DE4233782A1 - Klonierung eines neuen Mitgliedes der Familie der Rezeptor-Protein-Tyrosin-Kinasen - Google Patents

Klonierung eines neuen Mitgliedes der Familie der Rezeptor-Protein-Tyrosin-Kinasen

Info

Publication number
DE4233782A1
DE4233782A1 DE4233782A DE4233782A DE4233782A1 DE 4233782 A1 DE4233782 A1 DE 4233782A1 DE 4233782 A DE4233782 A DE 4233782A DE 4233782 A DE4233782 A DE 4233782A DE 4233782 A1 DE4233782 A1 DE 4233782A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
protein
nucleic acid
sequence
primer
hek2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE4233782A
Other languages
English (en)
Inventor
Klaus Dipl Biol Dr Strebhardt
Helga Prof Ruebsamen-Waigmann
Uwe Dipl Biol Holtrich
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus
Original Assignee
Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus filed Critical Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus
Priority to DE4233782A priority Critical patent/DE4233782A1/de
Publication of DE4233782A1 publication Critical patent/DE4233782A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Protein- Tyrosin-Kinase (PTK), das dafür kodierende Gen, sowie ein Verfahren zum Nachweis neuer PTK-Gene mittels einer PCR- Reaktion.
PTKs nehmen bei der Regulation der zellulären Aktivität eine Schlüsselstellung ein. Im Rahmen der Signalweiterleitung sind sie daran beteiligt, diese Aktivität zu verändern. Zahlreiche Hinweise machen deutlich, daß wahrscheinlich alle PTKs an der Informationsweiterleitung aus der Umgebung der Zelle über die Membran hinweg in das Zellinnere hinein beteiligt sind. Obwohl die Informationsübermittlung noch nicht in allen Einzelheiten aufgeklärt ist, scheint klar zu sein, daß PTKs die Proliferation und den Differenzierungsstatus von Zellen modulieren.
Ein anschauliches Beispiel hierfür sind die Wachstumsfaktor­ rezeptoren, wie z. B. der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) - Rezeptor (Ullrich, A. und Schlessinger, j., 1990, Cell 91, 203). Diese Moleküle sind integrale Bestandteile der Membran und weisen extrazelluläre und zytoplasmatische Domänen auf. Die Bindung eines Liganden an die extrazelluläre Domäne führt zur Aktivierung der katalytischen intrazellulären Region, was mit der Modulation der transmembranen Signalweitergabe ein­ hergeht. Diese Aktivierung der Kinaseaktivität ändert die zelluläre Aktivität in vielen Bereichen.
PTKs sind auch deshalb wichtig, weil sie bei der malignen Transformation involviert werden. Viele PTKs wurden ursprüng­ lich in ihrer Eigenschaft als Onkogen identifiziert. Nach wie vor stellen die PTKs die größte Gruppe der Onkogene (Bishop, J.M., 1987, Science 235, 305) dar. Einige PTKs werden von Retroviren transduziert. Darüberhinaus führen bestimmte PTKs zur zellulären Transformation und sind an der Entstehung humaner Erkrankungen ohne Mitwirkung von Retroviren betei­ ligt. HER2/ neu ist ein Beispiel dafür: Dieses Onkogen wurde erstmalig in Tumorzellen von Ratten identifiziert, in denen die Aktivierung durch eine Punktmuta­ tion in der transmembranen Domäne bewirkt wird (Bergmann, C.J. et al., 1986, Cell 45, 649). Es konnte auch gezeigt werden, daß eine Überexpression von HER2/ neu mit Brustkrebs und ovarialem Krebs korreliert. PTKs können aufgrund ihrer Sequenz und der daraus resul­ tierenden Struktur in mehrere Familien unterteilt werden. Man unterscheidet die src, fps, abl und csk - Familien (cytoplas­ matische PTKs) und vier Familien von Rezeptor-PTKB (Bräu­ ninger, A. et al., 1992, Gene 110, 205; Ullrich, A. und Schlessinger, j., 1990, Cell 6, 203). Die Prototypen der Rezeptor PTKs sind:
EGF Rezeptor, Insulin Rezeptor, Platelet derived growth factor (PDGF)-Rezeptor (diese Familie enthält den colony­ stimulating-factor 1 (CSF) und den basischen Fibroblasten- Wachstumsfaktor (FGF)-Rezeptor) und das eph Protein. Alle PTKs haben eine konservierte katalytische Region von ungefähr 260 Aminosäuren, die das katalytische Zentrum bein­ haltet (Hanks, S. K. et al., 1988, Science 241, 42).
In Anbetracht der bedeutsamen Rolle der PTKs bei der Kontrol­ le der Zellproliferation und bei der Tumorentstehung ist es sehr wichtig, neue Mitglieder dieser Familie zu identifi­ zieren.
Die hier beschriebene Nukleinsäuresequenz kodiert für ein neues Mitglied der EPH/elk-Familie von Rezeptor-PTKs. Diese Familie wird im folgenden näher beschrieben:
Das EPH-Gen
Die EPH mRNA hat eine Länge von 3,5 kb und kodiert für ein Produkt von 984 Aminosäuren (AS). Diese Primärsequenz enthält zwei hydrophobe Regionen: AS 1-23 und 548-568 (Hirai H. et al., 1987, Science 238, 1717; Maru, Y. et al., 1990, Oncogene 5, 445; Maru, y. et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 3770). Mehrere Glykosylierungsstellen befinden sich im amino­ terminalen Teil des Proteins. Achtzehn der insgesamt 31 Cysteinreste sind konzentriert im Bereich von AS 171 bis 386. Im Gegensatz zum EGF-R1, bei dem zwei Cystein-reiche Regionen zu finden sind, zeigt EPH nur eine solche Region. Im carboxy­ terminalen Teil ist eine ATP-Bindungsstelle und eine Au­ tophosphorylierungsregion, vergleichbar mit Tyr-416 von pp60v-src, lokalisiert. Diese Sequenzcharakteristika deuten an, daß das EPH-Genprodukt ein transmembranes Glykoprotein mit Kinaseaktivität ist. Die EPH cDNA wurde aus einer Leberkarzinom-Zellinie isoliert. EPH-Transkripte sind in Leber, Lunge und Niere der Ratte zu finden. Weitere Studien haben gezeigt, daß EPH hauptsächlich in Zellen epithelialen Ursprungs exprimiert wird. Die Überexpression von EPH mRNA konnte in Lungen- und Lebertumoren nachgewiesen werden, ohne daß Amplifikationen des Gens nachweisbar waren. Der Vergleich der Sequenz aus einer normalen Leber und einem Lebertumor brachte keinerlei Unterschiede hervor.
Wird das EPH-Gen unter dem Einfluß einer retroviralen LTR (long terminal repeat) stark exprimiert, erlangt es onkogenes Potential, d. h. transfizierte NIH 3T3-Zellen sind in der Lage, in Weichagar Kolonien zu bilden und in Nacktmäusen Tumore hervorzurufen.
Beim Studium von Colon-, Lungen-, Mamma- und Leberkarzinomen wurde das EPH-Gen überexprimiert gefunden. EPH konnte auf Chromosom 7 lokalisiert werden.
Das elk-Gen
Das elk-Protein zeigt ebenfalls die Charakteristika von Rezeptor-PTKs, indem es eine N-terminale Signalsequenz, eine cystein-reiche extrazelluläre Domäne, ein membrandurchqueren­ des Segment und eine zytoplasmatische Kinase-Region enthält (Letwin, K. et al., 1988, Oncogene 3, 621; Lhotak, V. et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11, 2496).
Aufgrund der Aminosäuresequenz und Gesamtstruktur sind elk und EPH verwandte Gene, die eine eigene Rezeptorfamilie charakterisieren. Das Elk-Protein hat wie das EPH-Protein eine Länge von 984 Aminosäuren mit einer Homologie zu EPH in der extrazellulären Domäne von etwas über 40%, in der Kina­ sedomäne von ca. 60% und im extremen C-Terminus von ca. < 40%. Elk wurde aus einer cDNA-Bank, basierend auf RNA von Rattenhirn, isoliert. Die elk mRNA, die eine Länge von 4,0 kb hat, wird am stärksten im Gehirn und deutlich schwächer im Hoden von Ratten exprimiert.
Das ECK-Gen
Ein weiteres Mitglied dieser Familie ist das humane ECK-Gen, das für ein Polypeptid von 967 Aminosäuren codiert und in Geweben mit einem hohen Anteil von epithelialen Zellen (Haut, Lunge, Eierstöcke und Darm) am stärksten exprimiert wird (Lindberg, R.A. and Hunter T., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 6316). Die ECK mRNA hat eine Länge von 4,7 kb.
Das eek-Gen
Die eek (eh- und elk related kinase) cDNA wurde aus einer Genbank, basierend auf mRNA von Rattenhirn, isoliert (Chan, j. and Watt, V.M., 1991, Oncogene 6, 1057). Die Expression des Gens mit einem Transkript von ca. 5 kb wurde in Rattenge­ weben nur im Gehirn, nicht in Dünndarm, Placenta, Lunge, Niere und Hoden nachgewiesen. Das eek-Gen ist auf Chromosom 1 lokalisiert.
Das erk-Gen
Die erk (elk-related kinase) cDNA wurde ebenfalls aus einer Ratten-cDNA-Bank isoliert (Chan, J. and Watt, V.M., 1991, Oncogene 6, 1057). Die mRNA hat eine ungefähre Länge von 4,2 kb. In diesem Fall ist die Expression auf die Rattenlunge be­ schränkt. Das erk-Gen ist auf Chromosom 1 lokalisiert.
Das HEK-Gen
Diese Rezeptorkinase konnte in der LK 63-Zellinie, die aus einer humanen pre-B-Zell Leukämie hervorging, nachgewiesen werden (Wicks, J.P. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 1611). Das korrespondierende Transkript, das eine Länge von 5,5-6 kb hat, ist nur in Zellinien zu finden, die auf lymphoiden Tumoren basieren.
Die Homologie von HEK zu anderen Mitgliedern dieser Familie, deren Proteinsequenz vollständig ist, beträgt: cek (Huhn) - 56,4%, elk (Ratte) - 56,1%; ECK (Mensch) - 50,6%; EPH (Mensch) - 42,3%.
Das neue Gen HEK2
Das hier beschriebene neue Gen HEK2 (human embryonal kinase 2), wurde aus einer cDNA-Bank, basierend auf humaner embryo­ naler RNA, isoliert. Aufgrund der Sequenzcharakteristika gehört HEK2 zur EPH/elk Familie. Die Länge der mRNA beträgt 4,6 kb. HEK2 Transkripte sind in folgenden adulten Geweben zu finden: Pankreas, Niere, Leber, Lunge, Plazenta, Gehirn und Herz.
Das Studium von Lungentumoren hat gezeigt, daß die HEK2 Expression im Tumor im Vergleich zum peripheren Referenzgewe­ be vermindert ist. Dies gilt besonders für Adenokarzinome und großzellige Karzinome der Lunge.
Aufgrund der enormen klinischen Bedeutung von Protein-Tyrosin Kinasen, insbesondere von Protein-Tyrosin Kinasen aus der EPH/elk Familie von Rezeptor PTKs, bestand somit ein Bedürf­ nis, neue Protein-Tyrosin Kinasen sowie Verfahren zu ihrem Nachweis bereitzustellen.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein neues HEK2 (mit den EPH/elk-Rezeptoren verwandte Tyrosin-Kinase)- Rezeptor-Protein, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es
  • a) die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Aminosäuresequenz oder
  • b) Varianten der Sequenz aus (a) umfaßt.
Ein Gegenstand der Erfindung ist auch ein neues Protein, das Teile der in SEQ ID NO:1 dargestellten Aminosäuresequenz umfaßt. Die Erfindung betrifft vorzugsweise ein HEK2- Rezeptor-Protein, welches die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Aminosäuresequenz enthält, es kann jedoch auch Varianten dieser Sequenz enthalten. Unter dem Begriff "Variante" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Sequenzen zu verstehen, die durch Substitution, Deletion oder/und Insertion einzelner Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte sich von der in SEQ ID NO:1 dargestellten Aminosäuresequenz unterscheiden. Unter den Begriff "Varianten" fallen sowohl natürlich vorkommende allelische Variationen des HEK2-Rezeptor-Proteins oder solche, die durch Tumorgenese entstehen, sowie durch rekombi­ nante DNA-Technologie (insbesondere durch in vitro-Mutagenese mit Hilfe von chemisch synthetisierten Oligonukleotiden) erzeugte Proteine, die hinsichtlich ihrer biologischen oder/und immunologischen Aktivität dem in SEQ ID NO : 1 gezeig­ ten Protein entsprechen.
Erfindungsgemäße Proteine zeichnen sich vorzugsweise dadurch aus, daß auf Aminosäureebene eine Homologie von mindestens 85%, besonders bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevor­ zugt mindestens 95% gegenüber der in SEQ ID NO:1 dar­ gestellten Aminosäuresequenz aufweisen.
Die in SEQ ID NO:1 dargestellte Aminosäuresequenz stellt das gesamte HEK2-Rezeptor-Protein dar. Dieses Protein weist 990 Aminosäuren auf. Das HEK2-Rezeptor-Gen oder Varianten davon können routinemäßig in einem Vektor kloniert werden, so daß dieser Vektor in einer geeigneten Wirtszelle zur Expression gebracht wird, wobei das erfindungsgemäße Protein entsteht. Bevorzugte Wirtszellen sind Mikroorganismen wie E.coli oder Hefe, aber auch höhere Zellen (z. B. Säuger- oder Insekten­ zellen). Bevorzugte Expressionsvektoren sind z. B. Plasmide, Bakteriophage Lambda für Prokaryonten, Hefevektoren oder virale Vektoren für höhere Zellen (z. B. SV40, Vaccinia, Baculoviren). Bezüglich der Expression des HEK2-Gens soll insbesondere auf die bei Sambrook et al. (A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) genannten Metho­ den verwiesen werden.
Ein Vergleich der HEK2-Rezeptor-Sequenz mit der EMBL-Daten­ bank ergibt ein hohes Maß an Homologie mit der Familie der Protein-Tyrosin-Kinasen, wobei die engste Verwandtschaft zur EPH/elk-Familie besteht. Das erfindungsgemäße Protein wird aufgrund seiner hohen Homologie zu Cek 5 (chicken embryonal kinase) als HEK2 (human embryonal kinase) bezeichnet. Es treten folgende Protein-Tyrosin-Kinase spezifische Se­ quenzcharakteristika auf:
1. Das ATP-Bindungsmotiv:
GlyAlaGlyGluPheGly . . . (25 Aminosäuren) . . . Lys (Aminosäuren 632-657)
2. Drei in der katalytischen Domäne von Protein-Tyrosin- Kinasen liegende Aminosäure-Motive, die bei allen Protein-Tyrosin-Kinasen der Rezeptorklasse hinsichtlich der Aminosäuresequenz und des Abstandes der Motive zueinander hoch konserviert sind:
HisArgAspLeuAlaAla (AS 748-753)
AspPheGly (AS 768-770)
ProIleArgTrpThrAla (AS 793-798).
Neben der Homologie über die gesamte Sequenz weisen zwei weitere Merkmale der HEK2-Rezeptor-Sequenz auf die enge Verwandtschaft zu den EPH/elk-Rezeptoren hin:
  • 1. Die extrazelluläre Domäne des Proteins enthält einen Bereich, in dem zahlreiche Cystein-Aminosäuren konzen­ triert sind.
  • 2. Die intrazelluläre Kinase-Region wird nicht unter­ brochen, d. h. es ist kein Kinaseinsert zu finden.
Weiterhin ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes HEK2-Rezeptor- Protein oder Teile davon kodiert. Diese Nukleinsäure kann z. B. genomische DNA oder RNA sein. Vorzugsweise handelt es sich dabei jedoch um ein rekombinantes DNA-Molekül.
Weiterhin ein Gegenstand der Erfindung ist eine erfindungsge­ mäße Nukleinsäure, welche
  • a) die in SEQ ID NO:1 dargestellte kodierende Sequenz,
  • b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleinsäuresequenz oder
  • c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter strin­ genten Hybridisierungsbedingungen hybridisierende Se­ quenz enthält.
Unter stringenten Hybridisierungsbedingungen im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man, daß eine Hybridisierung auch nach Waschen bei 55°C in einem wäßrigen Niedrigsalz- Puffer (z. B. 0,2 × SSC) noch auftritt (siehe auch Sambrook, J. et al. (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder einen Teil davon enthält. Der Vektor kann in Eukary­ onten, Prokaryonten oder in Eukaryonten und Prokaryonten replizierbar sein. Er kann ein in das Genom der Wirtszelle integrierbarer Vektor (z. B. Bacteriophage Lambda) oder ein Vektor sein, der extrachromosomal vorliegt (z. B. ein Plas­ mid). Der erfindungsgemäße Vektor kann durch Subklonierung des HEK2-Gens in einen Basisvektor erhalten werden. Derartige Basisvektoren, insbesondere Vektoren mit den zur Pro­ teinexpression erforderlichen Elementen sind einem Fachmann geläufig.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. Die Zelle kann sowohl eine eukaryontische als auch eine prokaryontische Zelle sein. Verfahren zur Transformation von Zellen sind allgemeiner Stand der Technik und brauchen daher nicht erläu­ tert zu werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für den Nachweis neuer Protein-Tyrosin-Kinasegene aus der EPH/elk-Familie mittels einer PCR-Reaktion.
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eignet sich besonders für Untersuchungen von Wachstumsfaktor-Rezeptor-Genen und Qnkoge­ nen, da deren Expression mit gängigen Techniken (Northern Blot) in verschiedenen Fällen unter der Nachweisgrenze liegt. Dies ist bei Protein-Tyrosin-Kinasen häufig der Fall, so daß die PCR speziell für die Suche nach neuen Mitgliedern dieser Gruppe optimiert wurde.
Diese Technik basiert auf der enzymatischen Amplifikation von Sequenzen, die von 2 Oligonukleotidprimern, als 5′- und 3′- Begrenzung fungierend, begrenzt werden. Nach 25 PCR-Zyklen erreicht man einen Amplifikationsgrad von 105-106. Dies verdeutlicht, daß auch äußerst selten vorkommende Transkripte so stark vermehrt werden können, daß man sie anschließend erfolgreich einer Blot-Analyse oder der Klonierung zuführen kann.
Unsere Analyse der Verwandtschaft von Rezeptor-Kinasen der EPH/elk-Familie führte zur Ermittlung von konservierten Bereichen in der extremen aminoterminalen Region.
Auf dieser Basis wurden dann entsprechende Primer eingesetzt, um die EPH/elk Gruppe von Protein-Tyrosin-Kinasen zu unter­ suchen. Durch Verwendung von Primern aus konservierten Re­ gionen (aminoterminale und Kinase-Region) wird gewährleistet, daß im Rahmen des PCR-Experiments PTKs der EPH/elk-Rezeptor- Familie amplifiziert werden können.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Verfahren für den Nachweis neuer Protein-Tyrosin-Kinasegene mittels einer PCR-Reaktion, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • a) aus dem Ausgangsmaterial mRNA nach an sich bekannten Methoden gewinnt,
  • b) die mRNA aus Schritt (a) mittels reverser Transkription in cDNA umschreibt,
  • c) das aus Schritt (b) resultierende Produkt mittels einer PCR-Reaktion in Anwesenheit von 2 Primern amplifiziert, wobei der erste Primer Sequenzen speziell für die ge­ suchte Familie enthält und der zweite Primer homolog zu konservierten Arealen aller PTKs ist, und
  • d) die resultierenden PCR-Produkte direkt sequenziert.
Dieses Verfahren unterscheidet sich von den bekannten Ver­ fahren dadurch, daß man als ersten Primer ein Oligonukleotid verwendet, das außerhalb der Kinasedomäne lokalisiert ist und eine bestimmte Subfamilie von PTKs repräsentiert. Somit wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nur ein Primer (der erste Primer) verwendet, welcher zu hoch konservierten Regionen bekannter Protein-Tyrosin-Kinase-Gene homologe Sequenzen enthält.
Vorzugsweise verwendet man bei diesen erfindungsgemäßen Verfahren einen ersten Primer, der zu Sequenzen von Protein- Tyrosin-Kinase-Genen aus der EPH/elk Familie homolog ist. Aufgrund der geringen Konzentration der Protein-Tyrosin- Kinase-Gen mRNA im Ausgangsmaterial wird die PCR vorzugsweise in mindestens 20 Zyklen, besonders bevorzugt in etwa 40 Zyklen durchgeführt. Der bei diesem Verfahren verwendete erste Primer ist vorzugsweise 19-25 Nukleotide lang.
Beim HEK2-Gen erhält man unter Verwendung von zwei Primern (aminoterminale und Kinase-Region: beide konserviert) ein PCR-Produkt von ca. 2080 Bp Länge. Die fehlenden 5′- und 3′- Enden des Gens werden auf folgende Weise hergestellt: man verwendet einen spezifischen Primer (5′-Region des 2080 Bp- Fragments) für das Priming der cDNA Synthese. An die 5′-Enden der resultierenden cDNA-Stücke wird ein Primer anligiert. Entsprechend dieser Primersequenz und einer 2. Sequenz aus der 5′-Region des 2080 Bp-Fragments werden Primer für die PCR eingesetzt. Auf diese Weise kann das 5′-Ende des neuen Gens komplett dargestellt werden. Um das 3′-Ende zu komplettieren, wird ein Oligo-dT-Primer für die cDNA-Synthese eingesetzt. Die anschließende PCR erfolgt mit einem zweiten Primer aus der 3′-Region des 2080 Bp Fragments und einem Oligo-dT- Sequenzen enthaltenden Nukleotid als Rückprimer.
Weiterhin ist auch eine therapeutische Anwendung mit mono­ klonalen Antikörpern gegen den Rezeptor möglich. So könnten beispielsweise radioaktive Antikörper oder mit einem Zellgift gekoppelte Antikörper gegen Krebszellen eingesetzt werden, die den HEK2-Rezeptor tragen. Die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen den HEK2-Rezeptor ist anhand der in SEQ ID NO:1 dargestellten Aminosäuresequenz des HEK2-Rezeptor­ proteins ohne Schwierigkeiten nach bekannten Verfahren (Köhler-Milstein) möglich. Als Immunogen können das gesamte HEK2-Rezeptorprotein oder auch nur kurze ( 6 Aminosäuren) Peptidsequenzen daraus verwendet werden.
Schließlich betrifft die Erfindung ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel auf Basis eines HEK2-Rezeptorproteins, eines dagegen gerichteten Antikörpers oder einer dafür kodie­ renden Nukleinsäure. Ein derartiges Mittel kann gegebe­ nenfalls bekannte pharmazeutische Verdünnungs-, Füll-, Träger- und Hilfsmittel enthalten. Durch Verwendung ein.es erfindungsgemäßen Mittels kann ein Nachweis der Überex­ pression von HEK2 in Tumoren auf Nukleinsäure- oder/und Proteinebene erfolgen.
Die Erfindung soll weiter durch die Sequenzprotokolle SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO:6 zusammen mit den folgenden Beispielen erläutert werden, ohne daß dabei der Umfang der Erfindung auf die Beispiele beschränkt werden soll.
Es zeigt:
SEQ ID NO:1 eine 3751 bp lange Nukleinsäuresequenz, die die für das HEK2-Rezeptorgen kodierende gene­ tische Information und die 990 AS lange Amino- Säuresequenz des HEK2-Rezeptorproteins enthält,
SEQ ID NO:2 die Nukleinsäuresequenz des Oligonukleotid­ primers P6(4),
SEQ ID NO:3 die Nukleinsäuresequenz des Oligonukleotid­ primers N5,
SEQ ID NO:4 die Nukleinsäuresequenz des Qligo­ nukleotidprimers P12 (T+),
SEQ ID NO:5 die Nukleinsäuresequenz des Oligonukleotid­ primers E6 und
SEQ ID NO:6 die Nukleinsäuresequenz des Oligonukleotid­ primers E3.
Beispiel 1 Isolierung einer Teilsequenz des HEK2-Gens
1.1 Es wurde gemäß dem Verfahren von Chirgwin et al. (Bio- Chemistry 18 (1979), 5294) RNA aus humanem Embryonalge­ webe isoliert. Mit dieser RNA wurde eine PTK-spezifische cDNA-Synthese durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt:
50 mmol/l Tris/HCl, pH 8,3 (22°C)
75 mmol/l KCl
10 mmol/l Dithiotreitol (DTT)
3 mmol/l MgCl2
500 µmol/l dNTP-Lösung
0,2 µmol/l Oligonukleotid-Primer P6(4) mit der in SEQ ID NO:2 dargestellten Nukleinsäuresequenz (diese Sequenz entspricht den Nukleotiden 2431 bis 2449 der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz).
3,0 µg Gesamt RNA
100 µg/ml Rinderserumalbumin
10 Einheiten Reverse Transkriptase (aus Moloney- Murine Leukemia virus).
Das obige Reaktionsgemisch wurde in 20 µl Reaktionsvolumen eine Stunde lang bei 37°C inkubiert.
1.2. Die Amplifizierung der cDNA aus 1.1 erfolgte mit zwei zu hoch konservierten Regionen von EPH/elk-verwandten Genen komplementären Primern (P6(4) und N5). Die Nukleinsäure­ sequenz des Primers P6(4) ist bereits oben angegeben. Die Sequenz von N5 ist in SEQ ID NO:3 dargestellt (diese Sequenz entspricht den Nukleotiden 352 bis 371 der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz).
Reaktionsbedingungen:
8,3 mmol/l Tris/HCl, pH 8,8 (22°C)
41,7 mmol/l KCl 1,25 mmol/l MgCl2
0,01% Gelatine
166,7 µmol/l dNTP-Lösung
0,2 µmol/l Primer P6(4) und N5
5 Einheiten Taq-Polymerase
10 µl cDNA-Syntheseansatz (aus der PTK-spezifischen cDNA Synthese).
Das Reaktionsvolumen war 60 µl. Die Bedingungen für die PCR- Reaktion waren wie folgt:
96°C Denaturierung für 1 Minute,
50°C Hybridisierung für 2 Minuten,
72°C Elongation für 3 Minuten
für 1 Zyklus und weitere 37 Zyklen bei 60°C Hybridisierung.
Auf diese Weise wurde ein 2097 bp langes DNA-Fragment erhal­ ten, das direkt sequenziert wurde. Die Nukleinsäuresequenz dieses DNA-Fragments entspricht den Nukleotiden 352 bis 2449 der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz.
Beispiel 2 Isolierung der C-terminalen Teilsequenz des HEK2-Rezeptorgens
2.1 Es wurde eine Amplifikation von cDNA zur 3′-terminalen Verlängerung des in Beispiel 1 erhaltenen PCR-Produkts durchgeführt.
Hierzu wurde eine PCR-Reaktion mit Primern durchgeführt, wovon der eine mit einer zum poly dA-Schwanz der cDNA komple­ mentären Qligo-dT-Sequenz versehen war. Der zweite Primer E3 war spezifisch für HEK2. Die Nukleinsäuresequenz von E3 ist in SEQ ID NO:6 dargestellt.
Als Oligo-dT-Primer wurde das Oligonukleotid P12(T+) verwen­ det, dessen Nukleinsäuresequenz in SEQ ID NO:4 dargestellt ist.
Die Polymerasekettenreaktion wurde in zwei Amplifikationsrun­ den durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen der ersten Ampli­ fikationsrunde waren wie folgt:
10 mmol/l Tris/HCl, pH 8,8 (22°C)
50 mmol/l KCl
1,5 mmol/L MgCl2
0,01% Gelatine
200 µmol/l dNTP-Lösung
0,02 µmol/l der Primer E3 und P12(T+)
5 Einheiten Taq-Polymerase
10 µl cDNA-Reaktionsprodukt.
Das Reaktionsvolumen war 50 µl. Die Bedingungen bei einem Zyklus der PCR-Reaktion waren wie folgt:
Denaturierung bei 96°C für 1 Minute,
Hybridisierung bei 70°C für 2 Minuten und
Elongation bei 72°C für 3 Minuten.
Insgesamt wurden 40 Zyklen durchgeführt.
Für die zweite Amplifikationsrunde wurde 1 µl PCR-Reaktions­ produkt aus der ersten Runde in einen frischen PCR-Ansatz gegeben und unter den gleichen Bedingungen aber mit 0,2 µmol/l Primerkonzentration, wie oben nochmals in 25 Zyklen amplifiziert. Zur Erhöhung der Spezifität wird ein Primerwechsel von E3/P12 auf E6/P12 vorgenommen. Die Nuklein- Säuresequenz des Primers E6 ist in SEQ ID NO:5 dargestellt (diese Sequenz entspricht den Nukleotiden 2323 bis 2347 der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz).
SEQ ID NO:2
ART DER SEQUENZ: Nukleinsäuresequenz
NAME UND HERKUNFT: Synthetischer Oligonukleotidprimer P6(4)
LÄNGE: 20 Nukleotide
CCATAGGTCCAGACATCACT
SEQ ID NO:3
ART DER SEQUENZ: Nukleinsäuresequenz
NAME UND HERKUNFT: Synthetischer Oligonukleotidprimer PN5
LÄNGE: 20 Nukleotide
TGCAAGGAGA CATTCAACCT
SEQ ID NO:4
ART DER SEQUENZ: Nukleinsäuresequenz
NAME UND HERKUNFT: Synthetischer Oligonukleotidprimer P12(T+)
LÄNGE: 37 Nukleotide
GCAGAATTCG TGAACTGCGG CCGCATTTTT TTTTTTT
SEQ ID NO:5
ART DER SEQUENZ: Nukleinsäuresequenz
NAME UND HERKUNFT: Synthetischer Oligonukleotidprimer E6
LÄNGE: 26 Nukleotide
CTGGAGGATG ACCCCTCCGA TCCTAC
SEQ ID NO:6
ART DER SEQUENZ: Nukleinsäuresequenz
NAME UND HERKUNFT: Synthetischer Oligonukleotidprimer E3
LÄNGE: 23 Nukleotide
GTCTCAGACT TTGGCCTCTC CCG

Claims (14)

1. HEK2-Rezeptor Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es
  • a) die in SEQ ID NO:1 dargestellte Aminosäuresequenz oder
  • b) Varianten der Sequenz aus (a) umfaßt.
2. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein HEK2-Rezeptor Protein und seine Varian­ ten nach Anspruch 1 kodiert.
3. Nukleinsäure nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein rekombinantes DNA-Molekül ist.
4. Nukleinsäure nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie
  • a) die in SEQ ID NO:1 dargestellte kodierende Sequenz,
  • b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nuklein­ säuresequenz oder
  • c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridi­ sierende Sequenz enthält.
5. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 bis 4 oder einen Teil davon ent­ hält.
6. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 bis 4 oder einem Vektor nach Anspruch 5 transformiert ist.
7. Verfahren für den Nachweis neuer Protein-Tyrosin-Kinase­ gene mittels einer PCR-Reaktion dadurch gekennzeichnet, daß man
  • a) aus dem Ausgangsmaterial mRNA nach an sich bekann­ ten Methoden gewinnt,
  • b) die mRNA aus Schritt (a) mittels reverser Trans­ kription in cDNA umschreibt,
  • c) das aus Schritt (b) resultierende Produkt mittels einer PCR-Reaktion in Anwesenheit von 2 Primern amplifiziert, wobei der erste Primer Sequenzen speziell für die gesuchte Familie enthält und der zweite Primer homolog zu konservierten Arealen aller PTKs ist und
  • d) die resultierenden PCR-Produkte sequenziert.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man einen ersten Primer verwendet, der zu Protein- Tyrosin-Kinasegenen aus der Familie der Wachstumsfaktor­ rezeptoren homologe Sequenzen aufweist.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die PCR in mindestens 20 Zyklen durchführt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man einen oligo-dT-Primer mit < 25 Nukleotiden Länge verwendet.
11. Verwendung eines Proteins nach Anspruch 1 oder einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 bis 4 zur Tu­ mortherapie oder/und Tumordiagnostik.
12. Verwendung eines Antikörpers gegen ein Protein nach Anspruch 1 zur Tumortherapie oder/und Tumordiagnostik.
13. Diagnostisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als aktiven Bestandteil ein Protein nach Anspruch 1 oder einen Antikörper gegen ein solches Protein oder eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 bis 4 umfaßt.
14. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als aktiven Bestandteil ein Protein nach Anspruch 1 oder einen gegen ein solches Protein gerichteten Antikörper oder eine Nukleinsäure nach einem der An­ sprüche 2 bis 4, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeu­ tisch üblichen Hilfs-, Träger-, Füll- und Verdünnungsmitteln umfaßt.
DE4233782A 1992-10-07 1992-10-07 Klonierung eines neuen Mitgliedes der Familie der Rezeptor-Protein-Tyrosin-Kinasen Withdrawn DE4233782A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4233782A DE4233782A1 (de) 1992-10-07 1992-10-07 Klonierung eines neuen Mitgliedes der Familie der Rezeptor-Protein-Tyrosin-Kinasen

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4233782A DE4233782A1 (de) 1992-10-07 1992-10-07 Klonierung eines neuen Mitgliedes der Familie der Rezeptor-Protein-Tyrosin-Kinasen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE4233782A1 true DE4233782A1 (de) 1994-04-14

Family

ID=6469895

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE4233782A Withdrawn DE4233782A1 (de) 1992-10-07 1992-10-07 Klonierung eines neuen Mitgliedes der Familie der Rezeptor-Protein-Tyrosin-Kinasen

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE4233782A1 (de)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995028484A1 (en) * 1994-04-15 1995-10-26 Amgen Inc. Hek5, hek7, hek8, hek11, new eph-like receptor protein tyrosine kinases
WO2003087841A2 (en) * 2002-04-09 2003-10-23 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd An ephrin-b receptor protein involved in carcinoma
US6992175B1 (en) 1994-04-15 2006-01-31 Amgen Inc. Nucleic acids encoding Eph-like receptor tyrosine kinases
WO2006132907A3 (en) * 2005-06-03 2007-05-18 Novartis Vaccines & Diagnostic Methods of treating, diagnosing or detecting cancer using an ephb3 modulator
EP1831694A2 (de) 2004-10-21 2007-09-12 The Penn State Research Foundation Eph-rezeptor-tumorbiomarker

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1464706A3 (de) * 1994-04-15 2004-11-03 Amgen Inc., HEK5, HEK7, HEK8, HEK11, EPH-ähnliche Protein-Tyrosinkinase-Rezeptoren
US5981246A (en) * 1994-04-15 1999-11-09 Amgen Inc. Nucleic acids encoding EPH-like receptor protein tyrosine kinases
US5981245A (en) * 1994-04-15 1999-11-09 Amgen Inc. EPH-like receptor protein tyrosine kinases
WO1995028484A1 (en) * 1994-04-15 1995-10-26 Amgen Inc. Hek5, hek7, hek8, hek11, new eph-like receptor protein tyrosine kinases
US6992175B1 (en) 1994-04-15 2006-01-31 Amgen Inc. Nucleic acids encoding Eph-like receptor tyrosine kinases
EP1464706A2 (de) * 1994-04-15 2004-10-06 Amgen Inc., HEK5, HEK7, HEK8, HEK11, EPH-ähnliche Protein-Tyrosinkinase-Rezeptoren
WO2003087841A2 (en) * 2002-04-09 2003-10-23 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd An ephrin-b receptor protein involved in carcinoma
JP2005522229A (ja) * 2002-04-09 2005-07-28 オックスフォード グライコサイエンシス （ユーケイ） リミテッド 癌に関与する蛋白質
WO2003087841A3 (en) * 2002-04-09 2004-02-26 Oxford Glycosciences Uk Ltd An ephrin-b receptor protein involved in carcinoma
AU2003227862B2 (en) * 2002-04-09 2008-08-28 Ucb Pharma S.A. An EPHRIN-B receptor protein involved in carcinoma
US7655426B2 (en) 2002-04-09 2010-02-02 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd Ephrin-B receptor protein involved in carcinoma
JP2010101901A (ja) * 2002-04-09 2010-05-06 Ucb Pharma Sa 癌に関与するタンパク質
EP1831694A2 (de) 2004-10-21 2007-09-12 The Penn State Research Foundation Eph-rezeptor-tumorbiomarker
EP1831694A4 (de) * 2004-10-21 2008-12-17 Penn State Res Found Eph-rezeptor-tumorbiomarker
WO2006132907A3 (en) * 2005-06-03 2007-05-18 Novartis Vaccines & Diagnostic Methods of treating, diagnosing or detecting cancer using an ephb3 modulator

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3043981C2 (de)
EP1027440B1 (de) Inhibitor-protein des wnt-signalwegs
DE69233421T2 (de) Neuartige rezeptor-typ tyrosinkinase und deren verwendung
DE69930950T2 (de) Zinkfinger-bindungsdomänen für gnn
EP0926236A1 (de) Bindungspartner für Inhibitoren von cyclinabhängigen Kinasen und ihre Verwendung zur Suche nach Inhibitoren, zur Diagnose oder zur Therapie
EP0875567A2 (de) Myc-bindende Zinkfinger-Proteine, ihre Herstellung und ihre Verwendung
EP1236740B1 (de) Vakzine gegen Krebserkrankungen, die mit dem HER-2/neu Onkogen assoziiert sind
DE4233782A1 (de) Klonierung eines neuen Mitgliedes der Familie der Rezeptor-Protein-Tyrosin-Kinasen
DE69433902T2 (de) Neuartige tyrosinkinase
EP0716701B1 (de) Serin-threonin-kinase enthaltendes mittel zur tumortherapie und tumordiagnose
EP0571407B1 (de) Klonierung eines neuen mitgliedes der familie der fibroblasten-wachstumsfaktoren (fgf)-rezeptoren
EP1127133B1 (de) Zellpermeabilität-vermittelndes polypeptid
DE69432963T2 (de) Plasmid und damit transformierte E. Coli Stämme
EP1237910B1 (de) Mit trp-proteinen verwandtes protein mtr1 und dieses codierende dna-sequenz
DE60117788T2 (de) Menschliche wingless-ähnliche gene
EP1007671B1 (de) Fanconi-gen ii
DE69832447T2 (de) Gen kodierend für Afadin-1
DE602004002388T2 (de) Verfahren zur herstellung von rekombinanten nukleinsäuremolekülen
DE69535039T2 (de) Cytoplasmatische Tyrosinkinase
EP1334195B1 (de) Analoga, agonisten, antagonisten und varianten der oxidoreduktase-enzymaktivität des makrophagen-migrations-inhibitions-faktors (mif) als immunmodulatoren, therapeutika, diagnostika und screening-agenzien bei inflammatorischen und immunerkrankungen
EP1290189A2 (de) Nukleinsäure codierend eine bindungsstelle einer protein kinase der mitogenen signalisierungskaskade für ein die glykolyse katalysierendes enzym
DE69736476T2 (de) Identifizierung von genen, die in multiplem myelom geändert sind
DE69932340T2 (de) Eine neue komponente des &#39;hedgehog&#39;-signalübertragungsweges
DE10144346A1 (de) TT-Virus-Sequenzen in menschlichen Tumorgeweben, Mittel zu deren Nachweis sowie Tumortherapie
EP1161535B1 (de) Rna polymerase i transkriptionsfaktor tif-ia

Legal Events

Date Code Title Description
8139 Disposal/non-payment of the annual fee