regiones variables de cadena ligera (L) (abreviadas en este documento como VL). Las regiones VH y VL pueden estar subdivididas adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de complementariedad" ("CDR"), intercaladas con regiones que están más conservadas denominadas "regiones marco" (FR). La extensión de la región marco y las CDR se ha definido de forma precisa (véase, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de EE.UU. de Salud y Servicios Humanos, NIH Publication núm. 91-3242, y Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917, que se incorpora en este documento por referencia). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

El anticuerpo anti-32144 puede incluir además una región constante de cadena pesada y ligera, para formar de esta manera una cadena de inmunoglobulina pesada y ligera, respectivamente. En una realización, el anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina, donde las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina están interconectadas, por ejemplo, por enlaces disulfuro. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. La región variable de las cadenas pesadas y ligeras contiene un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos típicamente median la unión del anticuerpo a tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmune (por ejemplo células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema clásico de complemento.

Como se usa en este documento, el término "inmunoglobulina" se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos esencialmente codificados por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina humanos reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa (IgA1 e IgA2), gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon y mu, así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (de aproximadamente 25 KDa o 214 aminoácidos) se codifican por un gen de región variable en el extremo NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de región constante kappa o lambda en el extremo COOH. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 KDa o 446 aminoácidos), se codifican de forma similar por un gen de región variable (de aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de región constante mencionados anteriormente, por ejemplo gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos).

El término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "parte de anticuerpo" o "fragmento"), como se usa en este documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo de longitud completa que retienen la capacidad de unirse específicamente al antígeno, por ejemplo, el polipéptido 32144 o un fragmento del mismo. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno del anticuerpo anti-32144 incluyen, pero no se limitan a: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')_{2}, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un enlace disulfuro a la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CHI; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH se codifican por dos genes distintos, pueden unirse, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que permite que se obtengan como una sola cadena proteica en la que las regiones VL y VH están emparejadas para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883). Dentro de el término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo también se incluyen estos anticuerpos de cadena sencilla. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los especialistas en la técnica y los fragmentos se exploran con respecto a la utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

El anticuerpo anti-32144 puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. En otras realizaciones, el anticuerpo puede producirse de forma recombinante, por ejemplo, puede producirse por presentación en fagos o por métodos combinatorios.

La presentación en fagos y los métodos combinatorios para generar anticuerpos anti-32144 se conocen en la técnica (como se describe, por ejemplo, en Ladner et al. Patente de EE.UU. núm. 5.223.409; Kang et al. Publicación Internacional núm. WO 92/18619; Dower et al. Publicación Internacional núm. WO 91/17271; Winter et al. Publicación Internacional núm. WO 92/20791; Markland et al. Publicación Internacional núm. WO 92/15679; Breitling et al. Publicación Internacional núm. WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación Internacional núm. WO 92/01047; Garrard et al. Publicación Internacional núm. WO 92/09690; Ladner et al. Publicación Internacional núm. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 2:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281. Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725-734. Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628. Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 2:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982.

En un aspecto, el anticuerpo anti-32144 es un anticuerpo completamente humano (por ejemplo un anticuerpo obtenido en un ratón que se ha modificado por ingeniería genética para producir un anticuerpo a partir de una secuencia de inmunoglobulina humana) o un anticuerpo no humano, por ejemplo un anticuerpo de roedor (ratón o rata), cabra, primate (por ejemplo, mono), camello. Preferiblemente, el anticuerpo no humano es de un roedor (un anticuerpo de ratón o de rata). En la técnica se conocen métodos para producir anticuerpos de roedor.

Pueden generarse anticuerpos monoclonales humanos usando ratones transgénicos que llevan genes de inmunoglobulina humana en lugar del sistema de ratón. Se usan esplenocitos de estos ratones transgénicos inmunizados con el antígeno de interés para producir hibridomas que secretan mAb humano con afinidades específicas por epítopos de una proteína humana (véase, por ejemplo, Wood et al. Solicitud Internacional WO 91/00906, Kucherlapati et al. Publicación PCT WO 91/10741; Lonberg et al. Solicitud Internacional WO 92/03918; Kay et al. Solicitud Internacional WO 92/03917; Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368:856-859; Green, L. L. et al. 1994 Nature Medicine 7:13-21; Morrison, S. L. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year Immunol. 7:33-40; Tuaillon et al. 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al. 1991 Eur J Immunol 21:1323-1326).

Un anticuerpo anti-32144 puede ser uno en el que la región variable, o una parte de la misma, por ejemplo, las CDR, se generan en un organismo no humano, por ejemplo, una rata o ratón. Están dentro de la invención anticuerpos quiméricos, con CDR injertadas y humanizados. Están dentro de la invención anticuerpos generados en un organismo no humano, por ejemplo, una rata o ratón, y después modificados, por ejemplo, en la región marco variable o la región constante, para reducir la antigenicidad en un ser humano.

Los anticuerpos quiméricos se pueden producir por técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Por ejemplo, un gen que codifica la región constante Fc de una molécula de anticuerpo monoclonal de murina (o de otra especie) se digiere con enzimas de restricción para eliminar la región que codifica la Fc de murina y se sustituye la parte equivalente de un gen que codifica una región constante Fc humana (véase Robinson et al., Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira, et al., Solicitud de Patente Europea 184.187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171.496; Morrison et al., Solicitud de Patente Europea 173.494; Neuberger et al., Solicitud Internacional WO 86/01533; Cabilly et al. Patente de EE.UU. núm. 4.816.567; Cabilly et al., Solicitud de Patente Europea 125.023; Better et al. (1988 Science 240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559).

Un anticuerpo humanizado o con CDR injertadas tendrá al menos una o dos, aunque generalmente las tres CDR del receptor (de cadenas de inmunoglobulina pesadas o ligeras) reemplazadas por una CDR del donante. El anticuerpo puede reemplazarse por al menos una parte de una CDR no humana o sólo algunas de las CDR pueden reemplazarse por CDR no humanas. Sólo es necesario reemplazar el número de CDR necesarias para la unión del anticuerpo humanizado a una 32144 o un fragmento de la misma. Preferiblemente, el donante será un anticuerpo de roedor, por ejemplo, un anticuerpo de rata o ratón, y el receptor será una región marco humana o una región marco humana consenso. Típicamente, la inmunoglobulina que proporciona las CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina que proporciona la región marco se denomina "aceptor". En un aspecto, la inmunoglobulina donante es no humana (por ejemplo, de roedor). La región marco del aceptor es una región marco que se da de forma natural (por ejemplo, humana) o una región marco consenso, o una secuencia idéntica en aproximadamente 85% o más, preferiblemente 90%, 95%, 99% o más a ella. Como se usa en este documento, el término "secuencia consenso" se refiere a la secuencia formada a partir de los aminoácidos (o nucleótidos) que se dan con más frecuencia en una familia de secuencias relacionadas (Véase, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania 1987). En una familia de proteínas, cada posición en la secuencia consenso está ocupada por el aminoácido que se da con más frecuencia en esa posición de la familia. Si dos aminoácidos se dan con la misma frecuencia, cualquiera puede incluirse en la secuencia consenso. Una "región marco consenso" se refiere a la región marco en la secuencia de inmunoglobulina
consenso.

Un anticuerpo puede humanizarse por métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos humanizados pueden generarse reemplazando secuencias de la región variable de Fv que no están implicadas directamente en la unión al antígeno con secuencias equivalentes de regiones variables de Fv humana. Se proporcionan métodos generales para generar anticuerpos humanizados por Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207, por Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214, y por Queen et al. documentos US 5.585.089, US 5.693.761 y US 5.693.762. Estos métodos incluyen el aislamiento, manipulación y expresión de las secuencias de ácido nucleico que codifican todo o parte de las regiones variables de Fv de inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera. Fuentes de dichos ácidos nucleicos se conocen bien por los expertos en la técnica y, por ejemplo, pueden obtenerse a partir de un hibridoma que produce un anticuerpo contra un polipéptido 32144 o un fragmento del mismo. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado, o fragmento del mismo, pueden clonarse entonces un vector de expresión apropiado.

Los anticuerpos humanizados o con injertos de CDR pueden producirse por injerto de CDR o sustitución de CDR, donde pueden reemplazarse una, dos o todas las CDR de una cadena de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. núm. 5.225.539; Jones et al. 1986 Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534; Beidler et al. 1988 J. Immunol. 141:4053-4060; el documento de Winter US 5.225.539. Winter describe un método de injerto de CDR que puede usarse para preparar los anticuerpos humanizados de la presente invención (Solicitud de Patente del Reino Unido GB 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987; el documento de Winter US 5.225.539).

También se describen anticuerpos humanizados en que los aminoácidos específicos se han sustituido, suprimido o añadido. Los anticuerpos humanizados preferidos tienen sustituciones de aminoácidos en la región marco, tal como para mejorar la unión al antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado tendrá residuos marco idénticos al residuo marco del donante o a otro aminoácido distinto del residuo marco del receptor. Para generar estos anticuerpos, un número pequeño seleccionado de residuos marco del aceptor de la cadena de inmunoglobulina humanizada pueden reemplazarse por los aminoácidos correspondientes del donante. Las localizaciones preferidas de las sustituciones incluyen residuos de aminoácidos adyacentes a la CDR, o que son capaces de interaccionar con una CDR (véase, por ejemplo, el documento US 5.585.089). Los criterios para seleccionar aminoácidos del donante se describen en el documento US 5.585.089, por ejemplo, las columnas 12-16 del documento US 5.585.089, por ejemplo, las columnas 12-16 del documento US 5.585.089. Se describen otras técnicas para humanizar anticuerpos en Padlan et al. documento EP 519596 A1, publicado el 23 de diciembre de 1992.

En realizaciones preferidas, un anticuerpo puede hacerse por inmunización con antígeno de 32144 purificado, o un fragmento del mismo, por ejemplo un fragmento descrito en este documento, un antígeno asociado a la membrana, tejido, por ejemplo, preparados de tejido en bruto, células completas, preferiblemente células vivas, células lisadas, o fracciones celulares, por ejemplo, fracciones de membranas.

Puede usarse una proteína 32144 de longitud completa o un fragmento peptídico antigénico de 32144 como inmunógeno o puede usarse para identificar anticuerpos anti-32144 obtenidos con otros inmunógenos, por ejemplo, células, preparados de membrana y similares. El péptido antigénico de 32144 debe incluir al menos 8 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2 e incluye un epítopo de 32144. Preferiblemente, el péptido antigénico incluye al menos 10 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 15 residuos de aminoácidos, incluso más preferiblemente al menos 20 residuos de aminoácidos y lo más preferiblemente al menos 30 residuos de aminoácidos.

Pueden usarse fragmentos de 32144 como inmunógenos o usarse para caracterizar la especificidad de un anticuerpo elevado frente a una proteína 32144. Pueden usarse fragmentos de 32144 que incluyen residuos de aproximadamente 104 a 120, aproximadamente 183 a 201 o aproximadamente 415 a 438 para hacer uso de ellos, por ejemplo, como inmunógenos o para hacer uso de ellos para caracterizar la especificidad de un anticuerpo, anticuerpos contra regiones hidrófilas de la proteína 32144. De forma similar, pueden usarse fragmentos de 32144 que incluyen residuos de aproximadamente 157 a 182, aproximadamente 388 a 414, o aproximadamente 471 a 489 para obtener un anticuerpo contra una región hidrófoba de la proteína 32144; y fragmentos de 32144 que incluyen residuos de aproximadamente 69 a 289, aproximadamente 204 a 235 o aproximadamente 419 a 513, para obtener un anticuerpo contra una región de hidrolasa de amida de ácidos grasos de la proteína 32144.

Se proporcionan anticuerpos reactivos con, o específicos para cualquiera de estas regiones, u otras regiones o dominios descritos en este documento.

Los anticuerpos pueden enlazar solo proteína 32144 nativa, solo proteína 32144 desnaturalizada o no nativa de otra forma, o ambas. Los anticuerpos pueden enlazar epítopos lineales o conformacionales. Los epítopos conformacionales algunas veces pueden identificarse identificando anticuerpos que se une a la proteína nativa pero no a la proteína 32144 desnaturalizada.

Los epítopos preferidos incluidos por el péptido antigénico son regiones de 32144 que están localizadas en la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrófilas, así como regiones con alta antigenicidad. Por ejemplo, puede usarse un análisis de probabilidad en superficie de Emini de la secuencia de la proteína 32144 humana para indicar las regiones que tienen una probabilidad particularmente elevada de localizarse en la superficie de la proteína 32144 y, por lo tanto, es probable que constituyan residuos en la superficie útiles para dirigir la producción de anticuerpos.

Preferiblemente, el anticuerpo puede enlazar a la parte extracelular de la proteína 32144, por ejemplo, puede enlazar a una célula entera que expresa la proteína 32144. De forma alternativa, el anticuerpo enlaza una parte intracelular de las proteínas 32144. Preferiblemente, los anticuerpos pueden enlazar uno o más del antígeno purificado, antígeno asociado a la membrana, tejido, por ejemplo, secciones de tejido, células enteras, preferiblemente células vivas, células lisadas, fracciones celulares, por ejemplo, fracciones de membrana.

El anticuerpo anti-32144 puede ser un anticuerpo monocatenario. Un anticuerpo monocatenario (scFV) puede obtenerse por ingeniería genética (véase, por ejemplo, Colcher, D. et al. (1999) Ann N Y Acad Sci 880:263-80; y Reiter, Y. (1996) Clin Cancer Res 2:245-52). El anticuerpo monocatenario puede dimerizarse o multimerizarse para generar anticuerpos multivalentes que tienen especificidades por diferentes epítopos de la misma proteína 32144 diana.

Preferiblemente, el anticuerpo tiene una función efectora y/o puede fijar el complemento. De forma alternativa, el anticuerpo no recluta células efectoras; ni se fija al complemento.

Preferiblemente, el anticuerpo tiene capacidad reducida o no tiene capacidad para enlazar un receptor Fc. Por ejemplo, es un isotipo o subtipo, fragmento u otro mutante, que no soporta la unión a un receptor Fc, por ejemplo, tiene una región de unión al receptor Fc mutagenizada o eliminada.

Preferiblemente, un anticuerpo anti-32144 altera (por ejemplo, aumenta o disminuye) la actividad de la hidrolasa de amida de ácidos grasos de un polipéptido 32144. Por ejemplo, el anticuerpo puede enlazar a o en proximidad al sitio activo, por ejemplo, a un epítopo que incluye un residuo localizado de aproximadamente 204 a 235 de la SEQ ID NO:2.

El anticuerpo puede acoplarse a una toxina, por ejemplo, una toxina polipeptídica, por ejemplo ricina o la toxina diftérica o un fragmento activo de la misma, o un núcleo radiactivo, o un agente de formación de imágenes, por ejemplo, un agente radiactivo, enzimático y otro agente, por ejemplo, un agente de formación de imágenes, por ejemplo, un agente de contraste de RMN. Se prefieren marcas que producen emisiones radiactivas detectables o fluorescencia.

Un anticuerpo anti-32144 (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) puede usarse para aislar 32144 por técnicas convencionales, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Además, un anticuerpo anti-32144 puede usarse para detectar la proteína 32144 (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante celular) para evaluar la abundancia y patrón de expresión de la proteína. Los anticuerpos anti-32144 pueden usarse de manera diagnóstica para controlar niveles de proteínas en un tejido como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse por acoplamiento (es decir, unión física) del anticuerpo o una sustancia detectable (es decir, marcaje con anticuerpos). Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminescentes, materiales bioluminescentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de los complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de los materiales fluorescente adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamin-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material bioluminiscente incluye luminol; los ejemplos de los materiales bioluminescentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina, y los ejemplos del material radioactivo adecuado incluyen I^{125}, I^{131}, S^{35} o H^{3}.

Se describe adicionalmente un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-32144, por ejemplo, un anticuerpo anti-32144 descrito en este documento. También se describen vectores que incluyen el ácido nucleico y células transformadas con el ácido nucleico, particularmente células que son útiles para producir un anticuerpo, por ejemplo, células de mamífero, por ejemplo células CHO o células linfáticas.

También se describen líneas celulares, por ejemplo, hibridomas, que fabrican un anticuerpo anti-32144, por ejemplo, y un anticuerpo descrito en este documento, y un método para usar dichas células para obtener un anticuerpo 32144.

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Vectores de Expresión Recombinante. Células Huésped y Células generadas por Ingeniería Genética

También se describen vectores, preferiblemente vectores de expresión que contienen un ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito en este documento. Como se usa en este documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido y puede incluir un plásmido, cósmido o vector viral. El vector puede ser capaz de replicarse de forma autónoma o puede integrarse en el ADN de un huésped. Los vectores virales incluyen, por ejemplo, retrovirus con defectos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados.

Un vector puede incluir un ácido nucleico de 32144 en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Preferiblemente, el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras unidas de forma operativa a la secuencia de ácido nucleico a expresar. El término "secuencia reguladora" incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos, así como secuencias inducibles y/o reguladoras con especificidad de tejido. El diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado y similares. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en las células huésped para producir de esta manera proteínas o polipéptidos, incluyendo proteínas o polipéptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en este documento (por ejemplo, proteínas 32144, formas mutantes de proteínas 32144, proteínas de fusión y similares).

Los vectores de expresión recombinante pueden diseñarse para la expresión de proteínas 32144 en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, pueden expresarse polipéptidos de la invención en E. coli, células de insecto (por ejemplo, usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Se tratan adicionalmente células huésped adecuadas en Goeddel, (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA. De forma alternativa, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras del promotor de T7 y polimerasa de T7.

La expresión de proteínas en procariotas se realiza la mayoría de las veces en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o proteínas que no son de fusión. Los vectores de fusión añaden un número de aminoácidos a una proteína codificada en los mismos, normalmente en el extremo amino de la proteína recombinante. Estos vectores de fusión típicamente tienen tres fines: 1) aumentar la expresión de la proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en la purificación por afinidad. A menudo, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Estas enzimas y sus secuencias de reconocimiento afines incluyen el Factor Xa, trombina y enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. y Johnson, K. S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan la glutatión-S-transferasa (GST), la proteína E de unión a la maltosa, o la proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.

Pueden usarse proteínas de fusión purificadas en ensayos de actividad de 32144 (por ejemplo, ensayos directos o ensayos competitivos descritos en detalle más adelante) o para generar anticuerpos específicos para proteínas 32144. Preferiblemente, una proteína de fusión expresada en un vector de expresión retroviral puede usarse para infectar células de médula ósea que posteriormente se trasplantan en receptores irradiados. Se examina entonces la patología del receptor después de que haya transcurrido un tiempo suficiente (por ejemplo, seis semanas).

Para maximizar la expresión de proteínas recombinantes en E. coli, se expresa la proteína en una bacteria huésped con una capacidad deteriorada de escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S. (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico a insertar en un vector de expresión, de forma que los codones individuales para cada aminoácido sean los utilizados preferentemente en E. coli (Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Esta alteración de secuencias de ácido nucleico de la invención puede realizarse por técnicas de síntesis de ADN convencionales.

El vector de expresión de 32144 puede ser un vector de expresión de levadura, un vector para la expresión en células de insecto, por ejemplo, un vector de expresión de baculovirus o un vector adecuado para la expresión en células de mamífero.

Cuando se usa en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión pueden proporcionarse por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores usados comúnmente se derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40.

En otro aspecto, el promotor es un promotor inducible, por ejemplo, un promotor regulado por una hormona esteroidea, por una hormona polipeptídica (por ejemplo, por medio de una ruta de transducción de señales), o por un polipéptido heterólogo (por ejemplo, los sistemas inducibles por tetraciclina "Tet-On" y "Tet-Off"; véase, por ejemplo, Clontech Inc., CA, Gossen y Bujard (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:5547, y Paillard (1989) Human Gene Therapy 9:983).

En otros aspectos, el vector de expresión recombinante de mamíferos es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo determinado de células (por ejemplo, los elementos reguladores específicos del tejido se utilizan para expresar el ácido nucleico). Los ejemplos no limitantes de promotores con especificidad de tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina (con especificidad de hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos del tejido linfoide (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), en particular los promotores de los receptores de las células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores específicos de las neuronas (por ejemplo, el promotor del neurofilamento; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), promotores específicos del páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916), y promotores específicos de la glándula mamaria (por ejemplo, promotor de suero de leche; Patente de EE.UU. núm. 4.873.316 y Publicación de Solicitud Europea Núm. 264.166). También se incluyen promotores regulados en el desarrollo, por ejemplo, los promotores de hox de murina (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor de \alpha-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).

Se describe adicionalmente un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de 32144 clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Pueden elegirse secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores y/o potenciadores virales) unidos de forma operativa a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido que dirijan la expresión constitutiva, específica de tejido o específica de tipo celular del ARN antisentido en una diversidad de tipos celulares. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado.

Se describe adicionalmente una célula huésped que incluye una molécula de ácido nucleico descrita en este documento, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de 32144 en un vector de expresión recombinante o una molécula de ácido nucleico de 32144 que contiene secuencias que permiten que se recombine de manera homóloga en un sitio específico del genoma de la célula huésped. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan indistintamente en este documento. Estos términos se refieren no sólo a la célula objeto particular, sino a la descendencia o posible descendencia de dicha célula. Como pueden realizarse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a una mutación o influencias ambientales, dicha descendencia puede, de hecho, no ser idéntica a la célula madre, pero aún así se incluye dentro del alcance del término como se usa en este documento.

Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, una proteína 32144 puede expresarse en células bacterianas (tal como células E. coli), células de insecto, células de levadura o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS (células CV-1 de riñón del mono verde africano que originan las células SV40; Gluzman (1981) Cell 23:175-182)). Otras células huésped adecuadas se conocen por los expertos en la técnica.

El ADN del vector puede introducirse en células huésped por técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se usa en este documento, los términos "transformación" y "transfección" pretenden hacer referencia a una diversidad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir un ácido nucleico extraño (por ejemplo, un ADN) en una célula huésped, incluyendo coprecipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación.

Una célula huésped puede usarse para producir (es decir, expresar) una proteína 32144. Por consiguiente, se describen métodos para producir una proteína 32144 que usa las células huésped descritas en este documento. En un aspecto, el método incluye cultivar la célula huésped de la invención (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica una proteína 32144) en un medio adecuado de forma que se produce la proteína 32144. En otro aspecto, el método incluye además el aislamiento de una proteína 32144 a partir del medio o de la célula huésped.

Se describe además una célula o preparado purificado de células que incluyen un transgen de 32144, o que expresan de forma errónea 32144 de otra forma. La preparación de células puede consistir en células humanas o no humanas, por ejemplo, células de roedor, por ejemplo, células de ratón o rata, células de conejo o células de cerdo. En realizaciones preferidas, la célula o células incluyen un transgen de 32144, por ejemplo, una forma heteróloga de un 32144, por ejemplo, un gen derivado de humanos (en el caso de una célula no humana). El transgen de 32144 puede expresarse de forma defectuosa, por ejemplo, tener una expresión excesiva o insuficiente. En otras realizaciones preferidas, la célula o las células incluyen un gen que expresa de forma errónea una proteína 32144 endógena, por ejemplo, un gen cuya expresión se altera, por ejemplo, una desactivación. Dichas células pueden servir como modelo para estudiar trastornos que están relacionados con alelos de 32144 mutados o expresados de forma errónea o para usar en la exploración de fármacos.

Se describe adicionalmente una célula humana, por ejemplo una célula madre hepática o hematopoyética, transformada con un ácido nucleico que codifica un polipéptido 32144 objeto.

También se describen células, preferiblemente células humanas, por ejemplo, células hematopoyéticas o fibroblastos, en las que un 32144 endógeno está bajo el control de una secuencia reguladora que normalmente no controla la expresión del gen de 32144 endógeno. Las características de expresión de un gen endógeno dentro de una célula, por ejemplo, una línea celular o microorganismo, pueden modificarse insertando un elemento regulador de ADN heterólogo en el genoma de la célula de tal forma que el elemento regulador insertado se une de forma operativa al gen de 32144 endógeno. Por ejemplo, un gen de 32144 endógeno que es "silencioso transcripcionalmente", por ejemplo, no se expresa normalmente o se expresa sólo a niveles muy bajos, puede activarse por inserción de un elemento regulador que es capaz de promover la expresión de un producto génico que normalmente se expresa en esa célula. Pueden usarse técnicas tales como recombinaciones homólogas dirigidas para insertar el ADN heterólogo como se describe, por ejemplo, en Chappel, documento US 5.272.071; documento WO 91/06667, publicado el 16 de mayo de 1991.

Preferiblemente, las células recombinantes descritas en este documento pueden usarse para terapia sustitutiva en un sujeto. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido 32144 unido de forma operativa a un promotor inducible (por ejemplo, un promotor regulado por el receptor de hormonas esteroideas) se introduce en una célula recombinante humana o no humana, por ejemplo, de mamífero, por ejemplo, porcina. La célula se cultiva y se encapsula en un material biocompatible, tal como arginato de polilisina, y posteriormente se implanta en el sujeto. Véase, por ejemplo, Lanza (1996) Biotechnol. 14:1107; Joki et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:35; y Patente de EE.UU. núm. 5.876.742. La producción del polipéptido 32144 puede regularse en el sujeto por medio de la administración de un agente (por ejemplo, una hormona esteroidea) al sujeto. De forma alternativa, las células recombinantes implantadas expresan y secretan un anticuerpo específico para un polipéptido 32144. El anticuerpo puede ser cualquier anticuerpo o cualquier derivado de anticuerpo descrito en este documento.

Usos

Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteína y anticuerpos descritos en este documento pueden usarse en uno o más de los siguientes métodos: a) ensayos de exploración; y b) medicina predictiva (por ejemplo, ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico, ensayos clínicos de monitorización y farmacogenéticas).

Las moléculas de ácido nucleico aisladas de 32144 pueden usarse, por ejemplo, para expresar una proteína 32144 (por ejemplo, por medio de un vector de expresión recombinante en una célula huésped en aplicaciones de terapia génica), para detectar un ARNm de 32144 (por ejemplo, en una muestra biológica) o una alteración genética en un gen de 32144, y para modular la actividad de 32144, como se describe adicionalmente más adelante. Además, las proteínas 32144 se pueden utilizar para seleccionar sustratos de 32144 que se dan de forma natural, para seleccionar fármacos o compuestos que modulan la actividad de 32144, así como para tratar trastornos caracterizados por una producción insuficiente o excesiva de proteína 32144 o una producción de formas de la proteína 32144 que han disminuido, son aberrantes o tienen una actividad no deseada en comparación con la proteína 32144 de tipo salvaje (por ejemplo, trastornos de proliferación y/o diferenciación celular, trastornos neurales, trastornos metabólicos o del dolor o trastornos del sueño). Además, los anticuerpos anti-32144 de la invención pueden usarse para detectar y aislar proteínas 32144, regular la biodisponibilidad de las proteínas 32144 y modular la actividad de 32144.

Se proporciona un método para evaluar en un compuesto la capacidad de interaccionar, por ejemplo, unirse a un polipéptido 32144 sujeto. El método incluye: poner en contacto el compuesto con el polipéptido 32144 objeto; y evaluar la capacidad del compuesto de interaccionar con, por ejemplo, de unirse o formar un complejo con el polipéptido 32144 objeto. Este método puede llevarse a cabo in vitro, por ejemplo en un sistema libre de células, o in vivo, por ejemplo, en un ensayo de trampa de interacción doble híbrido. Este método puede usarse para identificar moléculas que se dan de forma natural que interaccionan con el polipéptido 32144 objeto. También puede usarse para encontrar inhibidores naturales o sintéticos del polipéptido 32144 objeto. Se tratan métodos de exploración con más detalle posteriormente.

Ensayos de Exploración

La invención proporciona métodos (también denominados en este documento como "ensayos de exploración") para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos o de ensayo (por ejemplo proteínas, péptidos, peptidomiméticos, peptoides, moléculas pequeñas u otros fármacos) que se unen a proteínas 32144, tienen un efecto estimulador o inhibidor, por ejemplo, sobre la expresión de 32144 o la actividad de 32144, o tienen un efecto estimulador o inhibidor, por ejemplo, sobre la expresión o actividad de un sustrato de 32144. Los compuestos identificados de esta manera pueden usarse para modular la actividad de productos génicos diana (por ejemplo, genes de 32144) en un protocolo terapéutico, para elaborar la función biológica del producto génico diana, o para identificar compuestos que alteran las interacciones normales con el gen diana.

En una realización, la invención proporciona ensayos para explorar compuestos candidatos o de ensayo que son sustratos de una proteína o polipéptido 32144 o una parte biológicamente activa del mismo. En otra realización, la invención proporciona ensayos para explorar compuestos candidatos o de ensayo que se unen o modulan una actividad de una proteína o polipéptido 32144 o una parte biológicamente activa del mismo.

En una realización, una actividad de una proteína 32144 puede ensayarse incubando un sustrato de amida de ácidos grasos marcada con ^{14}C con extractos de membrana de células que expresan una proteína 32144. Después de la incubación, los productos de reacción pueden separarse por cromatografía en capa fina, eluirse del sílice con fluido de centelleo, y contarse en un contador de centelleo. Se han descrito ensayos como este, por ejemplo, en Cravatt et al. (1996), supra, y Giang y Cravatt (1997), supra.

Los compuestos de ensayo pueden obtenerse usando cualquiera de las numerosas estrategias en los métodos de la biblioteca combinatoria conocidos en la técnica, que incluyen: bibliotecas biológicas; bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moléculas que tienen las funcionalidades de péptidos, pero con un nuevo esqueleto no peptídico que son resistentes a la degradación enzimática pero que sin embargo permanecen bioactivas; véase, por ejemplo, Zuckermann, R. N. et al. (1994) J. Med Chem. 37:2678-85); bibliotecas en fase de disolución o en fase sólida paralelas dirigibles espacialmente; métodos de bibliotecas sintéticas que requieren desconvolución; el método de biblioteca "una perla-un compuesto"; y los métodos de bibliotecas sintéticas que usan la selección de cromatografía de afinidad. Las estrategias de biblioteca biológica y biblioteca de peptoides se limitan a bibliotecas de péptidos, mientras que las otras cuatro estrategias son aplicables a bibliotecas de compuestos peptídicos, oligómeros no peptídicos o compuestos de molécula pequeña (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).

Pueden encontrarse ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares en la técnica, por ejemplo, en: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed Engl. 33:2061; y Gallop et al. (1994) J Med Chem. 37:1233.

Pueden presentarse bibliotecas de compuestos en disolución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421) o en perlas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (Ladner, Patente de EE.UU. núm. 5.223.409), esporas (Ladner Patente de EE.UU. núm. 5.223.409), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) o en fagos (Scott y Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner supra).

En una realización, un ensayo es un ensayo basado en células en el que una célula que expresa una proteína 32144 o una parte biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de ensayo y se determina la capacidad del compuesto de ensayo de modular la actividad de 32144. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo de modular la actividad de 32144 puede realizarse controlando, por ejemplo, hidrólisis de hidrolasa de amida de ácidos grasos. La célula, por ejemplo, puede ser de mamífero, por ejemplo, humana.

También puede evaluarse la capacidad del compuesto de ensayo de modular la unión de 32144 a un compuesto, por ejemplo, un sustrato de 32144, o de unirse a 32144. Esto puede conseguirse, por ejemplo, por acoplamiento del compuesto, por ejemplo el sustrato, con una marca radioisotópica o enzimática de tal forma que la unión del compuesto, por ejemplo, el sustrato a 32144 pueda determinarse por medio de la detección del compuesto marcado, por ejemplo, el sustrato en un complejo. De forma alternativa, 32144 podría acoplarse con un resultado radioisotópico o enzimático para controlar la capacidad de un compuesto de ensayo de modular la unión de 32144 a un sustrato de 32144 en un complejo. Por ejemplo, los compuestos (por ejemplo, sustratos de 32144) pueden marcarse con ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{3}H, directamente o indirectamente, y el radioisótopo puede detectarse por recuento directo de radioemisión o por recuento de centelleo. De forma alternativa, los compuestos pueden marcarse enzimáticamente, por ejemplo, con peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, o luciferasa, y la marca enzimática puede detectarse determinando la conversión de un sustrato apropiado en producto.

Puede evaluarse la capacidad de un compuesto (por ejemplo, un sustrato de 32144) de interaccionar con 32144 con o sin el marcaje de cualquiera de los agentes que interaccionan. Por ejemplo, puede usarse un microfisiómetro para detectar la interacción de un compuesto con 32144 sin el marcaje del compuesto o del 32144. McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257:1906-1912. Como se usa en este documento, un "microfisiómetro" (por ejemplo, Cytosensor) es un instrumento analítico que mide la velocidad a la que una célula acidifica su entorno usando un sensor potenciométrico dirigible por luz (LAPS). Los cambios en esta velocidad de acidificación pueden usarse como indicador de la interacción entre un compuesto y 32144.

En aún otra realización, se proporciona un ensayo libre de células en el que una proteína 32144 o una parte biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de ensayo y se evalúa la capacidad del compuesto de ensayo de unirse a la proteína 32144 o a la parte biológicamente activa de la misma. Las partes biológicamente activas preferidas de las proteínas 32144 a usar en los ensayos de la presente invención incluyen fragmentos que participan en interacciones con moléculas que no son 32144, por ejemplo, fragmentos con altas puntuaciones de probabilidad de localización en superficie.

En los ensayos sin células de la invención pueden usarse formas solubles y/o unidas a la membrana de proteínas aisladas (por ejemplo, proteínas 32144 o partes biológicamente activas de las mismas). Cuando se usan formas unidas en la membrana de la proteína, puede ser deseable utilizar un agente de solubilización. Los ejemplos de estos agentes de solubilización incluyen detergentes no iónicos tales como n-octilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, isotridecipoli(etilenglicoléter)_{n}, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano sulfonato (CHAPS), 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propano sulfonato (CHAPSO) o N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propano sulfonato.

Los ensayos libres de células implican preparar una mezcla de reacción de la proteína del gen diana y el compuesto de ensayo en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los dos componentes interaccionen y se unan, formando de esta manera un complejo que puede retirarse y/o detectarse.

También puede detectarse la interacción entre dos moléculas, por ejemplo, usando transferencia de energía de fluorescencia (FET) (véase, por ejemplo, Lakowicz et al., Patente de EE.UU. núm. 5.631.169; Stavrianopoulos, et al., Patente de EE.UU. núm. 4.868.103). Se selecciona una marca fluoróforo en la primera molécula "donadora" de tal forma que su energía fluorescente emitida se absorba por una marca fluorescente en una segunda molécula "aceptora", que a su vez puede emitir fluorescencia debido a la energía absorbida. De forma alternativa, la molécula de proteína "donadora" simplemente puede utilizar la energía fluorescente natural de los residuos de triptófano. Se eligen marcas que emiten diferentes longitudes de onda de luz, de tal forma que la marca de la molécula "aceptora" puede diferenciarse de la de la "donadora". Como la eficacia de transferencia de energía entre las marcas está relacionada con la distancia que separa las moléculas, puede evaluarse la relación espacial entre las moléculas. En una situación en la que se produce la unión entre las moléculas, la emisión fluorescente del resultado de la molécula "aceptora" en el ensayo debe ser máxima. Convenientemente puede medirse un acontecimiento de unión FET por medios de detección fluorométrica convencionales bien conocidos en la técnica (por ejemplo, usando un fluorímetro).

En otra realización, la determinación de la capacidad de la proteína 32144 de unirse a una molécula diana puede lograrse usando el Análisis de Interacción Biomolecular (BIA) a tiempo real (véase, por ejemplo, Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). La "resonancia de plasmón superficial" o "BIA" detecta interacciones bioespecíficas a tiempo real, sin marcar ninguna de las moléculas que interaccionan (por ejemplo, BIAcore). Los cambios en la masa en la superficie de unión (que indica un acontecimiento de unión) dan por resultado alteraciones del resultado de refracción de luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (SPR)), dando como resultado una señal detectable que puede usarse como indicación de reacciones a tiempo real entre moléculas biológicas.

En una realización, el producto del gen diana o la sustancia de ensayo se ancla en una fase sólida. Al final de la reacción pueden detectarse los complejos de producto génico diana/compuesto ensayo anclados en la fase sólida. Preferiblemente, el producto génico diana puede anclarse en una superficie sólida y el compuesto de ensayo (que no se ancla) puede marcarse, directamente o indirectamente, con marcas detectables descritas en este documento.

Puede ser deseable inmovilizar 32144, o un anticuerpo anti-32144 o su molécula diana para facilitar la separación entre las formas complejadas y las formas no complejadas de una o las dos proteínas, así como para acomodar la automatización del ensayo. La unión de un compuesto de ensayo a una proteína 32144, o la interacción de una proteína 32144 con una molécula diana en presencia y ausencia de un compuesto candidato, pueden lograrse en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los ejemplos de estos recipientes incluyen placas de microtitrado, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. En una realización, puede proporcionarse una proteína de fusión que añade un dominio que permite a una o a las dos proteínas unirse a una matriz. Por ejemplo, pueden adsorberse proteínas de fusión glutatión-S-transferasa/32144 o proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa/diana en perlas de glutatión sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitrado modificadas con glutatión, que se combinan entonces con el compuesto de ensayo o el compuesto de ensayo y la proteína diana no adsorbida o proteína 32144, y la mezcla puede incubarse en condiciones que conducen a la formación de complejos (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sales y pH). Después de la incubación, se lavan las perlas o los pocillos de la placa de microtitrado para retirar cualquier componente que no se haya unido, se inmoviliza la matriz en el caso de las perlas y se determinan los complejos directa o indirectamente, por ejemplo, como se descrito anteriormente. De forma alternativa, los complejos pueden
disociarse de la matriz y puede determinarse el nivel de unión o actividad de 32144 usando técnicas convencionales.

Otras técnicas para inmovilizar una proteína 32144 o una molécula diana en matrices incluyen el uso de conjugación de biotina y estreptavidina. Puede prepararse moléculas diana o proteínas 32144 biotiniladas a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando técnicas conocidas en este campo (por ejemplo, un equipo de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL), e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical).

Para realizar el ensayo, el componente no inmovilizado se añade a la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Después de completarse la reacción, se retiran los componentes que no han reaccionado (por ejemplo, por lavado) en condiciones tales que los complejos formados permanezcan inmovilizados en la superficie sólida. La detección de complejos anclados en la superficie sólida puede lograrse de varias maneras. Donde el componente no inmovilizado previamente está premarcado, la detección de la marca inmovilizada en la superficie indica que se formaron complejos. Donde el componente no inmovilizado previamente no está premarcado, puede usarse una marca indirecta para detectar complejos anclados en la superficie; por ejemplo usando un anticuerpo marcado específico para el componente inmovilizado (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente o marcarse indirectamente, por ejemplo, con un anticuerpo anti-Ig marcado).

En una realización, este ensayo se lleva a cabo utilizando anticuerpos reactivos con la proteína 32144 o moléculas diana que no interfieren con la unión de la proteína 32144 a su molécula diana. Estos anticuerpos pueden derivarse en los pocillos de la placa y la diana no unida o la proteína 32144 puede quedar atrapada en los pocillos por conjugación con el anticuerpo. Los métodos para detectar estos complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GST, incluyen inmunodetección de complejos usando anticuerpos reactivos con la proteína 32144 o molécula diana, así como ensayos ligados a enzimas que se basan en la detección de una actividad enzimática asociada con la proteína 32144 o molécula diana.

De forma alternativa, los ensayos libres de células se pueden realizar en una fase líquida. En dicho ensayo, los productos de reacción se separan de los componentes que no han reaccionado, por cualquiera de varias técnicas convencionales, incluyendo pero sin limitación: centrifugación diferencial (véase por ejemplo, Rivas, G., y Minton, A. P., (1993) Trends Biochem Sci 18:284-7); cromatografía (cromatografía por filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico); electroforesis (véase por ejemplo, Ausubel, F. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: Nueva York); e inmunoprecipitación (véase por ejemplo, Ausubel, F. et al., eds. (1999) Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley: Nueva York). Estas resinas y técnicas cromatográficas se conocen por los expertos en la técnica (véase por ejemplo, Heegaard, N. H., (1998) J Mol Recognit 11:141-8; Hage, D. S., y Tweed, S. A. (1997) J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 699:499-525). Además, también puede utilizarse convenientemente transferencia de energía de fluorescencia, como se describe en este documento, para detectar la unión sin purificación adicional del complejo de la solución.

En una realización preferida, el ensayo incluye poner en contacto la proteína 32144 o una parte biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a 32144 para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo de interaccionar con una proteína 32144, donde la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo de interaccionar con una proteína 32144 incluye la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo de unirse preferentemente a 32144 o a una parte biológicamente activa de la misma o modular la actividad de una molécula diana en comparación con el compuesto conocido.

Los productos génicos diana de la invención pueden interaccionar, in vivo, con una o más macromoléculas celulares o extracelulares tales como proteínas. Para los fines de este análisis, dichas macromoléculas celulares y extracelulares se denominan en este documento como "compañeros de unión". Los compuestos que rompen dichas interacciones pueden ser útiles en la regulación de la actividad del producto génico diana. Estos compuestos pueden incluir, aunque no están limitados a, moléculas tales como anticuerpos, péptidos y moléculas pequeñas. Los genes/productos diana preferidos para usar en esta realización son los genes de 32144 identificados en este documento. En una realización alternativa, la invención proporciona métodos para determinar la capacidad del compuesto de ensayo de modular la actividad de una proteína 32144 por medio de la modulación de la actividad de un efector aguas abajo de una molécula diana de 32144. Por ejemplo, puede determinarse la actividad de la molécula efectora en una diana apropiada o puede determinarse la unión del efector a una diana apropiada, como se ha descrito previamente.

Para identificar compuestos que interfieren con la interacción entre el producto génico diana y su(s) compañero(s)
de unión celular o extracelular, se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto génico diana y el compañero de unión, en unas condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los dos productos formen un complejo. Para ensayar un agente inhibidor, la mezcla de reacción se proporciona en presencia y ausencia del compuesto de ensayo. El compuesto de ensayo puede incluirse inicialmente en la mezcla de reacción o puede añadirse en un tiempo posterior a la adición del gen diana y su compañero de unión celular o extracelular. Las mezclas de reacción de control se incuban sin el compuesto de ensayo o con un placebo. Después se detecta la formación de cualquier complejo entre el producto génico diana y el compañero de unión celular o extracelular. La formación de un complejo en la reacción de control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de ensayo, indica que el compuesto interfiere con la interacción del producto génico diana y el compañero de unión interactivo. Además, la formación de complejos dentro de mezclas de reacción que contienen el compuesto de ensayo y el producto génico diana normal también puede compararse con la formación de complejos dentro de mezclas de reacción que contienen el compuesto de ensayo y el producto génico diana mutante. Esta comparación puede ser importante en los casos en los que deseable identificar compuestos que alteran interacciones de productos génicos diana mutantes pero no normales.

Estos ensayos pueden llevarse a cabo en un formato heterogéneo u homogéneo. Los ensayos heterogéneos implican el anclaje, o bien del producto génico diana o del compañero de unión en una fase sólida y la detección de complejos anclados en la fase sólida al final de la reacción. En los ensayos homogéneos, la reacción entera se lleva a cabo en una fase líquida. En cualquier estrategia, el orden de adición de los reactivos puede variarse para obtener diferente información sobre los compuestos que se están ensayando. Por ejemplo, pueden identificarse compuestos de ensayo que interfieren con la interacción entre los productos génicos diana y los compañeros de unión, por ejemplo, por competición, realizando la reacción en presencia de la sustancia de ensayo. De forma alternativa, pueden ensayarse compuestos de ensayo que rompen los complejos preformados, por ejemplo, compuestos con mayores constantes de unión que desplazan uno de los componentes del complejo, añadiendo el compuesto de ensayo a la mezcla de reacción después de que se hayan formado los complejos. Los diversos formatos se describen brevemente más adelante.

En un sistema de ensayo heterogéneo, o bien el producto génico diana o el compañero de unión celular o extracelular interactivo, se ancla en una superficie sólida (por ejemplo, una placa de microtitrado), mientras que la especie no anclada se marca, o bien directa o indirectamente. Las especies ancladas pueden inmovilizarse por uniones covalentes o no covalentes. De forma alternativa, puede usarse un anticuerpo inmovilizado específico para la especie a anclar para anclar la especie a la superficie sólida.

Para realizar el ensayo, el compañero de la especie inmovilizada se expone a la superficie recubierta con o sin el compuesto de ensayo. Después de completarse la reacción, se retiran los componentes que no han reaccionado (por ejemplo, por lavado) y cualquier complejo formado permanecerá inmovilizado en la superficie sólida. Donde la especie no inmovilizada está pre-marcada, la detección de la marca inmovilizada en la superficie indica que se formaron complejos. Donde la especie no inmovilizada no está pre-marcada, puede usarse una marca indirecta para detectar complejos anclados en la superficie; por ejemplo, usando un anticuerpo marcado específico para la especie inicialmente no inmovilizada (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente o marcarse indirectamente con, por ejemplo, un anticuerpo anti-Ig marcado). Dependiendo del orden de adición de los componentes de reacción, pueden detectarse compuestos de ensayo que inhiben la formación de complejos o que rompen los complejos preformados.

De forma alternativa, la reacción puede llevarse a cabo en una fase líquida en presencia o ausencia del compuesto de ensayo, los productos de reacción pueden separarse de los componentes que no han reaccionado y los complejos pueden detectarse; por ejemplo, usando un anticuerpo inmovilizado específico para uno de los componentes de unión para anclar cualquier complejo formado en disolución, y un anticuerpo marcado específico para el otro compañero para detectar complejos anclados. De nuevo, dependiendo del orden de adición de los reactivos a la fase líquida, pueden identificarse compuestos de ensayo que inhiben complejos o que rompen complejos preformados.

En una realización alternativa de la invención, puede usarse un ensayo homogéneo. Por ejemplo, se prepara un complejo preformado del producto génico diana y el producto del compañero de unión celular o extracelular interactivo, en el que o bien los productos génicos diana o sus compañeros de unión están marcados, aunque la señal generada por la marca se inactiva debido a la formación del complejo (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. núm. 4.109.496 que utiliza esta estrategia para inmunoensayos). La adición de una sustancia de ensayo que compite y desplaza una de las especies del complejo preformado dará como resultado la generación de una señal por encima del nivel de fondo. De esta manera, pueden identificarse sustancias de ensayo que alteran la interacción de producto génico diana-compañero de unión.

En aún otro aspecto, las proteínas 32144 pueden usarse como "proteínas de cebo" en un ensayo doble híbrido o en un ensayo triple híbrido (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. núm. 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054. Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; y Brent documento WO 94/10300), para identificar otras proteínas que se unen o interaccionan con 32144 ("proteínas de unión a 32144" o "32144-bp") y están implicadas en la actividad de 32144. Dichas 32144-bp pueden ser activadoras o inhibidoras de señales por las proteínas 32144 o dianas de 32144 tales como, por ejemplo, elementos aguas abajo de una ruta de señalización mediada por 32144.

El sistema doble híbrido se basa en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que consisten en dominios de unión y activación de ADN separables. En resumen, el ensayo utiliza dos construcciones de ADN diferentes. En una construcción, el gen que codifica una proteína 32144 se fusiona a un gen que codifica el dominio de unión al ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En la otra construcción, una secuencia de ADN de una biblioteca de secuencias de ADN, que codifica una proteína no identificada ("presa" o "muestra") se fusiona a un gen que codifica el dominio de activación del factor de transcripción conocido. (De forma alternativa: la proteína 32144 puede fusionarse al dominio activador). Si las proteínas "cebo" y "presa" pueden interaccionar, in vivo, formando un complejo dependiente de 32144, los dominios de unión y activación de ADN del factor de transcripción se acercan mucho. Esta proximidad permite la transcripción de un gen indicador (por ejemplo, IacZ) que se une de forma operable a un sitio regulador de la transcripción que responde al factor de transcripción. La expresión del gen indicador puede detectarse y pueden aislarse colonias de células que contienen el factor de transcripción funcional y usarse para obtener el gen clonado que codifica la proteína que interacciona con la proteína 32144.

En otra realización, se identifican moduladores de la expresión de 32144. Por ejemplo, una mezcla de células o libre de células se pone en contacto con un compuesto candidato y se evalúa la expresión del ARNm o la proteína 32144 con respecto a nivel de expresión del ARNm o proteína 32144 en ausencia del compuesto candidato. Cuando la expresión del ARNm o proteína 32144 es mayor en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador de la expresión del ARNm o la proteína de 32144. De forma alternativa, cuando la expresión del ARNm o la proteína 32144 es menor (menor de una forma estadísticamente significativa) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, se identifica el compuesto candidato como un inhibidor de la expresión del ARNm o la proteína 32144. El nivel de expresión del ARNm o la proteína 32144 puede determinarse por métodos descritos en este documento para detectar el ARNm o la proteína 32144.

En otro aspecto, la invención pertenece a una combinación de dos o más de los ensayos descritos en este documento. Por ejemplo, un agente de modulación puede identificarse usando un ensayo basado en células o libre de células, y la capacidad del agente para modular la actividad de una proteína 32144 puede confirmarse in vivo, por ejemplo, en un animal tal como un modelo animal para un trastorno de proliferación y/o diferenciación celular, un trastorno neural, un trastorno metabólico o del dolor o un trastorno del sueño.

Un agente identificado como se describe en este documento (por ejemplo, un agente modulador de 32144, una molécula de ácido nucleico de 32144 antisentido, un anticuerpo específico para 32144 o un compañero de unión de 32144) puede usarse en un modelo animal apropiado para determinar la eficacia, toxicidad, efectos secundarios o mecanismos de acción, de tratamiento con dicho agente. Además, pueden usarse agentes identificados por los ensayos de exploración descritos anteriormente para los tratamientos como se describe en este documento.

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Medicina predictiva

La presente invención también pertenece al campo de la medicina predictiva en la que se usan ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico y ensayos clínicos de monitorización con fines de pronóstico (predictivos) para tratar de esta manera a un individuo.

En general, la invención proporciona un método para determinar si un sujeto tiene riesgo de padecer un trastorno relacionado con una lesión o la expresión defectuosa de un gen que codifica 32144.

Dichos trastornos incluyen, por ejemplo, un trastorno asociado con la expresión defectuosa del gen de 32144, tal como un trastorno en la proliferación y/o diferenciación celular, por ejemplo, cáncer de pulmón, colon u ovario.

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El método incluye uno o más de lo siguiente:

detectar en un tejido del sujeto, la presencia o ausencia de una mutación que afecta la expresión del gen de 32144, o detectar la presencia o ausencia de una mutación en una región que controla la expresión del gen, por ejemplo, una mutación en la región de control 5';

detectar, en un tejido del sujeto, la presencia o ausencia de una mutación que altera la estructura del gen de 32144;

detectar, en un tejido del sujeto, la expresión defectuosa del gen de 32144, a nivel de ARNm, por ejemplo, detectando un nivel de tipo no silvestre de un ARNm;

detectar, en un tejido del sujeto, la expresión defectuosa del gen, a nivel de la proteína, por ejemplo, detectando el nivel de tipo no silvestre de un polipéptido 32144.

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En realizaciones preferidas, el método incluye: establecer la existencia de al menos una de una supresión de uno o más nucleótidos del gen de 32144; una inserción de uno o más nucleótidos en el gen, una mutación puntual, por ejemplo, una sustitución de uno o más nucleótidos del gen, una reordenación cromosómica general del gen, por ejemplo, una translocación, inversión o supresión.

Por ejemplo, la detección de la lesión genética puede incluir: (i) proporcionar una sonda/cebador que incluye un oligonucleótido que contiene una región de una secuencia de nucleótidos que hibrida con una secuencia en el mismo sentido o antisentido de la SEQ ID NO:1, o mutantes que se dan de forma natural de la misma o secuencias que flanquean a 5' o 3' asociadas de forma natural con el gen de 32144; (ii) exponer la sonda/cebador al ácido nucleico del tejido; y detectar, por hibridación, por ejemplo, hibridación in situ, la sonda/cebador al ácido nucleico la presencia o ausencia de la lesión genética.

En realizaciones preferidas que detectan la expresión defectuosa que incluye establecer la existencia de al menos una de una alteración al nivel de la transcripción de un ARN mensajero del gen de 32144; la presencia de un patrón de corte y empalme de tipo no silvestre de un transcrito de ARN mensajero del gen; o un nivel de tipo no silvestre de 32144.

Los métodos de la invención pueden usarse antes del nacimiento o para determinar si la descendencia de un sujeto tendrá riesgo de un trastorno.

En realizaciones preferidas el método incluye determinar la estructura de un gen de 32144, siendo una estructura anómala indicativa del riesgo de padecer el trastorno.

En realizaciones preferidas el método incluye poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo de la proteína o ácido nucleico de 32144, que hibrida de forma específica con el gen. Estas y otras realizaciones se tratan más adelante.

Ensayos de Diagnóstico y Pronóstico

Los ensayos de diagnóstico y pronóstico de la invención incluyen un método para evaluar el nivel de expresión de moléculas de 32144 y para identificar variaciones y mutaciones en la secuencia de las moléculas de 32144.

Control y Perfil de Expresión. La presencia, nivel o ausencia de proteína o ácido nucleico de 32144 en una muestra biológica puede evaluarse obteniendo una muestra biológica de un sujeto de ensayo y poniendo en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar la proteína o el ácido nucleico de 32144 (por ejemplo, ARNm, ADN genómico) que codifica la proteína 32144, de tal manera que se detecte la presencia de la proteína o ácido nucleico de 32144 en la muestra biológica. El término "muestra biológica" incluye tejidos, células y fluidos biológicos aislados a partir de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Una muestra biológica preferida es suero. El nivel de expresión del gen de 32144 puede medirse de varias formas, incluyendo, aunque no limitándose a: medición del ARNm codificado por los genes de 32144; medición de la cantidad de proteína codificada por los genes de 32144; o medición de la actividad de la proteína codificada por los genes de 32144.

El nivel de ARNm correspondiente al gen de 32144 en una célula puede determinarse por formatos tanto in situ como in vitro.

El ARNm aislado puede usarse en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, aunque no están limitados a, análisis de Southern o Northern, análisis de la reacción de la cadena polimerasa y matrices de sondas. Un método de diagnóstico preferido para la detección de los niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que puede hibridar con el ARNm codificado por el gen que se está detectando. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico de 32144 de longitud completa, tal como el ácido nucleico de la SEQ ID NO:1, o una parte del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar de forma específica en condiciones rigurosas con el ARNm o ADN genómico de 32144. La sonda puede disponerse en una dirección de una matriz, por ejemplo, una matriz descrita más adelante. En este documento se describen otras sondas adecuadas para usar en los ensayos de diagnóstico.

En un formato, se inmoviliza ARNm (o ADNc) en una superficie y se pone en contacto con las sondas, por ejemplo procesando el ARNm aislado en un gel de agarosa y transfiriendo el ARNm del gel a una membrana, tal como de nitrocelulosa. En un formato alternativo, las sondas se inmovilizan en una superficie y el ARNm (o ADNc) se pone en contacto con las sondas, por ejemplo, en una matriz de chips de genes bidimensional descrita más adelante. Un experto en la técnica puede adaptar métodos de detección de ARNm conocidos para usar en la detección del nivel de ARNm codificado por los genes de 32144.

El nivel de ARNm en una muestra que se codifica por uno de 32144, puede evaluarse por amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, por rtPCR (Mullis (1987) Patente de EE.UU. núm. 4.683.202), reacción de la cadena ligasa (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), replicación de secuencia autosostenida (Guatelli et al., (1990) Proc. Natl. Acad Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta Replicasa (Lizardi et al., (1988) Bio/Technology 6:1197), replicación por círculo rodante (Lizardi et al., Patente de EE.UU. núm. 5.854.033) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido de la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas conocidas en la técnica. Como se usa en este documento, los cebadores de amplificación se definen como un par de moléculas de ácido nucleico que pueden templar regiones 5' o 3' de un gen (hebras más y menos, respectivamente o vice-versa) y contener una región corta entre ellos. En general, los cebadores de amplificación tienen una longitud de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos y flanquean una región con una longitud de aproximadamente 50 a 200 nucleótidos. En condiciones apropiadas y con reactivos apropiados, dichos cebadores permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos flanqueada por los cebadores.

Para los métodos in situ, puede prepararse/procesarse una muestra celular o de tejido e inmovilizarse en un soporte, típicamente un portaobjetos de vidrio, y después poner en contacto con una sonda que puede hibridar con el ARNm que codifica el gen de 32144 que se está analizando.

En otra realización, los métodos además ponen en contacto una muestra de control con un compuesto o agente capaz de detectar ARNm o ADN genómico de 32144 y comparan la presencia del ARNm o ADN genómico de 32144 en la muestra de control con la presencia de ARNm o ADN genómico de 32144 en la muestra de ensayo. En aún otra realización, se usa el análisis en serie de expresión génica, como se describe en la Patente de EE.UU. núm. 5.695.937, para detectar niveles de transcripción de 32144.

Pueden usarse diversos métodos para determinar el nivel de proteína codificada por 32144. En general, estos métodos incluyen poner en contacto un agente que se une de forma selectiva a la proteína, tal como un anticuerpo con una muestra, para evaluar el nivel de proteína en la muestra. En una realización preferida, el anticuerpo lleva una marca detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferiblemente, monoclonales. Puede usarse un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo Fab o F(ab')_{2}). El término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, pretende incluir el marcaje directo de la sonda o anticuerpo por acoplamiento (es decir, unión física) de una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como el marcaje indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con una sustancia detectable. En este documento se proporcionan ejemplos de sustancias detectables.

Los métodos de detección pueden usarse para detectar la proteína 32144 en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Las técnicas in vitro para la detección de la proteína 32144 incluyen ensayos de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), immunoprecipitaciones, immunofluorescencia, inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA) y análisis de transferencia de Western. Las técnicas in vivo para la detección de la proteína 32144 incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo anti-32144 marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y localización en un sujeto puede detectarse por técnicas convencionales de formación de imágenes. En otra realización, la muestra se marca, por ejemplo, se biotinila y después se pone en contacto con el anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-32144 colocado en una matriz de anticuerpo (como se describe más adelante). La muestra puede detectarse, por ejemplo, con avidina acoplada a una marca fluorescente.

En otra realización, los métodos incluyen además poner en contacto la muestra de control con un compuesto o agente capaz de detectar la proteína 32144, y comparar la presencia de la proteína 32144 en la muestra de control con la presencia de la proteína 32144 en la muestra de ensayo.

También se describen equipos para detectar la presencia de 32144 en una muestra biológica. Por ejemplo, el equipo puede incluir un compuesto o agente capaz de detectar una proteína o ARNm de 32144 en una muestra biológica; y un patrón. El compuesto o agente puede estar empaquetado en un recipiente adecuado. El equipo puede comprender además instrucciones para usar el equipo para detectar la proteína o ácido nucleico de 32144.

Para equipos basados en un anticuerpo, el equipo puede incluir: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo, unido a un soporte sólido) que se une a un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención; y, opcionalmente (2) un segundo anticuerpo diferente que se une o bien al polipéptido o al primer anticuerpo y se conjuga con un agente detectable.

Para equipos basados en oligonucleótidos, el equipo puede incluir: (1) un oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido marcado de forma detectable que hibrida con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención o (2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico que corresponde a un marcador de la invención. El equipo también puede incluir un agente tamponante, un conservante o un agente estabilizador de proteínas. El equipo también puede incluir componentes necesarios para detectar el agente detectable (por ejemplo, una enzima o un sustrato). El equipo también puede contener una muestra de control o una serie de muestras de control que pueden ensayarse y compararse con la muestra de ensayo contenida. Cada componente del equipo puede encerrarse dentro de un recipiente individual y todos los diversos recipientes pueden estar dentro de un solo envase, junto con instrucciones para interpretar los resultados de los ensayos realizados usando el equipo.

Los métodos diagnósticos descritos en este documento pueden identificar sujetos que tienen, o un riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad errónea, aberrante o no deseada de 32144, por ejemplo cáncer de pulmón, colon, mama o de ovario. Tal y como se utiliza en este documento, el término "no deseado" incluye un fenómeno no deseado implicado en una respuesta biológica tal como un trastorno neural o la proliferación celular no regulada.

En una realización, se identifica una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante o indeseada de 32144. Se obtiene una muestra de ensayo de un sujeto y se evalúa la proteína o ácido nucleico de 32144 (por ejemplo, ARNm o ADN genómico), donde el nivel, por ejemplo, la presencia o ausencia de proteína o ácido nucleico de 32144 es diagnóstico de que un sujeto tiene o tiene un riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante o indeseada de 32144. Como se usa en este documento, una "muestra de ensayo" se refiere a una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto de interés, incluyendo un fluido biológico (por ejemplo, suero), una muestra celular o un tejido.

Los ensayos de pronósticos descritos en este documento pueden utilizarse para determinar si a un sujeto se le puede administrar un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, u otro candidato de fármaco) para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante o indeseada de 32144. Por ejemplo, tales métodos se pueden utilizar para determinar si un sujeto puede ser tratado de forma eficaz con un agente para un trastorno neuronal, un trastorno del sueño, un trastorno metabólico o de dolor, o un trastorno de la proliferación y/o diferenciación celular.

También se describe un medio informático que tiene una pluralidad de registros de datos codificados de forma digital. Cada registro de datos incluye un valor que representa el nivel de expresión de 32144 en una muestra, y un descriptor de la muestra. El descriptor de la muestra puede ser un identificador de la muestra, un sujeto a partir del cual se derivó la muestra (por ejemplo, un paciente), un diagnóstico o un tratamiento (por ejemplo, un tratamiento preferido). En una realización preferida, el registro de datos incluye además valores que representan el nivel de expresión de genes distintos de 32144 (por ejemplo, otros genes asociados con un trastorno de 32144, u otros genes en una matriz). El registro de datos puede estructurarse como una tabla, por ejemplo una tabla que forma parte de una base de datos tal como una base de datos relacional (por ejemplo, una base de datos SQL de los entornos de bases de datos Oracle o Sybase).

También se caracteriza un método para evaluar una muestra. El método incluye proporcionar una muestra, por ejemplo, a partir del sujeto y determinar un perfil de expresión génica de la muestra, donde el perfil incluye un valor que representa el nivel de expresión de 32144. El método puede incluir además la comparación del valor o el perfil (es decir, múltiples valores) con un valor de referencia o perfil de referencia. El perfil de expresión génica de la muestra puede obtenerse por cualquiera de los métodos descritos en este documento (por ejemplo, proporcionando un ácido nucleico a partir de la muestra y poniendo en contacto el ácido nucleico con una matriz). El método puede usarse para diagnosticar un trastorno de proliferación y/o diferenciación celular en un sujeto donde un aumento en la expresión de 32144 es una indicación de que el sujeto tiene o es propenso a tener un trastorno de la proliferación y/o diferenciación celular. El método puede usarse para monitorizar un tratamiento para el trastorno de la proliferación y/o diferenciación celular en un sujeto. Por ejemplo, el perfil de expresión génica puede determinarse para muestra de un sujeto sometido a tratamiento. El perfil puede compararse con un perfil de referencia o con un perfil obtenido a partir del sujeto antes del tratamiento o antes de la aparición del trastorno (véase, por ejemplo, Golub et al. (1999) Science 286:531).

En aún otro aspecto, la invención caracteriza un método para evaluar un compuesto de ensayo (véase también, "Ensayos de Exploración", anterior). El método incluye proporcionar una célula y un compuesto de ensayo; poner en contacto el compuesto de ensayo con la célula; obtener un perfil de expresión del sujeto para la célula con la que ha entrado en contacto; y comparar el perfil de expresión del sujeto con uno o más perfiles de referencia. Los perfiles incluyen un valor que representa el nivel de expresión de 32144. En una realización preferida, el perfil de expresión del sujeto se compara con un perfil diana, por ejemplo, un perfil para una célula normal o para el estado deseado de una célula. El compuesto de ensayo se evalúa favorablemente si el perfil de expresión del sujeto es más similar al perfil diana que un perfil de expresión obtenido a partir de una célula con la que no ha contactado.

En otro aspecto, la invención caracteriza un método para evaluar a un sujeto. El método incluye: a) obtener una muestra a partir de un sujeto, por ejemplo, a partir de un cuidador sanitario, por ejemplo, un cuidador sanitario que obtiene la muestra del sujeto; b) determinar el perfil de expresión de un sujeto para la muestra. Opcionalmente, el método incluye además una o las dos etapas de: c) comparar el perfil de expresión del sujeto con uno o más perfiles de expresión de referencia; y d) seleccionar el perfil de referencia más similar al perfil de referencia del sujeto. El perfil de expresión del sujeto y los perfiles de referencia incluyen un valor que representa el nivel de expresión de 32144. Puede usarse una diversidad de medidas estadísticas rutinarias para comparar dos perfiles de referencia. Una medida posible es la longitud del vector de distancia que es la diferencia entre los dos perfiles. Cada uno de los perfiles del sujeto y de referencia se representa como un vector multidimensional, donde cada dimensión es un valor en el perfil.

El método puede incluir además la transmisión de un resultado a un cuidador sanitario. El resultado puede ser el perfil de expresión del sujeto, un resultado de una comparación del perfil de expresión del sujeto con otro perfil, un perfil de referencia más similar o un descriptor de cualquiera de los mencionados anteriormente. El resultado puede transmitirse a través de una red informática, por ejemplo, el resultado puede estar en forma de una transmisión informática, por ejemplo, una señal de datos informáticos incluidos en una onda portadora.

También se describe un medio informático que tiene un código ejecutable para realizar las siguientes etapas: recibir el perfil de expresión de un sujeto; acceder a una base de datos de perfiles de expresión de referencia; y o bien i) seleccionar un perfil de referencia correspondiente que sea el más similar al perfil de expresión del sujeto o ii) determinar al menos una puntuación de comparación para la similitud del perfil de expresión del sujeto con al menos un perfil de referencia. El perfil de expresión del sujeto y los perfiles de expresión de referencia incluyen un valor que representa el nivel de expresión de 32144.

Esta invención se ilustra adicionalmente con los ejemplos siguientes que no se deben interpretar como limitantes.

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Ejemplos Ejemplo 1 Identificación y Caracterización de ADNc de 32144 Humano

La secuencia de ácido nucleico de 32144 humano se enumera como sigue:

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1

La secuencia de 32144 humano (Fig. 1; SEQ ID NO:1), que tiene aproximadamente 2007 nucleótidos de longitud. La secuencia de ácido nucleico incluye un codón de iniciación (ATG) y un codón de terminación (TAG) que está resaltado y subrayado anteriormente. La región entre e incluida en el codón de iniciación y el codón de terminación es una secuencia de codificación que inicia la metionina de aproximadamente 1599 nucleótidos, que incluye el codón de terminación (nucleótidos indicados como "de codificación" de la SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3). La secuencia de codificación codifica una proteína de 532 aminoácidos (SEQ ID NO:2), que se enumera como sigue:

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2

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Ejemplo 2 Distribución tisular del ARNm de 32144

Se determinó la expresión endógena del gen de 32144 humano usando el Sistema de Detección de Secuencia de Perkin-Elmer/ABI 7700 que emplea la tecnología TaqMan. En resumen, la tecnología TaqMan se basa en una RT-PCR convencional con la adición de un tercer oligonucleótido con especificidad de gen (denominado como sonda) que tiene un colorante fluorescente acoplado a su extremo 5' (típicamente 6-FAM) y un colorante de inactivación en el extremo 3' (típicamente TAMRA). Cuando el oligonucleótido marcado con fluorescencia está intacto, se inactiva la señal fluorescente del colorante 5'. Según avanza la PCR, la actividad nucleolítica de 5' a 3' de la Taq polimerasa digiere el cebador marcado, produciendo un nucleótido libre marcado con 6-FAM, que ahora se detecta como señal fluorescente. El ciclo de PCR donde primero se libera y se detecta la fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad inicial del gen de interés en la muestra de ensayo, proporcionando de esta manera una medida cuantitativa de la concentración del patrón inicial. Las muestras pueden controlarse internamente por la adición de una segunda serie de cebadores/sondas específicas para un gen de mantenimiento tal como GAPDH que se ha marcado con un fluoróforo diferente en el extremo 5' (típicamente VIC).

Para determinar el nivel de 32144 en diversos tejidos humanos, se diseñó un conjunto de cebador/sonda. Se preparó ARN total a partir de una serie de tejidos humanos usando el equipo RNeasy de Qiagen. Se preparó una primera hebra de ADNc a partir de 1 \mug de ARN total usando un cebador oligo-dT y una transcriptasa inversa Superscript II (Gibco/BRL). El ADNc obtenido a partir de aproximadamente 50 ng de ARN total se usó para la reacción TaqMan. Los tejidos ensayados incluyen tejidos humanos y varias líneas celulares mostradas en las Tablas 1-5. Se detectó ARNm de 32144 en un número de tejidos, que incluyen el riñón, páncreas, cerebro e hígado (Tabla 1). De manera importante, la expresión de 32144 se sobre-reguló en la mayoría de los tumores de pulmón, colon, mama y ovario ensayados (Tablas 1-3). También se detectó ARNm de 32144 en varias líneas celulares tumorales, tanto hechas crecer in vivo (Tabla 4) como in vitro (Tabla 5), y el crecimiento de las líneas celulares tumorales de mama en agar se correlacionaron con la expresión aumentada de ARNm de 32144 en comparación al crecimiento en plástico (Tabla 5).

La incidencia de la expresión asociada al tumor del ARNm de 32144 en tejidos de pulmón, ovario, mama y colon se evaluó adicionalmente por hibridación in situ (Tabla 6). Se ve una notable expresión de 32144 asociada al tumor en todos los diferentes tipos de tumor ensayados. Este dato, como el dato Taqman, sugiere un papel para el 32144 en el desarrollo tumoral. Además, la expresión del ARNm de 32144 en los carcinomas de mama indolentes invasivos frente a los carcinomas de mama metastásicos se evaluó por hibridación del ARN de las células tumorales a chips de microselección que eran capaces de detectar ácidos nucleicos de 32144 (Tabla 7). Todos los tumores ensayados expresaron ARNm de 32144, mientras 2/5 de los tumores metastásicos y 0/3 de tumores indolentes invasivos presentaron un aumento relativo en la expresión de 32144. Este dato, junto con el dato de hibridación in-situ del tumor de colon, revela una correlación positiva entre la expresión de 32144 y la metástasis tumoral, al menos para los tumores de mama y colon.

TABLA 1

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Como se muestra en la columna "Expresión Relativa" de la Tabla 1, el ARNm de 32144 se expresa en el páncreas, riñón, hígado, corteza cerebral, hipotálamo, amígdalas, ganglios linfáticos, mama, glándulas salivales, piel y ovario. Se observa expresión débil en el corazón y vasos sanguíneos, ganglio de la raíz dorsal, colon, pulmón, bazo, intestino delgado y células sanguíneas. Además, la expresión de 32144 se sobre-regula altamente en los tumores de pulmón, colon y mama, y se sobre-regulan ligeramente en los tumores de ovario. Abreviaturas usadas en la Tabla 1: SMC, célula del músculo liso; HUVEC, células endoteliales de la vena umbilical humana; CHF, fallo congestivo del corazón; diff, diferenciado; COPD, enfermedad pulmonar obstructiva crónica; IBD, enfermedad inflamatoria del intestino; BM-MNC, célula mononuclear de la médula ósea; PBMC, célula pre-médula ósea.

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TABLA 2

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Como se muestra en la columna "Expresión Relativa" de la Tabla 2, la expresión de ARNm de 32144 está sobre-regulada ligeramente en 4/8 de las muestras de tumor de mama ensayadas, en comparación al tejido de mama normal, y dramáticamente sobre-regulada en 3/8 de las muestras de tumor de mama. Asimismo, 7/7 de las muestras de tumor de ovario muestran un aumento en la expresión de 32144 respecto al tejido normal de ovario, mientras 2/7 contenían niveles dramáticamente sobre-regulados de ARNm de 32144. Entre las muestras de tumor pulmonar ensayadas, 8/9 mostraron un aumento en la expresión de 32144 respecto al tejido normal de pulmón, con 4/9 que contenían niveles altamente elevados de ARNm de 32144. Abreviaturas usadas en la Tabla 2: N, tejido normal; T, tumor; SmC, carcinoma de células pequeñas; PDNSCCL, carcinoma de células no pequeñas pobremente diferenciadas; SCC, carcinoma de células escamosas; AC, adenocarcinoma; NHBE, línea celular pulmonar.

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TABLA 3

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Como se muestra en la columna "Expresión Relativa" de la Tabla 3, 6/8 de los tumores de colon ensayados tienen un elevado nivel de expresión de 32144 en comparación con el tejido normal de colon, con 3/8 mostrando un dramático aumento en la expresión de ARNm de 32144. Todas las metástasis de hígado ensayadas expresaron ARNm de 32144. Abreviaturas usadas en la Tabla 3: N, tejido normal; T, tumor; Met, metástasis; HMVEC, células endoteliales vasculares humanas; prol, proliferación.

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TABLA 4

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La Tabla 4 representa la expresión relativa de ARNm de 32144 en líneas celulares que se han xenografiado en ratones y se han permitido formar tumores. Varias de las líneas representan altos niveles de expresión de 32144 cuando crecen en dichas condiciones. La más notable es una de las líneas tumorales de colon en la Etapa C, una pareja de las líneas tumorales de mama, una de las líneas de carcinoma de ovario y una línea se fibroblasto de riñón infantil. Muchas de las otras líneas celulares también expresan ARNm de 32144 cuando se xenografían en ratones. Abreviaturas usadas en la Tabla 4: T, tumor; HCT116, HT29 y Colo 205, líneas celulares de carcinoma de colon; NCIH125, NCIH322, NCIH460, A549 y NHBE, líneas celulares de carcinoma pulmonar.

TABLA 5

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La Tabla 5 representa la expresión relativa de ARNm de 32144 en líneas celulares de carcinoma de mama que crece en diversas condiciones. El crecimiento de las líneas celulares en agar correlaciona con un aumento en la expresión de 32144, como se muestra por las líneas celulares MCF10AT3B, MCF3B, clon 5 de MCF10AT3B y clon t de MCT10AT3B. Las células de MCF10A no representaron un cambio en la expresión de 32144 en respuesta al factor de crecimiento epidérmico (EGF), mientras que respondieron al factor de crecimiento de insulina Iea (IGF-1A) aumentando gradualmente la expresión del ARNm de 32144 en el curso de 24 horas.

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TABLA 6

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La expresión de ARNm de 32144 se analizó por hibridación in situ tanto en muestras de tejido normal como tumoral. La expresión de ARNm de 32144 se observó de forma consistente en los tumores, sugiriendo un papel para la 32144 en el desarrollo tumoral. Además, en las muestras de tumor de colon, la expresión de ARNm de 32144 fue más prevalente en tumores metastáticos, indicando una posible relación entre la expresión de 32144 y la metástasis tumoral en algunos tejidos. Abreviaturas usadas en la Tabla 6 incluyen: PD, pobremente diferenciado; MD, moderadamente diferenciado; NSCC, carcinoma de células no pequeñas; SCC, carcinoma de células escamosas; AC, adenocarcinoma; IDC, carcinoma ductal invasivo; ILC, carcinoma lobular invasivo; Met, metástasis; El paréntesis indica el tejido en que se encontró el tumor, si es otro diferente al tejido de origen.

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TABLA 7

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La expresión del análisis basado en la selección de la expresión de ARNm de 32144 humano en los carcinomas de mama indolentes invasivos (IIC) y los carcinomas de mama metastáticos (MetC). 2/5 de carcinomas de mama metastáticos representaron un elevado nivel de expresión de 32144, mientras que 0/3 de carcinomas de mama indolente invasivo representaron una elevación de la expresión de 32144, sugiriendo una correlación entre la elevada expresión de 32144 y la metástasis tumoral.

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Ejemplo 3 Distribución Tisular de ARNm de 32144 por Análisis de Northern

Pueden realizarse hibridaciones de transferencia Northern con diversas muestras de ARN en condiciones normalizadas y se lavan en condiciones restrictivas, es decir, 0,2xSSC a 65ºC. Puede usarse una sonda de ADN correspondiente a todo o a parte del ADNc de 32144 (SEQ ID NO:1). El ADN se marcó radiactivamente con ^{32}P-dCTP usando el equipo Prime-It (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Pueden sondarse filtros que contienen ARNm de tejidos hematopoyéticos y endocrinos de ratón y líneas de células cancerosas (Clontech, Palo Alto, CA) en disolución de hibridación ExpressHyb (Clontech) y lavarse con alta rigurosidad de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

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Ejemplo 4 Expresión Recombinante de 32144 en Células Bacterianas

En este ejemplo, se expresa 32144 como un polipéptido de fusión de glutatión-S-transferasa (GST) recombinante en E. coli y el polipéptido de fusión se aísla y se caracteriza. Específicamente, se fusiona 32144 a GST y se expresa este polipéptido de fusión en E. coli, por ejemplo, la cepa PEB199. La expresión de la proteína de fusión GST-32144 en PEB199 es inducida con IPTG. El polipéptido de fusión recombinante se purifica a partir de lisados bacterianos en bruto de la cepa de PEB 199 inducida por cromatografía de afinidad en perlas de glutatión. Usando el análisis electroforético en gel de poliacrilamida del polipéptido purificado a partir de los lisados bacterianos, se determina el peso molecular del polipéptido de fusión resultante.

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Ejemplo 5 Expresión de Proteína 32144 Recombinante en Células COS

Para expresar el gen de 32144 en células COS (por ejemplo, células COS-7, células SV40 con origen CV-1; Gluzman (1981) Cell 23:175-182), se usa el vector ADNpc/Amp por Invitrogen Corporation (San Diego, CA). Este vector contiene un origen de replicación de SV40, un gen de resistencia a la ampicilina, un origen de replicación de E. coli, un promotor de CMV seguido de una región poliligadora, y un intrón de SV40 y un sitio de poliadenilación. Un fragmento de ADN que codifica la proteína 32144 entera y una marca HA (Wilson et al. (1984) Cell 37:767) o una marca FLAG fusionada en fase a su extremo 3' del fragmento, se clona en la región poliligadora del vector, situando de esta manera la expresión de la proteína recombinante bajo el control del promotor de CMV.

Para construir el plásmido, la secuencia de ADN de 32144 se amplifica por PCR usando dos cebadores. El cebador 5' contiene el sitio de restricción de interés seguido de aproximadamente veinte nucleótidos de la secuencia de codificación de 32144 que empieza a partir del codón de inicio; la secuencia del extremo 3' contiene secuencias complementarias al otro sitio de restricción de interés, un codón de terminación de la traducción, la marca HA o la marca FLAG y los últimos 20 nucleótidos de la secuencia de codificación de 32144. El fragmento amplificado por PCR y el vector ADNpc/Amp se digieren con las enzimas de restricción apropiadas y el vector se desfosforila usando la enzima CIAP (New England Biolabs, Beverly, MA). Preferiblemente, los dos sitios de restricción elegidos son diferentes de forma que el gen de 32144 se inserte en la orientación correcta. La mezcla de ligamiento se transforma en células E. coli (pueden usarse cepas HB101, DH5\alpha y SURE, disponibles en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), el cultivo transformado se pone en placas con medio de ampicilina y se seleccionan las colonias resistentes. El ADN plasmídico se aísla a partir de los transformantes y se examina por análisis de restricción con respecto a la presencia del fragmento correcto.

Posteriormente se transfectan células COS con el ADN del plásmido ADNpc/Amp-32144 usando métodos de coprecipitación con fosfato cálcico o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación. Pueden encontrarse otros métodos adecuados para transfectar células huésped en Sambrook, J., Fritsh, E. F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. La expresión del polipéptido 32144 se detecta por radiomarcado (puede usarse ^{35}S-metionina o ^{35}S-cisteína disponible en NEN, Boston, MA) e inmunoprecipitación (Harlow, E. y Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) usando el anticuerpo monoclonal específico de HA. En resumen, las células se marcan durante 8 horas con ^{35}S-metionina (o ^{35}S-cisteína). Después se recogen los medios de cultivo y las células se lisan usando detergentes (tampón RIPA, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5). Tanto el lisado celular como el medio de cultivo se precipitan con un anticuerpo monoclonal específico de HA. Los polipéptidos precipitados después se analizan por SDS-PAGE.

De manera alternativa, el ADN que contiene la secuencia de codificación de 32144 se clona directamente en el poliligador del vector ADNpc/Amp usando los sitios de restricción apropiados. El plásmido resultante se transfecta en células COS de la manera descrita anteriormente y la expresión del polipéptido 32144 se detecta por radiomarcado e inmunoprecipitación usando un anticuerpo monoclonal específico de 32144.

Claims (12)

1. Un método para identificar un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, comprendiendo el método:

a) poner en contacto una primera muestra obtenida de dicho sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico que hibrida específicamente una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3 como se muestra en el ejemplo 1;

b) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la primera muestra que hibrida específicamente con la sonda;

c) poner en contacto una segunda muestra obtenida de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3 como se muestra en el ejemplo 1;

d) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la segunda muestra que hibrida específicamente con la sonda;

e) comparar el nivel de los ácidos nucleicos que se hibridan con la sonda en la primera muestra con el nivel de los ácidos nucleicos que se hibridan con la sonda en la segunda muestra,

en la que un nivel aumentado de ácidos nucleicos que hibridan en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica a un sujeto que tienen un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario.

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2. El método según la reivindicación 1, en el que dicha sonda de hibridación está marcada de forma detectable.

3. El método según la reivindicación 1, en el que dicha detección es por hibridación in situ.

4. Un método para identificar un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, comprendiendo el método:

a) poner en contacto una primera muestra obtenida de dicho sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con un cebador de primera y segunda amplificación, cada uno de los cuales hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

i)

una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NO:1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1; y

ii)

una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1;

b) incubar la primera muestra en condiciones que permiten la amplificación del ácido nucleico;

c) poner en contacto la segunda muestra obtenida de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con dicho cebador de primera y segunda amplificación;

d) incubar la segunda muestra en condiciones que permiten la amplificación del ácido nucleico; y

e) comparar el nivel de amplificación del ácido nucleico en la primera muestra respecto al nivel de amplificación del ácido nucleico en la segunda muestra,

en la que un nivel aumentado de amplificación de ácido nucleico en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica a un sujeto que tienen un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario.

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5. Un método para identificar un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, que comprende:

a) poner en contacto una primera muestra obtenida de dicho sujeto que comprende polipéptidos con un anticuerpo que enlaza específicamente a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

i)

un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1; y

ii)

un polipéptido que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1;

b) detectar la presencia de un polipéptido en la primera muestra que se une al anticuerpo;

c) poner en contacto una segunda muestra de un sujeto de control que comprende polipéptidos con el anticuerpo;

d) detectar la presencia de un polipéptido en la segunda muestra que se une al anticuerpo; y

e) comparar el nivel de la unión al anticuerpo en la primera muestra respecto al nivel de la unión al anticuerpo en la segunda muestra,

en la que un nivel aumentado de anticuerpo que enlaza en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica a un sujeto que tienen un cáncer de pulmón, colon o de ovario, o un riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón, colon o de ovario.

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6. El método según la reivindicación 5, en el que dicho anticuerpo está marcado de forma detectable.

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7. Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, comprendiendo el método:

analizar la capacidad del compuesto para disminuir la expresión de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos idéntica al 95% a la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO:1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1, o un complemento de la misma;

ii) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntico en al menos 95% de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1;

(iii) una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos representada en las SEQ ID NO: 1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1; y

(iv) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1;

identificando así un compuesto capaz de tratar el cáncer de pulmón, colon o de ovario.

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8. Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un cáncer de pulmón, colon o de ovario, comprendiendo el método:

analizar la capacidad del compuesto para disminuir la actividad de la hidrolasa de amida de ácidos grasos de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

i) un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 95% al ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO:1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1;

ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntico en al menos 95% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1;

iii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1; y

iv) un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO:1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1;

identificando así un compuesto capaz de tratar el cáncer de pulmón, colon o de ovario.

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9. Un método según la reivindicación 8, en el que dicho ensayo es un ensayo basado en células.

10. Un método según la reivindicación 8, en el que dicho ensayo es un ensayo libre de células.

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11. Un método para evaluar la eficacia de un tratamiento para el cáncer de pulmón, colon o de ovario, en una muestra aislada de un sujeto que se trata con un protocolo en evaluación, que comprende:

evaluar el nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en 95% a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO: 3 como se muestra en el ejemplo 1;

b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1; y

c) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3 como se muestra en el ejemplo 1;

en el que una disminución en el nivel de expresión del ácido nucleico después del tratamiento, respecto al nivel antes del tratamiento, es indicativo de la eficacia del tratamiento de un cáncer de pulmón, colon o de ovario.

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12. Un método para evaluar la eficacia de un tratamiento para el cáncer de pulmón, colon o de ovario, en una muestra aislada de un sujeto que se trata con un protocolo en evaluación, que comprende:

evaluar el nivel de expresión de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

i) un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 95% al ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1;

ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntico en al menos 95% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1;

iii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 como se muestra en el ejemplo 1; y

iv) un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO:1 o 3 como se muestra en el ejemplo 1;

en el que una disminución en el nivel de expresión del polipéptido después del tratamiento, respecto al nivel antes del tratamiento, es indicativo de la eficacia del tratamiento de un cáncer de pulmón, colon o de ovario.