KR20000064581A

KR20000064581A - 증식세포파괴용효소배합물

Info

Publication number: KR20000064581A
Application number: KR1019980707184A
Authority: KR
Inventors: 프랑시스 블랑쉐; 베아트리체 카메롱; 미셸 쿠데르; 조엘 쿠르제
Original assignee: 자끄 사비나; 아방티 파르마 소시에테 아노님
Priority date: 1996-03-15
Filing date: 1997-03-12
Publication date: 2000-11-06
Also published as: WO1997035024A1; SK124598A3; FR2746016B1; CA2248629A1; HUP9902320A2; BR9708194A; ZA972247B; NO984132D0; NO984132L; FR2746016A1; US6518062B1; EP0910654A1; AU732432B2; AU2164297A; HUP9902320A3; IL126154A0; JP2000507814A; CZ291398A3

Abstract

세포, 특히 증식성 세포의 파괴에 유용한 효소 배합물이 개시됨. 효소 배합물의 세포내 발현 및 전달을 가능케 하는 벡터, 및 이의 치료용도, 특히 항암 유전자 요법에서의 용도가 또한 개시됨.

Description

증식세포 파괴용 효소 배합물

유전정보를 유기체 또는 세포 중으로 도입하는데 있는 유전자 요법은 과거 수 년에 걸쳐 비상한 발전을 해왔다. 특히, 병리에 관련된 유전자의 동정, 유전자 투여용 벡터의 개발, 조절 또는 조직-특이성 발현 시스템의 개발은 이들 새로운 치료법의 개발에 기여를 해왔다. 따라서, 과거 5 년 동안, 단일유전자 질환(혈우병, 낭포성 섬유증), 암, 심혈관 질환 또는 신경계 장애와 같은 분야에서 유전자 또는 세포 요법의 다양한 임상적 시도가 유럽과 미국에서 착수되었다.

세포 과증식과 결부된 병리(암, 재협착증 등) 분야에서 다양한 방법이 개발되었다. 일부는 종양 억제 유전자(p53, Rb)의 사용에 기초하고, 다른 것은 발암유전자(myc, Ras)에 대한 안티센스의 사용에 기초하며, 또 다른 것들은 면역요법(종양 항원 또는 면역세포 등의 투여)에 기초한다. 다른 방법은 세포 파괴를 유도할 수 있는 독성 또는 자기불활화 유전자를 질병에 걸린 세포 중으로 도입하는 데에 있다. 이러한 유전자는 예를 들면, 세포를 약제에 민감하게 할 수 있는 유전자이다. 이들은 일반적으로, 포유류 세포에서 발현될 때, 초기에는 거의 또는 전혀 무독한 프로드럭을 고도로 독성을 띠는 제제로 전환시키는 비포유류계 무독 효소를 암호화하는 유전자이다. 프로드럭의 이러한 활성화 기전은 몇 가지 면에서 유리하다: 프로드럭의 농도 또는 효소의 발현을 조정함으로써 치료지수를 최적화하고, 프로드럭을 더 이상 투여하지 않고 독성을 차단하며 치사율을 평가할 수 있다. 추가로, 이러한 자기불활화 유전자의 사용은 특정 유형의 종양에는 특이적이지 않지만 일반적인 적용에는 장점을 제공한다. 따라서, 종양 억제 유전자 또는 발암유전자 안티센스의 사용에 기초한 전략은 억제 유전자의 결핍 또는 발암유전자의 과발현을 보이는 종양에만 적용될 수 있다. 이와 마찬가지로, 면역요법에 기초한 방법은 면역제한 및 면역컴피턴스를 토대로 환자 개개에 기초하여 개발되어야 한다. 한편, 자기불활화 유전자 사용에 기초한 전략은 여타 종양형, 및 더욱 일반적으로는 실용적으로 여타 세포형에도 적용될 수 있다.

예를 들면, 사이토신 데아미나제, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 또는 티미딘 키나제, 예를 들면, 배리셀라 바이러스 또는 허피스 심플렉스 바이러스 1 형의 티미딘 키나제를 암호화하는 유전자와 같은 다양한 자기불활화 유전자가 문헌에 기재되어 잇다.

에스케리키아 콜라이의 사이토신 데아미나제는 사이토신의 우라실로의 탈아민화를 촉매할 수 있다. 이.콜라이 유전자를 발현하는 세포는 따라서, 5-플루오로사이토신을 유독 대사산물인 5-플루오로우라실로 전환시킬 수 있다[참조문헌: Mullen et al. 1992 Proc. Natl. Acad. USA 89 p33].

에스케리키아 콜라이의 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제는 데옥시아데노신의 무독성 동족체의 매우 유독한 아데닌 동족체로의 전환을 허용한다. 진핵세포 효소는 이러한 활성을 보이지 않으므로, 포유류 세포가 박테리아 유전자를 발현하면, 6-메틸퓨린-2′-데옥시리보뉴클레오사이드와 같은 데옥시아데닌의 동족체는 이들 세포에 유독한 산물로 전환되게 될 것이다[참조문헌: Sorscher et al. 1994 Gene Therapy 1 p233].

배리셀라 바이러스의 티미딘 키나제는 6-메톡시퓨린 아라비노사이드의 일인산화를 허용한다. 포유류 세포가 이러한 바이러스 유전자를 발현하면, 이러한 모노포스페이트가 생성되고 이어서 세포효소에 의해 유독 화합물로 대사된다[참조문헌: Huber et al. 1991 Proc. Natl. Acad. USA 88 p8039].

이들 유전자 가운데서, 티미딘 키나제(TK)를 암호화하는 유전자가 치료관점에서 특히 가장 유리한데, 그 이유는 기타 자기불활화 유전자와는 달리, 분열세포를 특이적으로 제거할 수 있는 효소를 생성하기 때문이며, 따라서 프로드럭은 DNA 합성을 억제하는 비확산성 산물로 전환된다. 바이러스 티미딘 키나제, 및 특히 배리셀라 바이러스 또는 허피스 심플렉스 바이러스 1 형의 티미딘 키나제는 세포 효소와는 상이한 기질 특이성을 띠며, 이들은 아시클로버 또는 갠시클로버와 같은 구아노신 동족체의 표적인 것으로 나타났다[참조문헌: Moolten 1986 Cancer Res. 46 p5276]. 따라서, 갠시클로버는 포유류 세포가 HSV1-TK 효소를 생성할 때에만 갠시클로버 모노포스페이트로 인산화되고, 이어서 세포 키나제는 갠시클로버 모노포스페이트가 디포스페이트로, 이어서 DNA 합성의 정지를 일으키고 세포사멸을 인도하는 트리포스페이트로 대사되도록 한다[참조문헌: Moolten 1986 Cancer Res. 46 p5276; Mullen 1994 Pharmac. Ther. 63 p199]. 기타 티미딘 키나제 및 기타 구아노신 동족체로도 동일기전이 일어난다..

더욱이, 전파된 독성 효과("방관자" 효과)가 TK 사용 중에 관찰되었다. 이러한 효과는 TK 유전자를 혼입하는 세포 뿐만 아니라 이웃 세포도 파괴함으로써 자신을 표명한다. 이러한 과정의 기전은 3 가지 방식으로 설명될 수 있다: i) 사멸세포로부터 수득된 인산화된 갠시클로버 또는 티미딘 키나제를 함유하는 아포톱시스성 소낭의 형성, 및 이어서 이웃세포에 의한 이들 소낭의 식균작용; ii) 자기불활화 유전자를 함유하지 않는 세포를 향한 자기불활화 유전자를 함유하는 세포의 대사 협동 과정에 의해 티미딘 키나제에 의해 대사된 프로드럭의 통과 및/또는 iii) 종양퇴행과 결부된 면역반응[참조문헌: Marini et al. 1995 Gene Therapy 2 p655].

당해분야의 전문가를 위해, 허피스 바이러스의 티미딘 키나제를 암호화하는 자기불활화 유전자의 용도가 매우 광범위하게 문서화되어 있다. 특히, 신경교종에 걸린 래트에서 생체내 최초 연구는 HSV1-TK 유전자가 발현될 때 및 150mg/kg 용량의 갠시클로버가 주입될 때 종양 퇴행을 보여준다[참조문헌: K. Culver et al. 1992 Science 256 p1550]. 그러나, 이들은 마우스에서는 매우 유독하며[참조문헌: T. Osaki et al. 1994 Cancer Research 54 p5258] 따라서, 인간에 있어 유전자 요법에 완전히 금지되어 있다.

다수의 치료 시도가 인간의 경우에 착수 중이며, 여기에서 TK 유전자는 특히 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 벡터와 같은 다양한 벡터에 의해 세포로 전달된다. 인간에서 유전자 요법의 임상시도에서, 5mg/kg 정도의 훨씬 적은 용량이 단기 치료기 동안 (14 일) 투여되어야 한다[참조문헌: E. Oldfield et al. 1995 Human gene Therapy 6 p55]. 용량이 더 높거나 치료기간이 더 긴 경우, 바람직하지 않은 유독한 부작용이 사실상 관찰된다.

이러한 단점을 극복하기 위해, 구아노신 동족체를 인산화하기 위한 더욱 특이성을 띠거나 더욱 활성을 띠는 티미딘 키나제 유도체를 합성하는 것이 제안되어 왔다. 따라서, 부위-지향성 돌연변이유발에 의해 수득된 유도체가 기술되어 왔다. 그러나, 순수 효소에 대한 어떠한 정확한 생화학적 특징규명도 수행되지 않았으며, 이러한 돌연변이체를 사용하는 어떠한 세포 시험도 발표되지 않았으며 어떠한 기능적인 개량도 보고되지 않았다(WO 95/30007; Black et al., 1993., Biochemistry 32 p11618). 또한, 자신의 처음 45 개의 코돈이 결실된 HSV1-TK 유전자의 유도성 발현이 진핵세포에서 수행되었지만, 프로드럭 용량은 문헌[참조: B. Salomon et al. 1995 Mol. Cell. Biol. 15 p5322)에서의 모든 시행에서 기술된 것들과 필적한 채로 남는다. 결과적으로, 현재까지 기술된 변법 중 어떤 것도 티미딘에 대해 또는 갠시클로버를 향해 개선된 활성을 보이지 않는다.

본 발명은 자기불활화 유전자를 사용하는 개선된 유전자 요법을 제공한다. 본 발명은 특히, 티미딘 키나제에 의한 구아노신 동족체의 인산화 효율을 개선하고 이에 따라 이러한 치료의 치료능을 개선시킬 수 있는 방법을 기술한다. 본 발명은 특히, i) 현저히 더 낮거나; ii) 더욱 명백한 방관자 효과를 유도할 수 있거나; iii) 야생형 티미딘 키나제가 과발현 될 때 발생할 수도 있는 세포독성을 유도하지 않는 갠시클로버 용량(각각 아시클로버)에서 이들 동족체의 삼인산화가 매우 현격히 증가되도록 갠시클로버 또는 아시클로버와 같은 뉴클레오사이드 동족체의 삼인산화 방법을 제공한다.

이러한 방법은 암, 심혈관 질환 또는 바이러스로 감염된 세포와 같은 특정 세포의 사멸을 요하는 적용에 적용될 수 있다; 이러한 바이러스는 HIV(인간 면역 결핍 바이러스), CMV(사이토메갈로바이러스) 또는 RSV(호흡기 합포체 바이러스) 형의 바이러스일 수 있다.

본 발명은 특히, 생체내에서 뉴클레오사이드 동족체의 인산화 반응을 개선시킬수 있는 효소의 배합물 사용에 기초한다.

따라서, 본 발명의 제 1 요지는

-모노포스페이트 동족체를 생성하기 위해 뉴클레오사이드 동족체를 인산화 할 수 있는 효소,

-디포스페이트 동족체를 생성하기 위해 모노포스페이트 동족체를 인산화 할 수 있는 효소, 및

-유독성 트리포스페이트 동족체를 생성하기 위해 디포스페이트 동족체를 인산화 할 수 있는 효소를 포함하는 조성물에 있다.

특히, 모노포스페이트 동족체를 생성하기 위해 뉴클레오사이드 동족체를 인산화할 수 있는 효소는 티미딘 키나제이고, 디포스페이트 동족체를 생성하기 위해 모노포스페이트 동족체를 인산화 할 수 있는 효소는 구아닐레이트 키나제이며 트리포스페이트 동족체를 생성하기 위해 디포스페이트 동족체를 인산화 할 수 있는 효소는 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제이다. 더욱이, 본 발명에 따른 조성물은 효소를 직접 포함하는 것이 아니라, 효소를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 요지는 또한,

-모노포스페이트 동족체를 생성하기 위해 뉴클레오사이드 동족체를 인산화 할 수 있는 효소를 암호화하는 제 1 핵산,

-디포스페이트 동족체를 생성하기 위해 모노포스페이트 동족체를 인산화 할 수 있는 효소를 암호화하는 제 2 핵산, 및

-유독성 트리포스페이트 동족체를 생성하기 위해 디포스페이트 동족체를 인산화 할 수 있는 효소를 암호화하는 제 3 핵산을 포함하는, 효소 배합물의 생체내 전달 및 생성에 사용될 수 있는 조성물이다.

유리하게는, 제 1 핵산은 티미딘 키나제를 암호화하고, 제 2 핵산은 구아닐레이트 키나제를 암호화하며 제 3 핵산은 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제를 암호화한다.

뉴클레오사이드 동족체는 일반적으로, 예를 들면, 갠시클로버, 아시클로버 또는 펜시클로버와 같은 구아노신 동족체이다. 다른 뉴클레오사이드 동족체는 예를 들면, 트리플루오로티미딘, 1-(2-데옥시-2-플루오로-베타-D-아라비노퓨라노실)-5-아이오도우라실, ara-A, 1-베타-D-아라비노퓨라노실티미딘(araT), 5-에틸-2′-데옥시우리딘, 아이오도우리딘, AZT, AIU, 디데옥시시티딘, AraC 및 브로모비닐데옥시우리딘(BVDU) 유형의 화합물이다. 바람직한 동족체는 갠시클로버, 아시클로버, 펜시클로버 및 BVDU이고, 바람직하게는 갠시클로버 및 아시클로버이다. 트리포스페이트 형은 직접 또는 간접적으로 세포사를 초래한다는 점에서 유독성이다.

티미딘 키나제(예를 들면, HSV1-TK)를 발현하도록 변형시킨 포유류 세포를 뉴클레오사이드 동족체(예를 들면, 갠시클로버)에 노출시킬 때, 이들은 갠시클로버 모노포스페이트를 생성하도록 갠시클로버의 인산화를 수행할 수 있게 된다. 계속해서, 세포성 키나제는 이러한 갠시클로버 모노포스페이트가 디포스페이트, 이어서 트리포스페이트로 연속적으로 대사되도록 한다. 이렇게 하여 생성된 갠시클로버 트리포스페이트는 이어서 DNA 중으로 혼입됨으로써 유독작용을 일으켜 세포 알파 DNA 폴리머라제를 부분적으로 억제하고, 이렇게 하여 DNA 합성의 정지를 초래하며 따라서 세포사를 이끈다. 이러한 기전에서, 뉴클레오사이드 동족체의 일인산화 단계는 제한성 단계인 것으로 생각된다. 이러한 이유로 해서, 상이한 방법이 티미디 키나제의 고유성질을 개선하려는 시도(TK 돌연변이체의 생성, 더 효율적인 투여방법 및 발현 시스템 등)로 선행기술에 기술되어 있다.

본 발명은 뉴클레오사이드 동족체의 인산화에 관여된 기타 효소를 티미딘 키나제와 함께 투여함으로써 치료효율을 개선시킬 수 있음을 명백히 보여준다. 따라서, 본 발명의 요지는 뉴클레오사이드 동족체 삼인산화의 세포내 반응을 최적화할 수 있는 효소의 다양한 배합물이다. 본 발명의 다른 일면은 이러한 효소 배합물의 도입 및 세포내 발현을 허용하는 벡터에 관한 것이다. 이들은 특히, 각각 효소 생산을 허용하는 수개의 벡터, 또는 각각 모든 효소 또는 수개의 효소의 생산을 허용하는 하나 이상의 벡터일 수 있다. 본 발명은 또한, 상응하는 유전자의 발현에 의해 동일 반응계에서 임의로 생성된 효소 배합물의 존재하 뉴클레오사이드 동족체의 삼인산화 방법, 및 증식성 세포의 파괴방법에 관한 것이다.

뉴클레오사이드 모노포스페이트의 뉴클레오사이드 트리포스페이트로, 이어서 트리포스페이트로의 인산화는 시험관내에서 문서화되었다. 이러한 인산화는 i)갠시클로버의 경우 인간 적혈구 용해물의 존재하에[참조문헌: Cheng et al. 1983 J. Biol. Chem. 258 p12460] 또는 ii)갠시클로버 및 아시클로버의 경우, 인간 적혈구의 구아닐레이트 키나제 및 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제의 효소제제의 존재하에서[참조문헌: Miller et al. 1980 J. Biol. Chem. 255 p720; Smee et al. 1985 Biochem. Pharmac. 34 p1049]에서 수행된다. 비록, 뉴클레오사이드 모노포스페이트의 디포스페이트로, 이어서 트리포스페이트로의 인산화가 포유류 세포에서 입증되었지만, 이러한 전환반응은 갠시클로버 모노포스페이트 또는 아시클로버 모노포스페이트로는 완전한 것으로 보이지 않는다[참조문헌:Agbaria et al. 1994 Mol. Pharmacol. 45 p777; Caruso et al. 1995 Virology 206 p495; Salomon et al. 1995 Mol. Cell. Biol. 15 p5322].

본 출원은 생체내 티미딘 키나제의 치료효율을 향상시킬 수 있도록 하는 조성물에 대해서 설명한다.

모노포스페이트 동족체를 생성하기 위해 뉴클레오사이드 동족체를 인산화 할 수 있는 본 발명에 따른 조성물 및 방법에 사용된 제 1 효소는 유리하게는 비포유류 티미딘 키나제이다. 바람직하게는 바이러스, 특히 포진 바이러스 기원의 티미딘 키나제이다. 포진 바이러스 티미딘 키나제 가운데서, 허피스 심플렉스 바이러스 1형 티미딘 키나제(HSV1-TK), 허피스 심플렉스 바이러스 2형 티미딘 키나제(HSV2-TK), 배리셀라 바이러스 티미딘 키나제(VZV-TK), 엡스타인-바 바이러스 티미딘 키나제(EBV-TK), 또는 소 기원[참조문헌:Mittal et al., J. Virol 70 (1989) 2901], 말 기원[참조문헌: Robertson et al., NAR 16 91988) 11303], 고양이 기원[참조문헌: Nunberg et al., J. Virol. 63 (1989) 3240] 또는 원숭이 기원[참조문헌: Otsuka et al., Virology 135 (1984) 316] 포진 바이러스의 티미딘 키나제를 들 수 있다.

허피스 심플렉스 바이러스 1형의 티미딘 키나제 효소를 암호화하는 유전자의 서열은 문헌[참조: McKnight 1980 Nucl. Acids Res. 8 p5931]에 기술되어 잇다. 이의 천연 돌연변이체가 존재하는 데, 티미딘에 대한 필적할 만한 효소활성을 갖는 단백질, 또는 갠시클로버를 이끈다[참조문헌: M. Michael et al. 1995 Biochem. Biophys. Res. Commun 209 p966]. 허피스 심플렉스 바이러스 2형의 티미딘 키나제 효소를 암호화하는 유전자의 서열도 기술되어 있다[참조문헌:Swain et al., J. Virol. 46 (1983) 1045].

본 발명에 사용된 티미딘 키나제는 천연 티미딘 키나제(효소의 천연 형태 또는 이의 천연 변이체 중 하나), 또는 유도된 형태, 즉 천연형의 구조적 변형(들)로 생기는 형태일 수 있다. 전술한 바와 같이, 각종 돌연변이체 또는 유도체가 문헌에 기술되어 있다.

비록 이들의 고유 성질이 유의할 만하게 변형되는 것으로 보이지는 않지만, 이들 분자는 본 발명의 프레임워크내에서 사용될 수 있다. 이들은 예를 들면, 뉴클레오사이드의 상호작용 부위의 DRH 영역에 근접한 곳에 변형이 일어난 돌연변이체이다(WO 95/30007). DRH 영역은 TK의 163, 164 및 165 위치의 아스파트산, 아르기닌, 및 히스티딘 잔기에 상응한다. 이들 3 개의 위치는 포진 TK들 간에는 고도로 보존되어 있다. 위치 160-162 및 168-170에서의 각종 돌연변이체가 기술되어 있다(WO 95/30007). 기타 인공 변이체는 ATP-결합부위에 변형을 보유한다(FR 96/01603). 더욱이, 다른 TK 유도체는 통상의 분자 생물학 기술에 따라 제조되고 본 발명의 배합물에 사용될 수 있다. 이들 돌연변이체는 예를 들면, 천연의, 바람직하게는 포진 티미딘 키나제 또는 이의 변이체 중 하나를 암호화하는 핵산상에서의 돌연변이유발에 의해 제조할 수 있다. 부위 지향성 돌연변이유발 또는 무작위 돌연변이유발을 수행가능케 하는 다양한 방법이 당업계의 업자에 공지되어 있으며, PCR- 또는 올리고뉴클레오타이드 지향성 돌연변이유발, 예를 들면, 하이드롤릴아민과 같은 화학약품에 의해 시험관내 또는 돌연변이체 이.콜라이 균주[참조문헌:Miller "a short course in bacterial genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1992]에서의 생체내 무작위 돌연변이유발을 들 수 있다. 따라서, 돌연변이된 서열은 이어서 세포 또는 무세포 시스템에서 발현되며 발현산물은 특히 실시예에서 기술된 조건하에서 티미딘 키나제 유형 활성의 존재에 대해 시험된다. 이러한 공정에서 생기는 효소는 모노포스페이트 동족체를 생성하기 위한 뉴클레오사이드 동족체 인산화능을 지니는데, 본 발명에 사용될 수 있다.

바람직하게는, 허피스 심플렉스 바이러스 1 형 티미딘 키나제(HSV1-TK) 또는 상응하는 암호화 핵산으로부터 유도된 TK는 본 발명의 프레임워크내에서 사용된다. 특히, 천연 변이체 또는 인공 변이체와 같은 HSV1-TK 또는 이의 변이체 중 하나이다. 인공 변이체 가운데서, 변이체 P155A/F161V 및 F161I[참조문헌:Biochemistry 32 (1993) p.11618], 변이체 A168S[참조문헌: Prot. Engin. 7 (1994) p.83] 또는 변이체 M60I와 같이 ATP 결합부위에 변이가 일어난 변이체를 들 수 있다. 더욱 바람직하게는, 허피스 심플렉스 바이러스 1형 티미딘 키나제(HSV1-TK)를 암호화하는 핵산이 사용된다.

디포스페이트 동족체를 생성하도록 뉴클레오사이드 모노포스페이트 동족체를 인산화할 수 있는 본 발명에 따른 조성물 및 방법에 사용된 제 2 효소는 유리하게는 구아닐레이트 키나제이다. 구아닐레이트 키나제(GMPK)는 각종 유기체(인간, 래트, 소, 효모)로부터 정제된다. GMPK를 암호화하는 유전자는 또한 각종 세포형, 특히 효모 사카로마이세스 세레비지애, GUK1 유전자[참조문헌: M. Konrad 1992 J. Biol. Chem. 267 p25652] 중으로 클로닝된다. 이러한 유전자로부터, 20 kDa GMPK 효소가 또한 정제되었다. gmk로 명명된 GMPK 유전자가 또한 분리되고 에스케리키아 콜라이에서 과발현되었다[참조문헌:D. Gentry et al. 1993 J. Biol. Chem. 268 p14316]. 이러한 효소는 협동성 및 올리고머화면에서 사카로마이세스 세레비지애와는 상이하며, 반면에 서열은 182 개 잔기 상에서 46.2% 동일한 강력한 영역을 보인다. 조혈세포 성장 포텐셜 활성을 지닌 인자(EPO 274,560)를 암호화하는 것으로 동정된 A11042 서열은 사카로마이세스 세레비지애 GUK1 유전자와 180 개의 잔기 상에서 51.9%의 동일성을 보이며, GMPK의 인간 동족체를 구성하는 것으로 보이지만, 어떠한 생물학적 데이터도 발표되지 않았다.

트리포스페이트 동족체의 생성을 위해 뉴클레오사이드 디포스페이트 동족체를 인산화할 수 있는 본 발명에 따른 조성물 및 방법에 사용된 제 3 효소는 유리하게는 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제이다. 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제(NDPK)는 광범위 기질 특이성을 지닌 효소이며 광범위원으로부터 정제된다[참조문헌: M. Inouye et al. 1991 Gene 105 p31]. 다양한 유기체의 경우(믹소코커스 잔투스, 드로소필라 멜라노가스터, 딕시오스테리움 디스코이듐, 래트, 소, 인간, 이.콜라이 및 사카로마이세스 세레비지애), NDPK 암호화 유전자가 클로닝되고 상응하는 효소가 매우 상동성이다[참조문헌: K. Watanabe et al. 1993 Gene 29 p141]. 그러나, 고등 진핵세포 효소만이 "루이신 지퍼" 서열을 보유한다. NDPK 활성을 암호화하는 것으로 기술된 인간 유전자는 특히 nm23-H1 및 nm23-H2이다. nm23-H2 유전자는 NDPK 활성 및 전사인자인 두가지 독립적인 기능을 갖는 이작용성 단백질을 암호화하는 것으로 제안된다[참조문헌: E. Postel et al. 1994 J. Biol. Chem. 269 p8627]. 사카로마이세스 세레비지애 YNK 유전자는 효모에 필수 유전자가 아니며 단량체의 분자량이 19 kDa인 사량체 단백질일 것으로 추정되는 NDPK를 암호화한다[참조문헌: A. Jong et al. 1991 Arch. Biochem. Biophys. 291 p241].

본 발명의 프레임워크내에서 사용되는 GMPK 또는 NDPK를 암호화하는 핵산 서열은 인간, 동물, 바이러스, 합성 또는 반합성 기원일 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 핵산서열은 당해분야의 숙련인에게 공지된 여타 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기술의 실례로는, 특히;

-문헌에 기술된 서열 및 예를 들면, 핵산 합성기를 사용하는 화학합성,

-특히 문헌에 기술된 바와 같이 특정 탐침에 의한 라이브러리의 스크리닝, 또는

-라이브러리로부터 스크리닝된 서열의 화학적 변형(연장, 결실, 치환 등)을 포함한 혼합 기술을 들 수 있다.

유리하게는, 본 발명의 프레임워크내에 사용된 핵산서열은 cDNA 또는 gDNA 서열이다. cDNA 서열은 RNA로부터 수득된 인트론-비함유 서열이다. gDNA 서열은 염색체 영역이다. 진핵세포에서, 이들은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 본 발명의 프레임워크내에서 사용된 gDNA 서열은 천연 유전자에 존재하는 인트론의 전부 또는 일부, 또는 예를 들면, 포유류 세포내 발현효율을 증가시키기 위해 cDNA 중으로 인위적으로 도입된 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다. 핵산은 천연효소 또는 동일 유형의 활성을 지닌 변이체 또는 유도체를 암호화 할 수 있다. 이들 동족체 핵산은 당업계의 숙련인에게 익히 공지되어 있는 통상의 분자 생물학 기술에 의해 수득될 수 있다. 이들은 돌연변이유발, 라이브러리로부터의 부위 지향성 또는 부위 지향성이 아닌 하이브리드화, 결실 또는 삽입, 하이브리드 분자의 작제 등일 수 있다. 일반적으로, 변형은 핵산 염기의 적어도 20%에 영향을 미친다. 유사 핵산의 작용가는 발현산물의 효소활성을 평가함으로써 실시예에 기술된 바와 같이 측정된다.

본 발명의 목적을 위한 특정 조성물은 티미딘 키나제를 암호화하는 제 1 핵산 및 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제를 암호화하는 제 2 핵산을 포함한다. 이러한 양태에서, 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제는 바람직하게는 비인간 진핵세포 기원이다. 비인간 효소는 자연상태에서 인간 세포에는 존재하지 않는 효소를 의미한다. 이는 바이러스 또는 동물 효소이거나, 또는 하등 진핵세포 유기체(예를 들면, 효모)로부터 유도될 수 있다. 이는 또한, 하나 이상의 구조적 변형을 보이는, 인간 효소의 비-천연 유도체일 수도 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 NDPK는 효모 또는 소 NDPK 중에서 선택된다. 이러한 조성물은 또한, 예를 들면, 효모 구아닐레이트 키나제와 같은 구아닐레이트 키나제를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.

본 발명의 목적을 위한 다른 특이적 조성물은 티미딘 키나제를 암호화하는 제 1 핵산 및 비인간 구아닐레이트 키나제를 암호화하는 제 2 핵산을 포함한다. 비인간 GMPK는 래트, 소, 효모 또는 세균 GMPK, 또는 이들의 유도체 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, GMPK는 하등 진핵세포, 특히 효모로부터 유도된다.

특히 유리한 양태에 따르면, 본 발명의 프레임워크내에 사용된 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제는 진핵세포 기원 또는 동물기원이다. 더욱 바람직하게는, 효모 또는 소 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제이다. 본 출원인은 사실상, 놀랍게도, 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지애로부터의 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제 또는 소로부터의 것이 갠시클로버 디포스페이트 또는 아시클로버 디포스페이트와 같은 뉴클레오사이드 디포스페이트 동족체를 뉴클레오사이드 트리포스페이트로 인산화시킬 수 있음을 입증하였다. 또한, 실시예에 제시된 결과는 이들 효소가 이러한 기질에 대해, 인간 효소보다 매우 우수한 활성을 보유하고 있음을 명백히 보여준다. 따라서, 인간 효소 0.675 ㎍의 존재하에서, 수득된 GCV 트리포스페이트의 %는 1.5%인 반면에, 효모 효소 0.75㎍의 존재하에서는 82.9%이다. 이와 마찬가지로, 인간효소 6.75㎍의 존재하에서, GCV 트리포스페이트의 %는 24%인 반면에, 효모 효소 1.5㎍의 존재하에서는 91.1% 및 소 효소 5㎍ 존재하에서는 92%이다. 동일결과가 다른 뉴크레오사이드 동족체인 아시클로버로 수득된다. 따라서, 인간 효소 6.75㎍의 존재하에서 수득된 ACV 트리포스페이트의 %는 0.4% 미만인 반면에, 효모 효소 1.5㎍의 존재하에서는 8%, 효모 효소 15㎍의 존재하에서는 81%, 및 소 효소 5㎍의 존재하에서는 1.3%이다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 배합물에, 효모 또는 소 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제를 사용하는 장점을 명백히 입증한다. 이러한 결과는 또한, 동족체의 모노포스페이트로의 인산화 제 1 단계가 공정에 있어 반드시 제한 단계이지만은 않고, 본 발명에 따른 효소의 배합물 사용으로 치료법의 치료능을 증가시킬 수 있음을 보여준다.

더욱이, 본 출원인은 또한, 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지애로부터의 구아닐레이트 키나제 또한 갠시클로버 모노포스페이트 또는 아시클로버 모노포스페이트와 같은 뉴클레오사이드 모노포스페이트 동족체의 뉴클레오사이드 디포스페이트로의 인산화를 우수한 활성으로 가능케함을 밝혀내었다. 따라서, 효모 효소 2.5㎍의 존재하에서, 수득 GCV 디포스페이트의 %는 92%을 초과할 수 있고 효모 효소 74㎍의 존재하에서는 수득 ACV 디포스페이트의 %가 54%이다. 더욱이, 제시된 결과는 구아닐레이트 키나제가 인간 효소의 2 배 만큼 높은 GCVMP 인산화율을 가짐을 보여준다. 이와 마찬가지로, GCVMP에 대한 이의 친화성은 인간 효소가 이러한 기질에 대해 보이는 친화성보다 적어도 2배까지 크다. 전체적으로, GCVMP에 대한 효모 효소에 대한 Vmax/Km 값은 인간 효소에 의해 보이는 값보다 4.4 배 더 높다. ACVMP의 경우, 효모 효소에 대한 Vmax/Km 값은 이러한 기질에 대해 인간 효소가 보이는 값보다 7 내지 9 배 더 높다.

본 출원인은 또한, 이러한 두 종류의 비인간 효소를 티미딘 키나제, 예를 들면, 허피스 바이러스 I 형 티미딘 키나제와 커플링시킴으로써 갠시클로버 또는 아시클로버와 같은 뉴클레오사이드 동족체를 트리포스페이트 유도체로, 매우 높은 효율로 인산화시킬 수 있음을 증명해내었다.

바람직한 양태에 따라, 본 발명의 조성물은 효모로부터의 구아닐레이트 키나제를 암호화하는 서열(EC-2.7.4.8) 및/또는 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제(EC-2.7.4.8)를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 이들은 효모 사카로마이세스 세레비지애로부터의 효소이다. 이들 서열은 갠시클로버 또는 아시클로버와 같은 뉴클레오사이드를 삼인산화시킬 수 있도록, 허피스 심플렉스 바이러스 1 형 티미딘 키나제를 암호화하는 서열(HSV1-TK)(EC-2.7.1.21)과 동시에 사용된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 효소 또는 효소의 생체내 생산을 허용하는 핵산의 배합물을 포함할 수 있다. 이러한 양태는 더 높은 수준의 생체내 효소 생산 및 더 큰 치료효과를 허용하기에 바람직하다.

제 1 양태에 따라, 본 발명의 조성물에 있어서, 핵산은 동일한 발현벡터에 의해 운반된다. 이러한 양태는 특히 유리한데, 그 이유는 오직 하나의 벡터만이 얻고자 하는 목적 치료효과를 위해 포유류 세포 중으로 도입되어야 하기 때문이다. 이러한 양태에서. 각종 핵산은 동일 발현벡터내 3 개의 고유한 발현 카세트를 구성할 수 있다. 따라서, 각종 핵산은 각각 전사 프로모터, 전사 터미네이터 및 고유 해독 시그널의 조절하에 놓일 수 있다. 또한, 발현이 단일 프로모터 및 단일 전사 터미네이터에 의해 지시되는 폴리시스트론 형태로 수 종의 핵산을 삽입시킬 수 있다. 이러한 작업은 특히 핵산서열 사이에 위치한 IRES(통합성 리보좀 유입 부위)의 사용에 의해 수행될 수도 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 발현벡터는 두 핵산의 발현을 지시하는 이시스트론 단위, 및 제 3 효소를 암호화하는 분리된 핵산을 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 또한, 3 종의 핵산 발현을 지시하는 삼시스트론 단위를 포함할 수 있다. 이러한 각종 양태는 실시예에서 설명된다.

본 발명의 목적을 위한 바람직한 발현벡터는 특히;

-티미딘 키나제를 암호화하는 제 1 핵산, 및 비인간 구아닐레이트 키나제(바람직하게는, 효모 구아닐레이트 키나제이다)를 암호화하는 제 2 핵산을 포함하는 벡터;

-티미딘 키나제를 암호화하는 제 1 핵산, 및 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제(바람직하게는, 비인간 진핵세포 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제이고, 더욱 바람직하게는 소 또는 효모 기원의 NDPK이다)를 암호화하는 제 2 핵산을 포함하는 벡터이다.

유리하게는, 이러한 벡터는 또한, 구아닐레이트 암호화 핵산을 포함한다.

본 발명의 벡터에 사용된 티미딘 키나제는 유리하게는 바이러스, 특히 포진 바이러스 기원의 티미딘 키나제이다. 바람직하게는, HSV-1 또는 HSV-2 바이러스 TK로부터 유도된 티미딘 키나제이다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 벡터에서, 각종 핵산은 고유 프로모터의 조절하에 놓일 수 있거나, 또는 시그널 프로모터의 조절하에 폴리시스트론 단위를 구성할 수 있다. 이와 관련하여, 전술한 바와 같이, 효소는 커플링된 형태로 생성될 수 있고, 각종 핵산은 각종 효소 활성을 운반하는 단백질을 생성하도록 커플링된다. 특히, 본 발명에 따른 벡터의 특정 양태는 바이러스 기원의 티미딘 키나제를 암호화하는 핵산 및 비인간 구아닐레이트 키나제를 암호화하는 핵산이 커플링되고 TK 및 GUK 활성 모두를 운반하는 단백질을 암호화함을 특징으로 한다. 다른 변법에 따라, 본 발명의 벡터에 있어서, 바이러스 기원의 티미딘 키나제를 암호화하는 핵산 및 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제를 암호화하는 핵산이 커플링되고 TK 및 NDPK 활성 모두를 운반하는 단백질을 암호화한다. 설명의 일환으로, 효소간의 커플링은 예를 들면 구조(G₄S)n의 펩타이드 링커에 의해 수행된다.

다른 양태에 따라, 본 발명의 조성물에 있어서, 핵산은 수 종의 발현 벡터에 의해 수행된다.

후술되는 바와 같이, 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 기원일 수 있다. 바이러스 기원의 벡터와 관련하여, 이들은 유리하게는 레트로바이러스 또는 아데노바이러스이다.

각종 프로모터가 본 발명의 프레임워크내에서 사용될 수 있다. 이들은 포유류 세포내 핵산발현을 허용하는 서열이다. 프로모터는 유리하게는, 인간세포에서 기능을 띠는 프로모터에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, 과증식성 세포(암세포, 재협착증 등)에서 핵산서열의 발현을 허용하는 프로모터이다. 이와 관련하여, 각종 프로모터가 사용될 수 있다. 이는 예를 들면, 고려되는 유전자(TK, GMPK, NDPK)의 실질적인 프로모터일 수 있다. 이는 또한 상이한 기원(기타 단백질의 발현에 관여하는, 심지어는 합성)의 영역일 수 있다. 이는 따라서, 여타 프로모터 또는 특이적 방식으로 또는 이와 달리 유도성 방식으로, 또는 이와 달리 강력하거나 약한 방식으로 유전자의 전사를 자극하거나 억제하는 유도된 서열일 수 있다. 특히, 진핵세포 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열을 들 수 있다. 예를 들면, 이들은 표적세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 진핵세포 프로모터 가운데서, 특히, 편재성 프로모터(HPRT, PGK, 알파-액틴, 튜불린 및 DHFR 유전자 등의 프로모터), 중간 필라멘트의 프로모터(GFAP, 데스민, 비멘틴, 뉴로필라멘트 및 케라틴 유전자 등의 프로모터), 치료 유전자의 프로모터(예를 들면, MDR, CFTR, 인자 VIII 및 ApoAI 유전자 등의 프로모터), 조직-특이성 프로모터(피루베이트 키나제, 빌린, 지방산 결합 장 단백질 및 평활근 알파-액틴 유전자 등의 프로모터), 예를 들면, 암세포와 같은 분열세포형의 특정 세포 프로모터 또는 자극에 대응하는 프로모터(스테로이드 호르몬 수용체, 레티노산 수용체, 글루코코티코이드 수용체 등)를 들 수 있거나 표지 유도될 수 있다. 이와 마찬가지로, 이들은 예를 들면, 아데노바이러스 E1A 및 MLP 유전자의 프로모터, CMV 초기 프로모터, 또는 RSV LTR 프로모터 등과 같이, 바이러스 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 또한, 이들 프로모터 영역은 활성화 서열 또는 조절 서열, 또는 조직-특이성 또는 우세 발현을 허용하는 서열의 첨가로 변성시킬 수 있다.

본 발명의 다른 요지는 구아노신 동족체 및 상기의 구아노신 동족체를 동시 투여 또는 개별 투여 또는 수 시간에 걸친 확산을 위해 삼인산화할 수 있는 효소의 조합을 포함하는 산물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 개별적으로 또는 함께 패키징된

- 뉴클레오사이드 동족체

- 티미딘 키나제를 암호화하는 핵산

- 구아닐레이트 키나제를 암호화하는 핵산, 및

- 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제를 암호화하는 핵산을 포함하는 독성 뉴클레오사이드 트리포스페이트 동족체의 생체내 생성을 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 요지는 또한 임의로 핵산 서열의 발현에 의해 원위치에 생성된 뉴클레오사이드의 인산화에 수반되는, 적어도 하나의 효소가 비인간 진핵세포 기원인 효소의 조합을 포함하는 조성물이다. 효소의 조합은 특히 TK와 NDPK; TK와 GMPK 또는 TK, GMPK와 NDPK를 포함한다.

본 발명은 또한 TK와 NDPK를 포함하는 효소 조합의 세포로의 투여를 포함하는 증식 세포의 파괴방법에 관한 것이다. 바람직하게도, 조합은 또한 구아닐레이트 키나제를 포함한다. 본 발명은 또한 TK와 GMPK를 포함하는 효소 조합의 세포로의 투여를 포함하는 증식 세포의 파괴방법에 관한 것이다.

본 방법에 따라서, 세포는 효소의 조합을 발현하는 세포에서 독성 화합물로 전환되는 뉴클레오사이드 동족체, 바람직하게는 구아노신 동족체와 접촉된다.

본 발명에 따라서, 효소를 암호화하는 핵산의 투여에 의해서 효소를 세포로 투여할 수 있다.

본 발명은 또한 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제 또는 이를 암호화하는 핵산을 증식 세포 파괴로 의도되는 약학 조성물의 제조를 위해서 티미딘 키나제 또는 티미딘 키나제를 암호화하는 핵산과 조합하여 사용함에 있다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 효소가 비인간 진핵세포 기원인, 효소의 조합으로의 동족체의 노출을 포함하는 뉴클레오사이드 동족체의 삼인산화 방법에 관한 것이다.

본 발명은 다수의 세포 기능장애를 간섭함을 가능하게 하는 신규 치료제를 제공한다. 이를 고려할 목적으로, 본 발명에 따른 핵산 또는 카세트를 그대로 처리될 부위에 주입하거나 직접적으로 파괴되거나 처리될 세포와 배양할 수 있다. 사실상 핵산이 특별한 벡터없이 세포로 통과할 수 있음이 기재되어 있다. 그러나, (i) 세포 통과의 효율, (ii) 클로닝, (iii) 세포외 및 세포내 안정성을 개선함을 가능하게 하는 투여 벡터의 사용이 본 발명의 프레임워크 내에서 바람직하다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 핵산 서열이 전달 벡터로 혼입된다. 사용된 벡터는 화학적이거나 플라스미드 또는 바이러스 기원일 수 있다.

화학적 벡터가 본 발명의 목적상, 진핵 세포에서 핵산 서열의 전달 및 발현을 촉진할 수 있는 비바이러스 제제를 포함하는 것으로 이해된다. 이러한 화학적 또는 생화학적, 합성 또는 천연 벡터는 특히 편리성, 안전성을 위해서, 또한 형질감염될 DNA의 크기에 관한 이론적 한계의 부재에 의해서 천연 바이러스에 대해 유리한 대안을 나타낸다. 이러한 합성 벡터는 두개의 주요 기능을 지니어, 형질감염될 핵산을 응축하고 세포 부착 및 원형질막, 경우에 따라 두 핵막을 가로지르는 통과를 촉진한다. 핵산의 다-음이온성을 극복하기 위해서, 비바이러스 벡터는 모두 다-양이온성 전하를 지닌다. 이러한 유형의 비바이러스 형질감염 기술의 대표적인 예로서, DNA 및 DEAE-덱스트란의 복합체 [참조문헌: Pagano et al., J. Virol. 1 (1967)891], DNA 및 핵단백질의 복합체 [참조문헌: Kaneda et al., Science 243 (1989) 375], DNA 및 지질의 복합체 [참조문헌: Felgner et al., PNAS 84 (1987)] 및 리포좀의 사용 [참조문헌: Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431] 등을 수반하는 것이 언급될 수 있다.

유전자 전달을 위한 벡터로서 바이러스의 사용은 이러한 물리적 형질감염 기술에 대한 유망한 대안으로서 나타난다. 이에 관하여, 다양한 바이러스를 특정 세포 집단을 감염시키는 능력에 대해서 시험한다. 특히, 레트로바이러스(RSV, HMS, MMS 등), HSV 바이러스, 아데노-수반 바이러스 및 아데노바이러스.

본 발명에 사용된 핵산 또는 벡터는 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 또는 경피 투여용 등으로 제형될 수 있다. 바람직하게는, 핵산 서열 또는 벡터는 주사 형태로 사용된다. 그러므로, 이것을 주사 제형, 특히 치료될 부위의 수준에서 직접적인 주사를 위해 약학적으로 허용되는 비히클과 혼합할 수 있다. 이들은 특히 경우에 따라 멸균수 또는 생리식염수의 첨가시 주사액을 구성하게 하는 등장성 멸균 용액, 또는 건조, 특히 동결-건조 조성물일 수 있다. 핵산 서열의 환자의 종양으로의 직접 주사는 이것이 치료 효과를 병에 걸린 조직의 수준에서 집중시킴을 가능하게 하므로 유리하다. 사용된 핵산 서열의 용량을 다양한 파라미터에 따라서, 특히 벡터, 사용된 투여 양식, 관련 병리 또는 원하는 치료 기간에 따라서 적응시킬 수 있다.

본 발명은 또한 상기에 규정된 효소 조합을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

이것은 또한 상기에 규정된 적어도 하나의 벡터를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

이것은 또한 효모 기원의 NDPK 또는 효모 기원의 GMPK의 뉴클레오사이드 동족체의 생체내 인산화를 위한 용도에 관한 것이다.

항증식성으로 인하여, 본 발명에 따른 약학 조성물은 과증식 장애, 예를 들면, 특히 암 및 재협착증의 치료에 가장 특별히 적합하다. 따라서, 본 발명은 세포, 특히 과증식 세포의 파괴에 특히 유효한 방법을 제공한다. 따라서, 종양 세포 또는 혈관 세포의 평활근 세포(재협착증)의 파괴에 적용할 수 있다. 암의 치료에 가장 특별히 적합하다. 실례로, 대장 선암, 갑상선암, 폐 암종, 골수성 백혈병, 직결장암, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, B 임파종, 난소암, 방광암, 신경교종, 간암종, 골수 또는 피부 암, 췌장암 또는 신장 및 전립선의 암, 후두암, 두부암 및 목부암, HPV-양성 항문생식기 암, 비인강의 EBV-양성 암 등이 언급될 수 있다.

이것은 시험관내 또는 생체외에서 사용될 수 있다. 이것은 핵산 서열(벡터의 서열 또는 카세트의 서열 또는 유도체의 직접 서열)의 존재하 세포 배양시에 본질적으로 존재한다. 생체내에서, 이것은 본 발명에 따른 벡터(또는 카세트)의 활성 양을 바람직하게는 직접적으로 치료될 부위의 수준에서, 고려되는 프로드럭, 즉, 갠시클로버 또는 뉴클레오사이드 동족체의 주입에 앞서, 동시에 및/또는 그후에 유기체에 투여시에 존재한다. 이에 관하여, 본 발명의 요지는 또한 세포 또는 이의 일부를 뉴클레오사이드 동족체의 존재하에 상기에 규정된 바와 같은 효소 조합 또는 핵산 서열 조합과 접촉시킴을 포함하는 과증식 세포의 파괴방법이다.

본 발명은 설명적이고 비제한적인 것으로 생각되는 하기의 실시예 및 도면의 도움으로 좀더 완전히 기재될 것이다.

본 발명은 유전자 및 세포 요법 분야에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 세포, 특히 증식세포 파괴에 사용될 수 있는 효소 배합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이러한 효소 배합물의 전달 및 세포내 발현을 허용하는 벡터, 및 항암 유전자 요법에 있어서 이의 치료적 용도에 관한 것이다.

도 1: 벡터 pcDNA3-TK의 개략도

도 2: 벡터 pXL2854의 개략도

도 3: 벡터 pXL2967의 개략도

도 4: 벡터 pXL3081의 개략도

도 5: 단백질 GMPK 및 NDPK의 발현도

도 6: 벡터 pXL3098의 개략도

표 1: GCVMP 및 ACVMP의 효모 및 인간 적혈구 GMPK에 대한 속도 상수. 공개된 값: [참조문헌: D.F. Smee et al (1985) Biochem. Pharmacol. 34: 1049-1056]^a; [R.E. Boehme (1984) J. Biol. Chem. 259:12346-12349]^b; [W.H. Miller and R.L. Miller (1980) J. Biol. Chem. 255:7204-7202]^c

표 2: TK-GMPK-NDPK 커플링: 형성된 산물의 %.

재료 및 방법

약어

ACV: 아시클로버

GCV: 갠시클로버

GMPK: 구아닐레이트 키나제

HSV1-TK: 허피스 심플렉스 바이러스 1형 티미딘 키나제

NDPK: 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제

일반 분자 생물학 기술

분자 생물학에서 이용되는 종래의 방법 예를 들어 플라스미드 DNA의 예비 추출, 세슘 클로라이드 구배에서 플라스미드 DNA의 원심분리, 아가로스 또는 아크릴아마이드 겔상의 전기영동, 전기 용출에 의한 DNA 단편의 정제, 단백질의 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 또는 이소프로판올을 이용한 생리식염수 배지에서 DNA의 침착, 및 에스케리키아 콜라이에서의 형질전환은 당해 분야의 숙련인에게 익히 공지되어 있고 문헌[참조: Sambrook et al. "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Ausubel et al. "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]에 자세히 기술되어 있다.

pUC형 플라스미드 및 M13류의 파아지는 시판 기원(Bethesda Research Laboratories)이고, 플라스미드 pBSK 또는 pBKS는 Stratagen에서 수득된다.

소위 PCR 기술[중합효소-촉매 연쇄 반응]에 의한 DNA 단편의 효소적 증폭은 제조자의 권장에 따라 DNA 열사이클러(Perkin Elmer Cetus)를 이용해 수행될 수 있다.

이. 콜라이 세포로 플라스미드 DNA의 전기투공은 공급자의 권장에 따라 일렉트로포레이터(Bio-Rad)를 이용해 수행될 수 있다.

뉴클레오타이드 서열의 검증은 Amersham에서 판매된 키트 또는 Applied Biosystems에서 판매된 키트를 이용하여 문헌[참조: Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74(1977) 5463-5467]에서 전개된 방법에 의해 수행될 수 있다.

실시예 1- 효소 화합물의 발현을 위한 벡터의 작제

본 실시예는 시험관 내 또는 생체 내에서 본 발명의 핵산 서열의 발현 및 전달을 위한 벡터의 다양한 작제방법에 관해 기술하고 있다.

1.1 - 플라스미드 벡터의 작제

플라스미드 벡터의 작제를 위해, 다양한 유형의 발현 벡터를 이용할 수 있다. 2가지 유형의 벡터가 좀더 특히 바람직하다:

- 문헌[참조: DNA Cloning, A practical approach Vol. 2, D. M. Glover(Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985]에 기술된 벡터 pSV2. 이 벡터는 진핵 세포 발현 벡터이다. 본 발명의 효소 화합물을 암호화하는 핵산을 이 벡터의 HpaI-EcoRV 부위에 삽입시킬 수 있다. 이들은 SV40 바이러스 인핸서의 프로모터의 조절하에 놓이게 된다.

- 벡터 pCDNA3(Invitrogen). 이것도 또한 진핵세포 발현 벡터이다. 이 벡터에서, 효소 및 본 발명의 효소 화합물을 암호화하는 핵산 서열은 초기 CMV 프로모터의 조절하에 놓이게 된다.

1.2 - 바이러스 벡터의 작제

특정 양태에 따라, 본 발명은 앞서 정의된 핵산의 생체 내 전달 및 발현을 허락하는 바이러스 벡터의 작제 및 사용에 있다.

아데노바이러스를 좀더 상세히 고려할 경우, 구조 및 특성이 약간 다른 상이한 혈청형이 특징화된다. 이러한 혈청형 중, 유형 2 또는 5 인간 아데노바이러스(Ad2 또는 Ad5) 또는 동물 기원(출원 WO94/26914 참조)의 아데노바이러스의 사용이 본 발명 맥락에서 바람직하다. 본 발명의 맥락에 이용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스 중, 개, 소, 쥐(예: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 조류 또는 원숭이(예: SAV)의 아데노바이러스가 언급될 수 있다. 바람직하게는, 동물 기원의 아데노바이러스는 개 아데노바이러스, 좀더 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스[예를 들면 Manhattan 균주 또는 A26/61 (ATCC VR-800)]이다. 바람직하게는, 인간 또는 개 또는 혼합 기원의 아데노바이러스가 본 발명의 맥락에 이용된다.

바람직하게는, 본 발명의 결손 아데노바이러스는 ITR, 캡시드화 허용 서열 및 본 발명에 따른 핵산을 포함한다. 좀더 바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스 게놈에서, 적어도 E1 영역은 비기능성이다. 관련 바이러스 유전자를 당해 분야의 숙련인에게 공지된 기술, 특히 관련 유전자에서 하나 이상 염기의 완전 억제, 치환, 부분 결실, 또는 첨가에 의해 비기능화시킬 수 있다. 이러한 변형은 시험관 내(분리된 DNA) 또는 원 장소에서, 예를 들면, 유전 공학 기술, 또는 돌연변이제에 의한 처리에 의해 이루어질 수 있다. 기타 영역, 특히 영역 E3(WO 95/02697), E2(WO 94/28938), E4(WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697) 및 L5(WO 95/02697)도 또한 변형될 수 있다. 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 아데노바이러스는 E1 및 E4 영역에서 결실을 포함한다. 또다른 바람직한 양태에 따라, 이는 본 발명의 E4 영역 및 핵산 서열이 삽입되는 수준에서 E1 영역에서의 결실을 포함한다(FR 94 13355참조). 본 발명의 바이러스에서, E1 영역에서의 결실은 바람직하게는 Ad5 아데노바이러스 서열상에서 뉴클레오타이드 455에서 3329로 확장된다.

본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스는 당해 분야의 숙련인에게 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다[참조문헌: Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917]. 특히, 이들은 아데노바이러스와 특히, 핵산 서열 또는 본 발명에 따른 혼합된 핵산 서열을 운반하는 플라스미드간의 상동 재조합에 의해 제조될 수 있다. 상동 재조합은 적절한 세포주로 아데노바이러스 및 플라스미드의 동시 형질감염 후에 일어난다. 사용된 세포주는 바람직하게는 재조합의 위험을 피하기 위해 통합된 형태로, 바람직하게는 (i) 상기 성분에 의해 형질감염될 수 있고 (ii) 결손 아데노바이러스 게놈의 일부를 보충할 수 있는 서열을 포함해야 한다. 세포주의 예를 들어 보면, 게놈에 통합된, 특히 출원 제 WO 94/26914 및 WO 95/02697 또는 문헌[참조: Yeh et al., J. Virol. 70 (1996) 559]에 기술된 E1 및 E4의 기능을 보충할 수 있는 Ad5 아데노바이러스 또는 세포주의 게놈 좌측 부위(12%)를 포함하는 인간 배 신장 세포주 293[참조문헌: Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59]이 언급될 수 있다.

다음, 복제된 아데노바이러스를 실시예에서 기술된 바와 같이, 종래의 분자 생물학 기술에 따라 회수하고 정제한다.

아데노-수반 바이러스(AAV)를 고려하면, 이들은 안정하고 부위-특이적인 방법으로, 이들이 감염시키는 세포의 게놈으로 통합되는 비교적 작은 크기의 DNA 바이러스이다. 이들은 세포 생장, 형태, 또는 분화에 어떠한 작용을 유발함이 없이, 광범위한 세포를 감염시킬 수 있다. 또한, 이들은 인간 병리와 관련되지 않은 것으로 보인다. AAV 게놈은 이미 클로닝, 서열분석 및 특징규명되었다. 이는 바이러스의 복제 기원으로 작용하는, 약 4700 염기를 포함하고, 각각의 말단에 약 145 염기의 역 반복 서열(ITR)을 포함한다. 게놈의 나머지는 캡시드화 기능을 운반하는 2개의 필수 영역으로 나뉘어진다: 게놈의 좌측 부위, 이는 바이러스 복제 및 바이러스 유전자의 발현과 관련된 rep 유전자를 포함함; 게놈의 우측 부위, 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 포함함.

시험관 내 및 생체 내에서 유전자 전달을 위한 AAV-유도 벡터의 사용에 관해서는 문헌(특히 WO 91/18088; WO 93/09239; US 4, 797, 368, US 5, 139, 941, EP 488 528 참조)에 기술되어 있다. 이들 출원은 rep 및/또는 cap 유전자가 제거되고 관련 유전자에 의해 치환되는 상이한 AAV-유도 작제물, 및 시험관 내(배양 세포) 또는 생체 내(유기체로 직접)에서 관련 유전자의 전달을 위한 이들의 사용에 관해 기술하고 있다. 본 발명에 따른 결손 재조합 AAV는 인간 헬퍼 바이러스(예를 들면 아데노바이러스)에 의해 감염된 세포주로, 두가지 AAV 역 반복 영역(ITR)에 의해 경계지워진 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열의 조합을 포함하는 플라스미드, 및 AAV 캡시드화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라스미드의 동시 형질감염에 의해 제조될 수 있다. 유용한 세포주는 예를 들면 세포주 293이다. 기타 생성 시스템은 예를 들어 출원 WO 95/14771; WO 95/13365; WO 95/13392 또는 WO 95/06743에서 기술되고 있다. 생성된 재조합 AAV를 종래 기술로 정제한다.

허피스 바이러스 및 레트로바이러스의 경우, 재조합 벡터의 작제는 문헌[참조: 특히 Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, 등]에 넓게 기술하고 있다. 특히, 레트로바이러스는 선택적으로 분화 세포를 감염시키는 통합성 바이러스이다. 이들은 따라서 암 적용을 위한 관련 벡터를 구성한다. 레트로바이러스의 게놈은 필수적으로 두개의 LTR, 캡시드화 서열 및 3개의 암호화 영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 레트로바이러스에서 유도된 재조합 벡터 중, gag, pol 및 env 유전자는 일반적으로 완전히 또는 부분적으로 제거되고, 관련 이종 핵산 서열로 대체된다. 이러한 벡터는 상이한 유형의 레트로바이러스 예를 들면 특히 MoMuLV("쥐 몰로니 백혈병 바이러스"; MoMuLV로도 호칭됨), MSV("쥐 몰로니 육종 바이러스"), HaSV("하비 육종 바이러스"); SNV("비장 괴사 바이러스"); RSV("라우스 육종 바이러스") 또는 프렌드 바이러스로부터 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 서열 또는 핵산 서열의 조합을 포함하는 본 발명에 따른 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위해, 특히 LTR, 캡시드화 서열 및 핵산 서열을 포함하는 플라스미드를 작제한 다음, 플라스미드에서 트랜스로 결여된 레트로바이러스 기능을 제공할 수 있는 소위 캡시드화 세포주를 형질감염시키는데 이용한다. 일반적으로, 캡시드화 세포주는 따라서 gag, pol 및 env 유전자를 발현시킬 수 있다. 특히 세포주 PA317(US 4, 861, 719), 세포주 PsiCRIP(WO 90/02806) 및 세포주 GP+envAm-12(WO 89/07150)인 이러한 캡시드화 세포주에 관해서는 이전 분야에 기술되어 있다. 또한, 재조합 레트로바이러스는 LTR 수준에서 변형을 포함할 수 있는데 이는 전사 활성, 및 gag 유전자의 일부를 포함하는 확장된 캡시드화 서열을 억제하기 위함이다[참조문헌: Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639]. 생성된 재조합 레트로바이러스를 종래 기술에 의해 정제한다.

본 발명을 수행하기 위해, 아데노바이러스 또는 결손 재조합 레트로바이러스를 이용하는 것이 가장 특히 유리하다. 이들 벡터는 실제로 종양 세포로 자기불활화 유전자를 전달시키기 위한 특히 유리한 이점을 보유한다.

1.3 - 화학 벡터

본 실시예 (1.1) 및 실시예 2에서 기술된 플라스미드 발현을 위한 핵산 또는 벡터는 이들이 시험관 내 또는 생체 외에서와 같이 투여될 수 있다. 실제로 네이키드 핵산이 세포를 형질감염 시킬 수 있음이 밝혀졌다. 그러나, 전달 효율을 개선시키기 위해, 본 발명의 프레임워크내에서 전달 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 이는 바이러스 벡터(실시예 1.2.)이거나 합성 형질감염제일 수 있다.

개발된 합성 벡터 중, 하기 유형: 폴리라이신, (LKLK)_n, (LKLK)_n, (PCT/FR/00098) 폴리에틸렌 이민(WO 96/02655) 및 DEAE 덱스트란의 양이온 중합체, 또는 양이온 지질 또는 리포펙탄트를 사용하는 것이 본 발명의 프레임워크내에서 바람직하다. 이들은 DNA를 응축시키고 세포막과의 연합을 촉진하는 특성을 보유한다. 이들 중, 리포폴리아민(리포펙타민, 트랜스펙탐, 등), 상이한 양이온 또는 중성 지질(DOTMA, DOGS, DOPE 등) 및 핵 기원의 펩타이드가 언급될 수 있다. 또한, 수용체에 의해 매개되는 표적화된 형질감염의 개념이 생겨나게 되었고, 이는 포획하길 원하는 세포 유형의 표면에 존재하는 양이온 중합체와 막 수용체 리간드간의 화학적 커플링에 의해 막에 복합체의 부착을 지시하는 동안 양이온 중합체에 의해 DNA를 응축시키는 원리를 이용한다. 트랜스페린 및 인슐린 수용체 또는 간세포의 아시알로글라이코단백질용 수용체의 표적화에 관해 기술되어 있다. 이러한 화학 벡터를 이용한 본 발명에 따른 조성물의 제조는 당해 분야의 숙련인에게 공지된 기술, 일반적으로 단지 다양한 성분을 접촉시켜 수행된다.

실시예 2 - 진핵세포 발현 벡터에서 HSV1-TK 및/또는 구아닐레이트 키나제 및/또는 뉴클레오사이드 디포스포키나제의 클로닝

본 실시예는 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 원장소에서 본 발명의 효소 조합을 생성하는, 본 발명의 특정 양태에 관해 기술한다.

포유 동물 세포에서 원핵세포 또는 진핵세포 유전자의 발현은 당해 분야의 숙련인에게 공지되어 있다. 이러한 발현을 최적화하기 위해, 하기에서 기술된 본 발명의 벡터는 하기의 신호를 포함한다: (i) 인간 세포에서 잘 발현되는 CMV 프로모터와 같은 프로모터/인핸서; (ii) 컨센서스가 (G/A)NNAUG(G/A)인 코작 서열; (iii) 발현될 유전자; 다음 (iv) 폴리아데닐화 서열[참조문헌: V. Chisholm 1995 DNA cloning Vol. 4, ed. D. Glover and B. Hames pl]. 이러한 작제물은 벡터 pZeoSV, pcDNA3 등과 같은 공업용 벡터에 의해 가능하고, 사카로마이세스 세레비지애에서 HSV1-TK, GMPK 및 NDK를 암호화 하는 유전자를 이용해 수행된다.

2.1 - HSV1-TK의 발현 벡터

플라스미드 pHSV-106(Gibco-BRL)에서 유도된 허피스 심플렉스 바이러스 유형 1 티미딘 키나제를 암호화하는 HSV1-TK 유전자는 진핵세포 발현 벡터 pcDNA3(Invitrogen)로 클로닝된다. 6936 염기쌍의 이러한 플라스미드 pcDNA-TK는 pcDNA3의 EcoRI과 NotI 부위 사이의 pBTK1에서 얻어진 1.5 kb의 EcoRI-NotI 삽입 부위를 도입시켜 작제된다, 도 1 참조. 플라스미드 pBTK1은 하기의 방법으로 수득된다: 말단을 무디게 한 후, pHSV-106에서 수득되고 HSV1-TK 유전자를 포함한 1.5 kb의 BglII-NcoI 삽입 서열은 문헌[참조: McKnight 1980 Nucl. Acids Res. 8 p5931]에 공개되어 있고, pBSK의 SmaI 부위로 클로닝된다.

플라스미드 pcDNA3-TK의 삽입 서열은 (i) 코작 서열(CGTATGG)을 포함하는 HSV1-TK 유전자의 상류 60 bp, (ii) 문헌[참조: McKnight 1980 Nucl. Acids Res. 8 p5931]에 공개된 것과 일치하는 유전자 서열(1.13 kb), (iii) 또한 McKnight에 의해 기술된 유전자의 3' 서열(0.3 kb)을 포함한다.

2.2 - 구아닐레이트 키나제의 발현 벡터

pGUK-1에서 유도된 사카로마이세스 세레비지애 구아닐레이트 키나제를 암호화하는 561 bp의 GUK1 유전자(실시예 3 참조)는 코작 컨센서스가 도입된 후 진핵세포 발현 벡터 pcDNA3(Invirogen)로 클로닝된다. 이 플라스미드 pXL2854는 하기의 방법으로 얻어진다. GUK1 유전자를 포함한 pGUK-1의 XbaI-BamHI 삽입 서열은 플라스미드 pSL301(Invitrogen)의 XbaI-BamHI 부위 사이로 클로닝되어 GUK1 유전자는 HindIII 및 BamHI 효소에 의해 절단되고 pcDNA3의 HindIII 및 BamHI 부위 사이에 클로닝되어 플라스미드 pcDNA3-GUK1가 생성될 수 있다. 이 플라스미드의 HindIII 및 pflMI 부위 사이에 코작 컨센서스 및 GUK1의 5' 영역을 포함한 150 bp의 HindIII-pflMI 단편이 클로닝되어 6001 bp의 플라스미드 pXL2854가 형성된다, 도 2 참조. 150 bp의 HindIII-pflMI 단편은 플라스미드 pGUK-1 및 센스 올리고뉴클레오타이드 6915 5'(GAG AAG CTT GCC ATG GCC CGT CCT ATC GTA A)3' (서열 번호 1) 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 6916 5'(GAG GAT CCG TTT GAC GGA AGC GAC AGT A)3'(서열 번호 2)에 의해 PCR로 증폭된 280 bp의 단편에서 분리되고, 이때 하이브리드화는 45℃에서 일어난다(코작 컨센서스는 올리고뉴클레오타이드 6915에서 밑줄 그어져 있음). PCR로 증폭된 핵산 서열은 서열분석되고 공개된 서열[참조문헌: M. Konrad 1992 J. Biol. Chem. 267 p25652]과 비교하여 변화 S2A(2번 위치의 세린이 알라닌으로 치환됨) 및 V34A(34번 위치의 발린이 알라닌으로 치환됨)에 상응하는 두가지 상이한 서열을 나타낸다.

2.3 - 뉴클레오사이드 디포스포키나제의 발현 벡터

플라스미드 pAD1-YNK에서 유도된 사카로마이세스 세레비지애 뉴클레오사이드 디포스포키나제를 암호화하는 YNK 유전자[참조문헌: K. Watanabe et al. 1993 Gene 29 p141]는 코작 컨센서스를 도입한 후 진핵세포 발현 벡터 pcDNA3(Invitrogen)로 클로닝된다. 이 플라스미드 pXL2967은 하기의 방법으로 수득된다. PCR 증폭은 40℃의 하이브리드화 온도에서 주형 및 센스 올리고뉴클레오타이드 7017 5'(AAG GAT CCA CCA TGG CTA GTC AAA CAG AAA)3'(서열 번호 3) 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 7038 5'(AAG AAT TCA GAT CTT CAT TCA TAA ATC CA)3'(서열 번호 4)로 플라스미드 pAD1-YNK를 이용하여 수행된다(코작 컨센서스는 올리고뉴클레오타이드 7017에서 밑줄 그어져 있음). 477 bp의 증폭된 단편을 BamHI 및 EcoRI으로 절단한 다음 pcDNA3의 BamHI 및 EcoRI 부위로 클로닝하여 5861 bp의 플라스미드 pXL2967을 생성한다, 도 3 참조. PCR-증폭 단편의 서열은 NDPK 단백질[참조문헌: K. Watanabe et al. 1993 Gene 29 p141]의 경우 변화 S2A S2A(2번 위치의 세린이 알라닌으로 치환됨)에 상응하는 위치 4를 제외하고는 YNK 유전자의 경우에 공개된 것과 동일하다.

2.4 - 2개 유전자의 동시-발현 벡터

유전자의 동시-발현은 당해 분야의 숙련인에게 공지된 몇가지 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 양태는 발현될 서열 사이에, 내부 리보좀 삽입 부위, IRES 서열[참조문헌: Mountford et al., TIG 11 (1995) 179]을 도입하는데 있다.

IRES 서열 및 YNK 유전자는 클로닝된 GUK1 유전자의 3'에서 pcDNA3로 도입되어 GUK1 및 YNK의 동시-발현을 허용하는 벡터를 이시스트론 단위(벡터 pGUK1-YNK)의 형태로 생성한다. 좀더 상세하게는, 플라스미드 pCITE(Novagen)에서 수득된 EMCV(뇌심근염 바이러스)의 IRES(내부 리보좀 삽입 부위) 서열은 EcoRI 및 NcoI 부위 사이에서 PCR에 의해 재클로닝되고 플라스미드 pBluescript(Stratagene)의 EcoRI 및 EcoRV 부위에 도입되어 플라스미드 pXL3065를 생성한다. 플라스미드 pXL2967에서 유도된 YNK 유전자를 포함한 477 bp의 NcoI-EcoRV 단편은 pXL2967의 NcoI 및 EcoRV 부위에서 클로닝되어 플라스미드 pXL3079를 형성한다. 플라스미드 pXL3079의 IRES 및 YNK 유전자를 포함한 1 kb의 BamHI-EcoRV 단편은 플라스미드 pXL2854의 BamHI 및 EcoRV에서 클로닝되어 플라스미드 pXL3081를 생성한다. 이 플라스미드는 사카로마이세스 세레비지애 구아닐레이트 키나제 자체를 암호화하는 GUK1 유전자의 상류에 CMV 및 T7 프로모터에 이어 사카로마이세스 세레비지애 뉴클레오사이드 디포스포키나제를 암호화하는 IRES 및 YNK 유전자를 포함한다, 도 4 참조. GMPK와 NDPK 단백질의 발현을 Promega로부터 입수된 망상 적혈구 전사/해독 시스템의 플라스미드 pXL2854, pXL2967 및 pXL3081의 보조로 시험한다 (도 5 참조). 수득된 결과는 GMPK와 NDPK 단백질이 플라스미드 pXL3081과 동시발현됨을 나타낸다.

동일한 접근법이 TK와 YNK를 동시발현하는 벡터(벡터 pTK-YNK) 또는 TK와 GUK1을 동시발현하는 벡터(벡터 pTK-GUK1)를 생성하기 위해서 사용된다.

2.5 - 3개 유전자의 동시발현을 위한 벡터

TK를 암호화하는 서열을 3개 효소 활성을 발현시킬 수 있는 벡터(벡터 pTK-GUK1-YNK)를 생성하기 위해서 상기 실시예 2.4의 벡터 pGUK1-YNK으로 삽입한다.

2.6 - HSV1-TK/사카로마이세스 세레비지애 GMPK 융합의 발현을 위한 벡터

융합 단백질의 작제가 당해분야 전문가들에게 익히 공지되어 있고 한 단백질의 C-말단부와 다른 단백질의 N-말단부 간의 펩타이드 링커의 생성에 의해서 수행된다 [참조문헌: 1989 Nature 339 p394]. 이러한 단백질은 효소의 세포성 동시국재를 허용하고 또한 기질의 "터널링"을 촉진할 수 있다 [참조문헌: Ljungcrantz et al., 1989 Biochemistry 28 p8786].

융합 단백질을 링커 -(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-(Gly)4 (서열번호 9)의 보조로 HSV1-TK(Asn376)의 C-말단 서열과 사카로마이세스 세레비지애(Ser2)로부터의 GMPM의 N-말단 서열을 결합시킴으로써 생성한다. 이러한 융합 단백질을 생성하게 하는 플라스미드 pXL3098을 하기의 방법으로 작제한다. HSV1-TK 유전자(위치 1108에서 1128)의 3' 서열을 HSV1-TK 유전자(위치 1128 bp)의 Asn 코돈이 아미노산((Gly)₄Ser)₂Gly를 암호화하는 코돈에 의해 이어지도록 센스 올리고뉴클레오타이드 5'(CCG GGA GAT GGG GGA GGC TAA CGG AGG TGG CGG TTC TGG TGG CGG AGG CTC CG)3' (서열번호 5)와 안티센스 올리고뉴클레오타이드 5'(GAT CCG GAG CCT CCG CCA CCA GAA CCG CCA CCT CCG TTA GCC TCC CCC ATC TC)3' (서열번호 6)의 하이브리드화에 의해서 클로닝한다. 59 bp 단편을 이렇게 하여 플라스미드 pTKL+를 생성하기 위해서 pNEB193 (Biolabs)의 XmaI와 BamHI 부위 사이에 클로닝한다. 사카로마이세스 세레비지애 GUK1 유전자의 5' 서열을 GMPK의 위치 2의 Ser 코돈이 (Gly)3Ser 코돈에 선행되도록 주형 pXL2854와 센스 올리고뉴클레오타이드 5'(GAC AAT TCC GGA GGC GGT GGC TCC CGT CCT ATC GTA)3' (서열번호 7)와 안티센스 올레고뉴클레오타이드 5'(GAG GAT CCG TTT GAC GGA AGC GAC AGTA)3' (서열번호 8)의 보조로 PCR에 의해 증폭한다. 이러한 0.27 kb 단편을 pUC19(Biolabs)의 BamHI와 EcoRI 부위 사이에서 클로닝하여 이어서 GUK1의 3' 서열을 함유하는 pXL2854의 0.44 kb PflMI-BamHI 단편을 도입하기 위해서 PflMI와 BamHI로 절단되는 플라스미드를 형성하고 플라스미드 pGUKL을 생성한다. pGUKL-의 0.58 kb BspEI-XbaI 단편을 pTEL+의 BspEI와 XbaI 부위 사이에 삽입하여 pTKLGUK를 생성한다. 이어서 pTKLGUK의 0.63 kb XmaI-BamHI 삽입부를 발현 벡터 pET11a의 XmaI와 BamHI 부위 사이에 클로닝하여 플라스미드 pXL3098을 형성한다 (도 6 참조). 이 플라스미드를 균주 BL21DE3met에 도입하고 단백질 TK-((Gly)₄Ser)₃-GMPK의 생성을 유발한다.

이어서 융합 단백질을 균질적으로 정제하고 이 효소의 GCV와 ACV의 인산화 동역학 파라미터를 사카로마이세스 세레비지애로부터의 단백질 HSV1-TK와 GMPK로 수득된 동역학 파라미터와 비교한다.

2.7 - 생체로의 이송 및 발현

실시예 2.1에서 2.6에 기재된 벡터를 본 발명에 따라서 효소 조합의 생체내 전달 및 발현에 사용한다. 이것을 고려할 목적으로, 이 벡터를 포함하는 다양한 조성물이 제조된다:

- 벡터 pcDNA3-TK, 벡터 pXL2854 및 리포펙타민을 포함하는 조성물,

- 벡터 pcDNA3-TK, 벡터 pXL2967 및 리포펙타민을 포함하는 조성물,

- 벡터 pcDNA3-TK, 벡터 pXL2854, 벡터 pXL2967 및 리포펙타민을 포함하는 조성물,

- 벡터 pTK-GUK1과 리포펙타민, 임의로 벡터 pXL2967과 조합하여 포함하는 조성물,

- 벡터 pTK-YNK, 리포펙타민, 임의로 벡터 pXL2854와 조합하여 포함하는 조성물, 및

- 벡터 pTK-GUK1-YNK와 리포펙타민을 포함하는 조성물.

리포펙타민을 실시예 1.3에 기재된 바와 같이 다른 화학적 벡터로 치환할 수 있다.

이러한 다양한 조성물을 본 발명의 효소 조합의 세포내 이송 및 발현을 위해 생체내 또는 생체외에서 사용한다. 이것을 또한 세포 배양액, 예를 들면, 섬유아세포 배양액 NIH3T3 또는 인간 대장 암종 세포 HCT116에서 사용할 수 있다. 벡터의 이송후, 뉴클레오타이드 동족체를 투여하고 세포 파괴가 증명된다.

실시예 3 - 구아닐레이트 키나제의 정제

사카로마이세스 세레비지애 GMPK를 과발현하는 이. 콜라이 균주의 세포 추출물을 EDTA의 존재하에 라이소자임으로의 용해, Menton-Golin의 분쇄 장치, French Press 또는 X-Press 유형의 사용, 초음파의 작용으로 언급될 수 있는 것들 중에서 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 좀더 상세하게는, 사카로마이세스 세레비지애 GMPK를 과발현하는 이. 콜라이 균주의 세포 추출물을 하기의 방법으로 제조한다:

이. 콜라이 균주 BL21 (DE3) pGUK-1을 문헌[참조: M. Konrad in J. Biol. Chem. 267 p25652 in 1992]에 기재된 바와 같이 배양한다. 원심분리(5000 x g; 20분) 후, 배양액 1ℓ로부터 수득된 세포를 1 mM EDTA를 함유하는 20 mM Tris/HCl 완충제 pH 7.5 20 ㎖에 재현탁하고 4분 동안 4℃에서 초음파처리한다. 원심분리(5000 x g; 1시간) 후, 상등액을 20 mM Tris/HCl 완충제 pH 7.5에서 평형을 이룬 MONO Q HR 10/10 컬럼(Pharmacia)으로 주입한다. 단백질을 20 mM Tris/HCl 완충제 pH 7.5에서 0 내지 500 mM NaCl의 직선 구배로 용출한다. GMPK 활성을 함유하는 분획을 합하고 농축한 다음 50 mM Tris/HCl 완충제 pH 7.5로 희석시킨 Superdex 75 HR16/10 컬럼(Pharmacia)에서 크로마토그래피한다. GUK 활성을 함유하는 분획을 합한다. 이러한 단계 후, 제조물은 SDS-PAGE에서 단일한 가시적 밴드를 갖고, 쿠마시 블루로 염색한 후, 이 밴드는 약 21,000의 겉보기 분자량으로 이동한다.

GMPK 활성을 문헌[참조: Agarwal et al., 1978 Meth. Enzymol. vol. LI p483]에 기재된 분석 절차를 사용하여 통상적으로 분석한다.

실시예 4 - 사카로마이세스 세레비지애 구아닐레이트 키나제에 대한 속도 상수의 결정

실시예 3에 기재된 바와 같은 정제된 효모 GMP 키나제에 대한 속도 상수는 하기의 효소 분석 조건하에서 결정된다:

효모 GMP 키나제를 4 mM ATP, 10 mM MgCl₂, 100 mM KCl, 1 mg/㎖ BSA(소 혈청 알부민) 및 5 내지 100 μM [8-3H]GCVMP (40 nCi/nmol) 또는 200 내지 3200 μM [8-3H]ACVMP (40 nCi/nmol)를 함유하는 50 mM Tris/HCl 완충제 pH 7.8 100 ㎕에서 30℃에서 10분 동안 배양한다. 반응을 반응 혼합물을 80℃에서 3분 동안 가열함으로써 정지시키고, 10 mM 칼륨 포스페이트 완충제 pH 3.5 50㎕를 첨가하고, 2분 동안 10,000 x g에서 원심분리 후, 상등액 100 ㎕를 하기 시스템의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해서 분석한다:

정지상: Partisphere SAX (WHATMAN) - 입자 직경: 5 ㎛

- 크기 : 4.6 x 125 mm.

이동상:

완충제 A: 0.01 M KH₂PO₄, pH 3.5 (농축된 H₃PO₄의 보조로 조정)

완충제 B: 0.75 M KH₂PO₄, pH 3.5 (농축된 H₃PO₄의 보조로 조정)

유량: 1 ㎖/분

구배:

분	%A	%B
0	100	0
5	100	0
30	0	100
40	0	100
42	100	0
45	100	0

검출:

UV: 265 nm

방사화학: 트리튬 검출

섬광물의 유량 (Berthold's Optisafe 1) 1 ㎖/분

속도 상수의 계산을 위해서, 효소 반응에 도입되는 효모 GMP 키나제의 양을 초기에 도입된 기질을 최대한으로 10%를 전환하기 위해서 조정한다. 미캘리스 곡선을 Grafit 소프트웨어(Sigma)의 보조로 실험점으로 조정한다. 결과가 표 1에 제시되어 있다. 이들은 효모 GMP 키나제가 GCVMP와 ACVMP를 인산화할 수 있음을 나타낸다. 또한, 이것은 인간 효소보다 2배 높은 GCVMP 인산화율을 나타낸다. 또한, GCVMP에 대한 친화성은 적어도 2와 동등한 인자에 의해 이러한 기질에 대한 인간 효소의 친화성보다 더 크다. 전체로, GCVMP에 대한 효모 효소에 대한 Vmax//Km 값은 인간 효소에 의해 표현되는 값보다 4.4배 더 높다. 경쟁을 시작하는 기질에 있어서, Vmax/Km 상수는 이들 기질에 대한 효소의 특이성을 결정한다. 이것은 "특이성 상수"의 명칭으로 알려져 있다 [참조문헌: A. Fersht, Enzyme Structure and Mechanism, 1985, W.H. Freeman and Co., London].

동일한 방법으로, 효모 GMP 키나제는 실질적으로 인간 효소보다 더 큰 ACVMP 인산화능을 지닌다. ACVMP에 대한 효모 효소의 Vmax/Km 값은 인간 효소가 이러한 기질에 대해 나타내는 값보다 7 내지 9 배 더 높다.

실시예 5 - TK, GMPK 및 NDK 효소 활성의 커플링

바람직한 커플링 양식에서, 배양을 BSA(소 혈청 알부민) 1 mg/㎖, 5 mM ATP, 4 mM MgCl₂, 12 mM KCl, 2 mM DTT, 600 μM EDTA, 100 μM [8-3H]GCV (40 nCi/nmol) 또는 100 μM [2-3H]-ACVMP 40 nCi/nmol를 함유하는 50 mM Tris/HCl 완충제 pH 7.8 100 ㎕와 다양한 양의 TK, GuK 및 NDPK(cf 표 2)에서 수행한다. 세 유기체의 NDPK를 표 2에 나타낸 바와 같이 사용한다 (SIGMA에 의해 시판되는 효소).

사카로마이세스 세레비지애의 효소 HSV1-TK와 GMPK의 커플링은 갠시클로버의 갠시클로버 디포스페이트로의 90% 인산화를 허용한다. 제빵 효모, 즉, 사카로마이세스 세레비지애로부터의 뉴클레오사이드 디포스포키나제는 적혈구로부터의 인간 뉴클레오사이드 디포스포키나제에 의해 허용되는 것보다 더욱 양호한 활성을 갖는 갠시클로버 트리포스페이트로의 인산화를 허용한다. 필적할만한 결과가 아시클로버로 수득된다. 이러한 결과는 TK의 단독 변형이 시스템의 성질을 개선하기에 충분할 수 있음을 나타내면서 (a) 본 발명에 따른 효소의 조합이 인산화에 있어 상당한 개선을 제공하고, (b) 본 발명의 시스템이 TK 자기불활화 유전자에 의한 처리의 효능을 증가시킴이 가능하며, (c) 일부 비-인간 효소가 이의 사용을 특히 유리하게 하면서 뉴클레오사이드 동족체에 대한 더욱 양호한 활성을 지님을 명백히 증명한다.

실시예 6 - HSV1-TK/사카로마이세스 세레비지애 GMPK 융합 단백질의 정제

융합 단백질을 과발현하는 이. 콜라이 균주의 세포 추출물을 EDTA의 존재하 라이소자임으로의 용해, Menton-Golin-유형 분쇄 장치, French Press 또는 X-Press의 사용, 초음파의 작용으로 언급될 수 있는 것들 중에서 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 좀더 상세하게는, 융합 단백질을 과발현하는 이. 콜라이 균주의 세포 추출물을 하기의 방법으로 제조한다:

이. 콜라이 균주 BL21 DE3 pXL3090을 LB 배지에서 배양한다. 원심분리(5000 x g; 20분) 후, 배양액 1ℓ로부터 수득된 세포를 50 mM DTT, 4 mM MgCl₂, 10% (v/v) 글리세롤, 2 mM 벤즈아미딘, E64 (N-[N-(L-3-트랜스-카복시옥시란-2-카보닐)-L-류실]-4-아미노부틸구아니딘 100 ㎍/ℓ를 함유하는 용액) 50 ㎕/ℓ, 0.2 mM Pefabloc, STI (대두 트립신 억제제), 류펩틴 2 mg/㎖을 함유하는 완충제 A(50 mM Tris/HCl pH 7.8) 20 ㎖에 재현탁시키고 4℃에서 4분 동안 초음파처리한다. 원심분리(5000 x g; 1시간) 후, 상등액을 완충제 A에서 평형을 이룬 MONO Q HR 10/10 컬럼(Pharmacia)에 주입한다. 단백질을 20 mM Tris/HCl 완충제 pH 7.5에서 0 내지 400 mM NaCl의 직선 구배로 용출한다. TK 및 GMPK 활성을 함유하는 분획을 함께 그루핑하고 농축한 다음 150 mM NaCl을 함유하는 완충제 A로 용출시킨 Superdex 200 HILoad 26/60 컬럼(Pharmacia)에서 크로마토그래피한다. TK 및 GMPK 활성을 함유하는 분획을 함께 그루핑한다. 이 단계에서, 제조물은 SDS-PAGE에서 단일의 가시적 밴드를 갖고, 쿠마시 블루로 염색한 후, 이 밴드는 약 61,000의 겉보기 분자량으로 이동한다.

실시예 7 - HSV1-TK/GMPK 융합에 의한 인산화의 연구

본 실시예는 사카로마이세스 세레비지애로부터의 단백질 HSV1-TK 및 GMPK로 수득된 동역학 파라미터와 비교하여, 융합의 GCV 및 ACV의 인산화의 동역학 파라미터의 연구를 기재한다.

7.1. TK 활성의 분석

TK의 활성은 하기와 같이 분석된다: TK 약 0.1 단위를 함유하는 효소 추출물을 BSA(소 혈청 알부민) 1 mg/㎖, 5 mM ATP, 4 mM MgCl₂, 12 mM KCl, 2 mM DTT, 600 μM EDTA 및 100 μM GCV + [8-3H]-GCV 40 nCi/nmol를 함유하는 50 mM Tris/HCl 완충제 pH 7.8 100 ㎕에서 37℃에서 15분 동안 배양한다. 반응을 1 mM 비방사능 티미딘을 함유하는 50 mM Tris/HCl 완충제 pH 7.8 10㎕를 첨가함으로서 정지시킨다. 인산화 종을 DEAE sephadex 컬럼(겔의 400 ㎕)에 부착시킨 다음, 컬럼을 세척한 후, 이 종을 1 M HCl 2㎖로 용출한다. 이어서 샘플의 방사능을 액체 신틸레이션에 의해서 카운팅한다.

7.2. GMPK 활성의 분석

GMPK의 활성을 문헌[참조: Method in Enzymology (1978) Vol. Li 483-490]에 기재된 분석 프로토콜을 사용하여 통상적으로 분석한다.

7.3. 융합 단백질의 활성과 TK 및 GMPK 효소 동시배양액의 분석

TK 및 GMPK의 합성 혼합물과 비교하여 TK-GMPK 융합 단백질의 GCV 또는 ACV를 GCVDP 또는 ACVDP로 전환하는 능력을 하기의 방법으로 측정한다:

BSA(소 혈청 알부민) 1 mg/㎖, 5 mM ATP, 4 mM MgCl₂, 12 mM KCl, 2 mM DTT, 600 μM EDTA 및 1 내지 100 μM GCV + [8-3H]-GCV (40 nCi/nmol) 또는 1 내지 100 μM ACV + [2-3H]ACV 40 nCi/nmol을 함유하는 50 mM Tris/HCl 완충제 pH 7.8 200 ㎕ 및 다양한 양의 TK, GMPK 및 동량의 융합 단백질에서 배양을 수행한다. 반응을 80℃에서 3분 동안 가열함으로써 정지시키고; 원심분리후, 배양 산물 100 ㎕를 하기의 시스템으로 분석한다:

정지상: Partisphere SAX (WHATMAN) - 입자 직경: 5 ㎛.

- 크기 : 4.6 x 125 mm.

이동상:

유량: 1 ㎖/분

구배:

분	%A	%B
0	100	0
5	100	0
30	0	100
40	0	100
42	100	0
45	100	0

검출:

UV: 265 nm

방사화학: 트리튬 검출

섬광물의 유량 (Berthold's Optisafe 1) 1 ㎖/분

사카로마이세스 세레비지애로부터의 효소 HSV1-TK와 GMPK의 커플링 및 조합은 갠시클로버의 갠시클로버 디포스페이트의 인산화를 허용한다 (표 3 참조). 필적할만한 결과가 아시클로버로 수득된다 (표 3 참조).

이러한 결과는 TK-GMPK 융합 단백질이 원래의 두 효소의 성질을 보유함을 나타낸다. 또한, 작업 조건에 따라서, TK-GMPK 융합 단백질은 야생형 TK 효소 및 GMPK 효소의 동시배양과 비교하여 a) GCV에 대해서 1.8 인자 이하의 범위로 b) ACV에 대해서 1.2 인자 이하의 범위로 인산화에 있어서의 상당한 개선을 제공한다.

융합 단백질은 생체에서 분리된 효소가 HSV1-TK에 있어 핵에, GMPK에 있어 세포질에 분포되는 세포내 효소 활성의 동시국재를 허용한다. 그러므로, 이러한 작제가 자기불활화 유전자에 의한 처리의 효율을 증가시킴이 가능하게 한다.

이러한 결과는 뉴클레오사이드 및 효소의 용량을 감소시킴과 실질적인 약리학적 이득을 수득함을 모두 가능하게 하면서, 본 발명의 치료적 가치를 대체로 명백히 증명한다.

서열 리스트

(1) 일반적인 정보:

(i) 출원인:

(A) 성명: 롱 프랑 로라 소시에테 아노님.

(B) 거리: 아브뉴 레이몽 아롱 20

(C) 도시: 앙토니

(E) 국가: 프랑스

(F) 우편 번호: 92165

(G) 전화: 01. 55. 71. 70. 36

(H) 팩스: 01. 55. 71. 72. 91

(ii) 발명의 명칭: 증식세포 파괴용 효소 배합물

(iii) 서열수: 9

(iv) 컴퓨터 판독 형태:

(A) 매체형: 테이프

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종

(C) 운영체계: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)

(2) 서열번호:1에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 31 염기쌍

(B) 유형: 뉴클레오타이드

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 유형: cDNA

(xi) 서열 배열: 서열번호:1:

(2) 서열번호:2에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 28 염기쌍

(B) 유형: 뉴클레오타이드

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 유형: cDNA

(xi) 서열 배열: 서열번호:2:

(2) 서열번호:3에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 뉴클레오타이드

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 유형: cDNA

(xi) 서열 배열: 서열번호:3:

(2) 서열번호:4에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 29 염기쌍

(B) 유형: 뉴클레오타이드

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 유형: cDNA

(xi) 서열 배열: 서열번호:4:

(2) 서열번호:5에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 53 염기쌍

(B) 유형: 뉴클레오타이드

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 유형: cDNA

(xi) 서열 배열: 서열번호:5:

(2) 서열번호:6에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 53 염기쌍

(B) 유형: 뉴클레오타이드

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 유형: cDNA

(xi) 서열 배열: 서열번호:6:

(2) 서열번호:7에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 36 염기쌍

(B) 유형: 뉴클레오타이드

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 유형: cDNA

(xi) 서열 배열: 서열번호:7:

(2) 서열번호:8에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 28 염기쌍

(B) 유형: 뉴클레오타이드

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 유형: cDNA

(xi) 서열 배열: 서열번호:8:

(2) 서열번호:9에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 14 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 유형: 펩타이드

(xi) 서열 배열: 서열번호:9:

GCVMP와 ACVMP에 대한 효모 및 인간 적혈구로부터의 구아닐레이트 키나제의 속도 상수

기질	효모 구아닐레이트 키나제(사카로마이세스 세레비지애)	인간 구아닐레이트 키나제(적혈구)
	Km(μM)	Vmax(μmol/분/mg)	Vmax/Km	Km(μM)	Vmax(μmol/분/mg)	Vmax/Km
GCVMP	18	40	2.2	40^a	20^a	0.5^a
GCVMP				42-54^b
ACVMP	280	22	0.08	218^a	1.9^a	0.009^a
				209-753^b
				330^c	3.6^c	0.011^c

TK-GMPK-NDPK 커플링: 형성된 산물의 NI당 %

기질100 ㎛	TK	GMPK	NDPK	형성된 산물의 NI당 %	배양시간(분)
	TK	GMPK	제빵용 효모	형성된 산물의 NI당 %		인간(적혈구)	소(간)
	Qty(㎍)	Qty(㎍)	Qty(㎍)	Qty(㎍)		Qty(㎍)	N	NMP	NDP	NTP
GCV	10.4	7.4				3.9	5.3	90.8		30
	2.6	2.5				3.5	7.5	89.0		30
	1.3	2.5				2.9	4.4	92.7		60
	10.4	7.4	1.5			1.1	0.9	6.9	91.1	30
	10.4	7.4	0.75			2.9	2.6	12.6	82.9	20
	1.3	2.5	0.75			3.9	3.2	13.8	79.1	60
	10.4	7.4		0.675		2.0	6.2	90.3	1.5	20
	10.4	7.4		6.75		2.4	2.5	71.1	24.0	30
	10.4	7.4			0.5	2.2	6.5	78.4	12.9	20
	10.4	7.4			5	1.9	0.6	5.8	92.0	30
ACV	11.7	74				20.0	26.0	54.0		20
	11.7	74	1.5			19.0	13.0	60.0	8.0	20
	11.7	74	15			13.0	1.4	4.6	81.0	30
	11.7	74		6.75		18.0	1.8	80.0	<0.4	30
	11.7	74			5	15.0	1.7	82.0	1.3	30

TK 및 GMPK 효소의 커플링 또는 조합에 의한 GCV 및 ACV의 인산화

기질	융합 200 ㎍	혼합물2-865/H12/GMPK 133/66 ㎍(resp.)	융합 2 ㎍	혼합물야생형/GMPK 1.66/0.33 ㎍(resp.)	혼합물2-865:H12/GMPK 1.66/0.33 ㎍(resp.)
GCV 100 μM			8270^**	4660^**
GCV 50 μM			4900^**		5300^**
ACV 100 μM	18500^**	17260^**

기질	융합 50 ㎍	혼합물2-865/H12/GMPK 33/17 ㎍(resp.)	혼합물야생형/GM33/17 ㎍(resp.)
ACV 20 μM	1220^**	2325^**	1045^**
ACV 50 μM	2920^**	3680^**	2390^**
ACV 50 μMIncub 1h	6740^**	5890^**
** 형성된 GCVDP의 pmmol

Claims

-모노포스페이트 동족체를 생성하기 위해 뉴클레오사이드 동족체를 인산화 할 수 있는 효소를 암호화하는 제 1 핵산,

-디포스페이트 동족체를 생성하기 위해 모노포스페이트 동족체를 인산화 할 수 있는 효소를 암호화하는 제 2 핵산, 및

-유독성 트리포스페이트 동족체를 생성하기 위해 디포스페이트 동족체를 인산화 할 수 있는 효소를 암호화하는 제 3 핵산을 포함하는, 효소 배합물의 생체내 전달 및 제조용 조성물.
제 1 항에 있어서, 제 1 핵산이 티미딘 키나제를 암호화함을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 제 2 핵산이 구아닐레이트 키나제를 암호화함을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 제 3 핵산이 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제를 암호화함을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 핵산이 동일벡터에 의해 운반됨을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 핵산이 수 종의 벡터에 의해 운반됨을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항 또는 6 항에 있어서, 벡터가 플라스미드 또는 바이러스 벡터임을 특징으로 하는 조성물.
티미딘 키나제를 암호화하는 핵산 및 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제를 암호화하는 제 2 핵산을 포함하는 조성물.
제 8 항에 있어서, 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제가 비인간 진핵세포 기원임을 특징으로 하는 조성물.
제 9 항에 있어서, 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제가 효모 또는 소 NDPK 중에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
제 10 항에 있어서, 티미딘 키나제 암호화 핵산 및 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제 암호화 핵산이 커플링되고 TK 및 NDPK 활성 모두를 운반하는 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 조성물.
제 8 항에 있어서, 추가로 구아닐레이트 키나제를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물.
제 12 항에 있어서, 핵산이 효모 구아닐레이트 키나제를 암호화함을 특징으로 하는 조성물.
티미딘 키나제를 암호화하는 핵산 및 비인간 구아닐레이트 키나제를 암호화하는 제 2 핵산을 포함하는 조성물.
제 14 항에 있어서, 구아닐레이트 키나제가 효모 기원임을 특징으로 하는 조성물.
제 15 항에 있어서, 티미딘 키나제 암호화 핵산 및 구아닐레이트 키나제 암호화 핵산이 커플링되고 TK 및 GUK 활성 모두를 운반하는 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 티미딘 키나제가 바이러스 기원임을 특징으로 하는 조성물.
-티미딘 키나제를 암호화하는 제 1 핵산, 및

-비인간 구아닐레이트 키나제를 암호화하는 제 2 핵산을 포함하는 벡터.
-티미딘 키나제를 암호화하는 제 1 핵산, 및

-뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제를 암호화하는 제 2 핵산을 포함하는 벡터.
제 19 항에 있어서, 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제가 비인간 진핵세포, 바람직하게는 소 또는 효모 기원임을 특징으로 하는 벡터.
제 19 항 또는 20 항에 있어서, 추가로 구아닐레이트 키나제를 암호화하는 핵산을 포함함을 특징으로 하는 벡터.
제 18 항 내지 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 티미딘 키나제가 바이러스 기원임을 특징으로 하는 벡터.
제 18 항 내지 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 각종 핵산이 별개의 프로모터 조절하에 배치됨을 특징으로 하는 벡터.
제 18 항 내지 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 각종 핵산이 단일 프로모터 조절하에 폴리시스트론 단위를 형성함을 특징으로 하는 벡터.
제 18 항, 22 항 및 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 기원의 티미딘 키나제를 암호화하는 제 1 핵산 및 비인간 구아닐레이트 키나제를 암호화하는 제 2 핵산을 포함하고, 상기 핵산이 커플링되며 TK 및 GUK 활성 모두를 운반하는 단백질을 암호화하는 벡터.
제 18 항 내지 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드 또는 바이러스 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
뉴클레오사이드 동족체를 삼인산화 할 수 있는 효소의 배합물, 및

뉴클레오사이드 동족체를 포함하는, 동시 또는 별도 투여 또는 시간에 따른 확산용 조성물.
-뉴클레오사이드 동족체,

-티미딘 키나제를 암호화하는 핵산,

-구아닐레이트 키나제를 암호화하는 핵산, 및

-뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제를 암호화하는 핵산을 별도로 또는 함께 포장하여 포함하는, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 동족체의 생체내 제조용 조성물.
-뉴클레오사이드 동족체,

-티미딘 키나제를 암호화하는 핵산, 및

-뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제를 암호화하는 핵산을 별도로 또는 함께 포장하여 포함하는, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 동족체의 생체내 제조용 조성물.
제 27 항 내지 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오사이드 동족체가 구아노신 동족체임을 특징으로 하는 조성물.
제 30 항에 있어서, 구아노신 동족체가 갠시클로버, 아시클로버 및 펜시클로버 중에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
뉴클레오사이드의 인산화에 관여하는 효소의 배합물을 포함하고, 이러한 효소 중 적어도 하나가 비인간 진핵세포 기원인 조성물.
TK 및 NDPK를 포함한 효소 및 뉴클레오사이드 동족체의 배합물을 세포에 투여함을 포함하는 증식성 세포의 파괴방법.
제 33 항에 있어서, 배합물이 추가로 구아닐레이트 키나제를 포함함을 특징으로 하는 방법.
TK 및 비인간 GMPK를 포함한 효소 및 뉴클레오사이드 동족체의 배합물을 세포에 투여함을 포함하는 증식성 세포의 파괴방법.
제 33 항 내지 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오사이드 동족체가 구아노신 동족체임을 특징으로 하는 방법.
제 36 항에 있어서, 구아노신 동족체가 갠시클로버, 아시클로버 및 펜시클로버 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 33 항 내지 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 효소가 이를 암호화하는 핵산의 투여에 의해 세포에 투여됨을 특징으로 하는 방법.
뉴클레오사이드 동족체를 효소 배합물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이들 중 적어도 하나가 효모 기원인, 뉴클레오사이드 동족체의 삼인산화 방법.
티미딘 키나제 또는 티미딘 키나제를 암호화하는 핵산 및 뉴클레오사이드 동족체와 함께, 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제 또는 이를 암호화하는 핵산의, 증식성 세포 파괴용 약학 조성물 제조를 위한 용도.
바이러스 기원의 티미딘 키나제와 구아닐레이트 키나제 간의 커플링용 단백질을 암호화하는 핵산.
제 41 항에 있어서, 구아닐레이트 키나제가 효모 기원임을 특징으로 하는 핵산.
바이러스 기원의 티미딘 키나제와 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제 간의 커플링용 단백질을 암호화하는 핵산.
제 41 항 내지 43 항 중 어느 한 항에 따른 핵산에 의해 암호화된 단백질.