SK124598A3 - Enzyme combinations for destroying proliferative cells - Google Patents

Description

Kombinácia enzýmov na deštrukciu proliferatívnych buniek

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka oblasti génovej terapie a bunkovej terapie. Týka sa najmä kombinácie enzýmov použiteľných na deštrukciu proliferatívnych buniek. Týka sa tiež vektorov, ktoré umožňujú prenos a intracelulárnu expresiu týchto kombinácií enzýmov, ako aj terapeutického použitia najmä v protirakovinovej génovej terapii.

Doterajší stav techniky

Génová terapia, ktorá spočíva vo vložení genetickej informácie do organizmu alebo do bunky, zaznamenala v posledných rokoch veľký rozvoj. K vývoju týchto nových terapeutických postupov prispeli najmä identifikácia génov zahrnutých do patológií, podávajúcich vektorov génov, rozpracovanie riadenia expresných systémov alebo tkanivovo špecifických systémov. Počas posledných piatich rokov bolo vykonané množstvo klinických testov v rámci génovej terapie alebo bunkovej terapie, ako v Európe, tak aj v Spojených štátoch, v takých oblastiach ako sú monogénové choroby (hemofília, mukoviscidóza) , rakovina, kardiovaskulárne choroby a tiež problémy nervového systému.

¹ V oblasti patológií spojených s hyperproliferatívnymi bunkami (rakovina, restenóza, atď.) boli vyvinuté rôzne } prístupy. Niektoré sú založené na použití génov supresorov nádorov (p53, Rb), iné sú založené na použití protilátok riadených proti onkogénom (myc, Ras), iné sú založené na imunoterapii (podávanie nádorových antigénov alebo podávanie špecifických imunitných buniek atď.) . Ďalší postup spočíva vo vložení toxických alebo samovražedných génov do určitých buniek. Tieto gény sú schopné vyvolať deštrukciu buniek, do ktorých boli vložené. Takéto gény sú napríklad gény schopné vyvolať citlivosť bunky k farmaceutickému činiteľovi. Ide o gény kódujúce enzýmy necicavčie a netoxické, ktoré, keď sú exprimované v cicavčích bunkách, premieňajú preformu účinnej látky, spočiatku málo toxickú či netoxickú, na látku vysoko toxickú. Takýto mechanizmus aktivácie preformy účinnej látky je výhodný z niekoľkých dôvodov: umožňuje optimalizovať > terapeutický prejav pri zachovaní koncentrácie preformy účinnej látky alebo expresie enzýmu, zrušiť toxicitu už nepodávanej preformy účinnej látky a určiť smrteľnú dávku. Okrem iného použitie samovražedných génov ponúka tú výhodu, že tieto gény nie sú špecifické len pre určitý nádor, ale sú aplikovateľné všeobecne. Stratégie založené na použití génov supresorov nádorov alebo antionkogénnych protilátok sú aplikovateľné jedine na tumory vykazujúce zníženie schopnosti uvedeného génu supresora alebo zníženie supresie uvedeného onkogénu. Prístupy založené na imunoterapii musia byť prispôsobené jednotlivým pacientom s ohľadom na obmedzenie a imunitnú kompetentnosť. Naopak, stratégia založená na použití samovražedného génu je aplikovateľná na všetky typy nádorov a prakticky na každý typ bunky.

V odbornej literatúre bol opísaný veľký počet samovražedných génov, ako napríklad gény kódujúce cytozíndeaminázu, purínnukleozidfosforylázu alebo tymidín. kinázu, napríklad tymidínkinázy vírusu varicela alebo vírusu herpes simplex typu 1.

Cytozíndeamináza Escherichia coli je schopná katalyzovať deamináciu cytozínu na uracil. Bunky, ktoré exprimujú gén Escherichia coli sú teda schopné konvertovať E-fluórcysteín na 5-fluóruracil, ktorý je toxickým metabolitom (Mullen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:33).

Purínnukleozidfosforyláza Escherichia coli umožňuje konverziu netoxických analógov deoxyadenozínu na veľmi toxické adenínové analógy. Keďže eukaryotické enzýmy túto aktivitu nemajú, ak cicavčie bunky exprimujú tento prokaryotický gén, analóg deoxyadenínu, 6-metylpurín-2^r-deoxyribonukleozid, je premenený ' na produkt toxický pre bunky (Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1:233).

Tymidínkináza vírusu varicela umožňuje monofosforyláciu 6metoxypurínarabinozidu. Ak cicavčie bunky exprimujú tento gén, je produkovaný tento monofosfát a následne metabolizovaný bunkovými enzýmami na toxickú látku (Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039).

Medzi týmito génmi je v terapeutickom pláne zaujímavý najmä gén kódujúci tymidínkinázu (TK), lebo na rozdiel od iných samovražedných génov vytvára enzým schopný špecificky eliminovať bunky v priebehu delenia, keďže preforma účinnej látky je premenená na produkt rozširitelný nie len na inhibíciu syntézy DNA. Vírusová tymidínkináza, najmä tymidínkináza vírusu varicela alebo herpes simplex typu 1, má substrátovú špecificitu odlišnú od bunkových enzýmov a bolo dokázané, že sú cielovými analógmi guanozínu takého, ako acyklovírus alebo gancyklovírus (Moolten, 1986, Cancer Res. 46:5276). Gancyklovírus je fosforylovaný na gancyklovírusmonofosfát. Keď cicavčie bunky produkujú enzým HSV1-TK, potom bunkové kinázy umožňujú metabolizáciu gancyklovírusmonofosfátu na difosfát, 'e potom trifosfát, ktorý vyvoláva zastavenie syntézy DNA, čo vedie k bunkovej smrti (Moolten, 1986, Cancer Res. 46:5276, “•x . Mullen, 1994, Pharmac. Ther. 64:199). Rovnaký mechanizmus prebieha u ďalších tymidínkináz a ďalších analógov guanozínu.

Pri použití TK bol pozorovaný šírený toxický účinok (účinok „by-stander) . Tento účinok sa prejavuje deštrukciou nielen tých buniek, ktoré obsahujú gén TK, ale tiež susedných buniek. Mechanizmus tohto pôsobenia je možné vysvetliť tromi spôsobmi: i) tvorbou apoptických mechúrikov, ktoré obsahujú fosforylovaný gancyklovírus alebo tymidínkinázu spôsobujúce bunkovú smrť, a následnou fagocytózou týchto mechúrikov susednými bunkami, ii) prechodom preformy účinnej látky metabolizovanej tymidínkinázou procesom metabolickej spolupráce buniek, ktoré obsahujú samovražedný gén, cez bunky, ktoré, ju neobsahujú a/alebo iii) imunitnou odpoveďou spojenou s potlačením nádoru (Marini et al., 1995, Gene Therapy 2:655).

Použitie samovražedného génu, ktorý kóduje tymidínkinázu vírusu herpes simplex typu 1, je široko opísané v odbornej literatúre. Najmä prvé štúdie in vivo na krysách, ktoré mali glióm, ukazujú regresiu nádoru keď bol exprimovaný gén HSV1-TK a keď bol injikovaný gancyklovírus v dávke 150 mg/kg (K. Culver et al., 1992, Science 256:1550). Tieto dávky sú pre myši vysoko toxické (T. Osaki et al., 1994, Cancer Research 54:5258) a teda úplne vylúčené z génovej terapie človeka.

Určitý počet klinických skúšok tiež prebieha u ľudí. V týchto skúškach je gén TK vydávaný z buniek prostredníctvom rôznych vektorov, ako sú najmä retrovírusové a adenovírusové vektory. V klinických testoch génovej terapie pre človeka sa používajú slabšie dávky, okolo 5 mg/kg, a kratšia doba liečenia (14 dní) (E. Oldfield et al., 1995, Human Gene Therapy 6:55). Pri zvýšených dávkach alebo pri predĺženej dobe liečenia boli pozorované nežiaduce vedľajšie účinky.

S cielom odstrániť tieto nevýhody bola navrhnutá syntéza látok odvodených od tymidínkinázy špecifickejších alebo aktívnejších vo fosforylácii analógov guanozínu. Boli tiež opísané deriváty získané cielenou mutagenézou. Nebola vykonaná žiadna presná biochemická charakterizácia na čistých enzýmoch, nebol publikovaný žiadny bunkový test používajúci tieto a nebolo opísané žiadne zvýšenie účinnosti (WO95/30007, Black et al., 1993, Biochemistry 32:11618). Indukovatelná expresia génu HSV1-TK s deléciou prvých 45 kodónov bola uskutočnená v eukaryotických bunkách, ale použité dávky preformy účinnej látky sú porovnateľné s dávkami opísanými vo všetkých pokusoch opísaných v odbornej literatúre (B. Salomon et al., 1995, Mol. Celí. Biol. 15:5322). Žiaden opísaný variant do dnešného dňa nevyjadruje zvýšenú aktivitu voči tymidínu alebo gancyklovírusu.

Podstata vynálezu

Predložený vynález navrhuje zlepšenú metódu génovej 'terapie človeka. Predložený vynález opisuje najmä metódu umožňujúcu zvýšiť účinnosť fosforylácie analógov guanozínu tymidínkinázou a tiež zvýšenie terapeutického potenciálu tohto liečenia. Predložený vynález navrhuje najmä metódu trifosforylácie analógov nukleozidov ako sú gancyklovírus a acyklovírus tak, aby trifosforylácia týchto analógov bola významne zvýšená s dávkami gancyklovírusu (príp. acyklovírusu) i) výrazne slabšími, ii) alebo schopnými vyvolať silnejší účinok „by-stander, iii) alebo nevedúcimi k bunkovej toxicite, ktorá by sa mohla prejaviť, keď je divý typ tymidínkinázy silno exprimovaný.

Táto metóda je aplikovateľná na rakovinu, kardiovaskulárne choroby alebo na každú nevyhnutnú aplikáciu smrti určitých buniek, ako sú bunky infikované vírusom, napr. vírusom typu HIV (human immunodeficiency virus), CMV (cytomegalovirus) a RSV (respirátory syncytial virus).

Predložený vynález sa týka predovšetkým použitia kombinácie enzýmov, ktoré umožňujú zvýšiť in vivo fosforylačnú reakciu analógov nukleozidov.

Prvý predmet. vynálezu spočíva teda v kompozícii obsahujúcej :

-enzým schopný fosforylovať analóg nukleozidu na vytvorenie monofosfátového analógu,

-enzým schopný fosforylovať uvedený monofosfátový analóg, pričom vzniká difosfátový analóg,

-enzým schopný fosforylovať uvedený difosfátový analóg, pričom vzniká toxický trifosfátový analóg.

Enzým schopný fosforylovať analóg nukleozidu za vzniku monofosfátového analógu je tymidínkináza, enzým schopný fosforylovať uvedený monofosfátový analóg za vytvorenia difosfátového analógu je guanylátkináza a enzým schopný fosforylovať uvedený difosfátový analóg za vytvorenia toxického . trifosfátového analógu je nukleoziddifosfátkináza. Kompozície podľa vynálezu môžu obsahovať enzým nepriamo, v podobe nukleovej kyseliny, ktorá daný enzým kóduje. Predmetom vynálezu je aj kompozícia použiteľná na uvoľnenie a produkciu kombinácie in vivo, ktorá obsahuje:

-prvú nukleovú kyselinu, ktorá kóduje enzým schopný fosforylovať analóg nukleozidu na vytvorenie monofosfátového analógu,

-druhú nukleovú kyselinu, ktorá kóduje enzým schopný fosforylovať uvedený difosfátový analóg na vytvorenie difosfátového analógu,

-tretiu nukleovú kyselinu, ktorá kóduje enzým schopný fosforylovať uvedený difosfátový analóg na vytvorenie toxického trifosfátového analógu.

Prvá nukleová kyselina výhodne kóduje tymidínkinázu, druhá nukleová kyselina výhodne kóduje guanylátkinázu, tretia nukleová kyselina výhodne kóduje nukleoziddifosfátkinázu.

Nukleozidový analóg je všeobecne analóg guanozínu, napríklad gancyklovírus, acyklovírus alebo pencyklovírus. Iné analógy sú napríklad látky typu trifluórotymidín, l-[2-deoxy, 2-fluoro, beta-D-arabinofuranozyl]-5-jódouracil, ara-A, 1-beta-D-arabinofuranozyltymidín (araT), 5-etyl-2'-deoxyuridín, jódouridín, AZT, AIU, dideoxycytidín, AraC a brómvinyldesuridín (BVDU). Uprednostňované analógy sú gancyklovírus, acyklovírus, pencyklovírus a BVDU, prednostne gancyklovírus a acyklovírus. Trifosfátová forma je toxická a spôsobuje priamo alebo nepriamo bunkovú smrť.

Keď sú cicavčie bunky modifikované na expresiu tymidínkinázy (napríklad HSV1-TK) uvedené do kontaktu s nukleozidovým analógom (napríklad gancyklovírusom), musia byť schopné zlepšiť fosforyláciu gancyklovírusu na vytvorenie -monofosfátu gancyklovírusu. Bunkové kinázy umožňujú úspešne metabolizovať tento monofosfát gancyklovírusu na difosfát a potom na trifosfát. Takto vytvorený trifosfát gancyklovírusu má toxický účinok, keď sa začlení do DNA a čiastočne inhibuje bunkovú DNA polymerázu alfa, čo vyvoláva zastavenie syntézy a to vedie k bunkovej smrti. Za limitujúcu etapu v tomto procese je považovaná etapa monofosforylácia nukleozidového analógu a to z toho dôvodu, že vo vedľajších odboroch boli opísané rôzne prístupy na zachovanie zlepšených vlastností tymidínkinázy (tvorba mutantov TK, hľadanie expresných systémov a účinnejšieho podávania atď.).

Predložený vynález teraz ukazuje, že je možné zvýšiť účinnosť liečenia podávaním ďalších enzýmov zahrnutých do fosforylácie nukleozidových analógov v kombinácii s tymidínkinázou. Predmetom predkladaného vynálezu sú tiež rôzne kombinácie enzýmov, ktoré umožňujú optimalizovať intracelulárnu reakciu trifosforylácie nukleozidových analógov. Iný aspekt '.predkladaného vynálezu sa týka vektorov, ktoré umožňujú vloženie a intracelulárnu expresiu týchto kombinácií enzýmov. 'Môže ísť najmä o niekoľko vektorov, ktoré umožňujú každú produkciu enzýmu, alebo o niekoľko vektorov, ktoré umožňujú každú produkciu niekoľkých enzýmov alebo všetkých enzýmov. Predkladaný vynález sa týka najmä metódy trifosforylácie nukleozidových analógov v prítomnosti kombinácie enzýmov prípadne produkovaných in situ napríklad expresiou zodpovedajúcich génov, ako aj metódy deštrukcie proliferatívnych buniek.

Fosforylácia monofosfátových nukleotidov na difosfáty a potom trifosfáty bola opísaná in vitro. Tieto fosforylácie boli vykonané v prítomnosti i) lyzátu Zudských buniek v prípade gancyklovírusu (Cheng et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:12460) alebo ii) enzýmových prípravkov guanylátkinázy a nukleoziddifosfátkinázy ľudských erytrocytov v prípade gancyklovírusu a acyklovírusu (Miller et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:720, Smée et al., 1985, Biochem. Pharmac. 34:1049). Fosforylácia monofosfátov nukleozidov na difosfáty a potom trifosfáty boli dokázané v cicavčích bunkách, tieto konverzie, ako sa zdá, sú neúplné u monofosfátu gancyklovírusu alebo monofosfátu acyklovírusu (Agbaria et al., 1994, Mol. Pharmacol. 45:777, Caruso et al., 1995, Virology 206:495, Salomon et al., 1995, Mol. Celí. Biol. 15:5322).

Predkladaná prihláška vynálezu teraz opisuje kompozície, ktoré umožňujú zvýšiť terapeutickú účinnosť tymidínkinázy in vi vo.

Prvým enzýmom, použitým v kompozícii a v metódach podľa predkladaného vynálezu, schopným fosforylovať nukleozidový analóg tak, aby bol vytvorený monofosfátový analóg, je výhodne necicavčia tymidínkináza. Ide najmä o tymidínkinázu vírusového pôvodu, najmä herpetického. Medzi herpetickými tymidínkinázami sa môžu najmä uviesť tymidínkináza vírusu herpes simplex typu 1 (HSV-TK1), tymidínkináza vírusu herpes simplex typu 2 (HSV2TK), tymidínkináza vírusu varicela (VZV-TK) , tymidínkináza vírusu Eppstein-Barrovej (EBV-TK) alebo tiež herpetická tymidínkináza vírusu hovädzieho pôvodu (Mittal et al., 1989, J. Virol. 70:2901), konského pôvodu (Robertson et al., 1988, NAR 16:11303), mačacieho pôvodu (Nunberg et al., 1989, J. Virol. 63:3240) alebo opičieho pôvodu (Otsuka et al., 1984, Virology 135:316).

Sekvencia génu, ktorý kóduje enzým tymidínkináza vírusu herpes simplex typu 1 bola opísaná v odbornej literatúre (pozri najmä McKnight, 1980, prírodné varianty, porovnateľnou enzýmovou

8:5931). Existujú k proteínom s tymidín alebo

Nucl. Acid. Res. ktoré vedú aktivitou na gancyklovírus (Michael et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:966). V odbornej literatúre bola tiež opísaná sekvencia génu, ktorý kóduje enzým tymidínkináza vírusu herpes simplex typu 2 (Swain et al., 1983, J. Virol. 46:1045).

Tymidínkináza použitá v predkladanom vynáleze môže byť natívna tymidínkináza (prírodná forma enzýmu alebo jej variant) alebo odvodená forma, totiž forma vzniknutá štruktúrnou modifikáciou či modifikáciami natívnej formy. Ako je už naznačené v odbornej literatúre boli opísané rôzne mutanty a deriváty. Keďže sa ich vlastnosti nezdajú byť významne modifikované, môžu byť tieto molekuly použité v rámci predkladaného vynálezu. Ide napríklad o mutanty, ktoré majú modifikáciu blízku oblasti DRH, miesta interakcie nukleozidu (W095/30007). Oblasť DRH zodpovedá kyseline asparágovej, arginínu a histidínu v polohách 163, 164 a 165 tymidínkinázy. Tieto tri polohy sú medzi herpetickými TK zachované. Boli opísané rôzne mutanty v polohách 160-162 a 168-170 (W095/30007). Iné umelo vytvorené varianty majú modifikácie na úrovni DNA väzbového miesta (FR96 01603). Iné deriváty tymidínkinázy môžu byť pripravené klasickými technikami molekulárnej biológie a použité v kombináciách podľa vynálezu. Tieto mutácie môžu byť pripravené napríklad mutagenézou nukleovej kyseliny, ktorá kóduje natívnu tymidínkinázu, prednostne herpetickú alebo jeden z jej variantov. Odborníkom je známy veľký počet metód riadenej alebo neriadenej mutagenézy, napríklad mutagenéza riadená PCR alebo oligonukleotidmi, neriadená mutagenéza in vítro chemickými činitelmi, napríklad hydroxylamínom, alebo in vivo v mutovanom kmeni Escherichia coli (Miller: A short course in bacterial genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1992). Takto mutované sekvencie sú exprimované v bunkovom alebo nebunkovom systéme a produkt expresie je testovaný na prítomnosť tymidínkinázovej aktivity za podmienok opísaných v príkladoch. Každý enzým, ktorý vznikol touto metódou má schopnosť fosforylovať nukleotidový analóg, aby vytvoril monofosfátový analóg, ktorý môže byť použitý v predkladanom

.. vynáleze.

V rámci prekladaného vynálezu sa používa tymidínkináza pochádzajúca z tymidínkinázy vírusu herpes simplex typu 1 (HSV1-TK) alebo zodpovedajúcej nukleovej kyseliny. Ide najmä o HSV1-TK alebo jeden z jej variantov, napríklad prírodný variant alebo umelo vytvorený variant. Medzi umelo vytvorenými variantmi sa môžu uviesť najmä varianty P1555A/F161V a F1611 (Biochemistry 32, 1993, pll618), variant A168S (Prot. Engin. 7, 1994, p83) alebo varianty, ktoré majú modifikáciu na úrovni DNA väzbového miesta, napríklad variant M60I. Používa sa najmä nukleová kyselina, ktorá kóduje tymidínkinázu vírusu herpes simplex typu 1 (HSV1-TK).

Druhým enzýmom, použitým v kompozíciách a metódach podlá vynálezu, schopným fosforylovať nukleozidový analóg, aby bol vytvorený difosfátový analóg, je výhodne guanylátkináza. Guanylátkináza (GMPK) bola purifikovaná z rôznych organizmov (človek, krysa, hovädzí organizmus, kvasinky). Gén, ktorý kóduje GMPK bol klonovaný tiež v rôznych bunkových typoch, najmä v Saccharomyces cerevisiae, gén GUK1 (Konrad, 1992, J. Biol. Chem 267:25652). Od tohto génu bol tiež purifikovaný enzým GMPK s molekulovou hmotnosťou 20 kDa. Bol tiež izolovaný gén GMPK označený gmk a silne exprimovaný v Escherichia coli (Gentry et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:14316). Tento enzým je odlišný od enzýmu Saccharomyces cerevisiae čo sa týka koordinácie a oligomerizácie, zatiaľ čo sekvencie vykazujú veľkú identickú oblasť 46,2% na 182 rezíduách. Sekvencia A11042 identifikovaná ako kódujúci faktor, ktorý má potencionálny účinok na rast hematopoetických buniek (EP0274560) predstavuje 51,9% totožnosti na 180 rezíduách u génu GUK1 kvasinky Saccharomyces cerevisiae a zdá sa, že tvorí ľudský homológ GMPK, aj keď neboli publikované nijaké biochemické údaje.

Tretím enzýmom, použitým v kompozícii a v metódach predkladaného vynálezu, schopným fosforylovať nukleozidový * difosfát na trifosfátový analóg je výhodne nukleoziddifosfátkináza. Nukleoziddifosfátkináza (NDPK) je enzým so širokou substrátovou špecificitou a bol purifikovaný z veľmi odlišných zdrojov (Inouye et al., 1991, Gene 105:31). Gén kódujúci NDPK bol klonovaný z rôznych organizmov (Myxococcus xanthus, Drosophíla melanogaster, Dictyostelium discoideum, krysa, hovädzí organizmus, človek, Escherichia coli a Saccharomyces cerevisiae], zodpovedajúce enzýmy boli vysoko homologické (Watanabe et al., 1993, Gene 29:141). Enzýmy vyšších eukaryotov obsahujú sekvenciu „leucine zipper (leucínový zips). Opísané ľudské gény kódujúce DNPK sú najmä nm23-Hl a nm23-H2. Je naznačené, že gén nm2-H2 kóduje dvoj funkčný proteín s dvoma nezávislými funkciami, ktorými sú aktivita NDPK a transkripčný faktor (Posteľ et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:8627). Gén YNK kvasinky Saccharomyces cerevisiae nie je pre kvasinky esenciálny a kóduje NDPK proteín, ktorý je pravdepodobne tetramerický a molekulová í. hmotnosť monomérov je 19 kDa (Jong et al., 1991, Árch. Biochem.

Biophys. 291:241).

Nukleotidová sekvencia kódujúca GMPK alebo NDPK použitých v rámci predkladaného vynálezu môže byť ľudského, zvieracieho, vírusového, syntetického alebo semisyntetického pôvodu.

Nukleotidové sekvencie podlá vynálezu môžu byť pripravené všetkými technikami známymi odborníkovi v danej oblasti. Ako príklad možno uviesť nasledujúce techniky:

-chemická syntéza s použitím sekvencií opísaných v odbornej literatúre, napríklad pomocou syntetizátora nukleových kyselín

- triedenie bánk pomocou špecifických sond, najmä sond opísaných v odbornej literatúre zmes techník zahrňujúcich chemickú modifikáciu (elongáciu, deléciu, substitúciu, atď.) sekvencie vybranej z banky.

Nukleové sekvenciu použité v rámci predkladaného vynálezu sú výhodne sekvencie cDNA alebo gDNA. Sekvencie cDNA sú sekvencie zbavené intrónov, získané od RNA. Sekvencie gDNA sú oblasti chromozómov. U eukaryotov obsahujú jeden alebo viac intrónov. Sekvencia gDNA použitá v rámci predkladaného vynálezu môže obsahovať celok alebo časť intrónov prítomných v prírodnom géne alebo jeden alebo viac umelo vytvorených intrónov vložených do cDNA napríklad na zvýšenie expresie v cicavčích bunkách. Nukleové kyseliny môžu kódovať natívne enzýmy alebo varianty alebo deriváty s totožnou aktivitou. Tieto analógy nukleových kyselín môžu byť získané klasickými technikami molekulárnej biológie, ktoré sú odborníkom dobre známe. Môže ísť o cielenú alebo nedelenú mutagenézu, deléciu alebo inzerciu, konštrukciu hybridných molekúl atď.. Funkčnosť analógov nukleových kyselín je určovaná tak, ako je to opísané v príkladoch určenia enzýmovej aktivity produktu expresie.

Kompozícia podľa vynálezu obsahuje prvú nukleovú kyselinu kódujúcu tymidínkinázu a druhú nukleovú kyselinu kódujúcu nukleoziddifosfátkinázu. V tomto spôsobe uskutočnenia vynálezu je nukleoziddifosfátkináza prednostne eukaryotického nehumánneho pôvodu. Nehumánnym enzýmom sa myslí enzým, ktorý nie je prirodzene prítomný v ľudských bunkách. Môže ísť o vírusový, zvierací enzým alebo enzým pochádzajúci z nižších organizmov ako sú kvasinky. Môže tiež ísť o neprírodný derivát ľudského enzýmu, ktorý má jednu alebo viac štruktúrnych modifikácií. NDPK použitá v prekladanom vynáleze je zvolená medzi NDPK kvasiniek a hovädzími NDPK. Tieto kompozície môžu okrem toho obsahovať nukleovú kyselinu kódujúcu guanylátcyklázu, napríklad kvasinkovú guanylátcyklázu.

Ďalšie kompozície podlá predkladaného vynálezu obsahujú prvú nukleovú kyselinu kódujúcu tymidínkinázu a druhú nukleovú kyselinu kódujúcu nehumánnu guanylátcyklázu. Nehumánna guanylátcykláza môže byť vybraná medzi GMPK krýs, hovädzími, kvasinkovými, bakteriálnymi alebo od nich odvodenými GMPK. GMPK pochádza prednostne z nižších eukaryotov, najmä z kvasiniek.

Podľa spôsobu uskutočnenia nukleoziddifosfátkináza použitá v rámci predkladaného vynálezu je eukaryotického alebo zvieracieho pôvodu. Ide najmä o kvasinkovú alebo hovädziu nukleoziddifosfátkinázu. Predkladatel skutočne dokázal, že kvasinková nukleoziddifosfátkináza pochádzajúca najmä zo

Saccharomyces cerevisiae alebo hovädzia NDPK umožňujú fosforylovať nukleozidové difosfátové analógy, ako je gancyklovírusdifosfát alebo acyklovírusdifosfát, na trifosfátové nukleozidy. Naznačené výsledky v príkladoch jednoznačne ukazujú, že tieto enzýmy majú pre tieto substráty vyššiu aktivitu ako ľudský enzým. V prítomnosti 0,675 μg ľudského enzýmu je množstvo získaného GCV trifosfátu 1,5%, v prítomnosti 0,75 μg kvasinkového enzýmu je dosiahnutých 82,9%. Rovnako v prítomnosti 6,75 μg ľudského enzýmu je množstvo získaného GCV trifosfátu 24%, v prítomnosti 1,5 μg kvasinkového enzýmu je dosiahnutých 91,1%, v prítomnosti 5 μg \ hovädzieho enzýmu je dosiahnutých až 92%. Rovnaké výsledky sú získané aj s inými analógmi nukleozidov, acyklovírusom. V prítomnosti 6,75 μg ľudského enzýmu je percento získaného ACV trifosfátu menej ako 0,4%, v prítomnosti 1,5 μ9 kvasinkového enzýmu je dosiahnutých 8%, v prítomnosti 15 μg kvasinkového enzýmu je dosiahnutých 81% a v prítomnosti 5 μ9 hovädzieho enzýmu je dosiahnutých 1,3%. Tieto výsledky jednoznačne ukazujú výhodu použitia, v kombinácii podľa vynálezu, kvasinkovej alebo hovädzej nukleoziddifosfátkinázy. Tieto výsledky tiež ukazujú, že prvá etapa fosforylácie monofosfátových analógov nie je etapou značne limitujúcou tento proces, a že použitie kombinácie enzýmov podľa vynálezu umožňuje zvýšiť terapeutický potenciál liečenia.

Predkladatel taktiež ukázal, že kvasinková guanylátcykláza, najmä zo Saccharomyces cerevisiae, umožňuje fosforylovať analógy nukleožidových monofosfátov, ako je gancyklovírusmonofosfát alebo acyklovírusmonofosfát, na nukleoziddifosfáty s dobrou aktivitou. V prítomnosti 2,5 pg kvasinkového enzýmu môže množstvo získaného GCV difosfátu dosahovať 92% a v prítomnosti 74 pg kvasinkového enzýmu dosahujú percentá získaného ACV difosfátu 54%. Uvedené výsledky jasne ukazujú, že guanylátkináza vykazuje dva krát vyššiu rýchlosť fosforylácie GCVMP ako ľudský enzým. Jeho afinita k GCVMP je aspoň dva krát vyššia ako afinita, ktorú vykazuje ludský enzým k tomuto substrátu. Hodnota Vmax/Km kvasinkového enzýmu je 7 až 9 krát vyššia ako hodnota prítomného ľudského enzýmu pre tento substrát.

Predkladáte! preukázal, že viazanie týchto dvoch nehumánnych enzýmov s tymidínkinázou, napríklad tymidínkinázou vírusu herpes simplex typu 2, umožňuje fosforylovať analógy nukleozidov ako je gancyklovírus alebo acyklovírus na trifosfátové deriváty s velmi významnou účinnosťou.

Podľa uprednostneného spôsobu uskutočnenia vynálezu kompozície podľa vynálezu obsahujú sekvencie kódujúce guanylátkinázu (EC-2.74.8) a/alebo kvasinkovú nukleoziddifosfátkinázu (EC-2.7.4.6). Ide najmä o enzýmy kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Tieto sekvencie sú použité spolu so sekvenciou HSV1-TK, ktorá kóduje tymidínkinázu vírusu herpes simplex typu 1 (EC-2.7.1.21), aby sa umožnilo trifosforylovať nukleozidové analógy ako je gancyklovírus alebo acyklovírus.

Ako už bolo naznačené, kompozície podľa vynálezu môžu obsahovať kombináciu enzýmov alebo nukleových kyselín umožňujúcich produkciu enzýmov in vivo. Výhodne ide o nukleové kyseliny. Tento spôsob uskutočnenia je uprednostnený, lebo umožní in vivo vyššiu produkciu enzýmov a tým tiež umožní významnejší terapeutický účinok.

Podľa prvého spôsobu uskutočnenia sú v kompozíciách podľa vynálezu nukleové kyseliny nesené rovnakým vektorom. Tento spôsob je veľmi výhodný, lebo postačuje vložiť do cicavčej bunky jeden vektor na získanie požadovaného terapeutického účinku. V tomto spôsobe uskutočnenia môžu tri rôzne nukleové kyseliny tvoriť· tri odlišné kazety expresie na jednom expresnom vektore. Rôzne nukleové kyseliny môžu byť umiestnené pod riadením transkripčného promótora, transkripčného terminátora a odlišných translačných signálov. Je tiež možné vložiť viac nukleových kyselín vo forme polycistrónu, ktorého expresia je riadená jedným promótorom a jedným transkripčným terminátorom. Toto môže byť uskutočnené najmä s použitím sekvencií IRES (Internal Ribosome Entry Site) umiestnených medzi nukleotidovými sekvenciami. Vektory expresie podľa vynálezu tiež môžu obsahovať bicistrónovú jednotku riadiacu expresiu dvoch nukleových kyselín a prípadne oddelenú nukleovú kyselinu kódujúcu tretí enzým. Vektory podľa vynálezu môžu tiež obsahovať tricistrónovú jednotku riadiacu expresiu všetkých ₀ troch nukleových kyselín. Tieto rozdielne spôsoby uskutočnenia vynálezu sú naznačené v príkladoch.

Expresné vektory uprednostnené podlá vynálezu sú najmä:

-vektor obsahujúci:

-prvú nukleovú kyselinu kódujúcu tymidínkinázu a

-druhú nukleovú kyselinu kódujúcu nehumánnu guanylátkinázu, najmä kvasinkovú guanylátkinázu.

-vektor obsahujúci:

-prvú nukleovú kyselinu kódujúcu tymidínkinázu

-druhú nukleovú kyselinu kódujúcu nukleoziddifosfátkinázu, najmä nehumánnu eukaryotickú nukleoziddifosfátkinázu.

Tento vektor výhodne obsahuje okrem iného nukleovú kyselinu kódujúcu guanylátkinázu.

'w

Tymidinkináza použitá vo vektoroch podľa vynálezu je výhodne vírusového pôvodu, najmä herpetická. Ide výhodne najmä o tymidínkinázu pochádzajúcu z vírusu HSV-1 alebo HSV-2.

Ako už bolo naznačené, do vektorov podľa vynálezu môžu byť umiestnené rôzne nukleové kyseliny pod riadením odlišných promótorov alebo môžu obsahovať polycistrónickú jednotku pod riadením jediného promótora. V tomto ohľade, ako už bolo naznačené, enzýmy môžu byť produkované v rozštiepenej forme, rôzne nukleové kyseliny sú rozštiepené, aby vytvorili proteín nesúci rôznu enzýmovú aktivitu. Spôsob uskutočnenia najmä vektorov podľa vynálezu je charakteristický tým, že nukleová kyseliny kódujúca tymidínkinázu vírusového pôvodu a nukleová kyselina kódujúca nehumánnu guanylátkinázu sú rozštiepené a kódujú proteín nesúci zároveň aktivitu TK a GUK. Podľa iného spôsobu sú vo vektoroch podlá vynálezu nukleová kyseliny kódujúca tymidínkinázu vírusového pôvodu a nukleová kyselina kódujúca nukleoziddifosfátkinázu rozštiepené a kódujú proteín nesúci zároveň aktivitu TK a NPDK. Väzba medzi enzýmami je uskutočnená prostredníctvom peptidovej spojky, napríklad štruktúry (G₄S)_n·

Podlá iného spôsobu uskutočnenia vynálezu sú v kompozíciách podlá vynálezu nukleové kyseliny nesené viacerými expresnými vektormi.

Ako je ďalej naznačené, expresné vektory môžu byť plazmidového alebo vírusového pôvodu. Pokiaľ ide o vírusové vektory, sú to výhodne retrovirus alebo adenovírus.

hormónov, receptor glukokortikoidov, atď.)

V rámci predkladaného vynálezu môžu byť použité rôzne promótory. Ide o sekvencie umožňujúce expresiu nukleovej kyseliny v cicavčej bunke. Promótor je výhodne vybraný medzi promótormi, ktoré sú funkčné v ľudských bunkách. Ide najmä o promótor umožňujúci expresiu sekvencie nukleovej kyseliny v hyperproliferatinych bunkách (rakovina, restenóza atď.). Z tohto hľadiska boli použité rôzne promótory. Ide napríklad o čistý promótor požadovaného génu (TK, GMPK, NDPK). Môže sa tiež ísť o oblasti rôzneho pôvodu (zodpovedné za expresiu iných proteínov alebo rovnakých syntetických). Ide tiež o každý promótor alebo odvodenú sekvenciu stimulujúcu alebo potlačujúcu transkripciu génu špecificky alebo nešpecifický, induktívne alebo neinduktívne, silno alebo slabo. Môžu sa uviesť najmä sekvencie promótorov eukaryotických alebo vírusových génov. Napríklad môže ísť o sekvencie promótorov pochádzajúcich z genómu cieľovej bunky. Z eukaryotických promótorov sa môžu použiť najmä promótory ubikvitínové (promótor génov HPRT, PGK, α-aktín, tubulín, DHFR atď.), promótory stredných vlákien (promótor génov GFAP, dezmín, vimentín, neurovlákna, keratín atď.), promótory terapeutických génov (napríklad promótor génov MDR, CFTR, Faktor VIII, ApoAI atď.), špecifické tkanivové promótory (promótor génu pyruvátkinázy, vilínu, promótor črevného proteínu viazania mastných kyselín, promótor aktínu a buniek hladkého svalstva atď.) , promótory buniek špecifického typu bunkového delenia, ako sú nádorové bunky alebo tiež promótory odpovedajúce na stimuly (receptory kyseliny retinovej, nazývané indukovatelné.

sekvencie promótorov pochádzajúcich z genómu steroidných receptor Môže ísť o vírusu, ako napríklad promótory génov E1A a MLP adenovírusu, raný promótor

CMV alebo tiež promótor LTR RSV, atď. . Tieto oblasti promótorov môžu byť modifikované pridaním aktivačnej sekvencie, reguláciou alebo sekvenciou umožňujúcou tkanivovo špecifickú alebo majoritnú expresiu.

Iný predmet vynálezu sa týka produktov obsahujúcich kombináciu enzýmov schopných trifosforylovať analóg guanozínu a uvedený analóg guanozínu z pohľadu spoločného podávania, oddeleného podávania alebo rozloženého v čase.

Vynález sa tiež týka kompozície na in vivo tvorbu toxického analógu nukleozidtrifosfátu obsahujúcej oddelene alebo spoločne:

-analóg nukleozidu

-nukleovú kyselinu kódujúcu tymidínkinázu

-nukleovú kyselinu kódujúcu guanylátkinázu

-nukleovú kyselinu kódujúcu nukleoziddifosfátkinázu.

Predmetom vynálezu je tiež kompozícia obsahujúca kombináciu enzýmov zahrnutých do fosforylácie nukleozidov, prípadne vytvorených in situ expresiou nukleových sekvencií aspoň jedným z týchto enzýmov, ktoré sú nehumánneho eukaryotického pôvodu. Kombinácia enzýmov obsahuje najmä TK a NDPK a GMPK alebo TK, GMPK a NDPK.

Predkladaný vynález sa tiež týka metódy deštrukcie proliferatívnych buniek, ktorá zahŕňa podávanie kombinácie enzýmov obsahujúcej TK a NDPK týmto bunkám. Kombinácia obsahuje prednostne okrem iného guanylátkinázu. Vynález sa týka tiež metódy deštrukcie proliferatívnych buniek, ktorá zahŕňa podávanie kombinácie enzýmov obsahujúcej TK a GMPK týmto bunkám.

Podľa tejto metódy sú bunky uvedené do kontaktu s analógom nukleozidu, prednostne s analógom guanozínu, ktorý je v bunkách exprimujúcich kombináciu enzýmov premenený na toxickú látku.

Podľa vynálezu môžu byť enzýmy podávané bunkám podaním nukleových kyselín kódujúcich uvedené enzýmy.

Vynález spočíva tiež v použití nukleoziddifosfátkinázy alebo nukleovej kyseliny kódujúcej NDK v kombinácii s tymidínkinázou alebo nukleovou kyselinou kódujúcou tymidínkinázu na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na deštrukciu proliferatívnych buniek.

Vynález sa tiež týka postupu trifosforylácie nukleozidových analógov obsahujúcich uvedený analóg a kombináciu enzýmov, pričom aspoň jeden je nehumánneho eukaryotického pôvodu.

Predkladaný vynález poskytuje teraz nové terapeutické látky umožňujúce interferovať s počtom nefunkčných buniek. S týmto cieľom môžu byť nukleové kyseliny alebo kazety pódia vynálezu injikované také ako sú na úrovni miesta ošetrenia alebo inkubované priamo s postihnutými bunkami alebo bunkami určenými na ošetrenie. Bolo opísané, že samotné nukleové kyseliny môžu penetrovať do bunky bez špeciálneho vektora, ale v rámci predkladaného vynálezu sa uprednostňuje použitie podávajúceho vektory, ktorý umožňuje zvýšiť i) účinnosť bunkovej penetrácie, ii) cielenie, iii) extra- a intracelulárnu stabilitu. V uprednostňovanom spôsobe uskutočnenia vynálezu sú nukleové sekvencie vložené do transportného vektora. Použitý vektor môže byť chemického, plazmidového alebo vírusového pôvodu.

Chemickým vektorom sa v zmysle vynálezu rozumie každý nevírusový vektor schopný umožniť prenos a expresiu nukleových sekvencií do eukaryotických buniek. Tieto chemické alebo biochemické, syntetické alebo prírodné vektory predstavujú zaujímavú alternatívu prírodným vírusom, najmä z dôvodu pohodlnosti, bezpečnosti a tiež neprítomnosti teoretického limitu týkajúceho sa veľkosti prenášanej DNA. Tieto syntetické vektory majú dve základné funkcie: skompaktniť nukleovú kyselinu na transfekciu a umožniť jej bunkovú fixáciu ako aj jej prechod cez plazmatickú membránu a prípadne cez dve nukleové membrány. Na zmiernenie polyaniónovej povahy nukleových kyselín majú nevírusové vektory všetky náboje polykatiónové. Ako príklad tohto typu techník nevírusovej transfekcie aktuálne vyvinutých na vloženie genetickej informácie je možné uviesť tie, ktoré zahŕňajú komplexy DNA a DEAE-dextrán (Pagano · et al., 1967, J. Virol 1:891), DNA a nukleové proteíny (Kaneda et al., 1989, Science 243:375), DNA a lipidy (Felgner et al., 1987, PNAS 64:7413), použitie lipozómov '(Fraley et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:10431) atď..

Použitie vírusov ako vektorov na prenos génov sa javí ako sľubná alternatíva fyzikálnych techník transfekcie. V tomto ohľade boli testované rôzne vírusy na svoju schopnosť infikovať rôzne bunkové populácie. Ide najmä o retrovírusy (RSV, HMS, MMS atď.), vírus HSV, vírus AAV (adeno-associated virus) a adenovírusy.

Sekvencie nukleových kyselín alebo vektor použitý v predkladanom vynáleze môže byť formulovaný z pohľadu podávania a to topikálne, orálne, parenterálne, intranazálne, intravenózne, intramuskulárne, podkožné, intraokulárne, transdermálne atď.. Sekvencia nukleovej kyseliny alebo vektor je použitý najmä vo forme injikovatelnej . Môže to teda byť zmes každého farmaceutický akceptovatelného vehikula na injikovatelnú formuláciu, najmä na priamu injekciu na úrovni t miesta ošetrenia. Môže ísť najmä o sterilné roztoky, izotonické roztoky alebo suché kompozície, najmä lyofilizované, ktoré po pridaní, podlá prípadu, sterilnej vody alebo fyziologického séra umožňujú injikovatelnú formu. Priama injekcia sekvencie nukleovej kyseliny do tumoru pacienta je zaujímavá, lebo umožňuje sústrediť terapeutický účinok na úrovni postihnutého tkaniva. Dávky nukleotidovej sekvencie môžu byť prispôsobené funkcii rôznych parametrov, najmä funkcii vektora, použitého spôsobu podávania, patológie alebo tiež doby liečenia.

Predkladaný vynález sa týka tiež každej farmaceutickej kompozície obsahujúcej kombináciu enzýmov tak, ako už bolo definované.

Týka sa tiež každej farmaceutickej kompozície, ktorá obsahuje aspoň jeden vektor taký, ako už bolo definované.

Týka sa tiež použitia NDPK kvasinkového pôvodu alebo GMPK kvasinkového pôvodu na fosforyláciu analógov nukleozidov in vi vo.

Z dôvodu ich antiproliferatívnych vlastností sú farmaceutické kompozície podľa vynálezu obzvlášť prispôsobené na liečenie hyperproliferatívnych chorôb ako napríklad rakoviny a restenózy. Predkladaný vynález sa týka aj metódy účinnej najmä na deštrukciu buniek, najmä hyperproliferatívnych buniek. Je tiež aplikovateľný na deštrukciu buniek tumorov alebo buniek hladkého svalstva vaskulárnej steny (restenóza) . Je najmä vhodný na liečenie rakovín. Napríklad je možné spomenúť adenokarcinómy tračníka, rakoviny štítnej žľazy, karcinómy pľúc, myeloidné leukémie, rakoviny prsníka, rakoviny pľúc, rakoviny žalúdka, rakoviny pažeráka, lymfómy B, rakoviny vaječníkov, rakoviny močového mechúra, glioblastómy, hepatokarcinómy, rakoviny kostí, rakoviny kože, rakoviny pankreasu alebo tiež rakoviny obličiek a prostaty, rakoviny hrtanu, rakoviny hlavy a krku, pozitívne genitálne rakoviny HPV (human papilloma vírus), pozitívne rakoviny nosohltanu EBV (vírus Epsteina-Barrovej) atď..

Môže byť použitý in vitro alebo ex vivo. Spôsob ex vivo spočíva najmä v inkubácii buniek v prítomnosti nukleovej sekvencie (alebo vektora, kazety alebo priamo derivátu). In vivo spôsob spočíva v podávaní aktívneho množstva vektoru (alebo kazety) podľa vynálezu do organizmu, prednostne priamo na úrovni miesta ošetrenia (najmä nádor), predbežne, súčasne a/alebo po injekcii preformy účinnej látky, teda gancyklovírusu alebo nukleozidového analógu. Z tohto hľadiska sú predmetom vynálezu aj metódy deštrukcie hyperproliferatívnych buniek zahrňujúce uvedenie spomínaných buniek alebo ich častí do kontaktu s kombináciou enzýmov alebo nukleotidovou sekvenciou tak, ako je už definované v prítomnosti nukleozidového analógu.

Nasledujúce obrázky a príklady vynález bližšie ilustrujú bez toho, že by akokoľvek obmedzovali jeho rozsah.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok	1:	.Schematické	znázornenie	vektora	pcDNA3-TK.
Obrázok	2:	Schematické	znázornenie	vektora	pXL2854
Obrázok	3:	Schematické	znázornenie	vektora	pXL2967
Obrázok	4 :	Schematické	znázornenie	vektora	pXL3081
Obrázok	5:	Dôkaz expresie proteínov GMPK a	NDPK
Obrázok	6:	Schematické	znázornenie	vektory	pXL3098

Tabulka 1: Kinetické konštanty kvasinkovej GMPK a ľudských erytrocytov na GCVMP a ACVPM. Publikované hodnoty: (Smée et al., 1985, Biochem. Pharmacol. 34: 1049-1056)³, (Boehme, 1984,

J. Biol. Chem. 259: 1234 6-1234 9) ^b, (Miller, W. H., Miller, R.

L., 1980, J. Biol. Chem. 255: 7204-7207)^c

Tabulka 2: Viazanie TK-GMPK-NDPK: % vytvorených produktov

Materiál a metódy

Skratky:

ACV acyklovírus

GCV gancyklovírus

GMPK guanylátkináza

HSV1-TK tymidínkináza vírusu herpes simplex typu 1

NDPK nukleoziddifosfátkináza

Všeobecné techniky molekulárnej biológie

Metódy klasicky používané v molekulárnej biológii, ako je preparatívna extrakcia plazmidovej DNA, odstreďovanie plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho, elektroforéza na agarózovom alebo akrylamidovom géle, purifikácia fragmentov DNA elektroelúciou, extrakcia proteínov zmesou fenol-chloroform, zrážanie DNA etanolom alebo izopropanolom, transformácia v Escherichia coli, atď., sú odborníkom dobre známe metódy sú podrobne opísané v odbornej literatúre (Sambrook et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, Ausbel et al., „Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987).

Plazmidy typu pUC a fágy série M13 sú komerčného pôvodu (Bethesda Research Laboratories), plazmidy pBSK alebo pBKS pochádzajú z firmy Stratagen.

Enzýmová amplifikácia fragmentov DNA technikou nazývanou PCR (Polymerase-catalysed Chain Reaction) môže byť vykonaná pomocou prístroja „DNA thermal cycler (Perkin Elmer Cetus) podľa odporúčania výrobcu.

Elektroporácia plazmidovej DNA do buniek Escherichia coli môže byť vykonaná pomocou elektroprátora (Bio-Rad) podľa odporúčania výrobcu.

Overenie nukleotidových sekvencií môže byť vykonané metódou podľa Sangera (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467) pomocou súpravy distribuovanej firmou Amersham alebo Applied Biosystems.

Príklady uskutočnenia vynálezu . Príklad 1

Konštrukcia vektorov expresie kombinácie enzýmov

Tento príklad opisuje rôzne metódy konštrukcie expresných vektorov a prenosných vektorov nukleotidových sekvencií podlá vynálezu in vitro alebo in vivo.

1.1 Konštrukcia plazmidových vektorov

Na konštrukciu plazmidových vektorov môžu byť použité rôzne typy expresných vektorov. Uprednostňované sú najmä nasledujúce dva typy vektorov:

- vektor pSV2 opísaný v DNA cloning, A practical approach Vol. 2, D.M. Glower (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Tento vektor je eukaryotický expresný vektor. Nukleové í kyseliny kódujúce kombinácie enzýmov podlá vynálezu môžu byť vložené do vektora v miestach Hpal-EcoRV. Sú umiestnené pod kontrolou promótora leucínového zipsu vírusu SV40.

vektor pCDNA3 (Invitrogen). Ide tiež o eukaryotický vektor. Nukleové sekvencie kódujúce enzýmy alebo kombinácie enzýmov podlá vynálezu sú umiestnené v tomto vektore pod kontrolou raného promótora CMV.

1.2 Konštrukcia vírusových vektorov

Vynález spočíva v konštrukcii a použití vírusových vektorov umožňujúcich prenos a expresiu in vivo nukleových kyselín takých, aké už boli opísané.

Čo sa týka najmä adenovírusu, boli charakterizované rôzne sérotypy, ktorých štruktúra a vlastnosti sa menia. Medzi týmito sérotypmi sa v rámci predkladaného vynálezu prednostne používajú ľudské adenovírusy typu 2 alebo 5 (Ad2 alebo Ad5) alebo adenovírusy zvieracieho pôvodu (prihláška vynálezu WO94/26914). Medzi adenovírusmi zvieracieho pôvodu použiteľnými v rámci predkladaného vynálezu sa môžu uviesť adenovírusy psieho, hovädzieho, myšieho pôvodu ( napríklad Mavl, Beard et al., 1990, Virology 75: 81), ovčieho, prasacieho, vtáčieho alebo tiež opičieho pôvodu (napríklad SAV) . Adenovírus zvieracieho pôvodu je výhodne adenovírus psí, najmä adenovírus SAV2 (napríklad Souche manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-800)) . V rámci predkladaného vynálezu sa výhodne používa adenovírus ľudského alebo psieho pôvodu alebo ich zmes.

Defektné adenovírusy podľa predkladaného vynálezu prednostne obsahujú ITR, sekvenciu umožňujúcu enkapsidáciu a želanú nukleovú kyselinu. Najmä v genóme adenovírusu podľa vynálezu je aspoň oblasť E1 nefunkčná. Uvažovaný vírusový gén môže byť zbavený funkčnosti všetkými odborníkom známymi technikami, najmä úplnou supresiou, substitúciou, čiastočnou deléciou alebo adíciou jednej alebo viacerých báz v uvažovanom alebo uvažovaných génoch. Takéto modifikácie môžu byť získané in vitro (na izolovanej DNA) alebo in situ, napríklad prostredníctvom genetických techník alebo tiež pôsobením mutagénnych látok. Ďalšie oblasti môžu byť tiež modifikované, najmä oblasť E3 (WO95/02697) , E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697). Podlá uprednostneného spôsobu uskutočnenia adenovírus podľa vynálezu obsahuje deléciu v oblasti E1 a E4. Podľa iného uprednostneného spôsobu obsahuje deléciu v oblasti E1 na úrovni, do ktorej sú vložené oblasť E4 a sekvencia kódujúca GAX (pozri FR94 13355). Vo vírusoch podľa vynálezu sa delécia v oblasti E1 rozkladá predovšetkým medzi nukleotidmi 455 až 3329 sekvencie adenovírusu Ad5.

Defektné rekombinantné adenovírusy podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené všetkými odborníkmi pomocou známych techník (Levrero et al., 1991, Gene 101:195, EP 185 573, Graham, 1984, EMBO J. 3: 2917). Môžu byť pripravené najmä všeobecnou rekombináciou medzi adenovírusom a plazmidom nesúcim okrem iného želanú sekvenciu DNA. Všeobecná rekombinácia vzniká po kotransfekcii uvedeného adenovírusu a plazmidu v prispôsobenej línii buniek. Použitá bunková .línia musí (i) byť transformovateľná uvedenými elementmi a (ii) obsahovať sekvencie schopné doplniť časť genómu defektného adenovírusu, najmä v ucelenej forme kvôli zamedzeniu nebezpečenstva rekombinácie. Ako líniu možno napríklad spomenúť ľudská embryonálna obličková línia 293 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36: 59), ktorá obsahuje zahrnutú v svojom genóme ľavú časť genómu adenovírusu Ad5 (12%) alebo je možné spomenúť línie schopné doplniť funkcie E1 a E4 tak, ako je opísané v prihláške vynálezu WO 94/26914 s WO 95/02697).

Adenovírusy, ktoré sa rozmnožia sú potom získané a purifikované klasickými technikami molekulárnej biológie.

Čo sa týka vírusov AAV (adeno-associated vírus), ide o DNA vírusy relatívne malej velkosti začleňujúce do genómu buniek, ktoré infikujú stabilne a regiošpecificky. Sú schopné infikovať široké spektrum buniek bez toho, aby indukovali účinok na rast, morfológiu alebo bunkovú diferenciáciu. Na druhej strane sa nezdá, že sú zahrnuté do patológií u ľudí. Genóm AAV bol klonovaný a charakterizovaný. Obsahuje okolo 4700 báz a na každom konci obsahuje oblasť obrátenej repetície (IRT) so 145 bázami, ktoré sú pre vírus počiatkom replikácie. Zvyšok genómu je rozdelený na dve oblasti nesúce hlavne funkcie enkapsidácie: ľavú časť genómu, ktorá obsahuje gén rep zahrnutý do vírusovej replikácie a expresie vírusových génov a pravú časť genómu, ktorá obsahuje gén cap kódujúci kapsidové proteíny vírusu.

Použitie vektorov odvodených od AAV na prenos génov in vitro a in vivo bolo opísané v literatúre (pozri najmä WO 91/18088, WO 93/09239, US4,797,368, US5,139,941, EP 488 528).

Tieto prihlášky vynálezov opisujú rôzne konštrukcie odvodené od * AAV, v ktorých gény rep a/alebo cap sú deletované a nahradené génom záujmu a tiež opisujú ich použitie na prenos in vitro (v bunkovej kultúre) alebo in vivo (priamo v organizme) uvedeného génu záujmu. Defektné rekombinantné AAV podlá predkladaného vynálezu môžu byť pripravené v infikovanej bunkovej línii pomocným ľudským vírusom (napríklad adenovírusom) kotransfekciou plazmidu obsahujúceho nukleotidovú sekvenciu záujmu ohraničenú dvoma oblasťami obrátenej repetície (ITR) AAV a plazmidu nesúceho gény enkapsidácie (gény rep a cap) AAV. Použiteľná bunková línia je napríklad línia 293. Iné systémy reprodukcie sú opísané napríklad v prihláškach WO 95/14771, WO 95/13365, WO 95/13392 alebo WO 95/06743. Produkované rekombinantné AAV sú potom purifikované klasickými technikami.

Čo sa týka vírusov herpes a retrovíruscv, konštrukcia rekombinantných vektorov bola široko opísaná v literatúre, pozri najmä Breakfield et al., 1991, New Biologist 3: 203, EP 453 242, EP 178 220, Bernstein et al., 1985, Genet Eng. 7: 235, ¹ McCormick, 1985, BioTechnology 3: 689 atď.. Retrovírusy sú ucelené vírusy selektívne infikujúce bunky pri delení. Sú tvorené génom záujmu na rakovinovú aplikáciu. Genóm retrovírusu obsahuje najmä dve LTR, sekvenciu enkapsidácie a tri kódujúce oblasti (gag, pol a env). V rekombinantných vektoroch odvodených od retrovírusov sú gény gag, pol a env všeobecne deletované, čiastočne alebo úplne, a nahradené heterológnou sekvenciou nukleovej kyseliny záujmu. Tieto vektory môžu byť odvodené od rôznych typov retrovírusov ako sú MoMuLV (murine moloney leukémia vírus), tiež označovaný ako MoMLV, MSV (murine moloney sarcoma vírus), HaSV (harvey sarcom.a vírus), SNV (spleen necrosis vírus), RSV (rous sarcoma vírus) alebo tiež Friendovho vírusu.

Na konštrukciu rekombinantných retrovírusov podlá vynálezu obsahujúcich nukleotidovú sekvenciu alebo kombináciu nukleotidových sekvencií podlá vynálezu je najprv vytvorený plazmid obsahujúci najmä LTR, sekvenciu enkapsidácie a uvedenú kódovanú sekvenciu a potom je použitý na transfekciu enkapsidačnej bunkovej línie, schopnej preniesť chybné retrovírusove funkcie do plazmidov. Enkapsidačné línie sú teda schopné exprimovať gény gag, pol a env. Takéto enkapsidačné línie boli opísané vo vedlajších odboroch, najmä línia PA317 (US 4,861,719), línia PsiCRIP (WO 90/02806) a línia GP+envAm-12 (WO 89/07150). Rekombinantné retrovírusy môžu obsahovať modifikácie na úrovni LTR na potlačenie transkripčnej aktivity ako aj rozsiahle sekvencie enkapsidácie, obsahujúce časť génu gag (Bender et al., 1987, J. Virol. 61: 1639). Vyprodukované rekombinantné retrovírusy sú potom purifikované klasickými technikami.

Na uskutočnenie predkladaného vynálezu je predovšetkým výhodné použiť rekombinantný defektný adenovírus alebo retrovírus. Tieto vektory majú zaujímavé vlastnosti najmä na na prenos samovražedných génov do nádorových buniek.

1.3 Chemické vektory

Nukleové kyseliny alebo plazmidové expresné vektory opísané v príklade 1.1 a príklade 2 môžu byť podávané také ako sú in vivo alebo ex vivo. Ukázalo sa, že samotné nukleové kyseliny môžu transfekovať bunky. Na zvýšenie účinnosti prenosu sa v rámci predkladaného vynálezu prednostne používa prenosový vektor. Môže ísť najmä o vírusový vektor (príklad 1.2) alebo syntetický transfekčný činiteľ.

Medzi vyvinutými syntetickými vektormi sa prednostne používajú v rámci predkladaného vynálezu katiónové polyméry polylyzínového typu, (LKLK)n, (LKKL)n, (PCT/FR/00098), polyetylénimín (WO 96/02655) a DEAE dextrán alebo tiež katiónové lipidy alebo lipofektanty. Tieto vektory majú schopnosť kondenzácie DNA a podporujú jej viazanie na bunkovú membránu. Medzi týmito posledne menovanými vektormi možno uviesť lipopolyamíny (lipofektamín, trasfektám, atď.), rôzne katiónové lipidy alebo neutrálne lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE, atď.), ako aj peptidy jadrového pôvodu. Okrem toho, pojem cieľovej transfekcie bol vyvinutý prostredníctvom receptora, ktorý využíva princíp kondenzácie DNA vďaka katiónovému polyméru s riadením fixácie komplexu na membránu vďaka chemickej väzbe medzi katiónovým polymérom a ligandom membránového receptora prítomného na povrchu bunky. Opísali sa cieľové receptory transferínu, inzulínu a receptor asialoglykoproteínov hepatocytov. Príprava farmaceutickej kompozície podľa predloženého vynálezu používajúca chemický vektor je uskutočnená známymi technikami, všeobecne jednoduchým skontaktovaním rôznych látok.

Príklad 2

Klonovanie HSV1-TK a/alebo guanylátkinázy a/alebo nukleoziddifosfátkinázy v eukaryotickom expresnom vektore

Tento príklad opisuje spôsob uskutočnenia vynálezu využívajúci systém plazmidového expresného vektora na prípravu kombinácií enzýmov podľa vynálezu in situ.

Expresia prokaryotických alebo eukaryotických génov v cicavčích bunkách je odborníkom dobre známa. Na optimalizáciu tejto expresie, ďalej opísané vektory podľa vynálezu obsahujú nasledujúce signály: i) promótor/leucínový zips, ako promótor CMV, ktorá je dobre exprimovaný v ľudských bunkách, ii) Kozákovu sekvenciu, ktorej vyjadrením je (G/ANNAUG(G/A) ), iii) exprimovaný gén, iv) polyadenylačnú sekvenciu (Chisholm, 1995, DNA Cloning vol. 4, ed. D. Glover et B. Hames pl) . Takéto konštrukcie sú možné pomocou komerčných vektorov ako sú pZeoSV, pcDNA3 a podobných a boli uskutočnené s génmi, ktoré kódujú HSV1-TK, GMPK a NDK kvasinky Saccharomyces cerevisiae.

2.1 Expresný vektor HSV1-TK

Gén HSV1-TK kódujúci tymidínkinázu vírusu herpes simplex typu 1 pochádzajúci z plazmidu pHSV-106 (Gibco-BRL) bol klonovaný v eukaryotickom expresnom vektore pcDNA3 (Invitrogen). Tento plazmid pcDNA3-TK 6936 bp bol konštruovaný vložením inzertu EcoRI-DNA3 (pozri obrázok 1).. Plazmid pBTKl bol získaný nasledujúcim spôsobom: Po odstránení prečnievajúcich koncov bol inzert BglII-Ncol 1,5 kb pochádzajúci z HSV-106 a obsahujúci gén HSV1-TK, ktorého sekvencia bola publikovaná (McKnight, 1980, Nucl. Acid. Res. 7: 5931) klonovaný do Smal miesta pBSK.

Inzert plazmidu pcDNA3-TK obsahuje i) 60 bp proti smeru génu HSV1-TK sekvenciu Kozák (CGTATGG), ii) sekvenciu génu (1,13 kb) , ktorá je identická s publikovanou sekvenciou (McKnight, 1980, Nucl, Acid. Res. 8: 5931), iii) sekvenciu 3' génu (0,3 kb) , ktorá je tiež opísaná v publikácii (McKnight, 1980, Nucl. Acid. Res. 8: 5931).

2.2 Expresný vektor guanylátkinázy

Gén GUK1 561 bp kódujúci guanylátkinázu kvasinky Saccharomyces cerevisiae vzniknutý z pGUK-1 (pozri príklad 3), bol klonovaný v eukaryotickom expresnom vektore pcDNA (Invitrogen) po tom, čo bol vložený konsenzus. Tento plazmid pXL2854 bol získaný nasledujúcim spôsobom. Inzert Xbal-BamHI pGUK-1 obsahujúci gén GUK1 bol klonovaný do plazmidu pSL301 (Invitrogen) medzi miesta Xbal-BamHI takým spôsobom, že gén GUK1 môže byť vyštiepený enzýmami HindlII a BamHI a môže byť klonovaný medzi miesta HindlII a BamHI pcDNA3, aby vznikol plazmid pcDNA-GUKl. Medzi miesta HindlII a PflMI tohto plazmidu bol klonovaný fragment HindlII-PflMI 150 bp obsahujúci konsenzus Kozák a oblasť 5' GUK1, aby vznikol plazmid pXL2854 6001 bp (pozri obrázok 2) . Fragment HindlII-PflMI 150 bp bol izolovaný z fragmentu 280 bp, amplifikovaný PCR pomocou plazmidu pGUK-1 a mediátorových oligonukleotidov 6915 5' (GAG AAG CTT GCC ATG GCC CGT CCT ATC GTA A) 3' (SEQ ID NO: 1) a antimediátorových 6916 5' (GAG GAT CCG TTT GAC GGA AGC AGT A) 3' (SEQ ID NO: 2) hybridizáciou pri 45°C (konsenzus Kozák je zdôraznený v sekvencii oligonukleotidu 6915). Nukleotidová sekvéncia amplifikovaná PCR bola sekvenovaná a má dve odlišnosti vzhľadom k publikovanej sekvencii (Konrad, 1992, J. Biol. Chem. 267: 25652) zodpovedajúce zmenám S2A (serín v polohe 2 je nahradený alanínom) a V34A (valín v polohe 34 je nahradený alanínom).

2.3 Expresný vektor nukleoziddifosfátkinázy

Gén YNK kódujúci nukleoziddifosfátkinázu S. cerevisiae pochádzajúci z plazmidu pADl-YNK (Watantabe et al., 1993, Gene 29: 141) bol klonovaný v eukaryotickom expresnom vektore pcDNA3 (Invitrogen) po tom, čo bol vložený konsenzus Kozák. Tento plazmid pXL2967 bol získaný nasledujúcim spôsobom. Amplifikácia PCR bola uskutočnená s plazmidom pADl-YNK ako matricou a mediátorovými oligonukleotidmi 7 017 5' (AAG GAT CCA CCA TGG CTA

GTC AAA CAG AAA) 3' (SEQ ID NO: 4) pri hybridizačnej teplote 40°C (konsenzus Kozák je zdôraznený v sekvencií oligonukleotidu 7017) . Amplifikovaný fragment 477 bp je riadený BamHI a EcoRI potom klonovaný medzi miesta BamHI a EcoRI pcDNA3, aby sa vytvoril plazmid Pxl2967 5861 bp, pozri obrázok 3. Sekvencia fragmentu amplifikovaná PCR je rovnaká ako publikovaná sekvencia génu YNK okrem zmeny v polohe 4, ktorá zodpovedá zmene S2A (serín v polohe 2 je nahradený alanínom) v proteíne NDPK (Watanabe et al., 1993, Gene 29: 141).

2.4 Vektor na spoločnú expresiu dvoch génov spoločná expresia dvoch génov môže byť uskutočnená viacerými spôsobmi, ktoré sú odborníkom dobre známe. Uprednostňovaný spôsob uskutočnenia spočíva vo vložení sekvencie IRES medzi sekvencie na exprimovanie (Mountford et al., 1995, TIG 11:179).

Sekvencia IRES a gén YNK sú vložené v 3' génu GUK1 klonovanom v pcDNA3, aby vznikol vektor, ktorý umožňuje spoločnú expresiu GUK1 a YNK vo forme bicistrónovej jednotky (vektor pGUKl-YNK) . Sekvencia IRS (internal ribosom entry site) EMCV (encephalomyocartis vírus) pochádzajúci z plazmidu pCITE (Novagen) bol reklonovaný PCR. medzi miesta EcoRI a Ncol a vložený do miest EcoRI a EcoRV plazmidu pBluescript (Stratagene), aby sa vytvoril plazmid pXL3065. Fragment NcolEcoRV 477 bp obsahujúci gén YNK pochádzajúci z plazmidu pXL2967 je klonovaný medzi miesta Ncol a EcoRV pXL3065, aby sa vytvoril plazmid pXL3079. Fragment BamHI-EcoRV 1 kb obsahujúci IRES a gén YNK plazmidu pXL3079 je klonovaný medzi miesta BamHI a EcoRV plazmidu pXL2854, aby sa vytvoril plazmid pXL3081. Tento plazmid obsahuje promótory CMV a T7 proti smeru génu GUK1 kódujúceho guanylátcyklázu S. cerevisiae , nasleduje IRES a gén YNK kódujúci nukleoziddifosfátkinázu S. cerevisiae, pozri obrázok 4. Expresia proteínov GMPK a NDPK bola testovaná pomocou plazmidov pXL2854, pXL2967 a pXL3081 v systéme transkripcie/transdukcie retikulocytov pochádzajúcich od firmy Promega, pozri obrázok 5. Získané výsledky ukazujú, že proteiny GMPK a NDPK sú spoločne exprimované plazmidom pXL3081.

Rovnaký prístup bol použitý na vytvorenie vektora, ktorý spoločne exprimuje TK a YNK (vektor pTK-YNK) alebo TK a GUK1 (vektor pTK-GUKl).

2.5 Vektor na spoločnú expresiu troch génov

Sekvencia kódujúca TK je vložená do vektora pGUKKl-YNK z príkladu 2.4, aby sa vytvoril vektor schopný exprimovať tri enzýmové aktivity (vektor pTK-GUKl-YNK).

2.6 Vektor na expresiu fúzie HSV1-TK/S. cerevisiae GMPK

Konštrukcia fúzneho proteinu je odborníkom dobre známa a uskutočňuje sa vytvorením peptidovej spojky medzi C-koncom proteinu a N-koncom iného proteinu (1989, Náture 339: 394).

takýto proteín umožňuje spoločne lokalizovať bunkové enzýmy a môže tiež uprednostniť „tunelovanie substrátu (Ljungcrantz et al., 1989, Biochemistry 28: 8786).

Fúzny proteín bol vytvorený spojením pomocou spojky (Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-(Gly)4 (SEQ ID NO: 9) C-konca sekvencie HSV1-TK (Asn376) a N-konca sekvencie GMPJ S. cerevisiae (Ser2). Plazmid pXL3098 umožňujúci produkciu tohto fúzneho proteinu bol konštruovaný nasledovným spôsobom. Sekvencia 3' génu HSV1-TK (polohy 1108 až 1128) bola klonovaná ' hybridizáciou mediátorových oligonukleotidov 5' (CCG GGA GAT GGG GGA GGC TAA CGG AGG TGG CGG TTC TGG TGG CGG AGG CTC CG) 3' (SEQ ID NO: 5) a antimediátorových 5' (GAT CCG GAG CCT CCG CCA CCA GAA CCG CCA CCT CCG TTA GCC TCC CCC ATC TC) 3' (SEQ ID NO: 6) takým spôsobom, že kodón Asn génu HSV1-TK (poloha 1128 bp)je nasledovaný kodónmi, ktoré kódujú aminokyseliny ((Gly)4Ser)2Gly. Fragment 58 bp je tiež klonovaný medzi miestami Xmal a BamHI pNEB193 (Biolabs), aby sa vytvoril plazmid pTKL+. Sekvencia 5' génu GUK1 S. cerevisiae je amplifikovaná PCR pomocou matrice pXL2854 a oligonukleotidov mediátorových 5' (GAG ATT TCCGGA GGC GGT GGC TCC CGT CCT ATC GTA) 3' (SEQ ID NO: 7) a antimediátorových 5' (GAG GAT CCG TTT GAC GGA AGC GAC AGT A) 3' (SEQ ID NO: 8) takým spôsobom, že kodón Ser v polohe 2 GMPK predchádza kodónom (Gly)3Ser. Tento fragment 0,27 kb je klonovaný medzi miesta BamHI. a EcoRI pUC19 *

(Biolabs), aby vznikol plazmid, ktorý je rozštiepený PflMI a BamHI, aby tam bol vložený fragment PflMI-BamHI 0,44 kb plazmidu pXL2854 obsahujúci sekvenciu 3'GUKK1 a bol vytvorený plazmid pGUKL-. Fragment BspEI-Xbal 0,58 kb pGUKL- je vložený medzi miesta BspEI a Xbal pTKL+, aby sa vytvoril pTKLGUK. Inzert Xmal-BamHI 0,63 kb pTKLGUK je klonovaný medzi miesta Xmal a BamHI expresného vektora pETlla, aby sa vytvoril plazmid pXL3098, pozri obrázok 6. Tento plazmid je teda vložený do kmeňa BL21DE3met- a vedie k vytvoreniu proteínu TK((Gly)4Ser)3-GMPK.

Fúzny proteín je purifikovaný až do úplnej homogenity a kinetické parametre fosforylácie GCV a ACV tohto enzýmu sú porovnateľné s kinetickými parametrami získanými s proteínmi HSV1-TK a GMPK S. cerevisiae.

2.7 Prenos a expresia ex vivo

Vektory opísané v príkladoch 2.1 až 2.6 sú použité na prenos a expresiu in vivo kombinácií enzýmov podľa vynálezu. S týmto cieľom boli pripravené rôzne kompozície obsahujúce uvedené vektory:

- kompozícia obsahujúca vektor pcDNA3-TK, vektor pXL2854 a lipofektamín

- kompozícia obsahujúca vektor pcDNA3-TK , vektor pXL2854, vektor pXL2967 a lipofektamín

- kompozícia obsahujúca vektor pvDNA3-TK, vektor pXL2854, vektor pXL2967 a lipofektamín

- kompozícia obsahujúca vektor pPK-GUKl a lipofektamín, prípadne v kombinácii s vektorom pXL2967 kompozícia obsahujúca vektor pPK-YNK a lipofektamín, * pripadne v kombinácii s vektorom pXL2854 a

- kompozícia obsahujúca vektor pPK-GUKl-YNK a «

lipofektamín.

Lipofektamín môže byť nahradený iným chemickým vektorom, aký je opísaný v príklade 1.3.

Tieto rôzne kompozície sú použité in vivo alebo ex vivo na prenos a intracelulárnu expresiu kombinácie enzýmov podľa vynálezu. Môžu byť tiež použité na bunkových kultúrach, napríklad na bunkových kultúrach fibroblastov NIH3T3 alebo bunkách ľudského karcinómu tračníka HCT116. Nukleozidový analóg je podávaný po prenose vektorov a je dokázaná bunková deštrukcia.

Príklad 3

Purifikácia guanylátkinázy

Nebunkové extrakty kmeňa E. coli silne exprimujúceho GMPK S. cerevisiae môžu byť pripravené rôznymi spôsobmi, medzi ktorými možno uviesť lýzu lyzozómov v prítomnosti EDTA, použitie drviaceho prístroja typu Mentom-Golin, French Press, X-Press alebo pôsobením ultrazvuku. Nebunkové extrakty sú, najmä extrakty kmeňa E. coli, ktorý silne exprimuje GMPK S. cerevisiae boli pripravené nasledujúcim spôsobom.

Kmeň E. coli BL21 (DE3)p GUK-1 je kultivovaný tak, ako bolo opísané (Konrad, 1992, J. Biol. Chem. 267:25652). Po odstredení (5000xg, 20 min) boli buky získané z 1 litra kultúry resuspendované v 20 ml pufra Tris/HCl 20 mM, pH 7,5, obsahujúcom 1 mM EDTA a sonifikované 4 minúty pri teplote 4°C. Po odstredení (50 000 x g, 1 hodinu) bol supernatant injikovaný na kolónu ΜΟΝΟ Q HR 10/10 (Pharmacia) ekvilibrovanú pufrom Tris/HCl 20 mM, pH 7,5. Proteíny sú eluované lineárnym gradientom od 0 do 500 mM NaCl v pufri Tris/HCl 20 mM, pH 7,5. frakcie obsahujúce GMPK aktivitu sú zozbierané a koncentrované, potom chromatografované na kolóne Superdex 75 HR16/10 (Pharmacia), eluované pufrom 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM

NaCl. Frakcie vykazujúce aktivitu GuK sú zozbierané. Po tejto etape preparát . predstavuj e samostatný viditeľný pruh na SDSPAGE po detekcii Coomassie Blue a tento pruh sa pohybuje s molekulovou hmotnosťou zodpovedajúcou 21 000.

Aktivita GMPK je klasicky stanovená použitím postupu opísaného v literatúre (Agarwal et al., 1978, Meth. Enzymol. vol. LI: 483).

Príklad 4

Stanovenie kinetických konštánt guanylátkinázy S. cerevisiae

Kinetické konštanty kvasničnej GMP-kinázy purifikovanej tak, ako bolo opísané v príklade 3, sú určené pri nasledujúcich podmienkach enzymatickej skúšky.

Kvasničná GMP-kináza je inkubovaná 10 min pri teplote 30°C v 100 μΐ 50 mM pufra Tris/HCl, pH 7,8 obsahujúceho 4 mM ATP, 10 mM MgClz/ 100 mM KCl, 1 mg/ml BSA (albumín hovädzieho séra) a 5100 μΜ (8-3H) ACVMP (40 nCi/nmol). Reakcia bola ukončená zahriatím reakčnej zmesi na 80°C počas 3 minút, pridá sa 50 μΐ mM fosforečnanu draselného pH 3,5 a po odstredení počas 2 minút pri 10 000 x g je 100 μΐ supernatantu analyzovaných vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) v nasledujúcom systéme:

Stacionárna fáza: Partisfér SAX (WHATMAN) - veľkosť častíc 5 μιη, rozmery 4,6 x 125 mm

Mobilná fáza:

Pufor A:	0, 01 M	KH2PO4,	pH 3, 5	(adjustované
koncentrovanej	h3po4)
Pufor B:	0, 75 M	kh2po4 ,	pH 3,5	(adjustované
koncentrovanej	H3PO4)
Prietok:	1 ml/min
Gradient:
minúta		%A		%B
0		100		0
5		100		0
30		0		100
40		0		100
42		100		0
45		100		0
Detekcia:

pomocou pomocou

UV: 265 nm

Rádiochemická: tríciová detekcia začiatok scintilácie (Optisafe 1 de Berthold) 1 ml/min

Na výpočet kinetických konštánt je množstvo kvasinkovej GMP-kinázy v enzýmovej reakcii nastavené tak, aby sa premenilo maximálne 10% substrátu vloženého na začiatku reakcie. Michaelisove krivky sú upravené extrémnymi bodmi pomocou logicel Grafit (Sigma). Výsledky sú uvedené v tabuľke 1. Ukazujú, že kvasinková GMP-kináza je schopná fosforylovať GCVMP a ACVMP. rýchlosť fosforylácie GCVMP je dvakrát vyššia ako u ľudského enzýmu. Jeho afinita ku GCVMP je dva krát vyššia alebo aspoň rovná afinite, ktorú vykazuje ľudský enzým k tomuto substrátu. Hodnota Vmax/Km kvasinkového enzýmu pre GCVMP je 4,4 krát vyššia ako táto hodnota ľudského enzýmu. Konštanta Vmax/Km určuje špecifitu enzýmu voči substrátom pre substráty vstupujúce do kompetície. Je známa pod názvom „specificity constant (A. Fernsth, Enzýme Structure and Mechanism, 1985, W. H. Freeman and Co., London).

Rovnakým spôsobom vykazuje kvasinková GMP-kináza vyššiu schopnosť fosforylovať ACVMP ako ľudský enzým. Hodnota Vmax/Km kvasinkového enzýmu pre ACVMP je 7 až 9 krát vyššia ako táto hodnota ľudského enzýmu pre tento substrát.

Príklad 5

Spojenie enzýmovej aktivity TK, GMPK a NDK

Podľa uprednostňovaného spôsobu spojenia sa inkubácia uskutočňuje v 100 μΐ 50 mM pufra Tris/HCl, pH 7,8, ktorý obsahuje 1 mg/ml BSA (albumín hovädzieho séra), 5 μη ATP, 4 mM MgCl₂, 12 mM KCl, 2 mM DT, 600 μΜ EDTA, 100 μΜ (8-3H)-GCV (40nCi/nmol) alebo 100 μΐ (2-3H)-ACV 40nCi/nmol a rôzne množstvo TK, GuK a NDPK (pozri tabuľka 2) . Použila sa NDPK z troch organizmov (komerčné enzýmy - Sigma), ako je uvedené v tabuľke 2.

Spojenie enzýmov HsVl-TK a GMPK S. cerevisiae umožňuje fosforylovať až 90% gancyklovírusdifosfátu. Nukleozid39 difosfátkináza zo S. cerevisiae, viazaná v enzýmoch HSV1-TK a GMPK umožňuje fosforylovať gancyklovírus na gancyklovírustrifosfát s lepšou aktivitou ako nukleoziddifosfátkináza ľudských erytrocytov. Porovnateľné výsledky sú tiež získané s acyklovírusom. Tieto výsledky jasne ukazujú, (a) že kombinácia enzýmov podľa vynálezu prináša významné zvýšenie fosforylácie, ktoré indikuje, že samotná modifikácia TK nemôže stačiť na zlepšenie vlastností systému, (b) že systém podľa vynálezu umožňuje zvýšiť účinnosť liečenia samovražedným génom TK, (c) že určité nehumánne enzýmy majú lepšiu aktivitu pre ’ nukleozidové analógy, čím sa ich použitie stáva mimoriadne výhodným.

Príklad 6

Purifikácia fúzneho proteínu HSV1-TK/S. cerevisiae GMPK

Nebunkové extrakty kmeňa E. coli silne exprimujúce fúzny proteín môžu byť pripravené rôznymi spôsobmi, medzi ktorými sa môže uviesť lýza lyzozómov za prítomnosti EDTA, použitie drviaceho prístroja typu Menton-Golin, French Press, X-press alebo pôsobením ultrazvuku. Nebunkové extrakty E. coli silne exprimujúce GMPK S. cerevisiae boli pripravené nasledujúcim spôsobom.

Kmeň E. coli BL21 DE3 pXL3098 je kultivovaný v prostredí LB. Po odstredení (500 x g, 20 min) boli bunky získané z 1 litra kultúry resuspendované v 20 ml pufra A: 50 mM Tris/HCl, pH 7,8m ktorý obsahuje 5 mM DDT, 4 mM MgCl₂, 10% glycerolu (obj./obj.), 2 mM benzamidín, 50 μΐ/l E64 (roztok 100 μρ/l N(N-(L-3-trans-karboxyoxirán-2-karbonyl)-L-leucyl) -4-aminobutylguanidín, 0,2 mM Péfabloc, STI (Soyebean trypsin inhibitor), 2 mg/ml Leupeptín). Bunky boli sonifikované 4 minúty pri teplote 4°C. Po odstredení (50 000 x g, 1 hodina) bol supernatant nanesený na kolónu ΜΟΝΟ Q HR 10/10 (Pharmacia) ekvilibrovanú pufrom A. Proteíny boli eluované lineárnym gradientom od 0 do 400 mM NaCl v pufri 20 mM Tris/HCl, pH 7,5. Frakcie obsahujúce aktivitu TK a GMPK boli zozbierané a koncentrované, potom chromatografované na kolóne Superdex 200 HILoad 26/60 (Pharmacia) a eluované pufrom A, ktorý obsahuje 150 mM NaCl. Frakcie obsahujúce aktivitu TK a GMPK sú zoskupené. Po tejto etape preparát predstavuje samostatný viditeľný pruh na SDSPAGE po detekcii Coomassie Blue a tento pruh sa pohybuje s molekulovou hmotnosťou zodpovedajúcou 61 000.

Príklad 7

Štúdia fosforylácie fúziou HSV1-TK/GMPK

Tento príklad opisuje štúdiu kinetických parametrov fosforylácie GCV a ACV fúziou porovnateľnou s kinetickými parametrami získanými s proteínmi HSV1-TK a GMPK S. cerevisiae.

7.1 Veľkosť aktivity TK

Aktivita TK je stanovená nasledovne: enzýmový extrakt, ktorý obsahuje okolo 0,1 jednotky TK je inkubovaný 15 minút pri teplote 37°c v 100 μΐ 50 mM pufra Tris/HCl pH 7,8, ktorý obsahuje 1 mg/ml BSA (albumín hovädzieho séra), 5 mM ATP, 4 mM MgCl₂, 12 mM KC1, 2 mM EDTA a 100 μΜ GCV + (8-3H)-GCV 40nCi/nmol. Reakcia bola zastavená pridaním 10 μΐ 50 mM pufra Tris/HCl pH 7,8, ktorý obsahuje 1 mM nerádioaktívneho tymidínu. Fosforylované vzorky sú zachytené na kolóne DEÄE sepharex (400 μΐ gélu)a po premytí kolóny sú eluované 2 ml 1 M HCI. Rádioaktivita vo vzorkách je určená kvapalinovou scintiláciou.

7.2 Stanovenie aktivity GMPK

Aktivita GMPK je klasicky stanovená použitím protokolu opísaného v literatúre (K. C. Agarwal et al., Methods In enzymology, 1978, Vol. LI: 483-490).

7.3 Stanovenie aktivity fúzneho proteínu a spoločná • enzýmov TK a GMPK inkubácia

Schopnosť fúzneho proteínu TK-GMPK transformovať GCV alebo ACV na GCVDP alebo ACVDP vzhľadom k syntetickej zmesi TK a GMPK je určená nasledujúcim spôsobom.

Inkubácia prebieha v prostredí 200 μΐ 50 mM pufra Tris/HCl pH 7,8, ktorý obsahuje 1 mg/ml BSA (albumín hovädzieho séra), 5 mM ATP, 4 mM MgCl₂, 12 mM KC1, 2 mM DTT, 600 írM EDTA, 1 až 100 μΜ GCV + (8-3H)-GCV 40 nCi/nmol alebo 1 až 100 μΜ ACV + (2-3H)ACV 40 nCi/nmol a rôzne množstvá TK, GMPK a ekvivalentné množstvá fúzneho proteínu. Reakcia bola zastavená zahriatím na teplotu 80°C počas 3 minút, po odstredení je 100 μΐ supernatantu analyzovaných v nasledujúcom systéme.

Stacionárna fáza: Partisfér SAX (WHATMAN), velkosť častíc μιη

Rozmery: 4,6 x 125 mm

Mobilná fáza:

Pufor A: 0,01 M KH₂PO₄, pH 3,5 (adjustované pomocou koncentrovanej H₃PO₄)

Pufor B: 0,75 M KH₂PO₄, pH 3,5 (adjustované pomocou koncentrovanej H₃PO₄)

Prietok: 1 ml/min

Gradient:

minúta %A

O 100

100

O

O

100

100 %B

O

O

100

100

O

O

Detekcia:

UV: 265 nm

Rádiochemická: tríciová detekcia začiatok scintilácie (Optisafe 1 de Berthold) 1 ml/min

Spojenie a kombinácia enzýmov HSV1-K a GMPK S. cerevisiae umožňuje fosforyláciu gancyklovírusu na gancyklovírusdifosfát (pozri tabuľku 3) . Porovnateľné výsledky sú získané s acyklovírusom (pozri tabuľku 3).

Tieto výsledky jasne ukazujú, že fúzny proteín TK-GMPK zachováva vlastnosti týchto dvoch pôvodných enzýmov. Okrem toho, podľa reakčných podmienok fúzny proteín TK-GMPK prináša významné zvýšenie fosforylácie a) zvýšenie faktora pre GCV na 1,8, b) zvýšenie fakíra pre ACV až na 1,2 c porovnaní so spoločnou inkubáciou divého typu TK a GMPK.

Fúzny proteín umožňuje in vivo spoločnú lokalizáciu enzýmových aktivít v bunke, oddelené enzýmy rozširujúce sa v jadre pre HSV1-TK a v cytosole pre GMPK. Táto konštrukcia teda umožňuje zvýšiť účinok liečenia samovražedným génom.

Tieto výsledky ako celok jasne ukazujú terapeutický význam predkladaného vynálezu, ktorý umožňuje zároveň znížiť dávku nukleozidu a získať významnú terapeutickú výhodu.

Zoznam sekvencií (1) Informácie o sekvencii SEQ ID NO: 1:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 31 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) konfigurácia: lineárna (i) typ molekuly: cDNA (ii) opis sekvencie SEQ ID NO: 1:

GAGAAGCTTG CCATGGCCCG TCCTATCGTA A 31 (1) Informácie o sekvencii SEQ ID NO: 2:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 28 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (i) typ molekuly: cDNA (ii) opis sekvencie SEQ ID NO: 2:

GAGGATCCGT TTGACGGAAG CGACAGTA 28 (1) Informácie o sekvencii SEQ ID NO: 3:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 30 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (i) typ molekuly: cDNA (ii) opis sekvencie SEQ ID NO: 3:

AAGGATCCAAC CATGGCTAGT CAAAAACAGAAA 30 (1) Informácie o sekvencií SEQ ID NO: 4:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 29 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (i) typ molekuly: cDNA (ii) opis sekvencie SEQ ID NO: 4:

AAGAATTCAG ATCTTCATTC ATAAATCCA 29 (1) Informácie o sekvencií SEQ ID NO: 5:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 53 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (i) typ molekuly: cDNA (ii) opis sekvencie SEQ ID NO: 5:

CCGGGAGATG GGGGAGGCTA ACGGAGGTGG CGGTTCTGGT GGCGGAGGCT

CCG (1) Informácie o sekvencii SEQ ID NO: 6:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 53 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: dva (D) konfigurácia: lineárna (i) typ molekuly: cDNA (ii) opis sekvencie SEQ ID NO: 6:

GATCCGGAGC CTCCGCCACC AGAACCGCCA CCTCCGTTAG CCTOCCCCAT

CTC (1) Informácie o sekvencii SEQ ID NO: 7:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 36 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (i) typ molekuly: cDNA (ii) opis sekvencie SEQ ID NO: 7:

GAGAATTCCG GAGGCGGTGG CTCCCGTCCT ATCGTA (1) Informácie o sekvencii SEQ ID NO: 8:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 28 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (i) typ molekuly: cDNA (ii) opis sekvencie SEQ ID NO: 8:

GAGGATCCGT TTGACGGAAG CGACAGTA (1) Informácie o sekvencii SEQ ID NO: 9:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 14 aminokyselín (B) typ: aminokyseliny (C) konfigurácia: lineárna (i) typ molekuly: peptid (ii) opis sekvencie SEQ ID NO: 9:

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly >

Ο

4J

Ο ο

tí

4-) >

tí φ

X!

U '>1 ω

Ό tí

N

N '(0 C •H 44 -P '(0 i—I >, tí tí tí tí) (0

N
'tí
c
•K
44
-P
'(0
rtí
>,
C
tí
tí
d
•n
Φ
>
0
44
C
•H
ω
tí
>
44
4-1
C	E
<0
4-J
>w	U
c 0
44	(C
'Φ	E
44
o	ζ
-H	O
44	Ľ)
Φ
G	ω
•H	tí
E	cu

tí

H b

(D

H

ľudská guanylátkináza (erytrocyty)	Vmax/Km	Βς Ό	(D U OS t—1 O i-1 O o o o
d S tí X -tí tí g £ í> 1—1 0 g 3.	(3 O CM	ro u σ co <tí CO
Km (μΜ)	D (0 O Lf) ** 1 CvJ	P co ιΛ m tí y 00 | o P d CO cm o m CM
(0 N '(0 tí •H 44 44 — 'tí Φ i—1 tí > 'tí tí W tí ’tí tí P d Φ tí 'tí Φ > o 0 44 tí co -tí * W tí > 44	Vmax/Km	CM *. CM	0, 08
d H \ C X -tí tí g £ k* Ή O g 3.	O	CM CM
% I	00 í—1	280
substrát		GCVMP	ACVNP

Tabulka 2: Viazanie TK-GMPK-NDPK: % vytvoreného produktu

čas

inkubácie

(min)

30

30

09

30

20

09

20

•—s ΓΟ

£\J

CO

Kl

CM

CO

ϋ

rH

σ

1—4

ď!

o

σ

c

c-t

4J

2

91

CM CO

o r-

r-i

•*7 CM

O i r-

92

00

*

•j

ď

u

*0 o

Oj

00

o

r*

σ

kO

CO

CO

rH

CO

O

kO

M Λ

Q 2

90.

σ 00

92 .

kO

CM t”Í

13 .

90 .

f—’

CO r-

uO

T tiO

<£>

CM

dP

q

Φ

Cl, X 2

5.3

M 0 >

lO r-

0.9

MO CM

3.2

6.2

ĽO CM

L.O

0.6

26

0,

’C*

i)

σ

iD

σι

t—4

σ

σ

CM

σ

o

o

Z

•

•

x

co

CO

CM

r—1

CM

co

CM

CM

CM

r-i

CM

ť

CO

to

•H

—

N

>c

h

ω

uO

:(0

>o

•

u0

uO

>

Q)

'-s

0

h

jC

>1

4-1

(0

bá Oj

ánn

roc

—

kO

iD

2

Q !Z

e s

+j

O

kO

kO

λ

M

Φ

Q)

44

Φ

rs

di

uO

uO r*

75

. r\

tG

'<0

>N

•

•

r-i

aj

O

o

o

(D

M

Q<

V

bS Oj

c

TP

lO

if)

uo

’T

3

Γ-

CM

CM

r-

r-

CM

H-

r*

bi H

σ

’T O 1—4

2.6

1.3

10.4

10.4

1.3

O r-4

=

=

=

11, 7

z

z

=

=

D

X

M 4J

>

>

03

O

υ

u

Λ

o

u

<

3

rH

-

0)

Tabuľka 3: Fosforylácia GCV a ACV spojením alebo kombináciou enzýmov TK a GMPK

zmes	2-865:H12/GMPK	Cn 3.		5300“
1.66/0.33	(resp.)
	&	cn
	Oj
	S
	o	03		t 4
		03	•
ω	a	•	Q.	O
0)		o	ω	co
e	4-1		Φ	kO
N		CO	M	'ňT
		kO	'—
	>
	•H	i—t
	Ό
Cn
=1
CM
					J,
(d				o	o
Ή					o
N				CN	<33
'3				CO
Ψ4
	^2
	Oj
	S	Cn
	CD	3.
w	C\]	kO	•
Φ	rH	CO	a			O
é	ffi	\	to			kO
N		03	φ			CN
	143	03	M			r-
		t—l	—'			r—1
	CO
	OJ
Cn
3·
o
o						o
CN						o
						143
(Ú						00
•H						t“H
N
'3
M-t
				cn	Cn	Cn
4-4				ZL	3.	3.
oj
C4				o	O	O
4-1				<3	143	O
CO				r*d		T-í
43
3				>	>	>
(0				u	O	CD
				c?	CD

zmes divý typ/GM 33/17 pg (resp.)	143 'T O rH	o cn cn CN
zmes 2-865:H12/GMPK 33/17 pg (resp.)	4 '43 CN Γ3 CN	3680“	5890“
fúzia 50 pg	O CN CN rH	2920“	4 O <3* r* kO
	ACV 2 0 μ g	Cn 3. O 143 > CD	ACV 50 Hg inkubácia 1 h

^Jpmol vytvoreného GCVDP

Claims (43)

1. Kompozícia na dodanie a produkciu in vivo kombinácie enzýmov obsahujúca:

prvú nukleovú kyselinu kódujúcu enzým schopný fosforylovať nukleozidový analóg, aby sa vytvoril monofosfátový analóg druhú nukleovú kyselinu fosforylovať uvedený monofosfátový difosfátový analóg kódujúcu enzým analóg, aby sa schopný vytvoril tretiu nukleovú kyselinu fosforylovať uvedený difosfátový trifosfátový analóg.

kódujúcu enzým analóg, aby sa schopný vytvoril

2. Kompozícia podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že prvá nukleová kyselina kóduje tymidínkinázu.

Kompozícia ý m, že druhá podlá nároku 1, vy nukleová kyselina kóduje značujúc guanylátkinázu.

4. Kompozícia podlá nároku tým, že tretia nukleová fosfátkinázu.

1, v y z kyselina na čujúca sa kóduje nukleoziddi

5. Kompozícia podlá nároku tým, že nukleové kyseliny sú

1, vyznačujúca nesené rovnakým vektorom.

6. Kompozícia podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že nukleové kyseliny sú nesené viacerými vektormi.

7. Kompozícia podľa nároku 5 alebo 6, vyznačujúca sa t ý m, že vektory sú plazmidové alebo vírusové.

8. Kompozícia obsahujúca nukleovú kyselinu kódujúcu tymidínkinázu a druhú nukleovú kyselinu kódujúcu nukleoziddifosfátkinázu.

9. Kompozícia podľa nároku 8, vyznačujúca sa tým, že nukleoziddifosfátkináza je eukaryotického nehumánneho pôvodu.

10. Kompozícia podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že nukleoziddifosfátkináza je vybraná medzi kvasinkovou alebo hovädzou NDPK.

11. Kompozícia podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že nukleová kyselina kódujúca tymidínkinázu a nukleová kyselina kódujúca nukleoziddifosfátkinázu sú spojené a kódujú proteín nesúci zároveň aktivity TK a NDPK.

12. Kompozícia podľa nároku 8, obsahujúca okrem iného nukleovú kyselinu kódujúcu guanylátkinázu.

13. Kompozícia podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že nukleová kyselina kóduje kvasinkovú guanylátkinázu.

14. Kompozícia obsahujúca nukleovú kyselinu kódujúcu tymidínkinázu a druhú nukleovú kyselinu kódujúcu nehumánnu guanylátkinázu.

15. Kompozícia podľa nároku 14, vyznačujúca sa tým, že guanylátkináza je kvasinkového pôvodu.

16. Kompozícia podľa nároku 15, vyznačujúca sa tým, že nukleová kyselina kódujúca tymidínkinázu a nukleová kyselina kódujúca guanylátkinázu sú spojené a kódujú proteín nesúci zároveň aktivity TK a NDPK.

17. Kompozícia podľa nárokov 1 až 15, vyznačuj úca sa t ý m, že tymidínkináza je vírusového pôvodu.

18. Vektor obsahujúci:

-prvú nukleovú kyselinu kódujúcu tymidínkinázu

-druhú nukleovú kyselinu kódujúcu nehumánnu guanylátkinázu.

19. Vektor obsahujúci:

-prvú nukleovú kyselinu kódujúcu tymidínkinázu

-druhú nukleovú kyselinu kódujúcu nukleoziddifosfátkinázu.

20. Vektor podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že nukleoziddifosfátkináza je nehumánneho eukaryotického pôvodu, najmä pôvodu hovädzieho alebo kvasinkového.

21. Vektor podlá nárokov 19 alebo 20, vyznačuj úci sa t ý m, že obsahuje okrem toho nukleovú kyselinu kódujúcu guanylátkinázu.

22. Vektor podlá nárokov 18 až 21, vyznačujúci sa tým, že tymidinkináza je vírusového pôvodu.

.

23. Vektor podlá nárokov 18 až 22, vyznačujúci sa tým, že rôzne nukleové kyseliny sú umiestnené pod kontrolou • rôznych promótorov.

24. Vektor podľa nárokov 18 až 22, vyznačujúci sa tým, že rôzne nukleové kyseliny tvoria polycistrónovú jednotku pod riadením promótorovej jednotky.

25. Vektor podľa nárokov 18, 22 a 24 obsahujúci prvú nukleovú kyselinu kódujúcu tymidínkinázu vírusového pôvodu a druhú nukleovú kyselinu kódujúcu nehumánnu guanylátkinázu, uvedenú nukleovú kyselinu viazanú a kódujúcu proteín nesúci zároveň aktivitu TK a GUK.

26. Vektor podlá nárokov 18 až 25, vyznačujúci sa tým, že ide o plazmidový alebo vírusový vektor, *

27. Kompozícia obsahujúca:

- kombináciu enzýmov schopných trifosforylovať nukleozidový analóg a

- uvedený nukleozidový analóg na súčasné alebo oddelené podávanie alebo na podávanie rozložené v čase.

28. Kompozícia na in vivo produkciu nukleozidového trifosfátového analógu obsahujúca oddelene alebo spoločne:

-nukleozidový analóg

-nukleovú kyselinu kódujúcu tymidínkinázu -nukleovú kyselinu kódujúcu guanylátkinázu

-nukleovú kyselinu kódujúcu nukleoziddifosfátkinázu.

29. Kompozícia na in vivo produkciu nukleozidového trifosfátového analógu obsahujúca oddelene alebo spoločne:

-nukleozidový analóg

-nukleovú kyselinu kódujúcu tymidínkinázu

-nukleovú kyselinu kódujúcu nukleoziddifosfátkinázu

30. Kompozícia podlá nárokov 27 až 29, vyznačuj úca sa t ý m, že nukleozidový analóg je guanozínový analóg.

31. Kompozícia podlá nároku 30, vyznačujúca sa tým, že guanozínový analóg je vybraný medzi gancyklovírusom, acyklovírusom a pencyklovírusom.

32. Kompozícia obsahujúca aspoň dva enzýmy schopné trifosforylovať nukleozidový analóg, aspoň jeden z týchto enzýmov je nehumánneho eukaryotického pôvodu.

33. Metóda na deštrukciu proliferatívnych buniek zahŕňajúca podávanie týmto bunkám kombinácie enzýmov obsahujúcej TK a NDPK a nukleozidový analóg.

34. Metóda podlá nároku 33, vyznačujúca sa tým, že kombinácia enzýmov obsahuje okrem iného guanylátkinázu.

35. Metóda na deštrukciu proliferatívnych buniek zahŕňajúca podávanie týmto bunkám kombinácie enzýmov obsahujúcej TK a nehumánnu GMPK a nukleozidový analóg.

36. Metóda podlá nárokov 33 až 35, vyznačujúca sa tým, že nukleozidový analóg je guanozínový analóg.

37. Metóda podlá nároku 36, vyznačujúca sa tým, že guanozínový analóg je vybraný medzi gancyklovírusom, acyklovírusom a pencyklovírusom.

38. Metóda podľa nárokov 33 až 37, vyznačujúca sa tým, že enzýmy sú podávané bunkám podávaním nukleových kyselín, ktoré tieto enzýmy kódujú.

39. Postup trifosforylácie nukleozidového analógu zahŕňajúci dodávanie uvedeného analógu s kombináciou enzýmov aspoň jedného medzi nimi kvasinkového pôvodu.

40. Použitie nukleoziddifosfátkinázy alebo nukleovej kyseliny kódujúcej tento enzým, v kombinácii s tymidínkinázou alebo s nukleovou kyselinou kódujúcou tymidínkinázu a nukleozidového analógu na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na deštrukciu proliferatívnych buniek.

41. Nukleová kyselina kódujúca fúzny proteín medzi tymidínkinázou vírusového pôvodu a guanylátkinázou.

42. Nukleová kyselina podľa nároku 41, vyznačujúca sa t ý m, že guanylátkináza je kvasinkového pôvodu.

43. Nukleová kyselina kódujúca fúzny proteín medzi tymidínkinázou vírusového pôvodu a nukleoziddifosfátkinázou.

44. Proteín kódovaný nukleovou kyselinou podlá nárokov 41 až 43.