JP2001031587A - ヒト細胞を処理するための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト細胞を処理するための方法と組成物を提
供すること。 【解決手段】 ウマヘルペスウイルス ４型（ＥＨＶ
４）チミジンキナーゼ・ポリペプチド又はそれをコード
する核酸の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉ
ｎ ｖｉｖｏにおいてヒト細胞をヌクレオシド類似体に
対して感受性にするための組成物の製造への使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおいてヒト細
胞を治療するための方法と組成物に関する。より詳しく
は、本発明はヒト細胞をヌクレオシド類似体に対して感
受性にするための改良された方法と組成物とに関する。
本発明は特にある一定のポリペプチド及び核酸の、特に
チミジンキナーゼ型の、条件自殺剤としての有利な性質
の発見に基づく。本発明は例えば実験生物学、治療、予
防，スクリーニング方法等のような、種々な技術分野に
おいて使用可能である。

【０００２】

【従来の技術】条件自殺遺伝子を発現する哺乳動物細胞
は、プロドラッグの毒性代謝産物への活性化によって選
択的に殺害されるか又は破壊される。ヘルペス単純ウイ
ルス１型チミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ）は
実験設定と臨床試験の両方において最も広範囲に用いら
れている自殺遺伝子である¹。ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子の
発現は腫瘍細胞を、アシクロビア（ＡＣＶ）、ガンシク
ロビア（ＧＣＶ）及びブロモビニル−デオキシウリジン
（ＢＶＤＵ）のような抗ウイルス剤に対して感受性にす
る。これらのヌクレオシド類似体はＨＳＶ１−ＴＫによ
って効果的にそれらの一リン酸エステル形に転化され、
次に宿主細胞キナーゼによって三リン酸エステル化合物
に転化される^2-4。延長ＤＮＡ中へのこれらの代謝産物
の組込みは、細胞死をもたらす延長を妨害する^5-8。Ｈ
ＳＶ１−ＴＫ／ＧＣＶ系は種々な動物モデルにおける移
植腫瘍^9-11並びに発癌物質誘導腫瘍¹²の退縮を誘導する
ために効果的であると判明している。これらの好ましい
結果に基づいて、幾つかの臨床遺伝子療法試験が、悪性
疾患¹³又は例えば移植片対宿主病のような他の増殖性疾
患に対するこの治療法の安全性及び効力を評価すること
を目的として、現在進行中であり、予備的な結果が現在
報告されている^14-17。

【０００３】増殖性細胞（例えば、腫瘍細胞）を殺害す
るＨＳＶ１−ＴＫ／ＧＣＶ系の効果にも拘わらず、治療
効果を最大化するため及び／又は治療方法を容易にする
ために、この系の改良を試みることが依然として重要視
されている。例えば、ＧＣＶは、緩慢な静脈内灌流によ
って投与され、患者の入院を必要とするという欠点を有
する。したがって、ＧＣＶプロドラッグと同じ効力を有
する、経口投与によるヌクレオシド類似体を発見するこ
とが重要であると考えられる。ＴＫによって見られる殺
害効果の効力を改良する方法を発見することも重要な成
果を表すと考えられる。これに関して、チミジンキナー
ゼの細胞レベルを高めるためにより強力なプロモーター
領域を用いることが、当該技術分野において提案されて
いる。リン酸化効力を高めるために幾つかの酵素の組み
合わせを用いることも示唆されている。さらに、ヌクレ
オシド類似体に対して改良されたアフィニティ又は活性
を有する、ＨＳＶ−１ ＴＫの突然変異体又は誘導体を
生成し、スクリーニングすることも提案されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は今回、上記問
題に対処する、さらに詳しくは、ヌクレオシド類似体に
対するヒト細胞の改良された感受性を与える、代替方法
と組成物を提供する。さらに詳しくは、出願人は今回予
期せぬことに、特定種類のチミジンキナーゼ、即ち、ウ
マヘルペスウイルス４型チミジンキナーゼ・ポリペプチ
ド又は核酸によって、ヒト細胞においてヌクレオシド類
似体に対する改良された感受性が得られうることを実証
した。特に、野生型ウマヘルペスウイルス４型チミジン
キナーゼ（ｗｔＥＨＶ４−ＴＫ）又はそのバリアントを
用いることによって、ヒト細胞がヌクレオシド類似体に
対してＨＳＶ−１ ＴＫによるよりも３〜１２倍感受性
が高くなることを、出願人は実証している。得られた結
果は、ＥＨＶ４−ＴＫが、実験用途、生物学用途、スク
リーニング用途又は治療用途を含めた、多くの用途のた
めにＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子に対する非常に重要な代替自
殺遺伝子を提供することを示す。

【０００５】

【課題を解決するための手段】それ故、本発明の１つの
目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎｖ
ｉｖｏにおいてヒト細胞をヌクレオシド類似体に対して
感受性にする組成物の製造のために、ウマヘルペスウイ
ルス４型（ＥＨＶ４）チミジンキナーゼ・ポリペプチド
又はそれをコードする核酸を用いることにある。本発明
の他の目的は、ヒト細胞をヌクレオシド類似体に対して
感受性にする方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ
ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ヒト細胞をウ
マヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ４）チミジンキナーゼ
・ポリペプチド又はそれをコードする核酸に接触させる
ことを含む前記方法にある。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の関係において、ウマヘル
ペスウイルス４型チミジンキナーゼ・ポリペプチド
（“ＥＨＶ４−ＴＫ”）なる用語は、野生型ＥＨＶ４−
ＴＫ又はその任意の生物学的活性フラグメント又はバリ
アントを意味する。野生型ＥＨＶ４−ＴＫは単離され、
特徴付けられており、そのアミノ酸配列は当該技術分野
において公表されている¹⁸。このポリペプチドはＥＨＶ
４−感染細胞から、例えば組換え産生、人為的合成又は
精製のような当該技術分野において知られた、任意の慣
用的方法によって得ることができる。野生型ＥＨＶ４−
ＴＫの生物学的活性フラグメント又はバリアントとは特
に、例えばＧＣＶ、ＡＣＶ又はＢＶＤＵのような、以下
で定義するヌクレオシド類似体をリン酸化する能力を有
するポリペプチドを意味する。

【０００７】ＥＨＶ４−ＴＫのフラグメントは例えば化
学的若しくは酵素による切断と続いての該フラグメント
の単離、切頭核酸からの組換え産生、人為的ポリペプチ
ド合成等のような、任意の慣用的方法によって製造する
ことができる。フラグメントは野生型ＥＨＶ４−ＴＫの
内部フラグメント又はＣ−末端若しくはＮ−末端フラグ
メント又はこれらの組み合わせのいずれでもよい。好ま
しくは、本発明によるフラグメントは野生型ＥＨＶ４−
ＴＫの全アミノ酸配列の少なくとも４０％、より好まし
くは少なくとも５０％を保有する。好ましい実施態様で
は、フラグメントは野生型ＥＨＶ４−ＴＫの全アミノ酸
配列の少なくとも７５％、より好ましくはその少なくと
も８５％を含む。野生型ＥＨＶ４−ＴＫのバリアント
は、一次若しくは二次構造の任意の突然変異（単数又は
複数）、置換（単数又は複数）、付加（単数又は複数）
及び／又は他の修飾（単数又は複数）によって野生型Ｅ
ＨＶ４−ＴＫから誘導される任意の生物学的活性ポリペ
プチドを含む。バリアントはＥＨＶ４における突然変異
又は多型に由来する天然バリアント並びに、例えば、異
種アミノ酸配列に融合したＥＨＶ４−ＴＫを含むハイブ
リッド・ポリペプチドを包含する。異種なる用語は、Ｅ
ＨＶ４とは異なる起源を有する、１個又は数個のアミノ
酸残基を含む、任意のアミノ酸配列を意味する。このよ
うな異種アミノ酸配列は、例えばポリペプチドの安定性
を高めるため若しくは分泌させるため又はポリペプチド
を標識するために、人為的に作製された配列であること
ができる。これに関連して、本発明はまた、例えば強化
グリーン蛍光タンパク質（Ｅ−ＧＦＰ）、ルシフェラー
ゼ、β−Ｇａｌ、Ｔｈｙ−１タンパク質、クロラムフェ
ニコール−アセチル−トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、
及び抗生物質（単数又は複数種類）に対する耐性を与え
る細胞タンパク質のような、マーカータンパク質に融合
したＥＨＶ４−ＴＫ部分を含む融合ポリペプチドをも開
示する。この融合は一般に、ＥＨＶ４−ＴＫポリペプチ
ドをコードする核酸領域と、例えばマーカー部分のよう
な、異種アミノ酸配列をコードする核酸領域との遺伝的
カップリングによって形成される。核酸は、２つの領域
が同時に発現されて、キメラポリペプチドを生成するよ
うに、フレームとして融合される。

【０００８】突然変異又は置換バリアントは、例えば特
異的突然変異誘発、特異的プライマーによる増幅等のよ
うな既知方法によって製造することができる。欠失も例
えば制限酵素を用いて慣用的方法によって導入すること
ができる。バリアントがｗｔＥＨＶ４−ＴＫの一次構造
の少なくとも８０％を保有することが好ましい。より好
ましいバリアントはｗｔＥＨＶ４−ＴＫに比べて多くと
も５個の修飾アミノ酸残基を含有する。

【０００９】他のバリアントは非天然グリコシル化又は
その他の翻訳後修飾を含むことができる。

【００１０】前述したように、ＥＨＶ４−ＴＫのバリア
ントは上述したような修飾［欠失（単数又は複数）、突
然変異（単数又は複数）、付加（単数又は複数）等］の
１個のみ又は幾つかを含むことができる。

【００１１】野生型ＥＨＶ４−ＴＫの上記フラグメント
又はバリアントの生物学的活性は、慣用的な方法によっ
て評価することができる。特に、前記ポリペプチドがヌ
クレオシド類似体をリン酸化する能力は、前記ポリペプ
チドを例えばアシクロビア又はガンシクロビアのような
ヌクレオシド類似体と接触させ、リン酸化されたアシク
ロビアまたはガンシクロビアを検出することによって測
定することができる。好ましくは、（ｉ）細胞中にポリ
ペプチドをコードする核酸構築体を、前記細胞における
前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で導入し；
（ｉｉ）前記細胞を例えばアシクロビア又はガンシクロ
ビアのようなヌクレオシド類似体と接触させ、（ｉｉ
ｉ）前記細胞に対するヌクレオシド類似体の毒性を評価
することによって、試験を実施する。適当である場合に
は、観察される毒性レベルを野生型ＥＨＶ４−ＴＫをコ
ードする核酸による同様な実験において観察される標準
毒性レベルに比較することができる。一例として、前記
試験を例えば線維芽細胞のような、任意の分割細胞によ
って行うこともできる。好ましい生物学的活性フラグメ
ント又はバリアントは、上記試験における野生型ＥＨＶ
４−ＴＫの毒性の少なくとも７５％を保有する。

【００１２】上述したように、本発明はウマヘルペスウ
イルス４型（ＥＨＶ４）チミジンキナーゼ・ポリペプチ
ド又はそれをコードする核酸を用いることによって実施
することができる。核酸の使用は好ましい実施態様を表
す。本発明の核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであることがで
き、好ましくは、ｃＤＮＡ又は合成領域を含む人為的Ｄ
ＮＡである。野生型ＥＨＶ４−ＴＫをコードする核酸は
クローン化されて、配列決定されている¹⁸。本発明のＥ
ＨＶ４−ＴＫポリペプチドをコードする核酸は、例えば
ライブラリー・スクリーニング、人為的合成、ゲノムＤ
ＮＡからのクローニング等のような、慣用的方法によっ
て得ることができる。本発明のＥＨＶ４−ＴＫポリペプ
チドをコードする特定の核酸は、野生型ＥＨＶ４−ＴＫ
をコードする核酸とハイブリダイズし、上記で定義した
ような生物学的活性ＥＨＶ４−ＴＫポリペプチドをコー
ドする任意の核酸である。ハイブリダイゼーションは好
ましくは、例えば４０℃、５０％ホルムアミド、５ＸＳ
ＳＣ；１ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ、５５〜６５℃における
洗浄のような、当業者（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等）に知られ
た緊縮条件下で実施する。本発明の他の特定の核酸は、
発現条件を改良するように修飾した野生型ＥＨＶ４−Ｔ
Ｋをコードする核酸である。特に、本発明の好ましい核
酸はそれに含有される任意の隠れたプロモーターを不活
化するように修飾される。実際に、チミジンキナーゼ遺
伝子が隠れたプロモーターを含有し、これが哺乳動物細
胞における該チミジンキナーゼ遺伝子の発現を妨害する
ことが観察されている。特に、隠れたプロモーターの存
在はしばしば、低い生物学的活性を有する又は生物学的
活性を有さず、可能な副作用を有する切頭形のチミジン
キナーゼの発現を生じる（これに関しては、参考文献１
９〜２０を参照のこと）。本発明の好ましい核酸はＥＨ
Ｖ４−ＴＫポリペプチドをコードする核酸であり、この
核酸は隠れたプロモーターを有さない。このような核酸
は（ｉ）核酸配列中の隠れたプロモーターを同定して、
（ｉｉ）例えば翻訳による中立修飾及び／又は欠失（単
数又は複数）によって核酸配列を修飾することによっ
て、作製することができる。実施例において開示するよ
うに、得られた核酸を哺乳動物細胞、特にヒト細胞にお
ける改良された発現に関して検査することができる。本
発明の特定の核酸はＥＨＶ４−ＴＫ遺伝子の５’領域に
欠失を含み、前記欠失は哺乳動物細胞における発現増加
を可能にする。

【００１３】好ましくは、本発明のＥＨＶ４−ＴＫポリ
ペプチドをコードする核酸は、例えば、コード配列の
５’側に配置されたプロモーター領域と、その３’側に
配置された終止コドンとを含む核酸構築体に含まれる。
このような核酸構築体は例えばプラスミドベクター、ウ
イルスベクター（即ち、組換えウイルス）、人為的染色
体、エピソーム等のようなベクターの一部でありうる。

【００１４】好ましい実施態様では、本発明は上記で定
義したようなＥＨＶ４−ＴＫポリペプチドをコードする
核酸を含むベクターを用いる。さらに一層好ましくは、
このようなベクターはプラスミド又はウイルスベクタ
ー、例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベ
クター、ＡＡＶ、ヘルペスウイルスベクター若しくはワ
クシニアウイルスベクターである。これに関連して、本
発明の特定の１実施態様は、ＥＨＶ４−ＴＫポリペプチ
ドをコードする核酸を含有する組換えウイルスを含む培
地上澄み液を用いる。本発明の核酸を提供する他の特定
の方法は、ＥＨＶ４−ＴＫポリペプチドをコードする核
酸を含有する組換えウイルスを産生する細胞の使用を含
む。これに関連して、ウイルス・パッケージング細胞、
特にレトロウイルス又はアデノウイルス・パッケージン
グ細胞を含む、任意の組成物を用いることができる。ウ
イルス上澄み液又はウイルス・パッケージング細胞の使
用が本発明の好ましい実施方法を表す。

【００１５】上述したように、本発明はヒト細胞をヌク
レオシド類似体に対して感受性にするための方法と組成
物とに関する。ヌクレオシド類似体なる用語は、リン酸
化されたときに、延長ＤＮＡ鎖中に組込まれて、ＤＮＡ
の複製及び／又は転写を妨害することができる任意の化
合物を意味する。好ましくは、本発明のヌクレオシド類
似体は、チミジンキナーゼによって、特にＨＳＶ−１
ＴＫによって一リン酸化ヌクレオシド類似体に転化され
ることができる任意の化合物である。このようなヌクレ
オシド類似体の例は、例えばガンシクロビア（ＧＣ
Ｖ）、アシクロビア（ＡＣＶ）及びブロモビニル−デオ
キシウリジン（ＢＶＤＵ）を包含する。これらのヌクレ
オシド類似体はＨＳＶ−１ ＴＫによってそれらの一リ
ン酸化形に効果的に転化され、次に宿主細胞キナーゼに
よって三リン酸化化合物に転化される。延長するＤＮＡ
中へのこれらの化合物の組込みは延長を妨害して、アポ
トーシスによる細胞死を生じる（Ｂａｌｚａｒｉｎｉ，
１９８９；Ｆｕｒｍａｎ，１９８０；Ｓｔ Ｃｌａｉ
ｒ，１９８７）。ヌクレオシド類似体の他の例は、ＥＨ
Ｖ４−ＴＫによってリン酸化されることができるピリミ
ジン又はプリンヌクレオシド（既知抗ウイルス薬又は合
成製品）から誘導される全ての化合物である。

【００１６】したがって、本発明は、細胞をヌクレオシ
ド類似体に対して感受性にする他の組成物と方法を提供
する。感受性とは、前記ヌクレオシド類似体の存在下
で、処理された細胞が一般にアポトーシスによって破壊
又は殺害されることを意味する。それ故、本発明は標的
細胞を破壊する改良方法をも提供する。本発明の１つの
利点は、処理の予想外に高い感受性を得ることが出来る
ことにある。実際に、本発明者は今回、本発明のポリペ
プチド又は核酸構築体をヒト細胞に接触させるときに、
前記細胞の非常に効果的な破壊をヌクレオシド類似体の
存在下で達成することができることを示している。特
に、実施例に示した結果は、ＥＨＶ４−ＴＫポリペプチ
ドを発現するヒト細胞が例えばＧＣＶのようなヌクレオ
シド類似体に対して、ＨＳＶ１−ＴＫを発現するヒト細
胞よりも３〜１２倍感受性が高いことを実証している。
換言すると、本発明は、標的細胞の破壊に用いられる、
例えばＧＣＶのような、ヌクレオシド類似体の用量を著
しく減ずることを可能にする。

【００１７】これに関連して、本発明の他の目的は、ヒ
ト細胞（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ又はｉｎ ｖ
ｉｖｏ）を破壊する（例えば、殺害する）ための組成物
の製造にＥＨＶ４−ＴＫポリペプチド又はそれをコード
する核酸を用いることにある。本発明はまた、ヒト細胞
を殺害する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉ
ｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおける前記ヒト細胞をＥＨＶ
４−ＴＫポリペプチド又はそれをコードする核酸に接触
させ、さらに前記細胞又はそれらの子孫（プロジェニ）
をヌクレオシド類似体に接触させることを含む前記方法
にある。

【００１８】ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅ
ｘ ｖｉｖｏにおいて、本発明を用いることができる。
本発明を用いて、所定細胞を選択目的、欠失目的、実験
用又は治療用途のいずれかのために殺害することができ
る。

【００１９】本発明は、自然分割細胞、病的分割細胞又
は誘導分割細胞を含めた、多様な種類のヒト細胞によっ
て実施することができる。自然分割細胞は、それらのラ
イフサイクル中に規則的に分割する細胞である。誘導分
割細胞は、自然には分割しないが、刺激されて分割する
ことができる細胞である。本発明の好ましい治療用途
は、増殖性ヒト細胞、より好ましくは異常に増殖するヒ
ト細胞の処理にある。特定の例示はヒト腫瘍細胞の処理
（即ち、破壊及び／又は殺害）である。これに関連し
て、例えば頭部及び頚部癌、肺癌（特に、非小細胞肺
癌）、神経膠芽腫、黒色腫、胸部癌、肝臓癌、卵巣癌、
前立腺癌、脳腫瘍等のような、種々な充実腫瘍細胞を挙
げることができる。本発明によって処理することができ
る、ヒト細胞の他の例は、異常に増殖するＴリンパ球の
特異的クローン、例えば自己免疫疾患又は移植片対宿主
疾患に関与するＴリンパ球のクローンによって表され
る。

【００２０】したがって、特定の実施態様では、本発明
はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖ
ｏにおいてヒト腫瘍細胞を殺害するための組成物の製造
にウマヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ４）チミジンキナ
ーゼ・ポリペプチド又はそれをコードする核酸を用いる
ことにある。本発明はまた、ヒト腫瘍細胞を殺害する方
法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉ
ｎ ｖｉｖｏにおいて前記ヒト腫瘍細胞をウマヘルペス
ウイルス４型（ＥＨＶ４）チミジンキナーゼ・ポリペプ
チド又はそれをコードする核酸と接触させ、さらに前記
細胞又はそれらの子孫をヌクレオシド類似体と接触させ
ることを含む前記方法にある。

【００２１】他の特定の実施態様では、本発明はｉｎ
ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおい
てヒトＴリンパ球を殺害するための組成物の製造にウマ
ヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ４）チミジンキナーゼ・
ポリペプチド又はそれをコードする核酸を用いることに
ある。本発明はまた、ヒトＴリンパ球を殺害する方法で
あって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ
ｖｉｖｏにおいて前記ヒトＴリンパ球をウマヘルペスウ
イルス４型（ＥＨＶ４）チミジンキナーゼ・ポリペプチ
ド又はそれをコードする核酸と接触させ、さらに前記細
胞又はそれらの子孫をヌクレオシド類似体と接触させる
ことを含む前記方法にある。

【００２２】上記で説明したように、本発明はｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘｖｉｖｏにおいて実
施することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉ
ｖｏ用途では、本発明を次の手順で実施することができ
る。

【００２３】処理すべき（即ち、ヌクレオシド類似体に
対して感受性にすべき）細胞群を用意する。これらの細
胞を任意の適当なデバイス（例えば、プレート、皿、フ
ラスコ、ボトル等）において、好ましくは無菌条件下、
任意の慣用的培地（ＲＰＭＩ，ＤＭＥＭ等）中で培養し
て維持することができる。次に、細胞を上記で定義した
ようなＥＨＶ４−ＴＫポリペプチド又は核酸と接触させ
る。これに関連して、細胞を細胞の直接インキュベーシ
ョンによってＥＨＶ４−ＴＫポリペプチド又は核酸と接
触させることができる。このインキュベーションはＥＨ
Ｖ４−ＴＫポリペプチド又は核酸を細胞によって又は細
胞の少なくとも一部によって吸収させる。このインキュ
ベーションは、細胞によるＥＨＶ４−ＴＫポリペプチド
又は核酸の吸収を高めるような、促進剤又は促進条件の
存在下で実施することができる。このような促進剤は、
例えば、任意のカチオン性脂質、ポリマー、リポソー
ム、リン酸カルシウム沈殿等である。インキュベーショ
ンはまた、例えば電界、遺伝子ガン等のような物理的処
理を含むこともできる。本発明の特定の実施態様では、
ベクター中に含有されるＥＨＶ４−ＴＫ核酸を用いる。
より好ましい実施態様では、この核酸はウイルスベクタ
ー（又はそれから産生される組換えウイルス）中に含有
される。組換えウイルスの使用は、これらの粒子の自然
の感染力のために、特に有利である。好ましい組換えウ
イルスは例えば組換えレトロウイルス、アデノウイル
ス、ＡＡＶ又はヘルペスウイルスを包含する。これらの
ベクターの作製方法は当業者に知られている。

【００２４】特定の実施態様では、このように、細胞を
ＥＨＶ４−ＴＫ核酸を含むベクターに、より好ましくは
ＥＨＶ４−ＴＫ核酸を含む組換えウイルスに接触させる
ことによって、細胞をヌクレオシド類似体に対して感受
性にする。

【００２５】これに関連して、本発明は特に、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｖｏにおいてヒ
ト細胞をヌクレオシド類似体に対して感受性にする方法
であって、ヒト細胞をＥＨＶ４−ＴＫ核酸を含むベクタ
ーに、より好ましくはＥＨＶ４−ＴＫ核酸を含む組換え
ウイルスに接触させることを含む前記方法に関する。イ
ンキュベーション時にＥＨＶ４−ＴＫ核酸を組込んだ細
胞はヌクレオシド類似体に対して感受性であり、同時に
他の周囲細胞もＴＫのバイスタンダー効果のために感受
性になる。

【００２６】上述したような組換えウイルスと細胞との
接触は、組換えウイルスを含む、培養上澄み液、例えば
精製溶液のような富化溶液若しくは懸濁液と共に細胞を
インキュベーションすることによって、又は組換えウイ
ルスを産生する産生細胞と該細胞とを同時培養すること
によって達成することができる。

【００２７】この接触工程は、インキュベーション条件
に依存して、７２時間以上まで続けることができる。次
に、細胞を任意の既知方法によって回収することができ
る。必要な場合には、実際にＥＨＶ４−ＴＫポリペプチ
ド又は核酸を含有する細胞を本質的に含む細胞群を得る
ための選択工程を細胞に対して行うことができる。これ
に関連して、インキュベーション条件と細胞群とに依存
して、選択工程前のトランスフェクト細胞の割合は５％
からほぼ９９％まで変化しうる。回収された細胞は洗浄
し、新鮮な培地に入れて、任意の適当な条件下（冷凍、
凍結乾燥等）で貯蔵することができる。

【００２８】処理済み細胞を殺害するために、次に細胞
をヌクレオシド類似体、即ち、処理済み細胞によって毒
性分子に転化される化合物（延長ＤＮＡへの組込みによ
って）とさらに接触させる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ使用で
は、任意の適当なデバイスにおいて細胞を任意の適当な
用量のヌクレオシド類似体と接触させることができる。
この処理は増殖性細胞のスクリーニング、特異的細胞群
の除去（即ち、枯渇）、プロモーター領域の活性評価等
のために実施することができる。ｅｘ ｖｉｖｏ適応で
は、処理済み細胞をいったん対象に注入してから、ヌク
レオシド類似体処理を行うこともできる。この実施態様
では、用量は本質的に、ｉｎ ｖｉｖｏ使用に関して以
下で述べる通りである。

【００２９】実際に、本発明をｉｎ ｖｉｖｏで行うた
めには、ＥＨＶ４−ＴＫポリペプチド又は核酸をそれを
必要とする対象に直接投与することによって、細胞をＥ
ＨＶ４−ＴＫポリペプチド又は核酸と接触させる。投与
は任意に適当な経路（動脈内、静脈内、筋肉内、腫瘍
内、皮膚から等）によって行うことができる。増殖性細
胞、特に腫瘍細胞の処理のためには、ＥＨＶ４−ＴＫポ
リペプチド又は好ましくは核酸を、好ましくは静脈内、
動脈内又は腫瘍内注入によって投与し、より好ましくは
腫瘍内注入によって既知方法に従って投与する。ＥＨＶ
４−ＴＫ核酸の投与量は当業者によって、ＨＳＶ１−Ｔ
Ｋ遺伝子による先行技術臨床試験の教えに基づいて調節
することができる。

【００３０】これに関連して、核酸は例えば０．１〜１
０００μｇ／投与で注入することができる。組換えウイ
ルスに関しては、１０³〜１０⁹ｐｆｕを投与時に注入す
ることができる。パッケージング細胞を用いている場合
には、１０⁴〜１０⁹細胞を注入することが好ましい。

【００３１】標的細胞がヌクレオシド類似体に対して感
受性になったならば、これらの細胞をヌクレオシド類似
体とのさらなる接触によって殺すことができる。

【００３２】これに関連して、ヌクレオシド類似体を対
象に種々なプロトコールと種々なタイムフレームに従っ
て投与することができる。一般に、ヌクレオシド類似体
は灌流、動脈内経路、静脈内経路又は皮膚経路によって
投与される。ヌクレオシド類似体の慣用的な投与量は一
日に１〜５０ｍｇ／ｋｇ、特に、約１０ｍｇ／ｋｇ、一
日二回である。ヌクレオシド類似体はＧＣＶ、ＡＣＶ、
ＢＶＤＵ又は上述したような任意の他の化合物であるこ
とができる。経口投与も考えられる。例えば、腫瘍細胞
の処理のためには、ヌクレオシド類似体を通常、ＥＨＶ
４−ＴＫポリペプチド又は核酸の投与後間もなく、１〜
１５日間から成る期間にわたって投与する。例えば特異
的なＴ細胞クローンのような、他の細胞に対しては、例
えばこれらの特定の標的Ｔ細胞クローンが増殖する場合
（即ち、ＧＶＨＤ、自己免疫疾患等）のみ、ヌクレオシ
ド類似体を投与する。

【００３３】本発明はまた、ヒト細胞増殖性障害の治療
用薬剤組成物であって、ウマヘルペスウイルス４型（Ｅ
ＨＶ４）チミジンキナーゼ・ポリペプチド又はそれをコ
ードする核酸と製薬的に受容される賦形剤とを含む前記
薬剤組成物に関する。好ましい実施態様では、薬剤組成
物は例えば上記で定義したようなウイルスベクターのよ
うな上記核酸を含む。他の実施態様では、薬剤組成物は
例えばレトロウイルス産生細胞のような組換えウイルス
産生細胞を含む。

【００３４】好ましくは、本発明の薬剤組成物はさら
に、同時に又は別々に投与されるヌクレオシド類似体を
も含む。本発明はまた、上記で定義したようなＥＨＶ４
−ＴＫ核酸を含有するヒト細胞を含む組成物にも関す
る。

【００３５】本発明の他の態様と利点は以下の実験部に
提示するが、これらは例示と見なすべきであり、本発明
の範囲を限定するものと見なすべきではない。

【００３６】

【実施例】図面の説明 図１：発現ベクターのマップ （Ａ）Ｃａｚａｕｘ等に述べられているプラスミドは、
ゼオシン耐性を与えるＳｈｅ ｂｌｅ遺伝子とフレーム
内で融合したヘルペスウイルスＴＫ（ＨＳＶ１、ＥＨＶ
４、ＥＢＶ又はＶＺＶ）をコードするｃＤＮＡを含む。
（Ｂ）融合タンパク質ＥＨＶ４−ＴＫ／Ｅ−ＧＦＰをコ
ードするベクターのマップ。下線を引いた配列はチミジ
ンキナーゼとゼオシン耐性タンパク質又はＥ−ＧＦＰと
の間の５’〜３’アームに相当する。

【００３７】図２：トランスフェクト細胞における融合
ＴＫ／ＺＥＯタンパク質発現の分析 （Ａ）ｔｋ（−）３Ｔ３安定クローンにおけるＨＳＶ１
−及びＥＨＶ４−ＴＫタンパク質レベルを示すウェスタ
ン・ブロット分析。（Ｂ）トランスフェクト及び非トラ
ンスフェクトｔｋ（−）１４３Ｂ細胞におけるＴＫ発現
のドット・ブロット分析。融合タンパク質は精製ウサギ
抗Ｓｈポリクローナル抗体によって示した。

【００３８】図３：ＨＳＶ１−又はＥＨＶ４−ＴＫによ
ってトランスフェクトしたヒトｔｋ（−）１４３Ｂ細胞
に対するＡＣＶ、ＧＣＶ及びＢＶＤＵの細胞傷害活性毒
性はＩＣ５０平均値±ＳＤとして表す。３回の独立した
実験に関して得た平均値を各ヒストグラムの頂部に示
す。

【００３９】図４：トランスフェクト及び非トランスフ
ェクトｔｋ（−）１４３Ｂ細胞におけるチミジン及びＧ
ＣＶリン酸化 細胞を放射能標識したチミジン又はＧＣＶと共にインキ
ュベートし、異なるリン酸化形をＦＰＬＣ分析によって
分離した。ｔｈｙ−ＭＰ、ｔｈｙ―ＤＰ及びｔｈｙ−Ｔ
Ｐの割合はそれぞれ、ＨＳＶ１−ＴＫ発現細胞では２
９．３、２７．５及び３９．２％であり、ＥＨＶ４−Ｔ
Ｋ発現細胞では３６．８、２７．５及び２８．８％であ
った。ＧＣＶ−ＭＰ、ＧＣＶ−ＤＰ及びＧＣＶ−ＴＰの
割合はそれぞれ、ＨＳＶ１−ＴＫ発現細胞では１５．
５、３６．５及び４５％であり、ＥＨＶ４−ＴＫ発現細
胞では２３．９、２９．３及び４５％であった。

【００４０】図５：ＥＨＶ４−ＴＫ／Ｅ−ＧＦＰ融合タ
ンパク質の二重機能性の分析 （Ａ）ｔｋ（−）３Ｔ３トランスフェクト及び非トラン
スフェクト細胞におけるＥ−ＧＦＰ発現。Ｅ―ＧＦＰ遺
伝子と融合したＥＨＶ４−ＴＫ遺伝子（図１−Ｂ）をｔ
ｋ（−）３Ｔ３細胞にトランスフェクトし、Ｅ−ＧＦＰ
陽性細胞をＦＡＣＳ分析によって検出した。トランスフ
ェクションの１週間後（１）と、ＨＡＴ培地における２
か月間培養後（２）にＥ−ＧＦＰ発現を測定した。
（Ｂ）トランスフェクト及び非トランスフェクト細胞に
おけるＧＣＶ毒性。結果は、ＧＣＶなしで増殖させた細
胞に比較して、生存細胞の％として表現した。

【００４１】材料と方法 化学物質 アシクロビア（ＡＣＶ、［９−（２−ヒドロキシエトキ
シメチル）グアニン］Ｚｏｖｉｒａｘ（登録商標））、
ガンシクロビア（ＧＣＶ、［９−（１，３−ジヒドロキ
シ−２−プロポキシメチル）グアニン］Ｃｙｍｅｖａｎ
（登録商標））、ブロモビニルデオキシウリジン（ＢＶ
ＤＵ、（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオ
キシウリジン）は、それぞれ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ（Ｉｓ
ｓｙ Ｉｅｓ−Ｍｏｕｌｉｎｅａｕｘ，フランス）、Ｓ
ｙｎｔｅｘ（パロアルト，カルフォルニア州、米国）及
びＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（セントルイ
ス、ミズーリ州、米国）から購入した。

【００４２】細胞系とプラスミド 内因性ＴＫ（ｔｋ（−）３Ｔ３）活性を有さないネズミ
ＮＩＨ３Ｔ３細胞はアメリカン タイプ カルチャ コ
レクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックビル、メリーラ
ンド州、米国）から、ヒトｔｋ（−）１４３Ｂ（ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ８３０３）及びＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ２４７）細胞と同様に入手した；ネズミ膵臓腫瘍細
胞系、ＰＡＮＣ−Ｏ２はＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ
（フランス）から提供された。全ての細胞を、１％Ｌ−
グルタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、１％ペニシリンとス
トレプトマイシンとネオマイシンとの混合物（Ｇｉｂｃ
ｏＢＲＬ）及びＮＩＨ３Ｔ３細胞に対しては１０％ウシ
新生仔血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）又は他の細胞系に対し
ては１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イー
グル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。

【００４３】ゼオシン耐性を与えるＳｈ Ｂｌｅ遺伝子
とフレーム内で融合したヘルペスウイルスＴＫ（ＨＳＶ
１、ＥＨＶ４、ＥＢＶ又はＶＺＶ）をコードするｃＤＮ
Ａを含む発現ベクターは既にＣａｚａｕｘ等によって述
べられている²¹。融合遺伝子はＨＳＶ１−ＴＫウイルス
プロモーターと、ウイルス・ポリオーマｐＹＦ４４１エ
ンハンサーとの転写制御下にある（図１−Ａ）。

【００４４】Ｅ−ＧＦＰ遺伝子とフレーム内で融合した
ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を含有するプラスミド（図１−
Ｂ）を、Ｅ−ＧＦＰ配列によるＳｈ Ｂｌｅ遺伝子のＰ
ＣＲ置換によって表されるプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ，パロアルト，カルフォルニア州、米国）から構築し
た。

【００４５】ＤＮＡトランスフェクション リン酸カルシウム沈殿キット（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用
いて、細胞を種々なプラスミドによってトランスフェク
トした。表現型発現の４８時間後に、細胞をＺｅｏｃｉ
ｎ（Ｃａｙｌａ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）：２５
μｇ／ｍｌ（３Ｔ３細胞）、５０μｇ／ｍｌ（１４３Ｂ
細胞）又は１００μｇ／ｍｌ（ＰＡＮＣ−Ｏ２とＨＣＴ
１１６細胞）を含む選択培地において増殖させた。

【００４６】トランスフェクションは２個のペトリ皿
（直径１００ｍｍ）中で行った。独立したクローンを採
取して、個々に拡張させ、又は培養状態に放置して細胞
塊を得た。

【００４７】細胞傷害性分析：ＡＣＶ、ＧＣＶ及びＢＶ
ＤＵの毒性を、細胞増殖の阻害を測定することによっ
て、定量的に評価した。細胞を２４穴プレートに２．５
ｘ１０³／穴で接種した。２４時間後に、細胞を薬物含
有培地中で７日間増殖させた。０．００１ｎＭから１０
０μＭまでの範囲の薬物濃度を３通りに試験した。２日
間毎に培地を新鮮なＤＭＥＭと交換した。６日目に、
１．５μＣｉの［メチル−³Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ，イギリス）を各穴に加えた。リン酸塩緩衝化生
理食塩水（ＰＢＳ ｐＨ７．３）による洗浄後に、取り
込まれた放射能をＭｉｃｒｏ−Ｂｅｔａ Ｐｌｕｓカウ
ンター（ＥＧ＆Ｇ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ａｎｄ
Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，フィンランド）によって測
定した。細胞傷害性用量をＩＣ５０値（［メチル−
³Ｈ］チミジン取り込みを５０％減ずるために必要な薬
物濃度）として表現し、選択指数を親細胞のトランスフ
ェクト細胞に対するＩＣ５０比率として算出した。

【００４８】生存率分析 親細胞とウイルス−ＴＫ発現細胞とを５ｘ１０³／穴で
６穴皿に入れた。２４時間後に、薬物を０．０１から１
００μＭまでの範囲の種々な濃度で培地に加えた。薬物
含有培地を２日間毎に交換した。７日間培養した後に、
ＧＣＶによる７日間培養後のトリパンブルー排除によっ
て生存細胞を計数することによって細胞生存率を評価し
た。

【００４９】ウェスタン・ブロット分析 細胞を氷冷ＰＢＳによって３回洗浄し、１０⁶トランス
フェクト細胞を溶菌緩衝液³⁷中でインキュベートした。
１ｘ１０⁵細胞からの溶菌液を１０〜１２％トリシン−
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎｏｖｅｘ，
サンジエゴ、カルフォニア州、米国）上の各ラインに供
給し、分離したタンパク質をエレクトロブロッティング
によってニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，ドイツ）上に移し
た。各ラインにおける等量のタンパク質と正確な転写と
を保証するために、０．３％Ｐｏｎｃｅａｕ Ｒｏｕｇ
ｅ染色によって染色することによって、帯を目視可能に
した。Ｚｅｏ融合タンパク質を精製ウサギ抗Ｚｅｏポリ
クローナル抗体（Ｃａｙｌａ，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，フラ
ンス）によって明らかにした後に、ホースラディッシュ
・ペルオキシダーゼにコンジュゲートした、ウサギＩｇ
Ｇに対する抗体と共にインキュベートした。この反応を
ＢＭ化学発光検出法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ ＳＡ）によって可視化した。

【００５０】ドット・ブロット分析 細胞抽出物の連続希釈物をニトロセルロース膜上に滴下
した。Ｚｅｏ融合タンパク質をウサギ抗Ｚｅｏポリクロ
ーナル抗体（Ｃａｙｌａ，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，フラン
ス）によって明らかにした後に、ホースラディッシュ・
ペルオキシダーゼにコンジュゲートした、ウサギＩｇＧ
に対する抗体と共にインキュベートした（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ ＳＡ）。
この反応をウェスタン・ブロット分析におけるように可
視化した。

【００５１】高速タンパク質液体クロマトグラフィー
（ＦＰＬＣ）によるヌクレオチド分析：３ｘ１０⁶細胞
を最終量５ｍｌの培地中で１μＭの［８−³Ｈ］ＧＣＶ
（３Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ｉｓｏｔｏｐｃｈｉｍ，フラン
ス）又は［メチル−³Ｈ］チミジン（５Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，イギリス）と共に７時間インキ
ュベートした。細胞をトリプシン処理によって分離し、
ＰＢＳによって２回洗浄した。ヌクレオチドを１ｍｌの
氷冷メタノール６０％によって−２０℃において一晩に
わたって抽出した。サンプルをアニオン交換カラム上で
高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ，Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ−ＬＫＢ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，スウェーデ
ン）によって分析した^38,39。放射能をカラム出口にお
いてラディアマチックＦｌｏ−ｏｎｅ Ｂｅｔａ Ａ−
５００装置（Ｐａｃｋａｒｄ，メリデン、コネチカット
州）によって計数し、ピークをＦｌｏ−ｏｎｅ／Ｄａｔ
ａソフトウェアによって分析した。

【００５２】フローサイトメトリー分析 ｔｋ（−）３Ｔ３細胞をＥＨＶ４−ＴＫ／Ｅ―ＧＦＰ融
合タンパク質をコードするプラスミドによってトランス
フェクトし、ＨＡＴ培地中で選択した。１週間培養した
後に、トランスフェクト細胞の蛍光を分析した。選択の
２か月後に、蛍光分析を繰り返した。細胞をＰＢＳによ
って２回洗浄し、蛍光強度を５２５ｎｍフィルター付き
ＦＡＣＳＣａｌｌｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ，Ｓａｎｎｙｖａｌｅ，カルフォルニア州）によ
って直接測定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアによ
って分析した。

【００５３】結果 種々なヘルペスウイルスチミジンキナーゼを発現した細
胞塊に対するヌクレオシド類似体毒性 Ｚｅｏｃｉｎ耐性を与えるＳｈ Ｂｌｅ遺伝子とフレー
ム内で融合したヘルペスウイルスＴＫ遺伝子を含む発現
ベクター（ｐＵＴ−ＴＫｘ）を用いた（図１Ａ）²¹。こ
のようなベクターの使用は形質導入された細胞の選択
と、抗Ｓｈポリクローナル抗体を用いる免疫検出による
キメラタンパク質の検出を容易にする。これらのベクタ
ーによって発現されたウイルスＴＫの機能性は、内因性
ＴＫ又はチミジンキナーゼ活性を有さない細菌及び酵母
において既に実証されている²¹。最初に、細胞ＴＫ欠損
ネズミ線維芽細胞（ｔｋ（−）３Ｔ３細胞）においてこ
れらの遺伝子を発現させ、安定なトランスフェクト細胞
をそれらのＺｅｏｃｉｎ耐性に基づいて選択した。次
に、細胞におけるウイルスＴＫの機能性を選択ＨＡＴ培
地での細胞増殖の分析と、［メチル−³Ｈ］チミジン（³
ＨＴ）取り込み分析とによって試験した。予想通りに、
全ての非トランスフェクト細胞はＨＡＴ培地中で死亡し
たが、全てのトランスフェクト細胞は生残し、³ＨＴを
取り込んだ（データ示さず）。

【００５４】次に、選択した塊状群をヌクレオシド類似
体に対するそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ感受性に関して、
細胞増殖の阻害をＮＩＨ−３Ｔ３親細胞と比較して測定
することによって、分析した（表１）。ＡＣＶ ＩＣ５
０値は、ＨＳＶ１−、ＥＨＶ４−及びＶＺＶ−ＴＫ発現
細胞では親ＮＩＨ−３Ｔ３細胞と比較して約１５分の１
であり、ＥＢＶ−ＴＫ発現細胞では４分の１に過ぎなか
った。ＨＳＶ１−及びＥＨＶ４−ＴＫ発現細胞はＧＣＶ
に対してＮＩＨ−３Ｔ３細胞よりも３５０倍及び７００
倍感受性が高く、これに比べて、ＶＺＶ−又はＥＢＶ−
ＴＫ発現細胞では７倍に過ぎなかった。ＢＶＤＵのＩＣ
５０値は、ＡＣＶ及びＧＣＶとは異なり、全てのヘルペ
スウイルス−ＴＫ発現細胞塊に対して同じ範囲内であ
り、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するよりも約１３００分の１
〜３６００分の１であった。

【００５５】これらの観察を付加的なネズミ腫瘍細胞
系、膵臓腫瘍ＰＡＮＣ−Ｏ２細胞を用いて拡大した。こ
の場合にも、ＩＣ５０値はＥＨＶ４−ＴＫ発現細胞に対
してはＨＳＶ１−ＴＫ発現細胞塊に対するよりも３倍低
く、それぞれ、０．５５±０．０７μＭと１．７±０．
５μＭ（２回の独立した実験の平均値、データ示さず）
であった。

【００５６】表１：塊状トランスフェクト及び非トラン
スフェクトネズミｔｋ（−）３Ｔ３細胞に対するＡＣ
Ｖ、ＧＣＶ及びＢＶＤＵの細胞傷害性 細胞増殖の阻
害を測定することによって、薬物毒性を評価した。細胞
を薬物含有培地中で７日間増殖させた。［メチル−
³Ｈ］チミジンを６日目に加え、取り込まれた放射能を
測定した。細胞傷害用量を２回又は３回実験の平均ＩＣ
５０値（［メチル−³Ｈ］チミジン取り込みを５０％減
ずるために必要な５０％阻害濃度）として表現し、選択
指数を親細胞のトランスフェクト細胞に対するＩＣ５０
比率として算出した。

【００５７】

【表１】

【００５８】ＨＳＶ１−ＴＫ又はＥＨＶ４−ＴＫ発現細
胞クローンに対するヌクレオシド類似体毒性 ヌクレオシド類似体毒性に対して細胞を感作するそれら
の能力に関して試験した４種類のヘルペスウイルスＴＫ
の中で、ＨＳＶ１−ＴＫとＥＨＶ４−ＴＫはより興味深
い選択指数を示した。細胞塊は種々な感受性を有するク
ローンの混合物を表すので、次には、これらの２種類の
ＴＫのいずれかを発現する個々のクローンに対する薬物
毒性を分析した。

【００５９】最初に、Ｓｈタンパク質に対するポリクロ
ーナル抗体を用いるウェスタン・ブロットによって幾つ
かのクローンのヘルペスウイルス−ＴＫ発現レベルを分
析した。１０⁵細胞の細胞抽出物を電気泳動に供給し
た。試験した４種類のＥＨＶ４−ＴＫ＋クローンと４種
類のＨＳＶ１−ＴＫ＋クローンとにおいて、ＥＨＶ４−
ＴＫ／ＺＥＯ（５３ＫＤａ）とＨＳＶ１−ＴＫ／ＺＥＯ
（５５ＫＤａ）とに相当する帯が同様な強度で観察され
た（図２−Ａ）。これらの細胞抽出物中にＳｈタンパク
質単独（２０ＫＤａ）に相当する検出可能な帯は存在し
なかった（データ示さず）。ＨＳＶ１−ＴＫ（＋）細胞
の全ての抽出物によって低いＰＭの弱い帯を観察するこ
とができた。この帯は既知の隠れた内部プロモーターに
おける転写開始に対応し、切頭ではあるが機能的タンパ
ク質の転写を生じる。^19,20,22

【００６０】次に、これらの８種類のクローンに対する
ＡＣＶ、ＧＣＶ及びＢＶＤＵの毒性を分析した（表
８）。ＡＣＶとＧＣＶに対して、ＥＨＶ４−ＴＫ発現細
胞の感受性はＨＳＶ１−ＴＫ発現細胞の感受性よりも統
計的に有意義であった（それぞれ、ｐ＜０．０５と０．
０１）。ＨＳＶ１−ＴＫ又はＥＨＶ４−ＴＫ発現クロー
ンは同じＢＶＤＵ感受性を示した。

【００６１】表２：ＨＳＶ１−ＴＫ及びＥＨＶ４−ＴＫ
発現ネズミｔｋ（−）３Ｔ３クローンに対するＡＣＶ、
ＧＣＶ及びＢＶＤＵの細胞傷害性 ＴＫ発現クローン
の薬物感受性を表１に述べたように試験した。細胞傷害
用量を３回実験の平均ＩＣ５０値として表現した。

【００６２】

【表２】

【００６３】ＨＳＶ１−ＴＫ又はＥＨＶ４−ＴＫを発現
するヒト細胞塊に対するヌクレオシド類似体毒性 ヌクレオシド類似体の代謝は異なる種の細胞では異なる
と考えられるので^{23-2 5}、ヒト細胞を殺害する系の効率
を分析した。

【００６４】したがって、ＨＳＶ１−ＴＫ又はＥＨＶ４
−ＴＫを発現するヒト細胞ｔｋ（−）骨肉腫１４３Ｂ細
胞塊を得た。最初に、Ｓｈタンパク質に対するポリクロ
ーナル抗体を用いるドット・ブロットによって各細胞塊
のヘルペスウイルス−ＴＫタンパク質発現レベルを分析
した（図２−Ｂ）。ｔｋ（−）１４３Ｂ細胞抽出物中に
融合タンパク質に対応する検出可能な帯は存在しなかっ
た。ＨＳＶ１−ＴＫ又はＥＨＶ４−ＴＫ発現細胞中には
融合タンパク質の同様な発現が観察された。

【００６５】次に、ＡＣＶ、ＧＣＶ及びＢＶＤＵに対す
る細胞感受性を研究した（図３）。ＨＳＶ１−ＴＫ及び
ＥＨＶ４−ＴＫ発現細胞中でＡＣＶの毒性は同様であっ
た。注目すべきは、ＥＨＶ４−ＴＫ発現細胞はＨＳＶ１
−ＴＫ発現細胞に比べて、ＧＣＶに対して約１２倍感受
性が高かった。これに反して、ＢＶＤＵ毒性はＥＨＶ４
−ＴＫ発現細胞におけるよりもＨＳＶ１−ＴＫ発現細胞
において大きかった（図３）。

【００６６】これらの観察を付加的な腫瘍細胞系、ヒト
結腸癌ＨＣＴ１１６細胞に拡大した。ＧＣＶのＩＣ５０
値はＥＨＶ４−ＴＫ発現細胞に対してはＨＳＶ１−ＴＫ
発現細胞塊に対するよりも３倍低く、それぞれ、０．１
１±０．０２μＭと０．３２±０．０８μＭ（３回の独
立した実験の平均値±ＳＤ）であった。ＥＨＶ４−ＴＫ
発現細胞とＨＳＶ１−ＴＫ発現細胞とは、ＨＣＴ１１６
細胞に比べて、ＧＣＶに対して４８５倍及び１７０倍感
受性が高かった（ＧＣＶのＩＣ５０値の平均値は５３．
４±１５μＭであった）。

【００６７】ＨＳＶ１−ＴＫ又はＥＨＶ４−ＴＫを発現
するヒト細胞におけるＧＣＶリン酸化 ＧＣＶがＨＳＶ１−ＴＫ発現細胞に比べてＥＨＶ４−Ｔ
Ｋ発現細胞においてより大きく毒性である理由を理解す
るために、ｔｋ（−）１４３Ｂ細胞とＨＳＶ１−ＴＫ又
はＥＨＶ４−ＴＫ発現細胞におけるＧＣＶリン酸化を分
析した。放射能標識ＧＣＶ又はチミジンと共に７時間イ
ンキュベーションした後に、ヌクレオチドを抽出して、
ＦＰＬＣによって分析した。

【００６８】ｔｋ（−）１４３Ｂ細胞中ではチミジンの
検出可能なリン酸化は存在しなかったが（データ示さ
ず）、両方のＴＫ発現細胞ではチミジンは同様にリン酸
化された（図４）。ＧＣＶに関して、種々なリン酸化形
の割合は両方のＴＫ発現細胞において同じであったが、
細胞内ＧＣＶの総量はＨＳＶ１−ＴＫ発現細胞よりもＥ
ＨＶ４−ＴＫ発現細胞の方が５倍大きかった。

【００６９】ＥＨＶ４−ＴＫ／Ｅ―ＧＦＰ融合タンパク
質の機能性 トランスフェクト細胞又は組織における導入遺伝子検出
を容易にするために、Ｅ−ＧＦＰ遺伝子をＥＨＶ４−Ｔ
Ｋ遺伝子の３’末端にフレーム内で融合させ、発現ベク
ター中にクローン化した（図１−Ｂ）。次に、この構造
をｔｋ（−）３Ｔ３細胞中にトランスフェクトしてか
ら、Ｅ−ＧＦＰ陽性細胞のＦＡＣＳ分析を行った。９５
％のＥ−ＧＦＰ発現細胞を含有する細胞塊を得た。２か
月間の培養中のＨＡＴ培地の存在下での蛍光と生存率と
を分析することによって、導入遺伝子の安定な発現と二
重機能性とを実証することができた（図５−Ａ）。ＥＨ
Ｖ４−ＴＫ／Ｅ―ＧＦＰ融合タンパク質の発現は、これ
らの細胞をＧＣＶに対して感作し、これらの細胞に対す
るＩＣ５０は、ｔｋ（−）３Ｔ３細胞に対する３０μＭ
に比べて、０．６μＭであった（図５−Ｂ）。

【００７０】

【発明の効果】考察 本発明者らは、細胞破壊のための現在のヘルペスウイル
ス誘導ＴＫ系の効力の改良を目的とした。この目的のた
めに、ヒト細胞における代替ＴＫ遺伝子の効力を評価す
ることを選択した。これらの遺伝子の発現レベルをモニ
ターすることが必要であったため、これらの遺伝子を、
Ｚｅｏｃｉｎ耐性を与えるタンパク質をコードするｓｈ
ｂｌｅ（これは入手可能なポリクローナル抗体による
ウェスタン・ブロッティングによって検出可能である）
に融合させた。

【００７１】最初に、真核細胞における種々なＴＫ−Ｚ
ＥＯ融合の二重機能性を、内因性チミジンキナーゼ活性
を有さないネズミ又はヒト細胞のトランスフェクション
によって実証した。Ｚｅｏｃｉｎによる選択は常に、後
にＨＡＴ培地の存在下で培養したときに全て生残った耐
性クローンを生じた。それ故、ペプチド融合が細胞に切
断されなかったとしても、全ての融合タンパク質が二重
機能性であると結論した。このことは、ＨＳＶ１−ＴＫ
が種々なタンパク質にアミノ−又はカルボキシ−融合し
た後にもその機能性を保有することを示した以前の実験
と一致する。^{21 ,24,26-28}

【００７２】種々なヘルペスＴＫの活性の有意差が観察
された。これらの差は細胞塊を分析したときと独立クロ
ーンを分析したときの両方で検出された。塊は臨床前及
び臨床セッティング中のｉｎ ｓｉｔｕトランスフェク
ト群を模倣するポリクローナル群の総酵素活性の良好な
推定値を生じ、クローンは導入遺伝子発現レベルに関し
て個々の細胞における活性を分析することを可能にす
る。本発明者はＡＣＶ、ＧＣＶ及びＢＶＤＵの毒性を研
究した。

【００７３】ＶＺＶ−ＴＫ及びＥＢＶ−ＴＫは、どのよ
うなヌクレオシド類似体を用いたとしても、ＨＳＶ１−
ＴＫに比べて利点を示さなかった。最近の２つの研究は
ヒト胸部癌細胞²⁹と、ヒト骨肉腫細胞³⁰における自殺遺
伝子としてのＶＺＶ−ＴＫの可能性を示している。これ
らの論文では、ＢＶＤＵの選択指数と、０．０６〜０．
６μＭの範囲であるＩＣ５０値は、本発明の値に非常に
類似するが、ＶＺＶ−ＴＫとＨＳＶ１−ＴＫとの比較は
示されていない。

【００７４】注目すべきは、ＥＨＶ４−ＴＫ発現細胞
は、塊として又はクローンとしてのいずれであっても、
ＨＳＶ１−ＴＫ発現細胞に比べて、ＧＣＶに対して常に
より感受性が高かった。この強化された毒性は、ウェス
タン・ブロットによる評価では、ＴＫ発現レベルの差に
よるものではなかった。このことはまた、ＨＳＶ１−Ｔ
Ｋ発現細胞に対してより強く毒性であるＢＶＤＵによる
正反対の効果の観察によっても示され、これらの酵素の
活性の間には量的な差ではなく、質的な差が存在するこ
とを実証する。

【００７５】ＨＳＶ１−ＴＫ発現細胞に比べて、ＥＨＶ
４−ＴＫ発現細胞におけるＧＣＶに対する改良された感
受性を説明する可能な機構を研究するために、ＦＰＬＣ
によってＧＣＶリン酸化を分析した。細胞内ＧＣＶの総
量はＨＳＶ１−ＴＫ発現細胞におけるよりもＥＨＶ４−
ＴＫ発現細胞において５倍大きかったが、種々なリン酸
化形の割合は両方のＴＫ細胞において同様であった。こ
のような差は、ＴＫ発現と相関すると報告されているヌ
クレオシドとそれらの類似体の吸収によって説明するこ
とができる。実際に、ｔｋ（−）大腸菌中へのチミジン
吸収は異種ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子から発現されたＴＫ活
性量に比例する³¹。さらに、哺乳動物ＨＳＶ１−ＴＫ発
現細胞は、対照細胞に比べて高いＧＣＶ吸収とリン酸化
とを示した³²。 両方のＴＫ（＋）細胞における同様な
ＴＫ発現が検出されたので（図２−Ｂ）、ＥＨＶ４−Ｔ
Ｋ発現細胞における細胞内ＧＣＶのより大きな量を、Ｇ
ＣＶに対するＨＳＶ１−ＴＫ活性に比べてより大きいＥ
ＨＶ４−ＴＫ活性と相関させることができた。

【００７６】上首尾に形質導入された細胞の迅速かつ効
果的な検出を可能にするマーカーによって、遺伝子導入
検出を非常に促進することができる。このことは特に、
細胞質タンパク質に該当する。しかし、適当な抗ＥＨＶ
４−ＴＫモノクローナル又はポリクローナル抗体は入手
可能ではない。したがって、本発明者らは強化グリーン
蛍光タンパク質（Ｅ−ＧＦＰ）を用いて、ＥＨＶ４−Ｔ
Ｋ／Ｅ−ＧＦＰ融合タンパク質を得た。トランスフェク
ト細胞においてＥ−ＧＦＰの発現は数か月間安定に留ま
り、フローサイトメトリーによって容易にモニターする
ことができる。哺乳動物細胞への融合プラスミドのトラ
ンスフェクションは、この構築体が機能性であり、細胞
が蛍光性（９５％）かつＧＣＶに対して感受性の両方で
あることを明らかにした。この結果は、ＨＳＶ１−ＴＫ
グリーン蛍光タンパク質融合遺伝子の二重機能性を報告
したＬｉｏｍａｓ等の最近の研究に一致する²⁸。キメラ
自殺／マーカー遺伝子は形質導入された細胞の検出を劇
的に容易にする筈である。このことは実験モデルにおい
て特に重要である。これに関連して、特異的細胞群の条
件付き除去のモデルを作製するために、自殺遺伝子がト
ランスジェニック・マウスにしばしば用いられる。

【００７７】細胞系に依存して、ＥＨＶ４−ＴＫはＨＳ
Ｖ１−ＴＫよりも３〜１２倍強力であった。このような
差は自殺遺伝子の臨床使用を考えるときに重要に思われ
る、マウス又はラットにおける実験的腫瘍の治療が、効
力を得るためにＧＣＶ用量がしばしば重要であることを
実証しているからである。ヒトにおける通常の投与量で
ある１０ｍｇ／ｋｇ、１日２回で投与したときに、ＧＣ
Ｖの血漿濃度は０．４４〜２．２μｇ／ｍｌの範囲であ
り³³、脳脊髄液（ＣＳＦ）濃度は約３分の１である
^34,35。それ故、ＨＳＶ１−ＴＫによって形質導入され
た脳腫瘍の治療のためにＣＳＦのＧＣＶ濃度が最適とは
いえない可能性がある。いずれにせよ、この酵素のより
良好な効率はより良好な治療効率及び／又はＧＣＶ使用
量の減少とをもたらす筈である。この後者の点は、ヒト
におけるＧＣＶ毒性が投与された総量に依存して累積す
るように見える（Ｃｙｔｏｖｅｎｅ（登録商標）製品モ
ノグラフ）ことからも重要である³⁶。

【００７８】要するに、これらの実験は自殺遺伝子とし
てのＥＨＶ４−ＴＫの、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉ
ｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおける実験的アプローチと治
療的アプローチの両方のための、可能な利益を強調す
る。

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【図面の簡単な説明】

【図１】発現ベクターのマップである。

【図２】トランスフェクト細胞における融合ＴＫ／ＺＥ
Ｏタンパク質発現の分析を示す。

【図３】ＨＳＶ１−又はＥＨＶ４−ＴＫによってトラン
スフェクトされたヒトｔｋ（−）１４３Ｂ細胞に対する
ＡＣＶ、ＧＣＶ及びＢＶＤＵの細胞傷害活性を示す。

【図４】トランスフェクト及び非トランスフェクトｔｋ
（−）１４３Ｂ細胞におけるチミジン及びＧＣＶのリン
酸化を示す。

【図５】ＥＨＶ４−ＴＫ／Ｅ―ＧＦＰ融合タンパク質の
二重機能性の分析を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 35/76 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウマヘルペスウイルス ４型（ＥＨＶ
   ４）チミジンキナーゼ・ポリペプチド又はそれをコード
   する核酸の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉ
   ｎ ｖｉｖｏにおいてヒト細胞をヌクレオシド類似体に
   対して感受性にするための組成物の製造への使用。
2. 【請求項２】 ウマヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ４）
   チミジンキナーゼ・ポリペプチド又はそれをコードする
   核酸の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ
   ｖｉｖｏにおいてヒト増殖性細胞、特にヒト腫瘍細胞を
   殺害するための組成物の製造への使用。
3. 【請求項３】 ＥＨＶ４−ＴＫポリペプチド又はそれを
   コードする核酸の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ
   又はｉｎ ｖｉｖｏにおいてヒトＴリンパ球を殺害する
   ための組成物の製造への使用。
4. 【請求項４】 ウマヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ４）
   チミジンキナーゼ・ポリペプチド又はそれをコードする
   核酸を含む、ヒト細胞増殖性疾患の治療用薬剤組成物。
5. 【請求項５】 さらにヌクレオシド類似体を含む、請求
   項４記載の薬剤組成物。
6. 【請求項６】 前記ウマヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ
   ４）チミジンキナーゼ・ポリペプチドが野生型ＥＨＶ４
   −ＴＫ又はそのフラグメント若しくはバリアントを含
   む、請求項１又は２に記載の使用。
7. 【請求項７】 ウマヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ４）
   チミジンキナーゼ・ポリペプチドをコードする前記核酸
   が、野生型ＥＨＶ４−ＴＫをコードする核酸又はそれと
   ハイブリダイズし、生物学的に活性なＥＨＶ４−ＴＫポ
   リペプチドをコードする核酸を含む、請求項１又は２に
   記載の使用。
8. 【請求項８】 前記核酸がベクター中に含有される、請
   求項１、２、６又は７のいずれか１項に記載の使用。
9. 【請求項９】 前記ベクターが組換えウイルスである、
   請求項８記載の使用。
10. 【請求項１０】 前記ヌクレオシド類似体がＧＣＶ、Ａ
    ＣＶ又はＢＶＤＵであり、好ましくはＧＣＶである、請
    求項１、２、６〜９のいずれか１項に記載の使用。