CN111233982B - 一种小分子蛋白质及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种小分子蛋白质及其应用，所述小分子蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述小分子蛋白为特殊改造的基因编码的核磁共振成像造影剂；本发明提供的基因序列在生物体内表达后，在核磁成像时能造成T1弛像时间的明显缩短，成像时相关部位高信号，解决了目前常用核磁共振成像造影剂的组织穿透性差、没有细胞/组织选择性、生物毒性强(金属造影剂)等众多问题，能够高分辨率、实时、在体地检测基因表达、细胞分化个体发育过程等，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

Description

一种小分子蛋白质及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种小分子蛋白质及其应用。

背景技术

磁共振成像(MRI,Magnetic Resonance imaging)是利用原子核在强磁场内 发生共振产生的信号经图像重建的一种成像技术。MRI利用射频脉冲对置于磁 场中含有自旋不为零的原子核进行激发，射频脉冲停止后，原子核进行成像， 在其成像过程中用感应线圈采集信号，按照一定的数学方法重建形成图像。即 将生物体置于特殊的磁场中，用无线电射频脉冲激发生物体内氢原子核，引起 氢原子核共振，并吸收能量。在停止射频脉冲后，氢原子核按特定频率发出射 电信号，并将吸收的能量释放出来，被体外的接收器收录，经电子计算机处理 获得图像。MRI技术目前普遍应用于科学研究以及医学检测成像中，具有无辐 射损伤的安全性，可任意方位断层扫描等，然而临床上发现不同组织或肿瘤组 织的成像时间相互重叠，导致诊断困难。因此人们开始研究造影剂，增强信号 对比、提高图像分辨率。这一过程主要是通过注射造影剂来改变组织局部成像 特性，提高成像对比度。

目前常用造影剂是一类化学合成的其密度高于活体组织的物质，造影剂本 身不产生信号，通过改变生物体内部组织中水质子的成像效率，与周围组织形 成对比，从而达到造影的目的。其中，顺磁性阳性造影剂包括Gd-DTPA、 Mn-DPDP等，起作用主要使T1缩短，在T1加权图像上呈高信号。超顺磁性物 质，例如超顺磁性氧化铁颗粒等，其主要作用是使T2缩短，在T2加权像上呈 低信号。

CN103432599A公开了一种纳米四氧化三锰核磁共振造影剂的制备方法，该 方法通过脉冲激光在液体中烧蚀固体靶材合成微纳材料，其操作简单，没有其 他化学杂质，制备的纳米四氧化三锰核磁共振造影剂的磁豫率高达 8.26mM-1s-1，比商业用的Gd-DTPA的值(r1＝4.11mM-1s-1)高出一倍，显示出了 良好的体内和体外成像效果。CN103191446A提供了一种核磁共振造影剂的制备 方法，用还原性糖将铁盐在高温下还原后得到Fe₃O₄，处理后进行表面修饰，标 记上抗体后，注射进大鼠体内一段时间后，即可进行MRI扫描成像。CN102397564A公开了一种多肽修饰的肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂及其制备 方法，采用高分子材料、聚乙二醇、多肽、双功能配体和三氯化钆，以多肽为 靶向头基，树枝状高分子材料为基础高分子载体，表面连接小分子造影剂，制 成肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂。

但总体来说这几类造影剂的院里都是将金属复合物打入生物体内，其缺点 十分明显：一、不具有细胞/组织特异选择性；目前绝大多数造影剂都为外源金 属复合物，因此其并不具有组织或者细胞特异性。而当想要在体实时研究某一 类基因的表达，或者某一类细胞/组织分化发育过程时，现有造影剂无法完成这 一目的；二、穿透性差，具有生物毒性。现有造影剂由于大多为外源金属复合 物，因此其对于某些组织或者肿瘤穿透性较差，因此当遇到这一类组织或者肿 瘤时，造影剂的效果会有很大程度上的减弱。另外目前常用的许多造影剂都具 有很强的生物毒性，例如钆(Gadolinium)类螯合物，这一类造影剂为近几十年 来最常用的造影剂之一，但是这类金属螯合物造影剂会在大脑、肾脏、骨头等 组织中大量累积，并对机体产生很强的生物毒性；三、造影剂代谢较快，不适 合长时程的科研研究或者临床医学观察；现有造影剂在生物体内的代谢速率较 快，绝大多数都会在48-72h后降低至有效剂量一下，因此对于长时程连续或者 多次的观察成像，现有造影剂并不能满足。

综上所述，研究提供一种具有组织细胞特异性、穿透力强、无生物毒性的 新型核磁共振成像造影剂，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种小分子蛋白质及其应 用，所述

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种小分子蛋白质，所述小分子蛋白质的氨基酸序 列如SEQ ID NO.1所示。

所述SEQ ID NO.1如下所示：

MRRRQRASRAGVVARRATPGDAQANSGRAPARPFQSFVSNGAMLMNK QIVAGIVAGLVSMSSHAQLGQLFQSVKEQVTQAATSQVNQGVRSATDEAVQA TSSRTRKAINSVRSPSSAAAATSTSPSAAEETNDATLSEARK.

优选地，所述小分子蛋白质的亲和金属离子包括2价锰离子。

优选地，所述小分子蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述SEQ ID NO.2的序列如下：

ATGGGTGTAGTCGCACGAAGAGCTACACCCGGTGACGCACAAGCCAA CTCAGGTAGAGCTCCCGCCCGGCCATTTCAGTCTTTTGTGTCAAACGGAGC CATGCTGATGAACAAGCAAATTGTGGCTGGGATAGTTGCAGGTCTGGTCA GCATGTCCTCCCACGCACAGCTCGGTCAACTCTTCCAGTCTGTTAAGGAAC AGGTCACTCAGGCAGCAACCTCTCAGGTAAATCAAGGAGTAAGGTCCGCT ACTGACGAAGCCGTGCAAGCAACATCTAGTCGGACCAGAAAGGCCATTAA CAGTGTTAGGTCCCCCTCAAGCGCAGCAGCCGCTACTTCTACAAGCCCTTC TGCTGCCGAGGAGACTAATGACGCTACCCTGAGTGAGGCCCGCAAATAA.

其中，所述小分子蛋白质为小于15KD的蛋白质。

本发明中，发明人发现一种新型小分子蛋白质，命名为GEM，所述小分子 蛋白质特异性结合2价锰离子，能够开发基于结合2价锰离子的应用。

第二方面，本发明提供一种质粒，所述质粒包括第一方面所述的小分子蛋 白质的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供一种慢病毒，所述慢病毒通过第二方面所述的质粒 和辅助质粒共转染包装得到。

第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的小分子蛋白质、第二方面所 述的质粒或第三方面所述的慢病毒用于制备核磁共振成像造影剂的用途。

第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的小分子蛋白质、第二方面所 述的质粒或第三方面所述的慢病毒用于制备神经示踪剂的用途。

第六方面，本发明提供一种如第一方面所述的小分子蛋白质、第二方面所 述的质粒或第三方面所述的慢病毒用于制备检测基因表达的标记物的用途

本发明中，发明人通过深入研究临床核磁成像造影剂的发展现状，广泛总 结现有技术的优缺点，以基因工程为手段，发现了一种新型小分子蛋白，氨基 酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述小分子蛋白质能够作为一种经特殊改造的基 因编码的核磁共振成像造影剂，此基因序列在经慢病毒等方式介导在生物体内 表达，所表达的蛋白在生物体内能结合锰离子，由于锰是一种带有顺磁性的物 质，因此在核磁成像时能造成T1弛像时间的明显缩短，成像时相关部高信号。 所述小分子蛋白质作为一种T1类型的阳性造影剂，解决了目前常用核磁共振成 像造影剂的组织穿透性差、没有细胞/组织选择性、生物毒性强(金属造影剂) 等众多问题；能够高分辨率、实时、在体的检测基因表达、细胞分化个体发育 过程等，具有广阔的应用前景。

第七方面，本发明提供一种如第一方面所述的小分子蛋白的制备方法，包 括如下步骤：

(1)以GEM蛋白的核苷酸序列为基础，进行酶切连接，构建GEM质粒；

(2)将步骤(1)构建的质粒进行蛋白表达。

本发明中的质粒构建过程，可根据不同需要选择不同载体进行构建。

优选地，步骤(2)所述蛋白表达的方式包括将GEM质粒进行慢病毒包装 并感染细胞或注射组织。

优选地，步骤(2)所述蛋白表达的载体包括Hela细胞、大鼠脑组织或恒河 猴脑组织中的任意一种或至少两种的组合。

本发明的蛋白表达过程，可根据不同实验或临床需求，进行不同组织特异 性表达(或者非特异性表达)。

本发明以慢病毒介导分别在Hela细胞和大鼠脑组织的表达为例，但并不局 限于此；慢病毒包装、病毒细胞感染及脑内微量注射方法为常用通用技术在此 不做赘述。

作为优选技术方案，本发明提供一种如第一方面所述的小分子蛋白的制备 方法，具体包括如下步骤：

(1)以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示GEM蛋白的核苷酸序列为基础， 在其3’端和5’端以BamHI和EcoRI两种酶插入pUltra-Smurf载体，进行酶切连 接，构建GEM质粒；

(2)将步骤(1)构建的质粒进行慢病毒包装并感染细胞或注射组织，进 行蛋白表达。

步骤(1)中，为了更为方便的检测GEM的表达，在其3’端插入一段3xFlag tag序列，因此最终插入pUltra-Smurf的序列如SEQ ID NO.3所示：

SEQ ID NO.3：

GGATCCATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGAC ATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGATGGGTGTAGTCGCACGAAGAGC TACACCCGGTGACGCACAAGCCAACTCAGGTAGAGCTCCCGCCCGGCCAT TTCAGTCTTTTGTGTCAAACGGAGCCATGCTGATGAACAAGCAAATTGTGG CTGGGATAGTTGCAGGTCTGGTCAGCATGTCCTCCCACGCACAGCTCGGTC AACTCTTCCAGTCTGTTAAGGAACAGGTCACTCAGGCAGCAACCTCTCAG GTAAATCAAGGAGTAAGGTCCGCTACTGACGAAGCCGTGCAAGCAACATC TAGTCGGACCAGAAAGGCCATTAACAGTGTTAGGTCCCCCTCAAGCGCAG CAGCCGCTACTTCTACAAGCCCTTCTGCTGCCGAGGAGACTAATGACGCTA CCCTGAGTGAGGCCCGCAAATAAGAATTC.

目前现有核磁成像造影剂的技术有两种，第一是向生物组织注入纳米级金 属颗粒，另一种表达转铁蛋白基因，累积内源铁，由于铁的不同分布从而产生 MRI T2加权成像的对比信号；而这两种方案目前都有以下几点缺点：首先，纳 米金属颗粒的组织穿透性较差，并且没有组织特异选择性；其次，表达转铁蛋 白虽然具有组织特异选择性以及较好的组织选择性，但是铁类属于T2造影剂， 而T2造影剂的原理是降低信噪比，即在暗的基础上边的更暗，因此分辨率较差， 信号相对不明显。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的小分子蛋白质作为一种基因编码介导的T1类型的阳性 造影剂，在使用过程中可以根据不同组织/细胞选择不同的启动子进行特异性表 达，因此具有很强的组织/细胞特意选择性，解决了目前常用核磁共振成像造影 剂的组织穿透性差、没有细胞/组织选择性的问题；

(2)本发明所采用的基因序源自于对人人体无害的微生物，并且本发明已 经在啮齿类、非人灵长类动物中进行验证，并未发现其生物毒性；本发明属于 T1类造影剂，T1类型的造影剂原理为提高信噪比，因此成像分辨率较高,较T2 类造影剂效果更好；本发明可根据不同临床或科研需要人为加上不同的基因表 达“开关”元件，选择不同时间段的表达，代谢慢，适合长时程临床观察和科学研 究，因此解决了生物毒性强(金属造影剂)的问题，能够高分辨率、实时、在 体的检测基因表达、细胞分化个体发育过程等。

附图说明

图1为本发明的GEM在细胞内的表达情况图，其中，图1(A)为HeLa 细胞转染GEM后的Western blot结果；图1(B)为GEM在大鼠脑中表达情 况图；

图2(A)为Hela细胞表达GEM后的MRI扫描图；

图2(B)为细胞MRI信号强度柱状图；

图3(A)为GEM在大鼠脑组织表达的3T MRI T1冠状面扫描图；

图3(B)为GEM在大鼠脑组织表达的3T MRI T1水平面扫描图；

图3(C)为病毒注射与MRI结果对应图；

图4(A)为原有技术T2加权像；

图4(B)为本发明T1加权成像效果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过 具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范 围内。

实施例1质粒构建

本发明以pUltra-Smurf载体为例，其中GEM原始序列SEQ ID NO.2如下所 示：

ATGGGTGTAGTCGCACGAAGAGCTACACCCGGTGACGCACAAGCCAA CTCAGGTAGAGCTCCCGCCCGGCCATTTCAGTCTTTTGTGTCAAACGGAGC CATGCTGATGAACAAGCAAATTGTGGCTGGGATAGTTGCAGGTCTGGTCA GCATGTCCTCCCACGCACAGCTCGGTCAACTCTTCCAGTCTGTTAAGGAAC AGGTCACTCAGGCAGCAACCTCTCAGGTAAATCAAGGAGTAAGGTCCGCT ACTGACGAAGCCGTGCAAGCAACATCTAGTCGGACCAGAAAGGCCATTAA CAGTGTTAGGTCCCCCTCAAGCGCAGCAGCCGCTACTTCTACAAGCCCTTC TGCTGCCGAGGAGACTAATGACGCTACCCTGAGTGAGGCCCGCAAATAA

分别在其3’端和5’端以BamHI和EcoRI两种酶插入pUltra-Smurf载体，同 时为了更为方便的检测GEM的表达，在其3’端插入一段3xFlag tag序列，因此 最终插入pUltra-Smurf的序列为SEQ ID NO.3：

GGATCCATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGAC ATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGATGGGTGTAGTCGCACGAAGAGC TACACCCGGTGACGCACAAGCCAACTCAGGTAGAGCTCCCGCCCGGCCAT TTCAGTCTTTTGTGTCAAACGGAGCCATGCTGATGAACAAGCAAATTGTGG CTGGGATAGTTGCAGGTCTGGTCAGCATGTCCTCCCACGCACAGCTCGGTC AACTCTTCCAGTCTGTTAAGGAACAGGTCACTCAGGCAGCAACCTCTCAG GTAAATCAAGGAGTAAGGTCCGCTACTGACGAAGCCGTGCAAGCAACATC TAGTCGGACCAGAAAGGCCATTAACAGTGTTAGGTCCCCCTCAAGCGCAG CAGCCGCTACTTCTACAAGCCCTTCTGCTGCCGAGGAGACTAATGACGCTA CCCTGAGTGAGGCCCGCAAATAAGAATTC.

实施例2GEM在细胞内的表达

以实施例1得到的质粒与包装质粒进行包装慢病毒，感染Hela细胞；

病毒表达效果见图1(A)-图1(B)，图1(A)为HeLa细胞转染GEM后 的Western blot检测结果，图1(B)为大鼠脑内病毒表达情况，由图1(A)和 图1(B)可知，蛋白表达成功。

细胞内表达后进行MRI检测，结果如图2(A)和图2(B)所示；

由图2(A)和图2(B)所示，对细胞进行MRI T1加权像扫描，GEM在 Hela细胞内表达成功，且MRI信号强度明显高于对照组。

实施例3GEM在组织内的表达

将包装好的慢病毒进行大鼠脑内病毒微量注射，步骤如下：

脑内病毒微量注射：本实施例选择大鼠纹状体脑区进行验证(纹状体这一 核团相对比较大，比较均一，各向同性比较好，其他脑区也可以作为实验脑区)； 成年大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后，将大鼠俯卧固定于立体定位上，头皮正 中切开并分离骨膜，根据大鼠脑图谱中纹状体核团的位置(A/P 0.6，M/L 3.0， D/V 5.2)用颅钻在颅骨开一小孔，用10uL微量注射针向纹状体脑区缓慢注射 2000nL的慢病毒，进样速度100nL/min，注射完毕后，停针5min，缓慢移除针 头。

实施例4MRI扫描检测

将实施例3表达后的大鼠脑组织进行MRI扫描检测，在病毒注射后5-6周 后，对大鼠进行麻醉后进行MRI(uMR790,Shanghai United Imaging Healthcare)扫 描，采用立体像素分辨率为0.25*0.25*1.5mm的三维磁化强度预备梯度回波序 列，采集大鼠全脑冠状面、水平面的T1加权图像，每个面扫描4-6分钟；结果 见图3(A)-图3(C)，由于本发明GEM表达后能结合锰离子，锰离子为顺磁 性物质，因此MRI扫描时采集T1加权像，其中图3(A)为的大鼠脑补冠状面 扫描结果，图3(B)为大鼠脑部水平面扫描结果，图3(C)为病毒注射与MRI结果对应图，慢病毒采用表达性较强的泛素启动子Ub，其中Amcyan为荧光蛋 白标签，用于检测病毒的表达，图中病毒左侧为对照；结果表明，本发明GEM 可以在T1加权像上产生高信号，MRI的信号和病毒表达的信号是重合的。

将本发明与成像效果与原有技术T2加权成像对比检测，结果如图4(A)- 图4(B)所示，其中，图4(A)为原有技术T2加权像，图4(B)本发明T1 加权成像效果图，由图4(A)-图4(B)可知，与原有技术相比，本发明的分 辨率更高，检测结果更直观清晰。

综上所述，本发明提供的小分子蛋白为特殊改造的基因编码的核磁共振成 像造影剂，在生物体内表达后，在核磁成像时能造成T1弛像时间的明显缩短， 成像时相关部高信号，解决了目前常用核磁共振成像造影剂的组织穿透性差、 没有细胞/组织选择性、生物毒性强(金属造影剂)等众多问题，能够高分辨率、 实时、在体的检测基因表达、细胞分化个体发育过程等，具有广阔的应用前景 和巨大的市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明 并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。 所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原 料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范 围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种小分子蛋白质，其特征在于，所述小分子蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的核酸序列编码的序列。

2.一种质粒，其特征在于，所述质粒包括权利要求1所述的小分子蛋白质的编码 核苷酸序列。

3.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒通过权利要求2所述的质粒和辅助质粒共转染包装得到。

4.一种如权利要求所述1所述的小分子蛋白质、权利要求2所述的质粒或权利要求3所述的慢病毒用于制备核磁共振成像造影剂的用途。

5.一种如权利要求1所述的小分子蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以GEM蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO.2为基础，进行酶切连接，构建GEM质粒；

(2)将步骤(1)构建的质粒进行蛋白表达。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述蛋白表达的方式包括将GEM质粒进行慢病毒包装并感染细胞或注射组织。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述蛋白表达的载体包括Hela细胞、大鼠脑组织或恒河猴脑组织中的任意一种或至少两种的组合。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)以GEM蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO.2为基础，在其3’端和5’端以BamHI和EcoRI两种酶插入pUltra-Smurf载体，进行酶切连接，构建GEM质粒；

(2)将步骤(1)构建的质粒进行慢病毒包装，并进行蛋白表达。

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