JP5211303B2 - 蛋白質の製造方法 - Google Patents
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Description
従来、ヌクレオシドに作用してリン酸化ヌクレオシドを生ずる反応を触媒する蛋白質としては、古細菌(Archaea)であるAeropyrum pernix由来の6−ホスホフルクトキナーゼ(6−Phosphofructokinase)、及び古細菌であるMethanocaldococcus jannaschii由来のホスホフルクトキナーゼ−B(Phosphofructokinase−B)が知られている。(非特許文献1、2)。
一方、Burkholderia thailandensis DSM13276株の配列表配列番号2の塩基配列は、該株の全ゲノム解析にて配列解析がされていた(非特許文献3)。しかし、該塩基配列がコードする蛋白質の性質はこれまでに解明されておらず、単にリボキナーゼらしいと予想されているに過ぎなかった。
Thomas Hansenら、Arch.Microbiol.、177巻、62−69頁、2001年 Thomas Hansenら、Extremophiles、11巻、105−114頁、2007年 H.S.Stanleyら、BMC Genomics、6巻、174頁、2005年
すなわち、本発明は以下に関する。
[1]下記(1)又は(2)のいずれかの蛋白質の製造方法であって、
該蛋白質をコードする塩基配列に基づき該蛋白質を形成する工程と、該蛋白質を取得する工程を含む該蛋白質の製造方法。
(1)配列表配列番号1のアミノ酸配列からなり、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質、
(2)配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号5のアミノ酸配列及び配列表配列番号6のアミノ酸配列を含む、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質。
[1−1]該(1)または(2)におけるヌクレオシドが、シチジン及びキサントシンを除くヌクレオシドである[1]に記載の製造方法。
[1−2]該ヌクレオシドが、アデノシン、チミジン、ウリジン、イノシン、又はグアノシンの少なくともいずれかひとつである[1]に記載の製造方法。
[1−3]該蛋白質を形成する工程が、該蛋白質をコードする塩基配列を含む細胞を用いることを含む[1]〜[1−2]のいずれかに記載の製造方法。
[1−4]該蛋白質を形成する工程が、該蛋白質をコードする塩基配列を導入した形質転換体を用いることを含む[1]〜[1−3]のいずれかに記載の製造方法。
[1−5]該蛋白質を形成する工程が、該蛋白質をコードする塩基配列を有する微生物を用いることを含む[1]〜[1−4]のいずれかに記載の製造方法。
[2]該蛋白質をコードする塩基配列に基づき該蛋白質を形成する工程が、Burkholderia属に属し、且つ、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質を産生する微生物を用いる工程である[1]〜[1−5]のいずれかに記載の製造方法。
[2−1]該蛋白質を形成する工程が、Burkholderia thailandensisを用いることを含む[1]〜[2]のいずれかに記載の製造方法。
[2−2]該蛋白質を形成する工程が、Burkholderia thailandensis DSM13276株を用いることを含む[1]〜[2−1]のいずれかに記載の製造方法。
[3]該蛋白質が、配列表配列番号1のアミノ酸配列からなり、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質である[1]〜[2−2]のいずれかに記載の製造方法。
[3−1]該蛋白質が、配列表配列番号1のアミノ酸配列における1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質である[1]〜[3]のいずれかに記載の製造方法。
[3−2]該蛋白質が、配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号5のアミノ酸配列及び配列表配列番号6のアミノ酸配列を含む(但し、配列番号5及び配列番号6中、Xaaは任意のアミノ酸を示す)、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質である[1]〜[3−1]のいずれかに記載の製造方法。
[4]該蛋白質をコードする塩基配列に基づき該蛋白質を形成する工程において形成された該蛋白質を取得するに際して、蛋白質を精製する工程をさらに含む[1]〜[3−2]のいずれかに記載の製造方法。
[4−1]該蛋白質を形成する工程が、該蛋白質をコードする塩基配列を含む細胞を用いることを含む[3]〜[4]のいずれかに記載の製造方法。
[4−2]該蛋白質を形成する工程が、該蛋白質をコードする塩基配列を導入した形質転換体を用いることを含む[3]〜[4−1]のいずれかに記載の製造方法。
[5]該蛋白質をコードする塩基配列が、配列表配列番号2で表される塩基配列である[3]〜[4−2]のいずれかに記載の製造方法。
[6]該蛋白質が下記の<1>〜<5>の理化学的性質を有する蛋白質である、[1]〜[5]のいずれかに記載の製造方法。
<1>作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ヌクレオシドをリン酸化ヌクレオシドとなす反応を触媒する;
<2>基質特異性
アデノシン、イノシン、及びグアノシンに作用し、シチジン及びキサントシンに実質的に作用しない。又、リボースに実質的に作用しない;
<3>至適pH
pH5.5〜7.5;
<4>pH安定性
37℃、3時間でpH6〜10の範囲で70%以上の活性を保持する;
<5>熱安定性
100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0の水溶液中、50℃、20分間の熱処理で80%以上の活性を保持する;
[6−1]該リン酸化ヌクレオシドがモノリン酸化ヌクレオシドである[6]に記載の製造方法。
[6−2]該リン酸供与体が、ATPである[6]〜[6−1]のいずれかに記載の製造方法。
[6−3]該蛋白質の、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、約34kDaである[6]〜[6−2]のいずれかに記載の製造方法。
[7]下記(1)から(3)のいずれかの蛋白質を用いる、ヌクレオシドのリン酸化方法。但し、該ヌクレオシドは、シチジン及びキサントシンを除くヌクレオシド。
(1)配列表配列番号1のアミノ酸配列からなり、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質。
(2)配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号5のアミノ酸配列及び配列表配列番号6のアミノ酸配列を含む、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質。
(3)下記の<1>〜<5>の理化学的性質を有する蛋白質。
<1>作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ヌクレオシドをリン酸化ヌクレオシドとなす反応を触媒する;
<2>基質特異性
アデノシン、イノシン、及びグアノシンに作用し、シチジン及びキサントシンに実質的に作用しない。又、リボースに実質的に作用しない;
<3>至適pH
pH5.5〜7.5;
<4>pH安定性
37℃、3時間でpH6〜10の範囲で70%以上の活性を保持する;
<5>熱安定性
100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0の水溶液中、50℃、20分間の熱処理で80%以上の活性を保持する;
[7−1]該(1)または(2)におけるヌクレオシドが、シチジン及びキサントシンを除くヌクレオシドである[7]に記載のヌクレオシドのリン酸化方法。
[7−2]該ヌクレオシドが、アデノシン、チミジン、ウリジン、イノシン、又はグアノシンの少なくともいずれかひとつである[7]に記載のヌクレオシドのリン酸化方法。
[7−3]該リン酸化ヌクレオシドがモノリン酸化ヌクレオシドである[7]〜[7−2]のいずれかに記載のヌクレオシドのリン酸化方法。
[7−4]該リン酸供与体が、ATPである[7]〜[7−3]のいずれかに記載のリン酸化方法。
[7−5]該蛋白質の、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、約34kDaである[7]〜[7−4]のいずれかに記載のリン酸化方法。
[8]配列表配列番号1に記載のアミノ酸配列からなり、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質を用いる[7]〜[7−5]のいずれかに記載のヌクレオシドのリン酸化方法。
[8−1]該蛋白質が、配列表配列番号1のアミノ酸配列における1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質である[7]〜[8]のいずれかに記載のヌクレオシドのリン酸化方法。
[8−2]該蛋白質が、配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号5のアミノ酸配列及び配列表配列番号6のアミノ酸配列を含む(但し、配列番号5及び配列番号6中、Xaaは任意のアミノ酸を示す)、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質である[7]〜[8−1]のいずれかに記載のヌクレオシドのリン酸化方法。
[8−3]該蛋白質をコードする塩基配列が、配列表配列番号2で表される塩基配列である[8]〜[8−2]のいずれかに記載のヌクレオシドのリン酸化方法。
[9]下記の<1>〜<5>の理化学的性質を有する蛋白質を用いる[7]〜[8−3]のいずれかに記載のヌクレオシドのリン酸化方法。
<1>作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ヌクレオシドをリン酸化ヌクレオシドとなす反応を触媒する;
<2>基質特異性
アデノシン、イノシン、及びグアノシンに作用し、シチジン及びキサントシンに実質的に作用しない。又、リボースに実質的に作用しない;
<3>至適pH
pH5.5〜7.5;
<4>pH安定性
37℃、3時間でpH6〜10の範囲で70%以上の活性を保持する;
<5>熱安定性
100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0の水溶液中、50℃、20分間の熱処理で80%以上の活性を保持する;
[9−1]該リン酸供与体が、ATPである[9]に記載のリン酸化方法。
[9−2]該蛋白質の、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、約34kDaである[9]〜[9−1]のいずれかに記載のリン酸化方法。
[10]該蛋白質が、Burkholderia thailandensis由来である[7]〜[9−2]のいずれかに記載のヌクレオシドのリン酸化方法。
[10−1]該蛋白質が、Burkholderia thailandensis DSM13276株由来である[7]〜[10]のいずれかに記載のヌクレオシドのリン酸化方法。
[11]該蛋白質が、少なくともマグネシウムイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン又はマンガンイオンを利用し、且つ、少なくとも37℃においてヌクレオシドをリン酸化する反応を触媒する[10]〜[10−1]のいずれかに記載のヌクレオシドのリン酸化方法。
[11−1]該蛋白質が、少なくともマグネシウムイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン又はマンガンイオンを利用する[10]〜[11]のいずれかに記載のヌクレオシドのリン酸化方法。
[11−2]該蛋白質が、少なくとも37℃においてヌクレオシドをリン酸化する反応を触媒する[10]〜[11−1]のいずれかに記載のヌクレオシドのリン酸化方法。
[12]下記(1)から(3)のいずれかの蛋白質を用いる、ヌクレオシドのリン酸化剤。但し、該ヌクレオシドは、シチジン及びキサントシンを除くヌクレオシド。
(1)配列表配列番号1のアミノ酸配列からなり、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質。
(2)配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号5のアミノ酸配列及び配列表配列番号6のアミノ酸配列を含む、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質。
(3)下記の<1>〜<5>の理化学的性質を有する蛋白質。
<1>作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ヌクレオシドをリン酸化ヌクレオシドとなす反応を触媒する;
<2>基質特異性
アデノシン、イノシン、及びグアノシンに作用し、シチジン及びキサントシンに実質的に作用しない。又、リボースに実質的に作用しない;
<3>至適pH
pH5.5〜7.5;
<4>pH安定性
37℃、3時間でpH6〜10の範囲で70%以上の活性を保持する;
<5>熱安定性
100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0の水溶液中、50℃、20分間の熱処理で80%以上の活性を保持する;
[12−1]上記[7−1]〜[11−2]に記載の少なくともいずれかひとつの特徴を有する上記[12]に記載のヌクレオシドのリン酸化剤。
[12−2]以下の(1)又は(2)のいずれかの蛋白質と、金属イオン、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、酸化型NAD(P)類及びpH緩衝剤を含むヌクレオシドのリン酸化剤。
(1)配列表配列番号1のアミノ酸配列からなり、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質。
(2)配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、配列表配列番号5及び配列表配列番号6のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質。
[12−3]該(1)または(2)におけるヌクレオシドが、シチジン及びキサントシンを除くヌクレオシドである[12−2]に記載のヌクレオシドのリン酸化剤。
[13]下記(1)から(3)のいずれかの蛋白質を用いる、ヌクレオシドを対応するリン酸化ヌクレオシドとするリン酸化ヌクレオシドの製造方法。但し、該ヌクレオシドは、シチジン及びキサントシンを除くヌクレオシド。
(1)配列表配列番号1のアミノ酸配列からなり、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質。
(2)配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号5のアミノ酸配列及び配列表配列番号6のアミノ酸配列を含む、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質。
(3)下記の<1>〜<5>の理化学的性質を有する蛋白質。
<1>作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ヌクレオシドをリン酸化ヌクレオシドとなす反応を触媒する;
<2>基質特異性
アデノシン、イノシン、及びグアノシンに作用し、シチジン及びキサントシンに実質的に作用しない。又、リボースに実質的に作用しない;
<3>至適pH
pH5.5〜7.5;
<4>pH安定性
37℃、3時間でpH6〜10の範囲で70%以上の活性を保持する;
<5>熱安定性
100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0の水溶液中、50℃、20分間の熱処理で80%以上の活性を保持する;
[13−1]上記[7−1]〜[11−2]に記載の少なくともいずれかひとつの特徴を有する上記[13]に記載のヌクレオシドを対応するリン酸化ヌクレオシドとするリン酸化ヌクレオシドの製造方法。
[14]下記(a)〜(c)の各工程を含むヌクレオシドの測定方法。但し、該ヌクレオシドは、シチジン及びキサントシンを除くヌクレオシド。
(a)下記(1)から(3)のいずれかの蛋白質と、ATPの存在下、試料中に含まれている可能性のあるヌクレオシドをリン酸化ヌクレオシドとADPとなす第一の反応を含む工程、
(1)配列表配列番号1のアミノ酸配列からなり、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質。
(2)配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号5のアミノ酸配列及び配列表配列番号6のアミノ酸配列を含む、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質。
(3)下記の<1>〜<5>の理化学的性質を有する蛋白質。
<1>作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ヌクレオシドをリン酸化ヌクレオシドとなす反応を触媒する;
<2>基質特異性
アデノシン、イノシン、及びグアノシンに作用し、シチジン及びキサントシンに実質的に作用しない。又、リボースに実質的に作用しない;
<3>至適pH
pH5.5〜7.5;
<4>pH安定性
37℃、3時間でpH6〜10の範囲で70%以上の活性を保持する;
<5>熱安定性
100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0の水溶液中、50℃、20分間の熱処理で80%以上の活性を保持する;
(b)上記第一の反応とは別異の第二の反応又は第二の複数の反応と、その反応を触媒する第二の酵素又は第二の複数の酵素の存在下、上記第一の反応により生ずるADPの量に応じて、第二の反応により測定対象の変化を生ぜしめる工程、
(c)該測定対象の変化量を検出し、試料中に含まれている可能性のあるヌクレオシドの量を測定する工程、
[14−1]該(1)または(2)におけるヌクレオシドが、シチジン及びキサントシンを除くヌクレオシドである[14]に記載のヌクレオシドの測定方法。
[14−2]該ヌクレオシドが、アデノシン、チミジン、ウリジン、イノシン、又はグアノシンの少なくともいずれかひとつである[14]に記載のヌクレオシドの測定方法。
[14−3]該リン酸化ヌクレオシドがモノリン酸化ヌクレオシドである[14]〜[14−2]のいずれかに記載のヌクレオシドの測定方法。
[14−4](a)工程における該蛋白質が、配列表配列番号1に記載のアミノ酸配列からなり、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質を用いる[14]〜[14−3]のいずれかに記載のヌクレオシドの測定方法。
[14−5](a)工程における該蛋白質が、配列表配列番号1のアミノ酸配列における1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質を用いる[14]〜[14−4]のいずれかに記載のヌクレオシドの測定方法。
[14−6](a)工程における該蛋白質が、配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号5のアミノ酸配列及び配列表配列番号6のアミノ酸配列を含む(但し、配列番号5及び配列番号6中、Xaaは任意のアミノ酸を示す)、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質である[14]〜[14−5]のいずれかに記載のヌクレオシドの測定方法。
[14−7](a)工程における該蛋白質が、下記の<1>〜<5>の理化学的性質を有する蛋白質を用いる[14]〜[14−6]のいずれかに記載のヌクレオシドの測定方法。
<1>作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ヌクレオシドをリン酸化ヌクレオシドとなす反応を触媒する;
<2>基質特異性
アデノシン、イノシン、及びグアノシンに作用し、シチジン及びキサントシンに実質的に作用しない。又、リボースに実質的に作用しない;
<3>至適pH
pH5.5〜7.5;
<4>pH安定性
37℃、3時間でpH6〜10の範囲で70%以上の活性を保持する;
<5>熱安定性
100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0の水溶液中、50℃、20分間の熱処理で80%以上の活性を保持する;
[14−8](a)工程における該蛋白質が、Burkholderia thailandensis由来である[14]〜[14−7]のいずれかに記載のヌクレオシドの測定方法。
[14−9](a)工程における該蛋白質が、Burkholderia thailandensis DSM13276株由来である[14]〜[14−8]のいずれかに記載のヌクレオシドの測定方法。
[14−10](a)工程における該蛋白質が、少なくともマグネシウムイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン又はマンガンイオンを利用する[14]〜[14−9]のいずれかに記載のヌクレオシドの測定方法。
[14−11](a)工程における該蛋白質が、少なくとも37℃においてヌクレオシドをリン酸化する反応を触媒する[14]〜[14−10]のいずれかに記載のヌクレオシドの測定方法。
[14−12](b)工程において、(b−1)ADP依存性ヘキソキナーゼの存在下、該第二の反応がグルコースとADPをグルコース−6−リン酸とAMPとなす反応と、(b−2)グルコース−6−リン酸脱水素酵素の存在下、酸化型NAD(P)類及び前記反応により生ずるグルコース−6−リン酸を、還元型NAD(P)類とグルクノラクトン−6−リン酸とせしめる反応を含み、上記第一の反応により生ずるADPの量に応じて還元型NAD(P)類が増加せしめられており、(c)工程において、還元型NAD(P)類の増加量を検出する工程、である[14]〜[14−11]のいずれかに記載のヌクレオシドの測定方法。
[14−13](b)工程において、(b−1)ピルビン酸キナーゼの存在下、PEPとADPをピルビン酸とATPに変化せしめる反応と、(b−2)乳酸脱水素酵素の存在下、還元型NAD(P)類及び前記の反応により生ずるピルビン酸を、酸化型NAD(P)類と乳酸とせしめる反応を含み、上記第一の反応により生ずるADPの量に応じて還元型NAD(P)類が減少せしめられており、(c)工程において、還元型NAD(P)類の減少量を検出する工程、である[14]〜[14−12]のいずれかに記載のヌクレオシドの測定方法。
[14−14](b)工程において、(b−1)ピルビン酸キナーゼの存在下、PEPとADPをピルビン酸とATPに変化せしめる反応と、(b−2)ピルビン酸オキシダーゼの存在下、酸素、リン酸及び前記の反応により生ずるピルビン酸を、過酸化水素とアセチルリン酸とせしめる反応を含み、上記第一の反応により生ずるADPの量に応じて過酸化水素が増加せしめられており、(c)工程において、過酸化水素の量を過酸化水素指示薬等で検出する工程、である[14]〜[14−13]のいずれかに記載のヌクレオシドの測定方法。
[14−15](c)工程における変化量の検出が、工程(a)及び(b)で処理した後の既知量のヌクレオシドと、測定対象の変化量を比較して、試料中に含まれている可能性のあるヌクレオシドの量を測定する工程である[14]〜[14−14]のいずれかのヌクレオシドの測定方法。
[14−16]該蛋白質の、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、約34kDaである[14]〜[14−15]のいずれかのヌクレオシドの測定方法。
このようなアミノ酸配列としては、RREFGGCA(G、A、又はT)NI(A、又はG)(Y、又はF)(A、S、T、又はN)L、及びDPTG(C、A、V、又はI)GDA(F、Y、W、又はH)R(G、A、又はS)Gの配列を含む、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質であれば更に好ましい。更に、本発明の配列表配列番号1のアミノ酸配列において、その配列表配列番号1のアミノ酸配列のN末端側、及びC末端側は、アミノ酸残基又はポリペプチド残基を含む、すなわち付加していても良く、その付加アミノ酸残基としてはシグナルペプチド、TEE配列、Sタグ、又はHisタグ等が挙げられる。配列表配列番号1のアミノ酸を欠失する場合は、例えば、N末端側のMet又はC末端側のLysから順に削除する例が挙げられる。配列表配列番号1のアミノ酸配列において、N末端のMetの欠失や、N末端がアシル基やアルキル基等による修飾を受ける等の翻訳後修飾された蛋白質も本発明の蛋白質である。又、本発明の蛋白質を公知の方法で無水コハク酸やPEG等により化学修飾して、本発明の蛋白質の至適pHや安定性等の性質を利用しやすいように変化させることも可能である。
理化学的性質
<1>作用
少なくともリン酸供与体の存在下、ヌクレオシドをリン酸化ヌクレオシドとなす反応を触媒する。好ましくは、下記〔式1〕の通りである。
ヌクレオシド + ATP −> リン酸化ヌクレオシド + ADP
本発明の蛋白質はアデノシン、イノシン、及びグアノシンに作用する。本発明の蛋白質はシチジン、キサントシン、及びリボースに実質的に作用しないが、通常、本発明の蛋白質の活性測定方法における測定法3の条件下で反応しない程度であることが好ましく、又、蛋白質溶液の希釈の程度を変更したり、反応試薬混合液中の各組成物の濃度を変更したりしても反応しない程度であることも好ましい。
<3>至適pH
本発明の蛋白質が最大の活性を示す至適pHは、pH5.5〜7.5の範囲に存在する。
<4>pH安定性
本発明の蛋白質は37℃、3時間でpH6〜10の範囲で70%以上の活性を保持する。
<5>熱安定性
本発明の蛋白質は100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0の水溶液中、50℃、20分間の熱処理で80%以上の活性を保持する。
本発明の蛋白質をコードする塩基配列を導入した形質転換体は、該塩基配列が挿入されたベクターである組換体ファージ又は組換体プラスミドを宿主に導入した細胞、又は微生物を含む。本発明の蛋白質をコードする塩基配列は、一部又は全てを合成して使用することができ、好ましくは本発明の蛋白質を、コードする塩基配列を遺伝子供与体から取得して使用する。遺伝子供与体としては、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質を形成する細胞であれば限定されないが、真正細菌、真核生物、又は古細菌を含む微生物が挙げられ、好ましくは上述の本発明の蛋白質を形成する微生物が挙げられる。
組換体プラスミドを導入する宿主としては、組換体プラスミドが安定かつ自律的に増殖可能な細胞、又は微生物であれば良く、例えば宿主微生物が大腸菌に属する微生物の場合、大腸菌BL21、大腸菌 DH1、大腸菌 JM109、大腸菌JM101、大腸菌 W3110、大腸菌C600等を含む、大腸菌B株、K株、C株やそれらの溶原菌が利用できる。又、宿主微生物がバチラス属に属する微生物の場合、バチラス・サチリス、バチラス・メガテリウム等、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンスTK24等、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエ INVSC1等が使用できる。本発明においては大腸菌を宿主微生物とする事が好ましい。
本発明の蛋白質は、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質を形成する天然の微生物や、該蛋白質をコードする塩基配列を導入した形質転換体の微生物等を培養し、培養物から蛋白質を取得することによって製造することができる。まず、該微生物等を栄養培地で培養して菌体内又は培養液中に該蛋白質を形成させ、菌体内に形成される場合には培養終了後、得られた培養物を濾過又は遠心分離等の手段により菌体を採集する。次いで、この菌体を機械的方法又はリゾチーム等の酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてEDTA、及び/又は適当な界面活性剤等を添加して該蛋白質を濃縮するか濃縮する事なく、アセトン、メタノール、エタノール等の有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩等による塩析法等を適用して本発明の蛋白質を沈殿させ回収する。この沈殿物を必要に応じて透析、等電点沈殿を行った後、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーや疎水的クロマトグラフィーにより処理して、本発明の蛋白質を得ることができる。又、これらの方法を適宜組み合わせて行うことができる。また、本発明の蛋白質が培養液中に形成される場合には、培養物を濾過又は遠心分離等の手段により菌体を除去し、培養液について、前記菌体内に形成される場合と同様の処理を行えばよい。
本発明のヌクレオシドのリン酸化剤は、ヌクレオシドをリン酸化ヌクレオシドとなす方法やヌクレオシドをリン酸化ヌクレオシドとするリン酸化ヌクレオシドの製造する方法に用いることができ、通常は組成物にてリン酸化剤となすことが好ましい例として示される。又、後述する本発明のヌクレオシドの測定方法に用いる組成物中にも本発明のヌクレオシドのリン酸化剤が含まれると考えられる。
本発明のリン酸化剤には、本発明の蛋白質のほか、リン酸供与体、金属イオン、pH緩衝剤、その他酵素や試薬等、が含まれるが、本発明の蛋白質、リン酸供与体、及び金属イオンの添加量や種類は上述と同様である。
本発明のヌクレオシドのリン酸化剤を二試薬以上に分離する場合、例えば試薬の安定化を目的とする場合は、本発明の蛋白質、リン酸供与体及びpH緩衝剤等を凍結乾燥して第一の試薬となし、金属イオン、pH緩衝剤等を液状品として第二の試薬となす分離の例が挙げられる。又、例えば試薬の測定精度向上を目的とする場合は、試料中に測定値へ影響を与える干渉物質が存在する場合を想定し、干渉物質の影響回避の為の試薬を含んで第一の試薬となし、本発明の蛋白質、リン酸供与体、金属イオン、pH緩衝剤等を含んで第二の試薬となす分離の例が挙げられる。
本発明の測定用組成物を二試薬以上に分離する場合、第一の試薬には少なくとも本発明の蛋白質、リン酸供与体、金属イオンとpH緩衝剤、第二の試薬には、少なくともADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、酸化型NAD(P)類とpH緩衝剤を含むように分離する例、又、第一の試薬には少なくとも本発明の蛋白質、リン酸供与体、金属イオン、還元型NAD(P)類とpH緩衝剤、第二の試薬には、少なくともピルビン酸キナーゼ、PEP、乳酸脱水素酵素とpH緩衝剤を含むように分離する例、あるいは、第一の試薬には少なくとも本発明の蛋白質、リン酸供与体、金属イオンとpH緩衝剤、第二の試薬には、少なくともピルビン酸キナーゼ、PEP、ピルビン酸オキシダーゼ、リン酸、過酸化水素指示薬とpH緩衝剤を含むように分離する例、が挙げられる。
本発明のヌクレオシドの測定に用いる測定用組成物に用いる本発明の蛋白質、リン酸供与体、金属イオン、ADP依存性ヘキソキナーゼ、グルコース、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、酸化型NAD(P)類、還元型NAD(P)類、ピルビン酸キナーゼ、PEP、乳酸脱水素酵素、ルビン酸オキシダーゼ、リン酸、過酸化水素指示薬及びpH緩衝剤の添加量や種類は、下記の本発明のヌクレオシドの測定方法と同様である。
本発明のヌクレオシドの由来は特に限定されないが、血漿、血清、尿、研究用試料等を挙げることができ、ヌクレオシドを含有すると予想される血漿、血清、尿、研究用試料等であれば好ましい。その他の試料としては、例えば、海水、天然水、果汁、飲料、廃液等が挙げられる。
本発明の工程(a)の温度は、上述と同様である。
本発明の工程(a)は水又は適宜のpH緩衝剤を用いることが好ましく、その条件は上述と同様である。
本発明の工程(a)における本発明の蛋白質の量、リン酸供与体(ATP)の量、及び金属イオンの量等は上述と同様である。
本発明の工程(b)(上記工程(b(ア))〜(b(ウ))を含む)における温度は、工程(b)で使用する酵素の作用温度範囲内が望ましく、工程(a)と同様の温度であっても良い。
本発明のヌクレオシドの測定方法における工程(c)における該測定対象の変化量を検出する方法は、該測定対象の変化量を公知の方法で検出する。一般的には該測定対象の変化に伴うそれら該測定対象の吸収スペクトルや吸光強度の変化を目視で検出したり、装置を用いて光学的方法で検出したりする方法が例示され、NAD(P)類の酸化還元に伴う吸収スペクトルや特定波長における吸光強度の変化を検出する方法や過酸化水素指示薬の変化に伴う吸収スペクトルや特定波長における吸光強度の変化を検出しても良い。又、装置を用いて還元型NAD(P)の蛍光を検出することも可能である。
定量する測定方法とは次の通りである。ヌクレオシドが含まれている可能性のある試料と、ヌクレオシドを既知の濃度で含む試料を、それぞれ単独に工程(a)〜(b)で処理し、工程(c)でそれぞれの変化量を検出する。ヌクレオシドが含まれている可能性のある試料中のヌクレオシドの濃度は、ヌクレオシドが含まれている可能性のある試料について工程(c)で検出した変化量と、ヌクレオシドを既知の濃度で含む試料について工程(c)で検出した変化量とを比較することにより定量する。
尚、本発明で使用する試薬類は、特に断らない限り、和光純薬工業株式会社製、シグマアルドリッチ社製、タカラバイオ株式会社製等であり、市販で容易に入手できるものを使用することができる。試薬のメーカーや純度等は特に限定されなくとも良いことは言うまでもない。
本発明の蛋白質の活性量を測定するに際しては、下記の測定法1、測定法2、又は測定法3を目的に応じて使い分けて求める。
測定法1は、反応工程が少ないので簡便に正確な活性値が測定できるが、340nmにおける吸光度を測定する方法なので測定装置の制約を受け易い。測定法2は550nmにおける吸光度を測定する方法なので測定装置の制約を受け難いが、色素が難水溶性なので正確な活性値を測定する場合は注意が必要である。測定法1及び測定法2がイノシンを基質にする測定であるのに対して、測定法3は任意の物質を基質として測定が可能であるが、340nmにおける吸光度を測定する方法なので測定装置の制約を受け易いし、使用する試薬の数が多いので正確な活性値を測定する場合は注意か必要である。
測定法1と測定法2でIMPDHとはイノシン5’一リン酸デヒドロゲナーゼを指す。IMPDHが市販されていない場合は、S.I.Kimら、Biosci.Biotechnol.Biochem.、64巻、1210−1216頁、2000年等に記載された方法で取得すれば良い。
尚、本明細書において、蛋白質の活性量を特定する必要がある際には、測定法を特に断らない限り、全て測定法3における活性量として換算して表記する。換算に際しては、同じ検体を各測定方法で測定し、その値の変化量の比率から換算できる。変化量の比率は、測定の条件や使用機器の精度等によりその値は変化し得るが、測定法1:測定法2:測定法3=3.0:5.5:0.7が例示される。
石英製の1.0cmキュベットに反応試薬混合液1を1.0ml量りとり、37℃で2分間予備加温する。30mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で適当な濃度に希釈した本発明の蛋白質溶液を0.05ml加えて混和し、37℃で反応を開始する。5分後に反応試薬混合液2を1.0ml混和して、340nmにおける吸光度を測定し、吸光変化を求める。求められた吸光変化をAs/min、本発明の蛋白質溶液の代わりに精製水を用いた盲検をAb/minとして、酵素活性(U/ml)を下記〔式2〕で算出する。
酵素活性(U/ml)={(As/min−Ab/min)/6.22}×2.05/0.05×希釈倍数
30mM リン酸カリウム緩衝液 pH7.0
10mM ATP(pH7)
20mM 塩化マグネシウム
5mM イノシン
50mM 塩化カリウム
[反応試薬混合液2]
100mM Tris/HCl緩衝液 pH9.0
13U/ml IMPDH
20mM NAD
50mM 塩化カリウム
1mM DTT
200mM EDTA(pH9)
石英製の1.0cmキュベットに反応試薬混合液を1.0ml量りとり、37℃で2分間予備加温する。30mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で適当な濃度に希釈した本発明の蛋白質溶液を0.01ml加えて混和し、37℃で反応を開始する。反応開始5分後に0.1Nの塩酸を2ml混和して反応を止め、550nmにおける吸光度を測定し、吸光変化を求める。求められた吸光変化をAs/min、本発明の蛋白質溶液の代わりに精製水を用いた盲検をAb/minとして、酵素活性(U/ml)を下記〔式3〕で算出する。
酵素活性(U/ml)={(As/min−Ab/min)/19}×3.01/0.01×希釈倍数
30mM Tris/HCl緩衝液 pH9.0
5mM ATP(pH7)
10mM 塩化マグネシウム
2.5mM イノシン
5U/ml IMPDH
10mM NAD
50mM 塩化カリウム
5U/ml DI(旭化成ファーマ株式会社製)
0.025% NTB
0.5% TX―100
石英製の1.0cmキュベットに反応試薬混合液を1.3ml量りとり、37℃で2分間予備加温する。20mM Tris/HCl緩衝液(pH7.5)で適当な濃度に希釈した本発明の蛋白質溶液を0.03ml加えて混和し、37℃で反応を開始する。反応開始後、340nmにおける吸光度を測定して直線的に反応している1分間当たりの吸光変化を求める。求められた吸光変化を、As/min、本発明の蛋白質溶液の代わりに精製水を用いた盲検をAb/minとして、酵素活性(U/ml)を下記〔式4〕で算出する。
酵素活性(U/ml)={(As/min−Ab/min)/6.22}×1.33/0.03×希釈倍数
20mM Tris/HCl緩衝液 pH7.5
20mM グルコース
1mM ATP(pH7)
1mM 塩化マグネシウム
1mM NADP
50mM 塩化カリウム
5U/ml グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ(旭化成ファーマ株式会社製)
5U/ml ADP依存性HK(旭化成ファーマ株式会社製)
1mM イノシン
<本発明の蛋白質の基質特異性>
後述の実施例17により調製した本発明の蛋白質を用いた。上述の活性測定法3でイノシンの代わりに表1中の各基質を使用して、本発明の蛋白質の相対活性を測定した。表1に、相対活性を比較した基質特異性を示す。
<本発明の蛋白質の至適pH>
後述の実施例17により調製した本発明の蛋白質の、測定法1の反応試薬混合液1における緩衝液を、pH4.5〜pH6.0の範囲はクエン酸/NaOH緩衝液(図1中○印)、pH6.0〜pH7.5の範囲はリン酸カリウム緩衝液(図1中●印)、pH7.0〜pH9.0の範囲はTris/HCl緩衝液(図1中△印)、pH9.5はグリシン/NaOH緩衝液(図1中□印)に変更して活性測定を行い、至適pHを測定した。図1に、最大活性を100%とした相対活性(%)を示した。本発明の蛋白質が最大の活性を示す至適pHは、pH5.5〜7.5の範囲に存在する。
<本発明の蛋白質のpH安定性>
後述の実施例17により調製した本発明の蛋白質を0.475mg/mlになるように100mMの、pH4.5〜pH6.0の範囲はクエン酸/NaOH緩衝液(図1中○印)、pH6.0〜pH7.5の範囲はリン酸カリウム緩衝液(図2中●印)、pH7.0〜pH9.0の範囲はTris/HCl緩衝液(図2中△印)、pH9.5〜11.0はグリシン/NaOH緩衝液(図2中□印)に希釈して37℃で3時間加温処理した後、本発明の蛋白質の残存活性を測定法1で測定した。図2に示す通り、本発明の蛋白質は37℃、3時間でpH6〜10の範囲で70%以上の活性を保持した。
<本発明の蛋白質の熱安定性>
後述の実施例17により調製した本発明の蛋白質を0.475mg/mlになるように100mM リン酸カリウム緩衝液pH7.0中に希釈し、各温度で20分間熱処理した後、本発明の蛋白質の残存活性を測定法1で測定した。図3に示す通り、本発明の蛋白質は100mM リン酸カリウム緩衝液pH7.0の水溶液中、50℃、20分間の熱処理で80%以上の活性を保持した。
<本発明の蛋白質の分子量>
後述の実施例17により調製した本発明の蛋白質におけるSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は、図4に示すように約34kDaであった。配列表配列番号1のアミノ酸配列からの計算値は、33,994であった。
<本発明の蛋白質の作用温度範囲>
後述の実施例17により調製した本発明の蛋白質を測定法1の活性測定法で、反応温度を15〜70℃まで変化して、本発明の蛋白質のイノシンをリン酸化する反応速度を測定した(図5)。その結果をアレニウスプロットして図6に示した。図5で示した通り、作用温度の範囲は少なくとも15〜70℃であった。又、図6より、20〜45℃の間における活性化エネルギーは約64kJ/molであった。尚、図6中Tは絶対温度を示す。又、図5で50℃以上では相対活性が上がっていないように見えるが、反応液中における本発明の蛋白質の安定性やATPの分解の結果と考えられる。
<本発明の蛋白質の金属の利用性>
後述の実施例17により調製した本発明の蛋白質を使用した下記の[混合物]において、表2に示した金属を使用した場合の、本発明の蛋白質によるAMPが生成する速度を測定し、結果を相対比として表2に示す。
[混合物]1mlに、最終濃度1mMとなるようにアデノシンを添加して37℃で30分間アデノシンのリン酸化方法を実施した。アデノシンのリン酸化方法を実施後の[混合物]を精製水で10倍に希釈して、25μlをHPLCで分離した。HPLCは昭和電工社製のAsahipak GS−320を使用し、移動相は200mMリン酸ナトリウム緩衝液pH3.0、流速は0.5ml/minで、室温で実施し、AMPの生成量を260nmの吸光で測定した。
[混合物]
50mM Tris/HCl緩衝液 pH 7.5
2.5mM ATP
5mM 表2に示す金属化合物
5mU/ml 実施例17により調製した本発明の蛋白質
<蛋白質濃度測定>
本発明の蛋白質の蛋白質濃度を、バイオラッド社のプロテインアッセイキットを用いて使用説明書記載の方法に従って測定し、BSAをスタンダードとして算出した。本発明の蛋白質の比活性は、該蛋白質の純度、測定の条件、使用機器の精度等によりその値は変化し得るが、後述の実施例17により調製した本発明の蛋白質の場合、約0.5U/mgであった。
<VmaxとKm、その1>
後述の実施例17により調製した本発明の蛋白質を測定法3の活性測定法で、Km値の1/10倍〜10倍の間で5つ以上の異なる濃度になるように基質濃度を調製して、ラインウェーバー・バーク逆数プロットにより各見かけのKm値を算出した。その結果を表3に示した。表3のVmaxとKmは、測定法3の条件下における見かけのVmaxとKmである。
<VmaxとKm、その2>
後述の実施例17により調製した本発明の蛋白質を測定法1の活性測定法で、Km値の1/10倍〜10倍の間で5つ以上の異なる濃度になるようにイノシン濃度及びNAD濃度を調製して、ラインウェーバー・バーク逆数プロットによりイノシンに対するKm値を算出した。その結果、Vmax=1.59μmol/min/mg、Km=0.18μmol/min/mgであった。
<DNAの抽出>
LB培地を使用して30℃2日間培養して集菌したBurkholderia thailandensis DSM13276株の菌体を50mM Tris/HCl緩衝液(pH8.0)、50mM EDTA、15%シュークロースを含む1mg/mlリゾチーム溶液で37℃、10分処理した後、SDSを最終濃度0.25%になるよう添加して菌体を溶解した。更に等量のフェノール/クロロホルムの1:1混合液を加え、30分攪拌した後、遠心分離(12,000rpm、15分間)して水層を回収した。回収した水層に10分の1量の3Mの酢酸ナトリウム(pH5.5)を混合後、2倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムDNAをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムDNAを、10mM Tris/HCl緩衝液(pH8.0)、1mM EDTA水溶液(以下TEと記載する場合もある)に溶解し、適量のRNaseAを加え、37℃で1時間保温し、混在しているRNAを分解した。次いで、等量のフェノール/クロロホルムの1:1混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に10分の1量の3Mの酢酸ナトリウム(pH5.5)と2倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムDNAを分離した。この染色体をTEに溶解し、TE飽和のフェノールとクロロホルムの1:1混合液を加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層に3Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)とエタノールを加え、撹拌後、−70℃で5分間冷却した後、遠心分離(2,000G、4℃、15分)し、沈澱した染色体を75% エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操作によりBurkholderia thailandensis DSM13276株のDNA標品を得た。
<PCR法による配列表配列番号2に示す遺伝子の増幅>
pTip QC1又はpTip QC2(特許第3944577号公報、及び特許第3793812号公報)のマルチクローニングサイトNdeI及びBamHI部位に配列表配列番号2の遺伝子を挿入するように、配列表配列番号3と配列表配列番号4のプライマーを設計した。PCRは、KOD DNAポリメラーゼ(東洋紡社製)を用いた。PCR条件は、使用説明書記載の方法に従った。得られた約1.0kbpのPCR産物は、例えばQIAGEN QIAquick PCR Purification Kitを用いる等、常法に従って精製した。
<発現ベクターとのライゲーション>
実施例12で精製したPCR産物をNdeI及びBamHIにより常法に従って制限酵素処理した。このインサートは常法に従って精製した。インサートはNdeI及びBamHIにより制限酵素処理し精製したpTip QC1又はpTip QC2と常法に従ってライゲーションし、pTip QC1/BthNK及びpTip QC2/BthNKを作成した。pTip QC1/BthNK及びpTip QC2/BthNKを大腸菌 DH5αに常法に従って形質転換し、コロニーダイレクトPCR法によるポジティブクローンから精製した組換体プラスミドは、DNAシーケンスによりインサート配列が正しい事を確認した。
<pTip QC1/BthNK、及びpTip QC2/BthNKのRhodococcus erythropolisへの形質転換>
pTip QC1/BthNK、及びpTip QC2/BthNKのRhodococcus erythropolisへの形質転換は特開2004−073116号公報等に記載の方法に従いエレクトロポレーション法(電気穿孔法)で実施した。エレクトロポレーション条件は次のようにした。コンピテントセルを融解し、pTip QC1/BthNK、又はpTip QC2/BthNKと混合して、2mmの専用チャンバーに入れ、7.5mS、2500V、25μF、400Ωでパルスをかけた。これにより、pTip QC1/BthNK、及びpTip QC2/BthNKの形質転換体をそれぞれ3株得た。
<発現チェック>
実施例14で得た形質転換体それぞれ3株を、34μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB培地に植菌した。30℃で2日間培養してシードとした。34μg/mlのクロラムフェニコールと1μg/mlのチオストレプトンを含むLB培地に上記のシードを1/10量植菌し、30℃で1日間培養した。培養液を遠心分離して集菌し、培養液の1/5倍量の20mM Tris/HCl緩衝液(pH7.5)に懸濁、超音波破砕して、遠心分離し、得られた上清を粗蛋白質液とした。粗蛋白質液のSDS−PAGEを図7に示す。これより本発明の蛋白質の大量発現が確認された。尚、図7(A)中矢印がpTip QC1/BthNK、図7(B)中矢印がpTip QC2/BthNKの形質転換体で発現した本発明の蛋白質である。尚、実施例14で得た形質転換体いずれの3株についても、同様の結果が得られた。
<pTip QC1/BthNK形質転換体から本発明の蛋白質の精製>
実施例15でpTip QC1/BthNK形質転換体を培養して得られた粗蛋白質液を0.1Mの塩化ニッケル、及び0.3Mの塩化ナトリウムを含む50mMのリン酸緩衝液(pH8.0)で平衡化したCherating Sepharose FF(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)に吸着させた。0.3Mの塩化ナトリウムを含む50mMのリン酸緩衝液(pH8.0)で充分に洗浄した後、10%グリセロールおよび0.3Mの塩化ナトリウムを含む50mMのリン酸緩衝液(pH6.0)で充分に洗浄した。0.4M イミダゾール、10%グリセロールおよび0.3Mの塩化ナトリウムを含む50mMのリン酸緩衝液(pH6.0)にて溶出した。活性画分は0.03Mの塩化ナトリウム、0.05Mの塩化カリウムおよび1mMのDTTを含む30mMのリン酸緩衝液(pH7.0)で透析して本発明の精製蛋白質を得た。1Lの培養で約80mgの精製蛋白質を得た。
<pTip QC2/BthNK形質転換体から本発明の蛋白質の精製>
実施例15でpTip QC2/BthNK形質転換体を培養して得られた粗蛋白質液を10mMのTris/HCl緩衝液(pH8.0)で平衡化したQ sep.BB(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)に吸着させた。10mMのTris/HCl緩衝液(pH8.0)で充分に洗浄した後、0及び0.5Mの塩化カリウムを含む10mMのTris/HCl緩衝液(pH8.0)を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度15%になるように硫酸アンモニウムを添加し、15%の硫酸アンモニウムを含む10mM リン酸カリウム緩衝液pH7.5で平衡化したPhenyl sep.FF(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)に吸着して15及び0%の硫酸アンモニウムを含む10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で平衡化したG−25(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)で脱塩した後、10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で平衡化したDEAE sep.FF(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)に吸着させた。10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で充分に洗浄した後、0及び0.5Mの塩化カリウムを含む10m Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化したG−25で脱塩して本発明の精製蛋白質を得た。1Lの培養で約50mgの精製蛋白質を得た。
<pETシステム(Novagen社製)を使用した本発明の蛋白質の発現>
実施例13で得られたインサートは、NdeI及びBamHIにより制限酵素処理し精製したpET21a(+)と常法に従ってライゲーションし、pET21a(+)/BthNKを作成した。pET21a(+)/BthNKを大腸菌BL21(DE3)に常法に従って形質転換し、コロニーダイレクトPCR法によるポジティブクローンから精製した組換体プラスミドは、DNAシーケンスしてインサート配列が正しい事を確認した。
得られた形質転換体3株を50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地に植菌した。30℃で1日間培養してシードとした。50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地に上記のシードを1/100量植菌し、30℃で一日培養した。培養液中の濃度が1mMになるようにIPTGを加え、更に30℃で3時間培養した。培養液を遠心分離して集菌し、培養液の1/5倍量の20mM Tris/HCl緩衝液(pH8.5)に懸濁、超音波破砕して、遠心分離し、得られた上清を粗蛋白質液とした。粗蛋白質液のSDS−PAGEを図8に示す。これより、本発明の蛋白質の大量発現が確認された。尚、図中矢印が本発明の蛋白質である。
<ヌクレオシドのリン酸化方法とリン酸化ヌクレオシド製造>
実施例17により調製した本発明の蛋白質を使用し、ヌクレオシドのリン酸化剤として下記の[混合物]を調製し、アデノシンのリン酸化方法を実施して、アデノシンからリン酸化アデノシン(AMP)を製造した。[混合物]1mlに、最終濃度1mMとなるようにアデノシンを添加して37℃で30分間アデノシンのリン酸化方法を実施した。アデノシンのリン酸化方法を実施後の[混合物]を精製水で10倍に希釈して、25μlをHPLCで分離した。HPLCは昭和電工社製のAsahipak GS−320を使用し、移動相は200mM リン酸ナトリウム緩衝液pH3.0、流速は0.5ml/minで室温において実施し、260nmの吸光をモニターした。アデノシンのリン酸化方法を実施後のクロマト図を図9の(C)、実施前のクロマト図を図9の(B)に示す。図9の(A)は同じHPLC条件で、標品のATP、ADP、AMP、及びアデノシン混合物をHPLCで分離したクロマト図である。本発明の蛋白質を使用したヌクレオシドのリン酸化剤で、アデノシンのリン酸化方法を実施して、アデノシンからリン酸化アデノシン(AMP)を製造することができた。盲検は実施例17で取得した本発明の蛋白質の代わりに精製水を使用して実施し、実施前後のクロマト図が図9の(B)と変化無いことを確認した。
[混合物]:
50mM Tris/HCl緩衝液 pH 7.5
2.5mM ATP
5mM 塩化マグネシウム
5mU/ml 実施例17により調製した本発明の蛋白質
<ヌクレオシドの測定方法1>
実施例17により調製した本発明の蛋白質を使用し、ヌクレオシドのリン酸化剤として下記[混合物1]及び[混合物2]を作成し、アデノシン、イノシン、及びグアノシンの混合物の測定方法を実施した。測定には日立7080形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル5μl、R1として[混合物1]を100μl、R2として[混合物2]を100μl、測定主波長は340nm、測定副波長は405nm、1ポイントエンド、10分反応、0−31とし、精製水によるブランクを差し引いた。試料としてアデノシン、イノシン、及びグアノシンの1:1:1混合物を合計濃度で図10の横軸の範囲で調整して、測定した結果を図10に示した。本発明の蛋白質を使用したヌクレオシドのリン酸化剤で、アデノシン、イノシン、及びグアノシン混合物の測定が実施できた。
[混合物1]:
20mM リン酸カリウム緩衝液 pH7.0
10mM ATP(pH7)
20mM 塩化マグネシウム
0.25U/ml 実施例17により調製した本発明の蛋白質
50mM 塩化カリウム
[混合物2]:
20mM リン酸カリウム緩衝液 pH7.0
20mM グルコース
20mM 塩化マグネシウム
50mM 塩化カリウム
5mM NADP
5U/ml グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ
5U/ml ADP依存性HK
<ヌクレオシドの測定方法2>
実施例17により調製した本発明の蛋白質を使用し、ヌクレオシドのリン酸化剤として下記[混合物]を作成し、アデノシン、イノシン、及びグアノシンの測定方法を実施した。測定には日立7080形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル3μl、R1として[混合物]を130μl、測定主波長は340nm、測定副波長は405nm、レートA、5分反応、7−9とし、精製水によるブランクを差し引いた。試料としてアデノシン、イノシン、及びグアノシンをそれぞれ図11〜図13の横軸の範囲で調整して測定した結果を図11〜図13に示した。本発明の蛋白質を使用したヌクレオシドのリン酸化剤を作成し、アデノシン、イノシン、及びグアノシンの測定が実施できた。
[混合物]:
50mM リン酸カリウム緩衝液 pH7.0
50mM 塩化カリウム
1mM ATP(pH7)
0.5mM 塩化マグネシウム
0.5mM PEP
0.1mM NADH
50U/ml ピルビン酸キナーゼ
15U/ml 乳酸脱水素酵素
2mM DTT
25mU/ml 実施例17により調製した本発明の蛋白質
<ヌクレオシドの測定方法3>
実施例17により調製した本発明の蛋白質を使用し、ヌクレオシドのリン酸化剤として下記[混合物]を作成し、アデノシン、イノシン、及びグアノシンの測定方法を実施した。測定には日立7080形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル3μl、R1として[混合物]を130μl、測定主波長は340nm、測定副波長は405nm、レートA、5分反応、7−9とし、精製水によるブランクを差し引いた。試料としてアデノシン、イノシン、及びグアノシンをそれぞれ図14〜図16の横軸の範囲で調整して測定した結果を図14〜図16に示した。本発明の蛋白質を使用したヌクレオシドのリン酸化剤を作成し、アデノシン、イノシン、及びグアノシンの測定が実施できた。
[混合物]:
20mM リン酸カリウム緩衝液 pH7.0
20mM グルコース
1mM ATP(pH7)
1mM 塩化マグネシウム
1mM NADP
50mM 塩化カリウム
5U/ml グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ
5U/ml ADP依存性HK
6mU/ml 実施例17により調製した本発明の蛋白質
実施例17により調製した本発明の精製蛋白質、及び実施例18により調製した本発明の粗蛋白質液を実施例17と同様の方法で精製蛋白質とした実施例18の本発明の精製蛋白質を、同時に上述の理化学的性質<1>〜<5>の比較を行った。その結果、該2種類の本発明の精製蛋白質は、上述の理化学的性質<1>〜<5>を備える蛋白質であることが確認できた。
Claims (8)
- 下記(1)から(3)のいずれかの蛋白質の製造方法であって、
該蛋白質をコードする塩基配列に基づき該蛋白質を形成する工程と、該蛋白質を取得する工程を含む該蛋白質の製造方法。
(1)配列表配列番号1のアミノ酸配列からなり、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質、
(2)配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号5のアミノ酸配列及び配列表配列番号6のアミノ酸配列を含む、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質、
(3)下記の<1>〜<5>の理化学的性質を有する蛋白質、
<1>作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ヌクレオシドをリン酸化ヌクレオシドとなす反応を触媒する;
<2>基質特異性
アデノシン、イノシン、及びグアノシンに作用し、シチジン及びキサントシンに作用しない。又、リボースに作用しない;
<3>至適pH
pH5.5〜7.5;
<4>pH安定性
37℃、3時間でpH6〜10の範囲で70%以上の活性を保持する;
<5>熱安定性
100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0の水溶液中、50℃、20分間の熱処理で80%以上の活性を保持する; - 該蛋白質をコードする塩基配列に基づき該蛋白質を形成する工程が、Burkholderia属に属し、且つ、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質を産生する微生物を用いる工程である請求項1に記載の製造方法。
- 該蛋白質をコードする塩基配列に基づき該蛋白質を形成する工程において形成された該蛋白質を取得するに際して、蛋白質を精製する工程をさらに含む請求項1に記載の製造方法。
- 該蛋白質をコードする塩基配列が、配列表配列番号2で表される塩基配列である請求項3に記載の製造方法。
- 下記(1)から(3)のいずれかの蛋白質を用いる、ヌクレオシドのリン酸化方法。但し、該ヌクレオシドは、シチジン及びキサントシンを除くヌクレオシド。
(1)配列表配列番号1のアミノ酸配列からなり、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質
(2)配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号5のアミノ酸配列及び配列表配列番号6のアミノ酸配列を含む、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質、
(3)下記の<1>〜<5>の理化学的性質を有する蛋白質、
<1>作用
少なくともリン酸供与体存在下で、ヌクレオシドをリン酸化ヌクレオシドとなす反応を触媒する;
<2>基質特異性
アデノシン、イノシン、及びグアノシンに作用し、シチジン及びキサントシンに作用しない。又、リボースに作用しない;
<3>至適pH
pH5.5〜7.5;
<4>pH安定性
37℃、3時間でpH6〜10の範囲で70%以上の活性を保持する;
<5>熱安定性
100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0の水溶液中、50℃、20分間の熱処理で80%以上の活性を保持する; - 該蛋白質が、Burkholderia thailandensis由来である請求項5に記載のヌクレオシドのリン酸化方法。
- 該蛋白質が、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が約34kDaである蛋白質であるか、又は少なくともマグネシウムイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン又はマンガンイオンを利用する蛋白質であるか、又は少なくとも37℃においてヌクレオシドをリン酸化する反応を触媒する蛋白質であるか、のいずれかである請求項6に記載のヌクレオシドのリン酸化方法。
- 下記(a)〜(c)の各工程を含むヌクレオシドの測定方法。但し、該ヌクレオシドは、
シチジン及びキサントシンを除くヌクレオシド。
(a)下記(1)から(3)のいずれかの蛋白質と、ATPの存在下、試料中に含まれている可能性のあるヌクレオシドがリン酸化ヌクレオシドとADPを生成する第一の反応を含む工程、
(1)配列表配列番号1のアミノ酸配列からなり、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質、
(2)配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号5のアミノ酸配列及び配列表配列番号6のアミノ酸配列を含む、ヌクレオシドのリン酸化反応を触媒し得る蛋白質、
(3)下記の<1>〜<5>の理化学的性質を有する蛋白質、
<1>作用
ATPとヌクレオシドに作用して、ADPとリン酸化ヌクレオシドを生ずる反応を触媒する;
<2>基質特異性
アデノシン、イノシン、及びグアノシンに作用し、シチジン及びキサントシンに作用しない。又、リボースに作用しない;
<3>至適pH
pH5.5〜7.5;
<4>pH安定性
37℃、3時間でpH6〜10の範囲で70%以上の活性を保持する;
<5>熱安定性
100mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0の水溶液中、50℃、20分間の熱処理で80%以上の活性を保持する;
(b)上記第一の反応とは別異の第二の反応又は第二の複数の反応と、その反応を触媒する第二の酵素又は第二の複数の酵素の存在下、上記第一の反応により生ずるADPの量に応じて、第二の反応により測定対象の変化を生ぜしめる工程、
(c)該測定対象の変化量を検出し、試料中に含まれている可能性のあるヌクレオシドの量を測定する工程、
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