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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Moleküle, wie z.B. Proteine, Polypeptide
und Nucleotide, beteiligt an dem "Hedgehog"-Signalübertragungsweg mit mutmaßlicher
Beteiligung an der Embryonalentwicklung und Karzinogenese. Die Erfindung
betrifft außerdem
verschiedene neue vorteilhafte Verwendungen der erfindungsgemäßen Moleküle, z.B.
bei Diagnose und Therapie.
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Hintergrund
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Beim
Studium der Entwicklung von Zellen sind Fruchtfliegen extensiv als
ein Modell verwendet worden, weil sie weniger komplex als Säugerzellen
sind.
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Musterbildung
geschieht durch eine Reihe logischer Schritte, die während der
Entwicklung eines Organismus viele Male wiederholt werden. Aus einer
weiteren evolutionären
Perspektive betrachtet sieht man über die Arten hinweg die gleiche
Art reiterativer Musterbildungen. Das zentrale Dogma der Musterbildung
ist beschrieben worden (Lawrence und Struhl, 1996). Drei ineinandergreifende
und überlappende
Schritte werden definiert. Zuerst teilen Positionsinformationen
in der Form von Morphogengradienten Zellen in nicht-überlappende
Sätze auf,
wobei jeder Satz ein Kompartiment begründet. Zweitens erwirbt jedes
dieser Kompartimente eine genetische Adresse als ein Ergebnis der
Funktion aktiver "Selektor"-Gene, die das Zellschicksal
innerhalb eines Kompartiments spezifizieren, und außerdem Zellen
und ihre Nachkommen anleiten, wie mit Zellen in benachbarten Kompartimenten
zu kommunizieren ist. Der dritte Schritt beinhaltet Wechselwirkungen
zwischen Zellen in benachbarten Compatimenten, die neue Morphogengradienten
initiieren, welche das Muster direkt organisieren.
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Wenn
man diese Schritte im größeren Detail
nimmt, findet man, dass der erste Schritt beim Mustern die Definition
von Sätzen
an Zellen in jedem Primordium ist. Zellen werden ihren Positionen
gemäß hinsichtlich sowohl
der dorsoventralen als auch anterioren/posterioren Achse mittels
Morphogengradienten zugeordnet. Die Verteilung von Zellen in der
Dorsoventralachse legt die Keimschichten bzw. Keimblätter, wie
z.B. Mesoderm oder Neuroektoderm, fest.
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Bei
der Segmentation wird der zweite Schritt (die Spezifizierung des
Zellschicksals in jedem Kompartiment) von dem Gen engrailed und
Elementen des Bithorax-Komplexes
ausgeführt.
Engrailed definiert anteriore und posteriore Kompartimente, sowohl
bei der Segmentation als auch bei der Ausprägung der Gliedmaßen.
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Der
dritte Schritt bei der Musterbildung, die Sekretion von Morphogenen,
dient zum Differenzieren von Mustern innerhalb von Kompartimenten
(und dadurch dem Etablieren von Segmentpolarität). Anfänglich sind alle Zellen innerhalb
eines Kompartiments äquipotent,
sie werden jedoch zur Ausbildung eines Musters diversifiziert. Musterbildung
hängt von Gradienten
von Morphogenen ab, von Gradienten, die entlang von Kompartimentgrenzen
eingeführt
werden. Solche Gradienten werden durch ein Signal kurzer Reichweite
etabliert, das in all den Zellen des Kompartiments induziert wird,
in welchen das oben erwähnte
Selektor-Gen engrailed aktiv ist. Für Segmentpolarität ist dieses
Signal Hedgehog. Im benachbarten Kompartiment ist das Selektor-Gen
inaktiv, was gewährleistet,
dass die Zellen für
das Signal empfindlich sind. Der Hedgehog-Signalbereich ist wahrscheinlich
nur ein paar Reihen an Zellen weit; ansprechende Zellen werden eine
lineare Quelle eines Morphogens mit großer Reichweite, das in alle
Richtungen nach außen
diffundiert. Es gibt drei bekannte Hedgehogs, Sonic (SHH), Indian
(IHH) und Desert (DHH). Die Proteine, die sie codieren, können sich
jeweils gegenseitig ersetzen, jedoch resultieren ihre unterschiedlichen
Beiträge
in Wildtyp-Tieren in einzigartigen Aktivitäten. SHH kontrolliert die Polarität von Gliedmaßenwachstum,
steuert die Entwicklung von Neuronen in dem ventralen Neuralrohr
und gestaltet Somiten. IHH kontrolliert endochondrale Knochenentwicklung,
und DHH ist für
die Spermiogenese notwendig. Hedgehog-Gene von Vertebraten werden in vielen
anderen Geweben, einschließlich
des peripheren Nervensystems, des Gehirns, der Lunge, Leber, Niere,
den Zahnprimordien, Genitalien sowie Enddarm- und Kopfdarm-Endoderm
exprimiert.
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Folglich
sind in Fliegen Segmentpolarität-Gene
als Mutationen identifiziert worden, welche das Muster der Körpersegmentstrukturen ändern. Mutationen
in diesen Genen verursachen, dass Tiere die veränderten Muster auf der Oberfläche von
Körpersegmenten
entwickeln, wobei die Veränderungen
das Muster entlang der Kopf-Schwanz-Achse beeinflussen. Beispielsweise
verursachen Mutationen in dem Gen patched, dass jedes Körpersegment
sich ohne die normalen Strukturen im Zentrum jedes Segments entwickelt.
Stattdessen besteht ein Spiegelbild des normalerweise im anterioren
Segment gefundenen Musters. Folglich erzeugen Zellen im Zentrum
des Segments die falschen Strukturen und weisen sie in die falsche
Richtung hinsichtlich der Gesamt-Kopf- bis -Schwanz-Polarität des Tiers.
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Etwa
sechzehn Gene in der Klasse sind bekannt. Die codierten Proteine
beinhalten Kinasen, Transkriptionsfaktoren, ein Zellverbindungsprotein,
zwei sezernierte Proteine, genannt wingless (WG), und das oben genannte
Hedgehog (HH), ein einzelnes Transmembran-Protein, genannt patched
(PTC), und einige neue Proteine, die zu keinem bekannten Protein
verwandt sind. Man glaubt, dass alle diese Proteine in Signalübertragungswegen
zusammenarbeiten, die Zellen über
ihre Nachbarn informieren, um Zellschicksale und -polaritäten festzusetzen.
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PTC
wurde, basierend auf genetischen Experimenten in Fliegen, als ein
Rezeptor für
HH-Protein vorgeschlagen. Ein Modell für das Verhältnis ist, dass PTC über einen
weitgehend unbekannten Weg wirkt, um sowohl seine eigene Transkription
als auch die Transkription des wingless-Segmentpolarität-Gens zu
inaktivieren. Dieses Modell schlägt
vor, dass HH-Protein, sezerniert von benachbarten Zellen, an den
PTC-Rezeptor bindet, ihn inaktiviert und dadurch verhindert, dass
PTC seine eigene Transkription oder die von wingless ab schaltet.
Eine Anzahl von Experimenten hat koordinierte Ereignisse zwischen
PTC und HH gezeigt.
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Humanes
patched-Gen (PTCH) wurde kürzlich
als das Gen identifiziert, das für
das Naevus-artige Basalzellkarzinom-Syndrom (NBCCS), auch bekannt
als das Gorlin-Syndrom,
verantwortlich ist, welches eine autosomale dominante Störung ist,
die sowohl für
Krebs als auch Entwicklungsdefekte (Gorlin (1995) Dermatologic Clinics
13:113–125),
gekennzeichnet durch multiple Basalzellkarzinome (BCCs), Medulloblastome
und Eierstockfibrome sowie zahlreiche Entwicklungsanomalien (Hahn,
H., Wicking, C., Zaphiropoulos, P.G., Gailani, M.R., Shanley, S.,
Chidambaram, A., Vorechovsky, I., Holmberg, E., Unden, A.B., Gillies,
S., Negus, K., Smyth, I., Pressman, C., Leffell, D.J., Gerrard,
B., Goldstein, A.M., Dean, M., Toftgård, R., Chenevix-Trench, G.,
Wainright, B. und Bale, A.E. (1996): "Mutations of the human homolog of Drosophila
patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome", Cell 85, 841–851; und
Johnson, R.L., Rothman, A.L., Xie, J., Goodrich, L.V., Bare, J.W.,
Bonifas, J.M., Quinn, A.G., Myers, R.M., Cox, D.R., Epstein, E.H.
Jr. und Scott, M.P. (1996): "Human
homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome", Science 272, 1668–1671) prädisponiert.
PTCH codiert für
einen Membranrezeptor der autolytisch gespaltenen (Protein-gespaltenen) Amino-terminalen
Domäne
von sonic hedgehog (SHH) (Mariago, V., Davey, R.A., Zuo, Y., Cunningham,
J.M. und Tabin, C.J. (1996): "Biochemical
evidence that patched is the Hedgehog receptor", Nature 384, 176–179; und Stone, D.M., Hynes,
M., Armanini, M., Swanson, T.A., Gu, Q., Johnson, R.L., Scott, M.P.,
Pennica, D., Goddard, A., Phillips, H., Noll, M., Hooper, J.E.,
de Sauvage, F. und Rosenthal, A. (1996): "The tumor-suppressor gene patched encodes
a candidate receptor for Sonic hedgehog", Nature 384, 129–134). Man glaubt, dass PTCH
im nicht-signalgebenden Zustand die nachfolgende Signalübertragung
eines weiteren Membranproteins, smoothened (SMO), inhibiert, jedoch
löst Binden
von SHH an PTCH diese Inhibition (Goodrich, L.V., Milenkovic, L.,
Higgins, K.M. und Scott, M.P. (1997): "Altered neural cell fates and medullablastom
in mouse patched mutants",
Science 277, 1109–1113).
Diese Kaskade an Signalübertragungsereignissen,
am besten in Drosophila charakterisiert, beinhaltet außerdem eine
Anzahl intrazellulärer
Komponenten, einschließlich
fused (eine Serin-Threonin-Kinase),
suppressor of fused, costal 2 und cubitus interruptus (Ruiz i Altaba,
A.: "Catching a
Glimpse of Hedgehog" (1997)
Cell 90, 193–196).
Das Letztere ist ein Transkriptionsfaktor, der die Expression von
Zielgenen, welche auch PTCH selbst einschließen, positiv reguliert.
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Mutationen
im PTCH-Gen sind sowohl in sporadischen als auch familiären BCCs
identifiziert worden (Gailani, M.R., Ståhle-Bäckdahl, M., Leffell, D.J.,
Glynn, M., Zaphiropoulos, P.G., Pressman, C., Unden, A.B., Dean,
M., Brash, D.E., Bale, A.E. und Toftgård, R. (1996): "The role of human
homologue of Drosophila patched in sporadic basal cell carcinomas" Nature Genet. 14,
78–81).
Das Fehlen des normalen PTCH-Proteins in diesen Zellen erlaubt,
dass die konstitutive Signalübertragung
von SMO auftritt, was in der Akkumulation von mutierten PTCH mRNAs
resultiert (Undén,
B.A., Zaphiropolous, P.G., Bruce, K., Toftgård, R. und Ståhle-Bäckdahl,
M. (1997): "Human
patched (PTCH) mRNA is overexpressed consistently in tumor cells
of both familial and sporadic basal cell carcinoma", Cancer Res. 57,
2336–2340).
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WO
96/11260 offenbart die Isolierung von patched-Genen und die Verwendung
des PTC-Proteins, um andere Liganden als den etablierten Liganden
Hedgehog, die daran binden, zu identifizieren.
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Jedoch
besteht nach wie vor ein Bedürfnis
eines weiteren Verständnisses
der SHH/PTCH-Zellsignalübertragung,
welches durch Offenbarung weiterer Gene, Peptide und Proteine, die
daran beteiligt sind, bereitgestellt werden kann.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen signifikanten Schritt vorwärts, betreffend
das Verständnis
des oben beschriebenen Wegs, dar. Mittels einer Kombination einer
cDNA-Bibliothek und RACE-Analyse ist ein neues humanes patched-ähnliches
Gen (PTCH2) kloniert und sequenziert worden. Einige alternativ gespleißte mRNA-Formen
von PTCH2 sind identifiziert worden, einschließlich Transkripte, denen Segmente
fehlen, von denen man glaubt, dass sie an sonic Hedgehog (SHH)-Bindung
beteiligt sind, und mRNAs mit unterschiedlich definierten 3-terminalen
Exons. Dementsprechend betrifft die Erfindung zwei Spleißvarianten,
die in unterschiedlichen C-Termini resultieren, wie in 2B offenbart.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 zeigt
die genomische Sequenz von SEQ ID NO:5, wobei Exons und Introns
in der genomischen Sequenz des neuen humanen patched 2-Gens gekennzeichnet
sind.
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2A offenbart
einen Aminosäuresequenzvergleich
der humanen PTCH2 (obere Zeilen)- und PTCH1 (untere Zeilen)-Sequenz.
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2B ist
eine Darstellung der alternativen Spleißereignisse, die in unterschiedlichen
C-Termini resultieren.
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2C ist
eine Darstellung der unterschiedlichen Variationen gespleißter Transkripte,
umfassend Exon 1- und Exon 2-Sequenzen.
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3A ist eine Dunkelfeld-Mikrophotographie
eines BCC-Tumors, hybridisiert mit 35S-markierter,
die ein reichlich vorhandenes Signal für PTCH1 mRNA (helle Körner) in
allen BCC-Tumorzellen zeigt.
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3B offenbart PTCH2 mRNA-Überexpression
in BCC und ist im Gegensatz hauptsächlich in den Basaloidzellen
in der Peripherie der Tumornester exprimiert.
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3C ist ein weiteres BCC, das ein starkes
PTCH2 mRNA-Signal in der Peripherie des Tumornestes (Tu) zeigt,
wohingegen in der Epidermis (Ep) kein Signal detektiert wird.
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3D sind Schnitte des gleichen Tumors (C),
hybridisiert mit der PTCH2-Sense-Sonde
zeigte sich kein Signal.
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3E zeigt Immunreaktivität für Ki-67.
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3F offenbart, wie Tumornester unter Hochleistungsvergrößerung reichlich
vorhandenes PTCH2 mRNA-Signal (schwarze Körner) in den dunklen Basaloid-Tumorzellen
und ein geringeres Signal im Zentrum (Pfeil) zeigen.
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Definitionen
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Die
Ausdrücke "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" werden hierin austauschbar
verwendet, um auf ein Polymer aus Aminosäureresten Bezug zu nehmen.
Die Ausdrücke
finden auf Aminosäurepolymere
Anwendung, bei welchen ein oder mehrere Aminosäurerest(e) ein künstliches
chemisches Analogon einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure ist,
und treffen auch auf natürlich
vorkommende Aminosäurepolymere
zu.
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Die
Ausdrücke "isoliert", "gereinigt" oder "biologisch rein" beziehen sich auf
Material, welches im Wesentlichen oder tatsächlich von Komponenten frei
ist, welche es normalerweise wie in seinem nativen Zustand gefunden
begleiten.
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Der
Ausdruck "Nucleinsäure" bezieht sich auf
ein Desoxyribonucleotid- oder
Ribonucleotid-Polymer in entweder einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form,
und umfasst, sofern nicht in anderer Weise beschränkt, bekannte
Analoga natürlicher
Nucleotide, die auf eine ähnliche
Weise wie natürlich
auftretende Nucleotide wirken können.
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Eine "Markierung" ist eine mittels
spektroskopischer, photochemischer, biochemischer, immunochemischer
oder chemischer Mittel detektierbare Zusammensetzung. Beispielsweise
beinhalten nützliche
Markierungen 32P, fluoreszierende Farbstoffe,
Elektronendichte-Reagenzien, Enzyme (z.B. wie gewöhnlich in
einem ELISA verwendet), Biotin, Dioxigenin ("dioxigenin") oder Haptene, und Proteine, für welche
Antiseren oder monoklonale Antikörper
erhältlich
sind (z.B. kann das Peptid von SEQ ID NO:1 z.B. durch Einbau einer
Radiomarkierung in das Peptid detektierbar gemacht werden und verwendet
werden, um Antikörper
zu detektieren, die spezifisch mit dem Peptid reaktiv sind).
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Wie
hierin verwendet, ist eine "Nucleinsäure-Sonde" als eine Nucleinsäure definiert,
die in der Lage ist, an eine Ziel-Nucleinsäure komplementärer Sequenz über eine
oder mehrere Arten chemischer Bindungen, für gewöhnlich über komplementäre Basenpaarung,
gewöhnlicherweise über Wasserstoffbrückenbildung,
zu binden. Wie hierin verwendet, kann eine Sonde natürliche (d.h.
A, G, C oder T) oder modifizierte Basen (7-Deazaguanosin, Inosin
etc.) einschließen.
Zusätzlich
dazu können
die Basen in einer Sonde mit einer anderen Bindung als einer Phosphodiesterbindung
verbunden sein, solange sie nicht mit der Hybridisierung interferiert. Folglich
können
Sonden beispielsweise Peptidnucleinsäuren sein, bei welchen die
einzelnen Basen durch Peptidbindungen anstatt Phosphodiesterverknüpfungen
verbunden sind. Ein Fachmann im Gebiet wird verstehen, dass Sonden
abhängig
von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen Zielsequenzen binden
können,
denen vollständige
Komplementarität
mit der Sondensequenz fehlt. Die Sonden sind vorzugsweise direkt markiert,
wie z.B. mit Isotopen, Chromophoren, Lumiphor, Chromogenen, oder
sind indirekt markiert, wie z.B. mit Biotin, an welches später ein
Streptavidin-Komplex binden kann. Durch Prüfen auf die Anwesenheit oder Abwesenheit
der Sonde kann man die Anwesenheit oder Abwesenheit der ausgewählten Sequenz
oder Teilsequenz detektieren.
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Eine "markierte Nucleinsäure-Sonde" ist eine Nucleinsäure-Sonde,
die, entweder kovalent, über
einen Linker, oder über
ionische, van der Waals- oder Wasserstoffbrückenbindungen an eine Markierung
gebunden ist, so dass die Anwesenheit der Sonde durch Detektieren
der Anwesenheit der Markierung, die an die Sonde gebunden ist, detektiert
werden kann.
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Der
Ausdruck "Ziel-Nucleinsäure" bezieht sich auf
eine Nucleinsäure
(oft abgeleitet von einer biologischen Probe), an welche eine Nucleinsäure-Sonde
entworfen ist, spezifisch zu hybridisieren. Es ist entweder die
Anwesenheit oder Abwesenheit der Ziel-Nucleinsäure, die es zu detektieren
gilt, oder die Menge der Ziel-Nucleinsäure, die quantifiziert werden
soll. Die Ziel-Nucleinsäure
weist eine Sequenz auf, die mit der Nucleinsäuresequenz der entsprechenden
Sonde, gerichtet auf das Ziel, komplementär ist. Der Ausdruck Ziel-Nucleinsäure kann
sich auf die spezifische Teilsequenz einer größeren Nucleinsäure, auf
welche die Sonde gerichtet ist, beziehen, oder auf die Gesamtsequenz
(z.B. Gen oder mRNA), bei der der Wunsch nach Detektion des Expressionslevels
besteht. Der Unterschied bei Verwendung wird aus dem Zusammenhang
ersichtlich sein.
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Der
Ausdruck "rekombinant", wenn unter Bezugnahme
auf eine Zelle oder Nucleinsäure
oder einen Vektor verwendet, zeigt an, dass die Zelle oder Nucleinsäure oder
der Vektor durch die Einführung
einer heterologen Nucleinsäure
oder die Veränderung
einer nativen Nucleinsäure
modifiziert worden ist, oder dass die Zelle von einer so modifizierten
Zelle abgeleitet ist.
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Der
Ausdruck "identisch" im Zusammenhang
zweier Nucleinsäuren
oder Polypeptidsequenzen bezieht sich auf die Reste in den beiden
Sequenzen, welche, wenn zur maximalen Übereinstimmung angeordnet, die
gleichen sind. Optimale Anordnung von Sequenzen für einen
Vergleich kann z.B. durch den lokale Homologie-Algorithmus von Smith
und Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, durch den Homologie-Anordnung-Algorithmus
von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, durch das
Suche-nach-Ähnlichkeit-Verfahren
von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444,
durch computerisierte Implementationen dieser Algorithmen (GAP,
GESTFTT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package,
Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch
Betrachtung durchgeführt
werden. Der BLAST-Algorithmus führt
eine statistische Analyse der Ähnlichkeit
zwischen zwei Sequenzen durch; siehe z.B. Karlin und Altschul (1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873–5787.
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Der
Ausdruck "wesentliche
Identität" oder "wesentliche Ähnlichkeit" im Zusammenhang
mit einem Polypeptid zeigt an, dass ein Polypeptid eine Sequenz
mit wenigstens 70% Sequenzidentität zu einer Referenzsequenz,
oder vorzugsweise 80%, oder bevorzugter 85% Sequenzidentität zu der
Referenzsequenz, oder am stärksten
bevorzugt 90% Identität über ein
Vergleichsfenster von etwa 10–20
Aminosäureresten
umfasst. Ein Hinweis darauf, dass zwei Polypeptidsequenzen im Wesentlichen
identisch sind, ist, dass ein Peptid gegenüber Antikörpern, erzeugt gegen das zweite
Peptid, immunologisch reaktiv ist. Folglich ist ein Polypeptid beispielsweise
im Wesentlichen identisch mit einem zweiten Polypeptid, wo die beiden
Peptide sich nur durch eine konservative Substitution unterscheiden.
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Ein
Hinweis darauf, dass zwei Nucleinsäuresequenzen im Wesentlichen
identisch sind, ist, dass das Polypeptid, welches die erste Nucleinsäure codiert,
mit dem Polypeptid, codiert von der zweiten Nucleinsäure, immunologisch
kreuzreaktiv ist. Ein weiterer Hinweis darauf, dass zwei Nucleinsäuresequenzen
im Wesentlichen identisch sind, ist, dass die beiden Moleküle unter
stringenten Bedingungen miteinander hybridisieren.
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Die
Phrase "hybridisiert
spezifisch mit" bezieht
sich auf das Binden, Duplexieren oder Hybridisieren eines Moleküls nur an
eine spezielle Nucleotidsequenz unter stringenten Bedingungen, wenn
diese Sequenz in einem komplexen Gemisch von (z.B. gesamter zellulärer) DNA
oder RNA vorliegt. Der Ausdruck "stringente Bedingungen" bezieht sich auf
Bedingungen, unter welchen eine Sonde mit ihrer Ziel-Teilsequenz
hybridisieren wird, jedoch nicht mit anderen Sequenzen. Stringente
Bedingungen sind Sequenz-abhängig
und werden unter unterschiedlichen Umständen unterschiedlich sein.
Längere
Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Im Allgemeinen
werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass sie etwa 5°C niedriger
als der thermische Schmelzpunkt Tm für die spezifische Sequenz bei
einer definierten Ionenstärke
und einem definierten pH sind. Die Tm ist die Temperatur (unter
definierter Ionenstärke,
definiertem pH und definierter Nucleinsäurekonzentration), bei welcher
50% der Sonden, komplementär
zu der Zielsequenz, im Gleichgewicht mit der Zielsequenz hybridisieren
(weil die Zielsequenzen im Allgemeinen im Überschuss vorhanden sind, sind
bei Tm 50% der Sonden im Gleichgewicht besetzt). Typischerweise
werden stringente Bedingungen jene sein, bei welchen die Salzkonzentration
weniger als 1,0 M Na-Ionenkonzentration, typischerweise etwa 0,01
bis 1,0 M Na-Ionenkonzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis
8,3 ist, und die Temperatur wenigstens etwa 30°C für kurze ("whort") Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide)
und wenigstens etwa 60°C für lange
Sonden (z.B. größer als
50 Nucleotide) ist. Stringente Bedingungen können auch durch Zugabe destabilisierender
Mittel, wie z.B. Formamid, erreicht werden.
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Der
Ausdruck "Antikörper" bezieht sich auf
ein Polypeptid, im Wesentlichen codiert von einem Immunglobulin-Gen
oder von Immunglobulin-Genen oder Fragmenten davon, welches spezifisch
einen Analyten (Antigen) bindet und erkennt.
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Ein "chimärer Antikörper" ist ein Antikörpermolekül, bei welchem
(a) die konstante Region oder ein Anteil davon verändert, ersetzt
oder ausgetauscht ist, so dass die Antigenbindungsstelle (variable
Region) mit einer konstanten Region einer unterschiedlichen oder
veränderten
Klasse, Effektorfunktion und/oder Spezies verknüpft ist, oder mit einem vollständig unterschiedlichen
Molekül
verknüpft
ist, welches dem chimären
Antikörper
neue Eigenschaften verleiht, z.B. einem Enzym, Toxin, Hormon, Wachstumsfaktor,
Arzneimittel etc.; oder (b) die variable Region oder ein Anteil
davon verändert,
ersetzt oder ausgetauscht ist mit einer variablen Region, die eine
unterschiedliche oder veränderte
Antigenspezifität
aufweist.
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Der
Ausdruck "Immunoassay" ist ein Assay, der
zum spezifischen Binden eines Analyten einen Antikörper einsetzt.
Der Immunoassay ist gekennzeichnet durch die Verwendung spezifischer
Bindeeigenschaften eines speziellen Antikörpers, um den Analyten zu isolieren,
zu targetieren und/oder zu quantifizieren.
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Die
Phrasen "bindet
spezifisch an ein Protein" oder "spezifisch immunreaktiv
mit" bezieht sich,
wenn auf einen Antikörper
Bezug genommen wird, auf eine Bindungsreaktion, welche für die Gegenwart
des Proteins in Anwesenheit einer heterogenen Population von Proteinen
und anderen Biologika bestimmend ist. Folglich binden unter vorgesehenen
Immunoassay-Bedingungen die spezifizierten Antikörper vorzugsweise an ein spezielles
Protein und binden nicht in signifikanter Menge an andere Proteine,
die in der Probe vorhanden sind. Spezifisches Binden an ein Protein
unter solchen Bedingungen erfordert einen Antikörper, der hinsichtlich seiner
Spezifität
für ein
spezielles Protein ausgewählt
ist. Eine Vielfalt an Immunoassay-Formaten kann verwendet werden,
um Antikörper
auszuwählen,
die mit einem speziellen Protein spezifisch immunreaktiv sind. Beispielsweise
werden Festphasen-ELISA-Immunoassays
routinemäßig verwendet,
um monoklonale Antikörper auszuwählen bzw.
zu selektieren, die mit einem Protein spezifisch immunreaktiv sind.
Siehe Harlow und Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbour Publications, New York, für eine Beschreibung von Immunoassay-Formaten
und -Bedingungen, die verwendet werden können, um sepzifische Immunreaktivität zu bestimmen.
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Ein "Genprodukt", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf eine Nucleinsäure,
deren Gegenwart, Abwesenheit, Menge oder Nucleinsäuresequenz
indikativ ist für
eine Gegenwart, Abwesenheit, Menge oder Nucleinsäurezusammensetzung des Gens.
Genprodukte schließen
folglich ein, sind aber nicht limitiert auf, ein mRNA-Transkript,
eine cDNA, umkehrtranskribiert von einer mRNA, und RNA, transkribiert
von dieser cDNA, eine DNA, amplifiziert aus der cDNA, eine RNA,
transkribiert aus der amplifizierten DNA, oder Teilsequenzen von
beliebigen dieser Nucleinsäuren.
Polypeptide, exprimiert durch das Gen oder Teilsequenzen davon,
sind auch Genprodukte. Der spezielle Typ an Genprodukt wird aus
dem Kontext und der Verwendung des Ausdrucks ersichtlich sein.
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Ein "modifiziertes Arzneimittel" bedeutet eine Verbindung,
welche die pharmazeutischen Eigenschaften des ursprünglichen
Arzneimittels oder der ursprünglichen
aktiven Substanz beibehält,
während
die Struktur davon modifiziert worden ist. Weiterhin umfasst von
dem Ausdruck "Arzneimittel" sind auch Verbindungen,
die mittels ihrer spezifischen Bindungseigenschaften in Diagnoseverfahren
verwendbar sind.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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In
einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung zwei Humanproteine,
wie offenbart in 2B, fähig dazu, im humanen PTCH/SHH-Weg
während
Embryonalentwicklung und/oder Karzinogenese, wie z.B. Basalzellkarzinom,
teilzunehmen. Die erfindungsgemäßen Proteine
sind von Varianten eines Gens codiert, dessen isolierte Nucleinsäure im Detail
unten beschrieben ist und welche aufgrund ihrer Ähnlichkeiten mit "patched 1" (PTCH1) als "patched 2" (PTCH2) bezeichnet
wird. Demgemäß weisen
die erfindungsgemäßen Proteine,
wenn verglichen mit humanem PTCH1-Protein, wesentliche Unterschiede
in Sequenz und Funktionen auf. Die Proteine können durch ihre Funktionen
gekennzeichnet werden, welche, wenn mit humanem PTCH1 verglichen, ähnlich sind,
jedoch auf gewisse Weisen unterschiedlich davon sind, die spezifischer
unten in dem Abschnitt "Ergebnisse
und Diskussion" offenbart
sind. Die neuen humanen PTCH2-Proteine gemäß der Erfindung unterscheiden
sich auch von dem zuvor isolierten Maus-PTCH2. Folglich umfasst
es in einer bevorzugten Ausführungsform
die Aminosäuresequenz,
offenbart in SEQ ID NO:1 und eingereicht bei der Gen-Bank unter Protein-Identifikationsnummer
AAD17260.1. Eines der vorliegenden Proteine umfasst alle Aminosäuren der Sequenz,
bezeichnet SEQ ID NO:1.
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Die
Proteine gemäß der Erfindung
werden von einem Fachmann auf diesem Gebiet mittels rekombinanter
DNA-Techniken unter Verwendung der unten offenbarten Moleküle oder
irgendeines synthetischen Verfahrens (siehe z.B. Barany und Merrifield,
Solid-Phase Peptide
synthesis, S. 3–284
in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Bd. 2: Special Methods
in Peptide synthesis, Teil A, Merrifield et al., J. Am. Chem.. Soc., 2149–2156) leicht
hergestellt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der Peptide,
Polypeptide und Proteine, die hierin offenbart sind, als Leitverbindungen
in Verfahren, die auf das Finden neuer Substanzen, z.B. modifizierter
Arzneimittel, wie z.B. Substanzen, die äquivalente oder sogar vorteilhaftere
Eigenschaften als die Leitverbindungen als solche aufweisen, abzielen.
Solche modifizierten Arzneimittel können auch mittels Verfahren kombinatorischer
Chemie entworfen werden, wobei eine strukturell ähnliche Verbindung z.B. mit
Hilfe von Computern spezifisch entworfen wird. Alternativ wird das
vorliegende modifizierte Arzneimittel durch Screenen einer Bibliothek
an Kandidatenverbindungen, z.B. unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers, identifiziert.
Im vorliegenden Zusammenhang soll verstanden werden, dass, wenn
solch ein modifiziertes Arzneimittel identifiziert worden ist, es
möglich
ist, es mittels irgendeiner anderen geeigneten Technik zu produzieren.
Proteomik-Verfahren, wobei vorliegende Moleküle verwendet werden, sowie
solch eine Verwendung per se, können
auch verwendbar bzw. nützlich
sein.
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Ein
zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Nucleinsäure, codierend
ein Protein, wie in Ansprüchen
1 und 2 definiert.
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Die
vorliegende Anmeldung offenbart die isolierte humane genomische
PTCH2-Nucleinsäure,
umfassend Teile oder alles der genomischen Sequenz, bezeichnet SEQ
ID NO:5. In der Offenbarung der genomischen Sequenz, gezeigt in 1,
ist die Exon/Intron-Struktur
des vorliegenden Gens gezeigt. Zusätzlich zu den darin gezeigten
Exons sind Exon 12a und 12b auch identifiziert worden, wie spezifisch
definiert von SEQ ID NO:3 bzw. SEQ ID NO:4. Interessanterweise gibt
es eine Spleißvariante,
die Exon 12a mit einem 3'-Segment
von Exon 12b mit Konservierung der intronischen GT-AG-Dinucloetide
verbindet. Exons 12a und 12b sind nicht Varianten, sondern die eigentlichen
Exons des Gens, identifiziert mittels Sequenzierung der entsprechenden
genomischen Region. (Materialien und Methoden waren wie unten beschrieben).
Demgemäß zeigen diese
Ergebnisse, dass PTCH2 die gleiche Intron/Exon-Struktur-Organisation wie PTCH1 aufweist.
Die vorliegende Anmeldung offenbart ein Transkript, das nur eines
der Exons 9 und 10, definiert in 1, ausgelassen hat.
In einer alternativen Ausführungsform
hat das erfindungsgemäße Transkript
sowohl Exon 9 als auch 10 ausgelassen. Die Spleißvarianten des vorliegenden
Gens werden in größerem Detail
unten im Abschnitt "Ergebnisse" diskutiert, wobei
alle innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung eingeschlossen
sind. Dieser Aspekt der Erfindung ermöglicht vorteilhafterweise das
Design geeigneter PCR-Primer, welches wiederum das Screenen aller
der codierenden Abschnitte davon nach Mutationen, z.B. mittels SSCP-Analyse,
Sequenzieren, oder eines anderen geeigneten Verfahrens, das einem
Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, ermöglicht. Demgemäß wurde
das neue humane PTCH2-Gen mittels Strahlungshybrid-Kartierung ("radiation hybrid mapping") auf Chromosom lp32-35
mit D15211 und WI-1404 als nächstgelegene
flankierende Marker und mit einer geschätzten Lokalisierung 5.5cR von
D1S443 lokalisiert. Diese Region wird durch LOH in verschiedenen unterschiedlichen
Tumortypen, wie z.B. Neuroblastom, Melanom, Brustkrebs, Darmkrebs
etc., oft verloren. Demgemäß ist PTCH2
ein Kandidat für
ein Tumorsuppressor-Gen in dieser Region und die vorliegende Erfindung
umfasst auch Diagnoseverfahren, basierend auf dieser neuen Offenbarung.
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Zu
dieser chromosomalen Region sind auch drei Krebs-Prädispositionssyndrome
("cancer predisposition
syndroms") kartiert
worden, nämlich
familiäres
Melanom CMM1, Modifiziererlokus für adenomatöse Polyposis coli hMom1 und
Michelinreifen-Baby-Syndrom.
PTCH2 ist ein weiterer Kandidat für das Gen hinter diesen vererbbaren
Syndromen. Die vorliegende Moleküle
werden deshalb auch vorteilhafterweise im Zusammenhang dieser Zustände, z.B.
bei Therapie und/oder Diagnose, wie z.B. in Assays, verwendet.
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Weiterhin
betrifft die Erfindung auch verschiedene PCR-Primer, basierend auf
Intronsequenzen, die Amplifikation der gesamten codierenden Sequenz
ermöglichen.
Solche Primer werden vorteilhafterweise für Mutationsscreenen verwendet.
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Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung der neuen isolierten Nucleinsäuren, z.B.
um Mutationen für
diagnostische und/oder therapeutische Zwecke zu identifizieren.
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Weitere
Ausführungsformen
dieses Aspekts der Erfindung beinhalten Nucleinsäure-Sonden, z.B. DNA-Sonden,
markierte Nucleinsäuren,
cDNAs, RNAs etc., d.h., alle Genprodukte, erhältlich von einem Fachmann im
Gebiet, basierend auf den neuen isolierten humanen PTCH2-Varianten.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Nucleinsäure, entsprechend irgendeiner
der in 2B offenbarten Spleißvarianten,
ein Protein oder Polypeptid, das davon codiert wird, sowie verschiedene
Verwendungen davon.
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Was
die Herstellung von Nucleinsäuren
gemäß der Erfindung
betrifft, kann eine beliebige geeignete rekombinante DNA-Technik
oder ein beliebiges synthetisches Verfahren verwendet werden. (Für allgemeine Laborvorgehensweisen,
die in diesem Zusammenhang verwendbar sind, siehe z.B. Sambrook
et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Bd. 1–3, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Berger und
Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology,
Bd. 153, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Current Protocols
in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols
(1994)).
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, umfassend
eine wie oben definierte Nucleinsäure. Vektoren sind z.B. verwendbar
für das
Transformieren von Zellen in vitro oder in vivo, um die Proteine
und Peptide gemäß der Erfindung
zu exprimieren, und können
z.B. Plasmide, Viren etc. sein.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist eine rekombinante Zelle, wie z.B.
eine eukaryotische, z.B. eine Säugerzelle,
oder eine prokaryotische Zelle, z.B. ein Bakterium, umfassend einen
Vektor, wie oben definiert. Solche Zellen können z.B. verwendet werden,
um in einer großen
Vielfalt von Zusammenhängen
Expressionslevel der erfindungsgemäßen Proteine und erfindungsgemäßen Polypeptide
zu verfolgen. Beispielsweise wird, wenn die Effekte eines Arzneimittels
bestimmt werden sollen, das Arzneimittel an den transformierten
Organismus, das transformierte Gewebe oder die transformierte Zelle
verabreicht werden. Dementsprechend sind Modellsysteme, die solche
Zellen einschließen,
ein weiterer Aspekt der Erfindung.
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Einen
weiteren Aspekt der Erfindung stellt ein Antikörper dar, wie z.B. ein monoklonaler
oder polyklonaler Antikörper,
welcher spezifisch an ein erfindungsgemäßes Protein oder Polypeptid
bindet. Eine beispielhafte Immunglobulin (Antikörper)-Struktureinheit umfasst
ein Tetramer. Jedes Tetramer ist zusammengesetzt aus zwei identischen
Paaren an Polypeptidketten, wobei jedes Paar eine "leichte" (etwa 25 kD) und
eine "schwere" Kette (etwa 50–70 kD)
aufweist. Der N-Terminus jeder Kette definiert eine variable Region
von etwa 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, vorwiegend verantwortlich
für Antigenerkennung.
Die Ausdrücke
variable leichte Kette (VL) und variable
schwere Kette (VH) beziehen sich auf diese
leichte bzw. schwere Kette.
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Die
Erfindung umfasst auch chimäre
oder andere Antikörper,
die die vorliegenden Proteine oder Polypeptide binden. Weiterhin
betrifft die Erfindung auch die Verwen dung der vorliegenden Antikörper in
Assays (in diesem Zusammenhang siehe z.B. Fundamental Immunology,
Dritte Ausgabe, W.E. Paul, Hrsg., Raven Press, N.Y., 1993).
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Weiterhin
betrifft die Erfindung auch eine rekombinante Zelle, die einen erfindungsgemäßen Antikörper exprimiert.
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Im
Allgemeinen können
Prokaryoten für
das Klonieren der DNA-Sequenzen,
codierend eine humane Anti-PTCH2-Immunglobulin-Kette, verwendet
werden. E. coli ist ein prokaryotischer Wirt, der insbesondere für das Klonieren
der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
verwendbar ist. Mikroben, wie z.B. Hefen, sind auch für die Expression
verwendbar. Saccharomyces ist eine bevorzugte Wirtshefe, mit geeigneten
Vektoren, die Expressionskontrollsequenzen, einen Replikationsursprung,
Terminationssequenzen und dergleichen wie gewünscht aufweisen. Typische Promotoren
schließen
3-Phosphoglyceratkinase und andere glykolytische Enzyme ein. Induzierbare
Hefepromotoren beinhalten unter anderen Promotoren von Alkoholdehydrogenase
2, Isocytochrom C und Enzymen, verantwortlich für Maltose- und Galactose-Verwertung.
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Säugerzellen
sind besonders bevorzugte Wirte für das Exprimieren von Nucleotidsegmenten,
codierend Immunglobuline oder Fragmente davon (siehe z.B. Winnacker,
From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., 1987). Eine Anzahl geeigneter
Wirtszelllinien, fähig
zum Sezernieren intakter heterologer Proteine, sind im Fachgebiet
entwickelt worden und schließen
CHO-Zelllinien, verschiedene COS-Zelllinien, HeLa-Zellen, L-Zellen
und Myelomzelllinien ein. Vorzugsweise sind die Zellen nicht-human.
Expressionsvektoren für
diese Zellen können
Expressionskontrollsequenzen beinhalten, wie z.B. einen Replikationsursprung,
einen Promotor, einen Enhancer (Queen et al. (1986) Immunol. Rev.
89:49) und notwendige Prozessierungsinformationsstellen, wie z.B.
Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen
und Transkriptionsterminatorsequenzen. Bevorzugte Expressionskontrollsequenzen
sind Promotoren, abgeleitet von endogenen Genen, Cytomegalovirus,
SV40, Adenovirus, Rinderpapillomavirus und dergleichen (siehe z.B.
Co et al. (1992) J. Immunol. 1458: 1149).
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Ein
zusätzlicher
Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Detektion eines
humanen PTCH2-Gens oder -Polypeptids, umfassend in einem Behälter ein
Molekül,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus einer Nucleinsäure, einem Polypeptid oder
einem Protein oder einem Antikörper
gemäß der Erfindung.
Weitere geeignete Komponenten solch eines Kits werden, wie auch
die Konditionen ihrer Verwendung, von einem Fachmann auf diesem
Gebiet leicht bestimmt.
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Weiterhin
betrifft die Erfindung auch die Verwendung einer Nucleinsäure, wie
offenbart in Anspruch 1 oder 2 5 in der Gentherapie. Zusätzlich zu
den spezifisch offenbarten Sequenzen kann ein beliebiges der hierin offenbarten
Exons diesbezüglich
verwendet werden. Für
einen Review über
Gentherapie-Vorgehensweisen siehe Anderson, Science (1992) 256:808–813; Nabel
und Felgner (1993) TIBTECH 11:211–217; Mitani und Caskey (1993)
TIBTECH 11: 162–166;
Mulligan (1993) Science 926–932;
Dillon (1993) TIBTECH 11: 167– 175; Miller
(1992) Nature 357: 455–460;
Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10): 1149–1154; Vigne (1995) Restorative
Neurology and Neuroscience 8: 35–36; Kremer und Perricaudet
(1995) British Medical Bulletin 51(1) 31–44; Haddada et al. (1995)
in Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler und Böhm (Hrsg.) Springer-Verlag,
Heidelberg, Deutschland; und Yu et al., Gene Therapy (1994) 1:13–26.
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Die
Ablieferung des Gens oder genetischen Materials in die Zelle ist
der erste kritische Schritt bei der Gentherapie-Behandlung einer
Krankheit. Eine große
Anzahl an Ablieferungsverfahren sind dem Fachmann im Gebiet gut
bekannt. Solche Verfahren beinhalten beispielsweise Liposomen-basierte
Genablieferung (Debs und Zhu (1993) WO 93/24640; Mannino und Gould-Fogerite
(1988) Bio Techniques 6(7): 682–691;
Rose US-PS Nr. 5 279 833; Brignam (1991) WO 91/06309; und Felgner
et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7414),
und replikationsdefekte retrovirale Vektoren, die eine therapeutische
Polynucleotidsequenz als Teil des retroviralen Genoms tragen (siehe
z.B. Miller et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:4239 (1990; Kolberg (1992)
J. NIH Res. 4:43, und Cornetta et al., Hum. Gene Ther. 2:215 (1991)).
Weit verwendete retrovirale Vektoren schließen jene, basierend auf murinem
Leukämievirus
(MuLV), Gibbonaffen-Leukämievirus
(GaLV), Affen-Immunodefizienzvirus ("Simian Immuno deficiency virus") (SIV), humanem
Immunodefizienzvirus (HIV), und Kombinationen davon, ein. Siehe
z.B. Buchscher et al. (1992) J. Virol. 66 (5) 2731–2739; Johann
et al. (1992) J. Virol. 66 (5):1635–1640 (1992); Sommerfelt et
al. (1990) Virol. 176:58–59;
Wilson et al. (1989) J. Virol. 63:2374–2378; Miller et al., J. Virol.
65:2220–2224
(1991); Wong-Staal et al., PCT/US94/05700, und Rosenburg und Fauc
(1993) in Fundamental Immunology, Dritte Auflage Panl (Hrsg.) Raven
Press, Ltd., New York, und die Referenzen darin, und Yu et al.,
Gene Therapy (1994) supra.
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Die
vorliegende Erfindung kann auch in der pharmazeutischen Industrie
verwendet werden. Beispielsweise wird sie Informationen bereitstellen,
die schließlich
Zellen aus fötalem
Gewebe ermöglichen
bzw. aktievieren können,
welche dann in Patienten transplantiert werden können, die z.B. unter Parkinson'scher Krankheit oder
Krebs, wie z.B. BCC, leiden. (Für
einen kurzen Übersichtsartikel
der Verfahren der Arzneimittelablieferung siehe Langer 249:1 527–1533 (1990),
Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. Aufl. (1985)
etc.).
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Detaillierte Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
die genomische Sequenz von SEQ ID NO:5, wobei Exons und Introns
in der genomischen Sequenz des vorliegenden humanen patched 2-Gens
bezeichnet sind. Jedoch sind Exons 12a und 12b, oben diskutiert,
in 1 nicht spezifisch gezeigt, sondern stattdessen
als die separaten Sequenzen SEQ ID NO:3 bzw. SEQ ID NO:4 offenbart.
Figur 2A offenbart einen Aminosäuresequenzvergleich
der Sequenzen von humanem PTCH2 (obere Zeilen) und PTCH1 (unter
Zeilen). Vertikale Linien zeigen identische Aminosäuren an, wohin gegen
Punkte ähnliche
Aminosäuren
anzeigen. Die dargestellte PTCH2-Sequenz ist zusammengesetzt aus
den ursprünglichen
cDNA-Klonen und den Produkten der 5-RACE-Analyse.
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2B ist
eine Darstellung der alternativen Spleißereignisse, die in unterschiedlichen
C-Termini resultieren. In der Parotis und dem Colon sind das vorletzte
und letzte Exon kanonisch miteinander verbunden. In fötalem Gehirn
dient das vorletzte Exon mit einem Teil des 3-Introns als das terminale
Exon. Die Intronsequenz ist durch kleine Buchstaben gezeigt, wobei
die flankierenden Exonsequenzen mit Großbuchstaben gezeigt sind. Oberhalb
der Nucleotidsequenz ist die abgeleitete Aminosäuresequenz gezeigt, und unterhalb
ist die entsprechende Sequenz von Mäuse-Ptch2 gezeigt. Die konservierten
intronischen Dinucleotide sind durch Buchstaben in Fettdruck gezeigt,
und die Terminationssignale sind mit Sternchen angezeigt. Beachten
Sie die Abwesenheit an Konservierung der Position der Stoppkodons
zwischen der Mäuse-
und humanen PTCH2-Sequenz. Die mutmaßlichen Polyadenylierungssignale
sind auch in diesem Diagramm gezeigt. Die genomische Organisation
wurde durch Analysieren von BAC-Klonen, umfassend das PTCH2-Gen,
erhalten.
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2C ist
eine Darstellung der unterschiedlichen Variationen an gespleißten Transkripten,
umfassend Exon 1- und Exon 2-Sequenzen. Die kanonischen Exons 1
und 2 sind durch Kästchen
und das Intron zwischen ihnen durch eine durchgehende Linie gezeigt.
Die GT- und AG-Dinucleotide, die sich in den Sequenz erstrecken,
die als Introns in individuellen Transkripten verwendet werden,
sind durch kleine Buchstaben angezeigt. G, genomische Struktur,
abgeleitet aus dem Sequenzieren der Segmente von BAC-Klonen, umfassend
das PTCH2-Gen; C, kanonisches Transkript; A, Transkript A (die ausgelassenen
Exons 9 und 10 dieses Produkts sind in dem Diagramm nicht gezeigt);
B, Transkript B.
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3A ist eine Dunkelfeld-Mikrophotographie
eines BCC-Tumors, hybridisiert mit 35S-markierter
Antisense-Sonde, die ein ausgeprägtes
Signal für
PTCH1-mRNA (helle Körner)
in allen BCC-Tumorzellen zeigt.
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3B offenbart PTCH2-mRNA-Überexpression
in BCC und ist im Gegensatz hauptsächlich in den Basaloidzellen
in der Peripherie der Tumornester exprimiert.
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3C ist ein weiterer BCC, der ein starkes
PTCH2-mRNA-Signal in der Peripherie des Tumornestes (Tu) zeigt,
wohingegen in der Epidermis (Ep) kein Signal detektiert wird.
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3D sind Schnitte des gleichen Tumors (C),
hybridisiert mit der PTCH2-Sense-Sonde, die kein Signal zeigen.
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3E zeigt Immunreaktivität für Ki-67
(braunes Präzipitat),
beobachtet in der Peripherie, in den Zellen, die starke Hochregulation
von PTCH2-mRNA zeigten.
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3F offenbart Tumornester unter Hochleistungsvergrößerung,
die ein ausgeprägtes PATCH2-mRNA-Signal
(schwarze Körner)
in den dunklen Basaloid-Tumorzellen und ein geringeres Signal im Zentrum
(Pfeil) zeigen. Balken (A–E),
24 μm, und
F, 6 μm.
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EXPERIMENTELLES
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Materialien und Methoden
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Im
vorliegenden Zusammenhang wird eine allgemeine Referenz zu G. Zaphiropoulos
et al., Cancer Res., Bd. 59, S. 787–792, 15. Februar 1999, gemacht,
die im vorliegenden Zusammenhang geeignete Methoden offenbart. Alle
in der vorliegenden Anmeldung erwähnten Referenzen sind hierdurch
hierin mittels Referenz eingeschlossen. Die Beispiele unten sollen
den Umfang der Erfindung nicht beschränken, sondern nur eine Veranschaulichung
sein.
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Die
RACE-Analyse wurde im Wesentlichen wie zuvor beschrieben (Zaphiropoulos,
P.G., und Toftgård, R.
(1996): "cDNA cloning
of a novel WD repeat protein mapping to the 9q22.3 chromosomal region", DNA Cell Biol.
15, 1049–1056)
unter Verwendung des Marathon-Kits (Promega) durchgeführt. Die
für RACE
verwendeten Primersequenzen sind auf Anfrage erhältlich.
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35S-markierte PTCH2-RNA-Sonden, verwendet
für die
in situ-Hybridisierungen, die, wie zuvor beschrieben (Unden et al.,
(1997), supra) durchgeführt
worden waren, entsprachen den Positionen 218 bis 437 und 838 bis
920 in der PTCH2-Sequenz von SEQ ID NO:1.
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Ergebnisse
und Diskussion
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Um
zusätzliche
Komponenten der PTCH/SHH-Kaskade an Signalübertragungsereignissen zu identifizieren,
wurde die Incyte LifeSeqTM-Datenbank (Incyte
Pharmaceuticals Inc., Palo Alto, CA, USA) unter Verwendung von PTCH-Sequenzen
durchsucht. Zusätzlich
zu Klonen, die die PTCH-cDNA repräsentierten, wurden zwei nahezu
identische cDNAs aus der Parotis und dem Colon identifiziert, die
Sequenzen enthielten, die ähnlich
zu, jedoch verschieden von dem 3-Ende von PTCH waren. Mittels 5-RACE-Analyse
unter Verwendung von fötalen
Gehirn-cDNAs wurde zusätzliche
Sequenzinformation von diesen Transkripten (als PTCH2 bezeichnet)
und entsprechend einer Volllängen-cDNA
erhalten (2A). PTCH2 ist 75% identisch
mit PTCH1, mit einer signifikant variablen Region, die zwischen
den Transmembrandomänen
6 und 7 vorhanden ist, und 91% identisch mit der kürzlich publizierten
Maus-Ptch2-Sequenz
(Motoyama, J., Takabatake, T., Takeshima, K. und Hui, C. (1998): "Ptch2, a second mouse
Patched gene is co-expressed with Sonic hedgehog", Nature Genet. 18, 104–106). In Ähnlichkeit
mit dem Maus-Gen, fehlt PTCH2 die C-terminale Erweiterung, die in
humanem, Maus- und Hühner-PTCH1
vorhanden ist (Goodrich, L.V., Johnson, R.L., Milenkovic, L., Mc-Mahon, J.A., und
Scott, M.P. (1996): "Conservation
of the hedgehog/patched signalling pathway from flies to mice: Induction
of a mouse patched gene by Hedgehog", Genes Dev. 10, 301–312, Marigo, V., Scott, M.P.,
Johnson, R.L., Goodrich, L.V. und Tabin, C.J. (1996): "Conservation in hedgehog
signalling: Induction of a chicken patched homolog by Sonic hedgehog
in the developing limb",
Development 122, 1225–1233).
Jedoch ist gemäß der vorliegenden
Erfindung gezeigt worden, dass die humane PTCH2-cDNA 36 Aminosäuren eher
als die Maus- Ptch2-Sequenz
endet. Weiterhin wurde, als 3-RACE von fötalem Gehirn durchgeführt wurde,
eine alternative C-terminale Region identifiziert. Diese hatte eine
hohe strukturelle Ähnlichkeit
mit der C-terminalen Ptch2-Sequenz, und sie stammt von der genomischen
Region ab, die die letzten zwei Exons von PTCH2 verbindet (2B).
Deshalb dient in diesen alternativ gespleißten Transkripten das vorletzte
Exon mit einem Segment des benachbarten 3-Introns als das terminale
Exon.
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Weiterhin
unterschieden sich die humanen und Maus-Transkripte in der Position
der Terminationssingale (die humane Sequenz ist 21 Aminosäuren länger), was
eine nicht-konservierte, Spezies-spezifische Funktion dieser alternativen
C-terminalen Domäne
vorschlägt.
Das Finden zweier möglicher
C-terminaler Regionen für
PTCH2 ist verblüffend
und impliziert eine Rolle dieses Phänomens beim Modulieren von
Signalübertragung.
Zusätzlich
alternativ gespleißte
Transkripte wurden auch mittels der RACE-Analyse identifiziert (2C).
Transkript A fehlt die Sequenz, die Exons 9 und 10 von PTCH1 entspricht
(vorläufige
Vergleiche der Intron-Exon-Verbindungen von PTCH2 mit PTCH1 zeigen
eine ähnliche
genomische Organisation an), wobei der offene Leserahmen bei der
Verbindung Exon 8-Exon 11 beibehalten wird. Exons 9 und 10 codieren
für den letzten
Teil der ersten extrazellulären
Schleife und für
Transmembran-Domänen
2 und 3 in der mutmaßlichen Struktur
des PTCH1-Proteins. Weiterhin fehlt diesem Transkript auch ein 5-Segment
des kanonischen Exons 2, bedingt durch die Verwendung einer alternativen
3-Spleißstelle,
die in diesem Exon vorhanden ist, wobei der offene Leserahmen aufrecht
erhalten wird. Die funktionale Konsequenz dieses alternativen Spleißens ist noch
nicht bekannt, jedoch ist es interessant anzumerken, dass die extrazellulären Schleifen
in PTCH1, wie man vermutet, beim Binden des Liganden SHH beteiligt
sind (Marigo et al., (1996), Nature 384, supra; Stone et al., (1996),
Nature 384, supra, und dass die Insertion einer Neo-Kassette in
Intron 9 des Maus-PTCH1-Gens mit einem schweren Phänotyp assoziiert
ist (Hahn, H., Wojnowski, L., Zimmer, A.M., Hall, J., Miller, G.
und Zimmer, A. (1998): "Rhabdomyosarcomas
and radiation hypersensitivity in a mouse model of Gorlin syndrome", Nature Med. 4,
619–622).
Weiterhin codieren Exons 9 und 10 einen Teil einer mutmaßlichen
Sterol-Wahrnehmungs-Domäne (Osborne,
T.F., und Rosenfeld, J.M. (1998): "Related membrane domains in proteins
of sterol sensing and cell signalling provide a glimpse of treasures
still buried within the dynamic realm of intracellular metabolic
regulation", Curr.
Opin. Lipidol. 9, 137–140),
auch gefunden in PTCH1, und welche kürzlich mit dem Vermitteln des
potenten modulierenden Effekts von Cholesterin auf SHH/PTCH-Signalweiterleitung
in Verbindung gebracht wurde (Cooper, M.K., Porter, J.A., Young,
K.E., und Beachy, P.A. (1998): "Teratogen-mediated inhibition
of target tissue response to Shh signalling", Science 280, 1603–1607). Folglich kann, falls
PTCH2 auch als ein Rezeptor für
SHH und/oder verwandte Faktoren dient, die Rezeptorform, der Exons
9 und 10 fehlen, veränderte
Signalweiterleitungseigenschaften zeigen. Transkript B enthält zusätzliche
Sequenzen zwischen kanonischen Exons 1 und 2, die von dem 5-Ende
von Intron 1 stammen. Der offene Leserahmen, der das Start-Methionin
von Exon 1 einschließt,
ist in diesem Transkript nicht beibehalten, was nahe liegt, dass, falls
dieses Transkript funktional ist, entweder das Methionin in Exon
2 oder Nicht-Methionin-Kodons verwendet wird/werden, um ein Proteinprodukt
zu produzieren. Dies ist ähnlich
zu dem, was für
die alternativen gespleißten
Produkte von humanem PTCH1 vorgeschlagen wurde (Hahn et al., Cell
85, supra). Durch Strahlungshybrid-Kartierung ("radiation hybrid mapping") wurde das PTCH2-Gen im Unterschied
zu PTCH1, das sich auf Chromosom 9q22.3 befindet, auf dem kurzen
Arm von Chromosom 1 lokalisiert.
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Es
wurde berichtet, dass die Maus- und Zebrafisch-Homologen von PTCH2
in einem teilweise überlappenden
Muster mit PTCH1 während
Embryonalentwicklung exprimiert werden und durch SHH induziert werden
(Motoyama et al., (1988) Nature Genet. 18, supra, Concordet, J.P.,
Lewis, K.E., Moore, J.W., Goodrich, L.V., Johnson, R.L., Scott,
M.P. und Ingham, P.W. (1996): "Spatial
regulation of a zebrafish patched homologue reflects the roles of
sonic hedgehog and protein kinase A in a neural tube and somite
patterning", Development 122,
2835–2846),
was eine Rolle bei diesem Signalweiterleitungsweg impliziert. Mit
diesem Hintergrund waren wir daran interessiert, die Expression
von PTCH2 in BCCs, welche konsistente Hochregulation von PTCH1 in allen
Tumorzellen zeigen, zu analysieren (Unden et al., (1997) Cancer
res. 57, supra. In situ-Hybridisierung wurde bei sechs familiären und
vier sporadischen BCCs unterschiedlicher histologischer Subtypen
durchgeführt.
Ein starkes positives Signal für
PTCH2-mRNA wurde ausschließlich
in den Tumorzellen aller BCCs beobachtet. Bemerkenswerterweise war
das Signal in den Palisaden-Peripherie-Zellen der Tumornester konsistent
stärker
(2). Diese Zellen zeigten auch eine
positive Immunofärbung
für den
Zellproliferationsmarker Ki-67.
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Der
Fund, dass in BCCs, die häufige
Mutationen in dem PTCH1-Gen aufweisen, die Expression der PTCH2-mRNAs
hochreguliert ist, verbindet das neue PTCH2 gemäß der Erfindung eng mit der PTCH/SHH-Kaskade
an Signalübertragungsereignissen.
Es ist deshalb wahrscheinlich, dass PTCH2 ein Ziel-Gen dieses Wegs
darstellt, welches, genau wie PTCH1 selbst, unter der negativen
Regulation von PTCH1 ist. Weiterhin legt diese Beobachtung stark
nahe, dass PTCH2 Funktionen aufweist, die unterschiedlich zu PTCH1
sind, weil die Hochregulation von PTCH2-Expression nicht in der
Lage zu sein scheint, für
inaktives PTCH1-Protein
zu kompensieren. Diese Schlussfolgerung ist außerdem von der frühen embryonalen
Letalität, die
in PTCH1 (-/-)-Mäusen
5, 13) gesehen wird, und dem Fehlen genetischer Heterogenität beim Gorlin-Syndrom
gestützt.
Jedoch verbleibt die Tatsache, ob PTCH2 die konstitutive Signalübertragung
von SMO blockieren kann oder als ein zusätzlicher SHH-Rezeptor wirken
könnte,
möglicherweise
abhängig
von alternativem Spleißen,
der Gegenstand weiteren Experimentierens.
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