DE69924003T2

DE69924003T2 - Medizinische verwendung eines gens und eines vektors, der eine multisubstrat-desoxyribonukleosidase kodiert

Info

Publication number: DE69924003T2
Application number: DE69924003T
Authority: DE
Inventors: Anna Karlsson; Magnus Johansson
Original assignee: ZGene AS
Current assignee: ZGene AS
Priority date: 1998-12-11
Filing date: 1999-12-10
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2019-12-11
Also published as: EP1137764B1; EP1137764A1; ATE290071T1; AU2018500A; AU778376B2; ES2239475T3; WO2000036099A1; US6582947B1; JP2002532090A; SE9804298D0; DE69924003D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das für eine Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase von Drosophila melangoaster kodiert, und Vektoren und rekombinante Viren, die das Gen umfassen, ebenso wie pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen solchen Vektor und/oder einen Virus umfassen. Die Erfindung betrifft zudem die Herstellung der Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase und ein Verfahren zur Phosphorylierung von Nucleosiden und Nucleosidanaloga.
Technischer Hintergrund
Nucleosidanaloga werden allgemein bei der Behandlung von Virusinfektionen und Krebs verwendet. Die therapeutischen Nucleosidanaloga sind inaktive Pro-Pharmaka, deren pharmakologische Aktivität von intrazellulärer Phosphorylierung abhängt. Die meisten der klinisch verwendeten Nucleosidanaloga werden durch Desoxyribonucleosidkinasen (Arnér et al., (1995) Pharmac. Ther. 67, 155–186) phosphoryliert. Diese Enzyme werden intensiv untersucht, da sie den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt bei der pharmakologischen Aktivierung der Nucleosidanaloga katalysieren. In humanen Zellen gibt es vier Haupt-Desoxyribonucleosidkinasen: Desoxycytidinkinase (dCK), Desoxyguanosinkinase (dGK), Thymidinkinase 1 (TK1) und Thymidinkinase 2 (TK2) (1995) Pharmac. Ther. 67, 155–186). DCK, dGK und TK2 sind eng sequenzverwandte Enzyme, wohingegen TK1 mit den anderen Desoxyribonucleosidkinasen (Johansson et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 7258–7262; Johansson et al., (1997) J. Biol. Chem. 272, 8454–8458; Chottiner et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 1531–1535) eine geringe Ähnlichkeit aufweist. Die menschlichen Desoxyribonucleosidkinasen weisen hinsichtlich der Phosphorylierung sowohl der Desoxyribonucleoside als auch der Nucleosidanaloga ausgeprägte Substratspezifitäten auf.
WO95/14102 offenbart rekombinante Adenoviren, die eine DNA-Sequenz umfassen, die für Herpes-simplex-Thymidinkinase kodiert, wobei dies unter der Kontrolle eines heterologen Expressionssignals stattfindet, das mit einer bestimmten Form von Krebs in Zusammenhang gebracht werden kann. Diese rekombinanten Viren werden dann zur Infizierung von Tumoren eines solchen Krebses verwendet. Als Ergebnis wird Thymidinkinase in dem Krebstumor exprimiert. Anschließend wird ein therapeutisches nucleosidanaloges Pro-Pharmakon, wie zum Beispiel Acyclovir (ACV, 9-(Hydroxy ethoxymethyl)guanin) und Gancyclovir (GCV) verabreicht. Aufgrund der verbesserten Exprimierung der Thymidinkinase in dem Tumor wird das Pro-Pharmakon nur in die aktive Form in dem Tumor umgewandelt, was zum Absterben des Tumors führt. Die Fähigkeit der Thymidinkinase, potentiell nützliche nucleosidanaloge Pro-Pharmaka zu phosphorylieren, ist begrenzt.
Auch die WO97/29196 betrifft rekombinante Adenoviren, die eine DNA-Sequenz umfassen, die für Herpes-simplex-Thymidinkinase (HSV-TK) kodiert. Die Kinase wird zur Erhöhung der Phosphorylierungsgeschwindigkeit und zur Erweiterung der Substratspezifität mutiert.
WO96/21724 offenbart rekombinante Viruspartikel, wie zum Beispiel rekombinante Retroviren, die RNA umfassen, die für menschliche Desoxycytidinkinase 2 kodiert. Diese Viruspartikel werden für dieselben Zwecke verwendet wie die in der WO97/29196 und WO95/14102 beschriebenen Viruspartikel, jedoch weist das Enzym eine andere Substratspezifität auf.
Dementsprechend ist das Einbringen einer "Suizid"-Nucleinsäurensequenz, wie zum Beispiel einer Nucleinsäuresequenz, die für eine Nucleosidkinase kodiert, in das Genom eines Virus oder einer anderen Art eines Vektors, der in der Lage ist, Nucleinsäuresequenzen in Tumorzellen eines menschlichen oder tierischen Patienten zu übertragen, und die nachfolgende Verabreichung eines therapeutischen nucleosidanalogen Pro-Pharmaka bekannt. Bekannte Nucleosidkinasen weisen eine beschränkte Substratspezifität auf. HSV-TK, das in den obenstehend genannten WO97/29196 und WO95/14102 beschrieben ist, kann 2',2'-Difluordesoxycytidin, 2-Chlor-2'-desoxyadenosin, 1-β-D-arabinfuranosylcytosin, 2',3'-Dideoxycytidin und 2'-Desoxy-3-thiacytidin nicht phosphorylieren. Auch bei der in der obenstehend genannten WO96/21724 Desoxyguanosinkinase wurde festgestellt, dass sie eine beschränkte Substratspezifität aufweist. Dieses Enzym phosporyliert nicht (E)-5-(2-Bromvinyl)-2'-desoxyuridin, (E)-5-(2-Bromvinyl)-1-β-D-arabinfuranosyl-uracil, 2',2'-difluordesoxycytidin, 1-β-D-Arabinfuranosylcytosin, 2',3'-Didesoxycytidin oder 3TC.
Dementsprechend besteht Bedarf an einer DNA-Sequenz, die für eine Nucleotidkinase kodiert, die eine breite Spezifität sowie eine hohe katalytische Phosphorylierungsgeschwindigkeit aufweist, um hinsichtlich der Verwendung von möglichen nucleosidanalogen Pro-Pharmaka eine Flexibilität zu erhalten, und um die Dosismenge zu verringern, die benötigt wird, um eine ausreichende therapeutische Wirkung zu erhalten, was in einem minimierten Risiko von unerwünschten Nebenwirkungen bei dem Patienten resultiert.
Werden phosphorylierte Nucleosidanaloga für den Handel erzeugt, besteht auch ein Bedarf an einer Nukleotidkinase, die eine breite Spezifität sowie eine hohe katalytische Phosphorylisierungsgeschwindigkeit aufweist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es hat sich nun herausgestellt, dass durch das Einbringen einer DNA- oder RNA-Sequenz, die eine Untersequenz umfasst, welche eine Homologie von wenigstens 60%, bevorzugt von wenigstens 80%, und am meisten bevorzugt von wenigstens 90% zu der DNA-Sequenz von SEQ. ID. NR. 1 umfasst, in eine Zelle, diese Zelle durch Phosphorylierung eine breite Spezifität zur Änderung des nucleosidanalogen Pro-Pharmakons in aktive Arzneimittel erhält. Gleicher aßen tritt diese Veränderung bei einer hohen katalytischen Geschwindigkeit auf. Die DNA-Sequenz wird bevorzugt durch Transformation mit einem geeigneten Virus oder einem anderen geeigneten Vektor in die Zelle eingebracht. Auch solche Viren und Vektoren stellen einen Teil der vorliegenden Erfindung dar.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein Bericht aus letzter Zeit (Munch-Petersen et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 3926–3931) zeigt, dass Zelllinien von der Fruchtfliege Drosophila melanogaster nur eine einzige Desoxyribonucleosidkinase umfassen. Der Bericht offenbart jedoch weder etwas über die Aminosäuresequenz des Enzyms noch über eine DNA-Sequenz, die für es kodiert. Dieses Enzym, das DM-dNK genannt wird, ist im Gegensatz zu den menschlichen Desoxyribonucleosidkinasen ein Multisubstratenzym. Obwohl Pyrimidinnucleoside die bevorzugten Substrate dieses Enzyms sind, katalysiert es die Phosphorylierung von sowohl Pyrimidin- als auch Purindesoxyribonucleosiden. Das Enzym phosphoryliert zudem ebenfalls mehrere antivirale und anti-Krebs-Nucleosidanaloga. Die katalytischen Geschwindigkeiten von Desoxyribonucleosid- und Nucleosidanalog-Phosphorylierung sind, je nach Substrat, 10- bis 100-mal höher als die maximalen katalytischen Geschwindigkeiten, die für Enzyme von Säugetieren berichtet werden. Die ausgedehnte Substratspezifität sowie die hohe katalytische Phosphorylierungsgeschwindigkeit von Desoxyribonucleosiden machen DM-dNK unter den Mitgliedern der Familie der Desoxyribonucleosidkinasen einmalig.
Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Nucleinsäuresequenz zur Verfügung zu stellen, die für eine Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase kodiert, die eine Homologie zu der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr. 2 von wenigstens 70% zeigt, bevorzugt eine Homologie von wenigstens 90%. Je nach dem Vektor, in welchen die Nucleinsäurensequenz eingebracht werden soll, kann die Nucleinsäurensequenz eine DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz sein. Die DNA kann eine cDNA, genomische DNA und synthetische DNA sein. Sie kann zudem zweisträngig oder einsträngig sein und wenn sie einsträngig ist, kann sie der kodierende Strang oder der anti-sense Strang sein. Die SEQ. ID. Nr. 1 offenbart eine cDNA-Sequenz, die für die Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase kodiert. Aufgrund der Tatsache, dass der genetische Code degeneriert ist, können jedoch auch andere Nucleinsäuresequenzen, die für dasselbe Enzym kodieren, im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Nucleinsäurensequenz zur Verfügung zu stellen, die einen Promotor umfasst, der mit einer Krankheit in Verbindung steht und/oder eine Signalsequenz, der/die operativ mit einer Nucleinsäurensubsequenz verbunden ist/sind, die für eine Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase kodiert, die eine Homologie zu der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr. 2 von wenigstens 70% zeigt, bevorzugt eine Homologie von wenigstens 90%. Je nach Vektor, in den die Nucleinsäurensequenz eingebracht werden soll, kann die Nucleinsäurensequenz eine DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz sein. Ferner ist es möglich, eine Expressionskassette, die eine solche DNA-Sequenz umfasst, direkt in die zu tötenden Zellen zu injizieren.
Ferner ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Vektor zur Verfügung zu stellen, wie zum Beispiel ein Plasmid, Cosmid oder einen Bakteriophagen, wobei der Vektor eine DNA-Sequenz umfasst, die für eine Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase kodiert, die eine Homologie zu der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. NR. 2 von wenigstens 70% zeigt, bevorzugt eine Homologie von wenigstens 90%. Der Vektor umfasst optional zudem einen Promotor, der mit einer Krankheit in Verbindung steht, und/oder eine Signalsequenz, die mit der DNA-Sequenz, die für eine Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase kodiert, operativ in Verbindung steht. Die Erfindung betrifft zudem Wirtszellen, die diese Vektoren umfassen.
Wirtszellen werden mit den Vektoren der vorliegenden Erfindung genetisch verändert (durch Transduktion, Transformation oder Transfektion), die zum Beispiel ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein können. Der Vektor kann zum Beispiel in Form eines Plasmids, eines viralen Partikels, eines Phagen, usw. vorliegen. Die gentechnisch veränderten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährmedien kultiviert werden, die so modifiziert werden, wie es für die Aktivierung von Promotoren, der Auswahl von Transformatoren oder der Amplifizierung der Gene, die für die Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase kodieren, geeignet ist. Die Kulturbedingungen wie zum Beispiel Temperatur, pH-Wert und ähnliches sind dieselben, wie sie zuvor bei den für die Expression ausgewählten Wirtszellen verwendet wurden, und sind dem Fachmann offensichtlich.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung von Polypeptiden durch rekombinante Techniken verwendet werden. Daher kann das Polynucleotid zum Beispiel in einem aus einer Vielzahl an Expressionsvektoren zur Expression eines Polypeptids umfasst sein. Derartige Vektoren umfassen chromosomale, nicht-chromosomale (wie zum Beispiel cDNA) und synthetische DNA-Sequenzen, z.B. Derivative von SV40, bakterielle Plasmide, Phagen-DNA, Baculovirus, Hefeplasmide, Vektoren, die von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA abstammen, virale DNA wie zum Beispiel Vaccinia, Adenovirus, Geflügelpockenvirus, und Pseudotollwut. Es kann jedoch auch jeder beliebige andere Vektor verwendet werden, so lange er replizierbar ist und in dem Wirt lebensfähig ist.
Die geeigneten DNA-Sequenzen können durch eine Vielzahl an Verfahren in den Vektor eingebracht werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, in (einen) geeignete(n) Restriktionsendonucleaseort(e) eingebracht. Derartige Verfahren und andere werden als im allgemeinen Wissen der Fachleute liegend angesehen.
Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist operativ an eine geeignete Expressionskontrollsequenz (Promotor) gebunden, um die mRNA-Synthese zu steuern. Als repräsentative Beispiele solcher Promotoren können genannt werden: LTR oder SV40 Promotor, das E. coli lac (lacI, lacZ) oder trp, der Lambda Phagen P_L Promotor und andere Promotoren, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder deren Viren steuern, wie zum Beispiel die Promotoren T3, T7, gpt, Lambda PR, CMV immediate early, HSV Thymidinkinase, early und late SV40 und late LTRs aus Retrovirus und Metallothionein-I der Maus. Der Expressionsvektor umfasst zudem eine Bindungsstelle für Ribosomen zur Initiierung der Translation und einen Transkrisptionsterminator. Der Vektor kann zudem geeignete Sequenzen zur Amplifikationsexpression umfassen.
Zudem umfassen die Expressionsvektoren bevorzugt eines oder mehrere auswählbare Markergene, um eine phänotypische Eigenschaft zur Auswahl von transformierten Wirtszellen wie zum Beispiel Dihydrofolatreductase oder Neomycinbeständigkeit für eukaryotische Zellkulturen, oder wie zum Beispiel Tetracyclin- oder Ampicillinbeständigkeit von E. coli zur Verfügung zu stellen.
Es ist ferner eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase durch rekombinante Techniken zur Verfügung zu stellen, die die Kultivierung rekombinanter prokaryotischer und/oder eukaryotischer Wirtszellen, die eine Nucleinsäurensequenz enthalten und in der Lage sind, diese zu exprimieren, wobei die Nucleinsäuresequenz eine Homologie zu der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. NR. 2 von wenigstens 70% aufweist, bevorzugt eine Homologie von wenigstens 90%, unter Bedingungen, die die Expression der Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase und die nachfolgende Rückgewinnung der Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase fördern.
Als repräsentative Beispiele geeigneter Wirte können genannt werden: Bakterienzellen, wie zum Beispiel E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Pilzzellen, wie zum Beispiel Hefe; Insektenzellen, wie zum Beispiel Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; tierische Zellen wie zum Beispiel CHO, COS oder Bowesmelanom; Adenovirus; Pflanzenzellen usw. Die Auswahl eines geeigneten Wirtes obliegt nach der hierin beschriebenen Lehre dem Fachmann.
Ferner ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verwendung der Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase, oder einer Nukleinsäure, die für eine Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase kodiert, zum Beispiel zur Phosphorylierung von Desoxyribonucleosiden zu Ribonucleotiden zur Aktivierung spezifischer anti-Krebs und antiviraler Medikamente, und zur Erhaltung der Lebensfähigkeit des Desoxynucleotidpools.
Ferner ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten Virus zur Verfügung zu stellen, wie zum Beispiel einen Retrovirus oder einen Adenovirus, dessen Genom einen mit einer Krankheit im Zusammenhang stehenden Promotor und/oder eine Signalsequenz, der/die operativ mit einer DNA-Sequenz oder einer RNA-Sequenz verbunden ist/sind, die für eine Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase kodiert, die eine Homologie zu der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr. 2 von wenigstens 70% zeigt, bevorzugt eine Homologie von wenigstens 90%, umfasst.
Ferner ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Arzneimittel zur Verfügung zu stellen, das einen rekombinanten Virus umfasst, wie zum Beispiel einen Retrovirus oder einen Adenovirus, dessen Genom einen mit einer Krankheit im Zusammenhang stehenden Promotor und/oder eine Signalsequenz, der/die operativ mit einer DNA-Sequenz oder einer RNA-Sequenz verbunden ist/sind, die für eine Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase kodiert, die eine Homologie zu der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr. 2 von wenigstens 70% zeigt, bevorzugt eine Homologie von wenigstens 90%, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablem Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel, umfasst.
Es ist ferner eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine konjugierte Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase zur Verfügung zu stellen, die eine Homologie zu der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr. 2 von wenigstens 70% zeigt, bevorzugt eine Homologie von wenigstens 90%, wobei die Desoxyribonucleosidkinase zu einer Targetgruppe konjugiert ist, wie zum Beispiel einer magnetischen Gruppe oder einem Antikörper, die gezielt an ein Antigen bindet, das mit einer Krankheit im Zusammenhang steht, wie zum Beispiel Krebs oder eine Virusinfektion.
Es ist ferner eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die eine konjugierte Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase umfasst, die eine Homologie zu der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr. 2 von wenigstens 70% zeigt, bevorzugt eine Homologie von wenigstens 90%, wobei die Desoxyribonucleosidkinase zu einer Targetgruppe konjugiert ist, wie zum Beispiel einer magnetischen Gruppe oder einem Antikörper, die gezielt an ein Antigen bindet, das mit einer Krankheit, wie zum Beispiel Krebs oder eine Virusinfektion, im Zusammenhang steht, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel.
Wie hierin offenbart betrifft der Begriff "Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase" eine Desoxyribonucleosidkinase, die eine Homologie zu der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr. 2 von wenigstens 70% zeigt, bevorzugt eine Homologie von wenigstens 90%. Die Desoxyribonucleosidkinase stammt von Drosophila melanogaster und weist eine breite Spezifität zur Änderung von nucleosidanalogen Pro-Pharmaka in aktive Arzneimittel durch Phosphorylierung auf. Gleichermaßen treten diese Veränderungen mit einer hohen katalytischen Geschwindigkeit auf.
Wie hierin offenbart betreffen die Begriffe "therapeutisches nucleosidanaloges Pro-Pharmakon", "therapeutisches Nucleosidanalog", und "Nucleosidanalog", Nucleoside und Analoga von Nucleosiden, die nicht toxisch sind und/oder denen verwendbare pharmazeutische Eigenschaften fehlen, die jedoch zu potenten pharmazeutisch verwendbaren Verbindungen umgewandelt werden können, wenn sie phosphoryliert werden. Typischerweise werden sie nach einer solchen Phosphorylierung cytotoxisch. Beispiele derartiger Verbindungen umfassen 9-(Hydroxyethoxymethyl)guanin (ACV), 1-β-D-arabinfuranosyladenin (AraA), 1-β-D-arabinfuranosylcytosin (AraC), 1-β-D-arabinfuranosylguanin (AraG), 1-β-D-arabinfuranosylthymin (AraT), 3'-Azido-2',3'-didesoxythymidin (AZT), 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU), (E)-5-(2-Bromvinyl)-2'-desoxyuridin (BVDU), 2-Chlor-2'-desoxyadenosin (CdA), 2',3'-Didehydro-2',3'-didesoxythymidin (D4T), 2',3'-Didesoxycytidin (ddC), Didesoxythymidin (ddT), 2',2'-Difluordesoxycytidin (dFdC), 1-(2-Desoxy-2-fluor-β-D-arabinfuranosyl)-5-ioduracil (FIAU), 3'-Fluor-2',3'-didesoxythymidin (FLT), (E)-5-(2-Bromvinyl)-1-β-D-arabinfuranosyl-uracil (BVaraU), 5-Fluordesoxyuridin (FdU), und 2'-Desoxy-3-thiacytidin, 2',2'-Difluordesoxyguanosin (dFdG), 2-Fluor-9-β-D-arabinfuranosyladenin (FaraA), 5-Aza-2'-desoxycytidin (5-AzadC), 5-Fluor-2'-desoxycytidin (5-FdC), 5-Methyldesoxycytidin (5-metdC), Granciclovir (GCV), 1-(2-Desoxy-2- fluor-1-β-D-arabinfuranosyl)-5-thymin (FMAU) und 5-(2-Bromvinyl)-2'-desoxycytidin BVDC).
Der Begriff "Promotor und/oder Signalsequenz, der/die mit einer Krankheit im Zusammenhang steht/stehen" wie er hierin offenbart ist, betrifft einen Promotor oder eine Signalsequenz, der/die in einer Zelle, die durch eine Krankheit wie zum Beispiel Krebs oder eine Virusinfektion, betroffen ist, aktiv ist. Es ist nicht erforderlich, dass der Promotor ein Gen steuert, das die Krankheit aktiv verursacht, aber es ist erforderlich, dass das Gen, das durch den Promotor gesteuert wird, in einer Zelle, die durch die Krankheit betroffen ist, aktiv ist. Es ist bevorzugt, dass das Gen nicht in den umliegenden Zellen, die durch die Krankheit nicht betroffen sind, aktiv ist. Gleichermaßen ist es nicht notwendig, dass die Signalsequenz direkt in die Mechanismen, die der Krankheit zugrunde liegen, involviert ist. Es ist jedoch erforderlich, dass die Signalsequenz das Gen, das für die multifunktionale Nucleosidkinase kodiert, aktiv auf eine Zelle, die durch die Krankheit betroffen ist, ansteuert. Beispiele sind Promotoren und Signalsequenzen, die von Viren stammen, wie zum Beispiel humanes Immundefizenzvirus (HIV), Hepatitis-C-Virus (HIV), der Promotor des TK-Gens des Herpes-simplex-Virus vom Typ I, Promotoren der Adenovirusgene E1A, und MLP, der LTR Promotor des Ross-Sarcoma-Virus, Promotoren von ubiquitären eukariotischen Genen, wie zum Beispiel HPRT, PGK, alpha-Actin, Tubulin und DHFR, Promotoren von Genen, die für faserartige Proteine kodieren, wie zum Beispiel GFAP, Desmin, Vimentin, Neurofilamente und Keratin, Promotoren von therapeutisch interessanten Genen wie zum Beispiel MDR, CFTR, Faktor VIII, und ApoAI, Promotoren von Genen, die insbesondere mit bestimmten Geweben im Zusammenhang stehen, wie zum Beispiel der Pyruvatkinasepromotor, und Promotoren von intestinalen Fettsäure-bindenden Proteinen, Promotoren, die die Expression von Onkogenen steuern, usw. Signalsequenzen, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Nucleinsäuresequenzen, die für eine Peptidsequenz kodieren, die die Fähigkeit hat, den Transport eines bestimmten Proteins in die Mitochondrien (Zhu et al. (1998), J. Biol. Chem., Ausgabe 273, 14707–14711; Johansson et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Ausgabe 93, 7258–7262) oder den Zellkern (Johansson et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Ausgabe 94, 11941–11945) zu lenken.
Die Erfindung betrifft zudem neuartige pharmazeutische und therapeutische Mittel, die die spezifische Abtötung von Zellen, die durch eine bestimmte Krankheit betroffen sind, wie zum Beispiel durch Krebs oder eine Virusinfektion, ermöglichen. Expressionskassetten, die eine cDNA umfassen, die für die Multisubstratdesoxynucleosidkinase der vorliegenden Erfindung kodiert, die operativ mit einem mit einer Krankheit im Zusammenhang stehenden Promotor oder einer Signalsequenz gebunden sind, können direkt per se in das zu behandelnde Gewebe injiziert werden. Es ist jedoch bevorzugt, eine Art von Vektor zur Einbringung von DNA in die zu behandelnden Zellen zu verwenden. Beispiele solcher Vektoren sind DEAE-Dextran (Pagano et al., (1967) J. Virol. Ausgabe 1, Seite 891), Zellkern-Proteine (Kaneda et al., (1989) Science, Ausgabe 243, Seite 375), Lipide (Felgner et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Ausgabe 84, Seite 7413) und Liposome (Fraley et al., (1980) J. Biol. Chem. Ausgabe 255 Seite 10431).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die DNA- oder RNA-Sequenz in die Zellen unter Verwendung eines rekombinanten Virus, das eine Nucleinsäure umfasst, die die für die Multisubstratdesoxynucleosidkinase der vorliegenden Erfindung als ein Vektor kodiert, als Vektor transferiert.
Beispiele für derartige Viren sind Retroviren (RSV, HMS, MMS, usw.) und Adenovirus.
Die Expressionskassette oder das Virus, die eine Nucleinsäurensequenz umfassen, die für die Multisubstratdesoxynucleosidkinase gemäß der vorliegenden Erfindung kodieren, kann in pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden, die für verschiedene Verabreichungsarten geeignet sind, zum Beispiel für eine topische, orale, parenterale, intranasale, intravenöse, intramuskuläre, intravenöse, subkutane, intraokulare und transdermale Verabreichung. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden bevorzugt in injizierbarer Form verwendet. Dementsprechend umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen eine Expressionskassette oder ein Virus, das eine Nucleinsäurensequenz umfasst, die für die Multisubstratdesoxynucleosidkinase gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel, das für eine injizierbare Lösung geeignet ist, die bevorzugt direkt in das zu behandelnde Gewebe injiziert werden kann. Beispiele für Formulierungen sind sterile isotonische wässrige Lösungen, oder trockene, insbesondere lyophilisierte, Zusammensetzungen, die in injizierbare Lösungen umgewandelt werden können, indem zum Beispiel steriles Wasser oder Serum hinzugefügt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Zellen zur in vivo-Expression eines Polypeptids zum Beispiel durch im Stande der Technik bekannte Verfahren gentechnisch in vivo verändert werden. Wie im Stande der Technik bekannt, kann eine Produzentenzelle zur Herstellung eines retroviralen Teilchens, das RNA enthält, die für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, einem Patienten zur gentechnischen Veränderung der Zellen in vivo und zur in vivo-Expression des Polypeptids verabreicht werden. Für den Fachmann sollten durch die Lehren der vorliegenden Erfindung diese und andere Verfahren zur Verabreichung einer erfindungsgemäßen Multisubstratdesoxynucleosidkinase offensichtlich werden. So kann zum Beispiel das Expressionsvehikel zur gentechnischen Veränderung von Zellen ein Retrovirus oder ein Adenovirus sein, der verwendet werden kann, um Zellen nach der Kombination mit einem geeigneten Übertragungsvehikel in vivo gentechnisch zu verändern.
Sobald die Multisubstratdesoxynucleosidkinase intrazellulär mittels Gentherapie exprimiert wird, kann sie zur Behandlung von Malignitäten, zum Beispiel Tumore, Krebs, Leukämie, und Lymphome und Virusinfektionen verwendet werden, da die Multisubstratdesoxynucleosidkinase den Anfangs-Phosporylierungs-Schritt eines therapeutischen nucleosidanalogen Pro-Pharmakons katalysiert. Beispiele für Krankheiten, die gemäß den Prinzipien, die in der, vorliegenden Erfindung dargestellt werden, behandelt werden können, sind wie folgt: Krebs in der Mundhöhle und im Pharynx, Krebs in den Verdauungsorganen (Ösophagus, Magen, Dünndarm, Dickdarm-Rektum, Leber, und Gallendurchgänge, Pankreas), Lungenkrebs, Bindegewebskrebs, Hautmelanom, Carcinoma basacellulare und Plattenepithelkarzinome, Brustkrebs, Krebs in den Geschlechtorganen (Cervix uteri, Corpus uteri, Eierstock, Prostata, Testis), Krebs in den Harnorganen (Blase, Niere), Krebs des Gehirns und des zentralen Nervensystems, Krebs der Endokrindrüsen (Thyroid und andere Endokrindrüsen), Leukämie und andere Krebsarten des Blutes und des Lymphgewebes (Hodgkinsche Krankheit, Non-Hodgkin-Lymphom, multiples Myelom), Krankheiten, die mit dem humanen Immundefizienvirus (HIV) in Verbindung stehen, Virushepatitis, Zytomegalovirenerkrankung und anderen chronischen Infektionen, die durch Viren verursacht werden.
Eine geeignete Dosis an Expressionskassette oder an rekombinantem Virus ist im Bezug auf die vorliegende Erfindung eine Funktion aus verschiedenen Parametern wie zum Beispiel dem verwendeten Vektor/rekombinanten Virus, der Verabreichungsart, der jeweiligen Pathologie, oder der Behandlungsdauer. Eine typische Dosis kann im Bereich von 10⁹–10¹² Viruspartikeln liegen.
Wurde die pharmazeutische Zusammensetzung, die die Expressionskassette und/oder das rekombinante Virus umfasst, geeigneten Zellen verabreicht, beginnen diese Zellen, die Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase zu exprimieren. Danach wird eine zweite pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die ein therapeutisches Nucleosidanalog zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel, bevorzugt einer injizierbaren sterilen wässrigen Lösung, umfasst. Die erfindungsgemäße Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase wandelt das therapeutische Nucleosidanalog in die aktive cytotoxische Form um, was zu Zelltod führt. Eine geeignete Dosis an Expressionskassette oder an rekombinantem Virus ist in Beziehung auf die vorliegende Erfindung eine Funktion von verschiedenen Parametern, wie zum Beispiel dem verwendeten Vektor/rekombinanten Virus, das Verabreichungsart, der speziellen Pathologie, oder der Behandlungsdauer. Eine typische Dosis kann im Bereich von 100 mg–5000 mg liegen.
Die Erfindung wird im Nachfolgenden unter Bezugnahme auf die anliegenden Figuren beschrieben, bei denen
1 Ähnlichkeiten und Homologien der Aminosäuresequenz der Kinase der vorliegenden Erfindung (Dm-dNK) und humaner TK2, humaner dCK, bzw. humaner dGK zeigt. Die Aminosäuresequenzen dieser Enzyme werden aneinander ausgerichtet und Homologien sind mit einem weißen Text auf schwarzem Hintergrund markiert;
2 den retroviralen Vektor pLXSN, der zur Bildung eines Retrovirus, das Dm-dNK cDNA (dNK-pLXSN) exprimiert, verwendet wird, zeigt. LTR, P_SV40 bzw. Neo^R, bedeutet einen long terminal repeat, SV40 large T-antigen Promotor, bzw. ein Neomycinresistenzgen;
3 eine Western-Blot-Analyse einer Dm-dNK-Expression in Krebszellen mit polyklonalen anti-Dm-dNK Mausantikörpern offenbart. (A) Die Antikörper detektierten rekombinante Dm-dNK ohne jede Kreuzreaktivität mit den humanen Nucleosidkinasen dCK, dGK, und TK2. (B) Western-Blot-Analyse von Proteinextrakten von Osteosarkomzelllinien, die mit dem pLXSN-Vektor oder dem Vektor, der Dm-dNK exprimiert, transfiziert sind;
4 ein Diagramm ist, das die Nucleosidkinaseaktivität in Rohextrakten von Zellen, die Dm-dNK exprimieren, zeigt. Die Phosphorylierung von dThd und CdA wurde untersucht;
5 Autoradiographien von TK-defizienten Zellen darstellt, die mit pLXSN oder dNK-pLXSN, inkubiert mit ³H-dThd, transduziert wurden. Wt bedeutet wild-type; und
6 Diagramme offenbart, die die Empfindlichkeit von Osteosarcomazellen gegenüber den Nucleosidanaloga BVDU, FdUrd, araC und dFdC zeigen.
Die Erfindung wird im Nachfolgenden unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschreiben, die lediglich der Veranschaulichung dienen und den Umfang der vorliegenden Erfindung in keiner Art und Weise einschränken sollen.
BEISPIEL 1: Klonierung von Dm-dNK cDNA
Die expressed Sequenz tag library der GeneBank-Datenbank des National Institute for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) wurde mit dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) durchsucht, um Drosophila melanogaster cDNA-Klone zu identifizieren, die für ähnliche Enzyme wie das humane dCK, dGK und TK2 kodierten. Es wurde ein EST-Klon, der von D. Harvey und dessen Kollegen (LD15983) hinterlegt worden war, identifiziert. Ein Plasmid, das das expressed sequence tag, das in den Vektor pBluescript SK+/– (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press) eingebracht war, umfasst, wurde von D. Harvey (Howard Hughes Medical Institute, University of California, USA) erhalten und die DNA-Sequenz des exprimierten sequence tags wurde mit einem Automated Laserfluorescent Sequencer (A. L. F.) (Amersham Pharmacia Biotech) gemäß den Anleitungen des Herstellers bestätigt. Die Bestimmung der DNA-Sequenz einer Gesamtlängen-1001 bp cDNA ergab, dass sie für ein Protein aus 250 Aminosäurenresten (SEQ. ID. NR. 2) kodiert. Die berechnete Molekularmasse des Proteins betrug 29 kDa. Die größte Ähnlichkeit wies das Protein mit humanem TK2 auf, das in der besten Ausrichtung 38% identische Aminosäuren aufwies (1). Humane dCK und dGK waren beide zu 28% mit Dm-dNK identisch.
BEISPIEL 2: Expression und Reinigung von rekombinanter Dm-dNK
Das Protein, für das die cDNA kodiert, wurde in Escherichia coli als ein Fusionsprotein zu Glutathion-S-transferase exprimiert. Zwei Oligonucleotidprimer, die den offenen Leserahmen der cDNA flankierten, wurden mit EcoRI- und SalI-Restriktionsenzymstellen (5'-AAGAATTCGGACTGATGGCGGAGGCAGCATCC (SEQ. ID. NR. 3) und 5'- AAGTCGACGTACTAATGGGATAATGGTTATCT (SEQ. ID. NR. 4)) entworfen. Die Oligonucleotide wurden in einer PCR verwendet und das amplifizierte DNA-Fragment wurde in die EcoRI-SalI-Orte des pGEX-5X-1 Plasmidvektors (Amersham Pharmacia Biotech) kloniert. Das Plasmid wurde in den Escherichia coli-Stamm BL21(DE3)pLysS (Stratagene) transformiert. Eine transformierte Kolonie wurde in ein 2YT-Medium (Sambrook, (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press) inokuliert, das mit 100 μg/ml Ampicillin und 34 μg/ml Chloramphenicol ergänzt war. Eine Proteinexpression wurde bei OD₅₉₅ = 0,9 mit 1 mM Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid 3 Stunden lang bei 37°C induziert. Die Zellen wurden durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 7.700 × g geerntet und in Phosphat-gepufferter Salzlösung resuspendiert. Die Bakterien wurden durch Hinzufügen von 1 mg/ml Lysozym und durch Sonifizierung lysiert. Triton X-100 wurde einer Endkonzentration von 1% (v/v) hinzugefügt und die Probe wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Proteinextrakt wurde bei 12.000 × g 10 Minuten lang zentrifugiert und auf eine Glutathion-Sepharose-4B-säule geladen (Amersham Pharmacia Biotech). Das gereinigte rekombinante Protein wurde in 50 mM Tris, pH 8,0, das mit 10 mM reduziertem Glutathion (Sigma) ergänzt ist, eluiert. Die Größe und Reinheit des rekombinanten Proteins wurde durch eine Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelectrophorese (Phast system, Amersham Pharmacia Biotech) bestimmt. Die Proteinkonzentration wurde durch eine Bradford-Protein-Untersuchung (BIO-RAD) bestimmt und Rinderserumalbumin wurde als Konzentrationsstandard verwendet. Etwa 10 mg Fusionsprotein pro Liter Bakterienkultur wurden erhalten. Die Elektrophorese zeigte eine einzelne Bande gereinigtes Protein.
BEISPIEL 3: Beschreibung von Dm-dNK
Eine Phosphortransferaseuntersuchung wurde zur Bestimmung der Substratspezifität der putativen Desoxyribonucleosidkinase verwendet. Die Phosphoryltransferuntersuchung wurde unter Verwendung von [[γ-³²P]ATP (3000 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech) wie beschrieben (Eriksson et al., (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun., Ausgabe 176, Seiten 586–592) durchgeführt. Die Nucleoside wurden 50 mM Tris, pH 8,5 mM MgCl₂, 1 mM unmarkiertes ATP, 100 μCi an [[γ-³²P]ATP und 1 μg rekombinante Dm-dNK hinzugefügt. Die Proben wurden 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. 2 μl der Umsetzungsmischungen wurden auf dünnschichtige Poly(ethyleneimin)cellulose F-Chromatographieblätter (Merck Inc.) in Punktform aufgebracht und das Nucleotid wurde in einem Puffer, der NH₄OH:Isobuttersäure:dH₂O (1:66:33) enthält, getrennt. Die Blätter wurden unter Verwendung von Phosphoimagerplatten (BAS 1000, Fujix) autoradiographiert. Unter den natürlich auftretenden Desoxyribonucleosiden phosphorylierte das Enzym wirksam sowohl die Pyrimidine Desoxycytidin und Desoxythymidin, ebenso wie die Purine Desoxyadenosin und Desoxyguanosin. Die Enzyme phosphorylierten keine Ribonucleoside. Die Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle 1 offenbart: Tabelle 1: Substratspezifität von rekombinanter Dm-dNK

Substrat relative Phosphorylierung 100 μM

Desoxyadenosin 1,7

Desoxycytidin 1,6

Desoxyuanosin 1,5

Desoxythymidin 1,0

Desoxyinosin 0,0
Es wurde ferner die Phosphorylierung des Enzyms von mehreren Nucleosidanaloga untersucht. Bei 100 μM wurden alle untersuchten Nucleosidanaloga effizient phosphoryliert. Es wurde zudem auch bestimmt, wie effizient die Nucleosidanaloga mit der Desoxythymidinphosphorylierung konkurrierten.
Die Konkurrenzexperimente wurden auf die folgende Art und Weise durchgeführt: Die Standardumsetzungsmischung umfasste 2,5 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, 1 mg/ml Rinderserumalbumin, 2, 5 mM ATP, 10 mM NaF, 2 μM Methyl-³H-thymidin, eine geeignete Menge an einem Nucleosidanalog und die Multisubstratdesoxyribonucleosidkinase in einer Menge, die zu einer linearen Umwandlung des Substrats führt, in einer Gesamtumsetzungsmischung von 50 μl 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Die Umsetzungsmischung wurde 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert und die Umsetzung wurde durch spotten auf die DE-81 Discs (Whatman) beendet. Die Discs wurden sofort in Ethanol (70%) eingetaucht und gewaschen. Die Filter wurden getrocknet und auf ihre Radioaktivität in einer auf Toluol-basierenden Szintillationssubstanz untersucht. Die Konzentration, die zu einer 50%-igen Inhibierung der Phosphorylierung von 2 μM Desoxythymidin führt, wurde als Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten bestimmt.
Die Ergebnisse sind in den untenstehenden Tabellen 2 und 3 dargestellt. Tabelle 2: Phosphorylierung von Nucleosidanaloga durch die Multisubstratdesoxynucleosidkinase. Die relative Phosphorylierung der Nucleosidanaloga korreliert mit der Desoxythymidinphosphorylierung.

Substrat relative Phosphorylierung bei 100 μM Substrat

AraA 1,5

AraC 1,9

AraG 1,7

AraT 1,5

AZT 1,3

BrdU 4,0

CdA 1,8

ddC 1,6

ddT 1,9

dFdC 3,3

FdU 1,5

FLT 1,7

Tabelle 3: Nucleosidanalogakonzentration, die aus einer 50%-igen kompetitiven Inhibierung (IC₅₀) der Phosphorylierung von 2 μM Desoxythymidin durch die Multisubstratdesoxynucleosidkinase und HSV-1 TK resultiert.

N. D.: = nicht bestimmt (not determined)

Die Tabelle zeigt, das die erfindungsgemäße Multisubstratdesoxynucleosidkinase in der Lage ist, eine große Menge an Nucleosidanaloga zu phosphorylieren. Das vorher verwendete Enzym HSV-1 TK weist eine beschränktere Substratspezifität auf.
BEISPIEL 4: Konstruktion eines Retrovirus, das Dm-dNK exprimiert
TK-defiziente Osteosarcomazellen wurden von der American Type Culture Collection erhalten. Die Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium kultiviert, das mit 10% (v/v) fötalem Kälberserum (Gibco BRL), 100 U/ml Penicillin, und 0,1 mg/ml Streptomycin ergänzt ist. Die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C mit einer Gasphase von 5% CO₂ wachsen gelassen.
Ein Retrovirusvektor, der auf dem Moloney Murin Leukämie Virus basiert, wurde zur Bildung eines Replikon-defizienten rekombinanten Retrovirus verwendet, um die cDNA von Dm-dNK in Säugetierzellen einzubringen. Oligonucleotidprimer, die gentechnisch veränderte EcoRI- und XhoI-Restriktionsenzymorte enthalten, wurden so gestaltet, dass sie den offenen Leserahmen von Dm-dNK cDNA (5'- AAGAATTCGGACTGATGGCGGAGGCAGCATCC (SEQ. ID. NR. 4) und 5'-TTCTCGAGTGGTTATCTGGCGACCCTCTGGC (SEQ. ID. NR. 8)) flankieren. Die Primer wurden in einer PCR verwendet und das DNA-Fragment wurde in die EcoRI-XhoI-Stelle des pLXSN-Plasmidvektors (Clontech) kloniert. Das Plasmid wurde unter Verwendung des Nucleobond-Plasmid-Reinigungskits (Clontech) gereinigt. Die DNA-Sequenz des konstruierten Plasmids wurde mittels einer DNA-Sequenz-Bestimmung unter Verwendung eines automatisierten ABI310-DNA-Sequenzers (Perkin-Elmer) nachgeprüft. 2 skizziert Replikon-defiziente rekombinante Retroviridae mit (dNK-pLXSN) und ohne die Dm-dNK cDNA (pLSNX).
RetroPack PT67 Packaging-Zellen (Clontech) wurden in einem Dulbecco's Modified Eagle's Medium, das mit 10% (v/v) fötalem Kälberserum (Gibco BRL), 100 U/ml Penicillin, und 0,1 mg/ml Streptomycin ergänzt war, kultiviert. Die pLXSN Plasmidvektoren wurden unter Verwendung von LipofectAmine (Life Technology Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers transfektiert. 48 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium von den Packaging-Zellen gesammelt, durch einen 0,45 μm-Filter gefiltert, 2-fach mit frischem Medium verdünnt und den Osteosarcomazellen hinzugefügt. Polybren wurde der Kultur bis zu einer Abschlusskonzentration von 4 μg/ml hinzugefügt. Die Zellen wurden weitere 48 Stunden lang inkubiert und dann 3 Wochen lang in Gegenwart von 1,0 mg/ml Geneticin kultiviert, um eine Population von stabilen transfizierten Genen zu bilden.
Zur Bestätigung, dass die Dm-dNK ihre enzymatische Aktivität beibehielt, als sie in humanen Zellen exprimiert wurde, wurde die Aktivität der dThd-Phosphorylierung in Rohzellenproteinextrakten bestimmt. Zellproteinextrakte wurden gemäß weithin bekannten Verfahren aus den transfizierten Osteosarcomazellen hergestellt. Desoxyribonucleosidkinaseuntersuchungen wurden in 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 5 mM MgCl₂, 5 mM ATP, 5 mM Dithiothreitol, 15 mM nAf, 100 mM KCl und 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin durchgeführt. 2,5 μM unmarkierte dThd und 2,5 μM [8-³H]-dThd (Moravek Biochemicals Inc.), oder 2 μM unmarkierte CdA und 3 μM [8-³H]-CdA (Moravek Biochemicals Inc.) wurden zusammen mit 20 μg Proteinextrakt in einem Gesamtvolumen von 35 μl hinzugefügt. Aliquoten der Umsetzungsmischung wurden nach 10, 20, bzw. 30 Minuten Inkubation bei 37°C auf den Whatman DE-81-Filtern festgestellt. Die Filter wurden drei Mal in 50 mM Ammoniumformiat gewaschen, dTMP wurde mit 0,5 M KCl von dem Filter eluiert, und die Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung ermittelt.
Die Ergebnisse sind in 4 offenbart. Untransfizierte Osteosarcomazellen, die in der cytosolischen TK1-Expression defizient waren, zeigten ein geringes Niveau an dThd-Phosphorylierung, wahrscheinlich katalysiert durch mitochondriale TK2. Die Zellen, die nur mit dem retroviralen pLXSN Vektor transfiziert waren, wiesen ähnliche Niveaus an dThd-Phosphorylierung auf wie die wildtype Zellen, wohingegen die Zellen, die mit dNK-pLXSN transfiziert wurden, eine 100-mal höhere enzymatische Aktivität aufwiesen als die parentale Zelllinie.
BEISPIEL 5: Western blot und Autoradiographie unter Verwendung von polychlonalen Mausantikörpern
Die Dm-dNK cDNA wurde in dem E. coli Stamm BL21 mit einem N-terminalen Polyhistidin-Tag exprimiert und das rekombinante Protein wurde durch eine Affinitätschromatographie gereinigt. 2,0 μg Protein, die in 300 μl Phosphat-gepufferter Salzlösung verdünnt wurden, wurden vier Wochen alten weiblichen BALB/c Mäusen mit der gleichen Menge an Freunds Komplett-Adjuvans (Sigma) subkutan verabreicht. Eine Boosterinjektion, die die selbe Menge an Protein enthält, wurde zehn Tage später zusammen mit dem Freunds Komplett-Adjuvans (Sigma) verabreicht. Zwei Wochen nach der Boosterinjektion wurden 3 ml Blut abgenommen und gerinnen gelassen. Das Serum wurde gesammelt und bei –20°C gelagert.
Zur Überprüfung der Spezifität der Antikörper wurde eine Western-blot Analyse mit rekombinanter Dm-dNK und den sequenzbezogenen humanen Desoxyribonucleosidkinasen dCK, dGK und TK2 durchgeführt. Proteinextrakte der transfizierten Osteosarcomazellen in Beispiel 4. Die Proteinkonzentration der Extrakte wurde durch eine Bio-Rad Proteinuntersuchung durchgeführt. Die Proteinextrakte wurden durch eine 1,2%-ige SDS/PAGE-Gelelektrophorese getrennt. Die Proteine wurden über Nacht bei 35 V auf eine Nitrozellulosemembran elektrotransferiert. Die Membran wurden eine Stunde bei Raumtemperatur mit den Dm-dNK Mausantiserum, blockiert und drei Mal mit TBS-Puffer gewaschen. Ein mit sekundärer alkalischer Phosphatase konjugierter anti-Maus IfG Antikörper, verdünnt 1:5000 (Sigma), wurde eine Stunde lang angewendet und die Membran wurde in einem TBS-Puffer gewaschen. Die Alkaliphosphatase, die auf der Membran immobilisiert ist, wurde mit BCIP/NBT (Sigma) entwickelt.
Die Ergebnisse der Western blot-Analyse sind in 3A dargestellt. Die anti-Dm-dNK-Antikörper detektierten das Dm-dNK-Protein und kreuzreagierten nicht mit den humanen Nucleosidkinasen. Die Antikörper wurden zur Analyse der Expression von Dm-dNK in den transfizierten Zellen (3B) verwendet. Eine Bande von 28 kDa wurde in den Zellen, die mit dem dNK-pLXSN Vektor transduziert wurden, detektiert, jedoch nicht in den Zellen, die mit pLSNX transduziert waren.
Audioradiographie wurde ferner verwendet, um die Inkorporation des dThd in situ sichtbar zu machen. Die Zellen wurden 24 Stunden lang auf Poly-L-lysin-beschichteten Kammer-Objektträgern (Nunc, Inc.) kultiviert. Zellen wurden 12 Stunden lang mit [³H]-dThd (Moravek Biochem) markiert. Die Zellen wurden zwei mal mit PBS abgespült, 10 Minuten lang in Methanol:Essigsäure (3:1) fixiert, drei mal mit eiskaltem 10%-igen TCA gewaschen und dann luftgetrocknet. Die Objektträger wurden mit einer Photoemulsion (Amersham) beschichtet und 1–4 Wochen bei 4°C ausgesetzt. Die Autoradiographen wurden unter Verwendung eines Entwicklers entwickelt.
Die Ergebnisse der Autoradiographie sind in 5 dargestellt. Die TK-defizienten Zellen, die mit [³H]-dThd inkubiert waren, zeigten ein in den Zellen verteiltes gepunktetes Autoradiographie-Muster, was die Phosphorylierung von dThd durch mitochondriale TK2 und dessen nachfolgende Inkorporation in mitochondriale DNA anzeigt. Die Zellen, die Dm-dNK exprimieren, wiesen eine Inkorporation von [³H]-dThd in nukleare DNA auf. ~90% der Zellen der Population wiesen dieses Muster auf, was anzeigt, dass die Mehrzahl der Zellen die Dm-dNK exprimierte. Zusammenfassend ist zu sagen, dass die in den Beispielen 4 und 5 beschriebenen Experimente zeigen, dass Krebszellen, die mit dem dNK-pLXSN retroviralen Vektor infiziert wurden, Dm-dNK exprimieren, und dass das Enzym seine enzymatische Aktivität bei der Expression in humanen Zellen beibehielt.
BEISPIEL 6: Untersuchungen der Zellproliferation
Es wurde die Empfindlichkeit der transduzierten Krebszellen hinsichtlich der Nucleosidanaloga BVDU, FdUrd, araC und dFdC bestimmt. AraC und FdUrd wurden von Sigma Inc erhalten. DFdC und dFdG wurden von Lilly Research Laboratories erhalten. BVDU war ein Geschenk von Prof J. Balzarini, Leuven, Belgien. 2000 Zellen wurden in 96-Well Mikrotiterplatten angeordnet und die angegebenen Konzentrationen an Nucleosidanaloga wurden nach 24 Std. hinzugefügt. Nachdem die Zellen vier Tage lang den Arzneimitteln ausgesetzt worden waren, wurde das Überleben der Zellen durch die MTT-Untersuchung (Boehringer Mannheim) untersucht. Jedes Experiment wurde dreifach ausgeführt. Zur Durchführung der statistischen Untersuchung wurden Student's t-Test paariger Proben verwendet.
Die Ergebnisse sind in 6 offenbart. Die parentale wild-type Zelllinie ist durch ausgefüllte Kreise dargestellt, Zellen, die nur durch pLXSN-Vektor transduziert wurden, sind durch ausgefüllte Quadrate dargestellt, und Zellen, die durch dNK-pLXS transduziert wurden, sind durch nicht-ausgefüllte Kreise dargestellt. Die Diagramme der 6 zeigen, dass die parentale wildtype Zelllinie und die Zellen, die mit dem LXSN-Vektor alleine transduziert worden sind, gleichermaßen empfindlich gegenüber den untersuchten Nucleosidanaloga waren. Die Zellen, die mit dNK-LXSN transduziert worden waren, wiesen eine 10- bis 1000-fach höhere Empfindlichkeit hinsichtlich BVDU, FdUrd, araC und dFdC auf.
Sequenzprotokoll

Claims

Eine Nukleinsäuresequenz, so wie eine DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz, die für eine Multisubstrat-Deoxyribonucleosidkinase mit einer Sequenz, die wenigstens 70% Homologie, vorzugsweise wenigstens 90% Homologie zu der Aminosäuresequenz von SEQ. ID. Nr. 2 zeigt, kodiert, für eine medizinische Verwendung.
Eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Multisubstrat-Deoxyribonucleosidkinase, für die die Sequenz kodiert, eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. Nr. 2 hat, für eine medizinische Verwendung.
Eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz eine wenigstens 70%ige Homologie, vorzugsweise eine wenigstens 90%ige Homologie zu der DNA-Sequenz aus SEQ. ID. Nr. 1 zeigt, für eine medizinische Verwendung.
Ein Vektor umfassend eine DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 für eine medizinische Verwendung.
Ein Vektor gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 funktional verbunden ist mit: a) einem Promoter, der in einer Zelle aktiv ist, die durch Krebs oder eine Virusinfektion betroffen ist; oder b) einer Signalsequenz, die aktiv die Multisubstrat-Deoxyribonucleosidkinase zu einer Zelle hinführt, die durch Krebs oder eine Virusinfektion betroffen ist.
Ein rekombinantes Virus umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
Ein rekombinantes Virus gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 funktional verbunden ist mit: a) einem Promoter, der in einer Zelle aktiv ist, die durch Krebs oder eine Virusinfektion betroffen ist; oder b) einer Signalsequenz, die aktiv die Multisubstrat-Deoxyribonucleosidkinase zu einer Zelle hinführt, die durch Krebs oder eine Virusinfektion betroffen ist.
Ein rekombinantes Virus gemäß Anspruch 7, für eine medizinische Verwendung.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen Vektor gemäß Anspruch 5 oder ein rekombinantes Virus gemäß Anspruch 7, gemeinsam mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, Hilfsstoff und/oder Verdünnungsstoff.