PT1509600E - Timidina-quinases vegetais e sua utilização - Google Patents

Timidina-quinases vegetais e sua utilização Download PDF

Info

Publication number
PT1509600E
PT1509600E PT03722322T PT03722322T PT1509600E PT 1509600 E PT1509600 E PT 1509600E PT 03722322 T PT03722322 T PT 03722322T PT 03722322 T PT03722322 T PT 03722322T PT 1509600 E PT1509600 E PT 1509600E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
leu
ala
asp
gly
ser
Prior art date
Application number
PT03722322T
Other languages
English (en)
Inventor
Birgitte Munch-Petersen
Wolfgang Knecht
Jure Piskur
Original Assignee
Birgitte Munch-Petersen
Wolfgang Knecht
Jure Piskur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Birgitte Munch-Petersen, Wolfgang Knecht, Jure Piskur filed Critical Birgitte Munch-Petersen
Publication of PT1509600E publication Critical patent/PT1509600E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A61K31/7072—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid having two oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. uridine, uridylic acid, thymidine, zidovudine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C12N9/1211—Thymidine kinase (2.7.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01076—Deoxyadenosine kinase (2.7.1.76)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

ΕΡ 1 509 600/PT
DESCRIÇÃO
"Timidina-quinases vegetais e sua utilização" CAMPO TÉCNICO
Este invento refere-se a novas timidina-quinases vegetais e à sua utilização em terapia génica. Mais especificamente, o presente invento proporciona novas timidina-quinases derivadas de tomate.
Noutros aspectos o presente invento proporciona novos polinucleótidos codificando as timidina-quinases vegetais, construções de vectores compreendendo o polinucleótido, células hospedeiras possuindo o polinucleótido ou vector, métodos de sensibilização de células a pró-fármacos, métodos de inibição de agentes patogénicos em animais de sangue quente e métodos de sintese de monofosfatos.
Numa concretização preferida o presente invento proporciona uma combinação única de uma timidina-quinase vegetal e o análogo de nucleósidos AZT para tratar crescimento celular anormal.
ANTECEDENTES DO INVENTO O ADN é constituído por quatro desoxirribonucleósido-trifosfatos, proporcionados através da via de novo e da de resgate. A enzima chave da via de novo é a ribonucleótido-redutase, que catalisa a redução do grupo 2'-OH dos nucleósido-difosfatos e as enzimas chave de resgate são as desoxirribonucleósido-quinases, que fosforilam os desoxir-ribonucleósidos nos correspondentes desoxirribonucleósido-monofosfatos.
As desoxirribonucleósido-quinases de vários organismos diferem na sua especificidade para o substrato, na regulação da expressão génica e na localização celular. Em células de mamífero existem quatro enzimas com especificidades sobreponíveis, as timidina-quinases 1 (TK1) e 2 (TK2), a desoxicitidina-quinase (dCK) e a desoxiguanosina-quinase (dGK), que fosforilam desoxirribonucleósidos de purina e 2 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ pirimidina. A ΤΚ1 e a TK2 são específicas de pirimidinas e fosforilam a desoxiuridina (dUrd) e a timidina (dlhd), e a TK2 também fosforila a desoxicitidina (dCyd). A dCK fosforila dCyd, desoxiadenosina (dAdo) e desoxiguanosina (dGuo), mas não dThd. A dGK fosforila dGuo e dAdo. A TK1 e a dCK são citosólicas, e a TK2 e a dGK localizam-se na mitocôndria, embora relatórios recentes indiquem também uma localização citoplasmática de TK2.
Com base na homologia com uma timidina-quinase derivada de um vírus Myxoma, foi proposto um gene de arroz codificando uma timidina-quinase (Hemayet Ullah, Dominique Robertson, e Roger C. Fites, "A Gene for Tymidine Kinase in Plants" (Número de Entrada AF066050; Plant gene register PGR99-048) Plant Physiol. 119: 1567, 1999). No entanto, foi isolada apenas uma sequência parcial, sequência que não é suficiente para expressão da proteína activa.
Dois pedaços de ADN genómico de Arabidopsis thaliana foram anotados como putativas timidina-quinases em GenBank™ (Nos de Entrada AAF13097 e BAB09824) . No entanto, até à data não se conseguiram trabalhos experimentais de caracterização, propriedades, localização, utilização ou função biológica de quinases vegetais. O AZT (3'-azido-3'-desoxitimidina, Zidovudine, Retrovir®) é um análogo de nucleósidos utilizado no tratamento de infecções por VIH. O passo limitante da velocidade da sua activação em células humanas é a activação do AZT-monofosfato (AZTMP) em AZT-difosfato.
Foi sugerido utilizar timidina-quinase do vírus Herpes simplex humano de tipo 1 (HSV1-TK) possuindo uma actividade de timidina-monofosfato-quinase endógena, para tratamento de terapia génica de infecções por VIH. HSV1-TK é filogeneticamente aparentada com a TK2 humana mas não com a TK1 humana. Foi também sugerida a utilização de HSV1-TK para melhorar a actividade antiviral de zidovudina e a utilização de HSV1-TK na combinação com AZT mostrou ser capaz de matar bactérias E. coli transformadas. No entanto, porque se crê que a fosforilação de AZTMP é o passo limitante da velocidade na activação do AZT em humanos, são foi conseguido trabalho 3 ΕΡ 1 509 600/PT experimental sobre a uma combinação eficaz de AZT com uma timidina-quinase para utilizar no tratamento de cancro humano ou noutras doenças relacionadas com crescimento celular anormal humano relacionado.
SUMÁRIO DO INVENTO É um objectivo do presente invento proporcionar novas timidina-quinases vegetais úteis para a conversão de análogos de nucleósidos em substâncias tóxicas e úteis para a conversão de análogos de nucleósidos em monofosfatos e de monofosfatos de análogos de nucleósidos nos correspondentes difosfatos. Os genes isolados das timidina-quinases vegetais podem ser utilizados em terapia génica para matar selectivamente células contendo os genes (e expostas a pelo menos um análogo de nucleósidos) e as timidina-quinases isoladas proporcionadas pelo presente invento podem ser utilizadas para o processo industrialmente importante de fosforilação de nucleósidos e/ou análogos de nucleósidos. As timidina-quinases isoladas podem também ser utilizadas para matar células através da injecção das enzimas nas células e da sujeição das células a pelo menos um análogo de nucleósidos. Sempre que for feita referência a um análogo de nucleósidos e/ou ao seu monofosfato, entenda-se que este análogo de nucleósidos é de preferência um análogo de desoxinucleósidos, com maior preferência um análogo de desoxirribonucleósidos e ainda de preferência AZT.
Mais especificamente, o presente invento proporciona uma combinação única de uma timidina-quinase vegetal com o análogo de nucleósidos AZT para tratar crescimento celular anormal.
Deste modo, no seu primeiro aspecto, o presente invento proporciona polinucleótidos isolados codificando enzimas timidina-quinases vegetais derivadas de tomate (Lycopersicum esculentum) . Estas timidina-quinases vegetais revelaram ser especialmente eficientes na fosforilação de AZT e possuem uma actividade endógena de monofosfato-quinase inesperadamente elevada especialmente em monofosfatos de análogos de nucleósidos tais como AZTMP.
Noutro aspecto o presente invento proporciona polinucleótidos isolados codificando enzimas timidina-quinases 4
ΕΡ 1 509 600/PT derivadas de plantas, enzimas timidina-quinase estas que, quando comparadas com a timidina-quinase do vírus Herpes simplex humano de tipo 1 (HSV1-TK) , diminuem em pelo menos três (3) vezes a dose letal (DL100) . De preferência, este análogo de nucleósidos é AZT.
Num terceiro aspecto o presente invento proporciona polinucleótidos mutados e/ou truncados isolados codificando variantes da enzima timidina-quinase derivadas de plantas.
Num quarto aspecto o presente invento proporciona enzimas timidina-quinase expressas por um polinucleótido do presente invento ou variantes da enzima timidina-quinase expressas através de um polinucleótido mutado (e/ou truncado) do presente invento.
Num quinto aspecto o presente invento proporciona enzimas timidina-quinase vegetais derivadas de tomate (Lycopersicum esculentum).
Num sexto aspecto o presente invento proporciona construções de vectores compreendendo um polinucleótido do presente invento e um promotor operativamente ligado ao polinucleótido.
Num sétimo aspecto o presente invento proporciona linhas celulares de empacotamento capazes de produzir viriões infecciosos compreendendo um vector do presente invento.
Num oitavo aspecto o presente invento proporciona células hospedeiras compreendendo um polinucleótido do presente invento ou um vector de expressão do presente invento.
Num nono aspecto o presente invento proporciona métodos de sensibilização de células a pró-fármacos, métodos estes que compreendem os passos de (i) transfecção ou transdução de uma célula com uma sequência polinucleotídica codificando uma enzima timidina-quinase vegetal que promova a conversão do referido pró-fármaco num fármaco (citotóxico) ou a entrega de outro modo da timidina-quinase vegetal à célula; e (i i) entrega de um pró-fármaco à referida célula; em que a célula é mais sensível ao fármaco (citotóxico) que ao pró-fármaco. 5
ΕΡ 1 509 600/PT
Num décimo aspecto o presente invento proporciona métodos de inibição de agentes patogénicos em animais de sangue guente, métodos estes gue compreendem a administração a tais animais de um polinucleótido do presente invento ou de um vector do presente invento.
Num décimo primeiro aspecto o presente invento refere-se à utilização das enzimas timidina-guinases vegetais do presente invento para a fosforilação de nucleósidos ou de análogos de nucleósidos.
Num décimo segundo aspecto o presente invento proporciona métodos de fosforilação de nucleósidos ou de análogos de nucleósidos, métodos estes que compreendem os passo de (i) sujeição do nucleósido ou do análogo de nucleósido à acção da enzima timidina-quinase do presente invento e (ii) recuperação do nucleósido ou análogo de nucleósido fosforilado.
Noutro aspecto o presente invento refere-se a artigos contendo um análogo de nucleósidos e uma timidina-quinase derivada de plantas de acordo com o presente invento ou um gene codificando para a referida timidina-quinase derivada de plantas, ou um vector compreendendo o referido gene codificando para a referida timidina-quinase derivada de plantas, como uma combinação para a administração simultânea, separada ou sucessiva em terapia de cancro.
Outros objectivos do presente invento serão aparentes aos peritos na arte a partir da seguinte descrição detalhada e dos exemplos. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO Timidina-quinases Vegetais
No seu primeiro aspecto o presente invento proporciona novas proteínas possuindo actividade enzimática de timidina-quinase (TK) , proteínas estas que são derivadas de plantas. Mais especificamente as novas enzimas timidina-quinases vegetais são derivadas de tomate (Lycopersicum esculentum) . 6
ΕΡ 1 509 600/PT
No contexto do presente invento, uma timidina-quinase é uma enzima capaz de fosforilar timidina mas não é capaz de fosforilar um nucleósido de purina utilizando os ensaios descritos no Exemplo 3, Tabela 5. Uma timidina-quinase pode ou não fosforilar desoxicitidina.
As enzimas timidina-quinases do presente invento são particularmente úteis para o tratamento de crescimento celular anormal através da activação de análogos de nucleósidos, em particular AZT.
Com base num alinhamento de múltiplas sequências de aminoácidos Clustal W (1.82) das timidina-quinases de tomate, pinheiro e arroz, foram identificados três motivos e vários resíduos conservados, semi-conservados e menos conservados, tal como mostrado na Tabela 1 abaixo. Na Tabela 1, o alinhamento começa com o resíduo de aminoácido n.° 65 da TK1 de Arroz, porque os primeiros 64 aminoácidos não se alinham com as outras timidina-quinases. 7 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ
Tabela 1
Alinhamento de Múltiplas Sequências de Aminoácidos Clustal W (1.82) (008) (019) (019) (008) (060) TKl arroz ---------- -MEAQPSYP-----------
TK1 tomate ---------- MAFSSSARN PVDLRNGSKW
AT-TKla -MATLKASFL IKTLDSDVTG TKl pinheiro --------------------------------------;— -MDDSGIYT-----------
AT-TKlb MRTLISPSLA PFSLHLHKPS LFSTALRFSF SINNITPTNS PPSTISTRKL QTKATRVTSS TKl arroz TKl tomate AT-TKla TKl pinheiro AT-TKlb
-----------GEIHVIVGP
SFC------P VGEXHVIVGP
DFLSDLERRG SGAVHVIMGP
---------- SGEIHLILGP
SSSQPLSSSS PGEIHWVGP * .*...**
MFAGKTTALL RRVQVEAGTG MFAGKTTAUj RHVWLESKDG MFSGKSTSLL RRXKSEISDG MFAGKTTALI RKMRAEIQMG MFSGKTTTLL HRILAERETG •fc·*·** .★.·*. * . . * -k
RNVALXKSDK DNRYGLDSW RNWLIKSSK DARYAVDAW RSVAMLKSSK DTRYAKDSW RRWLVKSDX DTRYGLNSW KRIAIIKSNK DTRYCTESXV t ; , : ; ** ( * * ** . . . * (057) (073) (079) (058) (120) TKl arroz TKl tomate AT-TKla TKl pinheiro AT-TKlb THDGTKMPCVJ ALPELSSFQD THDGTRFPCW SLFDLSSFKQ THDGIGFPGW ALPDLMSFPE SHDGAKMPCW AVADLASFKC THDGEKYPCW SLPDLSSFKE .*** *** ·» , * * *
KLGTEAYD-K RFGKDAY3-K KFGLDAYN-K KLGEEAYK-Q RFGFDDYENR VDVIGIDEAQ VDVIGIDEAQ LDVIGIDEAQ VDVIGIDEAQ LDVIGIDEAQ . ★ **·****** FFDDLHDFCC KAADRDGKXV FFGDLYEFCC NAADFDGKII FFGDLYEFCC KVADDDGKXV FFKDLYSFCQ VAADRDCKTV FFGDLYEFCR EAADKEGKTV ****« * * * * . * * . (11S) (132) (138) (117) (180)
Motivo I TKl arroz TKl tomate AT-TKla TKl pinheiro AT-TKlb WAGLDGDYK WAGLDGDYL IVAGLDGDYL IVAGLDGDYL IVÀGLDGDFM .******* . RNKFGSVLDI RKSFGSVLDI RRSFGAVLDI RKSFG5ALEL RRRFGSVLDL * **. * . . IPLADSVTKL IPLADTVTKL IPIADSVTKL XPIADSWKL I PI ADTVTKL **.* *.* **
TARCELCGRR
TARCELCNER
TARCEVCGHK
KSRCELCGKA
TSRCEVCGKR . (Hri . * AFFTLRKTRE AFFTFRKTNE AFFTLRKNCD ASFTFRKTGE ALFTMRKTEE * * * . ★ * . TKTELIGGAD TETELIGGAD TRTELIGGAD KKTEWGGAD KETELIGGAE **..***- (176) (192) (198) (177) (240)
Motivo II
Região Lid TKl arroz TKl tomate AT-TKla TKl pinheiro AT-TKlb (212) (234) (238) VYMPVCRQHY LDGQIVIEAT RIVLD-LEKS KVI3AFK------ IYMFVCRQHY VNGQSVNESA KMVLE-SHKV SNELILESPL VDP VYMPVCRKHY ITHHIVIKAS KKVLEDSDKA RAESCVAATI — IYMPVCRRHY VNGQIVIDTT RAVLS-SPEV QYDACAQATT TSC VYMPVCRSKY VCGQNVLETA RAVLE---SS NNHSWASSL---(277) .★***** ** . . * .. · **e
Motivo III - designa motivos (Motivo I, Motivo II e Motivo III) * designa resíduos conservados : designa resíduos semí-conservados . designa resíduos menos conservados
Por essa razão, numa concretização preferida a enzima timidina-quinase vegetal do presente invento compreende um ou mais dos seguintes três motivos:
Vai Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gin Phe Phe (Motivo I) Vai Ala Gly Leu Asp Gly (Motivo II) Tyr Met Pro Vai Cys Arg (Motivo III) .
Noutra concretização preferida, a enzima timidina-quinase vegetal do presente invento compreende a região Lid: Vai AI Lys Leu A2 A3 Arg Cys Glu A4 (região Lid), 8 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ em que AI é seleccionado a partir de Thr e Vai, A2 é seleccionado a partir de Thr e Lys, A3 é seleccionado a partir de Ala e Ser e A4 é seleccionado a partir de Leu e Vai.
Numa concretização mais preferida a enzima timidina-quinase vegetal do presente invento compreende todos os resíduos conservados identificados na Tabela 1.
Identidade dos Polipéptidos
Noutra concretização preferida a enzima timidina-quinase vegetal do presente invento compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:4 ou como SEQ ID NO:5, ou uma sequência de aminoácidos que tenha pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, com maior preferência pelo menos 95% de identidade, ainda com mais preferência pelo menos 98% de identidade, quando determinado ao longo de todo o comprimento da SEQ ID.
No contexto deste invento "identidade" é uma medida do grau de homologia das sequências de aminoácidos. Para caracterizar a identidade, são alinhadas sequências sujeitas para que se obtenha a maior ordem de homologia (coincidências). Com base nestes princípios gerais a "percentagem de homologia" de duas sequências de aminoácidos é determinada utilizando o algoritmo BLASTP (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences"; FEMS Microbiol. Lett. 174: 247-250, 1999), que está disponível no sítio da internet National Center for Biotechnology Information (NCBI), e utilizando as definições por defeito aqui sugeridas (i.e., Matrix = Blosum62; Open gap = 11; Extension gap = 1; Penalties gab x_dropoff = 50; Expect = 10; Word size = 3; Filter on). 0 algoritmo BLAST determina a % de identidade de sequência num intervalo de sobreposição entre duas sequências alinhadas. Para os fins do presente invento, a percentagem de identidade de sequência é calculada num intervalo de sobreposição de pelo menos 50 aminoácidos, com maior preferência pelo menos 75 aminoácidos, ainda com mais preferência pelo menos 100 aminoácidos, sendo o intervalo calculado por BLASTP sob as definições por defeito. 9
ΕΡ 1 509 600/PT
Os resultados desta comparação BLASTP sao apresentados na Tabela 2.
Tabela 2
Comparação BLASTP de Sequências Proteicas de Timidina-guinases de Diferentes Origens Vegetais TK Tomate Arroz AT (a) AT (b) Pinheiro 65/82/197 69/84/193 59/77/208 62/83/195 Tomate - 75/86/196 69/84/193 65/81/208 Arroz - - 69/84/193 65/83/197 AT (a) - - - 60/78/215
Identidades (%)/Positivos (%)/comprimento do fragmento comparado Timidina-quinase de pinheiro (Pinus taeda)
Timidina-quinase de tomate (Lycopersicum esculentum)
Timidina-quinase de arroz (Oryza sativa)
Timidina-quinases (a) e (b) de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana)
Numa concretização preferida a enzima timidina-quinase vegetal do presente invento é derivada de tomate e tem pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, com maior preferência pelo menos 95%, ainda com maior preferência pelo menos 98% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências SEQ ID NO:4 ou 5.
Polipéptidos Variantes
Numa concretização mais preferida a enzima timidina-quinase vegetal do presente invento compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:4 ou como SEQ ID NO:5.
No contexto deste invento, o termo “análogo funcional" significa um polipéptido (ou proteína) possuindo actividade de timidina-quinase e possuindo uma sequência de aminoácidos que difere da sequência apresentada como SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO:5, numa ou mais posições de aminoácidos. Tais polipéptidos análogos incluem polipéptidos compreendendo substituições conservativas, variantes de processamento, isoformas, homólogos de outras espécies e polimorfismos.
Tal como aqui definido, o termo "substituições conservativas" denota a substituição de um resíduo de 10 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ aminoácido por outro resíduo biologicamente semelhante. Exemplos de substituições conservativas incluem: i) a substituição de um resíduo por outro não polar ou hidrófobo tal como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, metionina, fenilalanina ou triptofano, em particular a substituição de outro por alanina, leucina, isoleucina, valina ou prolina; ou ii) a substituição de um resíduo por outro polar neutro (sem carga) tal como serina, treonina, tirosina, asparagina, glutamina ou cisteína, em particular a substituição de lisina por arginina, ácido aspártico por glutâmico ou de asparagina por glutamina; ou iii) a substituição de um resíduo por outro com carga positiva tal como lisina, arginina ou histidina; ou iv) a substituição de um resíduo por outro com carga negativa tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico. O termo substituição conservativa inclui também a utilização de um resíduo de aminoácido substituído em vez de um resíduo de aminoácido original, desde que os anticorpos criados para o polipéptido substituído também imuno-reajam com o polipéptido não substituído.
Modificações desta sequência de aminoácidos primária podem resultar em proteínas que tenham uma actividade substancialmente equivalente em comparação com o polipéptido correspondente não modificado e podem assim ser considerados análogos funcionais das proteínas originais. Tais modificações podem ser intencionais, p. ex. através de mutagénese dirigida ao local, ou podem ocorrer espontaneamente, e incluem variantes de processamento, isoformas, homólogos de outras espécies e polimorfismos. Tais análogos funcionais estão também contemplados de acordo com o presente invento.
Deleções C-terminais
Noutra concretização o presente invento proporciona enzimas timidina-quinase vegetais possuindo deleções C-terminais quando comparadas com a enzima original (tipo selvagem). Tais enzimas truncadas podem ser obtidas através de 11 ΕΡ 1 509 600/PT técnicas convencionais, p. ex. mutagénese dirigida ao local, ou tal como descrito nos exemplos operativos.
De acordo com o presente invento verificou-se que as deleções C-terminais criam enzimas com propriedades melhoradas, em particular maior estabilidade e/ou melhor especificidade para o substrato, quando comparadas com a enzima de tipo selvagem.
Numa concretização mais preferida o presente invento proporciona enzimas timidina-quinases possuindo uma deleção C-terminal da ordem de 1-60 resíduos de aminoácido, de preferência 1-50 resíduos de aminoácido, com maior preferência 1-40 resíduos de aminoácido, ainda com preferência Ι-ΒΟ resíduos de aminoácido, ainda com maior preferência 1-26 resíduos de aminoácido, sendo preferível 1-24 resíduos de aminoácido.
Numa concretização ainda mais preferida, a enzima timidina-quinase vegetal do presente invento é uma enzima timidina-quinase derivada de tomate que possui uma deleção C-terminal de 26 resíduos de aminoácido. Numa concretização mais preferida a enzima timidina-quinase vegetal do presente invento é uma enzima timidina-quinase possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5.
Polinucleótidos Codificando Timidina-quinases Vegetais
Noutro aspecto o presente invento proporciona polinucleótidos isolados codificando enzimas timidina-quinase vegetais derivadas de tomate, de preferência as enzimas timidina-quinase vegetais descritas acima.
Protocolo de Hibridação
Numa concretização preferida, o polinucleótido isolado do presente invento é capaz de hibridar com a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID NO:3 ou a sua cadeia complementar. 12 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ A hibridação deve ser alcançada sob condições pelo menos de baixo rigor, mas de preferência em condições de rigor médio ou elevado.
As condições experimentais adequadas para determinação da hibridação em condições de rigor baixo, médio ou elevado, respectivamente, entre uma sonda nucleotidica e uma sequência de ADN ou ARN homóloga, envolvem o embebimento prévio do filtro contendo os fragmentos de ADN ou ARN a hibridar em SSC 5χ (Cloreto de sódio/Citrato de sódio; cf. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a Ed., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989) durante 10 minutos, e pré-hibridação do filtro numa solução de SSC 5x, solução de Denhardt 5x (cf. Sambrook et al., Op cit.), SDS a 0,5% e 100 yg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado e sujeito a ultra-sons (cf. Sambrook et al., Op cit.), seguido de hibridação na mesma solução contendo uma concentração de 10 ng/ml de uma sonda iniciada de modo aleatório (Feinberg, A.P. & Vogelstein, B.; Anal. Biochem. 132: 6-13, 1983), marcada com 32P-dCTP (actividade especifica >1χ109 cpm/pg) durante 12 horas a aproximadamente a 45°C. O filtro é então lavado duas vezes durante 30 minutos em SSC 2χ, SDS a 0,5% a uma temperatura de pelo menos 55°C (condições de rigor baixo), de preferência de pelo menos 60°C (condições de rigor médio), mais preferido de pelo menos 65°C (condições de rigor médio/elevado) , ainda mais preferido de pelo menos 70°C (condições de rigor elevado), e ainda mais preferido de pelo menos 75°C (condições de rigor muito elevado).
Os ácidos nucleicos complementares ou ácidos nucleicos sinal podem ser marcados através de métodos convencionais conhecidos na arte para detectar a presença de oligonucleótidos hibridados. O método mais vulgar de detecção é a utilização de autorradiografia com, p. ex., sondas marcadas com 3H, 125I, 35S, 14C ou 32P, que podem então ser detectadas utilizando uma película de raios X. Outros marcadores incluem ligandos, que se ligam a anticorpos marcados, fluoróforos, agentes quimioluminescentes, enzimas ou anticorpos, que podem então servir como membros de um par de ligação específica para um ligando marcado. 13
ΕΡ 1 509 600/PT
Identidade das Sequências de ADN
Noutra concretização preferida, o polinucleótido isolado do presente invento tem pelo menos 73%, de preferência pelo menos 75%, com maior preferência pelo menos 80%, ainda com mais preferência pelo menos 90%, ainda com maior preferência pelo menos 95% e sendo preferível pelo menos 98% de identidade com a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID NO:3, quando determinada ao lonqo de todo o comprimento da SEQ ID NO:. Para os fins do presente invento a percentagem de identidade de sequência é calculada quando BLASTN proporciona um intervalo de sobreposição de pelo menos 100 nucleótidos, sendo o intervalo determinado sob as definições por defeito. De preferência o intervalo de sobreposição tem pelo menos 150 nucleótidos, com maior preferência pelo menos 225 nucleótidos, ainda com maior preferência pelo menos 300 nucleótidos.
No contexto deste invento, "identidade" é uma medida do grau de homologia das sequências nucleotídicas. Para caracterizar a identidade, as sequências sujeitas são alinhadas de modo a obter a maior ordem de homologia (coincidências) . Com base nestes princípios gerais, a "percentagem de identidade" de duas sequências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos é determinada utilizando o algoritmo BLASTN (Tatiana, A., Tatusova, Thomas, L. Madden; "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences"; FEMS Microbiol. Lett. 174: 247-250, 1999), que está disponível no sítio da internet de National Center for Biotechnology Information (NCBI), e utilizando as definições por defeito aqui sugeridas (i.e., Reward for a match = 1; Penalty for a match = -2; Strand option = both strands; Open gap = 5; Extension gap = 2; Penalties bap x__dropoff = 50; Expect = 10; Word size = 11; Filter on) . O algoritmo BLASTN determina a % de identidade de sequência num intervalo de sobreposição entre duas sequências nucleotídicas alinhadas. Para os fins do presente invento a percentagem de identidade de sequência é calculada num intervalo de sobreposição de pelo menos 100 nucleótidos, sendo o intervalo determinado através de BLASTN sob as definições por defeito. De preferência, o intervalo de sobreposição tem pelo menos 300 nucleótidos. 14 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ
Os resultados desta comparação BLASTN sao apresentados na Tabela 3.
Tabela 3
Comparação BLASTN de Sequências Nucleotídicas de Timidina-quinases de Diferentes Origens Vegetais TK Tomate Arroz AT (a) AT (b) Pinheiro 74/194 * 82/51 76/158 72/236 74/206 Tomate - 73/383 74/503 74/285 Arroz - - 74/315 0 AT (a) - - - 77/200
Identidades (%)/comprimento do fragmento comparado * dividido num fragmento N-terminal e num C-terminal 0 Sem semelhança significativa Timidina-quinase de pinheiro (Pinus taeda) Timidina-quinase de tomate (Lycopersicum esculentum) Timidina-quinase de arroz (Oryza sativa) Timidina-quinases (a) e (b) de Arabidopsis thaliana
Sequências de ADN Análogas
Na sua concretização mais preferida, o polinucleótido isolado do presente invento compreende a sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID NO: 3 ou um análogo funcional desta.
No contexto deste invento, o termo "análogo funcional" cobre polinucleótidos conservativamente modificados e polinucleotidos codificando polipéptidos funcionalmente equivalentes.
No contexto deste invento, o termo "polinucleótidos conservativamente modificados" refere-se aos ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas ou em que o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos para sequências essencialmente idênticas.
Devido à degenerescência do código genético um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica 15
ΕΡ 1 509 600/PT qualquer dada proteína. Por exemplo, os codões GCA, GCC, GCG e GCU codificam todos o aminoácido alanina. Assim, em todas as posições em que é especificada uma alanina por um codão, o codão pode ser alterado para qualquer um dos codões correspondentes descritos sem alterar o polipéptido codificado. Tais variações de ácidos nucleicos são "variações silenciosas" que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada uma das sequências de ácido nucleico daqui, que codifica um polipéptido, descreve também todas as possíveis variações silenciosas do ácido nucleico. Um perito reconhecerá que cada codão num ácido nucleico (excepto AUG, que é vulgarmente o único codão para metionina) pode ser modificado para dar uma molécula funcionalmente idêntica. Deste modo, cada variação silenciosa de um ácido nucleico, que codifique um polipéptido, está implícita em cada sequência descrita.
Vectores de Expressão
Num terceiro aspecto o presente invento proporciona vectores de expressão recombinantes compreendendo o polinucleótido isolado do presente invento e um promotor operativamente ligado ao polinucleótido. O vector de expressão do presente invento é de preferência um adequado para a realização da expressão num organismo eucariótico.
Numa concretização mais preferida o vector de expressão do presente invento é um vector virai, em particular um vector virai de Herpes simplex, um vector adenoviral, um vector virai associado a adenovírus, um vector de lentivírus, um vector retroviral ou um vector virai de vacínia.
Linhas Celulares de Empacotamento
Num quarto aspecto o presente invento proporciona linhas celulares de empacotamento capazes de produzir um virião infeccioso, linha celular esta que compreende um vector do presente invento. 16
ΕΡ 1 509 600/PT
As células de empacotamento referem-se a células contendo os elementos necessários para a produção de vírus recombinantes infecciosos, que faltam num vector de vírus recombinante. Os métodos para a preparação de linhas celulares de empacotamento são conhecidos na arte anterior. Células Hospedeiras
Num quinto aspecto o presente invento proporciona uma célula hospedeira isolada compreendendo o polinucleótido isolado do presente invento ou o vector de expressão do presente invento.
Numa concretização preferida a célula hospedeira do presente invento é uma célula bacteriana, de preferência uma célula eucariótica, em particular uma célula de mamífero, uma célula humana, um oócito ou uma célula de levedura.
Numa concretização mais preferida a célula hospedeira do presente invento é uma célula humana, uma célula de cão, uma célula de macaco, uma célula de rato, uma célula de porco ou uma célula de ratinho.
Composições Farmacêuticas
Para utilizar em terapia a enzima timidina-quinase vegetal do presente invento pode ser administrada de qualquer forma conveniente. Numa concretização preferida, a enzima timidina-quinase vegetal do presente invento é incorporada numa composição farmacêutica juntamente com um ou mais adjuvantes, excipientes, transportadores e/ou diluentes, e a composição farmacêutica preparada pelo perito na arte utilizando métodos convencionais conhecidos na arte.
Tais composições farmacêuticas podem compreender a enzima timidina-quinase vegetal do presente invento, ou anticorpos contra uma timidina-quinase vegetal. A composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com um ou mais outros agentes, fármacos ou hormonas. A composição farmacêutica deste invento pode ser administrada através de qualquer via adequada, incluindo, mas 17 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ não se limitando à via oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, anteral, tópica, aplicação sublingual ou rectal, bucal, vaginal, intra-orbital, intracerebral, intracraniana, intra-espinal, intraventricular, intracisterna, intracapsular, intrapulmonar, transmucosa ou através de inalação.
Mais detalhes sobre técnicas para formulação e administração podem ser encontrados na última edição de "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co., Easton, PA). O ingrediente activo pode ser administrado numa ou várias doses por dia. As dosagens apropriadas actualmente contempladas estão entre 0,5 ng a cerca de 50 pg/kg de timidina-quinase/kg de peso corporal por administração, e de cerca de 1,0 ng/kg a cerca de 100 pg/kg por dia. A dose administrada tem, como é claro, de ser cuidadosamente ajustada à idade, ao peso e à condição do indivíduo a tratar, bem como à via de administração, forma de dosagem e regímen, e o resultado desejado e a dosagem e exacta devem, como é claro, ser determinados pelo médico assistente.
Noutras concretizações, a timidina-quinase vegetal do presente invento pode ser administrada através de entrega genética, utilizando linhas celulares e vectores tal como descrito abaixo em métodos de tratamento.
Por essa razão, noutra concretização preferida, o presente invento proporciona composições farmacêuticas compreendendo o polinucleótido do presente invento, ou um vector do presente invento, ou uma célula de empacotamento do presente invento, ou uma célula hospedeira do presente invento, e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
Para gerar tais linhas celulares terapêuticas, o polinucleótido do presente invento pode ser inserido num vector de expressão, p. ex., um plasmídeo, vírus ou outro veículo de expressão, e operativamente ligado a sequências de 18 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ controlo da expressão através de ligação de um modo que a expressão da sequência de codificação seja alcançada sob condições compatíveis com as sequências de controlo da expressão.
Sequências de controlo da expressão adequadas incluem promotores, estimuladores, terminadores da transcrição, codões de início, sinais de processamento para intrões e codões de terminação, todos mantidos no enquadramento de leitura correcto do polinucleótido do presente invento de modo a permitir a tradução correcta do ARNm. As sequências de controlo da expressão podem também incluir componentes adicionais tais como sequências líder e sequências de parceiros de fusão. Métodos de Tratamento O presente invento, que se refere a polinucleótidos e proteínas, polipéptidos, fragmentos peptídicos ou derivados produzidos a partir deles, bem como a anticorpos dirigidos contra tais proteínas, péptidos ou derivados, pode ser utilizado para tratamento ou alívio de um distúrbio ou uma doença do corpo de um animal vivo, incluindo um humano, distúrbio ou doença estes que respondem à actividade de um agente citotóxico. 0 distúrbio, doença ou condição pode ser em particular um cancro ou uma infecção virai.
As células cancerígenas são células em rápida proliferação com a capacidade de invadir e metastizar tecido adjacente e assim comprometer a função de partes essenciais do corpo conduzindo a doença grave e morte. Os tratamentos habituais são cirurgia, radiação e quimioterapia e recentemente emergiu um novo tratamento, terapia génica. Na terapia enzimática de pró-fármaco dirigido por genes (GDEPT) é entregue um gene às células cancerígenas e expresso aí. A enzima correspondente converte depois o pró-fármaco administrado numa forma activa, parando a proliferação celular. Um dos sistemas GDEPT baseia-se em desoxirribonucleósido-quinases e diferentes pró-fármacos, análogos de nucleósidos. 19 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ
Os polinucleótidos do presente invento podem em particular ser utilizados como um "gene suicida", i.e., um gene de susceptibilidade a um fármaco. A transferência de um gene suicida para uma célula alvo torna a célula sensível a compostos ou composições que são relativamente não tóxicos para as células normais.
Por essa razão, num sétimo aspecto, o presente invento proporciona um método para sensibilizar células alvo a pró-fármacos, método este que compreende os passos de: i) transfecção ou transdução da célula alvo com uma sequência polinucleotídica codificando uma enzima timidina-quinase vegetal que promove a conversão do referido pró-fármaco num fármaco (citotóxico), ou de outro modo entregando a timidina-quinase vegetal à célula; e ii) entrega do referido pró-fármaco à referida célula alvo; em que a referida célula alvo é mais sensível ao referido fármaco (citotóxico) que ao referido pró-fármaco. A célula alvo pode ser uma qualquer célula de interesse, em particular uma célula humana, uma célula de cão, uma célula de macaco, uma célula de rato, uma célula de gato, uma célula de porco ou uma célula de ratinho. De preferência, a célula alvo é uma célula humana.
No seu aspecto mais amplo pode ser utilizada qualquer timidina-quinase vegetal. No entanto, numa concretização preferida, a sequência polinucleotídica codificando uma enzima timidina-quinase vegetal é uma sequência polinucleotídica do presente invento.
Numa concretização mais preferida o pró-fármaco é um análogo de nucleósidos.
No contexto deste invento um análogo de nucleósidos preferido para utilizar de acordo com o presente invento é seleccionado a partir do grupo que consiste em aciclovir (9-(2-hidroxietoxi)metilguanosina), buciclovir (9-(3,4-di- hidroxibutil)guanina), famciclovir (2-(2-(2-amino-9H-purin-9- 20 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ il)etil)-1,3-propanodiol diacetato), ganciclovir (9-(2-hidroxi-1-(hidroximetil)etoxilmetil)guanosina) , peneiclovir, valciclovir, trifluorotimidina, AZT (3'-azido-3'-desoxitimidina), AIU (5'-iodo-5'-amino-2',5'-didesoxiuridina), ara-A (arabinósido de adenosina; Vivarabina), ara-C (arabinóido de citidina), ara-G (9-beta-D-arabinofuranosilguanina), ara-T, 1-beta-D-arabinofuranosiltimina, 5-etil-2'-desoxiuridina, 5-iodo-5'-amino-2,5'-didesoxiuridina, 1-(2-desoxi-2-fluoro-beta-D-arabinofuranosil)-5-iodouracilo, idoxuridina (5-iodo-2'-desoxiuridina), fludarabina (2-fluoroadenina-9-beta-D-arabinofuranósido), gencitabina, 3'-desoxiadenosina (3-dA), 2 ',3'-didesoxiinosina (ddl), 2',3'-didesoxicitidina (ddC), 2',3'-didesoxitimidina (ddT), 2',3'-didesoxiadenosina (ddA), 2',3'-didesoxiguanosina (ddG), 2-cloro-2'-desoxiadenosina (2CdA), 5-fluorodesoxiuridina, BVaraU ((E)-5-(2-bromovinil)-1-beta-D-arabinofuranosiluracilo), BVDU (5-bromovinil-desoxiuridina), FIAU (l-(2,-desoxi-2,-fluoro-beta-D-arabinofuranosil)-5-iodouracilo), 3TC (2'-desoxi-3'-tiacitidina), dFdC gemeitabina (2',2'-difluorodesoxicitidina), dFdG (2',2'-difluorodesoxiguanosina) , 5-fluorodesoxiuridina (FdUrd), d4T (2',3'-didesidro-3'-desoxitimidina), ara-M (6-metoxipurinoarabinonucleósido) , IudR (5-Iodo-2'-desoxiuridina), CaFdA (2 '-cloro-2'-ara-fluorodesoxiadenosina), ara-U (1-beta-D-arabinofuranosiluracilo), FBVAU (E)-5-(2'-bromovinil)-1-(2-desoxi-2-fluoro-beta-D- arabinofuranosil)uracilo, FMAU l-(2-desoxi-2-fluoro-beta-D-arabinofuranosil)-5-metiluracilo, FLT 3'-fluoro-2'-desoxitimidina, 5-Br-dUrd 5-bromodesoxiuridina, 5-Cl-dUrd 5-clorodesoxiuridina ou dFdU 2',2'-difluorodesoxiuridina.
Numa concretização mais preferida o análogo de nucleósidos para utilizar de acordo com o presente invento é AZT (3'-azido-3'-desoxitimidina). A enzima timidina-quinase do presente invento pode ser utilizada directamente através, p. ex., de composições farmacêuticas injectadas, implantadas ou ingeridas para tratar um processo patológico que responda à enzima timidina-quinase. 0 polinucleótido do presente invento, incluindo as sequências complementares deste, pode ser utilizado para a 21
ΕΡ 1 509 600/PT expressão da enzima timidina-quinase do presente invento. Isto pode ser alcançado através de linhas celulares expressando tais proteínas, péptidos ou derivados do presente invento, ou através de vectores virais codificando tais proteínas, péptidos ou derivados do presente invento, ou através de células hospedeiras expressando tais proteínas, péptidos ou derivados. Estas células, vectores e composições podem ser administrados para tratamento de áreas alvo para afectar um processo de doença que responda a agentes citotóxicos.
Vectores de expressão adequados podem ser um vector virai derivado de Herpes simplex, adenovírus, lentivírus, retrovírus ou vírus vacínia ou de vários plasmídeos produzidos em bactérias, e podem ser utilizados para entrega in vivo de sequências nucleotídicas a um organismo inteiro ou a um órgão, tecido ou população celular alvo. Outros métodos incluem mas não se limitam a, transfecção por lipossomas, electroporação, transfecção com péptidos transportadores contendo sinais de localização nuclear ou outra, e entrega de genes através de sistemas de libertação lenta. Células específicas podem ser atingidas através da utilização de marcadores da superfície celular, tais como marcadores específicos para células de cancro. Tanto a proteína como uma construção de vector podem ser direccionadas a células utilizando marcadores da superfície celular. As células em divisão podem ser atingidas através de transdução com um vector retroviral, que apenas infecta células em divisão.
Ainda noutro aspecto do presente invento, sequências nucleot ídicas "anti-sentido" complementares à sequência nucleotídica do presente invento ou porções desta, podem ser utilizadas para inibir ou estimular a expressão da enzima timidina-quinase.
Noutra concretização preferida o presente invento proporciona métodos para inibição de agentes patogénicos em animais de sangue quente, métodos estes que compreendem o passo de administração ao referido animal de um polinucleótido do presente invento ou de um vector de expressão do presente invento. 22
ΕΡ 1 509 600/PT
Numa concretização mais preferida a sequência polinucleotidica ou o vector de expressão é administrado in vi vo.
Noutra concretização preferida o agente patogénico é um virus, uma bactéria ou um parasita ou mesmo uma célula tumoral.
Noutra concretização preferida o agente patogénico é uma célula imunitária auto-reactiva.
Numa concretização ainda mais preferida o método compreende ainda o passo de administração de um análogo de nucleósidos ao referido animal de sangue quente.
De preferência, o análogo de nucleósidos é seleccionado de entre os descritos acima.
Numa concretização mais preferida o análogo de nucleósidos para utilizar de acordo com o presente invento é AZT (3'-azido-3'-desoxitimidina).
Sistemas de Suicídio
Uma utilização muito importante dos genes codificando timidina-quinase do presente invento é para sistemas de suicídio em terapia baseada em células e genes. Em todos os tipos de terapias celulares e génicas em mamíferos existe a necessidade de se ter sistemas que permitam a morte irreversível das células transplantadas ou das células que tenham sido transduzidas através da terapia génica.
Existem basicamente dois tipos de terapias baseadas em células que podem ambas beneficiar de ter um sistema de suicídio inserido baseado em timidina-quinases de acordo com o presente invento. Na terapia celular de substituição, células nuas são transplantadas para um sujeito para substituírem células que tenham perdido a capacidade de realizar a sua função no corpo ou para substituírem células mortas. Uma vez transplantadas e completamente integradas no corpo do sujeito, elas não podem ser facilmente removidas por meios cirúrgicos. Por possuírem um sistema de suicídio inserido no qual uma 23
ΕΡ 1 509 600/PT timidina-quinase do presente invento é expressa constitutivamente ou indutivamente, as células podem ser mortas através da administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um análogo de nucleósidos, tal como AZT. O análogo de nucleósidos pode ser administrado se as células transplantadas começarem a proliferar de um modo descontrolado. Pode-se também desejar terminar o tratamento simplesmente porque já não há necessidade das células de substituição ou porque a continuação do tratamento será através de alguma outra via. O outro tipo de terapia baseada em células inclui células terapêuticas que são transplantadas para o corpo para segregar, p. ex., um factor de crescimento numa certa localização. Frequentemente tais células terapêuticas são encapsuladas e podem ser novamente removidas do corpo de modo relativamente fácil mas é preferida a incorporação de um sistema de suicídio porque as células podem ser mortas selectivamente sem utilização de cirurgia.
Em terapia génica in vivo aplicam-se as mesmas considerações que na terapia celular de substituição. A incorporação de um gene de suicídio pode ser alcançada através da construção de um vector virai compreendendo o gene terapêutico e uma timidina-quinase de acordo com o presente invento. De preferência, o gene terapêutico e a timidina-quinase são inseridos sob o controlo do mesmo promotor, opcionalmente separando-os com uma construção IRES.
Nos casos em que as células transplantadas foram condicionalmente imortalizadas antes da transplantação há o risco teórico de o oncogene iniciar a transcrição após a transplantação e de as células transplantadas se tornarem consequentemente tumorigénicas. Os meios para controlar esta situação são disponibilizados pelo presente invento. Sempre que as células sejam imortalizadas através de transdução com um oncogene sob o controlo de um promotor indutível (p. ex., o sistema ligado-desligado Tet, o promotor Mxl ou semelhantes), é inserida uma timidina-quinase na construção do vector sob o controlo do mesmo promotor (ou utilizando uma construção IRES). Isto assegura que sempre que o oncogene for transcrito, a timidina-quinase é também transcrita e as células 24 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ transduzidas e tumorigénicas podem ser selectivamente mortas através da administração de um análogo de nucleósidos, tal como AZT. Método de Fosforilação de Nucleósidos A enzima timidina-quinase do presente invento pode ter uma utilidade diferente, incluindo aplicações terapêuticas e biotecnológicas.
Num oitavo aspecto o presente invento refere-se à utilização da enzima timidina-quinase vegetal do presente invento para fosforilação de nucleósidos ou de um análogo de nucleósidos, com a condição de que não seja um método para tratamento do corpo humano ou de um animal através de terapia.
Numa concretização preferida o presente invento proporciona um método para fosforilação de um nucleósido ou de um análogo de nucleósidos, compreendendo os passos de: i) sujeição do nucleósido ou análogo de nucleósidos à acção da enzima timidina-quinase vegetal do presente invento; e ii) recuperação do nucleósido ou análogo de nucleósidos fosforilado; com a condição de que não seja um método para tratamento do corpo humano ou de um animal através de terapia.
Em particular, as timidina-quinases do presente invento podem ser utilizadas para fosforilação de didesoxiguanosina.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS O presente invento é ainda ilustrado através de referência aos desenhos anexos, nos quais: A Fig. 1 mostra a actividade de dTMP-quinase (CPM) ao longo do tempo (0 a 120 minutos) de AT-TKla (), AT-TKlb (·) e HSV1-TK (T), respectivamente; e A Fig. 2 mostra a actividade de AZT-monofosfato-quinase (CPM) (0 a 120 minutos) de AT-TKla (□), AT-TKlb (O) e HSV1-TK (V), respectivamente. 25
ΕΡ 1 509 600/PT
EXEMPLOS O presente invento é ainda ilustrado com referência aos seguintes exemplos, que não se pretende sejam de modo algum limitantes do âmbito do presente invento tal como reivindicado.
Exemplo 1
Construção de um Vector Retroviral Expressando Quinases Vegetais O ADNc das quinases vegetais foi clonado num vector retroviral baseado no vírus da leucemia de Moloney (MLV) de murídeo para gerar um retrovírus recombinante deficiente na replicação contendo as quinases TK1.
Os fragmentos de ADN foram amplificados com polimerase Pfu (Stratagene) utilizando iniciadores com locais de restrição flanqueadores desenhados.
As construções de Arabidopsis baseadas em AT-TKla foram cortadas com BamHl/Xhol, e os fragmentos de PCR de tomate foram cortados com BglII/Xhol, e clonados no local BglII-Xhol do vector plasmídico pLCXSN, que é um vector de transferência retroviral derivado de pLXSN (Clontech, cat# K1060-B) através de inserção do promotor CMV a montante do poliligante.
Obtiveram-se quatro construções: AtTKl (PZG53), AtTKlA24 (PZG56), TomTKl (PZG69) e TomTKlA26 (PZG59). pLCXSN sozinho e o vector contendo HSV1-TK (clonado no local BamHl/Xhol) foram utilizados como controlo.
Os plasmideos foram purificados utilizando o estojo de plasmídeos Qiagen (QIAGEN) e as sequências de ADN para os plasmideos construídos foram verificadas através de determinação da sequência de ADN.
Foram utilizadas as seguintes sequências iniciadoras: 5' ccg ctc gag atg gcg act ctc aaa gct tcc ttt ttg 3' (AT TKl-for; SEQ ID NO: 14); 26 ΕΡ 1 509 600/PT 5' cgc gga tcc tta gat tgt age age aac aca gga ttc 3' (AT TKl-rev; SEQ ID NO: 15); 5' cgc gga tcc tta aac aat atg att agt gat gta atg ctt g 3' (AT TKl DC; SEQ ID NO: 16); 5' gga aga tet tta gac aga ttg tcc att aac ata gtg ctg 3' (TTK1 DC; SEQ ID NO: 17); 5' gga aga tet tta tgg ate aac tag tgg tga ttc taa g 3' (TTKl-rev; SEQ ID NO: 18); e 5' ccg etc gag atg gct ttt tea tea tet gct aga aac 3' (TTKl-for; SEQ ID NO: 19).
Para comparação foi também construído um plasmídeo de expressão para a timidina-quinase do vírus Herpes simplex humano de tipo 1 (HSV1-TK). A timidina-quinase do HSV1 humano foi amplificada utilizando os iniciadores: 5' tat agg ate cgc cac cat ggc ttc gta ccc cgg c 3' (HSV1-TK - for; SEQ ID NO: 20); e 5' tat act cga gga ggt cga etc agt tag cc 3' (HSV1-TK - rev; SEQ ID NO: 21); e utilizando o plasmídeo pCMV-pacTK descrito por Karreman (Karreman, C., Gene 218: 57-62, 1998) como molde. Células de empacotamento 293T (ATTC CRL-11268) foram cultivadas a 37°C em meio OPTIMEM 1 (Life Technologies, Inc.). O vector plasmídico pLCXSN construído foi transfectado para as células de empacotamento utilizando LipofectAMINE PLUS (Life Technology Inc.) de acordo com o protocolo proporcionado pelo fornecedor. O meio das células transfectadas foi colhido 48 horas após a transfecção, filtrado através de um filtro de 0,45 mm, sedimentado através de ultracentrifugação (50000 xg, 90 minutos a 4°C) e dissolvido em tampão TEN (NaCl 100 mM, Tris 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM). O tampão contendo vírus foi subsequentemente utilizado para transduzir as linhas celulares de cancro com uma MOI de 5. 27 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ
Cultura Celular e Transdução Retroviral
Foram adquiridas células de glioblastoma U-87 MG (ATCC HTB-14) e glioblastoma U-118 MG (ATCC HTB-15) em American Type Culture Collection. Todas as células foram cultivadas em meio essencial mínimo, E-MEM M (Bio Whittaker n.° Cat. 12-611) com soro fetal bovino originário da Austrália a 10% (v/v) (Bio
Whittaker N.° Cat. 14-701) e 1 ml/1 de gentamicina (Bio Whittaker N.° Cat. 17-518 L). As células foram criadas a 37°C numa incubadora humidificada com uma fase gasosa de C02 a 5%.
As linhas celulares foram transduzidas com o meio contendo retrovírus misturado com 5 pg/ml de Polibreno, incubadas durante 48 horas e depois cultivadas continuamente durante 3 semanas na presença de 200 pg/ml de geneticina (Life Technologies Inc.).
Ensaios de Proliferação Celular
As células foram plaqueadas a 1500-2500 células/poço em placas de 96 poços revestidos com poli-L-lisina. AZT (3'-azido-3'-desoxitimidina; disponível em Sigma) foi adicionado após 24 horas, e o meio contendo análogos de nucleósidos não foi mudado. A sobrevivência celular foi ensaiada através do ensaio XTT (Roche) após 5 dias de exposição a fármacos.
Cada experiência foi efectuada em quatro réplicas. O valor da CI5o dos compostos investigados foi calculado como o valor médio destas experiências utilizando SigmaPlot® (Dyrberg Trading, Karislunde, DK) e calculado de acordo com a expressão: di = Max /(1+( [I] /CI5o) ) em que
Di = crescimento celular na concentração inibidora determinado através do ensaio XTT;
Max = crescimento celular máximo determinado através do ensaio XTT; [I] = a concentração inibidora; e CI50 = (concentração inibidora de 50% do crescimento) uma dose que inibe o crescimento celular em 50%. 28 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ
Expressão de Quinases Vegetais de Maior Sensibilidade a AZT
Foi determinada a sensibilidade a AZT das células não transduzidas e das células transduzidas com o vector retroviral sozinho ou com o vector contendo quinases vegetais. A citotoxidade (CI5o) foi determinada após 5 dias de exposição ao fármaco. Os resultados desta determinação são apresentados na Tabela 4.
Tabela 4
Sensibilidade (CI50) de linhas celulares de glioblastoma a AZT (nM)
As concentrações que causam 50% de letalidade são mostradas para cada construção e linha celular parental. O factor do aumento da sensibilidade é comparado com a linha celular parental. CI50 Nenhum PZG53 PZG56 PZG59 PZG69 HSV1-TK pLCXSN Linhas celulares policlonais transientes U-87 MG 4, 468 0,097 0,303 0,026 0, 047 >5 >5 U-118 MG 1,021 0,062 0,296 0,034 0,045 1, 923 0, 859 Linhas celulares policlonais estáveis U-87 MG 2,439 0,0719 0,1324 0,0251 0,017 2,577 4,0676 U-118 MG 0, 779 0,095 0,2027 0,0266 0,1902 2,7264 2,3335 A diferença na sensibilidade entre as linhas celulares parentais e as células transduzidas com o vector pLCXSN sozinho foi de menos de 1 vez. Ambas as linhas celulares de glioblastoma, que expressavam quinases vegetais, mostraram um aumento da sensibilidade ao AZT. O maior aumento foi detectado para a linha celular U-87 MG expressando TK1 de tomate com uma diminuição de quase 240 vezes na IC5o em comparação com as células não transduzidas.
Exemplo 2
Clonagem das Timidina-quinases
Este exemplo descreve como os genes codificando as timidina-quinases de tomate, pinheiro, arroz e Arabidopsis do 29 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ presente invento foram identificados e como foram construídos vectores para expressar as várias timidina-quinases.
Com base na sua homologia com a TK1 humana, foram identificadas duas sequências de tomate, ACCN BE463259 e ACCN BG129197 (disponíveis em Clemson University Genomics
Institute, USA), uma sequência de pinheiro, ACCN AW755132 (disponível em Dr. Ross Whetten, North Carolina State University, USA) , e uma EST, ACCN D24903 (disponível em MAFF DNA Bank, 1-2, 2-chome, Kannondai, Tsukuba, Ibaraki 305-8602, Japan) com homologia com a TK1 postulada de arroz (ACCN AF066050) utilizando a ferramenta de pesquisa de homologia local (tBLASTn) disponível no local da internet de NCBI, e utilizando as definições padrão (i.e., Filter on, Expect = 10, Word size = 3, Matrix = Blosum62, Gap costs = Existence 11 Extension 1).
Começando a partir de iniciadores derivados dos plasmídeos foram sequenciadas as inserções. Subsequentemente foram desenhados iniciadores com base nos dados das sequências recentemente obtidos. A sequência da inserção em D24903 combinada com a informação da sequência derivada de ACCN AU068889 previu um ORF para uma proteína 64 aminoácidos mais longa que a relatada em A066050.
Timidina-guinase de Tomate O ORF da timidina-quinase de tomate foi amplificado através de PCR utilizando os seguintes iniciadores: 5' CGC GGA TCC ATG GCT TTT TCA TCA TCT GCT AGA AAC CCA GTT GAC CTG AG 3' (IMS TOTK1-B; SEQ ID NO:22); e 5' CCG GAA TTC TTA TGG ATC AAC TAG TGG TGA TTC TAA G 3' (2MS TOTK1-E; SEQ ID NO:23); e utilizando o plasmídeo contendo ACCN BG129197 como molde. O fragmento de PCR foi subsequentemente cortado por EcoRI /BamE.1 e ligado no vector pGEX-2T (Amersham-Pharmacia) , que foi também cortado por EcoRI/BamRI. O plasmídeo resultante foi designado pGEX-2T-TOM-TKl. 30
ΕΡ 1 509 600/PT
Timidina-quinase de Arabidopsis thaliana (AT-TKla) O ORF de TKla de Arabidopsis thaliana (Entrada N.° AAF13097) foi amplificado a partir de uma biblioteca de ADNc (Stratagene) utilizando os seguintes iniciadores: 5' CGC GGA TCC ATG GCG ACT CTC AAA GCT TCC TTT TTG ATC AAA ACC C 3' (lmsAtTKl-B; SEQ ID NO:24); e 5' CCG GAA TTC TTA GAT TGT AGC AGC AAC ACA GGA TTC AGC 3' (2msAtTKl-E; SEQ ID NO:25). O fragmento de PCR foi subsequentemente cortado por EcoRI/BamHI e ligado no vector pGEX-2T (Amersham-Pharmacia), que foi também cortado por EcoRI/BamEI. O plasmídeo resultante foi designado pGEX-2T-AT-TKla.
Timidina-quinase de Arabidopsis thaliana (AT-TKlb) O ORF de TKlb de Arabidopsis thaliana (Entrada N.° BAB09824) foi amplificado a partir de uma biblioteca de ADNc (Stratagene) utilizando a seguinte estratégia, que também criou vários mutantes com deleções N-terminais de AT-TKlb. O ORF completo (ACCN BAB09824) foi amplificado a partir de uma biblioteca de ADNc (Stratagene) utilizando os iniciadores: 5' ATG AGA ACA TTA ATC TCA CCA TCT C 3' (lmtAtTKlL; SEQ ID NO:26); e
5' CTA AAG TGA ACT TGC TAC AAC ACT ATG 3' (2mtAtTKlL; SEQ ID NO : 2 7) .
Este produto de PCR completo foi utilizado para amplificação de um fragmento com pontas soltas BamRI/EcoRI utilizando os iniciadores: 5' CGC GGA TCC ATG AGA ACA TTA ATC TCA CCA TCT C 3' (lmtAtTKlL-B, SEQ ID NO:28); e 5' CCG GAA TTC CTA AAG TGA ACT TGC TAC AAC AC 3' (2mtAtTKl-E; SEQ ID NO:29). O fragmento de PCR foi subsequentemente cortado por EcoRI/BamRI e ligado no vector pGEX-2T que foi também cortado 31
ΕΡ 1 509 600/PT por EcoRI/Bamhl. O plasmídeo resultante foi designado pGEX-2T-AT-TKlb (P661).
Em analogia foram feitas deleções N-terminais e ligou-se em pGEX-2T. Foi alcançada uma deleção N-terminal de 22 aminoácidos através da utilização dos iniciadores
5' CGC GGA TCC TCC ACC GCT CTT CGC TTC TCC 3' (lmtAtTKlI-B; SEQ ID NO:3 0) ; e 2mtAtTKl-E (SEQ ID NO:29). O plasmídeo resultante foi designado pGEX-2T-AT-AN22TKlb (P662).
Foi alcançada uma deleção N-terminal de 45 aminoácidos através da utilização dos iniciadores 5' CGC GGA TCC TCC ACC AGA AAG CTA CAA ACG 3' (lmtAtTKl-B; SEQ ID NO:31); e 2mtAtTKl-E (SEQ ID NO:29). O plasmídeo resultante foi designado pGEX-2T-AT-AN45TKlb (P663).
Foi alcançada uma deleção N-terminal de 63 aminoácidos através da utilização dos iniciadores
5' CGC GGA TCC CAG CCG CTC TCC TCC TCA TC 3' (lmtATTKlS-B; SEQ ID NO:32); e 2mtAtTKl-E (SEQ ID NO:29). O plasmídeo resultante foi designado pGEX-2T-AT-AN63TKlb (P664).
Timidina-quinase de Arroz A timidina-quinase de arroz foi amplificada utilizando os iniciadores 5' CGG GAT CCG GCG GCG GCG GCG GAC AAG TCT CG 3' (losTKls-B; SEQ ID NO:3 3) ; e 5' CGG AAT TCT TAC TTG AAA GCA TGG ATA ACC TTG G 3' (2osTKl-E; SEQ ID NO:34); e utilizando D24903 como molde. 32 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ Ο fragmento de PCR foi subsequentemente cortado por EcoRI/BamRI e ligado no vector pGEX-2T (disponível em Amersham-Pharmacia) que foi também cortado por EcoRI/BamRI. O plasmídeo resultante foi designado pGEX-2T-Rice-TKl.
Timidina-guinase de HSV1 (utilizada para controlo) A timidina-quinase de HSV1 foi amplificada utilizando os iniciadores 5' CGC GGA TCC ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT C 3' (HSVl-for A; SEQ ID NO:3 5) ; e 5' CCG GAA TTC TTA GTT AGC CTC CCC CAT CTC CCG 3' (HSVI-rev; SEQ ID NO:36); e utilizando o plasmídeo pCMV-pacTK descrito por Karreman (Karreman C, Gene 218: 57-62, 1998) como molde. O fragmento de PCR foi subsequentemente cortado por EcoRI/BamRI e ligado no vector pGEX-2T (Amersham-Pharmacia) que foi também cortado por EcoRI/BamRI. O plasmídeo resultante foi designado pGEX-2T-HSVl-TK.
Exemplo 3
Expressão e Purificação de Timidina-quinases Recombinantes
Este exemplo descreve como KY895 foram transformadas com os plasmídeos obtidos de acordo com o Exemplo 2, para expressarem timidina-quinases. Células KY895 foram transformadas através dos plasmídeos de expressão do Exemplo 2 utilizando técnicas padrão, p. ex., tal como descrito, p. ex., por Sambrook et ai. (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989).
As KY895 transformadas foram criadas até uma D0600 nm de 0,5-0,6 em meio LB/Ampicilina (100 pg/ml) a 37°C e a expressão proteica foi induzida através da adição de IPTG para ficar 100 μΜ. As células foram criadas durante 4 h a 25°C e foram subsequentemente colhidas por centrifugação. O sedimento 33 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ celular foi sujeito a ultra-sons no tampão de ligação A (NaP04 20 mM, pH 7,3; NaCl 150 mM; Glicerol a 10%; e Triton X-100 a 0,1%) na presença de uma mistura de inibidores de proteases (Complete™ - livre de EDTA de Roche Dignostics). A capacidade dos extractos para fosforilarem os quatro desoxirribonucleósidos naturais foi testada a uma concentração fixa de 100 μΜ dos desoxirribonucleósidos. A especificidade mais elevada em cada extracto foi ajustada para 100%. Em (parêntesis) a actividade específica correspondente a 100% é dada em mU/mg.
Os resultados destas avaliações são apresentados na Tabela 5.
Tabela 5
Actividade de Desoxirribonucleósido-guinase em Extractos de Células KY895
4 horas de indução com IPTG 0,1 mM a 25°C KY895 transformadas com Thd dAdo dGuo dCyd pGEX-2T n.d. n.d. n.d. n.d. pGEX-2T-TOM-TKl 100 (124) n.d. n.d. 0,1 pGEX-2T-AT-TKla 100 (53) n.d. n.d. n.d. pGEX-2T-AT-TKlb 100 (4,4) n.d. n.d. 4 pGEX-2T-AT-AN22TKlb 100 (4,4) n.d. n.d. 4 pGEX-2T-AT-AN45TKlb 100 (5,2) n.d. n.d. 3 pGEX-2T-AT-AN63TKlb 100 (4) n.d. n.d. 1 n.d. designa "não detectável".
Os dados nesta tabela mostram que todas as enzimas são timidina-quinases.
Os extractos foram sujeitos a centrifugação a 10000 xg durante 30 minutos, filtrados, e carregados na coluna. A partir dai duas colunas de 1 ml de Glutationa-Sepharose (disponível em Pharmacia) foram combinadas e equilibradas em tampão de ligação A. Após carregamento da amostra, a coluna foi lavada com 40 ml de tampão de ligação A. Subsequentemente a coluna foi lavada com 5 ml de ATP/MgCl2 10 mM em (A) e incubada durante 1 hora à temperatura ambiente, e depois 30 minutos a 4°C. 0 ATP/MgCl2 foi removido através de lavagem com 10 ml de tampão de ligação A. 34
ΕΡ 1 509 600/PT A proteína etiqueta GST é clivada da TK na coluna de ligação a GST através de clivagem com trombina de acordo com o protocolo do fabricante (Pharmacia).
As constantes cinéticas da TK purificada foram determinadas tal como descrito por Munch-Petersen et al. (Munch-Petersen, B., Knecht, W., Lenz, C., Sondergaard, L., Piskur, J., “Functional expression of a multisubstrate deoxyribonucleoside quinase from Drosophila melanogaster and its C-terminal deletion mutants"; J. Biol. Chem. 275: 6673- 6679, 2000) .
Os dados cinéticos foram avaliados através de regressão não linear utilizando a equação de Michaelis-Menten v = VmaxX (S) / (Km+(S) ) ou a equação de Hill v = Vmaxx (S) h/ (K0,5h+ (S) h) tal como descrito por Knecht et al., (Knecht, W., Bergjohann, U., Gonski, S., Kirschbaum, B. e Lõffler, M., "Functional expression of a fragment of human dihydroorotate dehydrogenase by means of the baculovirus expression vector system and kinetic investigation of the purified recombinant enzyme";
Eur. J. Biochem. 240: 292-301, 1996). Km é a constante de Michaelis, K0,s define o valor da concentração de substrato (S) à qual v = 0,5 Vmax e h é o coeficiente de Hill (Cornish-
Bowden, A., “Fundamentais of enzyme kinetics"; Portland Press
Ltd., Londres, 1995, pág. 33; e Liebecg, C., "IUBMB Biochemical nomenclature and related documents"; Portland
Press Ltd., Londres, 1992).
Tabela 6
Relação entre Velocidade e Concentração de Substrato para Thd para Quinases Vegetais Recombinantes (r)
Kn (pm) Vmax (iriU/mg) kcat (S_1) W/Kn (NTV1) rTOM-TKl OO O 60 0, 026 32500 rAT-AN45TKlb* 18 165 0, 071 3944 rAT-TKla* 85 452 0,2 2353 rHSVl-TK* * 0,38 - 0, 46 1200000 * Dados de Le Breton, C.; "In vítro study of novel deoxyribonucleoside Kinases for gene therapy"; B. Sc. Report, 2002, University of Paris VII/Technical University of Denmark. ** Dados de Kokoris, M.S. e Black, M.E.; "Characterization of Herpes simplex Virus type 1 thymidine Kinase mutants engineered for 35 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ improved ganciclovir or acyclovir activity"; Protein Science 11: 2267-2272, 2002.
Tabela 7
Relação entre Velocidade e Concentração do Substrato para AZT para Quinases Vegetais Recombinantes
Km (VM) Vrrex (mCJ/mg) W (s_1) kcat/Km (M"1 S-1) rTOM-TKl 22,4 1579 0,681 30400 rAT-AN45TKlb 1,46 242 0, 104 71200 rAT-TKla 3,55 244 0, 106 29900 rHSVl-TK Γ-1—1 i—1 »·. 0,028 16500
As Tabelas 6 e 7 demonstram que as TK vegetais fosforilam AZT mais eficientemente (kcat/Km) que Thd, o que está em forte contraste com a rHSVl-TK que fosforila Thd muito mais eficientemente que AZT. A razão (kcat/Km(Thd) ) / (kcat/Km (AZT) ) para as TK de tomate, Arabidopsis e HSV1 são como se segue: rTOM-TKl 1, 07 rAT-AN45TKlb 0,06 rAT-TKla 0,08 rHSVl-TK 72, 7
Exemplo 4
Crescimento da E. coli KY895 Transformada em Placas de Análogo de Nucleósidos
Este exemplo descreve como células hospedeiras transformadas com os plasmideos obtidos de acordo com o Exemplo 2 são capazes de crescer em placas na presença do análogo de nucleósidos AZT (3'-azido-3'-desoxitimidina). A experiência foi realizada tal como descrito por Knecht et al. (Knecht, W., Munch-Petersen, B. e Piskur, J., "Identification of residues involved in the specificity and regulation of the highly efficient multisubstrate deoxiribonucleoside Kinase from Drosophila melanogaster", J. Mol. Biol. 301: 827-837, 2000). 36
ΕΡ 1 509 600/PT
Tabela 8
Crescimento de Células KY895 na Presença de AZT KY895 transformadas com DLioo pGEX-2T > 100 pGEX-2T-TOM-TKl 0,0316 pGEX-2T-AT-TKla 0,316 pGEX-2T-AT-TKlb 1 pGEX-2T-AT-AN22TKlb 0,316 pGEX-2T-AT-AN45TKlb 0,1 pGEX-2T-AT-AN63TKlb 0,1 pGEX_2T-HSVl-TK 1 pGEX-2T-hu-TKl 1 pGEX-2T-Bm-dNK 100 pGEX-2T-Dm-dNK 100 pGEX-2T é o vector e está disponível em Amersham-Pharmacia; pGEX-2T-Dm-dNK é o vector contendo o gene codificando uma desoxirribonucleósido-quinase multi-substratos derivada de Drosophila melanogaster descrita por Munch-Petersen et al. (Munch-Petersen, B., Knecht, W., Lenz, C., Sondergaard, L., Piskur, J., "Functional expression of a multisubstrate desoxyribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster and its C-terminal deletion mutants"; J. Biol. Chem. 275: 6673-6679, 2000); pGEX-2T-Bm-dNK é o vector contendo o gene codificando uma desoxirribonucleósido-quinase derivada de Bombyx mori descrita por Knecht et al. (Knecht, W., Ebert, Petersen, G., Munch-Petersen, B., Piskur, J., "Desoxyribonucleoside Kinases belonging to the timidina-quinase 2 (TK2)-like group vary significantly in substrate specificity, kinetics and feed-back regulation"; J. Mol. Biol. 315: 529-540, 2002); pGEX-2T-huTKl é o vector contendo o gene codificando uma timidina-quinase humana (TK1) descrita por Berenstein et al. (Berenstein, D., Christensen, J.F., Kristensen, T., Hofbauer, R., Munch-Petersen, B., "Valine, not methionine, is amino acid 106 in human cytosolic thymidine Kinase (TK1). Impact on 37
ΕΡ 1 509 600/PT oligomerization, stability, and kinetic properties", J. Biol. Chem. 275(41): 32187-32192, 2000). A Tabela 8 mostra que a timidina-quinase derivada de tomate é a quinase mais potente quando determinada em combinação com o análogo de nucleósidos AZT. Esta enzima é cerca de 30 vezes mais activa que a derivada de Herpes simplex.
Exemplo 5
Testes da Actividade de TK em Placas de Selecção de TK
Este exemplo descreve a determinação da actividade de timidina-quinase utilizando células KY895 transformadas com os plasmideos descritos no Exemplo 2. O teste da actividade de timidina-quinase foi realizado tal como descrito por Knecht et al. (Knecht, W., Munch-Petersen, B. e Piskur, J., “Identification of residues involved in the specificity and regulation of the highly efficient multisubstrate deoxyribonucleoside Kinase from Drosophila melanogaster", J. Mol. Biol. 301: 827-837, 2000). pGEX-2T é o vector disponível em Amersham-Pharmacia utilizado como controlo. A desoxirribonucleósido-quinase multisubstratos da mosca da fruta Drosophila melanogaster (pGEX-2T-Dm-dNK), obtido de acordo com Munch-Petersen et al. (Munch-Petersen, B., Knecht, W., Lenz, C., Sondergaard, L., Piskur, J., "Functional expression of a multisubstrate deoxyribonucleoside Kinase from Drosophila melanogaster and its C-terminal deletion mutants"; J. Biol. Chem. 275: 6673-6679, 2000) foi utilizada como controlo positivo. 38 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ
Tabela 9
Crescimento em Placas de Selecção de TK
Timidina (pg/ml) 0,05 1 2 10 20 50 pGEX-2T - - - - - - pGEX-2T-Dm-dNK + + + + + + pGEX-2T-T0M-TKl + + + + + + pGEX-2T-Rice-TKl n.d. n.d. + n.d. n.d. n.d. pGEX-2T-AT-TKla n.d. n.d. + n.d. n.d. n.d. + crescimento - sem crescimento n.d. não determinado
Este exemplo demonstra que todas as enzimas sao capazes de fosforilar timidina.
Exemplo 6
Fosforilação de Monofosfatos de Nucleósidos em Difosfatos de Nucleósidos A actividade monofosfato-quinase foi testada através da determinação dos produtos das reacções catalisadas por timidina-quinase, essencialmente tal como descrito por Munch-Petersen et al., J. Biol. Chem. 273: 7 3926-3931, 1998.
Resumidamente, a quantidade de enzima que catalisa a conversão de 30 nmol/min de timidina em monofosfato de timidina (30 mU) foi incubada em 100 μΐ de uma mistura de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 (22°C); MgCl2 2,5 mM; ATP 2,5 mM; ditiotreitol 10 mM; CHAPS 0,5 mM; 3 mg/ml de albumina de soro bovino; e substrato marcado com 3H 100 μΜ (1,8 Ci/mmol).
Amostras temporais de 5 μΐ de mistura reaccional foram misturadas com 5 μΐ de timidina 5 mM, TMP, TDP e TTP. 5 μΐ desta mistura foram plaqueados em placas de polietilenimina-celulose, que foram reveladas ascendendo em LÍCI2 0,5 M. Os pontos com os nucleósidos e nucleótidos foram identificados sob luz UV e cortados. A radioactividade nos pontos foi extraída com KC1 0,2 M em HC1 0,1 M, e determinada através de contagem de cintilações 39 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ líquidas. 1 pmol de nucleósido/nucleótido radioactivo conta 850 cpm.
As timidina-quinases recombinantes foram expressas e purificadas tal como descrito no Exemplo 3.
Os resultados desta experiência são apresentados nas Figs. 1 e 2. As cpm obtidas nos tempos indicados (15, 30, 60, 90 e 120 minutos, respectivamente) são determinadas nos pontos TDP derivados de 2,5 μΐ da mistura reaccional.
Tal como esperado, HSV1-TK fosforila ambos os substratos, mas o substrato AZT-monofosfato é fosforilado a um grau 10 vezes inferior ao do substrato timidina.
Surpreendentemente, no entanto, as enzimas TK1 vegetais são capazes de fosforilar AZT-monofosfato embora sejam incapazes de fosforilar TMP. Esta nova propriedade nunca foi anteriormente relatada para nenhuma timidina-quinase.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Wolfgang Knecht,
Birgitte Munch-Petersen,
Jure Piskur, <120> Timidina-quinases de plantas e sua utilização
<130> 504-204-WO <150> DK PA 2002 00794 <151> 2002-05-23 <150> DK PA 2003 00178 <151> 2003-02-07 <160> 36 <170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 660 <212> ADN <213> Pinus taeda <220>
<221> CDS <222> (1)..(660) <223> 40 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ <400> 1 atg gat gac teg ggt ate tac aca agt gga gaa att cat ctt ate ttg 48 Met Asp Asp Ser Gly Ile Tyr Thr Ser Gly Glu Ile His Leu Ile Leu 1 5 10 15 ggg cct atg ttc gcg ggc aag acg act gee ctt att cgt aaa atg cga 96 ' Gly Pro Met Phe Ala Gly Lys Thr Thr Ala Leu Ile Arg Lys Met Arg 20 25 30 gca gaa att caa atg ggc aga aga gtg gtg ctt gtg aaa tet gac aag 144 Ala Glu Ile Gin Met Gly Arg Arg Val Val Leu Val Lys Ser Asp Lys 35 40 45 gat aca aga tat 999 ctg aac tea gtt gtg tet cat gat ggt gca aaa 192 Asp Thr Arg Tyr Gly Leu Asn Ser Val Val Ser His Asp Gly Ala Lys 50 55 60 atg cct tgc tgg gct gtt gca gat ctt gca tet ttc aaa ggc aaa tta 240 Met Pro Cys Trp Ala Vai Ala Asp Leu Ala Ser Phe Lys Gly Lys Leu 65 70 75 80 gga gag gag gct tac aag cag gta gat gtg ate ggc att gat gaa gca 288 Gly Glu Glu Ala Tyr Lys Gin Vai Asp Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala 85 90 95 cag ttc ttc· aaa gac ctg tat agt ttt tgt cag gta gca gct gat aga 336 Gin Phe Phe Lys Asp Leu Tyr Ser Phe Cys Gin Val Ala Ala Asp Arg 100 105 110 gat ggg aaa att gtt att gtt gct ggc ctt gat ggg gat tat ttg agg 384 A3p Gly Lys Ile Vai Ile Val Ala Gly Leu Asp Gly Asp Tyr Leu Arg 115 12 0 125 aag age ttt gga tea gct ctt gag ttg ata cct ata gcg gat tet gta 432 Lys Ser Phe Gly Ser Ala Leu Glu Leu Ile Pro Ile Ala Asp Ser Val 13 0 135 140 gtt aaa ttg aag tea ege tgt gag ctg tgt ggt aag gee gca tea ttt 480 Vai Lys Leu Lys Ser Arg Cys Glu Leu Cys Gly Lys Ala Ala Ser Phe 145 150 155 160 aca ttt cgt aaa aca gga gaa aga aaa act gaa gtt gtt ggt ggt gca 528 Thr Phe Arg Lys Thr Gly Glu Arg Lys Thr Glu Val Val Gly Gly Ala 165 170 175 gac att tac atg cca gtg tgc cga cgg cac tat gta aat ggg caa att 576 Asp Ile Tyr Met Pro Vai Cys Arg Arg His Tyr Val Asn Gly Gin Ile 180 185 190 gtt att gat aca acg agg gct gtg ctg gaa tcc ccg gag gtg caa tat 624 Vai Ile Asp Thr Thr Arg Ala Val Leu Glu Ser Pro Glu Val Gin Tyr 195 200 205 gat gct tgt gca caa gca acc aca aca tet gga taa 660 Asp Ala Cys Ala Gin Ala Thr Thr Thr Ser Gly 210 215 <210> 2 <211> 219
<212> PRT <213> Pinus taeda 41 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ <400> 2
Met 1 Asp Asp Ser Gly 5 Ile Tyr Thr Ser Gly 10 Glu Ile His Leu Ile Leu 15 Gly Pro Met Phe 20 Ala Gly Lys Thr Thr 25 Ala Leu Ile Arg Lys Met Arg 30 Ala Glu Ile Gin 35 Met Gly Arg Arg 40 Vai Vai Leu Vai Lys 45 Ser Asp Lys Asp Thr 50 Arg Tyr Gly Leu Asn 55 Ser Vai Vai Ser His Asp 60 Gly Ala Lys Met 65 Pro Cys Trp Ala Vai 70 Ala Asp Leu Ala Ser Phe Lys 75 Gly Lys Leu 80 Sly Glu Glu Ala Tyr 85 Lys Gin Vai Asp Vai 90 Ile Gly Ile Asp Glu Ala 95 Gin Phe Phe Lys 100 Asp Leu Tyr Ser Phe 105 Cys Gin Vai Ala Ala Asp Arg 110 Asp Gly Lys Ile 115 Vai Ile Vai Ala 120 Gly Leu Asp Gly Asp 125 Tyr Leu Arg Lys Ser 130 Phe Gly Ser Ala Leu 135 Glu Leu Ile Pro Ile Ala 140 Asp Ser Vai Vai 145 Lys Leu Lys Ser Arg 150 Cys Glu Leu Cys Gly Lys Ala 155 Ala Ser Phe 160 Thr Phe Arg Lys Thr 165 Gly Glu Arg Lys Thr 170 Glu Vai Vai Gly Gly Ala 175 Asp Ile Tyr Met 180 Pro Vai Cys Arg Arg His 185 Tyr Vai Asn Gly Gin Ile 190 Vai Ile Asp Thr 195 Thr Arg Ala Vai 200 Leu Glu Ser Pro Glu 205 Vai Gin Tyr Asp Ala 210 Cys Ala Gin Ala Thr 215 Thr Thr Ser Gly
<210> 3 <211> 705 <212> ADN <213> Lycopersicon esculentum <220> <221> CDS <222> (1)..(705) <223> 42 ΕΡ 1 509 600/PT <400> 3 atg gct ttt tca tca tct gct aga aac cca gtt gac ctg aga aat gga 48 Met 1 Ala Phe Ser Ser 5 Ser Ala Arg Asn Pro 10 Val Asp Leu Arg Asn 15 Gly tcg aag aac agt ttt tgt ccg gtg ggt gaa ata cat gta att gtt ggt 96 Ser Lys Asn Ser 20 Phe Cys Pro Val Gly 25 Glu Ile His Val Ile 30 Val Gly cct atg ttt gct gga aaa acc act gct ctt ctt cgc cgg gtc aat ttg 144 Pro Met Phe 35 Ala Gly Lys Thr Thr 40 Ala Leu Leu Arg Arg Val 45 Asn Leu gaa tcc aac gat ggg aga aat gtg gta ctg att aag tca agt aaa gat 192 Glu Ser 50 Asn Asp Gly Arg Asn 55 Val val, Deu Ile Lys 60 Ser Ser Lys Asp gca aga tat gct gta gat gca gtg gtg aca cat gat ggg aca aga ttt 240 Ala Arg 65 Tyr Ala Vai Asp 70 Ala Val val Thr His 75 Asp Gly Thr Arg Phe 80 cca tgt tgg tca ttg ccg gat ctt tca tct ttc aag cag aga ttt gga 288 Pro Cys Trp Ser Leu 85 Pro Asp Leu Ser Ser 90 Phe Lys Gin Arg Phe 95 Gly aaa gat gca tat gaa aag gtg gat gtg att ggc ate gat gaa gct cag 336 Lys Asp Ala Tyr Glu Lys Val Asp Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gin 100 105 110 ttc ttt ggg gac ctt tat gag ttc tgc tgc aat gct gct gat ttt gat 384 Phe Phe Gly Asp Leu Tyr Glu Phe Cys Cys Asn Ala Ala Asp Phe Asp 115 120 125 ggg aaa att ata- gtt gtt gca ggc cta gat ggt gat tac ttg agg aag 432 Gly Lys Ile Ile Val Val Ala Gly Leu Asp Gly Asp Tyr Leu Arg Lys 130 135 140 agt ttt ggt tca gtg ctt gac ata att cca ctt gct gat act gtg acc 480 Ser Phe Gly Ser Val Leu Asp Ile Ile Pro Leu Ala Asp Thr Val Thr 145 150 155 160 aag ttg act gct aga tgt gag ttg tgt aac aga agg gca. .ttt ttc acc 528 Lys Leu Thr Ala Arg Cys Glu Leu Cys Asn Arg Arg Ala Phe Phe Thr 165 170 175 ttc aga aag act aat gag aca gag act gag ctt ata gga ggt gct gat 576 Phe Arg Lys Thr Asn Glu Thr Glu Thr Glu Leu Ile Gly Gly Ala Asp 180 185 190 att tac atg cct gtt tgt cgt cag cac tat gtt aat gga caa tct gtc 624 Ile Tyr Met Pro Val Cys Arg Gin His Tyr Val Asn Gly Gin Ser Val 195 200 205 aat gaa tct gca aaa atg gtt ctt gaa tct cat aaa gtg tca aat gaa 672 Asn Glu Ser Ala Lys Met Val Leu Glu Ser His Lys Val Ser Asn Glu 210 215 220 ctt ate tta gaa tca cca cta gtt gat cca táa 705 Leu Ile Leu Glu Ser Pro Leu Val Asp Pro 225 230
<210> 4 <211> 234 <212> PRT <213> Lycopersicon esculentum 43 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ <400> 4 Met 1 Ala Phe Ser Ser 5 Ser Ala Arg Asn Pro 10 Vai Asp Leu Arg Asn 15 Gly Ser Lys Asn Ser 20 Phe Cys Pro Vai Gly 25 Glu Ile His Vai Ile 30 Vai Gly Pro Met Phe 35 Ala Gly Lys Thr Thr 40 Ala Leu Leu Arg Arg 45 Vai Asn Leu GXu Ser 50 Asn Asp Gly Arg Asn 55 Vai Vai Leu Ile Lys 60 Ser Ser Lys Asp Ala 65 Arg Tyr Ala Vai Asp 70 Ala Vai Vai Thr His 75 Asp Gly Thr Arg Phe 80 Pro Cys Trp Ser Leu 85 Pro Asp Leu Ser Ser 90 Phe Lys Gin Arg Phe 95 Gly
Lys Asp Ala Tyr 100 Glu Lys Vai Asp Vai 105 Ile Gly Ile Asp Glu 110 Ala Gin Phe Phe Gly 115 Asp Leu Tyr Glu Phe 120 Cys Cys Asn Ala Ala 125 Asp Phe Asp Gly Lys 130 Ile íle Vai Vai Ala 135 Gly Leu Asp Gly Asp 140 Tyr Leu Arg Lys Ser 145 Phe Gly Ser Vai Leu 150 Asp Ile Ile Pro Leu 155 Ala Asp Thr Val Thr 160 Lys Leu Thr Ala Arg 165 Cys Glu Leu Cys Asn 170 Arg Arg Ala Phe Phe 175 Thr Phe Arg Lys Thr 180 Asn Glu Thr Glu Thr 185 Glu Leu Ile Gly Gly 190 Ala Asp Ile Tyr Met 195 Pro Vai Cys Arg Gin 200 His Tyr Vai Asn Gly 205 Gin Ser Val Asn Glu 210 Ser Ala Lys Met Vai 215 Leu Glu Ser His Lys 220 val Ser Asn Glu ' Leu 225 Ile Leu Glu Ser Pro 230 Leu Vai Asp Pro
<210> 5 <211> 208 <212> PRT <213> Lycopersicon esculentum 44 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ <400> 5
Met 1 Ala Phe Ser Ser 5 Ser Ala Arg Asn Pro 10 Vai Asp Leu Arg Asn Gly 15 Ser Lys Asn Ser 20 Phe Cys Pro Vai Gly 25 Glu Ile His Vai Ile 30 Vai Gly Pro Met Phe Ala 35 Gly Lys Thr Thr 40 Ala Leu Leu Arg Arg 45 Vai Asn Leu Glu Ser 50 Asn Asp Gly Arg Asn 55 Vai Vai Leu Ile Lys 60 Ser Ser Lys Asp Ala Arg 65 Tyr Ala Vai Asp 70 Ala Vai Vai Thr His Asp 75 Gly Thr Arg Phe 80 Pro Cys Trp Ser Leu 85 Pro Asp Leu Ser Ser 90 Phe Lys Gin Arg Phe 95 Gly Lys Asp Ala Tyr 100 Glu Lys Vai Asp Vai 105 Ile Gly Ile Asp Glu 110 Ala Gin Phe Phe Gly Asp 115 Leu Tyr Glu Phe 120 Cys Cys Asn Ala Ala 125 Asp Phe Asp Gly Lys 130 Ile Ile Vai Vai Ala 135 Gly Leu Asp Gly Asp 140 Tyr Leu Arg Lys Ser 145 Phe Gly Ser Vai Leu Asp 150- Ile Ile Pro Leu Ala 155 Asp Thr Vai Thr 160 Lys Leu Thr Ala Arg 165 Cys Glu Leu Cys Asn 170 Arg Arg Ala Phe Phe 175 Thr Phe Arg Lys Thr 180 Asn Glu Thr Glu Thr 185 Glu Leu Ile Gly Gly Ala 190 Asp Xle Tyr Met Pro 195 Vai Cys Arg Gin 200 His Tyr Vai Asn Gly 205 Gin Ser Vai <210> 6 <211 > 831 <212> ADN <213> Oryza sativa <2 2 0 > <221> CDS <222> d).. (831) <223> 45 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ <400> 6 atg age tcc att tgc gee atg aga tcc ctc ctc gee gee tcc acc ttc 48 Met 1 Ser Ser Ile Cys 5 Ala Met Arg Ser Leu 10 Leu Ala Ala Ser Thr 15 Phe ctc ege tcc ggc gct tcc cct ctg ctg cgg CCC ctt tcc cgt cct ctc 96 Leu Arg Ser Gly 20 Ala Ser Pro Leu Leu 25 Arg Pro Leu Ser Arg 30 Pro Leu cct tcc ege ctg aat ctt tcc cga ttc ggt ccg gtg agg ccg gtc tet 144 Pro Ser Arg 35 Leu Asn. Leu Ser Arg 40 Phe Gly Pro Vai Arg Pro 45 Vai Ser gcg gcg gcg gcg gcg gcg gac aag tet cga gsc gga ggc ggc tcc gcg 192 Ala Ala 50 Ala Ala Ala Ala Asp 55 Lys Ser Arg Gly Gly 60 Gly Gly Ser Ala atg gag gee cag ccg teg tat CCC ggt gag att cac gtc ate gtg ggc 240 Met 65 Glu Ala Gin Pro Ser 70 Tyr Pro Gly Glu Ile 75 His Vai Ile Val Gly 80 ccc atg ttc gee ggg aag acc act gee Ctt ctc cga ege gtg cag gtc 288 Pro Met Phe Ala Gly 85 Lys Thr Thr Ala Leu 90 Leu Arg Arg Vai Gin 95 Val gag gee ggc act ggc agg aac gtg gea ctc ate aag tet gac aag gac 336 Glu Ala Gly Thr 100 Gly Arg Asn Vai Ala 105 Leu Ile Lys Ser Asp 110 Lys Asp aat agg tat gga ttg gat tet gtc gta act cat gat ggc aca aag atg 384 Asn Arg Tyr 115 Gly Leu Asp Ser Vai 120 Vai Thr His Asp Gly Thr 125 Lys Met cea tgc tgg gct cta cct gag ctt tea agt ttc caa gat aaa tta gga 432 Pro Cys 130 Trp Ala' Leu Pro Glu 135 Leu Ser Ser Phe Gin 140 Asp Lys Leu Gly aca gag gct tac gat aag gtt gat gtc ata ggt att gat gaa gea cag 480 Thr 145 Glu Ala Tyr Asp Lys 150 Val Asp Val Ile Gly 1.55 Ile Asp Glu Ala Gin 160 ttt ttt gac gat ctt cat gat ttc tgc tgc aaa gct gct gac cgt gat 528 Phe Phe Asp Asp Leu 165 His Asp Phe Cys Cys 170 Lys Ala Ala Asp Arg 175 Asp gga aaa att gtt gta gtc gea ggg cta gat ggt gac tac aaa agg aac 576 Gly Lys Ile Val 180 Val Val Ala Gly Leu 185 Asp Gly Asp Tyr Lys 190 Arg Asn aaa ttt ggg tea gtt ctg gac att ata ccc ttg gct gac teg gtc acc 624 Lys Phe Gly 195 Ser Val Leu Asp Ile 200 Ile Pro Leu Ala Asp 205 Ser Val Thr aag ctc acc gea ege tgt gag ttg tgc ggt ege cgt gea ttc ttc acg 672 Lys Leu 210 Thr Ala Arg Cys Glu 215 Leu Cys Gly Arg Arg 220 Ala Phe Phe Thr ctg agg aag aca cgg gaa act aag acc gag ctc att gga gga gct gat 720 Leu 225 Arg Lys Thr Arg Glu 230 Thr Lys Thr Glu Leu 235 Ile Gly Gly Ala Asp 240 gtg tac atg cct gta tgt agg caa cac tac ctg gat ggt cag att gtc 768 Val Tyr Met Pro Val 245 Cys Arg Gin His Tyr 250 Leu Asp Gly Gin Ile 255 Val att gag gee aca agg att gtg ctg gat ctt gaa aaa tcc aag gtt ate 816 Ile Glu Ala Thr 260 Arg Ile Val Leu Asp 265 Leu Glu Lys Ser Lys 270 Val Ile cat gct ttc aag tga His Ala Phe Lys 275 831 46
ΕΡ 1 509 600/PT <210 > 7 <211 > 276 <212 > PRT <213 > Oryza sa <400 > 1
Met 1 Ser Ser Ile Cys 5 Ala Met Arg Ser Leu Leu 10 Ala Ala Ser Thr 15 Phe Leu Arg Ser Gly 20 Ala Ser Pro Leu Leu 25 Arg Pro Leu Ser Arg 30 Pro Leu Pro Ser Arg 35 Leu Asn Leu Ser Arg 40 Phe Gly Pro Vai Arg 45 Pro Vai Ser Ala Ala 50 Ala Ala Ala Ala Asp 55 Lys Ser Arg Gly Gly 60 Gly Gly Ser Ala Met 65 Glu Ala Gin Pro Ser 70 Tyr Pro Gly Glu Ile 75 His Vai Ile Vai Gly 80
Pro Met Phe Ala Gly 85 Lys Thr Thr Ala Leu 90 Glu Ala Gly Thr 100 Gly Arg Asn Vai Ala 105 Leu Asn Arg Tyr 115 Gly Leu Asp Ser Vai 120 Vai Thr Pro Cys 130 Trp Ala Leu Pro Glu 135 Leu Ser Ser Thr 145 Glu Ala Tyr Asp Lys 150 Vai Asp Vai Ile Phe Phe Asp Asp Leu 165 His Asp Phe Cys Cys 170 Gly Γ.γ« Tle 180 185 Lys Phe Gly 195 Ser Vai Leu Asp Ile 200 Ile Pro Lys Leu 210 Thr Ala Arg Cys Glu 215 Leu Cys Gly Leu 225 Arg Lys Thr Arg Glu 230 Thr Lys Thr Glu Vai Tyr Met Pro Vai 245 Cys Arg Gin His Tyr 250 Ile Glu Ala Thr 260 Arg Ile Vai Leu Asp 265 Leu His Ala Phe 275 Lys
Leu Arg Arg Vai Gin Vai 95
Ile Lys Ser Asp Lys Asp 110
His Asp Gly Thr Lys Met 125
Phe Gin Asp Lys Leu Gly 140
Gly Ile Asp Glu Ala Gin 155 160
Lys Ala Ala Asp Arg Asp 175
Gly Asp Tyr Lys Arg Asn 190
Leu Ala Asp Ser. Vai Thr 205
Arg Arg Ala Phe Phe Thr 220
Leu Ile Gly Gly Ala Asp 235 240
Leu Asp Gly Gin Ile Vai 255
Glu Lys Ser Lys Vai Ile 270 <210> 8 <211> 717 <212> ADN Λ 00 \—1 Oxl V Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> <223> (D . . (717) 47 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ <400> 8 atg Scg act ctc aaa gct tcc ttt ttg ate aaa acc ctc gac agt gac 48 Met 1 Ala Thr Leu Lys 5 Ala Ser Phe Leu Ile 10 Lys Thr Leu Asp Ser 15 Asp gtc acc gga gat ttt ctc tcc gat ctg gaa cgt cgt ggg tea ggt gct 96 Vai Thr Gly Asp 20 Phe Leu Ser Asp Leu 25 Glu Arg Arg Gly Ser 30 Gly Ala gtt cat gtt ate atg ggt cct atg ttt tet ggg aaa teg acc tet ctc 144 Vai His Vai 35 Ile Met Gly Pro Met 40 Phe Ser Gly Lys Ser 45 Thr Ser Leu ctt cg c cga ate aag tea gag ate age gac gga aga agt gtt gcg atg 192 Leu Arg 50 Arg Ile Lys Ser Glu 55 Ile Ser Asp Gly Arg 60 Ser Val Ala Met ctg aaa teg agt aag gat acg aga tac gea aaa gat teg gtg gtg aca 240 Leu 65 Lys Ser Ser Lys Asp 70 Thr Arg Tyr Ala Lys 75 Asp Ser Val val Thr 80 cat gat gga att gga ttc cct tgc tgg gct Ctt cca gat ctc atg tea 288 His Asp Gly Ile Gly 85 Phe Pro Cys Trp Ala 90 Leu Pro Asp Leu Met 95 Ser ttt cct gag aaa ttc gga cta gat gct tat aac aag ctt gat gtg att 336 Phe Pro Glu Lys 100 Phe Gly Leu Asp Ala 105 Tyr Asn Lys Leu Asp 110 Val Ile ggt att gat gag gct cag ttc ttt gga gat ctt tat gag ttt tgc tgc 384 Gly Ile Asp 115 Glu Ala Gin Phe Phe 120 Gly Asp Leu Tyr Glu 125 Phe Cys Cys aaa gtc gct gat gat gat ggt aaa att gtg ate gtt gct ggc cta gat 432 Lys Vai 130 Ala Asp Asp Asp Gly 135 Lys Ile Val Ile Val 140 Ala Gly Leu Asp ggt gac tat tta agg agg agt ttt ggg gct gta ctt gac att ata cca 480 Gly 145 Asp Tyr Leu Arg Arg 150 Ser Phe Gly Ala Val 155 Leu Asp Ile Ile Pro 160 ata gct gat tet gtg act aag cta act gea agg tgt gag gtc tgt gga 528 Ile Ala Asp Ser Vai 165 Thr Lys Leu Thr Ala 170 Arg Cys Glu Val Cys 175 Gly cat aaa gct ttc ttc act tta aga aag aat tgt gac acc aga act gag 576 His Lys Ala Phe 180 Phe Thr Leu Arg Lys 185 Asn Cys Asp Thr Arg 190 Thr Glu ctt att ggt gga gct gat gtc tat atg cct gtt tgt ege aag cat tac 624 Leu Ile Gly 195 Gly Ala Asp Vai Tyr 200 Met Pro val Cys Arg 205 Lys His Tyr ate act aat cat att gtt att aaa gee tet aag aaa gtc ttg gaa gat 672 Ile Thr 210 Asn His Ile Vai Ile 215 Lys Ala Ser Lys Lys 220 Val Leu Glu Asp tet gac aag gct aga gct gaa tcc Ser Asp Lys Ala Arg Ala Glu Ser 225 230 <210> 9 <211> 238 <212> PRT <213> Arabídopsis thaliana tgt Cys gtt Val gct Ala 235 gct Ala aca Thr ate Ile taa 717 48 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ <400> 9
Met 1 Ala Thr Leu Lys 5 Ala Ser Phe Leu Ile 10 Lys Thr Leu Asp Ser 15 Asp Vai Thr Gly Asp 20 Phe Léu Ser Asp Leu 25 Glu Arg Arg Gly Ser 30 Gly Ala Vai His Vai 35 Ile Met Gly Pro’ Met 40 Phe Ser Gly Lys Ser 45 Thr Ser Leu Leu Arg 50 Arg Ile Lys Ser Glu 55 Ile Ser Asp Gly Arg 60 Ser Vai Ala Met Leu 65 Lys Ser Ser Lys Asp 70 Thr Arg Tyr Ala Lys 75 Asp Ser Vai Vai Thr 80 His Asp Gly Ile Gly 85 Phe Pro Cys Trp Ala 90 Leu Pro Asp Leu Met 95 Ser Phe Pro Glu Lys 100 Phe Gly Leu Asp Ala 105 Tyr Asn Lys Leu Asp 110 Vai Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gin Phe Phe Gly Asp Leu Tyr Glu Phe Cys Cys 115 120 125 Lys Vai 130 Ala Asp Asp Asp Gly 135 Lys Ile Vai Ile Vai 140 Ala Gly Leu Asp Gly 145 Asp Tyr Leu Arg Arg 150 Ser Phe Gly Ala Vai 155 Leu Asp Ile Ile Pro 160 Ile Ala Asp Ser Vai 165 Thr Lys Leu Thr Ala 170 Arg Cys Glu Vai Cys .175 Gly -His- Lys Ala Phe -Phe -Thr Leu Arg -Lys -Asn Cys -Asp- Thr Arg- -Thr- Glu_ 180 185 190
Leu Ile Gly Gly Ala Asp Vai Tyr Met Pro Vai Cys Arg Lys His Tyr 195 200 205
Ile Thr Asn His Ile Vai Ile Lys Ala Ser Lys Lys Vai Leu Glu Asp 210 215 220
Ser Asp Lys Ala Arg Ala Glu Ser Cys Vai Ala Ala Thr Ile 225 230 235 <210> 10 <211> 645 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (D . . (645) <223> 49 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ <400> 10 atg gcg act ctc aaa gct tec ttt ttg ate aaa acc ctc1 gac agt gac 48 Met Ala Thr Leu Lys Ala Ser Phe Leu Ile Lys Thr Leu Asp Ser Asp 1 5 10 15 gtc acc gga gat ttt ctc tcc gat ctg gaa cgt cgt ggg tea ggt gct 96 Vai Thr Gly Asp Phe Leu Ser Asp Leu Glu Arg Arg Gly Ser Gly Ala 20 25 30 gtt cat gtt ate atg ggt cct atg ttt tet ggg aaa teg acc tet ctc 144 Val His val Ile Met Gly Pro Met Phe Ser Gly Lys Ser Thr Ser Leu 35 40 45 ctt ege cga ate aag tea gag ate age gac gga aga agt gtt gcg atg 192 Leu Arg Arg Ile Lys Ser Glu Ile Ser Asp Gly Arg Ser Val Ala Met 50 55 60 ctg aaa teg agt aag gat acg aga tac gea aaa gat teg gtg gtg aca 240 Leu Lys Ser Ser Lys Asp Thr Arg Tyr Ala Lys Asp Ser Val Val Thr 65 70 75 80 cat gat gga att gga ttc cct tgc tgg gct ctt cca gat ctc atg tea 288 His Asp Gly Ile Gly Phe Pro Cys Trp Ala Leu Pro Asp Leu Met Ser 85 90 95 ttt cct gag a&a ttc gga cta gat gct tat a&c aag ctt gat gtg att 336 Phe Pro Glu Lys Phe Gly Leu Asp Ala Tyr Asn Lys Leu Asp Val Ile 100 105 110 ggt att gat gag gct cag ttc ttt gga gat ctt tat gag ttt tgc tgc 384 Gly Ile Asp Glu Ala Gin Phe Phe Gly Asp Leu Tyr Glu Phe Cys Cys 115 120 125 aaa gtc gct gat gat gat ggt aaa att gtg ate gtt gct ggc cta gat 432 Lys Val Ala Asp Asp Asp Gly Lys Ile Val Ile Val Ala Gly Leu Asp 130 135 140 ggt gac tat tta agg agg agt ttt ggg gct gta Ctt gac att ata cca 480 Gly Asp Tyr Leu Arg Arg Ser Phe Gly Ala Val Leu Asp Ile Ile Pro 145 150 155 160 ata gct gat tet gtg act aag cta act gea agg tgt gag gtc tgt gga 528 Ile Ala Asp Ser Val Thr Lys Leu Thr Ala Arg Cys Glu Val Cys Gly 165 17 0 175 aaa gcL L Lc± ay cl úây c±aL LgL yae àuc aga' act gag His Lys Ala Phe Phe Thr Leu Arg Lys Asn Cys Asp Thr Arg Thr Glu 180 185 190 ctt att ggt gga gct gat gtc tat atg cct gtt tgt ege aag cat tac 624 Leu Ile Gly Gly Ala Asp Val Tyr Met Pro Val Cys Arg Lys His Tyr 195 200 205 ate act aat cat att gtt taa 645 Ile Thr Asn His Ile Val 210
<210 > 11 <211> 214 <212> PRT <213> Arabidopsis thalíana 50
ΕΡ 1 509 600/PT <400> 11
Met 1 Ala Thr Leu Lys 5 Ala Ser Phe Leu Ile 10 Lys Thr Leu Asp Ser Asp 15 Vai Thr Gly Asp 20 Phe Leu Ser Asp Leu 25 Glu Arg Arg Gly Ser 30 Gly Ala Vai His Vai 35 Ile Met Gly Pro Met 40 Phe Ser Gly Lys Ser 45 Thr Ser Leu Leu Arg 50 Arg Ile Lys Ser Glu 55 Ile Ser Asp Gly Arg 60 Ser Vai Ala Met Leu 65 Lys Ser Ser Lys Asp 70 Thr Arg Tyr Ala Lys 75 Asp Ser Vai Vai Thr 80 His Asp Gly Ile Gly 85 Phe Pro Cys Trp Ala 90 Leu Pro Asp Leu Met 95 Ser Phe Pro Glu Lys 100 Phe Gly Leu Asp Ala 105 Tyr Asn Lys Leu Asp 110 Vai Ile Gly Ile Asp 115 Glu Ala Gin Phe Phe 120 Gly Asp Leu Tyr Glu 125 Phe Cys Cys Lys Vai 130 Ala Asp Asp Asp Gly 135 Lys Ile Vai Ile Vai 140 Ala Gly Leu Asp Gly 145 Asp Tyr Leu Arg Arg 150 Ser Phe Gly Ala Vai 155 Leu Asp Ile Ile Pro 160 Ile Ala Asp Ser Vai Thr Lys Leu Thr Ala Arg Cys Glu Vai Cys Gly X6B 170 17b His Lys Ala Phe 180 Phe Thr Leu Arg Lys 185 Asn Cys Asp Thr Arg 190 Thr Glu Leu Ile Gly 195 Gly Ala Asp Vai Tyr 200 Met Pro Vai Cys Arg 205 Lys His Tyr Ile Thr 210 Asn His Ile Vai <210> 12 <211> 834 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (D · . (834) <223> 51 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ <4 0 0 > 12 atg aga aca tta ate tca cca tct ctt gct CCC ttc tct ctt cat ctc 48 Met Arg Thr Leu Ile Ser Pro Ser Leu Ala Pro Phe Ser Leu His Leu 1 5 10 15 cat aaa ccc tct ctc ttc tcc acc gct ctt ege ttc tcc ttc tca ate 96 His Lys Pro Ser Leu Phe Ser Thr Ala Leu Arg Phe Ser Phe Ser Ile 20 25 30 aac aac ata acc CCC aca aat tca cct cct tcc acc att tcc acc aga 144 As n Asn Ile Thr Pro Thr Asn Ser Pro Pro Ser Thr Ile Ser Thr Arg 35 40 45 ~ aag cta caa acg aaa gcg acg agg gta aca tca tca tca tca tct cag 192 Lys Leu Gin Thr Lys Ala Thr Arg Vai Thr Ser Ser Ser Ser Ser Gin 50 55 60 ccg ctc tcc tcc tca tct CCC ggc gaa ate cac gtc gta gtc ggt cca 240 Pro Leu Ser Ser Ser Ser Pro Gly Glu Ile His Vai Vai Vai Gly Pro 65 70 75 80 atg ttc tcc ggt aaa aca aca aca ctt ctc ege cgt ata ctc gee gaa 288 Met Phe Ser Gly Lys Thr Thr Thr Leu Leu Arg Arg Ile Leu Ala Glu 85 90 95 aga gaa acc ggt aaa aga ate gca ate ate aaa tcc aac aaa gac aca 336 Arg Glu Thr Gly Lys Arg Ile Ala Ile Ile Lys Ser Asn Lys Asp Thr 100 105 110 aga tac tgc acc gaa tca ata gtt act cac gac ggt gag aaa tac cct 384 Arg Tyr Cys Thr Glu Ser Ile Vai Thr His Asp Gly Glu Lys Tyr Pro 115 120 125 tgc tgg tca ctc CCC gat ctc tcg tcc ttc aaa gag aga ttc gga ttc 432 Cys Trp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Ser Phe Lys Glu Arg Phe Gly Phe 130 135 140 gac gac tac gag aat ega tta gat gtg att gga ate gac gaa gct caa 480 Asp Asp Tyr Glu Asn. Arg Leu Asp Vai Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gin 145 150 155 160 ttc ttc gga gat ctt tac gag ttt tgc cgt gaa gct gct gat aaa gag 528 Phe Phe Gly Asp Leu Tyr Glu Phe Cys Arg Glu Ala Ala Asp Lys Glu 165 170 175 ggt aaa act gta att gtt gct gga ttg gat ggt gat ttt atg agg agg 576 Gly Lys Thr Vai Ile Vai Ala Gly Leu Asp Gly Asp Phe Met Arg Arg 180 185 190 agg ttt ggt tcg gtt ctt gat ttg att ccg att gcg gat acg gtt acg 624 Arg Phe Gly Ser Vai Leu Asp Leu Ile Pro Ile Ala Asp Thr Vai Thr 195 200 205 aag ctg acg tca cgg tgt gag gtt tgt ggg aag aga gct ttg ttt acg 672 -Lys Len Thr -Ser. Cyfz m n Vsl ryq m y ala Th-r 210 215 220 atg agg aag acg gag gag aaa gag acg gag ttg ate ggt ggt gct gaa 720 Met Arg Lys Thr Glu Glu Lys Glu Thr Glu Leu Ile Gly Gly Ala Glu 225 230 235 240 gtt tat atg cct gtg tgt agg agt cat tac gtt tgc ggt caa aac gtt 768 Vai Tyr Met Pro Vai. Cys Arg Ser His Tyr Vai Cys Gly Gin Asn Val 245 250 255 ttg gaa acc gct cgt gee gtt ttg gat tca age aat·aat cat agt gtt 816 Leu Glu Thr Ala Arg Ala Val Leu Asp Ser Ser Asn Asn His Ser Val 260 265 270 gta gca agt tca ctt tag Vai Ala Ser Ser Leu 275 834 52 ΕΡ 1 509 600/ΡΤ
<210> 13 <211> 277 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 13
Met Arg Thr Leu Ile Ser Pro Ser Leu Ala Pro Phe Ser Leu His Leu 15 10 15
His Lys Pro Ser Leu Phe Ser Thr Ala Leu Arg Phe Ser Phe Ser Ile 20 25 30
Asn Asn Ile Thr Pro Thr Asn Ser Pro Pro Ser Thr Ile Ser Thr Arg 35 40 45
Lys Leu Gin Thr Lys Ala Thr Arg Vai Thr Ser Ser Ser Ser Ser Gin 50 55 60
Pro Leu Ser Ser Ser Ser Pro Gly Glu Ile His Vai Vai Vai Gly Pro 65 70 . 75 80
Met Phe Ser Gly Lys Thr Thr Thr Leu Leu Arg Arg Ile Leu Ala Glu 85 90 95
Arg Glu Thr Gly Lys Arg Ile Ala Ile Ile Lys Ser Asn Lys Asp Thr· 100 105 110
Arg Tyr Cys Thr Glu Ser Ile Vai Thr His Asp Gly Glu Lys Tyr Pro 445-120-12-5
Cys Trp 130 Ser Leu Pro Asp Leu 135 Ser Ser Phe Lys Glu 140 Arg Phe Gly Phe Asp 145 Asp Tyr Glu Asn Arg 150 Leu Asp Vai Ile Gly 155 Ile Asp Glu Ala Gin 160 Phe Phe Gly Asp Leu 165 Tyr Glu Phe Cys Arg 170 Glu Ala Ala Asp Lys 175 Glu Gly Lys Thr Vai 180 Ile Vai Ala Gly Leu 185 Asp Gly Asp Phe Met 190 Arg Arg Arg Phe Gly Ser 195 Vai Leu Asp Leu 200 Ile Pro Ile Ala Asp 205 Thr Vai Thr Lys Leu 210 Thr Ser Arg Cys Glu 215 Vai Cys Gly Lys Arg Ala 220 Leu Phe Thr Met 225 Arg Lys Thr Glu Glu 230 Lys Glu Thr Glu Leu 235 Ile Gly Gly Ala Glu 240 Vai Tyr Met Pro Vai 245 Cys Arg Ser His Tyr 250 Vai Cys Gly Gin Asn 255 Vai Leu Glu Thr Ala 260 Arg Ala Vai Leu Asp 265 Ser Ser Asn Asn His 270 Ser Vai Vai Ala Ser 275 Ser Leu
<210> 14 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador de PCR 53
ΕΡ 1 509 600/PT <400> 14 ccgctcgaga tggcgactct caaagcttcc tttttg 36 <210 > 15 <211 > 36 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR <400> 15 cgcggatcct tagattgtag cagcaacaca ggattc 36 <210> 16 <211 > 40 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR <400> 16 cgcggatcct taaacaatat gattagtgat gtaatgcttg 40 <210> 17 <211 > 39 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência artificial <220> <223> iniciador de PCR <400> 17 ggaagatctt tagacagatt gtccattaac atagtgctg 39 <210 > 18 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR <400> 18 ggaagatctt tatggatcaa ctagtggtga ttctaag 37
<210 > 19 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência artificial <2 2 0 >
<223> iniciador de PCR 54 ΕΡ 1 509 600/PT <400> 19 ccgctcgaga tggctttttc atcatctgct agaaac 36
<210 > 20 <211 > 34 <212> ADN Λ 00 \—1 CN V Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR <400> 20 tataggatcc gccaccatgg cttcgtaccc <210> 21 <211 > 29 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR <400> 21 tatactcgag gaggtcgact cagttagcc : <210> 22 <211 > 50 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência artificial <220> <223> iniciador de PCR <400> 22 cgcggatcca tggctttttc atcatctgct <210 > 23 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR <400> 23 ccggaattct tatggatcaa ctagtggtga <210 > 24 <211> 46 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR 50
55 ΕΡ 1 509 600/PT <400> 24 cgcggatcca tggcgactct caaagcttcc tttttgatca aaaccc 46 <210 > 25 <211 > 39 <212> ADN Λ 00 \—1 CN V Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR <400> 25 ccggaattct tagattgtag cagcaacaca ggattcagc 39 <210> 26 <211 > 25 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR <400> 26 atgagaacat taatctcacc atctc 25
<210> 27 <211 > 27 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência artificial <220> <223> iniciador de PCR <400> 27 ctaaagtgaa cttgctacaa cactatg 27 <210 > 28 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR <400> 28 cgcggatcca tgagaacatt aatctcacca <210 > 29 <211> 32 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR
56 ΕΡ 1 509 600/PT <400> 29 ccggaattcc taaagtgaac ttgctacaac ac 32
<210 > 30 <211 > 30 <212> ADN Λ 00 \—1 CN V Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR <400> 30 cgcggatcct ccaccgctct tcgcttctcc <210> 31 <211 > 30 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR <400> 31 cgcggatcct ccaccagaaa gctacaaacg <210> 32 <211 > 29 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência artificial <220> <223> iniciador de PCR <400> 32 cgcggatccc agccgctctc ctcctcatc : <210 > 33 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR <400> 33 cgggatccgg cggcggcggc ggacaagtct <210 > 34 <211> 34 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR 57 ΕΡ 1 509 600/PT <400> 34 cggaattctt acttgaaagc atggataacc ttgg 34 <210 > 35 <211 > 31 <212> ADN Λ 00 \—1 CN V Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR <400> 35 cgcggatcca tggcttcgta ccccggccat c 31 <210> 36 <211 > 33 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência artificial <2 2 0 > <223> iniciador de PCR <400> 36 ccggaattct tagttagcct cccccatctc ccg 33
Lisboa, 2009-03-18

Claims (32)

  1. ΕΡ 1 509 600/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Polinucleótido isolado, codificando para uma timidina-quinase vegetal, polinucleótido este que tem pelo menos 73%, de preferência pelo menos 75%, com maior preferência pelo menos 80%, ainda com mais preferência pelo menos 90%, e ainda com maior preferência pelo menos 95%, sendo o mais preferível pelo menos 98% de identidade, com a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID NO:3, quando determinada ao longo de todo o seu comprimento.
  2. 2. Polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID NO:3.
  3. 3. Timidina-quinase vegetal, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, com maior preferência pelo menos 95%, ainda com maior preferência pelo menos 98% de identidade com qualquer uma dessas sequências, quando determinada ao longo de todo o seu comprimento.
  4. 4. Timidina-quinase vegetal de acordo com a reivindicação 3, compreendendo um ou mais dos seguintes três motivos/regiões: Vai Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gin Phe Phe (Motivo I) Vai Ala Gly Leu Asp Gly (Motivo II) Tyr Met Pro Vai Cys Arg (Motivo III) Vai AI Lys Leu A2 A3 Arg Cys Glu A4 (região Lid) , em que AI é seleccionado entre Thr e Vai, A2 é seleccionado entre Thr e Lys, A3 é seleccionado entre Ala e Ser, e A4 é seleccionado entre Leu e Vai.
  5. 5. Timidina-quinase vegetal de qualquer uma das reivindicações 3 e 4, compreendendo todos os resíduos conservados identificados na Tabela 1.
  6. 6. Timidina-quinase vegetal de qualquer uma das reivindicações 3-5 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5. ΕΡ 1 509 600/ΡΤ 2/5
  7. 7. Timidina-quinase vegetal de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-6 possuindo uma deleção C-terminal da ordem de 1-60 resíduos de aminoácido, de preferência 1-50 resíduos de aminoácido, com maior preferência 1-40 resíduos de aminoácido, ainda com mais preferência 1-30 resíduos de aminoácido, ainda com maior preferência 1-26 resíduos de aminoácido, sendo o mais preferível 1-24 resíduos de aminoácido.
  8. 8. Timidina-quinase vegetal de acordo com a reivindicação 8 sendo uma enzima timidina-quinase derivada de tomate e possuindo uma deleção C-terminal de 26 resíduos de aminoácido, possuindo a referida enzima timidina-quinase vegetal com uma deleção C-terminal a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5.
  9. 9. Timidina-quinase vegetal de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-7, que é derivada de tomate e enzima esta que apresenta pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, com maior preferência pelo menos 95%, ainda com maior preferência pelo menos 98% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:4.
  10. 10. Timidina-quinase vegetal de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-9, que diminui pelo menos três (3) vezes a dose letal (Dl^oo) de pelo menos um análogo de nucleósidos quando comparada com a acção de uma timidina-quinase derivada da timidina-quinase do vírus Herpes simplex humano de tipo 1 (HSV1-TK).
  11. 11. Construção de vector compreendendo o polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2 e um promotor operativamente ligado ao polinucleótido.
  12. 12. Construção de vector de acordo com a reivindicação 11 sendo um vector virai, em particular um vector virai de Herpes simplex, um vector adenoviral, um vector virai associado a adenovírus, um vector de lentivírus, um vector retroviral ou um vector virai de vacínia. ΕΡ 1 509 600/PT 3/5
  13. 13. Linha celular de empacotamento capaz de produzir um virião infeccioso compreendendo o vector de acordo com uma das reivindicações 11-12.
  14. 14. Célula hospedeira compreendendo o polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 ou o vector de acordo com uma das reivindicações 11-12.
  15. 15. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 14, que é uma célula humana, uma célula de cão, uma célula de macaco, uma célula de rato ou uma célula de ratinho.
  16. 16. Composição farmacêutica compreendendo a enzima timidina-quinase vegetal de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-10 e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
  17. 17. Composição farmacêutica compreendendo o polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, ou um vector de acordo com uma das reivindicações 11-12 e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.
  18. 18. Composição farmacêutica compreendendo a linha celular de empacotamento de acordo com a reivindicação 13, ou a célula hospedeira de acordo com uma das reivindicações 18-19 e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.
  19. 19. Método de sensibilização de uma célula a um pró-fármaco, método este que compreende os passos de: i) transfecção ou transdução da referida célula com uma sequência polinucleótidica codificando uma enzima timidina-quinase vegetal de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-10 que promove a conversão do referido pró-fármaco num fármaco (citotóxico); e ii) entrega do referido pró-fármaco à referida célula; em que a referida célula é mais sensível ao referido fármaco (citotóxico) que ao referido pró-fármaco, com a condição de o método não ser um método para tratamento do corpo humano ou de um animal através de terapia. ΕΡ 1 509 600/PT 4/5
  20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a sequência polinucleotídica codificando uma enzima timidina-quinase vegetal é uma sequência polinucleotídica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3.
  21. 21. Método de acordo com uma das reivindicações 19-20, em que o pró-fármaco é um análogo de nucleósidos.
  22. 22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o análogo de nucleósidos é AZT (3'-azido-3'-desoxitimidina).
  23. 23. Polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2 ou vector de acordo com uma das reivindicações 11-12, para utilizar num método de inibição de um agente patogénico num animal de sangue quente, método este que compreende a administração ao referido animal do referido polinucleótido ou vector.
  24. 24. Polinucleótido ou vector de acordo com a reivindicação 23, em que a referida sequência polinucleotídica ou o referido vector é administrado in vivo.
  25. 25. Polinucleótido ou vector de acordo com uma das reivindicações 23-24, em que o referido agente patogénico é um vírus, uma bactéria ou um parasita.
  26. 26. Polinucleótido ou vector de acordo com uma das reivindicações 23-24, em que o referido agente patogénico é uma célula tumoral.
  27. 27. Polinucleótido ou vector de acordo com uma das reivindicações 23-24, em que o referido agente patogénico é uma célula imunitária auto-reactiva.
  28. 28. Polinucleótido ou vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-27, para utilização num método de inibição de um agente patogénico num animal de sangue quente, compreendendo ainda o passo de administração de um análogo de nucleósidos ao referido animal de sangue quente.
  29. 29. Polinucleótido ou vector de acordo com a reivindicação 28 para utilização num método de inibição de um ΕΡ 1 509 600/ΡΤ 5/5 agente patogénico num animal de sangue guente, em gue o referido análogo de nucleósidos é AZT (3'-azido-3'- desoxitimidina).
  30. 30. Utilização da enzima timidina-guinase vegetal de acordo com qualguer uma das reivindicações 3-10 para a fosforilação de um nucleósido ou de um análogo de nucleósidos, com a condição da utilização não ser um método para tratamento do corpo humano ou de um animal através de terapia.
  31. 31. Método de fosforilação de um nucleósido ou de um análogo de nucleósidos, compreendendo os passos de: i) sujeição do nucleósido ou análogo de nucleósidos à acção da enzima timidina-quinase vegetal de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-10, e ii) recuperação do nucleósido ou análogo de nucleósidos fosforilado, com a condição de o método não ser um método para tratamento do corpo humano ou de um animal através de terapia.
  32. 32. Artigos contendo um análogo de nucleósidos e a timidina-quinase de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-10, ou um gene codificando para a referida timidina-quinase derivada de plantas, ou vector compreendendo o referido gene codificando para a referida timidina-quinase derivada de plantas na forma de uma combinação, para a administração simultânea, separada ou sucessiva em terapia de cancro. Lisboa, 2009-03-18
PT03722322T 2002-05-23 2003-05-21 Timidina-quinases vegetais e sua utilização PT1509600E (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200200794 2002-05-23
DKPA200300178 2003-02-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT1509600E true PT1509600E (pt) 2009-03-26

Family

ID=29585606

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT03722322T PT1509600E (pt) 2002-05-23 2003-05-21 Timidina-quinases vegetais e sua utilização

Country Status (15)

Country Link
US (1) US7928206B2 (pt)
EP (1) EP1509600B1 (pt)
JP (1) JP2006504403A (pt)
CN (1) CN1662647A (pt)
AT (1) ATE419337T1 (pt)
AU (1) AU2003229543B2 (pt)
CA (1) CA2485182A1 (pt)
DE (1) DE60325587D1 (pt)
DK (1) DK1509600T3 (pt)
ES (1) ES2320434T3 (pt)
MX (1) MXPA04011572A (pt)
NZ (1) NZ536623A (pt)
PT (1) PT1509600E (pt)
RU (1) RU2339695C2 (pt)
SI (1) SI1509600T1 (pt)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2456937B (en) 2006-10-24 2011-07-13 Bradley Fixtures Corp Capacitive sensing for washroom fixture
JP5211303B2 (ja) * 2007-10-25 2013-06-12 独立行政法人産業技術総合研究所 蛋白質の製造方法
CN114107339B (zh) * 2021-12-09 2024-06-07 菏泽学院 泡桐丛枝植原体胸苷激酶基因引物、基因、融合蛋白、多克隆抗体及其应用
CN117016549B (zh) * 2023-03-13 2024-02-27 山东蓬勃生物科技有限公司 核苷类化合物及其组合物在促进植物生长中的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2189543A1 (en) * 1994-05-02 1995-11-09 Lawrence A. Loeb Thymidine kinase mutants
US6197743B1 (en) * 1996-07-26 2001-03-06 The Trustees Of Boston University Compositions and methods for the treatment of viral disorders
WO1999019466A2 (en) 1997-10-14 1999-04-22 Darwin Molecular Corporation Thymidine kinase mutants and fusion proteins having thymidine kinase and guanylate kinase activities
WO1999067372A1 (en) 1998-06-22 1999-12-29 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Mutated herpes simplex virus type 1 thymidine kinases and uses thereof
GB0008966D0 (en) 2000-04-13 2000-05-31 Imp College Innovations Ltd Vectors for gene therapy

Also Published As

Publication number Publication date
DE60325587D1 (de) 2009-02-12
NZ536623A (en) 2006-05-26
RU2339695C2 (ru) 2008-11-27
CN1662647A (zh) 2005-08-31
JP2006504403A (ja) 2006-02-09
SI1509600T1 (sl) 2009-06-30
ES2320434T3 (es) 2009-05-22
EP1509600A1 (en) 2005-03-02
AU2003229543A1 (en) 2003-12-12
RU2004133390A (ru) 2005-08-10
MXPA04011572A (es) 2005-07-05
AU2003229543B2 (en) 2008-03-20
CA2485182A1 (en) 2003-12-04
US20060035850A1 (en) 2006-02-16
ATE419337T1 (de) 2009-01-15
US7928206B2 (en) 2011-04-19
DK1509600T3 (da) 2009-04-27
EP1509600B1 (en) 2008-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20070248543A1 (en) Chicken Deoxycytidine and Deoxyadenosine Kinase Enzymes and Their Use
US10155052B2 (en) Thymidine kinase
RU2297453C2 (ru) Вариант мультисубстратной дезоксирибонуклеозидкиназы, кодирующий его мутированный полинуклеотид, экспрессирующая векторная конструкция и их применение
US7666639B2 (en) Plant deoxyribonucleoside kinase enzymes and their use
PT1509600E (pt) Timidina-quinases vegetais e sua utilização
KR20000064581A (ko) 증식세포파괴용효소배합물
US20070202120A1 (en) Yellow Fever Mosquito Deoxyribonucleoside Kinases And Its Use
EP1974026A2 (en) Mutant deoxyadenosine kinase enzymes and their use
Zhang et al. Potent anticancer effects of lentivirus encoding a Drosophila melanogaster deoxyribonucleoside kinase mutant combined with brivudine
WO2023074122A1 (ja) ｙＣＤ遺伝子の変異体、およびその利用
Chen et al. Protection of a cytidine deaminase gene gainst toxicity of high dose chemotherapy in mice
MXPA98007181A (en) Combinations of enzymes for the destruction of proliferati cells