JP2006504403A - 植物チミジンキナーゼおよびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
Hemayet Ullah, Dominique Robertson, and Roger C. Fites: A Gene for Thymidine Kinase in Plants (Accession No. AF066050; Plant gene register PGR99-048) Plant Physiol. 1999 119 1567
第1の実施態様において、本発明は、チミジンキナーゼ(TK)酵素活性を有する新規のタンパク質を提供し、前記タンパク質は植物に由来する。より詳細には、新規の植物チミジンキナーゼ酵素は、種子植物(Spermatophyta),特にマツ (Pinus taeda), トマト (Lycopersicum esculentum), コメ (Oryza sativa), 及び(又は) シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)に由来する。
CLUSTAL W(1.82)マルチプルアミノ酸配列アライメント
*保存された残基を示す。
:保存性の高い残基を示す。
.保存性の低い残基を示す。
Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gln Phe Phe (モチーフ I)
Val Ala Gly Leu Asp Gly (モチーフII)
Tyr Met Pro Val Cys Arg (モチーフIII)
別の好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素は、下記のLid領域を含む。
より好ましい別の実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素は、SEQ ID NO:2として、SEQ ID NO:4として、SEQ ID NO:5として、SEQ ID NO:7として、SEQ ID NO:9として、SEQ ID NO:11として、もしくはSEQ ID NO:13として表されるアミノ酸配列、またはSEQ IDの全長にわたって判定した場合に、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%の同一性、最も好ましくは少なくとも98%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
異なる植物を起源とするチミジンキナーゼのタンパク質配列のBLASTP比較
マツ(Pinus taeda)チミジンキナーゼ
トマト(Lycopersicum esculentum)チミジンキナーゼ
コメ(Oryza sativa)チミジンキナーゼ
シロイヌナズナ (Arabidopsis thaliana)チミジンキナーゼ(a)および(b)
好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素は、マツに由来し、SEQ ID NO:2に示した配列に対して、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の配列同一性を少なくとも有する。
最も好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素は、SEQ ID NO:2として、SEQ ID NO:4として、SEQ ID NO:5として、SEQ ID NO:7として、SEQ ID NO:9として、SEQ ID NO:11として、あるいはSEQ ID NO:13として示されるアミノ酸配列またはその機能的アナログを含む。
(i)アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニンまたはトリプトファンなどの1つの非極性または疎水性残基による別のものの置換、特に、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンまたはプロリンによる別のものの置換。
(iv)アスパラギン酸やグルタミン酸などの負に荷電した残基による別のものの置換。
他の実施形態において、本発明は親(野生型)酵素と比べた場合に、C末端が欠失した植物チミジンキナーゼ酵素を提供する。このような切断された酵素は、例えば部位特異的変異や、実施例に記載したような従来の技術によって得ることができる。
N末端欠失、特に、AT−TK1b(SEQ ID NO:13)の、N末端22アミノ酸残基の欠失およびN末端45アミノ酸の欠失、またはN末端63アミノ酸の欠失についても考える。これらのアミノ酸は、推定オルガネラシグナルペプチドを構成する。実施例4(表8)で証明されたように、これらのN末端アミノ酸の欠失は、AZTに対するLD100を減少させる。
他の実施態様において、本発明はマツ、トマト、コメまたはシロイヌナズナに由来する植物チミジンキナーゼ酵素、好ましくは上述の植物チミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
好ましい実施形態において、本発明の単離ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1として、SEQ ID NO:3として、SEQ ID NO:6として、SEQ ID NO:8として、SEQ ID NO:10として、SEQ ID NO:12表されるポリヌクレオチド配列、またはそれらの相補鎖とハイブリダイズすることができる。
他の好ましい実施形態において、本発明の単離ポリヌクレオチドは、SEQ ID NOの全長にわたって判定した場合に、SEQ ID NO:1として、SEQ ID NO:3として、SEQ ID NO:6として、SEQ ID NO:8として、SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:12として表されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも73%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の同一性を有する。本発明のために、配列同一性の百分率は、BLASTNが少なくとも100ヌクレオチドの重複範囲を与えた場合に算出され、該範囲はデフォルト設定において決定される。より好ましくは、重複範囲は少なくとも150ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも225ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも300ヌクレオチドである。
異なる植物起源のチミジンキナーゼのヌクレオチド配列のBLASDTN比較
*N末端とC末端断片に分割
◇有意な類似性見られず
マツ(Pinus taeda)チミジンキナーゼ
トマト(Lycopersicum esculentum)チミジンキナーゼ
コメ(Oryza sativa)チミジンキナーゼ
シロイヌナズナチミジンキナーゼ(a)および(b)
類似DNA配列
その最も好ましい実施形態において、本発明の単離ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1として、SEQ ID NO:3として、SEQ ID NO:6として、SEQ ID NO:8として、SEQ ID NO:10として、またはSEQ ID NO:12として表されるポリヌクレオチド配列、またはその機能的アナログを含む。
第3の実施態様において、本発明は、本発明の単離ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモータとを含む組換え発現ベクターを提供する。
第4の実施態様において、本発明は、感染性ビリオンを産生することのできるパッケージング細胞株を提供し、該細胞株は本発明のベクターを含む。
第5の実施態様において、本発明は、本発明の単離ポリヌクレオチド、または本発明の発現ベクターを含む単離宿主細胞を提供する。
第6の実施態様において、本発明は、治療上有効な量の本発明の植物チミジンキナーゼ酵素または本発明の宿主細胞と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む新規の薬学的調合物に関する。
ポリヌクレオチドおよびタンパク質、ポリペプチド、ペプチド断片またはそれらから製造される誘導体、ならびにそのようなタンパク質、ペプチドまたは誘導体に対する抗体に関する本発明は、ヒトを含む動物生体の疾患または疾病を治療または緩和するために用いることができ、前記疾患または疾病は、細胞毒物質の活性に応答する。
(i)細胞に、前記プロドラッグの(細胞毒)薬物への変換を促進する植物チミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を用いてトランスフェクションまたは形質導入するか、何らかの方法で細胞内に植物チミジンキナーゼを運搬する工程と、(ii)前記プロドラッグを前記標的細胞内に運搬する工程とを含み、前記標的細胞は前記プロドラッグよりも前記(細胞毒)薬物により感受性が高い。
本発明のチミジンキナーゼをコードする遺伝子の最も重要な用途の一つとして、細胞および遺伝子に基づく治療における自殺系としての用途がある。哺乳動物に対するあらゆるタイプの細胞および遺伝子治療において、移植細胞または遺伝子治療によって形質導入された細胞を不可逆的に殺すことのできる系が必要とされる。
本発明のチミジンキナーゼ酵素には、治療およびバイオテクノロジー用途を含む様々な利用性が考えられる。
i)前記ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素を作用させる工程と、
ii)リン酸化されたヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを回収する工程とを含む。
本発明のチミジンキナーゼ酵素は、植物の成長を改変または制御するための方法における利用性も見いだされている。したがって、さらなる実施態様において、本発明は、植物の成長を改変または制御するための方法に関し、前記植物は、本発明の植物チミンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞を含み、前記方法は、植物または植物細胞をヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログ、好ましくはAZTに曝露する工程を含む。植物チミジンキナーゼの未知の特性、特に本発明に記載したような特性の発見によって、本発明者らは、ヌクレオシドアナログを除草剤として使用することを企図している。植物チミジンキナーゼは、ヌクレオシドアナログを非常に高速で毒性物質に変換するため、ヌクレオシドアナログは、これらのチミジンキナーゼを天然または異種遺伝子として有する植物に対する除草剤として使用することができる。本発明のチミジンキナーゼを、これらの特性を有するチミジンキナーゼを持たない植物に導入することにより、この植物をヌクレオシドアナログ、特にAZTに対して感受性にする。
本発明を添付の図面によって更に説明する:
図1は、それぞれAT−TK1a(■)、AT−TK1b(●)およびHSV1−TK(▼)のdTMPキナーゼ活性(CPM)の経時変化(0〜120分)を示す。
植物キナーゼを発現するレトロウィルスベクターの構築
植物キナーゼのcDNAをモロニーマウス白血病(MLV)ウィルスに基づくレトロウィルスベクター中にクローニングして、TK1キナーゼを含む複製欠失組換えレトロウィルスを作成した。
5’ ccg ctc gag atg gcg act ctc aaa gct tcc ttt ttg 3’ (AT TK1-for; SEQ ID NO: 14);
5’ cgc gga tcc tta gat tgt agc agc aac aca gga ttc 3’ (AT TK1-rev; SEQ ID NO: 15);
5’ cgc gga tcc tta aac aat atg att agt gat gta atg ctt g 3’ (AT TK1 DC; SEQ ID NO: 16);
5’ gga aga tct tta gac aga ttg tcc att aac ata gtg ctg 3’ (T TK1 DC; SEQ ID NO: 17);
5’ gga aga tct tta tgg atc aac tag tgg tga ttc taa g 3’ (T TK1-rev; SEQ ID NO: 18); and
5’ ccg ctc gag atg gct ttt tca tca tct gct aga aac 3’ (T TK1-for; SEQ ID NO: 19).
比較のために、ヒトI型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV1−TK)に対する発現プラスミドも構築した。ヒトHSV1に由来するチミジンキナーゼを、プライマー
5’ tat agg atc cgc cac cat ggc ttc gta ccc cgg c 3’ (HSV1-TK - for; SEQ ID NO: 20); 及び
5’ tat act cga gga ggt cga ctc agt tag cc 3’ (HSV1-TK - rev; SEQ ID NO: 21);
を用いて、また鋳型としてKarreman [Karreman C; Gene1998 218 57-62]によって記載されたプラスミドpCMV-pacTKを用いて増幅した。
グリア芽腫U−87MG(ATCC HTB−14)およびグリア芽腫U−118MG(ATCC HTB−15)細胞を、American Type Culture Collectionより購入した。すべての細胞を、最小必須培地、E−MEM M(Bio Whittaker Cat.No.12−611)中で、10%(v/v)オーストラリア原産のウシ胎仔血清(Bio Whittaker Cat.No.14−701)および1mL/Lのゲンタマイシン(Bio Whittaker Cat.No.17−518L)とともに培養した。細胞を5%CO2の気相を有した加湿したインキュベータ中、37℃で培養した。
細胞を1ウェルあたり1500〜2500個となるように、ポリ−L−リジンでコートした96ウェルプレート上にプレーティングした。24時間後、AZT(3’−アジド−3’−デオキシチミジン;Sigmaより市販)を添加したところ、ヌクレオシドアナログを含有する培地は変化しなかった。
(式中、dIは、XTTアッセイによって判定される阻害剤濃度における細胞増殖を示し;
Maxは、XTTアッセイによって判定される最大細胞増殖であり;
[I]は、阻害剤濃度を表し、
IC50(50%増殖阻害濃度)は、細胞増殖を50%阻害する用量を表す。)
AZTに対する感受性が向上した植物キナーゼの発現
非形質導入細胞の感受性と、レトロウィルスベクター単独またはAZTに対する植物キナーゼを含むベクターのいずれかで形質導入された細胞の感受性を判定した。
グリア芽腫細胞株のAZT(mM)に対する感受性(IC 50 )
50%の致死率をもたらす濃度を各構築物および親細胞株について示す。感受性増加率は親細胞株と比較したものである。
チミジンキナーゼのクローニング
本実施例では、本発明のトマト、マツ、コメおよびシロイヌナズナチミジンキナーゼをコードする遺伝子の同定の仕方、ならびに、様々なチミジンキナーゼを発現するためのベクターの構築の仕方について説明する。
トマトチミジンキナーゼのORFを下記のプライマー、5’ CGC GGA TCC ATG GCT TTT TCA TCA TCT GCT AGA AAC CCA GTT GAC CTG AG 3’ (1MS TOTK1-B; SEQ ID NO: 22)および
5’ CCG GAA TTC TTA TGG ATC AAC TAG TGG TGA TTC TAA G 3’ (2MS TOTK1-E; SEQ ID NO: 23)を用いて、また鋳型としてACCN BG129197を含有するプラスミドを用いてPCRにより増幅した。
(シロイヌナズナチミジンキナーゼ(AT−TK1a))
シロイヌナズナ由来のTK1aのORF(アクセッション番号:AAF13097)を下記のプライマーを用いてcDNAライブラリー(Stragene)より増幅した; 5' CGC GGA TCC ATG GCG ACT CTC AAA GCT TCC TTT TTG ATC AAA ACC C 3' (1msAtTK1-B; SEQ ID NO: 24); 及び
5' CCG GAA TTC TTA GAT TGT AGC AGC AAC ACA GGA TTC AGC 3' (2msAtTK1-E; SEQ ID NO: 25)。
(シロイヌナズナチミジンキナーゼ(AT−TK1b))
シロイヌナズナ由来のTK1aのORF(アクセッション番号:BAB09824)を以下のような戦略を用いてcDNAライブラリー(Stragene)より増幅した。この場合、AT−TK1bのいくつかのN末端欠失変異体も得られた。
5’ ATG AGA ACA TTA ATC TCA CCA TCT C 3’ (1mtAtTK1L; SEQ ID NO: 26); 及び 5’ CTA AAG TGA ACT TGC TAC AAC ACT ATG 3’ (2mtAtTK1L; SEQ ID NO: 27)。
5’ CGC GGA TCC atg aga aca tta atc tca cca tct c 3’ (1mtAtTK1L-B; SEQ ID NO: 28); 及び
5’ CCG GAA TTC CTA AAG TGA ACT TGC TAC AAC AC 3’ (2mtAtTK1-E; SEQ ID NO: 29)。
5’ CGC GGA TCC tcc acc gct ctt cgc ttc tcc 3’(1mtAtTK1I-B; SEQ ID NO: 30); 及び
2mtAtTK1-E (SEQ ID NO: 29)。
5’ CGC GGA TCC tcc acc aga aag cta caa acg 3’(1mtAtTK1-B; SEQ ID NO: 31); 及び2mtAtTK1-E (SEQ ID NO: 29)。
5’ CGC GGA TCCcag ccg ctc tcc tcc tca tc 3’ (1mtATTK1S-B; SEQ ID NO: 32); and
2mtAtTK1-E (SEQ ID NO: 29)。
コメ由来のチミジンキナーゼをプライマー
5' CGG GAT CCG GCG GCG GCG GCG GAC AAG TCT CG 3' (1osTK1s-B; SEQ ID NO: 33); 及び
5' CGG AAT TCT TAC TTG AAA GCA TGG ATA ACC TTG G 3' (2osTK1-E; SEQ ID NO: 34)を用いて、また鋳型としてD24903を用いて増幅した。
HSV1由来のチミジンキナーゼはプライマー
5' CGC GGA TCC ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT C 3' (HSV1-for A; SEQ ID NO: 35); 及び
5' CCG GAA TTC TTA GTT AGC CTC CCC CAT CTC CCG 3' (HSV1-rev; SEQ ID NO: 36)を用いて、また鋳型としてKarreman [Karreman C; Gene1998 218 57-62]に記載のプラスミドpCMV-pacTKを用いて増幅した。
組換え型チミジンキナーゼの発現と精製
本実施例では、チミジンキナーゼを発現させるための、実施例2で得られたプラスミドによるKY895の形質転換の仕方について説明する。
25℃にて0.1mM IPTGで4時間誘導したKY895細胞の抽出物中のデオキシリボヌクレオシドキナーゼ活性
組換え型(r)植物キナーゼについてのThdに対する速度と基質濃度の関係
**Kokoris M S and Black M E: Characterization of Herpes Simplex Virus type 1 thymidine kinase mutants engineered for improved ganciclovir or acyclovir activity; Protein Science 2002 112267-2272からのデータ
表7
組換え型植物キナーゼについてのAZTに対する速度と基質濃度の関係
rTOM-TK1 1.07
rAT-DN45TK1b 0.06
rAT-TK1a 0.08
rHSV1-TK 72.7
例4
ヌクレオシドアナログプレート上での形質転換大腸菌KY895の成長
本実施例では、実施例2に従って得られたプラスミドにより形質転換された宿主細胞が、ヌクレオシドアナログAZT(3’−アジド−3’−デオキシチミジン)の存在下において、どのようにしてプレート上で成長できるかについて説明する。
AZT存在下におけるKY895細胞の増殖
pGEX−2T−Dm−dNKは、ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)由来の多基質デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を含むベクターであり、Munch-Petersen 等 [Munch-Petersen B, Knecht W, Lenz C, Sondergaard L, Piskur J: Functional expression of a multisubstrate deoxyribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster and its C-terminal deletion mutants; J. Biol. Chem. 2000 275 6673-6679]Knecht等に記載されている;
pGEX−2T−Bm−dNKは、カイコ(Bombyx mori)由来のデオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を含むベクターであり、Knecht 等 [Knecht W, Ebert Petersen G, Munch-Petersen B, Piskur J: Deoxyribonucleoside kinases belonging to the thymidine kinase 2 (TK2) -like group vary significantly in substrate specificity, kinetics and feed-back regulation ; J. Mol. Biol. 2002 315529-540]によって記載されている;
pGEX−2T−hu TK1は、ヒトチミジンキナーゼ(TK1)をコードする遺伝子を含むベクターであり、Berenstein 等 [Berenstein D, Christensen J F, Kristensen T, Hofbauer R, Munch-Petersen B: Valine, not methionine, is amino acid 106 in human cytosolic thymidine kinase (TK1). Impact on oligomerization, stability, and kinetic properties; J. Biol. Chem. 2000 275(41) 32187-32192]に記載されている。
TK選択プレート上でのTK活性の試験
本実施例では、実施例2に記載したプラスミドで形質転換したKY895細胞を用いたチミジンキナーゼ活性の測定について説明する。
TK選択プレート上の増殖
−増殖なし
n.d.検出されず
本実施例は、すべての酵素がチミジンをリン酸化できることを実証している。
ヌクレオシドモノホスフェートからヌクレオシドジホスフェートへのリン酸化
モノホスフェートキナーゼ活性は、本質的にMunch-Petersen 等.; J. Biol. Chem. 1998 273 7 3926-3931に記載されているように、チミジンキナーゼによって触媒される反応の生成物を測定することにより調べた。
Claims (46)
- 植物由来の植物チミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチドであって、該単離ポリヌクレオチドが、
i)マツ(Pinus taeda)、コメ(Oryza sativa)またはトマト(Lycopersicum esculentum)に由来するチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド、
ii)ヒトI型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV1−TK)と比べた場合、そして真核細胞に形質導入するとすぐに、少なくとも1つのヌクレオシドアナログのIC50を少なくとも4倍減少させる、植物由来のチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド、
iii)少なくとも1つのヌクレオシドアナログモノホスフェートを、チミジンモノホスフェートよりも高度にリン酸化することのできる、植物由来のチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド、
iv)[kcat/Km(Thd)]/[kcat/Km(少なくともヌクレオシドアナログ)]の比率が2より小さい、植物由来のチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド、
v)発現し、そしてヒトI型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV1−TK)と比べた場合、[kcat/Km(Thd)]/[kcat/Km(少なくとも1つのヌクレオシドアナログ)]の比率が少なくとも5倍減少し、その際該アナログが任意のヌクレオシドアナログである、植物に由来するチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド、及び
vi)ヒトI型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV1−TK)と比べた場合、そして真核細胞に形質導入するとすぐに、少なくとも1つのヌクレオシドアナログのIC50を少なくとも4倍減少させる、植物由来のチミジンキナーゼ酵素変種をコードする単離された変異及び(又は)切断ポリヌクレオチドより成る群から選ばれる、上記単離ポリペプチド。 - シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のチミジンキナーゼ酵素をコードする、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つのヌクレオシドアナログモノホスフェートが、AZTモノホスフェートであること、及び(又は)少なくとも1つのヌクレオシドアナログがAZTである、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下において、SEQ ID NO:1として、SEQ ID NO:3として、SEQ ID NO:6として表されるポリヌクレオチド配列またはその相補鎖とハイブリダイズできる、請求項1記載の単離ポリヌクレオチド。
- SEQ ID NOの全長にわたって判定した場合に、SEQ ID NO:1として、SEQ ID NO:3として、またはSEQ ID NO:6として表されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも73%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の同一性を有する、請求項4記載の単離ポリヌクレオチド。
- SEQ ID NO:1として、SEQ ID NO:3として、SEQ ID NO:6として表されるポリヌクレオチド配列またはその機能的アナログを含む、請求項1〜5のいずれか1つに記載の単離ポリヌクレオチド。
- 単離植物チミジンキナーゼ酵素であって、
i)請求項1〜6のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドによってコードされる単離チミジンキナーゼ、
ii)マツ(Pinus taeda)、トマト(Lycopersicum esculentum)またはコメ(Oryza sativa)に由来する、単離植物チミジンキナーゼ酵素、
iii)真核細胞内のヒトI型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV1−TK)と比べた場合、少なくとも1つのヌクレオシドアナログのIC50を少なくとも4倍減少させる、単離植物チミジンキナーゼ酵素、
iv)少なくとも1つのヌクレオシドアナログモノホスフェートを、チミジンモノホスフェートよりも高度にリン酸化することのできる、植物由来の単離チミジンキナーゼ酵素、
v)[kcat/Km(Thd)]/[kcat/Km(少なくとも1つのヌクレオシドアナログ)]の比率が2より小さい、植物由来の単離チミジンキナーゼ酵素、
vi)発現し、そしてヒトI型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV1−TK)と比べた場合、[kcat/Km(Thd)]/[kcat/Km(少なくとも1つのヌクレオシドアナログ)]の比率が少なくとも5倍減少し、該アナログが任意のヌクレオシドアナログである、植物由来の単離チミジンキナーゼ酵素、及び
vii)ヒトI型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV1−TK)と比べた場合、そして真核細胞に形質導入するとすぐに、少なくとも1つのヌクレオシドアナログのIC50を少なくとも4倍減少させる、植物由来の単離された変異及び(又は)切断チミジンキナーゼ酵素変種、
より成る群から選ばれる、上記単離植物チミジンキナーゼ酵素。 - シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)に由来する、請求項7記載の単離チミジンキナーゼ。
- 少なくとも1つのヌクレオシドアナログモノホスフェートがAZTモノホスフェートであり、及び(又は)少なくとも1つのヌクレオシドアナログがAZTである、請求項7記載の植物チミジンキナーゼ。
- 下記の3つのモチーフ/領域の1種以上を含む、請求項7〜9のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ:
Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gln Phe Phe(モチーフI)
Val Ala Gly Leu Asp Gly(モチーフII)
Tyr Met Pro Val Cys Arg(モチーフIII)
Val A1 Lys Leu A2 A3 Arg Cys Glu A4(Lid領域)(式中、A1はThrおよびValから選択され、A2はThrおよびLysから選択され、A3はAlaおよびSerから選択され、A4はLeuおよびValから選択される)。 - 表1中で同定される保存性残基のすべてを含む、請求項7〜10のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ。
- SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、もしくはSEQ ID NO:13のアミノ酸配列、またはその全長にわたって判定した場合に、これらの配列のいずれかと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項7〜11のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ。
- SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11もしくはSEQ ID NO:13のアミノ酸配列またはその機能的アナログを含む、請求項7〜12のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ。
- 1〜60のアミノ酸残基、好ましくは1〜50のアミノ酸残基、より好ましくは1〜40のアミノ酸残基、より好ましくは1〜30のアミノ酸残基、さらに好ましくは1〜26のアミノ酸残基、最も好ましくは1〜24のアミノ酸残基のオーダーでC末端欠失を有する、請求項7〜13のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ。
- 26アミノ酸残基のC末端欠失を有する(SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有する)トマト由来のチミジンキナーゼ酵素である、請求項14記載の植物チミジンキナーゼ。
- 24アミノ酸残基のC末端欠失を有する(SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する)シロイヌナズナ由来のチミジンキナーゼ酵素である、請求項14記載の植物チミジンキナーゼ。
- マツに由来し、SEQ ID NO:2として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の同一性を示す、請求項7〜16のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ。
- トマトに由来し、SEQ ID NO:4として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の同一性を示す、請求項7〜16のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ。
- コメに由来し、SEQ ID NO:7として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の同一性を示す、請求項7〜16のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ。
- シロイヌナズナに由来し、SEQ ID NO:9として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の同一性を示す、請求項7〜16のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ。
- シロイヌナズナに由来し、SEQ ID NO:11として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の同一性を示す、請求項7〜16のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ。
- シロイヌナズナに由来し、SEQ ID NO:13として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%の同一性を示す、請求項7〜16のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ。
- ヒトI型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV1−TK)由来のチミジンキナーゼの作用と比べた場合に、少なくとも1つのヌクレオシドアナログの致死量(LD100)を少なくとも3倍減少させる、請求項7〜22のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ。
- 請求項1〜6のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド及び、該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモータを含む、ベクター構築物。
- ウィルスベクター、特に単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルス関連ウィルスベクター、レンチウィルスベクター、レトロウィルスベクターまたはワクシニアウィルスベクターである、請求項24記載のベクター構築物。
- 請求項24又は25記載のベクターを含む感染性ビリオンを産生することのできる、パッケージング細胞株。
- 請求項1〜6のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、または請求項24又は25記載のベクターを含む、宿主細胞。
- ヒト細胞、イヌ細胞、サル細胞、ラット細胞またはマウス細胞である、請求項27記載の宿主細胞。
- 請求項7〜23のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ酵素及び薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含む、薬学的調合物。
- 請求項1〜6のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドまたは請求項24又は25記載のベクター及び薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含む、薬学的調合物。
- 請求項26記載のパッケージング細胞株または請求項27又は28記載の宿主細胞及び薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含む、薬学的調合物。
- 細胞をプロドラッグに対して感作させる方法であって、当該方法が、
(i)該細胞を、該プロドラッグの(細胞毒)薬物への変換を促進する植物チミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を用いてトランスフェクションまたは形質導入する工程及び
(ii)該プロドラッグを該細胞に運搬する工程を含み、
その際、該細胞が該プロドラッグに対するよりも該(細胞毒)薬物に対して高い感受性を有することを特徴とする、上記方法。 - 植物チミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列が、請求項1〜6のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド配列である、請求項32記載の方法。
- プロドラッグがヌクレオシドアナログである、請求項32又は33記載の方法。
- ヌクレオシドアナログがAZT(3’-アジド-3’-デオキシチミジン)である、請求項34記載の方法。
- 温血動物において病原性物質を阻害する方法であって、該動物に請求項1〜6のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、または請求項24〜25のいずれか1つに記載のベクターを投与することを含む、上記方法。
- 該ポリヌクレオチド配列または該ベクターが生体内に投与される、請求項36記載の方法。
- 該病原性物質がウィルス、細菌または寄生虫である、請求項36又は37記載の方法。
- 該病原性物質が腫瘍細胞である、請求項36又は37記載の方法。
- 該病原性物質が自己反応性免疫細胞である、請求項36又は37記載の方法。
- 該温血動物にヌクレオシドアナログを投与する工程をさらに含む、請求項36〜40のいずれか1つに記載の方法。
- 該ヌクレオシドアナログがAZT(3’-アジド-3’-デオキシチミジン)である、請求項41記載の方法。
- ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログのリン酸化のために、請求項7〜23のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ酵素を使用する方法。
- ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログをリン酸化する方法であって、
i)ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに、請求項7〜23のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ酵素を作用させる工程及び、
ii)リン酸化されたヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを回収する工程を含む、
上記方法。 - 請求項7〜23のいずれか1つに記載の植物チミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞を含む植物の成長を制御または改変する方法であって、当該方法が該植物または植物細胞をヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに曝露する工程を含む、上記方法。
- ヌクレオシドアナログと請求項7〜23のいずれか1つに記載のチミジンキナーゼ、または前記植物由来のチミジンキナーゼをコードする遺伝子、または前記植物由来チミジンキナーゼをコードする前記遺伝子を含むベクターを、癌治療において、同時、分割または連続投与のための組み合わせとして含む、製品。
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