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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Abtöten menschlicher proliferierender
Zellen in vitro, ex vivo oder in vivo. Genauer gesagt, diese Erfindung
stellt verbesserte Möglichkeiten
zur Verfügung,
um menschliche Zellen gegenüber
Nukleosidanaloga zu sensitivieren. Die Erfindung betrifft insbesondere
die Entdeckung vorteilhafter Eigenschaften bestimmter Polypeptide
und Nukleinsäuren
als konditionale Selbstmord-Wirkstoffe, insbesondere vom Thymidinkinase
Typ. Die Erfindung kann in verschiedenen technischen Gebieten angewendet werden,
z.B. in der experimentellen Biologie, Therapie, Prophylaxe, Durchmusterungsverfahren,
etc.
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Zellen
von Säugetieren,
die ein konditionales Selbstmord-Gen exprimieren, werden selektiv
abgetötet oder
zerstört
durch Aktivierung eines Vorläufer-Wirkstoffs
zu einem toxischen Metabolit. Das Herpes-Simplex-Virus Typ 1 Thymidinkinase-Gen
(HSV1-TK) ist das am häufigsten
verwendete Selbstmord-Gen, sowohl in experimentellen Ansätzen als
auch in klinischen Studien1. Die Expression
des HSVI-TK-Gens sensitiviert Tumorzellen gegenüber antiviralen Wirkstoffe
wie Acyclovir (ACV), Ganciclovir (GCV) und Bromvinyl-Desoxyuridin (BVDU).
Diese Nukleosidanaloga werden durch HSV1-TK effizient in ihre Monophosphatform
umgewandelt und werden dann durch zelluläre Kinasen des Wirts in Triphosphatverbindungen
umgewandelt.2-4 Der Einbau dieser Metabolite
in elongierende DNS blockiert die Elongation, was zum Zelltod führt.5-8 Das HSV1-TK/GCV-System hat sich als effizient
erwiesen, sowohl die Regression von transplantierten Tumoren in verschiedenen
Tier-Modellen,9-11 als auch von mittels
Karzinogenen induzierten Tumoren zu bewirken.12 Basierend
auf diesen positiven Ergebnissen werden mehrere klinische Gentherapie-Studien
durchgeführt
mit dem Ziel, die Sicherheit und Effizienz dieses Verfahrens bei
der Behandlung von malignen Erkrankungen13 oder
weiteren proliferativen Erkrankungen, wie der Transplantat-gegen-Empfänger-Erkrankung
(Graft versus Host disease), festzustellen, und vorläufige Ergebnisse
sind jetzt veröffentlicht
worden.14-17
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Trotz
der Effektivität
des HSV1-TK/GCV-Systems beim Abtöten
proliferierender Zellen (z.B. Tumorzellen), ist es wichtig zu versuchen,
das System zu verbessern mit dem Ziel, die therapeutische Wirksamkeit
zu maximieren und/oder die Behandlungsbedingungen zu erleichtern.
Zum Beispiel hat GCV den Nachteil, dass es über langsame intravenöse Perfusion
verabreicht wird, was eines Krankenhausaufenthalts des Patienten bedarf.
Es wäre
deshalb interessant, ein Nukleosidanalogon für die orale Verabreichung zu
finden, das dieselbe Wirksamkeit wie der GCV-Vorläufer-Wirkstoff
hat. Es wäre
auch eine signifikante Leistung, wenn man Wege finden würde, um
die Wirksamkeit des Abtöt-Effekts,
den man mit einer Thymidinkinase beobachtet, verbessert. In dieser
Hinsicht ist die Verwendung stärkerer
Promotorregionen vom Stand der Technik nahe gelegt worden, um die
zellulären
Mengen an Thymidinkinase zu steigern. Es ist ebenfalls vorgeschlagen
worden, eine Kombination verschiedener Enzyme zu verwenden, um die
Phosphorylierungseffizienz zu steigern. Ferner wurde vorgeschlagen,
Mutanten oder Derivate von HSV1-TK zu produzieren oder nach Ihnen
systematisch zu suchen, die eine erhöhte Affinität oder Aktivität gegenüber Nukleosidanaloga
aufweisen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt nun alternative Möglichkeiten zur Verfügung, die
die oben dargelegten Aufgaben behandeln und die insbesondere eine
verbesserte Sensitivität
humaner Zellen gegenüber
Nukleosidanaloga bereitstellen. Insbesondere haben die Anmelder
nun unerwarteterweise zeigen können,
dass eine erhöhte
Sensitivität
gegenüber
Nukleosidanaloga, die aus Ganciclovir und Acyclovir ausgewählt werden,
in humanen Zellen mit einem besonderen Typ von Thymidinkinase erreicht
werden kann, das heißt
mit einem Thymdinkinase-Polypeptid oder -Nukleinsäure des
Pferdeherpesvirus Typ 4. Insbesondere haben die Anmelder gezeigt,
dass, unter Verwendung von Wildtyp Pferdeherpesvirus Typ 4 Thymidinkinase
(wtEHV4-TK) oder Varianten davon, menschliche Zellen 3- bis 12-fach
sensitiver gegenüber
Ganciclovir oder Acyclovir werden als mit HSV-1TK. Die erhaltenen
Ergebnisse zeigen, dass EHV4-TK ein sehr interessantes, alternatives
Selbstmord-Gen gegenüber
HSVI-TK-Gen für
viele Verwendungen darstellt, einschließlich experimenteller, biologischer,
Durchmusterungs- oder therapeutischer Anwendungen.
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung; liegt deshalb in der Verwendung
eines Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) Thymidinkinase-Polypeptids
oder einer dafür
kodierenden Nukleinsäure
zur Herstellung einer Zusammensetzung, die humane Zellen gegenüber einem
Nukleosidanalogon, das aus Ganciclovir und Acyclovir ausgewählt wird,
in vitro, ex vivo oder in vivo sensitiviert.
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Im
Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck
Pferdeherpesvirus Typ 4 Thymidinkinase-Polypeptid („EHV4-TK") entweder Wildtyp
EHV4-TK oder jegliches biologisch aktive Fragment oder Variante
davon. Wildtyp EHV4-TK
wurde isoliert, charakterisiert und seine Aminosäuresequenz wurde im Stand der
Technik publiziert.18 Dieses Polypeptid
kann über
jedes bekannte konventionelle Verfahren nach dem Stand der Technik
gewonnen werden, z.B. über
rekombinante Produktion, künstliche
Synthese oder Reinigung aus EHV4-infizierten Zellen. Ein biologisch
aktives Fragment oder eine Variante von Wildtyp EHV4-TK bezeichnet
unter anderem ein Polypeptid, das die Fähigkeit besitzt, ein Nukleosidanalogon
wie unten definiert zu phosphorylieren, z.B. GCV, ACV oder BVDU.
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Fragmente
von EHV4-TK können über jedes
konventionelle Verfahren zubereitet werden, wie chemische oder enzymatische
Spaltung gefolgt von Auftrennung der Fragmente, rekombinante Herstellung über verkürzte Nukleinsäuren, künstliche
Polypeptidsynthese, etc. Das Fragment kann ein internes Fragment
oder ein C-terminales oder ein N-terminales Fragment von Wildtyp
EHV4-TK oder eine Kombination davon sein. Vorzugsweise sollte ein
Fragment nach der vorliegenden Erfindung mindestens 40%, noch mehr
bevorzugt mindestens 50% der gesamten Aminosäuresequenz von Wildtyp EHV4-TK
beibehalten. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Fragment
mindestens 75% der gesamten Aminosäuresequenz von Wildtyp EHV4-TK,
oder noch mehr bevorzugt mindestens 85% davon. Varianten von Wildtyp
EHV4-TK umfassen alle biologisch aktiven Polypeptide, die vom Wildtyp
EHV4-TK ableitet sind durch jedwede Mutation(en), Substitution(en),
Additionen) und/oder andere Modifikation(en) der Primär- oder
Sekundärstruktur.
Varianten beinhalten sowohl alle natürlichen Varianten resultierend
aus Mutationen oder Polymorphismus von EHV4, als auch beispielsweise
Hybrid-Polypeptide, welche die EHV4-TK als Fusion an eine heterologe Aminosäuresequenzen umfassen.
Der Ausdruck heterolog bezeichnet jede Aminosäuresequenz umfassend eine oder
mehrere Aminosäurereste,
die einen anderen Ursprung haben als EHV4. Solch eine heterologe
Aminosäuresequenz
kann jede künstlich
hergestellte Sequenz sein, die zum Beispiel eine erhöhte Stabilität, oder
eine Sekretion des Polypeptids oder eine Markierung des Polypeptids
zur Verfügung
stellt. Diesbezüglich
offenbart die vorliegende Erfindung auch Fusionspolypeptide umfassend
einen EHV4-TK-Anteil fusioniert an ein Marker Protein, z.B. verstärktes grünes Fluoreszenzprotein
(E-GFP), Luciferase, β-Gal,
Thy-1-Protein, Chloramphenicol-Acetyltransferase
(CAT), und Zellproteine, die Antibiotikaresistenz bewirken. Die
Fusion wird normalerweise zubereitet durch die genetische Kopplung
eines Nukleinsäurebereichs
kodierend für
EHV4-TK-Polypeptid, und eines Nukleinsäurebereichs kodierend für eine heterologe
Aminosäuresequenz,
z.B. der Markeranteil. Die Nukleinsäuren werden im Leseraster fusioniert,
so dass die beiden Bereiche gleichzeitig exprimiert werden und ein chimäres Polypeptid
ergeben.
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Mutations-
oder Substitutionsvarianten können über bekannte
Techniken zubereitet werden, z.B. spezifische Mutagenese, Amplifikation
mit spezifischen Primern und dergleichen. Deletionen können ebenfalls über konventionelle
Techniken eingeführt
werden, z.B. durch die Verwendung von Restriktionsenzymen. Bevorzugt
behalten die Varianten mindestens 80% der Primärstruktur von wtEHV4-TK bei.
Bevorzugtere Varianten enthalten maximal 5 modifizierte Aminosäurereste
im Vergleich zu wtEHV4-TK.
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Andere
Varianten können
unnatürliche
Glykosylierung oder posttranslationale Modifikationen umfassen.
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Wie
angedeutet, können
die Varianten von EHV4-TK nur eine oder mehrere Modifikationen,
wie oben beschrieben (Deletion(en), Mutation(en), Addition(en),
etc.), umfassen.
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Die
biologische Aktivität
der oben genannten Fragmente oder Varianten von Wildtyp EHV4-TK
kann über
konventionelle Techniken festgestellt werden. Insbesondere die Fähigkeit
der Polypeptide, Nukleosidanaloga zu phosphorylieren, kann gemessen
werden durch das in Kontakt bringen der Polypeptide mit einem Nukleosidanalogon,
z.B. Acyclovir oder Ganciclovir, und nachweisen der Anwesenheit
von phosphatiertem Acyclovir oder Ganciclovir. Bevorzugt wird der
Test durchgeführt
durch (i) einführen
eines Nukleinsäurekonstrukts,
kodierend für
das Polypeptid, in eine Zelle, unter Bedingungen, die eine Expression
des Polypeptids in der Zelle erlauben, (ii) inkubieren der Zelle
mit einem Nukleosidanalogon wie Acyclovir oder Ganciclovir, und (iii)
feststellen der Toxizität
des Nukleosidanalogons in der Zelle. Das Niveau der beobachteten
Toxizität
kann gegebenenfalls verglichen werden mit einem Standard-Toxizitätsniveau,
das in einem ähnlichen
Experiment mit einer für
Wildtyp EHV4-TK kodierenden Nukleinsäuresequenz beobachtet wird.
Zum Beispiel kann der Test mit jeder sich teilenden Zelle, wie Fibroblasten,
durchgeführt
werden. Bevorzugte biologisch aktive Fragmente oder Varianten behalten
mindestens 75% der Toxizität
von Wildtyp EHV4-TK in einem Test, wie oben offenbart, bei.
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Wie
oben angegeben, kann die vorliegende Erfindung durchgeführt werden
unter Verwendung eines Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) Thymidinkinase-Polypeptids
oder einer dafür
kodierenden Nukleinsäure.
Die Verwendung einer Nukleinsäure
stellt eine bevorzugte Ausführungsform
dar. Nukleinsäuren
dieser Erfindung können
DNS oder RNS sein, vorzugsweise cDNS oder eine künstliche DNS umfassend synthetische
Bereiche. Die Nukleinsäure,
kodierend für
Wildtyp EHV4-TK, ist kloniert und sequenziert worden.18 Eine
Nukleinsäure, kodierend
für ein
EHV4-TK-Polypeptid dieser Erfindung, kann über konventionelle Techniken
wie das Durchmustern einer Bibliothek, artifizielle Synthese, Klonierung
von genomischer DNS, etc., erhalten werden. Eine besondere Nukleinsäure kodierend
für EHV4-TK-Polypeptid
dieser Erfindung, ist jede Nukleinsäure, die mit der für Wildtyp
EHV4-TK kodierenden Nukleinsäure
hybridisiert und für
ein biologisch aktives EHV4-TK-Polypeptid wie oben definiert kodiert.
Hybridisierung erfolgt bevorzugt unter stringenten Bedingungen,
die dem Fachmann bekannt sind (Sambrook et al.), z.B. 40°C; 50% Formamid,
5 × SSC;
1 × Denhardt,
mit Waschschritten zwischen 55 und 65°C. Eine weitere besondere Nukleinsäure dieser
Erfindung ist eine Nukleinsäure
kodierend für
Wildtyp EHV4-TK,
die modifiziert wird, um die Expressionsbedingungen zu verbessern.
Insbesondere wird eine bevorzugte Nukleinsäure dieser Erfindung modifiziert,
so dass jeder darin enthaltene kryptische Promotor inaktiviert wird.
Es ist in der Tat beobachtet worden, dass die Gene von Thymidinkinasen
kryptische Promotoren enthalten, welche ihre Expression in Säugetierzellen
stören.
Die Anwesenheit von kryptischen Promotoren führt insbesondere zur Expression
von verkürzten
Versionen an Thymidinkinase mit niedrigerer oder gar keiner biologischen
Aktivität
und potentiellen Nebenwirkungen (siehe in diesem Zusammenhang Referenzen
19–20).
Eine bevorzugte Nukleinsäure
dieser Erfindung ist eine Nukleinsäure, die ein EHV4-TK-Polypeptid kodiert,
wobei die Nukleinsäure
keinen kryptischen Promotor aufweist. Solch eine Nukleinsäure kann zubereitet
werden durch (i) identifizieren des kryptischen Promotors in der
Nukleinsäuresequenz
und (ii) modifizieren der Nukleinsäuresequenz, z.B. mittels translational
neutraler Modifikationen und/oder mittels Deletion(en). Die resultierende
Nukleinsäure
kann auf eine verbesserte Expression in Säugetierzellen, besonders in menschlichen
Zellen, getestet werden, wie in den Beispielen offenbart. Ein besondere
Nukleinsäure
dieser Erfindung umfasst eine Deletion im 5' Bereich eines EHV4-TK-Gens, wobei die
Deletion eine erhöhte
Expression in Säugetierzellen
zur Verfügung
stellt.
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Vorzugsweise
ist die Nukleinrsäure,
die ein EHV4-TK Polypeptid dieser Erfindung kodiert, in einem Nukleinsäurekonstrukt
beinhaltet, das zum Beispiel eine Promotorregion 5' und ein Terminationssignal
3' der kodierenden
Sequenz umfasst. Solch ein Nukleinsäurekonstrukt kann Teil eines
Vektors sein, z.B. eines Plasmid Vektors, eines viralen Vektors
(das heißt
eines rekombinanten Virus), eines artifiziellen Chromosoms, eines
Episoms, etc.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
verwendet diese Erfindung einen Vektor umfassend eine Nukleinsäure kodierend
für ein
EHV4-TK-Polypeptid wie oben definiert. Sogar noch bevorzugter ist
solch ein Vektor ein Plasmid oder ein viraler Vektor, z.B. ein retroviraler
Vektor, ein adenoviraler Vektor, ein AAV, ein Herpesvirusvektor
oder ein Vacciniavirusvektor. Diesbezüglich verwendet eine besondere
Ausführungsform
dieser Erfindung einen Kulturüberstand,
umfassend ein rekombinantes Virus, das eine Nukleinsäure beinhaltet,
die ein EHV4-TK-Polypeptid kodiert. Eine weitere besondere Art eine
Nukleinsäure
dieser Erfindung zur Verfügung
zu stellen, umfasst die Verwendung von Zellen, die rekombinantes
Virus produzieren, beinhaltend eine Nukleinsäure, die EHV4-TK Polypeptid
kodiert. Diesbezüglich
kann jede Zusammensetzung, die Virus-verpackende Zellen umfasst,
verwendet werden, insbesondere Retrovirus- und Adenovirus-verpackende
Zellen. Die Verwendung eines viralen Überstands oder einer Virus-verpackenden
Zelle stellt einen bevorzugten Weg dar, diese vorliegende Erfindung
auszuführen.
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Wie
oben angegeben, besteht diese Erfindung darin, humane Zellen gegenüber einem
aus Ganciclovir und Acyclovir ausgewählten Nukleosidanalogon zu
sensitivieren. Der Ausdruck Nukleosidanalogon bezeichnet jede Verbindung,
die, wenn sie phosphoryliert ist, in eine elongierende DNS-Kette
eingebaut werden kann, um DNS-Replikation und/oder Transkription
zu blockieren. Ein Nukleosidanalogon dieser Erfindung ist eine Verbindung,
die durch Thymidinkinase, insbesondere durch HSV-1TK, in ein monophosphoryliertes
Nukleosidanalogon umgewandelt werden kann. Beispiele für Nukleosidanaloga
schließen
z.B. Ganciclovir (GCV), Acyclovir (ACV) und Bromvinyl-Desoxyuridin
(BVDU) ein. Diese Nukleosidanaloga werden effizient in ihre monophosphatierte
Form durch HSV-1TK konvertiert, und werden dann durch zelluläre Kinasen
des Wirts in triphosphorylierte Verbindungen umgesetzt. Einbau dieser
Verbindungen in elongierende DNS blockiert die Elongation, was zu
einem apoptotischen Zelltod führt
(Balzarini, 1989; Furman, 1980; St Clair, 1987). Weitere Beispiele
für Nukleosidanaloga
sind alle Verbindungen, die von Pyrimidin- oder Purinnukleosiden
abgeleitet sind, die durch EHV4-TK phosphoryliert werden können (bekannte
antivirale Wirkstoffe oder synthetische Produkte).
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Die
Erfindung stellt also alternative Mittel zur Verfügung, Zellen
gegenüber
aus Ganciclovir und Acyclovir ausgewählten Nukleosidanaloga zu sensitivieren.
Sensitivität
bedeutet, dass in Gegenwart der Nukleosidanaloga die behandelten
Zellen zerstört
oder abgetötet
werden, im Allgemeinen durch Apoptose. Die Erfindung stellt deshalb
auch ein verbessertes Verfahren zur Zerstörung von Zielzellen zur Verfügung. Ein
Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der unerwartet hohen
erzielbaren Sensitivität
der Behandlung. Tatsächlich
haben die Erfinder nun gezeigt, dass wenn Polypeptide oder Nukleinsäurekonstrukte
der vorliegenden Erfindung mit humanen Zellen in Kontakt gebracht
werden, in der Gegenwart eines Nukleosidanalogons eine sehr effiziente
Zerstörung
der Zellen erreicht werden kann. Die in den Beispielen gezeigten
Ergebnisse zeigen insbesondere, dass menschliche Zellen, die EHV4-TK-Polypeptid
exprimieren, 3- bis 12-fach sensitiver sind gegenüber Nukleosidanaloga
wie GCV, als humane Zellen, die HSV-1TK exprimieren. In anderen
Worten: die Erfindung erlaubt eine signifikante Reduzierung der
Dosen an Nukleosidanaloga, z.B. GCV, die verwendet werden, um die
Zielzellen zu zerstören.
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Diesbezüglich besteht
ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung in der Verwendung
eines EHV4-TK-Polypeptids oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure für die Herstellung
einer Zusammensetzung zur Zerstörung
(z.B. Abtötung)
von humanen Zellen (in vitro, ex vivo oder in vivo). Die Erfindung
besteht auch in einem Verfahren des Abtötens humaner Zellen, das das
in Kontakt bringen der humanen Zellen in vitro oder ex vivo mit
EHV4-TK-Polypeptid oder einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz
und ferner in Kontakt bringen der Zellen oder deren Nachkommen mit
Nukleosidanaloga umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung kann verwendet werden in vitro, in vivo oder
ex vivo. Sie kann verwendet werden um bestimmte Zellen abzutöten, entweder
zu Selektions- oder Depletionszwecken, für experimentelle Verwendungen
oder therapeutische Anwendungen.
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Die
vorliegende Erfindung kann durchgeführt werden mit verschiedenen
Typen von humanen Zellen, einschließlich sich natürlich, pathologisch
und induziert teilender Zellen. Natürlich sich teilende Zellen
sind Zellen, die sich regelmäßig im Laufe
ihres Lebenszyklus teilen. Induziert sich teilende Zellen sind Zellen,
die sich nicht natürlicherweise
teilen würden,
aber zur Teilung angeregt werden können. Eine bevorzugte therapeutische
Verwendung der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung von proliferierenden
humanen Zellen, noch bevorzugter, von anormal proliferierenden humanen
Zellen. Eine besondere Veranschaulichung ist die Behandlung (das
heißt
die Zerstörung
und/oder Abtötung)
von humanen Tumorzellen. Diesbezüglich
können
Zellen verschiedener solider Tumore erwähnt werden, beispielsweise
von Kopf- und Nackenkrebs, Lungenkrebs (insbesondere der nicht-kleinzellige Lungenkrebs),
Glioblastom, Melanom, Brustkrebs, Leberkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs,
Gehirntumoren und dergleichen. Ein weiteres Beispiel für humane
Zellen, die behandelt werden können
gemäß dieser
Erfindung, wird repräsentiert
durch spezifische Klone von T-Lymphozyten, die anormal proliferieren,
beispielsweise Klone von T-Lymphozyten, die an Autoimmunerkrankungen
oder der Transplantat-gegen-Empfänger-Erkrankung
(Graft versus Host disease) beteiligt sind.
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Dementsprechend
besteht in einer bestimmten Ausführungsform
die Erfindung in der Verwendung eines Thyimdinkinase-Polypeptids
des Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) oder einer dafür kodierenden
Nukleinsäure
zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Abtöten humaner Tumorzellen in
vitro, ex vivo oder in vivo. Die vorliegende Erfindung besteht auch
in einem Verfahren, eine humane Tumorzelle abzutöten, das das in Kontakt bringen
der humanen Tumorzelle in vitro oder ex vivo mit einem Thyimdinkinase-Polypeptid
des Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) oder einer dafür kodierenden
Nukleinsäure,
und ferner das in Kontakt bringen der Zellen oder deren Nachkommen
mit einem Nukleosidanalogon umfasst.
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In
einer weiteren besonderen Ausführungsform
besteht die Erfindung in der Verwendung eines Thyimdinkinase-Polypeptids
des Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) oder einer dafür kodierenden
Nukleinsäure
zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Abtöten humaner T-Lymphozyten in
vitro, ex vivo und in vivo. Ein Verfahren zum Abtöten humaner
T-Lymphozyten, das das in Kontakt bringen der humanen T-Lymphozyten
in vitro oder ex vivo mit einem Thymidinkinase-Polypeptid des Pferdeherpesvirus
Typ 4 (EHV4) oder einer dafür kodierenden
Nukleinsäure
und ferner das in Kontakt bringen der Zellen oder deren Nachkommen
mit einem Nukleosidanalogon umfasst, ist ebenfalls Teil der Erfindung.
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Wie
oben erklärt,
kann die vorliegende Erfindung in vitro, in vivo und ex vivo verwendet
werden. Für
in vitro oder ex vivo Verwendungen kann die Erfindung gemäß der folgenden
Vorgehensweise ausgeführt
werden.
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Eine
Zellpopulation, die behandelt werden soll (das heißt die gegenüber einem
Nukleosidanalogon sensitiviert werden), wird bereitgestellt. Die
Zellen können
in jeder geeigneten Vorrichtung (z.B. eine Platte, eine Schale,
ein Kolben, eine Flasche, etc.), vorzugsweise unter sterilen Bedingungen,
in jedem konventionellen Kulturmedium (RPMI, DMEM, etc.) in Kultur
gehalten werden. Die Zellen werden dann mit dem EHV4-TK-Polypeptid oder einer
Nukleinsäure
wie oben definiert in Kontakt gebracht. Diesbezüglich werden die Zellen durch
direkte Inkubation der Zellen mit EHV4-TK-Polypeptid oder Nukleinsäure in Kontakt
gebracht. Diese Inkubation erlaubt die Aufnahme des EHV4-TK-Polypeptids oder
der Nukleinsäure
durch die Zellen, oder zumindest durch einen Teil der Zellen. Diese
Inkubation kann durchgeführt
werden in der Gegenwart von unterstützenden Agenzien oder Bedingungen,
die die Aufnahme des EHV4-TK-Polypeptids oder der Nukleinsäure durch
die Zelle erhöhen.
Solche Agenzien sind zum Beispiel jedes kationische Lipid, Polymer,
Liposom, Kalziumphosphatpräzipitat,
etc. Die Inkubation kann auch physikalische Maßnahmen umfassen, z.B. elektrische
Felder, Gen-Kanone und dergleichen. In einer besonderen Ausführungsform
dieser Erfindung wird eine EHV4-TK-Nukleinsäure verwendet, die in einem
Vektor enthalten ist. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist
die Nukleinsäure
in einem viralen Vektor (oder einem davon hergestellten rekombinanten
Virus) enthalten. Die Verwendung eines rekombinanten Virus ist besonders
vorteilhaft aufgrund der natürlichen
Infektionsstärke dieser
Partikel. Bevorzugte rekombinante Viren schließen z.B. rekombinante Retroviren,
Adenoviren, AAV oder Herpesviren ein. Verfahren zur Herstellung
dieser Vektoren sind dem Fachmann bekannt.
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In
einer besonderen Ausführungsform
werden die Zellen deshalb gegenüber
einem Nukleosidanalogon sensitiviert durch das in Kontakt bringen
der Zellen mit einem Vektor, umfassend eine EHV4-TK-Nukleinsäure, bevorzugter
mit einem rekombinanten Virus, umfassend eine EHV4-TK-Nukleinsäure.
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Diesbezüglich bezieht
sich die Erfindung ganz besonders auf ein Verfahren humane Zellen
gegenüber einem
Nukleosidanalogon, das aus Ganciclovir und Acyclovir ausgewählt wird,
in vitro, ex vivo oder in vivo zu sensitivieren durch das in Kontakt
bringen der humanen Zelle mit einem Vektor umfassend eine EHV4-TK
Nukleinsäure,
bevorzugter mit einem rekombinanten Virus umfassend eine EHV4-TK
Nukleinsäure.
Zellen, die nach Inkubation die EHV4-TK-Nukleinsäure eingebaut haben, sind sensitiv
gegenüber
einem Nukleosidanalogon, ebenso wie weitere Zellen in der Umgebung
aufgrund des „Bystander"-Effekts der TK.
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Das
in Kontakt bringen der Zellen mit rekombinantem Virus, wie oben
offenbart, kann erreicht werden durch Inkubation der Zellen mit
einem Kulturüberstand
oder einer angereicherten Lösung
oder Suspension, z.B. einer gereinigten Lösung umfassend das rekombinante
Virus, oder durch Co-Kultivierung mit Hersteller-Zellen, die rekombinantes
Virus herstellen.
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Der
Schritt des In-Kontakt-Bringens kann Zeitspannen von bis zu 72 Stunden
oder mehr umfassen, je nach den Inkubationsbedingungen. Die Zellen
können
dann gemäß allen
bekannten Verfahren wiedergewonnen werden. Sie können, falls gewünscht, einem
Selektionsschritt unterworfen werden, um eine Zellpopulation zu
erhalten, die im Wesentlichen Zellen umfasst, die wirklich das EHV4-TK-Polypeptid
oder -Nukleinsäure
enthalten. Diesbezüglich
kann der Prozentsatz an transfizierten Zellen vor jeglichem Selektionsschritt,
je nach Inkubationsbedingungen und Zellpopulation, zwischen 5 und
beinahe 99% schwanken. Die wiedergewonnenen Zellen können gewaschen
und in frisches Medium gesetzt werden, oder unter allen geeigneten
Bedingungen gelagert werden (Einfrieren, Lyophilisieren, etc.).
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Um
die behandelten Zellen abzutöten,
werden die Zellen ferner mit einem Nukleosidanalogon, das aus Ganciclovir
und Acyclovir gewählt
wird, in Kontakt gebracht, das heißt einer Verbindung, die durch
die behandelten Zellen in ein toxisches Molekül umgewandelt wird (durch Einbau
in elongierende DNS). Für
in vitro Verwendung können
die Zellen mit jeder geeigneten Dosierung des Nukleosidanalogons
in jeder angemessenen Vorrichtung in Kontakt gebracht werden. Die
Behandlung kann durchgeführt
werden, um eine Durchmusterung nach proliferierenden Zellen durchzuführen, spezifische
Zellpopulationen zu eliminieren (das heißt zu depletieren), die Aktivität einer
Promotorregion zu bestimmen, etc. Für ex vivo Indikationen kann
die Nukleosidanalogabehandlung auch durchgeführt werden, nachdem die behandelten
Zellen in das Subjekt injiziert worden sind. In dieser Ausführungsform
sind die Dosierungen im Prinzip wie unten für in vivo Anwendungen diskutiert.
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Um
die Erfindung in vivo durchzuführen,
müssen
die Zellen mit EHV4-TK-Polypeptid
oder -Nukleinsäure
in Kontakt gebracht werden durch direkte Verabreichung an ein Subjekt,
das dessen bedarf. Die Verabreichung kann durchgeführt werden über jeden
geeigneten Weg (intraarteriell, intravenös, intramuskulär, intratumoral,
kutan, etc.). Für
die Behandlung proliferierender Zellen, vor allem von Tumorzellen,
wird das EHV4-TK-Polypeptid,
oder vorzugsweise die Nukleinsäure,
vorzugsweise über
intravenöse,
intraarterielle oder intratumorale Injektionen verabreicht, bevorzugter über intratumorale
Injektion gemäß bekannter
Techniken. Die Dosierung an EHV4-TK-Nukleinsäure kann angepasst werden durch
den Fachmann, basierend auf der Lehre aus früheren klinischen Studien mit
dem HSVI-TK-Gen, die im Stand der Technik bereits ausgeführt sind.
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In
dieser Hinsicht können
Nukleinsäuren
z.B. von 0,1 bis 1000 μg/Dosis
injiziert werden. Bezüglich
rekombinantem Virus können
pro Dosis 103–109 pfu
injiziert werden. Wenn Verpackungszellen verwendet werden, werden
vorzugsweise 104–109 Zellen
injiziert.
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Sobald
die Zielzellen sensitiv gegenüber
einem Nukleosidanalogon geworden sind, können sie abgetötet werden
durch weiteren Kontakt mit einem Nukleosidanalogon.
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Diesbezüglich kann
das Nukleosidanalogon dem Subjekt verabreicht werden gemäß verschiedener Protokolle
und unterschiedlicher Zeitrahmen. Im Allgemeinen wird das Nukleosidanalogon
verabreicht über Perfusion
oder auf intraarteriellen, intravenösen oder kutanen Verabreichungswegen.
Konventionelle Dosierung für
Nukleosidanaloga liegt zwischen 1 und 50 mg/kg pro Tag, insbesondere
bei etwa 10 mg/kg, zweimal pro Tag. Das Nukleosidanalogon kann GCV
oder ACV sein. Orale Verabreichung ist auch vorgesehen. Zur Behandlung
von Tumorzellen wird z.B. das Nukleosidanalogon normalerweise kurz
nach dem EHV4-TK-Polypeptid oder -Nukleinsäure verabreicht, und für einen
Zeitraum, der zwischen 1 und 15 Tagen umfasst. Für weitere Zellen, wie T-Zellklone,
soll das Nukleosidanalogon nur verabreicht werden, wenn diese speziell
anvisierten T-Zellklone z.B. proliferieren (das heißt bei GVHD,
Autoimmunerkrankungen, etc.).
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Die
Erfindung bezieht sich auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung
zur Behandlung zellproliferativer Erkrankungen des Menschen umfassend
ein Pferdeherpesvirus Typ-4 (EHV4) Thymidinkinase-Polypeptid oder
eine dafür
kodierende Nukleinsäure
und einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipient. In einer bevorzugten
Ausführungsform
umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung einen Vektor umfassend
die oben genannte Nukleinsäure,
beispielsweise einen viralen Vektor wie oben definiert. In einer
weiteren Ausführungsform
umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung eine Zelle, die rekombinantes
Virus produziert, zum Beispiel eine Retroviren-produzierende Zelle.
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Vorzugsweise
umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung
außerdem
ein Nukleosidanalogon, das aus Ganciclovir und Acyclovir ausgewählt wird,
zur simultanen oder separaten Verabreichung.
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Ebenfalls
beschrieben ist eine Zusammensetzung umfassend humane Zellen, die
eine EHV4-TK-Nukleinsäure
wie oben definiert enthalten.
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Weitere
Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in dem sich
anschließenden
experimentellen Abschnitt präsentiert,
der als erläuternd
und nicht den Umfang der Erfindung einschränkend verstanden werden soll.
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1:
Karte der Expressionsvektoren.
- (A) Plasmide,
wie beschrieben in Cazaux et al., beinhalten die cDNS kodierend
für eine
Herpesvirus Thymidinkinase (HSV1, EHV4, EBV oder VZV) im Leseraster
fusioniert mit dem She ble-Gen, das Resistenz gegenüber Zeozin
bewirkt.
- (B) Karte des Vektors kodierend für das Fusionsprotein EHV4-TK/E-GFP.
Unterstrichene Sequenzen korrespondieren mit dem 5' nach 3' Arm zwischen der
Thymidinkinase und dem Zeozinresistenzprotein oder dem E-GFP.
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2:
Analyse der TK/ZEO-Fusionsproteinexpression in transfizierten Zellen.
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(A)
Western Blot Analyse, die die HSV1- und EHV4-TK-Proteinmengen in
stabilen Klonen von tk(–) 3T3
zeigt. (B) Dot Blot-Analyse der TK-Expression in transfizierten
und untransfizierten tk(–)
143B Zellen. Fusionsproteine wurden nachgewiesen mittels gereinigtem
polyklonalem Kaninchen anti-Sh Antikörper.
-
3:
Zytotoxische Aktivität
von ACV, GCV und BVDU gegenüber
humanen tk(–)
143B Zellen transfiziert mit HSV1- oder EHV4-TK. Toxizität ist dargestellt
als Durchschnitt der IC50-Werte ± SD. Der Durchschnitt, bestimmt
aus 3 unabhängigen
Experimenten, ist oberhalb jedes Histogramms angezeigt.
-
4:
Thymidin- und GCV-Phosphorylierung in transfizierten und untransfizierten
tk(–)
143B Zellen.
-
Zellen
wurden mit radioaktiv-markiertem Thymidin oder GCV inkubiert, und
die unterschiedlichen Phosphorylierungsfarmen wurden durch FPLC-Analyse
aufgetrennt. Der Prozentsatz an thy-MP, thy-DP und thy-TP war 29.3,
27.5 und 39.2% in HSV1-TK-exprimierenden
Zellen bzw. 36.8, 27.5 und 28.8% in EHV4-TK-exprimierenden Zellen.
Der Prozentsatz an GCV-MP, GCV-DP und GCV-TP war 15.5, 36.5 und
45% in HSV1-TK-exprimierenden
Zellen bzw. 23.9, 29.3 und 45% in EHV4-TK-exprimierenden Zellen.
-
5:
Analyse der dualen Funktionalität
des EHV4-TK/E-GFP-Fusionsproteins.
-
(A)
E-GFP-Expression in tk(–)
3T3 transfizierten und untransfizierten Zellen. EHV4-TK-Gen fusioniert mit
E-GFP-Gen (1-B) wurde in tk(–) 3T3 Zellen
transfiziert, und E-GFP
positive Zellen wurden per FACS-Analyse nachgewiesen. Die Expression
von E-GFP wurde bestimmt eine Woche nach Transfektion (1) und nach
2 Monaten Kultivierung in HAT-Medium (2). (B) GCV-Toxizität in transfizierten
und untransfizierten Zellen. Die Ergebnisse wurden dargestellt als
% der lebensfähigen
Zellen im Vergleich zu Zellen, die ohne GCV kultiviert wurden.
-
Chemikalien
-
Acyclovir
(ACV, [9-(2-Hydroxyethoxymethyl)guanin] Zovirax®),
Ganciclovir (GCV, [9-(1,3-Dihydroxy-2-propoxymethyl)guanin] Cymevan®),
Bromvinyldesoxyuridin (BVDU (E)-5-(2-Bromvinyl)-2'-desoxyuridin), wurden
erworben von Wellcome (Issy les-Moulineaux,
Frankreich), Syntex (Palo Alto, CA, USA) bzw. Sigma Chemical Co.
(St. Louis, MO, USA).
-
Zelllinien und Plasmide
-
NIH
3T3 Mauszellen, denen eine endogene TK-Aktivität (tk(–) 3T3) fehlt, wurden bezogen
von der "American
Type Culture Collection" (Rockville,
MD, USA), ebenso wie humane tk(–)
143B-(ATCC CRL 8303) und HCT116-(ATCC CCL 247)Zellen; die Bauchspeicheldrüsenkrebs-Mauszelllinie
PANC-O2 war eine Geschenk von Rhone-Poulenc (Frankreich). Alle Zellen
wurden kultiviert in „Dulbecco's modified Eagle's medium" (DMEM), ergänzt durch
1% L-Glutamin (GibcoBRL), 1% einer Mischung aus Penizillin, Streptomyzin
und Neomyzin (GibcoBRL) und 10% Serum von neugeborenen Kälbern (GibcoBRL)
im Falle von NIH 3T3 Zellen oder 10% fötalem Kälberserum (GibcoBRL) für die anderen
Zelllinien.
-
Expressionsvektoren
beinhaltend die cDNS, die für
Herpesvirus Thymidinkinase (HSV1, EHV4, EBV oder VZV) kodiert, und
im Leseraster mit dem Zeozin-Resistenz-vermittelnden Sh Ble-Gen fusioniert
ist, sind bereits früher
von Cazaux et al.21 beschrieben worden.
Die fusionierten Gene stehen unter der transkriptionellen Kontrolle
des viralen HSV1-TK-Promotors und des viralen Polyoma pYF441-Enhancers
(1-A).
-
Plasmide,
die ein HSV1-TK-Gen im Leseraster fusioniert mit dem E-GFP-Gen enthalten
(1-B), wurden vom beschriebenen Plasmid
durch -Austausch des Sh Ble-Gens via PCR gegen die E-GFP-Sequenz (Clontech,
Palo Alto, CA, USA) hergestellt.
-
DNS-Transfektion:
-
Zellen
wurden transfiziert mit den verschiedenen Plasmiden durch Verwendung
des Kalziumphosphatpräzipitationskit
(GibcoBRL). Nach 48 h phänotypischer
Expression wurden die Zellen in Selektionsmedium mit Zeozin (Cayla,
Toulouse, Frankreich) kultiviert: 25 μg/ml (3T3-Zellen), 50 μg/ml (143
B-Zellen) oder 100 μg/ml
(PANC-O2- und HCT 116-Zellen).
-
Die
Transfektion wurde durchgeführt
in 2 Petri-Schalen (Ø 100
mm). Unabhängige
Klone wurden gepickt und individuell vermehrt, oder in Kultur behalten
um eine Bulk-Kultur zu bekommen.
-
Zytotoxizitäts-Assay:
-
ACV,
GCV und BVDU-Toxizität
wurde quantitativ bestimmt durch Messung der Inhibition zellulärer Proliferation.
2.5 × 103 Zellen wurden pro Loch in 24-Loch-Platten
ausgesät.
24 h später
wurden sie dann für
7 Tage in Wirkstoff-haltigem Medium kultiviert. Die Wirkstoffkonzentrationen,
die im Bereich von 0.001 nM bis 100 μM lagen, wurden in dreifacher
Ausführung
getestet. Das Medium wurde jeden zweiten Tag gegen frisches DMEM
ausgetauscht. An Tag 6 wurden 1.5 μCI von [Methyl-3H]-Thymidin
(Amersham, UK) zu jedem Loch zugesetzt. Nach Waschschritten mit
Phosphat-gepufferter Saline (PBS pH 7.3), wurde die eingebaute Radioaktivität mit einem
Micro-Beta Plus Zähler
(EG&G Instruments
and Wallac, Turku, Finnland) bestimmt. Zytotoxizitätsdosen
wurden angegeben als IC50-Werte
(benötigte
Wirkstoffkonzentration zur Reduktion der Inkorporierung von [Methyl-3H]-Thymidin
um 50%) und die Selektivitätsindizes
wurden als IC50-Verhältnisse
der parentalen Zellen gegenüber
den transfizierten Zellen berechnet.
-
Lebensfähigkeits-Assay:
-
Parentale
und virale TK-exprimierende Zellen wurden zu 5 × 103 Zellen
pro Loch in 6-Lochplatten
ausplattiert. Nach 24 h wurden die Wirkstoffe in verschiedenen Konzentrationen
im Bereich von 0.01 bis 100 μM dem
Medium zugesetzt. Wirkstoff-haltiges Medium wurde alle 2 Tage ausgewechselt.
Nach 7 Tagen in Kultur wurde die Zelllebensfähigkeit analysiert durch das
Zählen
lebensfähiger
Zellen mittels Trypan Blau Ausschluss nach 7 Tagen in Kultur mit
GCV.
-
Western Blot-Analyse:
-
Zellen
wurden dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen und 106 transfizierte
Zellen wurden in Lysis-Puffer37 inkubiert.
Für die
SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurden Lysate von 1 × 105 Zellen pro Spur auf ein 10–12% Tricin-Polyacrylamidgel
geladen (Novex, San Diego, CA, USA), und aufgetrennte Proteine mittels
Elektroblotting auf eine Nitrozellulosemembran transferiert (Schleicher & Schuell, Dassel,
Deutschland). Um eine gleichmäßige Proteinbeladung
jeder Spur und einen korrekte Übertragung
sicherzustellen, wurden die Banden durch Färbung mit 0.3% Ponceau Rot-Farbstoff
visualisiert. Zeo-Fusionsproteine
wurden nachgewiesen mit gereinigten polyklonalen Kaninchen anti-Zeo
Antikörpern
(Cayla, Toulouse, Frankreich), gefolgt von Inkubation mit Antikörper gegen
Kaninchen IgG, der mit Meerrettichperoxidase gekoppelt ist. Die
Reaktion wurde visualisiert über
die BM Chemilumineszenz-Nachweisverfahren (Boehringer Mannheim,
Frankreich SA).
-
Dot Blot-Analyse:
-
Sukzessive
Verdünnungen
von zellulären
Extrakten wurden auf eine Nitrozellulosemembran getropft. Zeo-Fusionsproteine
wurden nachgewiesen mit Kaninchen anti-Zeo polyklonalen Antikörpern (Cayla,
Toulouse, Frankreich) gefolgt von einer Inkubation mit Antikörper gegen
Kaninchen IgG, der mit Meerrettichperoxidase (Boehringer Mannheim,
Frankreich SA) gekoppelt ist. Die Reaktion wurde wie in unter Western Blot-Analyse beschrieben
visualisiert.
-
Nukleotidanalyse mittels
schneller Protein-Flüssigchromatographie
(FPLC):
-
3 × 106 Zellen wurden für 7 h mit 1 μM [8-3H] GCV (3 Ci/mmol, Isotopchim, Frankreich)
oder [Methyl-3H]-Thymidin (5 Ci/mmol, Amersham,
UK) in einem finalen Volumen von 5 ml Medium inkubiert. Zellen wurden
mittels Trypsin-Behandlung abgelöst
und zweimal mit PBS gewaschen. Die Nukleotide wurden mit 1 ml eiskaltem
Methanol 60% über
Nacht bei –20°C extrahiert.
Die Proben wurden mittels schneller Flüssigchromatographie (FPLC,
Pharmacia-LKB Instruments,
Schweden) auf einer Anionen-Austauschersäule analysiert.38,39 Radioaktivität wurde
am Säulenausgang
mit einem Radiamatic Flo-one Beta A-500 Apparat (Packard, Meridan,
CT) gemessen, und die Peaks wurden mit Flo-one/Data Software analysiert.
-
Durchflusszytometrische
Analyse
-
tk(–) 3T3-Zellen
wurden mit dem Plasmid kodierend für das EHV4-TK/E-GFP-Fusionsprotein, transfiziert
und in HAT-Medium selektioniert. Nach einer Woche in Kultur wurde
die Fluoreszenz der transfizierten Zellen analysiert. Die Fluoreszenz-Analyse
wurde 2 Monate nach der Selektion wiederholt. Zellen wurden zweimal
mit PBS gewaschen und die Intensität der Fluoreszenz wurde direkt
auf einem FACSCalibur (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA) mit einem
525 nm Filter bestimmt und mit CellQuest Software analysiert.
-
Nukleosidanalogatoxizität auf Bulk-Zellkulturen,
die verschiedene Herpesvirus-Thymidinkinasen
exprimieren
-
Wir
haben Expressionsvektoren für
Herpesvirus Thymidinkinasen, die im Leseraster mit dem Zeozin-Resistenz-vermittelnden
Sh Ble-Gen fusioniert sind, verwendet (pUT-TKx) (1A).21 Die Verwendung solcher Vektoren erleichtert
die Selektion von transduzierten Zellen und den Nachweis von chimären Proteinen durch
Immunnachweis mittels anti-Sh polyklonalen Antikörpern. Die Funktionalität der von
diesen Vektoren exprimierten viralen TK ist bereits in Bakterien
und Hefen, denen endogene TK oder Thymidylatkinase Aktivität fehlt,
gezeigt worden.21 Wir haben zunächst diese
Gene in Maus-Fibroblasten
mit zellulärer
TK-Defizienz (tk(–) 3T3
Zellen) exprimiert und selektionierten die stabil transfizierten
Zellen über
ihre Resistenz gegenüber
Zeozin. Die Funktionalität
der viralen TK in Zellen wurde dann überprüft durch Analyse des Zellwachstums
in selektivem HAT-Medium und durch [Methyl-3H]-Thymidin
(3HT)-Einbau-Assays. Wie erwartet, während alle
untransfizierten Zellen in HAT starben, überlebten alle Transfektanten
und bauten 3HT (Daten nicht gezeigt) ein.
-
Selektionierte
Bulk-Populationen wurden dann auf ihre in vitro Sensitivität gegenüber Nukleosidanaloga
durch Messung der Inhibition der Zellproliferation im Vergleich
zu parentalen NIH 3T3-Zellen (Tabelle 1) untersucht. ACV IC50-Werte
waren ungefähr
15-fach niedriger in HSV1-, EHV4- und VZV-TK-exprimierenden Zellen
als im Vergleich zu den parentalen NIH-3T3-Zellen, und nur 4-fach
niedriger für
EBV-TK exprimierende Zellen. HSV1- und EHV4-TK exprimierende Zellen
waren 350- und 700-fach sensitiver gegenüber GCV als NIH-3T3 Zellen,
im Vergleich zu nur 7-fach für
VZV- oder EBV-TK-exprimierende Zellen. Im Gegensatz zu ACV und GCV
waren die IC50-Werte für
BVDU im selben Bereich für
alle Herpesvirus-TK-exprimierende Bulk-Zellen, zwischen 1300- und
3600-fach niedriger als für
NIH-3T3 Zellen.
-
Diese
Beobachtungen wurden ausgeweitet durch Verwendung einer zusätzlichen
Tumor-Mauszelllinie,
den Bauchspeicheldrüsentumorzellen
PANC-O2. Erneut wurde festgestellt, dass die IC50-Werte 3-fach niedriger
für EHV4-TK-
als für
HSV1-TK-exprimierende Bulk-Zellen
waren, 0.55 ± 0.07
bzw. 1.7 ± 0.5 μM (Durchschnitt
von zwei unabhängigen
Experimenten, Daten nicht gezeigt).
-
Tabelle
1: Zytotoxizität
von ACV, GCV und BVDU auf bulk-transfizierte und untransfizierte
tk(–)
3T3 Mauszellen. Die Wirkstofftoxizität wurde festgestellt durch
Messung der Inhibition der Zellproliferation. Zellen wurden kultiviert
in Wirkstoff-haltigem Medium für
7 Tage. [Methyl-3H]-Thymidin wurde am Tag
6 zugesetzt und die eingebaute Radioaktivität wurde gemessen. Zytotoxische
Dosen wurden angegeben als durchschnittliche IC50-Werte (50% inhibierende
Konzentration benötigt
um den [Methyl-3H]-Thymidin-Einbau um 50%
zu reduzieren) von 2 oder 3 Experimenten und die Selektivitätsindizes
wurden berechnet als IC50-Verhältnisse
der parentalen zu den transfizierten Zellen.
-
-
Toxizität der Nukleosidanaloga
auf HSV1-TK- und EHV4-TK-exprimierende Zellklone.
-
Innerhalb
der vier auf ihre Fähigkeit,
Zellen gegenüber
der Toxizität
von Nukleosidanaloga zu sensitivieren, getesteten Herpesvirus TK,
zeigten HSV1- und EHV4-TK die interessanteren Selektivitätsindizes.
Weil Bulk-Zellen ein Gemisch an Klonen verschiedener Sensibilitäten darstellen,
analysierten wir als nächstes
die Wirkstoffzytotoxizität
auf individuellen Klonen, die eine der zwei TK exprimieren.
-
Als
erstes analysierten wir das Herpesvirus-TK-Proteinexpressionsniveau
in mehreren Klonen mittels Western-Blot unter Verwendung polyklonaler
Antikörper
gegen Sh-Protein. Zellextrakte von 105 Zellen
wurden für
die Elektrophorese geladen. Banden, die mit EHV4-TK/ZEO (53 KDa) und HSV1-TK/ZEO (55
KDa) korrespondieren, konnten mit gleicher Intensität in den
getesteten vier EHV4-TK+ und vier HSV1-TK+ Klonen beobachtet werden
(2-A). Es gab keine nachweisbare Bande
in diesen Zellextrakten, die mit Sh-Protein alleine (20 KDa) korrespondieren
würde (Daten
nicht gezeigt). Eine schwächere
Bande von niedrigerem PM konnte ebenfalls in allen Extrakten von
HSV1-TK(+)-Zellen beobachtet werden. Diese Bande korrespondiert
mit einer Transkriptionsinitiation an einem bekannten kryptischen,
internen Promotor, die zur Translation eines verkürzten, aber
funktionellen Proteins führt.19-20,22
-
Wir
analysierten dann die Toxizität
von ACV, GCV und BVDU an diesen acht Klonen (Tabelle 2). Für ACV und
GCV war die Sensitivität
von EHV4-TK-exprimierenden Zellen statistisch wichtiger als die
von HSV1-TK-exprimierenden Zellen (p < 0.05 bzw. 0.01). HSV1- oder EHV4-TK-exprimierende
Klone zeigten die gleiche BVDU-Sensitivität.
-
Tabelle
2: Zytotoxizität
von ACV, GCV und BVDU auf HSV1-TK- und EHV4-TK-exprimierende murine tk(–) 3T3-Klone.
Die Sensitivität
von TK-exprimierenden Klonen gegenüber den Wirkstoffen wurde wie
in Tabelle 1 beschrieben getestet. Zytotoxischen Dosen wurden ausgedrückt als
durchschnittliche IC50-Werte aus 3 Experimenten.
-
-
Nukleosidanalogatoxizität auf humane
Bulk-Zellen, die HSV1-TK oder EHV4-TK exprimieren.
-
Da
der Metabolismus eines Nukleosidanalogons in den Zellen verschiedener
Spezies unterschiedlich sein könnte,23-25 analysierten wir deshalb die Effizienz
des Systems beim Abtöten
humaner Zellen.
-
Folglich
wurden humane tk(–)
Osteosarkoma 143B-Bulk-Zellen, die HSV1- oder EHV4-TK exprimieren,
hergestellt. Wir analysierten zunächst das Herpesvirus-TK-Proteinexpressionsniveau
für jede
Bulk-Kultur über
einen Dot-Blot unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers gegen
Sh-Protein (2-B). Es gab keine nachweisbare
Bande korrespondierend mit dem fusionierten Protein in tk(–) 143B-Zellextrakten.
Die gleiche Expression des fusionierten Proteins wurde in HSV1-
oder EHV4-TK-exprimierenden Zellen beobachtet.
-
Wir
untersuchten dann die Zellsensitivität gegenüber ACV, GCV und BVDU (3).
Die Toxizität
von ACV war ähnlich
in HSV1- und EHV4-TK-exprimierenden Zellen. Bemerkenswerterweise
waren EHV4-TK-exprimierende Zellen ungefähr 12-fach sensitiver gegenüber GCV
als HSV1-TK-exprimierende Zellen. Im Gegensatz dazu war die Toxizität von BVDU
größer in HSV1-TK
als in EHV4-TK-exprimierenden Zellen (3).
-
Diese
Beobachtungen wurden ausweitet auf eine zusätzliche Tumorzelllinie, nämlich humane
Kolonkarzinom HCT116-Zellen. Die IC50-Werte für GCV waren 3-fach niedriger
für EHV4-TK-
als für
HSV1-TK-exprimierende Zellen, 0.11 ± 0.02 bzw. 0.32 ± 0.08 μM (Durchschnittswerte ± SD für 3 unabhängige Experimente).
EHV4- und HSV1-TK-exprimierende
Zellen waren 485- und 170-fach sensitiver gegenüber GCV als HCT116-Zellen (der
Durchschnitt der IC50-Werte für
GCV war 53.4 ± 15 μM).
-
GCV-Phosphorylierung in
humanen Zellen, die HSV1-TK oder EHV4-TK exprimieren.
-
Um
zu verstehen, warum GCV in EHV4-TK-exprimierenden Zellen toxischer
ist als im Vergleich dazu in HSVI-TK-exprimierenden Zellen, analysierten
wir die GCV-Phosphorylierung
in tk(–)
143B und HSV1- oder EHV4-TK-exprimierenden Zeilen. Nach 7-stündiger Inkubation
mit radioaktiv-markiertem GCV oder Thymidin, wurden die Nukleotide
extrahiert und mittels FPLC analysiert.
-
Während in
den tk(–)
143B-Zellen keine Phosphorylierung von Thymidin nachweisbar war
(Daten nicht gezeigt), wurde Thymidin in beiden TK-exprimierenden
Zellen in ähnlicher
Weise phosphoryliert (4). Für GCV waren die Verhältnisse
der verschiedenen Phosphorylierungsformen in beiden TK-Zellen gleich,
während die
Gesamtmenge an intrazellulärem
GCV 5-fach höher
in EHV4-TK-exprimierenden Zellen war als in HSV1-TK-exprimierenden Zellen.
-
Funktionalität eines
EHV4-TK/E-GFP-Fusionsproteins.
-
Um
den Nachweis des Transgens in transfizierten Zellen oder Geweben
zu erleichtern, wurde das E-GFP-Gen im Leseraster an das 3' Ende des EHV4-TK-Gens
fusioniert und in einen Expressionsvektor kloniert (1-B).
Diese Konstruktion wurde dann in tk(–) 3T3-Zellen transfiziert,
gefolgt von einer FACS-Analyse von E-GFP positiven Zellen. Eine
Bulk-Zellkultur
mit 95% E-GFP-exprimierenden Zellen wurde erhalten. Die stabile
Expression und die duale Funktionalität des Transgens konnte gezeigt
werden über
die Fluoreszenzanalyse und das Überleben
in Gegenwart von HAT-Medium im Verlaufe 2-monatiger Zellkultur (5-A). Expression des EHV4-TK/E-GFP-Fusionsproteins
sensitivierte effizient diese Zellen gegenüber GCV, für das der IC50-Wert 0.6 μM war, im
Vergleich zu 30 μM
für tk(–) 3T3-Zellen
(5-B).
-
Wir
beabsichtigten die Wirksamkeit der momentanen, von Herpesviren abgeleiteten
TK-Systeme zur Zerstörung
von Zellen zu verbessern. Zu diesem Zweck wählten wir den Weg, die Wirksamkeit
alternativer TK-Gene in humanen Zellen festzustellen. Da wir die
Expressionsniveaus dieser Gene überwachen
mussten, wurden sie an sh ble fusioniert, das für ein Protein kodiert, das
Resistenz gegenüber
Zeozin vermittelt und das im Western Blot mittels verfügbarer polyklonaler
Antikörper
nachgewiesen werden kann.
-
Wir
verifizierten zunächst
die duale Funktionalität
der verschiedenen TK-ZEO-Fusionen
in eukaryotischen Zellen durch Transfektion von murinen oder humanen
Zellen mit fehlender endogener Thymidinkinaseaktivität. Selektion
mit Zeozin führte
immer zu resistenten Klonen, die alle überlebten, wenn sie später in Gegenwart
von HAT-Medium kultiviert wurden. Deshalb schlussfolgerten wir,
dass selbst wenn die Peptidfusionen in den Zellen nicht gespalten
würden,
alle Fusionsproteine bi-funktional wären. Das stimmt mit früheren Experimenten überein,
die gezeigt hatten, dass HSV1-TK seine Funktionalität nach einer
Amino- oder Carboxy-terminalen Fusion an verschiedene Proteine beibehält.21,24,26-28
-
Signifikante
Unterschiede in der Aktivität
der verschiedenen Herpes-TK wurden beobachtet. Diese Unterschiede
wurden sowohl in der Analyse von Bulk-Zellkulturen als auch von
unabhängigen
Klonen gefunden. Die Bulk-Kulturen stellen eine bessere Abschätzung der
gesamten Enzymaktivität
in einer polyklonalen Population zur Verfügung, die eine in situ transfizierte
Population in der prä-klinischen
und klinischen Situation imitiert, während die Klone eine Analyse
der Aktivität
in individuellen Zellen in Bezug auf das Expressionsniveau des Transgens
erlauben. Wir untersuchten die Toxizität von ACV, GCV und BVDU.
-
VZV-
und EBV-TK zeigten gar keine Vorteile gegenüber HSV1-TK, welches Nukleosidanalogon
auch immer verwendet wurde. Zwei aktuelle Studien zeigten das Potenzial
von VZV-TK als Selbstmord-Gen in humanen Brustkrebszellen29 und humanen Osteosarkomzellen.30 In diesen Artikeln lagen die Selektivitätsindizes und
IC50-Werte für
BVDU im Bereich von 0.06 bis 0.6 μM
auf recht ähnlichem
Niveau wie unsere Werte, aber es wurde kein Vergleich zwischen VZV
und HSV1-TK gezeigt.
-
Bemerkenswerterweise
waren EHV4-TK-exprimierende Zellen immer sensitiver gegenüber GCV
als HSVI-TK-exprimierende, egal ob Bulk-Kulturen oder Klone. Diese
verstärkte
Toxizität
war nicht auf einen Unterschied in den TK-Expressionsniveaus zurückzuführen, wie
mittels Western Blot festgestellt wurde. Das wird ferner auch von
der Beobachtung eines entgegengesetzten Effekts mit BVDU angedeutet,
der für HSV1-TK-exprimierende Zellen
toxischer ist, was zeigt, dass es eher einen qualitativen als einen
quantitativen Unterschied zwischen den Aktivitäten dieser Enzyme gibt.
-
Um
den möglichen
Mechanismus, der die verbesserte Sensitivität gegenüber GCV in EHV4-TK-exprimierenden
Zellen im Vergleich zu HSVI-TK-exprimierenden Zellen erklärt, zu untersuchen,
analysierten wir die GCV-Phosphorylierung mittels FPLC. Die Gesamtmenge
an intrazellulärem
GCV war 5-fach höher
in EHV4-TK- als in HSVI-TK-exprimierenden Zellen, während die
Anteile der verschiedenen Phosphorylierungsformen in beiden TK-Zellen ähnlich waren.
Derartige Unterschiede könnten
erklärt
werden mit der Aufnahme von Nukleosiden und deren Analoga, die,
wie berichtet worden ist, mit der TK-Expression korreliert. Tatsächlich,
die Aufnahme von Thymidin in tk(–) Escherichia coli ist proportional
zur Menge an vom heterologen HSVI-TK-Gen exprimierter TK-Aktivität.31 Ferner zeigten Säugetier HSV1-TK-exprimierende
Zellen eine höhere GCV-Aufnahme
und Phosphorylierung als Kontrolzellen.32 Da
wir ähnliche
TK-Expression in beiden TK(+)-Zellen (2-B)
nachgewiesen haben, konnte die größere Menge an intrazellulärem GCV
in EHV4-TK-exprimierenden Zellen mit einer größeren EHV4-TK-Aktivität gegenüber GCV
im Vergleich zu HSV1-TK-Aktivität
korreliert werden.
-
Der
Nachweis einer Genübertragung
könnte
erheblich erleichtert werden durch Marker, die einen schnellen und
effizienten Nachweis von erfolgreich transduzierten Zellen erlauben.
Das trifft vor allem auf zytoplasmatische Proteine zu. Es sind jedoch
keine geeigneten monoklonalen oder polyklonalen anti-EHV4-TK-Antikörper erhältlich.
Deshalb verwendeten wir das verstärkte grüne Fluoreszenzprotein (E-GFP)-Gen,
um ein EHV4-TK/E- GFP-Fusionsprotein
herzustellen. Die Expression von EGFP bleibt stabil über Monate
in transfizierten Zellen und kann einfach über Durchflusszytometrie überwacht
werden. Transfektion des Fusionsplasmid in Säugetierzellen erbrachte, dass
das Konstrukt funktional ist, dass die Zellen sowohl fluoreszieren
(95%) als auch sensitiv gegenüber
GCV sind. Dieses Ergebnis stimmt überein mit einer aktuellen Studie
von Liomas et al, die von einer dualen Funktionalität eines
HSV1-TK-Grünes
Fluoreszenzprotein-Fusionsgens berichteten.28 Diese
chimären
Selbstmord-/Marker-Gene sollten den Nachweis von transduzierten Zellen
dramatisch erleichtern. Das wäre
von besonderer Bedeutung in experimentellen Modellen. Diesbezüglich werden
Selbstmord-Gene häufig
in transgenen Mäusen
verwendet, um Modelle für
die konditionale Ablation spezifischer Zellpopulationen herzustellen.
-
Abhängig von
den Zelllinien war EHV4-TK3- bis 12-fach stärker als HSV1-TK. Solch ein
Unterschied erscheint signifikant, wenn man den klinischen Einsatz
von Selbstmord-Genen erwägt,
da die Behandlung von experimentellen Tumoren in Mäusen und
Ratten zeigt, dass die GCV-Dosierung oft kritisch für das Erreichen der
Wirksamkeit ist. Wenn es mit 10 mg/kg 2-mal pro Tag verabreicht
wird, was die übliche
Dosierung in Menschen ist, dann liegt die plasmatische GCV-Konzentration
im Bereich zwischen 0.44 und 2.2 μg/ml,33 und die Konzentrationen in der Gehirn
und Rückenmarksflüssigkeit
(Cerebrospinal Fluid; CSF) sind ungefähr 3-fach niedriger.34,35 Es ist deshalb möglich, dass die CSF/GCV-Konzentrationen
suboptimal sind für
die Behandlung von Gehirntumoren, die mit HSV1-TK transduziert sind.
Auf jedem Fall sollte eine verbesserte Effizienz des Enzyms zu einer
besseren Behandlungseffizienz und/oder Abnahme der verwendeten GCV-Dosis
führen. Letzterer
Punkt ist auch signifikant, weil GCV-Toxizität im Menschen anscheinend kumulativ
ist, abhängig
von der verabreichten Gesamtmenge (Cytovene® Produkt-Monographie).36
-
Zusammenfassend
unterstreichen diese Experimente die potenziellen Vorteile von EHV4-TK
als Selbstmordgen, sowohl für
experimentelle wie für
therapeutische Ansätze,
in vitro, ex vivo und in vivo.
-
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