DE69533748T2 - Immunsuppressive proteinziele - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Cyclosporin A, FK506 und Rapamycin sind mikrobielle Produkte mit starken immunsuppressiven Eigenschaften, die vorwiegend aus einer selektiven Inhibition der T-Lymphocyten-Aktivierung resultieren. Rapamycin wurde zuerst als ein antifungales Antibiotikum beschrieben, das aus Streptomyceten (Streptomyces hygroscopicus) extrahiert wurde (Vezina et al. (1975) J. Antibiot., 28: 721; Sehgal et al. (1975) J. Antibiot. 28: 727; und Sehgal et al., US-Pat. Nr. 3,929,992). In der Folge wurde für den Makrolid-Arzneistoff Rapamycin gezeigt, dass er sowohl immunsuppressive als auch antineoplastische und antiproliferative Eigenschaften aufweist (Morris (1992) Transplant Res 6: 39–87).
  • Jede dieser Verbindungen, Cyclosporin A, FK506 und Rapamycin, unterdrücken das Immunsystem durch Blockade von deutlich unterschiedlichen biochemischen Reaktionen, die gewöhnlich die Aktivierung von Immunzellen einleiten würden. Kurz, Cyclosporin A und FK506 wirken bald nach der Ca2+-abhängigen T-Zell-Aktivierung, um die Synthese von Cytokinen, die wichtig sind für die Aufrechterhaltung und Amplifikation der Immunantwort, zu verhindern. Rapamycin wirkt später, um multiple Beeinflussungen von Cytokinen auf Immunzellen, einschließlich der Inhibition von Interleukin-2 (IL2)-ausgelöster T-Zell-Proliferation, zu blockieren, aber seine antiproliferativen Wirkungen sind nicht nur auf T- und B-Zellen beschränkt. Rapamycin inhibiert auch selektiv die Proliferation von Wachstumsfaktor-abhängigen und Wachstumsfaktor-unabhängigen Nicht-Immunzellen. Von Rapamycin wird allgemein angenommen, dass es Zellproliferation durch Blockade spezifischer Signal-Vorgänge, die für den Start der S-Phase für eine Anzahl von Zell-Typen einschließlich Lymphocyten (Bierer et al. (1990) PNAS 87: 9231–9235; und Dumont et al. (1990) J. Immunol 144: 1418–1424) sowie Nicht-Immunzellen wie Hepatocyten (Francavilla et al. (1992) Hepatology 15: 871–877; und Price et al. (1992) Science 257: 973–977) wichtig sind, inhibiert. Einige Beweisansätze legen nahe, dass die Assoziation von Rapamycin mit unterschiedlichen Mitgliedern einer Familie von intrazellulären FK506/Rapamycin-Bindungsproteinen (FKBPs) nötig ist für die Inhibition der G1-Progession, die durch Rapamycin vermittelt wird. Zum Beispiel werden die Wirkungen von Rapamycin durch ein Übermaß der strukturellen FKBP-Liganden FK506 oder 506BD umgekehrt (Brierer et al. supra; Dumont et al. supra; und Bierer et al. (1990) Science 250: 556–559).
  • Cyclosporin A bindet an eine Klasse von Proteinen, genannt Cyclophiline (Walsh et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 13115–13118), wogegen die Primärziele für sowohl FK506 als auch Rapamycin, wie oben angedeutet, die FKBPs sind (Harding et al. (1989) Nature 341: 758–760; Siekienka et al. (1989) Nature 341: 755–757; und Soltoff et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 17472–17477). Sowohl die Cyclophilin/Cyclosporin- als auch die FKBP12/FK506-Komplexe binden an eine spezifische Proteinphosphatase (Calcineurin), von der angenommen wird, dass sie die Aktivität von IL-2-Gen-spezifischenTranskriptions-Aktivatoren kontrolliert (Literaturübersicht in Schreiber (1991) Cell 70: 365–368). Im Gegensatz dazu sind die nachgeschalteten Zellziele für den Rapamycin-sensitiven Signalweg nicht besonders gut charakterisiert, im besonderen was die Identität des direkten Ziels des FKBP-Rapamycin-Komplexes betrifft.
  • Die TOR1- und TOR2-Gene von S. cerevisiae wurden ursprünglich durch Mutationen identifiziert, die Zellen erbringen, die resistent gegen Rapamycin sind (Heitman et al. (1991) Science 253: 905–909), und es gab eine frühe Spekulation, dass der FKBP/Rapamycin-Komplex die zelluläre Funktion des TOR-Genprodukts durch direkte Bindung an einen Phosphoserin-Rest von entweder TOR1 oder TOR2 inhibieren könnte. In der Folge wurden jedoch neue Modelle für die Rapamycin-Arzneistoff-Interaktion vorgeschlagen, die nicht die direkte Bindung des FKBP/Rapamycin-Komplexes an die TOR-Proteine einbeziehen. Zum Beispiel schrieb, basierend auf Versuchsdaten bezüglich Cyclin-cdk-Aktivität in Rapamycin-behandelten Zellen, das Schreiber-Labor in Albers et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 22825–22829:
    'Obwohl es möglich ist, dass das TOR2-Genprodukt ein direktes Ziel des FKBP-Rapamycin-Komplexes ist, ist eine wahrscheinlichere Erklärung die, dass das TOR2-Genprodukt dem direkten Ziel von Rapamycin nachgeschaltet vorkommt, und dass die TOR2-Mutation bewirkte, dass das Protein konstitutiv aktiv wurde. Wenn das letztere Modell korrekt ist, dann trifft das TOR2-Genprodukt auf p70s6k, Cyclin-abhängigen Kinasen und Cyclin D1 als Proteine, die dem direkten Ziel des FKBP-Rapamycin-Komplexes nachgeschaltet vorkommen, und von denen gezeigt wurde, dass sie wichtige Rollen spielen in der Zellzyklus-Progression. Die Identifizierung des direkten Ziels des FKBP-Rapamycin-Komplexes wird wahrscheinlich eine vorgeschaltete Komponente des Signal-Transduktions-Signalwegs, die zur G1-Progression führt, offen legen und wird helfen, die Signal-Transduktionswege aufzuklären, die Wachstumsfaktor-vermittelte Signalvorgänge und Cyclin-cdk-Aktivität, die für die Zellzyklus-Progression benötigt werden, verbindet.'
  • In gleicher Weise, nach Untersuchung der Rolle von TOR1- und TOR2-Mutationen in Rapamycin-resistenten Hefezellen, schrieb die Livi-Gruppe in Cafferkey et al. (1993) Mol. Cell Biol. 13: 6012–6023:
    'Daher dürfen die Aminosäure-Veränderungen, die wir im Rapamycin-freigesetzten DRR1 [TOR1]-Protein identifiziert haben, ermöglichen, dass es den Verlust des proliferativen Signals kompensiert, das durch Rapamycin mehr durch konstituitive Aktivierung eines alternativen Signals als durch Verhinderung seiner Assoziation mit dem FKBP12-Rapamycin-Komplex inhibiert wurde. Die Positionen der Mutationen innerhalb der Kinase-Domäne, aber in einer Region, die nicht von den PI 3-Kinasen geteilt wird, unterstützt diese Idee. Daher ist es gänzlich möglich, dass DRR1 nicht eine Komponente des Rapamycin-sensitiven Sinalwegs in Wildtyp-Hefezellen ist. Statt dessen können Unsinns-Mutationen in DRR1 an Ser-1972 seine normale Aktivität verändern und ihm ermöglichen, dass es die Funktion eines essentiellen Proteins ersetzt, dass das wahre Ziel von Rapamycin ist'.
  • Kunz et al. (1993) Cell 73: 585–596 beschreiben die Clonierung des Hefe-TOR2-Gens, das ein 282 kD-Phosphatidylinositol (pi)3-Kinase-Homolog codiert. Das Protein ist angeblich ein Ziel für einen G1-Arrest durch FKBP12-Rapamycin. Die Autoren beschreiben signifikante Ähnlichkeit zwischen der C-terminalen Hälfte des TOR2-Proteins mit verschiedenen Proteinen des Standes der Technik. Die N-Enden zeigten jedoch keine Ähnlichkeit mit irgendwelchen Proteinen des Standes des Technik. Kunz und Kollegen schließen daraus, dass der Wirkungsmechanismus von Rapamycin in Hefe in T-Zellen ähnlich ist und dass das Ziel von FKBP12-Rapamycin im IL2-Signal-Transduktions-Signalweg von T-Zellen ein TOR-Homolog ist. Diese Schlussfolgerung ist unter anderem basierend auf der Beobachtung, dass das Zielprotein FKBP12 konserviert ist zwischen Hefe und Menschen. Es wird weiter vorgeschlagen, dass die Protein-Protein-Interaktionen zwischen FKBP12 und TOR konserviert sind. Die Lehre von Kunz et al. liefert jedoch keinen Hinweis, dass TOR2 direkt an FKBP (FPR1 in Hefe) bindet. In der Tat erklären Kunz et al. in dieser Publikation, dass es unklar ist, ob TOR2 direkt mit FKBP interagiert oder ob die zwei Proteine in dem gleichen Signalweg funktionieren.
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, zelluläre Proteine zu identifizieren, die die direkt nachgeschalteten Zielproteine für den FKBP/Rapamycin-Komplex sind, und die Gene, die diese Proteine codieren, zu isolieren.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung von neuen Proteinen menschlichen Ursprungs, die unmittelbar nachgeschaltete Ziele für FKBP/Rapamycin-Komplexe sind. Wie hierin beschrieben, wurde ein Arzneistoff-abhängiger Interaktions-Einfangtest verwendet, um eine Anzahl von Proteinen, die mit einem FK506-bindenden Protein/Rapamycin-Komplex interagieren und die hierin zusammen als ,RAP-Bindungsproteine' oder ,RAP-BPs' bezeichnet werden, zu isolieren. Im speziellen wurden einige Säuger-Gene (Orthologe) für ein Proteine cloniert, das hierin als ,RAPT1' bezeichnet wird, wobei das Protein anscheinend in Beziehung steht zu den Hefe-TOR1- und TOR2-Produkten. Darüber hinaus wurde eine neues Ubiquitin-konjugierendes Enzym, hierin als ,rap-UBC' bezeichnet, basierend auf seiner Fähigkeit, FKBP/Rapamycin-Komplexe zu binden, cloniert. Zusätzlich wurde ein RAPT1-ähnliches Protein aus dem menschlichen Pathogen Candida cloniert. Die vorliegende Erfindung macht daher neue Proteine (sowohl rekombinante als auch aufgereinigte Formen), rekombinante Gene und andere neue Reagenzien und Tests zur diagnostischen und therapeutischen Verwendung verfügbar.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung in eukaryontischen Zellen, im besonderen menschlichen Zellen, von neuen Protein-Protein-Interaktionen zwischen den FK506-Bindungsprotein/Rapamycin-Komplexen und bestimmten zellulären Proteinen, die in der Folge hierin als ,RAP-Bindungsproteine' oder ,RAP-BP' bezeichnet werden.
  • Im allgemeinen betrifft die Erfindung ein Säuger-RAPT1-Polypeptid, bevorzugt eine im wesentlichen reine Aufbereitung eines RAPT1-Polypeptids, oder ein rekombinantes RAPT1-Polypeptid. In bevorzugten Ausführungsformen hat das Polypeptid eine biologische Aktivität, die mit seiner Bindung an Rapamycin in Beziehung steht, z. B. es behält die Fähigkeit an einen FKBP/Rapamycin-Komplex zu binden bei, obwohl es in der Lage sein kann, die Bildung von Rapamycin-abhängigen Komplexen entweder zu agonisieren oder zu antagonisieren. Das Polypeptid kann identisch sein zu einem Polypeptid, gezeigt in SEQ ID No: 2, oder es kann lediglich homolog zu jener Sequenz sein. Zum Beispiel hat das Polypeptid vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die mindestens 70% homolog ist zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID No: 2, obwohl höhere Sequenz-Homologien von zum Beispiel 80%, 90% oder 95% auch in Betracht gezogen werden und im allgemeinen bevorzugt werden. Das Polypeptid kann das Voll-Längen-Protein umfassen oder einen Teil eines Voll-Längen-Proteins wie die RAPT1-Polypeptide, dargestellt in SEQ ID No: 2, oder ein noch kleineres Fragment dieses Proteins, wobei das Fragment zum Beispiel mindestens 20, 50, 100 oder 150 Aminosäuren lang sein kann. Wie unten beschrieben, kann das RAPT1-Polypeptid entweder ein Agonist (z. B. nachahmend) oder alternativ ein Antagonist einer biologischen Aktivität einer natürlich vorkommenden Form des Proteins sein, z. B. ist das Polypeptid fähig, die Bildung von Rapamycin-Komplexen wie Komplexen, die FK506-Bindungsproteine oder Zellzyklus-regulierende Proteine einbeziehen, zu modulieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform darf sich ein Peptid, das mindestens eine biologische Aktivität der erfindungsgemäßen RAPT1-Polypeptide aufweist, in der Aminosäuresequenz von der Sequenz in SEQ ID No: 2 unterscheiden, aber solche Unterschiede resultieren in einem modifizierten Protein, das in der gleichen oder ähnlichen Weise funktioniert, wie das native RAPT1-Protein, oder die gleichen oder ähnliche Eigenschaften des nativen RAPT1-Proteins aufweist. Homologe des natürlich vorkommenden Proteins werden jedoch in Betracht gezogen, die antagonistisch zu der normalen zellulären Rolle des natürlich vorkommenden Proteins sind.
  • In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen ist das RAPT1-Protein ein rekombinantes Fusionsprotein, das einen zweiten Polypeptid-Teil einschließt, z. B. ein zweites Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die nicht in Beziehung steht zu dem RAPT1-Polypeptid-Teil, z. B. ist der zweite Polypeptid-Teil Glutathion-S-Transferase, z. B. ist der zweite Polypeptid-Teil eine DNA-bindende Domäne eines Transkriptionsregulations-Proteins, z. B. ist der zweite Polypeptid-Teil eine RNA-Polymerase-aktivierende Domäne, z. B. ist das Fusionsprotein funktionell in einem Zwei-Hybrid-Test.
  • Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Immunogen, umfassend ein RAPT1-Peptid in einer immunogenen Herstellung, wobei das Immunogen fähig ist, eine Immunantwort, die spezifisch ist für das RAPT1-Polypeptid, hervorzurufen; z. B. eine humorale Antwort, z. B. eine Antikörper-Antwort; z. B. eine zelluläre Antwort. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Immunogen eine antigene Determinante, z. B. eine einzigartige Determinante, von einem Protein, dargestellt durch SEQ ID No: 2.
  • Hierin ist auch ein RAPT1-ähnliches Polypeptid von einer Candida-Art (caRAPT1) beschrieben, vorzugsweise eine im wesentlichen reine Herstellung von einem caRAPT1-Polypeptid oder ein rekombinantes caRAPT1-Polypeptid. Das caRAPT1-Polypeptid kann eine biologische Aktivität in Verbindung mit seiner Bindung an Rapamycin aufweisen, z. B., es behält die Fähigkeit zur Bindung an einen Rapamycin-Komplex wie einen FKBP/Rapamycin-Komplex. Das Polypeptid kann identisch sein mit dem Polypeptid, gezeigt in SEQ ID No: 14, oder es kann lediglich homolog zu dieser Sequenz sein. Zum Beispiel hat das caRAPT1-Polypeptid vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die mindestens 60% homolog ist zu der Aminosäuresequenz in SEQ ID No: 14, obwohl höhere Sequenz-Homologien von zum Beispiel 80%, 90% oder 95% auch in Betracht gezogen werden. Das caRAPT1-Polypeptid kann das ganze Polypeptid, dargestellt in SEQ ID No: 14, umfassen, oder es kann ein Fragment dieses Proteins umfassen, wobei das Fragment zum Beispiel mindestens 5, 10, 20, 50 oder 100 Aminosäuren lang sein kann. Das caRAPT1-Polypeptid kann entweder ein Agonist (z. B. nachahmend) oder alternativ ein Antagonist einer biologischen Aktivität einer natürlich vorkommenden Form des Proteins sein.
  • Ein Peptid, das mindestens eine biologische Aktivität des erfindungsgemäßen caRAPT1-Polypeptids aufweist, kann sich in der Aminosäuresequenz von der Sequenz in SEQ ID No: 14 unterscheiden, aber solche Unterschiede resultieren in einem modifizierten Protein, das in der gleichen oder ähnlichen Weise wie das native caRAPT1 funktioniert oder das die gleichen oder ähnliche Eigenschaften des nativen Proteins aufweist. Homologe das natürlich vorkommenden caRAPT1-Proteins werden in Betracht gezogen, die antagonistisch zu der normalen zellulären Funktion des natürlich vorkommenden Proteins sind.
  • Das caRAPT1-Protein kann ein rekombinantes Fusionsprotein sein, das einen zweiten Polypeptid-Teil einschließt, z. B. ein zweites Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die nicht in Beziehung steht zu der caRAPT1-Sequenz, z. B. ist der zweite Polypeptid-Teil Glutathion-S-Transferase, z. B. ist der zweite Polypeptid-Teil eine DNA-bindende Domäne eines Transkriptionsregulations-Proteins, z. B. ist der zweite Polypeptid-Teil eine RNA-Polymerase-aktivierende Domäne, z. B. ist das Fusionsprotein funktionell in einem Zwei-Hybrid-Test.
  • Auch in Betracht gezogen wird ein Immunogen, umfassend ein caRAPT1-Peptid in einer immunogenen Herstellung, wobei das Immunogen fähig ist, eine Immunantwort, spezifisch für das caRAPT1-Polypeptid, hervorzurufen; z. B. eine humorale Antwort, z. B. eine Antikörper-Antwort; z. B. eine zelluläre Antwort. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Immunogen eine antigene Determinante, z. B. eine einzigartige Determinante, von einem Protein, dargestellt durch SEQ ID No: 14.
  • Ein noch weiterer Aspekt ist eine Antikörper-Herstellung, die spezifisch mit einem Epitop des caRAPT1-Immunogens reagiert.
  • Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt Fragmente von einem RAPT1, z. B. hRAPT1 oder mRAPT1, wobei die Fragmente die Fähigkeit beibehalten, an ein FK-Bindungsprotein in einer Rapamycin-abhängigen Weise zu binden. Dementsprechend ermöglicht die vorliegende Erfindung die Herstellung von Arzneistoff-Durchmusterungs-Tests, im besonderen von Tests mit hohen Durchgängen, wie unten beschreiben, zur Identifizierung von Immunsuppressoren, antimykotischen Agenzien und dergleichen, die durch die Bindung der Rapamycin-Bindungsdomäne der RAPT1-ähnlichen Proteine wirken. Zum Beispiel liefert die vorliegende Erfindung Teile der RAPT1-ähnlichen Proteine, die leichter zu manipulieren sind als das Voll-Längen-Protein. Das Voll-Längen-Protein ist auf Grund seiner Größe schwieriger zu exprimieren als ein rekombinantes Protein oder ein Fusionsprotein, das die Rapamycin-Bindungs-Aktivität beibehalten würde, und kann sehr wohl unlöslich sein. Hierin sind auch lösliche Polypeptide beschrieben, die einen löslichen Teil eines RAPT1-ähnlichen Polypeptids einschließen, der an besagten FKBP/Rapamycin-Komplex bindet, wie an die Rapamycin-bindende Domäne, dargestellt durch eine Aminosäuresequenz, selektiert aus der Gruppe, bestehend aus Val26-Tyr160 von SEQ ID No: 2 (mRAPT1), Val2012-Tyr2144 von SEQ ID No: 12 (hRAPT1), Val41-Tyr173 von SEQ ID No: 14 (caRAPT1), Val1-Tyr133 von SEQ ID No: 16 (TOR1) und Val1-Arg133 von SEQ ID No: 18 (TOR2).
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert eine im wesentlichen isolierte Nucleinsäure, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die ein RAPT1-Polypeptid codiert. In bevorzugten Ausführungsformen: das codierte Polypeptid bindet spezifisch einen Rapamycin-Komplex und/oder ist in der Lage, den Zusammenbau von Rapamycin-enthaltenden Protein-Komplexen entweder zu agonisieren oder zu antagonisieren. Die codierende Sequenz der Nucleinsäure kann eine RAPT1-codierende Sequenz umfassen, die identisch zu der cDNA, gezeigt in SEQ ID No: 1, sein kann, oder sie kann lediglich homolog zu dieser Sequenz sein. Zum Beispiel hat die RAPT1-codierende Sequenz vorzugsweise eine Sequenz, mindestens 70% homolog zu der Nucleotidsequenz in SEQ ID No: 1, obwohl höhere Sequenzhomologien von zum Beispiel 80%, 90% oder 95% auch in Betracht gezogen werden. Die Nucleinsäure kann die Nucleotid-Sequenz, dargestellt in SEQ ID No: 1, umfassen, oder sie kann ein Fragment jener Nucleinsäure umfassen, wobei das Fragment zum Beispiel ein Fragment codieren kann, das zum Beispiel mindestens 5, 10, 20, 50, 100 oder 133 Aminosäuren lang ist. Das Polypeptid, das von der Nucleinsäure codiert wird, kann entweder ein Agonist (z. B. nachahmend) oder alternativ ein Antagonist einer biologischen Aktivität einer natürlich vorkommenden Form des RAPT1-Proteins sein, z. B. das Polypeptid ist fähig, Rapamycin-vermittelte Protein-Komplexe zu modulieren.
  • Darüber hinaus wird in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen die erfindungsgemäße RAPT1-Nucleinsäure eine Transkriptionsregulations-Sequenz einschließen, z. B. mindestens eine von einer Transkriptions-Promotor- oder Transkriptions-Enhancer-Sequenz, wobei die regulatorische Sequenz funktionell verbunden ist mit der RAPT1-Gensequenz. Solche regulatorischen Sequenzen können verwendet werden, um die RAPT1-Gensequenz passend für die Verwendung als ein Expressionsvektor zu machen.
  • Auch in Betracht gezogen wird eine Nucleinsäure, die unter stringenten Bedingungen an eine Nucleinsäure-Sonde hybridisiert, die mindestens 12 aufeinanderfolgenden Nucleotiden von SEQ ID No: 1 und/oder 11 entspricht; bevorzugterweise mindestens 20 aufeinanderfolgenden Nucleotiden, und mehr bevorzugt mindestens 40 aufeinanderfolgenden Nucleotiden. Die Nucleinsäure kann an eine Region der menschlichen oder Maus-RAPT1-Gene hybridisieren, die der Bindungs-Domäne für Rapamycin entsprechen.
  • Darüber hinaus wird auch eine im wesentlichen isolierte Nucleinsäure in Betracht gezogen, die eine Nucleotid-Sequenz aufweist, die ein caRAPT1-Polypeptid codiert. In bevorzugten Ausführungsformen: das codierte Polypeptid bindet spezifisch Rapamycin-Komplexe und/oder ist in der Lage die Bildung von Rapamycin-enthaltenden Protein-Komplexen entweder zu agonisieren oder zu antagonisieren. Die codierende Sequenz der Nucleinsäure kann eine caRAPT1-codierende Sequenz umfassen, die identisch sein kann zu der cDNA, gezeigt in SEQ ID No: 13, oder sie kann lediglich homolog sein zu dieser Sequenz. Zum Beispiel hat die caRAPT1-codierende Sequenz bevorzugt eine Sequenz, die mindestens 60% homolog ist zu den Nucleotidsequenzen in SEQ ID No: 13, obwohl höhere Sequenzhomologien von zum Beispiel 80%, 90% oder 95% auch in Betracht gezogen werden. Die Nucleinsäure kann die Nucleotid-Sequenz, die in SEQ ID No: 13 dargestellt ist, umfassen, oder sie kann ein Fragment dieser Nucleinsäure umfassen, wobei das Fragment zum Beispiel ein Fragment codieren kann; das zum Beispiel mindestens 5, 10, 20, 50, 100 oder 140 Aminosäuren lang ist. Das Polypeptid, das von der Nucleinsäure codiert wird, kann entweder ein Agonist (z. B. nachahmend) oder alternativ ein Antagonist einer biologischen Aktivität einer natürlich vorkommenden Form des caRAPT1-Proteins sein, z. B. ist das Polypeptid fähig, Rapamycin-vermittelte Protein-Komplexe zu modulieren.
  • Die erfindungsgemäße caRAPT1-Nucleinsäure kann eine Transkriptionsregulations-Sequenz einschließen, z. B. mindestens eine von einer Transkriptions-Promotor- oder Transkriptions-Enhancer-Sequenz, wobei die regulatorische Sequenz funktionell verbunden ist mit der caRAPT1-Gensequenz. Solche regulatorischen Sequenzen können verwendet werden, um die caRAPT1-Gensequenz passend für die Verwendung als ein Expressions-Vektor zu machen.
  • Die Nucleinsäure kann unter stringenten Bedingungen an eine Nucleinsäure-Sonde hybridisieren, die mindestens 12 aufeinanderfolgenden Nucleotiden der SEQ ID No: 13 entspricht; bevorzugterweise mindestens 20 aufeinanderfolgenden Nucleotiden und mehr bevorzugt mindestens 40 aufeinanderfolgenden Nucleotiden.
  • Die Beschreibung betrifft auch transgene nicht-menschliche Tiere, z. B. Mäuse, Ratten, Kaninchen oder Schweine, die ein Transgen haben, z. B. Tiere, die eine heterologe Form eines der RAP-BP-Gene, die hierin beschrieben sind, einschließen (und vorzugsweise exprimieren), z. B. ein Gen, das von Menschen stammt oder das ein endogenes RAP-BP-Gen fehl-exprimiert, z. B. ein Tier, in dem die Expression von einem oder mehreren der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine zerstört ist. Solch ein transgenes Tier kann als ein Tiermodell für die Untersuchung von zellulären Störungen, umfassend mutierte oder fehl-exprimierte RAP-BP-Allele, oder für die Verwendung in der Arzneimittel-Durchmusterung dienen.
  • Es wird auch eine Sonde/ein Primer geliefert, umfassend ein im wesentlichen gereinigtes Oligonucleotid, wobei das Oligonucleotid eine Region einer Nucleotidsequenz umfasst, die unter stringenten Bedingungen an mindestens 10 aufeinanderfolgende Nucleotide der Sense- oder Antisense-Sequenz von einer der SEQ ID Nos: 1, 11 oder 13 oder natürlich vorkommende Mutanten davon hybridisiert. Die Sonde/der Primer kann darüber hinaus eine Markierungs-Gruppe, die daran angehängt und in der Lage ist, nachgewiesen zu werden, enthalten. Die Markierungs-Gruppe kann z. B. aus einer Gruppe, bestehend aus Radioisotopen, fluoreszierenden Verbindungen, Enzymen und Enzym-Co-Faktoren, selektiert werden. Sonden der Erfindung können als ein Teil eines diagnostischen Test-Kits für die Identifizierung von transformierten Zellen verwendet werden, wie für den Nachweis einer Menge einer Nucleinsäure, die eines der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine codiert, in einer Probe von Zellen, die von einem Patienten isoliert wurde; z. B. Messen der RAP-BP-mRNA-Menge in einer Zelle oder Feststellen, ob das genomische RAP-BP-Gen mutiert oder deletiert wurde. Vorzugsweise ist das Oligonucleotid mindestens 10 Nucleotide lang, obwohl Primer von 20, 30, 50, 100 oder 150 Nucleotiden Länge auch in Betracht gezogen werden.
  • Hierin sind auch Testsysteme zur Durchmusterung von Test-Verbindungen nach Molekülen, die eine Interaktion zwischen einem RAP-Bindungsprotein und Rapamycin/Protein-Komplexen induzieren, beschrieben. Ein beispielhaftes Verfahren schließt die Schritte ein von (i) Kombinieren eines RAP-Bindungsproteins der Erfindung, eines FK506-Bindungsproteins und einer Test-Verbindung, z. B, unter Bedingungen, in denen das FK506-Bindungsprotein und das RAP-Bindungsprotein, nicht aber die Test-Verbindung, außer Stande sind, zu interagieren; und (ii) Nachweis der Bildung eines Arzneistoff-abhängigen Komplexes, der das FK506-Bindungsprotein und das RAP-Bindungsprotein enthält. Eine statistisch signifikante Veränderung wie eine Steigerung der Bildung des Komplexes in der Anwesenheit einer Test-Verbindung (relativ zu dem, was in Abwesenheit der Test-Verbindung beobachtet wurde) weist auf eine Modulierung, z. B. Induktion der Interaktion zwischen dem FK506-Bindungsprotein und dem RAP-Bindungsprotein, hin. Darüber hinaus werden Primär-Durchmusterungen geliefert, in denen das FK506-Bindungsprotein und das RAP-Bindungsprotein in einem Zell-freien System kombiniert sind und mit der Test-Verbindung in Kontakt gebracht werden; d. h. das Zell-freie System wurde aus einer Gruppe selektiert, bestehend aus einem Zell-Lysat und einem wiederhergestellten Protein-Gemisch. Alternativ werden FK506-Bindungsprotein und das RAP-Bindungsprotein simultan exprimiert, z. B. rekombinant in einer Zelle, und die Zelle wird in Kontakt gebracht mit der Test-Verbindung, z. B. als ein Interaktions-Einfangtest (Zwei-Hybrid-Test).
  • Des weiteren wird hierin ein Verfahren zur Behandlung eines Tieres dargestellt, das unerwünschtes Zell-Wachstum aufweist, das charakterisiert ist durch Verlust der Wildtyp-Funktion von einem oder mehreren der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch effektiven Menge eines Agens, das fähig ist, die Interaktion des RAP-Bindungsproteins mit anderen zellulären oder viralen Proteinen zu inhibieren. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung eines Nucleinsäure-Konstrukts, das Polypeptide codiert, die in einer der SEQ ID Nos: 2 oder 12 dargestellt sind, unter Bedingungen, unter denen das Konstrukt von Zellen eingebaut wird, denen das RAP- Bindungsprotein fehlt, und unter Bedingungen, in denen das rekombinante Gen exprimiert wird, z. B. durch Gen-Therapie-Verfahren. In anderen Ausführungsformen wird die Wirkung eines natürlich vorkommenden RAP-Bindungsproteins antagonisiert durch therapeutische Expression eines RAP-BP-Homologs, das zum Beispiel ein Antagonist der Bildung von Rapamycin-vermittelten Komplexen ist, oder durch Abgabe eines Antisense-Nucleinsäure-Moleküls, das Transkription und/oder Translation des angezielten RAP-BP-Gens inhibiert, antagonisiert.
  • Ein weiteres Verfahren bezieht sich auf den Nachweis, ob ein Individuum, z. B. ein menschlicher Patient, ein Risiko aufweist für eine Störung, die charakterisiert ist durch ungewollte Zellproliferation. Das Verfahren schließt den Nachweis, der Anwesenheit oder Abwesenheit einer genetischen Läsion in einem Gewebe des Individuums ein, die charakterisiert ist durch mindestens eine von (i) eine Mutation eines Gens, codierend ein Protein, das dargestellt ist durch eine von SEQ ID Nos: 1 oder 11, oder ein Homolog davon; (ii) die Fehl-Expression eines Gens, codierend ein Protein, dargestellt durch eine der SEQ ID Nos: 1 oder 11; oder (iii) die Fehleinbau eines RAP-Bindungsproteins in einem regulatorischen Protein-Komplex, z. B. einem Rapamycin-enthaltenden Komplex. In bevorzugten Ausführungsformen: Nachweis der genetischen Läsion schließt das Sicherstellen des Vorkommens von mindestens einem der folgenden Punkte ein: einer Deletion von einem oder mehreren Nucleotiden vom RAP-BP-Gen; einer Addition von einem oder mehreren Nucleotiden des Gens, einer Substitution von einem oder mehreren Nucleotiden des Gens, einer gravierenden chromosomalen Umordnung des Gens; einer Änderung in der Menge eines Messenger-RNA-Transkripts des Gens; der Anwesenheit eines nicht-Wildtyp Spleißmusters eines Messenger-RNA-Transkripts des Gens; oder einer nicht-Wildtyp-Menge des Proteins.
  • Zum Beispiel kann der Nachweis der genetischen Läsion einschließen (i) Bereitstellen einer Sonde/eines Primers, einschließlich eines Oligonucleotids, das eine Region einer Nucleotidsequenz enthält, die an eine Sense- oder Antisense-Sequenz von einer der SEQ ID Nos: 1 oder 11 oder natürlich vorkommende Mutanten davon oder 5'- oder 3'-flankierende Sequenzen, die natürlicherweise mit dem RAP-BP-Gen assoziiert sind, hybridisiert; (ii) Aussetzen der Sonde/des Primers einer Nucleinsäure des Gewebes; und (iii) Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit der genetischen Läsion durch Hybridisierung der Sonde/des Primers an die Nucleinsäure; z. B. worin der Nachweis der Läsion die Anwendung der Sonde/des Primers umfasst, um die Nucleotidsequenz des RAP-BP-Gens und ggf. die flankierenden Nucleinsäuresequenzen festzustellen. Zum Beispiel kann die Sonde/der Primer in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden, oder in einer Ligierungs-Kettenreaktion (LCR). In alternativen Ausführungsformen wird die Menge des RAP-Bindungsproteins in einem Immuntest nachgewiesen unter Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch immunreaktiv ist mit einem Protein, dargestellt durch eine der SEQ ID Nos: 1 oder 11.
  • In ähnlicher Weise kann eine Candida-Infektion nachgewiesen werden durch die Verwendung von Sonden/Primern, die an ein Candida-Gen hybridisieren, das ein RAPT1-ähnliches Protein codiert. Zum Beispiel kann das Verfahren beinhalten (i) Bereitstellen einer Sonde/eines Primers, einschließend ein Oligonucleotid, das eine Region einer Nucleotidsequenz enthält, die an eine Sense- oder Antisense-Sequenz von einer der SEQ ID NO: 13 oder an natürlich vorkommende Mutanten davon oder 5'- oder 3'-flankierende Sequenzen hybridisiert, die natürlicherweise assoziiert sind mit dem caRAPT1-Gen; (ii) Aussetzen der Sonde/des Primers einer Nucleinsäure einer biologischen Probe, z. B.: Bewebebiopsie, Flüssigkeitsprobe, Kot, etc.; und (iii) Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Candida-Organismus durch Hybridisierung der Sonde/des Primers an die Nucleinsäure.
  • Hierin ist auch ein in vivo-Verfahren zur Isolation von Genen beschrieben, die Proteine codieren, die physikalisch mit einem ,Köder'-Protein/Arzneistoff-Komplex interagieren. Das Verfahren ist abhängig vom Nachweis der Wiederherstellung eines transkriptionellen Aktivators in der Anwesenheit des Arzneistoffes, im speziellen worin der Arzneistoff ein kleines, organisches nicht-Peptidyl-Molekül ist (z. B. < 2500K), z. B. Makrolid, z. B. Rapamycin, FK506 oder Cyclosporin. Im speziellen verwendet das Verfahren chimäre Gene, die Hybrid-Proteine exprimieren. Das erste Hybrid umfasst die DNA-bindende Domäne eines transkriptionellen Aktivators, fusioniert an das Köder-Protein. Das zweite Hybrid-Protein enthält eine transkriptionelle Aktivator-Domäne, fusioniert an ein ,Fisch'-Protein, z. B. ein Test-Protein, das aus einer cDNA-Genbank stammt. Wenn die Fisch- und Köder-Proteine fähig sind, in einer Arzneistoff-abhängigen Weise zu interagieren, bringen sie die zwei Domänen des transkriptionellen Aktivators in enge Nachbarschaft. Diese Nähe ist ausreichend, um die Transkription eines Reporter-Gens zu bewirken, das in der Wirkung funktionell verbunden ist mit einer transkriptionellen Regulations-Stelle, die auf den transkriptionellen Aktivator anspricht, und die Expression des Marker-Gens kann nachgewiesen und verwendet werden, um die Interaktion des Köder-Protein/Arzneistoff-Komplexes mit einem anderen Protein zu bewerten.
  • Die Anwendung der vorliegenden Erfindung wird, außer anderweitig hingewiesen, konventionelle Methoden der Zellbiologie, Zellkultur, Molekularbiologie, Transgen-Biologie, Mikrobiologie, rekombinante DNA und Immunologie verwenden, die innerhalb der Fähigkeit des Fachbereiches liegen. Solche Methoden sind in der Literatur zur Gänze erklärt. Siehe zum Beispiel Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. Aufl., Hrsg.. Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Bände I und II (D. N. Glover Hrsg., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait Hrsg., 1984); Multis et al. US-Patent Nr: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); die Abhandlung, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller und M. P. Calos Hrsg. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Bd. 154 und 155 (Wu et al. Hrsg.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer und Walker, Hrsg., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Bd. I–IV (D. M. Weir und C. C. Blackwell, Hrsg., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
  • Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden durch die folgende detaillierte Beschreibung und durch die Ansprüche deutlich.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt die Karte des pACT-Vektors, der verwendet wurde, um das menschliche RAPT1 zu clonieren. Die RAPT1-enthaltende Version von pACT, bezeichnet als ,plC524', wurde bei dem ATCC abgelegt.
  • 2 zeigt die Interaktion von FKBP12 und hRAPT1 (Rapamycin-Bindungs-Domäne) als eine Funktion der Rapamycin-Konzentration. Die Interaktion wird als β- Galaktosidase-Aktivität nachgewiesen. Es wird keine Interaktion nachgewiesen, wenn FK506 an Stelle von Rapamycin verwendet wird oder wenn lex.da (ein Kontroll-Plasmid) FKBP12 ersetzt.
  • 3 zeigt die relative Stärke der Interaktion zwischen Paaren von FK506-Bindungsproteinen und Rapamycin-Bindungs-Domänen (BD)-Fusionen in der Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen von Rapamycin, gemessen durch β-Galaktosidase-Expression (siehe Beispiel 8). Der Hefe-Reporter-Stamm VBY567 wurde mit den bezeichneten Paaren von Plasmiden transformiert. LexA-DNA-Bindungs-Domäne-Fusionen an menschliches FKBP12, Hefe-FKBP12 und an eine Sequenz, die nicht in Beziehung dazu steht und als Negativ-Kontrolle fungiert, wurden als ,Köder' verwendet. Die sauren VP16-Aktivierungs-Domäne-Fusionen an menschliche RAPT1-BD, menschliche RAPT1-BD, enthaltend die Serin-zu-Arginin Substitution, Hefe-Tor1-BD, Hefe-Tor1-BD (nicht gezeigt) und Candida albicans-RAPT1-BD wurden auf Interaktion gegen die Köder-Fusionen getestet. Transformanten, enthaltend jedes Paar von Plasmiden, wurden auf β-Galaktosidase-Expression in Medium, das das chromogene Substrat X-Gal enthält, getestet. Kolonien wurden entweder als weiß (offene Balken) oder blau (gefüllte Balken) nach Wachstum bei 30°C für 2 Tage bewertet. Die Mengen der β-Galaktosidase-Expression wurden qualitativ durch die Intensität der blauen Farbe mit 1 (Hellblau) bis 4 (tiefes Blau) bewertet.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Kürzliche Studien haben einige bemerkenswerte Einsichten in die molekulare Basis der eukaryontischen Zellzyklus-Regulation geliefert. Passage einer Säuger-Zelle durch den Zellzyklus wird an einer Anzahl von Schlüssel-Kontrollpunkten reguliert. Unter diesen sind die Punkte des Eintritts in die und Austritts von der Quieszenz (G0), der Restriktions-Punkt, der G1/S-Übergang und der G2/M-Übergang (zur Literaturübersicht siehe Draetta (1990) Trends Biol Sci 15: 378–383; und Sherr (1993) Cell 73: 1059–1065). Schließlich wird die Information von diesen Kontroll-Punkten durch die regulierende Aktivität einer Gruppe von verwandten Kinasen, den Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) integriert. Zum Beispiel wird der G1-zu-S-Phasen-Übergang jetzt so verstanden, dass er zeitlich präzise durch die vorübergehende Bildung von Multiprotein-Komplexen festgelegt ist, die die periodische Interaktion einer Vielzahl von Cyclinen und Cyclin-abhängigen Kinasen einbezieht.
  • Zur Illustration, die Stimulierung von ruhenden T-Lymphocyten durch Zell-gebundene Antigene löst ein komplexes Aktivierungs-Programm aus, das in Zellzyklus-Eintritt (G0-zu-G1-Übergang) und der Expression von Interleukin-2 (IL-2)-Rezeptoren mit hoher Affinität führt. Die folgende Bindung von IL-2 an seinen Rezeptor mit hoher Affinität bewirkt das Fortschreiten der aktivierten T-Zellen durch einen späten-G1-Phase-,Restriktions-Punkt' (Pardee (1989) Science 246: 603–608), nach dem die Zellen determiniert sind, daß ein relativ autonomes Programm der DNA-Replikation und schließlich die Mitose zu Ende geführt wird.
  • Eine wichtige Folge der Information bezüglich der eukaryontischen Zellzyklus-Regulation ist die Darstellung einer neuen Klasse von molekularen Zielen für potentielle Wachstums-modulierende Arzneistoffe. Der Makrolid-Ester Rapamycin ist ein wirksamer Immusuppressor, dessen Mechanismus der Wirkung in Beziehung steht zu der Inhibition von Cytokin-abhängiger T-Zell-Proliferation (Bierer et al. (1990) PNAS 87: 9231–9235; Dumont et al. (1990) J. Immunol 144: 1418–1424; Sigal et al. (1991) Transplant Proc 23: 1–5; und Sigal et al. (1992) Annu Rev Immunol 10: 519–560). Rapamycin beeinflusst spezifisch einen späten-G1-Phase-Vorgang, der nötig ist für das Fortschreiten von IL-2-stimulierten Zellen in die S-Phase (Morice et al. (1993) J Biol Chem 268: 3734–3738). Die Lage des Zellzyklus-Arrest-Punktes, der durch Rapamycin induziert wird, weist darauf hin, dass dieser Arzneistoff die regulatorischen Proteine beeinflusst, die den G1-zu-S-Phasen-Übergang lenken, im besonderen in Lymphocyten.
  • Wie hierin beschrieben, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Entdeckung von neuen Proteinen von Säuger-Ursprung, die unmittelbar nachgeschaltete Ziele für FKBP/Rapamycin-Komplexe sind. Wie unten beschrieben, wurde ein Arzneistoff-abhängiger Interaktions-Einfangtest verwendet, um eine Zahl von Proteinen zu isolieren, die an den FKBP12/Rapamycin-Komplex binden, und die hierin zusammen als ,RAP-Bindungsproteine' oder ,RAP-BPs' bezeichnet werden. Im speziellen wurden Maus- und menschliche Gene für ein Protein (hierin bezeichnet als ,RAPT1') cloniert, das anscheinend in Beziehung steht zu den Hefe-TOR1- und -TOR2-Gen-Produkten. Darüber hinaus wurde ein neues Ubiquitin-konjugiertes Enzym (hierin bezeichnet als ,rap-UBC') basierend auf seiner Fähigkeit, FKBP/Rapamycin-Komplexe zu binden, cloniert. Die vorliegende Erfindung macht daher neue Proteine (sowohl rekombinante als auch aufgereinigte Formen), rekombinante Gene und andere neue Reagenzien und Tests für die diagnostische und therapeutische Verwendung verfügbar. Darüber hinaus werden Arzneistoff-Entdeckungstests zur Identifizierung von Agenzien beschrieben, die die Bindung von einem oder mehreren der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine mit FK506-Bindungsproteinen modulieren können. Solche Agenzien können therapeutisch hilfreich sein, das Wachstum und/oder die Differenzierung einer Zelle zu verändern, aber sie können auch in vitro als Zellkultur-Zusätze zur Kontrolle der Proliferation und/oder Differenzierung von gezüchteten Zellen und gezüchtetem Gewebe verwendet werden. Andere Aspekte der Erfindung sind unten beschrieben oder werden für Fachleute im Lichte der vorliegenden Offenbarung deutlich.
  • Zur Vereinfachung werden bestimmte Begriffe, die in der Beschreibung, den Beispielen und angehängten Ansprüchen verwendet werden, hier gesammelt.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff ,Nucleinsäure' auf Polynucleotide wie Desoxyribonucleinsäure (DNA) und, wo es passend ist, Ribonucleinsäure (RNA). Es sollte auch verstanden werden, das der Begriff Äquivalente, Analoge von entweder RNA oder DNA, gebildet aus Nucleotid-Analogen, einschließt, und, wenn es auf die beschriebene Ausführungsform anwendbar ist, Einzelstrang (wie Sense- oder Antisense-)- und Doppelstrang-Polynucleotide.
  • Der Begriff ,Gen' oder ,rekombinantes Gen' bezeichnet eine Nucleinsäure, umfassend einen offenen Leserahmen, codierend ein RAP-Bindungsprotein der vorliegenden Erfindung, einschließlich sowohl Exon- und (gegebenenfalls) Intron-Sequenzen. Ein ,rekombinantes Gen' bezeichnet eine Nucleinsäure, codierend ein RAP-Bindungsprotein und umfassend RAP-BP-codierende Exon-Sequenzen, obwohl es gegebenenfalls Intron-Sequenzen enthalten darf, die entweder von einem chromosomalen RAP-BP-Gen stammen oder von einem chromosomalen Gen, das dazu nicht in Beziehung steht. Beispielhafte rekombinante Gene, die veranschaulichende RAP-Bindungsproteine codieren, schließen eine Nucleinsäure-Sequenz ein, dargestellt durch eine von SEQ ID NOs: 1, 11, 13 oder 23. Der Begriff ,Intron' bezeichnet eine DNA-Sequenz, die in einem gegebenen RAP-BP-Gen vorhanden ist, das nicht in ein Protein translatiert wird und im allgemeinen zwischen Exons gefunden wird.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff ,Transfektion' das Einbringen einer Nucleinsäure, z. B. eines Expressions-Vektors, in eine Empfänger-Zelle durch Nucleinsäure-vermittelten Gentransfer. ,Transformation', wie hierin verwendet, bezeichnet einen Vorgang, in dem der Genotyp einer Zelle als ein Resultat der zellulären Aufnahme von exogener DNA oder RNA verändert wird und zum Beispiel die transformierte Zelle eine rekombinante Form des RAP-Bindungsproteins der vorliegenden Erfindung exprimiert, oder wo Anti-Sense-Expression von dem transferierten Gen vorkommt, die Expression für eine natürlich vorkommende Form des RAP-Bindungsproteins zerstört ist.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff ,Vektor' ein Nucleinsäure-Molekül, das fähig ist, eine andere Nucleinsäure, an die er gebunden wurde, zu transportieren. Ein Typ des bevorzugten Vektors ist ein Episom, d. h. eine Nucleinsäure, die zur extra-chromosomalen Replikation fähig ist. Bevorzugte Vektoren sind jene, die fähig sind zur autonomen Replikation und Expression von Nucleinsäuren, an die sie gebunden sind. Vektoren, die fähig sind, die Expression von Genen, an die sie funktionell gebunden sind, zu lenken, werden hierin als ,Expressions-Vektoren' bezeichnet. Im allgemeinen liegen Expressions-Vektoren von Nützlichkeit für rekombinante DNA-Methoden oft in der Form von ,Plasmiden' vor, die zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleifen bezeichnen, die in ihrer Vektor-Form nicht an das Chromosom gebunden sind. In der vorliegenden Spezifikation werden ,Plasmid' und ,Vektor' austauschbar verwendet, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines Vektors ist. Die Erfindung plant dennoch, solche anderen Formen von Expressions-Vektoren einzuschließen, die äquivalente Funktionen haben und die im Anschluß hierzu auf dem Fachgebiet bekannt werden.
  • ,Transkriptionsregulations-Sequenz' ist ein generischer Begriff, der im gesamten Verlauf der Beschreibung verwendet wird, um DNA-Sequenzen zu bezeichnen, wie Start-Signale, Verstärker bzw. Enhancer und Promotoren, die die Transkription von Protein-codierenden Sequenzen, mit denen sie funktionell verbunden sind, induzieren oder kontrollieren. In bevorzugten Ausführungsformen steht die Transkription eines rekombinanten RAP-BP-Gens unter der Kontrolle einer Promotor-Sequenz (oder einer anderen transkriptionellen Regulations-Sequenz), die die Expression des rekombinanten Gens in einem Zell-Typ, in dem die Expression geplant ist, kontrolliert. Es wird verstanden werden, dass das rekombinante Gen unter der Kontrolle von Transkriptionsregulations-Sequenzen stehen kann, die die gleichen sind oder die verschieden sind von jenen Sequenzen, die die Transkription der natürlich vorkommenden Form des RAP-Bindungsproteins kontrollieren.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff ,Gewebe-spezifischer Promotor' eine DNA-Sequenz, die als ein Promotor dient, z. B. die Expression einer selektierten DNA-Sequenz, die funktionell gebunden ist an den Promotor, reguliert, und die die Expression der selektieren DNA-Sequenz in spezifischen Zellen eines Gewebes wie Zellen einer lymphoiden Linie, z. B. B- oder T-Lymphocyten, oder alternativ z. B. Leber-Zellen, beeinflusst. In einer illustrativen Ausführungsform können Gen-Konstrukte, die lymphoid spezifische Promotoren anwenden, durch Steuern der Expression der mutanten Form von RAP-BP nur in lymphatischem Gewebe als ein Teil einer Gen-Therapie verwendet werden, um dominant-negative Mutations-Formen eines RAP-Bindungs-Proteins zu liefern, um lymphatischen Zellen zu erhalten, die resistent sind gegen Rapamycin. Der Begriff überdeckt auch sogenannte ,leaky' Promotoren, die Expression einer selektierten DNA vorwiegend in einem Gewebe regulieren, aber Expression auch in anderen Geweben hervorrufen.
  • Wie hierin verwendet, ist ein ,transgenes Tier' jegliches Tier, bevorzugt ein nicht-menschliches Säugetier, ein Vogel oder eine Amphibie, in dem/der eine oder mehrere Zellen des Tieres heterologe Nucleinsäure enthalten, die durch menschliche Intervention eingebracht wurde, wie durch transgene Methoden, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Die Nucleinsäure wird in die Zelle direkt oder indirekt durch Einbringen in einen Vorläufer der Zelle, durch willentliche genetische Manipulation wie durch Mikroinjektion oder durch Infektion mit einem rekombinanten Virus eingebracht. Der Begriff genetische Manipulation schließt nicht klassische Kreuzungs-Züchtung oder in vitro-Fertilisation ein, sondern ist eher auf das Einbringen eines rekombinanten DNA-Moleküls gerichtet. Dieses Molekül kann in einem Chromosom integriert sein, oder es darf extrachromosomal-replizierende DNA sein. In den typischen transgenen Tieren, die hierin beschrieben werden, bewirkt das Transgen, dass Zellen eine rekombinante Form eines erfindungsgemäßen RAP-Bindungs-Proteins exprimieren, z. B. entweder agonistische oder antagonistische Formen. Transgene Tiere, in denen das rekombinante RAP-BP-Gen ruhig ist, werden jedoch auch in Betracht gezogen, wie zum Beispiel die FLP- oder CRE-Rekombinase-abhängigen Konstrukte, die unten beschrieben sind. Die ,nicht-menschlichen Tiere' der Erfindung schließen Vertebraten wie Nagetiere, nicht-menschliche Primaten, Schaf, Hund, Kuh, Hühner, Amphibien, Reptilien, usw. ein. Bevorzugte nicht-menschliche Tiere werden aus der Nagetier-Familie selektiert, einschließlich Ratte und Maus, am meisten bevorzugt Maus, obwohl transgene Amphibien wie Mitglieder der Xenopus-Gattung und transgene Hühner auch wichtige Hilfsmittel zum Verständnis von zum Beispiel Embryogenese und Gewebe-Musterung liefern können. Der Begriff ,chimäres Tier' wird hierin verwendet, um Tiere zu bezeichnen, in denen das rekombinante Gen gefunden wird oder in denen das rekombinante Gen in einigen, aber nicht allen Zellen des Tieres exprimiert wird. Der Begriff ,Gewebe-spezifisches chimäres Tier' weist darauf hin, dass das rekombinante RAP-BP-Gen in manchen Geweben, nicht aber in anderen vorhanden ist und/oder exprimiert wird.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff ,Transgen' eine Nucleinsäure-Sequenz (codierend z. B. ein RAP-Bindungs-Protein), die zum Teil oder gänzlich heterolog ist, d. h. fremd zu dem transgenen Tier oder der Zelle, in das/die sie eingebracht wird, oder homolog ist zu einem endogenen Gen des transgenen Tieres oder der Zelle, in das sie eingebracht wird, aber die entworfen wurde, um in das Genom des Tieres in solcher Weise inseriert zu werden, oder inseriert wird, um das Genom der Zelte, in die sie inseriert wird (z. B. wird sie an einer Stelle inseriert, die sich von der des natürlichen Gens unterscheidet, oder ihre Insertion resultiert in einem Knock-out), zu verändern. Ein Transgen kann eine oder mehrere transkriptionelle Regulations-Sequenzen und jegliche andere Nucleinsäure einschließen, wie Introns, die für eine optimale Expression einer selektierten Nucleinsäure nötig sein können.
  • Wie wohlbekannt ist, können Gene für ein spezielles Polypeptid in einzelnen oder multiplen Kopien innerhalb des Genoms eines Individuums existieren. Solche duplizierten Gene können identisch sein oder können bestimmte Modifikationen aufweisen, einschließlich Nucleotid-Substitutionen, Additionen oder Deletionen, die alle noch für Polypeptide codieren, die im wesentlichen die gleiche Aktivität aufweisen. Der Begriff ,DNA-Sequenz, codierend ein RAP-Bindungs-Protein' kann daher ein oder mehrere Gene innerhalb eines bestimmten Individuums bezeichnen. Darüber hinaus können bestimmte Unterschiede in Nucleotid-Sequenzen zwischen individuellen Organismen existieren, die Allele genannt werden. Solche Allel-Unterschiede können oder können nicht in Unterschieden in der Aminosäure-Sequenz des codierten Polypeptids resultieren, und trotzdem noch ein Protein mit der gleichen biologischen Aktivität codieren.
  • ,Homologie' bezeichnet eine Sequenz-Ähnlichkeit zwischen zwei Peptiden oder zwischen zwei Nucleinsäure-Molekülen. Homologie kann festgestellt werden durch Vergleich einer Position in jeder Sequenz, die zum Zweck des Vergleiches ausgerichtet werden kann. Wenn eine Position in der verglichenen Sequenz von der selben Base oder Aminosäure eingenommen wird, dann sind die Moleküle homolog an dieser Position. Ein Grad der Homologie zwischen Sequenzen ist eine Funktion der Zahl der übereinstimmenden oder homologen Positionen, die von den Sequenzen geteilt werden.
  • ,Zellen', ,Wirtszellen' oder ,rekombinante Wirtszellen' sind Begriffe, die hierin austauschbar verwendet werden. Es wird verstanden, dass solche Begriffe nicht nur die spezielle Ziel-Zelle bezeichnen, sondern die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen einer solchen Zelle. Da bestimmte Modifikationen in folgenden Generationen auf Grund von entweder Mutation oder Umwelteinflüssen auftreten können, kann solche Nachkommenschaft de facto nicht mit der Eltern-Zelle identisch sein, ist aber noch im Rahmen des Begriffes, wie hierin verwendet, eingeschlossen.
  • Ein ,chimäres Protein' oder ,Fusions-Protein' ist eine Fusion einer ersten Aminosäure-Sequenz, codierend eine der erfindungsgemäßen RAP-Bindungs- Proteine, mit einer zweiten Aminosäure-Sequenz, die eine Domäne definiert, die fremd und nicht wesentlich homolog ist mit irgendeiner Domäne des erfindungsgemäßen RAP-BP. Ein chimäres Protein kann eine fremde Domäne darstellen, die in einem Organismus gefunden wird (obwohl einem unterschiedlichen Protein), der auch das erste Protein exprimiert, oder es kann eine ,interspezies-', ,intergenerische-', usw. Fusion von Proteinstrukturen sein, die durch verschiedene Arten von Organismen exprimiert wird. Zum Beispiel kann ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung durch die allgemeine Formel Z1-Z2-Z3 dargestellt werden, worin Z2 die gesamte oder einen Teil einer Polypeptid-Sequenz eines RAP-Bindungs-Proteins darstellt, und Z1 und Z3 jeweils Polypeptid-Sequenzen darstellen, die heterolog zu der RAP-BP-Sequenz sind, wobei zumindest eine von Z1 und Z3 in dem Fusionsprotein vorhanden ist.
  • Der Ausdruck ,evolutionär in Bezug stehend zu', bezogen auf Nucleinsäure-Sequenzen, codierend RAP-Bindungs-Proteine, bezeichnet Nucleinsäure-Sequenzen, die natürlich in einem Organismus entstanden sind, einschließlich natürlich vorkommender Mutanten. Darüber hinaus bezeichnet der Begriff auch Nucleinsäure-Sequenzen, die, während sie zu Beginn von natürlich vorkommenden Isoformen von RAP-Bindungs-Proteinen stammten, durch Mutagenese verändert wurden, wie zum Beispiel durch eine solche kombinatorische Mutagenese, wie sie unten beschrieben ist, die aber noch Polypeptide codieren, die FKBP/Rapamycin-Komplexe binden oder die zumindest eine Aktivität des Eltern-RAP-Bindungs-Proteins beibehalten oder die Antagonisten dieser Aktivitäten des Proteins sind.
  • Der Begriff ,isoliert', wie auch hierin in Bezug auf Nucleinsäuren wie DNA oder RNA verwendet, bezeichnet Moleküle, die von anderen DNAs beziehungsweise RNAs getrennt wurden, die in der natürlichen Quelle des Makromoleküls vorhanden sind. Zum Beispiel schließt eine isolierte Nucleinsäure, codierend eines der erfindungsgemäßen RAP-Bindungs-Proteine, vorzugsweise nicht mehr als 10 Kilobasen (KB) einer Nucleinsäure-Sequenz ein, die dieses spezielle RAP-BP-Gen in der genomischen DNA natürlich unmittelbar flankiert, mehr bevorzugt nicht mehr als 5 kb von solchen natürlich vorkommenden flankierenden Sequenzen und am meisten bevorzugt weniger als 1,5 kb einer solchen natürlich vorkommenden flankierenden Sequenz. Der Begriff isoliert, wie hierin verwendet, bezeichnet auch eine Nucleinsäure oder ein Peptid, das im wesentlichen frei ist von zellulärem Material, viralem Material oder Kultur-Medium, wenn es durch rekombinante DNA-Methoden hergestellt wurde, oder chemische Vorläufer oder andere Chemikalien, wenn sie chemisch synthetisiert wurden. Darüber hinaus soll eine ,isolierte Nucleinsäure' Nucleinsäure-Fragmente einschließen, die nicht natürlich als Fragmente vorkommen und nicht in der natürlichen Form gefunden würden.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet eine ,Rapamycin-Bindungs-Domäne' eine Polypeptid-Sequenz, die eine Bindungs-Aktivität zur speziellen Interaktion mit einem FKBP/Rapamycin-Komplex verleiht. Beispielhafte Rapamycin-Bindungs-Domänen sind innerhalb der Polypeptide dargestellt, die definiert sind durch Val26-Tyr160 von SEQ ID No: 2 (mRAPT1), Val2012-Tyr2144 von SEQ ID No: 12 (hRAPT1), Val41-Tyr173 von SEQ ID No: 14 (caRAPT1), Val1-Tyr133 von SEQ ID No: 16 (TOR1) und Val1-Arg133 von SEQ ID No: 18 (TOR2).
  • Ein ,RAPT1-ähnliches Polypeptid' bezeichnet ein eukaryontisches zelluläres Protein, das ein direktes Bindungs-Ziel-Protein für einen FKBP/Rapamycin-Komplex ist und das einige Sequenz-Homologie mit einem Säuger-RAPT1-Protein der vorliegenden Erfindung teilt. Beispielhafte RAPT1-ähnliche Polypeptide schließen die Hefe-TOR1- und -TOR2-Proteine ein.
  • Ein ,lösliches Protein' bezeichnet ein Polypeptid, das in einem wässrigen Puffer unter physiologischen, isotonen Bedingungen wie zum Beispiel 0,14 M NaCl oder Saccharose in einer Proteinkonzentration von so viel wie 10 μM, mehr bevorzugt so viel wie 10 mM nicht präzipitiert (z. B. mindestens etwa 95 Prozent, mehr bevorzugt mindestens 99 Prozent bleiben im Überstand). Diese Bedingungen beziehen sich spezifisch auf die Abwesenheit von Detergenzien oder anderen denaturierenden Mitteln in effektiven Konzentrationen.
  • Wie unten beschrieben, betrifft ein Aspekt dieser Erfindung eine isolierte Nucleinsäure, umfassend die Nucleotid-Sequenz, codierend ein RAP-Bindungs-Protein, Fragmente davon und/oder Äquivalente von solchen Nucleinsäuren. Der Begriff Nucleinsäure, wie hierin verwendet, zielt darauf hin, solche Fragmente und Äquivalente einzuschließen, z. B. wird der Begriff äquivalent verstanden, Nucleotid-Sequenzen einzuschließen, die funktionell äquivalente RAP-Bindungs-Proteine oder funktionell äquivalente Peptide codieren, die zum Beispiel die Fähigkeit beibehalten, an den FKBP/Rapamycin-Komplex zu binden, und die zusätzlich andere Aktivitäten eines RAP-Bindungs-Proteins, wie hierin beschrieben, beibehalten können. Äquivalente Nucleotid-Sequenzen werden Sequenzen einschließen, die sich durch eine oder mehrere Nucleotid-Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen wie allelische Varianten unterscheiden; und werden auch Sequenzen einschließen, die sich von der Nucleotid-Sequenz der Säuger-RAPT1-Gene, die in SEQ ID No: 1 dargestellt sind, auf Grund der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden. Äquivalente Nucleinsäuren werden auch Nucleotid-Sequenzen einschließen, die unter stringenten Bedingungen (d. h. äquivalent zu etwa 20–27°C unter der Schmelztemperatur (Tm) der DNA-Duplexform, die in etwa 1 M Salz gebildet wird) an eine Nucleotid-Sequenz von einem RAPT1-Protein, umfassend die Sequenz, die in SEQ ID No: 2 gezeigt ist, hybridisieren, oder an eine Nucleotid-Sequenz des RAPT1-Gen-Inserts von plC524 (ATCC-Zulassungs-Nr. 75787). In einer Ausführungsform werden Äquivalente des weiteren Nucleinsäure-Sequenzen einschließen, die abstammen von und evolutionär in Beziehung stehen zu einer Nucleotid-Sequenz, umfassend jene, die in SEQ ID No: 1 gezeigt ist.
  • Die Aminosäure-Sequenz, die in SEQ ID No: 2 gezeigt ist, und das Fragment, dargestellt in dem ATCC-Clon 75787, repräsentieren biologisch aktive Teile größerer Voll-Längen-Formen von Säuger-RAPT1-Proteinen. In bevorzugten Ausführungsformen bindet das RAPT1-Polypeptid an FKBP/Rapamycin-Komplexe. In bevorzugten Ausführungsformen werden Teile des RAPT1-Proteins, isoliert aus der Voll-Längen-Form, eine spezifische Bindungs-Affinität für einen FKBP/Rapamycin-Komplex beibehalten, z. B, einen FKBP12/Rapamycin-Komplex, z. B. mit einer Affinität von mindestens 50%, mehr bevorzugt mindestens 75% und noch mehr bevorzugt mindestens 90% der Bindungs-Affinität einer natürlich vorkommenden Form von RAPT1 für solch einen Rapamycin-Komplex. Von einem Polypeptid wird angenommen, dass es eine biologische Aktivität eines RAPT1-Proteins besitzt, wenn das Polypeptid eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist: die Fähigkeit, einen FKBP/Arzneistoff-Komplex zu binden, z. B. einen FKBP/Makrolid-Komplex, z. B. einen FKBP/Rapamycin-Komplex; die Fähigkeit, an einen FKBP12/Rapamycin-Komplex zu binden; die Fähigkeit, die Bildung von FKBP/Rapamycin-Komplexe zu modulieren; die Fähigkeit, Zellproliferation zu regulieren, z. B. den Zell-Zyklus zu regulieren, z. B. das Fortschreiten einer Zelle durch die G1-Phase zu regulieren. Darüber hinaus kann, basierend auf Sequenz-Analyse, die biologische Funktion der erfindungsgemäßen RAPT1-Proteine eine Phosphatidyl-Inosit-Kinase-Aktivität wie eine PI-3-Kinase-Aktivität einschließen. Ein Protein wird in Bezug auf RAPT1-Bioaktivität auch als bioaktiv angesehen, wenn es ein spezifischer Agonist (nachahmend) oder Antagonist von einer der oben aufgeführten Eigenschaften ist.
  • In Bezug auf das rap-UBC-Enzym kann das Protein mindestens einen Teil der Aminosäure-Sequenz von SEQ ID No: 24 (oder des rap-UBC-Gen-Inserts von SMR4-15, beschrieben in Beispiel 5) umfassen, der entweder die Fähigkeit besitzt, an einen FKBP/Rapamycin-Komplex zu binden, oder die Fähigkeit, Ubiquitin an ein zelluläres Protein zu konjugieren, oder beide. Wenn man als gegeben ansieht, dass Rapamycin eine Blockade im Zell-Zyklus während der G1-Phase bewirkt, ist es wahrscheinlich, dass das Spektrum der biologischen Aktivität des erfindungsgemäßen rap-UBC-Enzyms die Kontrolle der Halbwerts-Zeiten von bestimmten Zell-Zyklus-regulierenden Proteinen einschließt, im Besonderen von relativ kurzlebigen Proteinen (z. B. Proteine, die Halbwerts-Zeiten in der Größenordnung von 30 Minuten bis 2 Stunden haben). Zum Beispiel darf das erfindungsgemäße UBC die Fähigkeit aufweisen, die Ubiquitinierung von zum Beispiel p53, myc und/oder Cyclinen zu vermitteln, und beeinflusst daher die zelluläre Halbwerts-Zeit eines Zell-Zyklus-regulierenden Proteins in proliferierenden Zellen. Die Bindung des rap-UBC an den FKBP/Rapamycin-Komplex kann in Sequestrierung des Enzymes weg von seinen Substrat-Proteinen resultieren. Daher kann Rapamycin die Ubiquitin-vermittelte Degradierung von p53 in einer Weise beeinflussen, die verursacht, dass zelluläre Mengen von p53 steigen, was im Gegenzug Progression der G1-Phase inhibiert.
  • Darüber hinaus wird es im allgemeinen geschätzt werden, dass es unter bestimmten Umständen vorteilhaft sein kann, Homologe der clonierten RAP-Bindungsproteine zu liefern, die in einer limitierten Kapazität als entweder RAP-BP-Agonisten oder RAP-BP-Antagonisten wirken, um nur eine Unterart der biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des Proteins entweder zu fördern oder zu inhibieren. Daher können spezifische biologische Effekte durch Behandlung mit einem Homolog von limitierter Funktion und mit weniger Nebenwirkungen im Verhältnis zu der Behandlung mit Agonisten oder Antagonisten hervorgerufen werden, die sich auf alle RAP-BP-bezogenen biologischen Aktivitäten richten. Zum Beispiel können RAPT1-Analoge und rap-UBC-Analoge hergestellt werden, die nicht in irgendeiner wesentlichen Weise an einen FKBP/Rapamycin-Komplex binden, die aber die meisten der anderen biologischen Funktionen beibehalten, die der natürlich vorkommenden Form des Proteins zugeschrieben werden. Zum Beispiel könnte das RAPT1-Homolog eine Kinase-Aktivität beibehalten, wie eine Phosphatidy-Inosit-Kinase-Aktivität, z. B. eine PI-3-Kinase-Aktivität. In Gegensatz dazu, kann das RAPT1-Homolog so hergestellt werden, dass ihm eine Kinase-Aktivität fehlt, aber die Fähigkeit beibehalten wird, an FKBP/Rapamycin-Komplex zu binden. Zum Beispiel können die FKBP/Rapamycin-Bindungs-Teile der RAPT1-Homologe wie die Rapamycin-Bindungs-Domänen dargestellt in SEQ ID Nos: 2 oder 12, verwendet werden, um Bindung an Rapamycin-Komplexe durch die natürlich vorkommende Form von RAPT1 kompetity zu inhibieren.
  • Homologe der erfindungsgemäßen RAP-Bindungs-Proteine können durch Mutagenese wie durch getrennte Punktmutationen) oder durch Kürzung hergestellt werden. Zum Beispiel kann eine Mutation Homologe hervorrufen, die im wesentlichen die gleichen oder lediglich eine Unterart der biologischen Aktivität der RAP-BP-Form, von der sie stammen, beibehalten. Alternativ können antagonistische Formen des Proteins hergestellt werden, die fähig sind, die Funktion der natürlich vorkommenden Form des Proteins zu inhibieren, wie durch kompetitive Bindung an FKBP/Rapamycin-Komplexe.
  • Die Nucleotid-Sequenz, bezeichnet in SEQ ID No: 1, codiert einen biologisch aktiven Teil des Maus-RAPT1-Proteins, und beinhaltet im speziellen eine Rapamycin-Bindungs-Domäne. Dementsprechend liefert eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Nucleinsäure, die ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäure-Sequenz umfasst, die im wesentlichen homolog ist zu dem Teil des RAPT1-Proteins, dargestellt durch SEQ ID No: 2. Vorzugsweise ist die Nucleinsäure ein cDNA-Molekül, umfassend mindestens einen Teil der Nucleotid-Sequenz, gezeigt in SEQ ID No: 1. Hierin ist auch eine Nucleinsäure beschrieben, codierend ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäure-Sequenz, die im wesentlichen homolog ist zu einem Teil des RAPT1-Proteins, dargestellt in SEQ ID No: 12, der einer Rapamycin-Bindungs-Domäne entspricht, z. B. Val2012 bis Tyr2144 von SEQ ID No: 12. In ähnlicher Weise ist hierin eine Nucleinsäure beschrieben, die mindestens einen Teil codiert, z. B. einen Rapamycin-Bindungs-Teil, des Candida-RAPT1-Polypeptids von SEQ ID No: 14.
  • Bevorzugte Nucleinsäuren codieren ein Polypeptid, das eine Aminosäure-Sequenz einschließt, die mindestens 70% homolog ist und am meisten bevorzugt 80% homolog mit einer Aminosäure-Sequenz, gezeigt in SEQ ID No: 2. Nucleinsäuren, die Peptide codieren, im besonderen Peptide, die eine Aktivität eines RAPT1-Proteins haben, und eine Aminosäure-Sequenz umfassen, die mindestens etwa 90%, mehr bevorzugt mindestens etwa 95% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 98–99% homolog ist mit einer Sequenz, die in SEQ ID No: 2 gezeigt ist, sind auch im Rahmen der Erfindung, so wie es natürlich Proteine sind, die identisch sind zu den vorher erwähnten Sequenz-Auflistungen. In einer Ausführungsform ist die Nucleinsäure eine cDNA, die ein Peptid codiert, das mindestens eine Aktivität eines erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteins aufweist. Vorzugsweise ist die Nucleinsäure ein cDNA-Molekül, umfassend mindestens einen Teil der Nucleotid-Sequenz, dargestellt in SEQ ID No: 2. Ein bevorzugter Teil dieser cDNA-Moleküle schließt die codierende Region des Gens ein. Zum Beispiel kann ein rekombinantes RAP-BP-Gen Nucleotid-Sequenzen eines PCR-Fragments einschließen, die durch Amplifizierung der codierenden Sequenzen für einen der RAP-BP-Clone der ATCC-Hinterlegungs-Nr: 75787 hergestellt wurden.
  • Die Nucleotid-Sequenz, gezeigt in SEQ ID No: 23, codiert ein biologisch aktives menschliches Ubiquitin-konjugierendes Enzym. Entsprechend codiert die Nucleinsäure ein Polypeptid, das die Rapamycin-Bindungs-Domäne des rap-UBC-Proteins, dargestellt durch SEQ ID No: 24, einschließt. Vorzugsweise ist die Nucleinsäure ein cDNA-Molekül, umfassend mindestens einen Teil der Nucleotid-Sequenz, gezeigt in SEQ ID No: 23. Bevorzugte Nucleinsäuren codieren ein Peptid, umfassend eine Aminosäuren-Sequenz, die mindestens 60% homolog ist, mehr bevorzugt 70% homolog und am meisten bevorzugt 80% homolog mit einer Aminosäure-Sequenz, die gezeigt ist in SEQ ID No: 24. Nucleinsäuren, die Polypeptide codieren, besonders jene, die eine Ubiquitin-konjugierende Aktivität haben und eine Aminosäure-Sequenz umfassen, die mindestens etwa 90%, mehr bevorzugt mindestens etwa 95% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 98–99% homolog ist mit einer Sequenz, die in SEQ ID No: 24 gezeigt ist, sind auch hierin beschrieben.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die rekombinanten RAP-BP-Gene darüber hinaus zusätzlich zu der Aminosäure-Sequenz, gezeigt im angehängten Sequenz-Protokoll, zusätzliche Nucleotid-Sequenzen einschließen, die Aminosäuren am C-Terminus und N-Terminus des Proteins codieren, obwohl sie nicht in jenem Sequenz-Protokoll gezeigt sind. Zum Beispiel kann das rekombinante RAPT1-Gen Nucleotid-Sequenzen eines PCR-Fragments einschließen, die durch Amplifikation der RAPT1-codierenden Sequenz von plC524 unter Verwendung von Primer-Sätzen, wie in Beispiel 4 beschrieben, hergestellt werden. Zusätzlich wird es im Lichte der vorliegenden Offenbarung möglich sein, nicht mehr als Routine-Versuche zu verwenden, um zum Beispiel aus einer cDNA-Genbank die übrigen 5'-Sequenzen von RAPT1 zu isolieren, wie durch RACE-PCR unter Verwendung von Primern, die aus den Sequenzen vom plC524-Clon gestaltet wurden, z. B. um die Voll-Längen-Sequenz von SEQ ID No: 12 herzustellen. Im besonderen zieht die Erfindung ein rekombinantes RAPT1-Gen in Betracht, das das Voll-Längen-RAPT1-Protein codiert. Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung schließt Nucleinsäuren ein, die Isoforme des Maus- oder menschlichen RAPT1 codieren, besonders Isoformen (z. B. Spleiß-Varianten, allelische Varianten, usw.), die fähig sind, mit dem FKBP12/Rapamycin-Komplex zu binden. Solche Isoforme so wie andere Mitglieder der größeren Familie von RAP-Bindungs-Proteinen können isoliert werden unter Verwendung der Arzneistoff-abhängigen Interaktions-Einfangtests, die im weiteren Detail unten beschrieben sind.
  • Hierin ist auch eine Nucleinsäure beschrieben, die unter hoch- oder niedrig-stringenten Bedingungen an eine Nucleinsäure hybridisiert, die ein Peptid codiert, das mindestens einen Teil einer Aminosäure-Sequenz aufweist, die in einer der SEQ ID Nos: 2, 12 oder 14 dargestellt ist. Geeignete Stringenz-Bedingungen, die DNA-Hybridisierung fördern, zum Beispiel 6,0 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von Waschen mit 2,0 × SSC bei 50°C, sind Fachleuten bekannt oder können gefunden werden in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1–6.3.6. Zum Beispiel kann die Salz-Konzentration in dem Waschschritt aus einer niedrigen Stringenz von etwa 2,0 × SSC bei 50°C bis zu einer hohen Stringenz von etwas 0,2 × SSC bei 50°C selektiert werden. Zusätzlich kann die Temperatur im Waschschritt erhöht werden von niedrigen Stringenz-Bedingungen bei Raumtemperatur, etwa 22°C, zu hohen Stringenz-Bedingungen bei etwa 65°C.
  • Nucleinsäuren, die eine Sequenz haben, die sich von der Nucleotid-Sequenz, gezeigt in SEQ ID No: 1, auf Grund von Degeneration im genetischen Code unterscheidet, sind auch innerhalb des Rahmens der Erfindung. Solche Nucleinsäuren codieren funktionell äquivalente Peptide (d. h. ein Peptid, das eine biologische Aktivität eines RAP-Bindungsproteins aufweist), aber sie unterscheiden sich in der Sequenz von den angehängten Sequenz-Protokoll auf Grund von Degeneration im genetischen Code. Zum Beispiel wird eine Zahl von Aminosäuren durch mehr als ein Triplett bestimmt. Codons, die die selbe Aminosäure oder Synonyme (zum Beispiel CAU und CAC codieren jeweils Histidin) spezifizieren, können in ,stillen' Mutationen resultieren, die die Aminosäure-Sequenz des RAP-Bindungsproteins nicht beeinflussen. Es wird dennoch erwartet, dass DNA-Sequenz-Polymorphismen, die zu Änderungen in den Aminosäure-Sequenzen der erfindungsgemäßen RAP-Bindungs-Proteine führen, unter Wirbeltieren existieren werden. Ein Fachmann wird schätzen, dass diese Variationen in einem oder mehreren Nucleotiden (bis zu etwa 3–5% der Nucleotide) der Nucleinsäuren, codierend Polypeptide, die eine Aktivität eines RAP-Bindungsproteins haben, unter Individuen einer gegebenen Spezies auf Grund natürlicher allelischer Variation existieren können. Irgendwelche und alle solchen Nucleotid-Variationen und resultierende Aminosäure-Polymorphismen befinden sich im Rahmen dieser Erfindung.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch eine Nucleinsäure, codierend nur einen Teil eines RAPT1-Proteins, wie die Rapamycin-Bindungs-Domäne. Wie hierin verwendet, bezeichnet ein Fragment einer Nucleinsäure, codierend solch einen Teil eines RAP-Bindungsproteins, eine Nucleotid-Sequenz, die weniger Nucleotide aufweist als die Nucleotid-Sequenz, codierend die ganze Aminosäure-Sequenz eines Voll-Längen-RAP-Bindungsproteins, die aber noch genug codierende Sequenz einschließt, um ein Polypeptid zu codieren, das fähig ist, an einen FKBP/Rapamycin-Komplex zu binden. Darüber hinaus schließen Nucleinsäure-Fragmente im Rahmen der Erfindung jene Fragmente ein, die fähig sind, unter hohen oder niedrigen Stringenz-Bedingungen mit Nucleinsäuren von anderen Wirbeltier-Spezies zu hybridisieren, im speziellen anderen Säugern, und können in Durchmusterungs-Protokollen verwendet werden, um Homologe der erfindungsgemäßen RAP-Bindungs-Proteine nachzuweisen. Nucleinsäuren im Rahmen der Erfindung können auch Verbindungs-Sequenzen, modifizierte Restriktions-Endonuclease-Stellen und andere Sequenzen enthalten, die nützlich sind für molekulare Clonierung, Expression oder Aufreinigung von rekombinanten Peptiden, die von RAP-Bindungs-Proteinen stammen.
  • Wie durch die unten aufgeführten Beispiele angedeutet, kann eine Nucleinsäure, codierend ein RAP-Bindungsprotein, von einer mRNA erhalten werden, die in irgendeiner Zahl von Zellen eines Wirbeltier-Organismus vorhanden ist, im speziellen von Säugern, z. B. Maus oder Mensch. Es sollte auch möglich sein, Nucleinsäuren zu erhalten, die RAP-Bindungsproteine von genomischer DNA, erhalten von sowohl adulten Individuen als auch Embryos, codieren. Zum Beispiel kann ein Gen, codierend ein RAP-Bindungsprotein, von entweder einer cDNA oder einer genomischen Genbank in Übereinstimmung mit Protokollen cloniert werden, die hierin beschrieben werden, so wie jenen, die allgemein auf dem Fachgebiet bekannt sind. Zum Beispiel kann eine cDNA, codierend ein RAPT1-Protein, im besonderen andere Isoforme, z. B. Paraloge oder Orthologe der RAPT1-Proteine, dargestellt durch entweder SEQ ID No: 2 oder 12, durch Isolierung von Gesamt-mRNA aus einer Säuger-Zelle, z. B. einer menschlichen Zelle, erhalten werden, herstellend doppelsträngige cDNAs aus der Gesamt-mRNA, Clonierung der cDNA in ein geeignetes Plasmid oder einen Bakteriophagen-Vektor und Isolieren von RAPT1-Clonen unter Verwendung von irgend einem einer Anzahl von bekannten Verfahren, z. B. Oligonucleotid-Sonden oder Western Blot-Analyse. Gene, die Proteine codieren, die in Beziehung stehen zu den erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteinen können auch unter Verwendung von etablierten Polymerase-Ketten-Reaktions-Verfahren in Übereinstimmung mit der Nucleotid-Sequenz-Information, die durch die Erfindung geliefert wird, cloniert werden. Die Nucleinsäure der Erfindung kann DNA oder RNA sein.
  • Es wird auch die Verwendung der isolierten Nucleinsäure in ,Antisense'-Therapie beschrieben. Wie hierin verwendet, bezeichnet ,Antisense'-Therapie die Verabreichung oder in situ-Herstellung von Oligonucleotid-Sonden oder deren Derivaten, die spezifisch unter zellulären Bedingungen mit der zellulären mRNA und/oder genomischen DNA hybridisieren (z. B. binden), die ein RAP-Bindungsprotein codieren, um Expression dieses Proteins zu inhibieren, wie zum Beispiel durch Inhibition von Transkription und/oder Translation. Die Bindung kann durch konventionelle Basenpaar-Komplementarität, oder zum Beispiel im Fall einer Bindung an DNA-Duplexmoleküle durch spezifische Interaktionen in der großen Furche der Doppelhelix stattfinden. Im allgemeinen bezeichnet ,Antisense'-Therapie den Bereich von Verfahren, die allgemein in dem Fachgebiet angewendet werden, und schließt jede Therapie ein, die von spezifischer Bindung an Oligonucleotid-Sequenzen abhängt.
  • Ein Antisense-Konstrukt kann zum Beispiel als ein Expressions-Plasmid geliefert werden, das, wenn es in der Zelle transkribiert wird, RNA produziert, die komplementär ist zu mindestens einem einzigartigen Teil der zellulären mRNA, die ein RAP-Bindungsprotein codiert. Alternativ kann das Antisense-Konstrukt eine Oligonucleotid-Sonde sein, die ex vivo hergestellt wird und die, wenn sie in die Zelle eingebracht wird, Inhibition der Expression durch Hybridisieren mit der mRNA und/oder genomischen Sequenzen eines RAP-BP-Gens verursacht. Solche Oligonucleotid-Sonden sind vorzugsweise modifizierte Oligonucleotide, die resistent sind gegen endogene Nucleasen, z. B. Exonucleasen und/oder Endonucleasen, und sind daher stabil in vivo. Beispielhafte Nucleinsäure-Moleküle für die Verwendung als Antisense-Oligonucleotide sind Phosphoramidat-, Phosphothioat- und Methylphosphonat-Analoge von DNA (siehe auch US-Patente 5,176,996; 5,264,564; und 5,256,775). Zusätzlich wurde eine Übersicht über allgemeine Vorgehensweisen für die Konstruktion von Oligomeren gegeben, die nützlich in Antisense-Therapie sind, zum Beispiel durch van der Krol et al. (1988) Biotechniques 6: 958–976; und Stein et al. (1988) Cancer Res 48: 2659–2668.
  • Dementsprechend sind die modifizierten Oligomere nützlich in therapeutischen, diagnostischen und Forschungs-Zusammenhängen. In therapeutischen Anwendungen werden Oligomere in einer Weise verwendet, die geeignet ist zur Antisense-Therapie im allgemeinen. Für solch eine Therapie können die Oligomere der Erfindung für eine Vielzahl von Bedingungen einer Verabreichung gebildet werden, einschließlich systemische und lokale oder lokalisierte Verabreichung. Verfahren und Formulierungen können im allgemeinen gefunden werden in Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA. Für systemischen Verabreichung wird Injektion, einschließlich intramuskulär, intraperitoneal und subcutan für Injektion, bevorzugt, die Oligomere der Erfindung können in flüssigen Lösungen formuliert werden, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern wie Hank-Lösung oder Ringer-Lösung. Zusätzlich können die Oligomere in fester Form formuliert sein und unmittelbar vor der Verwendung wieder gelöst oder suspendiert werden. Lyophilisierte Formen sind auch eingeschlossen.
  • Systemische Verabreichung kann auch durch transmucosal oder transdermale Mittel stattfinden, oder die Verbindungen können oral verabreicht werden. Für transmucusale oder transdermale Verabreichung werden Eindringungsmittel, die für die Barriere, die durchdrungen werden soll, geeignet sind, in der Formulierung verwendet. Solche Eindringungsmittel sind im allgemeinen in dem Fachbereich bekannt und schließen zum Beispiel für transmucusale Verabreichung Gallen-Salze oder Fusidinsäure-Derivate ein. Zusätzlich können Detergenzien verwendet werden, um die Durchdringung zu erleichtern. Transmucosale Verabreichung kann durch Nasen-Sprays oder die Verwendung von Suppositorien stattfinden. Zur oralen Verabreichung werden die Oligomere in konventionelle, orale Verabreichungsformen formuliert, wie Kapseln, Tabletten und Tonika. Für lokale Verabreichung werden die Oligomere der Erfindung in Salben, Wundsalben, Gele oder Cremen, wie allgemein in dem Fachgebiet bekannt, formuliert.
  • Zusätzlich zur Verwendung in der Therapie können Oligomere als diagnostische Reagenzien verwendet werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von den Ziel-DNA- oder RNA-Sequenzen, an die sie spezifisch binden, nachzuweisen. Solche diagnostischen Tests sind unten in weiterem Detail beschrieben.
  • In ähnlicher Weise können Antisense-Konstrukte durch Antagonsieren der normalen biologischen Aktivität eines RAP-Bindungsproteins in der Manipulation von Gewebe, z. B. Gewebe-Proliferation und/oder -Differenzierung, sowohl für in vivo- als auch ex vivo-Gewebe-Kultur-Systeme, verwendet werden.
  • Diese Erfindung liefert auch Expressions-Vektoren, die eine Nucleinsäure enthalten, codierend ein RAP-Bindungsprotein der vorliegenden Erfindung, die funktionell verbunden ist mit mindestens einer Transkriptionsregulations-Sequenz. Funktionell verbunden soll bedeuten, dass die Nucleotid-Sequenz in einer Weise mit einer regulatorischen Sequenz verbunden ist, die die Expression der Nucleotid-Sequenz erlaubt. Regulatorische Sequenzen sind auf dem Fachgebiet anerkannt und werden selektiert, um die Expression eines rekombinanten RAP-Bindungsproteins zu leiten. Dementsprechend schließt der Begriff Transkriptionsregulations-Sequenz Promotoren, Verstärker und andere Expressions-Kontrollelemente ein. Solche regulatorischen Sequenzen sind beschrieben in Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Zum Beispiel kann jede einer großen Vielzahl von Expressions-Kontroll-Sequenzen – Sequenzen, die die Expression einer DNA-Sequenz kontrollieren, wenn sie mit ihr funktionell verbunden sind, in diesen Vektoren verwendet werden, um DNA-Sequenzen, codierend die RAP-Bindungsproteine dieser Erfindung, zu exprimieren. Solche nützlichen Expressions-Kontroll-Sequenzen schießen zum Beispiel die frühen und späten Promotoren von SV40, Adenovirus oder den sehr frühen Cytomegalievirus-Promotor, das lac-System, das trp-System, das TAC- oder TRC-System, den T7-Promotor, dessen Expression durch T7-RNA-Polymerase gesteuert wird, die wichtigsten Operator- und Promotor-Regionen des Phage lambda, die Kontroll-Regionen für fd-coat-Protein, den Promotor für 3-Phosphoglycerat-Kinase oder andere glycolytische Enzyme, die Promotoren der sauren Phosphatase, z. B. Pho5, die Promotoren des Hefe-α-Paarungs-Faktors, den Polyeder-Promotor des Baculovirus-Systems und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen von prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder deren Viren kontrollieren, und verschiedene Kombinationen davon ein. Es sollte verstanden werden, dass die Gestaltung des Expressions-Vektors abhängig sein kann von solchen Faktoren wie die Wahl der Wirts-Zelle, die transformiert werden soll, und/oder der Art des Proteins, von dem gewünscht wird, dass es exprimiert wird. Darüber hinaus sollte die Kopien-Anzahl des Vektors, die Fähigkeit zur Kontrolle dieser Kopien-Anzahl und die Expression von anderen Proteinen, codiert durch den Vektor, wie Antibiotika-Marker, in Betracht gezogen werden. In einer Ausführungsform schließt der Expressions-Vektor ein rekombinantes Gen ein, codierend ein Polypeptid, das die Wirkung eines RAP-Bindungsproteins nachahmt oder andersartig agonisiert oder das alternativ ein Polypeptid codiert, das die Wirkung eines authentischen RAP-Bindungsproteins antagonisiert. Solche Expressions-Vektoren können verwendet werden, um Zellen zu transfizieren und dabei Polypeptide zu produzieren, einschließlich Fusions-Proteine, codiert durch Nucleinsäuren, wie hierin beschrieben.
  • Darüber hinaus können die Gen-Konstrukte der vorliegenden Erfindung auch als ein Teil eines Gen-Therapie-Protokolls verwendet werden, um Nucleinsäuren zu liefern, die entweder eine agonistische oder antagonistische Form von einem oder mehreren der erfindungsgemäßen RAP-Bindungs-Proteine codieren. Daher betrifft ein anderer Aspekt der Erfindung Expressions-Vektoren für in vivo-Transfektion und Expression eines RAP-Bindungsproteins in besonderen Zelltypen, um die Funktion von einem oder mehreren der erfindungsgemäßen RAP-Bindungs-Proteine in einer Zelle, in der dieses Protein oder andere transkriptionell regulatorische Proteine, an die es bindet, fehl-exprimiert sind, wiederherzustellen oder alternativ die Funktion zu beenden. Zum Beispiel kann Gen-Therapie verwendet werden, um ein Gen zu liefern, das ein Rapamycin-insensitives RAP-Bindungsprotein codiert, um ein spezielles Gewebe oder einen Zell-Typ resistent gegen Rapamycin-induzierten Zell-Zyklus Arrest zu machen.
  • Expressions-Konstrukte der erfindungsgemäßen RAP-Bindungs-Proteine und Mutanten davon können in jeglichem biologisch wirksamen Träger verabreicht werden, z. B. jegliche Formulierung oder Zusammensetzung, die fähig ist, das RAP-BP-Gen effektiv an Zellen in vivo zu liefern. Vorgehensweisen schließen Insertion des erfindungsgemäßen Gens in virale Vektoren, einschließlich rekombinante Retroviren, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus und Herpes-simplex Virus-1, oder rekombinante bakterielle oder eukaryontische Plasmide ein. Virale Vektoren transfizieren Zellen direkt; Plasmid-DNA kann geliefert werden mit Hilfe von zum Beispiel kationischen Liposomen (Lipofektin) oder derivatisierten (z. B. Antikörper-konjugierten) Polylysin-Konjugaten, Gramacidin S, künstlichen viralen Hüllen oder anderen derartigen intrazellulären Trägern so wie durch direkte Injektion des Gen-Konstrukts oder CaPO4-Präzipitation, ausgeführt in vivo. Es wird geschätzt werden, dass, da die Transduktion von geeigneten Ziel-Zellen den ersten kritischen Schritt in der Gen-Therapie darstellt, die Wahl des speziellen Gen-Abgabe-Systems abhängig sein wird von solchen Faktoren wie dem Phänotyp des geplanten Ziels und dem Weg der Verabreichung, z. B. lokal oder systemisch. Darüber hinaus wird erkannt werden, dass das spezielle Gen-Konstrukt, das für in vivo Transduktion einer RAP-BP-Expression geliefert wird, auch nützlich ist für in vitro Transduktion von Zellen, wie in diagnostischen Tests.
  • Eine bevorzugte Vorgehensweise zum in vivo-Einbringen von Nucleinsäure in eine Zelle ist durch Verwendung eines viralen Vektors, enthaltend Nucleinsäure, z. B. eine cDNA, codierend die spezielle Form des erwünschten RAP-Bindungsproteins. Infektion von Zellen mit einem viralen Vektor hat den Vorteil, dass ein großer Anteil der angezielten Zellen die Nucleinsäure erhalten kann. Zusätzlich werden Moleküle, die innerhalb des viralen Vektors codiert werden, z. B. durch eine cDNA, die in dem viralen Vektor enthalten ist, effizient in Zellen exprimiert, die virale Vektor-Nucleinsäure aufgenommen haben.
  • Von Retrovirus-Vektoren und Adeno-assoziierten Virus-Vektoren wird allgemein verstanden, dass sie das rekombinante Gen-Abgabe-System der Wahl für den Transfer von exogenen Genen in vivo, besonders in Menschen, sind. Diese Vektoren weisen eine effiziente Abgabe von Genen in Zellen auf, und die transferierten Nucleinsäuren werden stabil in die chromosomale DNA des Wirts integriert. Eine wesentliche Vorbedingung für die Verwendung von Retroviren ist, die Sicherheit von deren Verwendung sicherzustellen, besonders in Bezug auf die Möglichkeit der Verbreitung von Wild-Typ-Virus in der Zell-Population. Die Entwicklung von spezialisierten Zell-Linien (genannt ,Verpackungs-Zellen'), die nur Replikations-defekte Retroviren produzieren, hat die Anwendbarkeit von Retroviren für die Gen-Therapie gesteigert, und defekte Retroviren sind für die Verwendung im Gen-Transfer für Gen-Therapie-Zwecke gut charakterisiert (zur Literaturübersicht siehe Miller, A. D. (1990) Blood 76: 271). Daher kann ein rekombinantes Retrovirus konstruiert werden, in dem ein Teil der retroviralen codierenden Sequenz (gag, pol, env) durch Nucleinsäure ersetzt wurde, die einen der erfindungsgemäßen Rezeptoren codiert, was den Retrovirus replikationsdefekt macht.
  • Das replikationsdefekte Retrovirus wird dann in Virionen verpackt, die verwendet werden können, um eine Ziel-Zelle unter Verwendung eines Helfer-Virus durch Standard-Verfahren zu infizieren. Protokolle zur Produktion von rekombinanten Retroviren und zur Infektion von Zellen in vitro oder in vivo mit solchen Viren können gefunden werden in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.) Greene Publishing Associates, (1989), Sektionen 9.10–9.14 und anderen Standard-Labor-Handbüchern. Beispiele von geeigneten Retroviren schließen pLJ, pZIP, pWE und pEM ein, die Fachleuten wohlbekannt sind. Beispiele für geeignete Verpackungs-Virus-Linien zur Herstellung von sowohl ecotropen als auch amphotropen retroviralen Systemen schließen ψCrip, ψCre, ψ2 und ψAm ein. Retroviren sind verwendet worden, um eine Vielzahl von Genen in viele unterschiedliche Zell-Typen einzubringen, einschließlich Lymphocyten, in vitro und/oder in vivo (siehe zum Beispiel Eglitis, et al. (1985) Science 230: 1395–1398; Danos und Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460–6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3014–3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6141–6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8039–8043; Fern et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8377–8381; Chowdhury et al. (1991) Science 245: 1802–1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7640–7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3: 641–647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892–10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150: 4104–4115; US-Patent Nr. 4,868,116; US-Patent Nr. 4,980,286; PCT-Anmeldung WO 89/07136; PCT-Anmeldung WO 89/02468; PCT-Anmeldung WO 89/05345 und PCT-Anmeldung WO 92/07573).
  • Darüber hinaus wurde gezeigt, dass es möglich ist, das Infektions-Spektrum von Retroviren und in der Folge von retroviralbasierenden Vektoren durch Modifizieren der viralen Verpackungs-Proteine auf der Oberfläche der viralen Partikel zu limitieren (siehe zum Beispiel PCT-Publikationen WO93/25234 und WO94/06920). Zum Beispiel schließen Strategien zur Modifikation des Infektions-Spektrums von retroviralen Vektoren ein: Kopplung von Antikörpern, die spezifisch sind für Zell-Oberflächen-Antigene, an das virale env-Protein (Roux et al. (1989) PNAS 86: 9079–9083; Julan et al. (1992) J. Gen Virol 73: 3251–3255; und Goud et al. (1983) Virology 163: 251–254); oder Kopplung von Zell-Oberflächen-Rezeptor-Liganden an die viralen env-Proteine (Neda et al. (1991) J Biol Chem 266: 14143–14146). Kopplung kann in Form von chemischer Vernetzung mit einem Protein oder einer anderen Art (z. B. Lactose, um das env-Protein in ein Asialoglyco-Protein zu konvertieren) so wie durch Erzeugung von Fusions-Proteinen (z. B. Einzel-Ketten-Antikörper/env-Fusionsproteine) stattfinden. Dieses Verfahren, während es nützlich ist, die Infektion von bestimmten Gewebe-Typen zu limitieren oder anderweitig zu lenken, kann auch verwendet werden, um einen ectropischen Vektor in einen amphotropen Vektor zu konvertieren.
  • Darüber hinaus kann die Verwendung von retroviraler-Gen-Abgabe weiter verstärkt werden durch die Verwendung von Gewebe- oder Zell-spezifischen transkriptionellen regulatorischen Sequenzen, die die Expression des RAP-BP-Gens des retroviralen Vektors kontrollieren.
  • Ein anderes virales Gen-Abgabe-System, das in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, verwendet Adenovirus-abstammende Vektoren. Das Genom eines Adenovirus kann so manipuliert werden, dass es ein Gen-Produkt von Interesse codiert und exprimiert, aber inaktiviert ist in Bezug auf seine Fähigkeit, sich in einem normalen lytischen, viralen Lebens-Zyklus zu replizieren. Siehe zum Beispiel Berkner et al. (1988) BioTechniques 6: 616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252: 431–434 und Rosenfeld et al. (1992) Cell 68: 143–155. Geeignete adenovirale Vektoren, abstammend von dem Adenovirus Stamm Ad-Typ 5 dl324 oder anderen Stämmen von Adenovirus (z. B. Ad2, Ad3, Ad7, usw.), sind Fachleuten wohlbekannt. Rekombinante Adenoviren können unter bestimmten Umständen vorteilhaft sein, indem, dass sie nicht fähig sind, Zellen, die sich nicht teilen, zu infizieren, und können verwendet werden, um eine große Vielzahl von Zell-Typen zu infizieren. Darüber hinaus ist das Virus-Partikel relativ stabil und kann aufgereinigt und konzentriert werden, und kann wie oben modifiziert werden, um das Spektrum der Infektiösität zu beeinflussen. Zusätzlich wird eingebrachte adenovirale DNA (und fremde DNA, die darin enthalten ist) nicht in das Genom einer Wirts-Zelle integriert, sondern bleibt episomal, dabei potentielle Probleme vermeidend, die als ein Ergebnis von Insertions-Mutagenese in Situationen vorkommen kann, in denen eingebrachte DNA in das Wirts-Genom integriert wird (z. B. retrovirale DNA). Darüber hinaus ist die Träger-Kapazität des adenoviralen Genoms für fremde DNA groß (bis zu 8 Kilobasen) im Vergleich zu anderen Gen-Abgabe-Vektoren (Berkner et al. zitiert supra; Haj-Ahmand und Graham (1986) J. Virol. 57: 267). In den meisten replikationsdefekten adenoviralen Vektoren, die derzeit verwendet werden und daher von der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden, sind alle oder Teile der viralen E1- und E3-Gene deletiert, aber sie behalten so viel wie 80% des adenoviralen genetischen Materials (siehe z. B. Jones et al. (1979) Cell 16: 683; Berkner et al., supra; und Graham et al. in Methods in Molecular Biology, E. J. Murray, Hrsg. (Humana, Clifton, NJ, 1991) Bd. 7. S. 109–127). Expression des inserierten RAP-BP-Gens kann unter Kontrolle von zum Beispiel dem E1A-Promotor, dem späten Hauptpromotor (MLP) und assoziierten Leader-Sequenzen, dem E3-Promotor oder exogen zugefügten Promotor-Sequenzen stehen.
  • Ein noch anderes virales Vektor-System, das nützlich ist für die Abgabe des erfindungsgemäßen RAP-BP-Gens ist das Adeno-assoziierte Virus (AAV). Adeno-assoziiertes Virus ist ein natürlich vorkommendes defektes Virus, das ein anderes Virus wie ein Adenovirus oder ein Herpes-Virus als ein Helfer-Virus für die effiziente Replikation und einen produktiven Lebens-Zyklus benötigt. (Für eine Literaturübersicht siehe Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158: 97–129). Es ist auch eines der wenigen Viren, das seine DNA in sich nicht-teilende Zellen integrieren kann, und zeigt eine hohe Frequenz von stabiler Integration (siehe zum Beispiel Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349–356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63: 3822–3828; und McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62: 1963–1973). Vektoren, die so wenig wie 300 Basenpaare von AAV enthalten, können verpackt werden und können integrieren. Platz für exogene DNA ist limitiert auf etwa 4,5 kb. Ein AAV-Vektor wie jener, beschrieben in Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3251–3260, kann verwendet werden, um DNA in Zellen einzubringen. Eine Vielzahl von Nucleinsäuren wurden in unterschiedliche Zell-Typen unter Verwendung von AW-Vektoren eingebracht (siehe zum Beispiel Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6466–6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4: 2072–2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2: 32–39; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51: 611–619; und Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 3781–3790).
  • Zusätzlich zu viralen Transfer-Techniken, wie die oben illustrierten, können auch nicht-virale Techniken verwenden werden, um Expression eines RAP-Bindungsproteins in dem Gewebe eines Tieres zu bewirken. Die meisten non-viralen Techniken des Gen-Transfers sind abhängig von normalen Mechanismen, die von Säuger-Zellen für die Aufnahme und den intrazellulären Transport von Makromolekülen verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen sind nicht-virale Gen-Abgabe-Systeme der vorliegenden Erfindung abhängig von endocytischen Wegen für die Aufnahme des erfindungsgemäßen RAP-BP-Gens durch die angezielte Zelle. Beispielhafte Gen-Abgabe-Systeme dieses Typs schließen liposomal-abstammende Systeme, poly-Lysin-Konjugate und künstliche virale Hüllen ein.
  • In einer repräsentativen Ausführungsform kann ein Gen, codierend eines der erfindungsgemäßen RAP-Bindungs-Proteine, in Liposomen, die auf ihrer Oberfläche positive Ladungen tragen (z. B. Lipofectine), und die (gegebenenfalls) mit Antikörpern gegen Zell-Oberflächen-Antigene des Ziel-Gewebes markiert sind (Mizuno et al. (1992) No Shinkei Geka 20: 547–551; PCT-Publikation WO91/06309; Japanische Patent-Anmeldung 1047381; und Europäische Patent-Publikation EP-A-43075) eingeschlossen werden. Zum Beispiel kann Lipofektion von Zellen unter Verwendung von Liposomen ausgeführt werden, die mit monoclonalen Antikörpern gegen irgend ein Zell-Oberflächen-Antigen markiert sind, das auf zum Beispiel T-Zellen vorhanden ist.
  • In klinischen Einrichtungen können Gen-Abgabe-Systeme für das therapeutische RAP-BP-Gen in einen Patienten durch eine Anzahl von Verfahren eingebracht werden, von denen jedes auf dem Fachgebiet bekannt ist. Zum Beispiel kann ein Arzneimittel des Gen-Abgabe-Systems systemisch eingebracht werden, z. B. durch intravenöse Injektion, und spezifische Transduktion des Proteins in den Zielzellen ergibt sich vor allem aus der Spezifität der Transfektion, die durch das Gen-Abgabe-Vehikel bereit gestellt wird, Zelltyp- oder Gewebetyp-Expression auf Grund der Transkriptionsregulations-Sequenzen, die Expression des Rezeptor-Gens kontrollieren, oder einer Kombination davon. In anderen Ausführungsformen ist die anfängliche Abgabe des rekombinanten Gens mehr limitiert, wobei das Einbringen in das Tier ziemlich lokalisiert ist. Zum Beispiel kann das Gen-Abgabe-Vehikel durch Katheder (siehe US-Patent 5,328,470) oder durch stereotaktische Injektion (z. B. Chen et al. (1994) PNAS 91: 3054–3057) eingebracht werden.
  • Das Arzneimittel des Gentherapie-Konstrukts kann im Wesentlichen aus dem Gen-Abgabe-System in einem geeigneten Lösungsmittel bestehen, oder kann eine Matrix zur langsamen Freisetzung umfassen, in die das Gen-Abgabe-Vehikel eingebettet ist. Alternativ kann, wo das komplette Gen-Abgabe-System intakt von rekombinanten Zellen hergestellt werden kann, z. B. retroviralen Vektoren, das Arzneimittel eine oder mehrere Zellen umfassen, die das Gen-Abgabe-System herstellen.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft rekombinante RAP-Bindungsproteine, die durch Gene, die von eukaryontischen Zellen abstammen, z. B. Säuger-Zellen, z. B. Zellen von Menschen, Mäusen, Ratten, Kaninchen oder Schweinen codiert werden. Der Ausdruck ,rekombinantes Protein' bezieht sich auf ein Protein der vorliegenden Erfindung, das durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt wird, worin allgemein DNA, die zum Beispiel das RAPT1-Protein codiert, in einen geeigneten Expressions-Vektor inseriert wird, der im Gegenzug verwendet wird, um eine Wirts-Zelle zu transformieren, um das heterologe Protein zu produzieren. Darüber hinaus soll der Ausdruck ,abstammend von' in Bezug auf ein rekombinantes Gen, das das rekombinante RAP-Bindungsprotein codiert, innerhalb der Bedeutung von ,rekombinantem Protein' jene Proteine einschließen, die eine Aminosäure-Sequenz eines nativen RAP-Bindungsproteins oder eine Aminosäure-Sequenz, die ähnlich dazu ist, aufweisen, die durch Mutation hergestellt wird, so dass sie Substitutionen und/oder Deletionen relativ zu einer natürlich vorkommenden Form des RAP-Bindungsproteins eines Organismus einschließt. Rekombinante RAPT1-Proteine, die von der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden, zusätzlich zu jenen, die eine Aminosäuresequenz eines nativen RAPT1-Proteins haben, umfassen Aminosäure-Sequenzen, die mindestens 70% homolog sind, mehr bevorzugt 80% homolog und am meisten bevorzugt 90% homolog sind mit einer Aminosäure-Sequenz, gezeigt in SEQ ID No: 2. Ein Polypeptid, das eine biologische Aktivität eines RAPT1-Proteins hat und das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens etwa 95%, mehr bevorzugt mindestens etwa 98% und am meisten bevorzugt identisch ist zu einer Sequenz, dargestellt in SEQ ID No: 2, liegt auch innerhalb des Rahmens der Erfindung.
  • In ähnlicher Weise schließen rekombinante rap-UBC-Proteine eine Aminosäure-Sequenz ein, die mindestens 70% homolog, mehr bevorzugt 80% homolog und am meisten bevorzugt 90% homolog mit einer Aminosäure-Sequenz ist, dargestellt durch SEQ ID No: 24. Rekombinante rap-UBC-Proteine, die identisch oder im wesentlichen identisch sind (z. B. 95 bis 98% homolog) mit einer Aminosäure-Sequenz von SEQ ID No: 24, werden auch speziell in Betracht gezogen.
  • Zusätzlich umspannt die Erfindung ausdrücklich rekombinante RAPT1-Proteine, hergestellt von den ATCC-hinterlegten Clonen, beschrieben in Beispiel 4, z. B. von ATCC-Hinterlegungs-Nummer 75787, so wie rekombinante Ubiquitin-konjugierende Enzyme, hergestellt von ATCC-Hinterlegungs-Nummer 75786, beschrieben in Beispiel 5.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im weiteren rekombinante Formen der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine, die evolutionär in Beziehung stehen zu einem RAP-Bindungsprotein, dargestellt in SEQ ID No: 2, d. h. nicht identisch aber fähig, als ein Agonist oder ein Antagonist von mindestens einer biologischen Aktivität eines RAP-Bindungsproteins zu wirken. Der Ausdruck ,evolutionär in Beziehung stehen', im Bezug auf Aminosäuresequenzen von rekombinanten RAP-Bindungsproteinen bezieht sich auf Proteine, die Aminosäuresequenzen haben, die natürlich entstanden sind, so wie auf Mutationsvarianten, die zum Beispiel aus rekombinanter Mutagenese stammen.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine. Zum Beispiel kann eine Wirts-Zelle, transfiziert mit einem Nucleinsäure-Vektor, der die Expression einer Nucleotidsequenz regelt, die das erfindungsgemäßen RAPT1-Protein oder rap-UBC codiert, unter geeigneten Bedingungen gezüchtet werden, um zu ermöglichen, dass eine Expression des Peptids erfolgt. Das Peptid kann abgesondert werden und aus einem Gemisch von Zellen und Medium, enthaltend das rekombinante Protein, isoliert werden. Alternativ kann das Peptid im Cytoplasma zurückgehalten werden, wie es von den natürlich vorkommenden Formen der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine angenommen wird, und die Zellen können geerntet, lysiert und das Protein kann isoliert werden. Eine Zell-Kultur schließt Wirts-Zellen, Medien und andere Nebenprodukte ein. Geeignete Medien für Zell-Kultur sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Die rekombinanten RAP-Bindungsproteine können isoliert werden aus Zell-Kultur-Medium, Wirts-Zellen oder beiden unter Verwendung von Verfahren zur Aufreinigung von Proteinen, die bekannt sind auf dem Fachgebiet, einschließlich Ionen-Austausch-Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese und Immun-Affinitäts-Aufreinigung mit Antikörpern, die spezifisch sind für ein RAP-Bindungsprotein. In einer Ausführungsform ist das RAP-Bindungsprotein ein Fusionsprotein, enthaltend eine Domäne, die seine Aufreinigung ermöglicht, wie ein RAPT1-GST-Fusionsprotein oder ein rapUBC-GST-Fusionsprotein.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch Wirts-Zellen, die transfiziert wurden mit einem RAP-BP-Gen zur Expression einer rekombinanten Form eines RAP-Bindungsproteins. Die Wirts-Zelle kann jegliche prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein. Daher kann eine Nucleotidsequenz, die aus der Clonierung der RAP-Bindungsproteine der vorliegenden Erfindung entstand und das gesamte oder einen ausgewählten Teil eines Proteins codiert, verwendet werden, um eine rekombinante Form eines RAP-BP durch mikrobielle oder eukaryontische zelluläre Vorgänge zu erzeugen. Ligierung einer Polynucleotidsequenz in ein Genkonstrukt wie einen Expressions-Vektor und Transformation oder Transfektion von Wirts-Zellen mit dem Vektor sind Standard-Verfahren, die verwendet werden zur Herstellung anderer wohlbekannter Proteine, z. B. Insulin, Interferone, p53, myc, Cycline und dergleichen. Ähnliche Verfahren oder Modifikationen davon können verwendet werden, um rekombinante RAP-Bindungsproteine oder Teile davon durch mikrobielle Mittel oder Gewebe-Kultur-Technologie in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung herzustellen. Wirts-Zellen, die geeignet sind zur Expression eines rekombinanten RAP-Bindungsproteins können zum Beispiel aus eukaryontischen (Hefe-, Vogel-, Insekten- oder Säuger-) oder prokaryontischen (bakteriellen) Zellen ausgewählt werden.
  • Das rekombinante RAP-BP-Gen kann durch Ligierung von Nucleinsäure, codierend ein RAP-Bindungsprotein, oder eines Teils davon in einen Vektor, der geeignet ist zur Expression in entweder prokaryontischen Zellen, eukaryontischen Zellen oder beiden, hergestellt werden. Expressions-Vektoren zur Herstellung von rekombinanten Formen von RAP-Bindungsproteinen schließen Plasmide und andere Vektoren ein. Zum Beispiel schließen geeignete Vektoren für die Expression eines RAP-BP Plasmide der Typen: pBR322-abstammende Plasmide, pEMBL-abstammende Plasmide, pEX-abstammende Plasmide, pBTac-abstammende Plasmide und pUC-abstammende Plasmide, zur Expression in prokaryontischen Zellen wie E. colicin.
  • Eine Anzahl von Vektoren existiert für die Expression von rekombinanten Proteinen in Hefe. Zum Beispiel sind YEP24, YIP5, YEP51, YEP52, pYES2 und YRP17 Clonierungs- und Expressions-Vehikel, die nützlich sind für das Einbringen von genetischen Konstrukten in S. cerevisiae (siehe z. B. Broach et al. (1983) in Experimental Manipulation of Gene Expression, Hrsg. M. Inouye Academic Press, S. 83, durch Bezugnahme hierin eingeschlossen). Diese Vektoren können in E. coli auf Grund der Anwesenheit des pBR322-ori und in S. cerevisiae auf Grund der Replikations-Determinante des Hefe-2 Mikron-Plasmids replizieren. Zusätzlich können Arzneistoff-Resistenz-Marker wie Ampicillin verwendet werden.
  • Bevorzugte Säuger-Expressions-Vektoren enthalten prokaryontische Sequenzen, um die Vermehrung des Vektors in Bakterien zu ermöglichen, und eine oder mehrere eukaryontische Transkriptionsregulations-Sequenzen, die Expression eines rekombianten RAP-BP-Gens in eukaryontischen Zellen bewirken. Die pcDNAI/amp-, pcDNAI/neo-, pRc/CMV-, pSV2gpt-, pSV2neo-, pSV2-dhfr-, pTk2-, pRSVneo-, pMSG, pSVT7-, pko-neo- und pHyg-abstammenden Vektoren sind Beispiele von Säuger-Expressions-Vektoren, die geeignet sind für Transfektion von eukaryontischen Zellen. Manche dieser Vektoren sind mit Sequenzen von bakteriellen Plasmiden wie pBR322 modifiziert, um Replikation und Arzneistoff-Resistenz-Selektion in sowohl prokaryontischen als auch eukaryontischen Zellen zu ermöglichen. Alternativ können Derivate von Viren wie das Rinder-Papillom-Virus (BPV-1) oder Epstein-Barr-Virus (pHEBo, pREP-abstammend und p205) verwendet werden für transiente Expression von Proteinen in eukaryontischen Zellen. Beispiele von anderen viralen (einschließlich retroviralen) Expressions-Systemen können oben in der Beschreibung der Gentherapie-Abgabe-Systeme gefunden werden.
  • In machen Fällen kann es wünschenswert sein, ein rekombinantes RAP-Bindungsprotein durch die Verwendung eines Baculo-Virus-Expressions-Systems zu exprimieren (siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Beispiele für solche Baculo-Virus-Expressions-Systeme schließen pVL-abstammende Vektoren (wie pVL1392, pVL1393 und pVL941), pAcUW-abstammende Vektoren (wie pAcUW1) und pBlueBac-abstammende Vektoren (wie den β-gal-enthaltenden pBlueBac III) ein.
  • Die verschiedenen Verfahren, die in der Herstellung der Plasmide und Transformation von Wirts-Organismen angewendet werden, sind wohlbekannt in dem Fachgebiet. Für andere geeignete Expressions-Systeme für sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Zellen sowie allgemein rekombinante Verfahren siehe Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. Ausg., Hrsg. durch Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Kapitel 16 und 17.
  • Wenn Expression eines Teils einer der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine erwünscht ist, d. h. eine Kürzungs-Mutante wie die RAPT1-Polypeptide von SEQ ID Nos: 2, 12 oder 14, kann es nötig sein, ein Start-Codon (ATG) an das Oligonucleotid-Fragment hinzuzufügen, das die erwünschte Sequenz, die exprimiert werden soll, enthält. Es ist wohlbekannt auf dem Fachgebiet, dass ein Methionin an der N-terminalen Position enzymatisch gespalten werden kann durch die Verwendung des Enzyms Methionin-Aminopeptidase (MAP). MAP wurde aus E. coli (Ben-Bassat et al. (1987) J. Bacteriol. 169: 751–757) und Salmonella typhimurium cloniert, und seine in vitro-Aktivität wurde an rekombinanten Proteinen demonstriert (Miller et al. (1987) PNAS 84: 2718–2722). Daher kann, wenn gewünscht, das Entfernen eines N-terminalen Methionins entweder in vivo durch Expression von RAP-BP-abstammenden Polypeptiden in einem Wirt, der MAP produziert (z. B. E. coli oder CM89 oder S. cerevisiae), oder in vitro durch Verwendung von aufgereinigter MAP (z. B. Verfahren von Miller et al., supra) erzielt werden.
  • Alternativ können die codierenden Sequenzen für das Polypeptid als ein Teil eines Fusionsgens eingebaut werden, so dass sie kovalent im Rahmen verbunden sind mit einer zweiten Nucleotidsequenz, die ein anderes Polypeptid codiert. Dieser Typ von Expressions-System kann nützlich sein, zum Beispiel wenn es wünschenswert ist, ein immunogenes Fragment eines RAP-Bindungsproteins herzustellen. Zum Beispiel kann das VP6-Capsid-Protein von Rotavirus als ein immunogenes Träger-Protein für Teile des RAPT1-Polypeptids verwendet werden, entweder in monomerer Form oder in der Form eines viralen Partikels. Die Nucleinsäure-Sequenzen, entsprechend dem Teil des RAPT1-Proteins, gegen das Antikörper hergestellt werden sollen, können in ein Fusionsgen-Konstrukt inkorporiert werden, das codierende Sequenzen für ein spätes Vaccinia-Virus-Struktur-Protein einschließt, um einen Satz von rekombinanten Viren herzustellen, die Fusionsproteine, umfassend einen Teil des Proteins RAPT1, als Teil des Virions exprimieren. Es wurde mit der Verwendung von immunogen Fusionsproteinen, die die Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen-Fusionsproteine verwenden, gezeigt, dass rekombinante Hepatitis-B-Virionen auch in dieser Funktion verwendet werden können. In ähnlicher Weise können chimäre Konstrukte, die Fusionsproteine codieren, enthaltend einen Teil eines RAPT1-Proteins und das Polio-Virus-Capsid-Protein, erstellt werden, um Immunogenität des Satzes von Polypeptid-Antigenen zu verstärken (siehe zum Beispiel EP-Publikation No. 0259149; und Evans et al. (1989) Nature 339: 385; Huang et al. (1988) J. Virol. 62: 3855; und Schlienger et al. (1992) J. Virol. 66: 2). Das erfindungsgemäße Ubiquitin-konjugierende Enzym kann als ein Immunogen in ähnlicher Weise manipuliert werden.
  • Das Multiple-Antigen-Peptid-System für Peptid-basierende Immunisierung kann auch angewendet werden, worin ein erwünschter Teil eines RAP-Bindungsproteins direkt aus organo-chemischer Synthese des Peptids auf einen oligomeren, sich verzweigenden Lysin-Kern erhalten wird (siehe zum Beispiel Posnett et al. (1988) JBC 263: 1719 und Nardelli et al. (1992) J. Immunol. 148: 914). Antigene Determinanten der RAP-Bindungsproteine können auch von bakteriellen Zellen exprimiert und dargeboten werden.
  • Zusätzlich zur Anwendung von Fusionsproteinen, um Immunogenität zu verstärken, wird es weit geschätzt, dass Fusionsproteine auch die Expression und Aufreinigung von Proteinen wie jedes der RAP-Bindungsproteine der vorliegenden Erfindung ermöglichen können. Zum Beispiel kann ein RAP-Bindungsprotein als ein Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsprotein hergestellt werden. Solche GST-Fusionsproteine können Aufreinigung eines RAP-Bindungsproteins vereinfachen, wie zum Beispiel durch Affinitäts-Aufreinigung unter Verwendung von Glutathion-derivatisierten Matrizen (siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al. (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)). In einer anderen Ausführungsform kann ein Fusionsgen, codierend eine Aufreinigungs-Leader-Sequenz wie eine Peptid-Leader-Sequenz, umfassend eine Poly-(His)/Enterokinase-Spaltungs-Sequenz, an den N-Terminus des erwünschten Teils eines RAP-Bindungsproteins hinzugefügt werden, um Aufreinigung des Poly(His)-Fusionsproteins durch Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung eines Ni2+-Metall-Harzes zu ermöglichen. Die Aufreinigungs-Leader-Sequenz kann dann in der Folge durch Behandlung mit Enterokinase entfernt werden (z. B. siehe Hochuli et al. (1987) J. Chromatography 411: 177; und Janknecht et al. PNAS 88: 8972).
  • Verfahren zur Herstellung von Fusionsgenen sind Fachleuten bekannt. Im Wesentlichen wird die Verbindung von verschiedenen DNA-Fragmenten, codierend für unterschiedliche Polypeptid-Sequenzen, in Übereinstimmung mit konventionellen Verfahren durchgeführt, wobei glatt-endende oder überstehende Enden für Ligierung, Restriktions-Enzym-Verdauung, um geeignete Enden zu liefern, gegebenenfalls Auffüllen von kohäsiven Enden, alkalische Phosphatase-Behandlung, um unerwünschte Verbindung zu vermeiden, und enzymatische Ligierung angewendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen durch konventionelle Verfahren, einschließlich automatisierten DNA-Synthesegeräten, synthetisiert werden. Alternativ kann PCR-Amplifizierung von Gen-Fragmenten unter Verwendung von Anker-Primern ausgeführt werden, die komplementäre Überhänge zwischen zwei aufeinanderfolgenden Gen-Fragmenten hervorrufen, die in der Folge aneinander gelagert werden, um eine chimäre Gen-Sequenz herzustellen (siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992).
  • Die vorliegende Erfindung macht auch aufgereinigte oder anderweitig isolierte Formen der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine verfügbar, die isoliert wurden von, aber anderweitig im Wesentlichen frei sind von anderen zellulären Proteinen, besonders FKBP oder anderen Rapamycin-Bindungsproteinen so wie Ubiquitin und Ubiquitin-abhängigen Enzymen, Signal-Transduktion und Zell-Zyklus-regulierenden Proteinen, die normalerweise mit den RAP-Bindungsproteinen assoziiert sein können. Der Ausdruck ,im Wesentlichen frei von anderen zellulären oder viralen Proteinen' (hierin auch als ,kontaminierende Proteine' bezeichnet) oder ,im Wesentlichen reine oder aufgereinigte Herstellungen' werden definiert als RAP-Bindungsproteine enthaltende Herstellungen, die weniger als 20% (nach Trockengewicht) kontaminierende Proteine enthalten und vorzugsweise weniger als 5% kontaminierende Proteine enthalten. Funktionelle Formen der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine können zum ersten Mal als aufgereinigte Herstellungen durch Verwendung von rekombinanten Proteinen, wie hierin beschrieben, hergestellt werden. Alternativ können die erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine durch Affinitäts-Aufreinigung unter Verwendung von zum Beispiel Matrix-gebundenem FKBP/Rapamycin-Protein isoliert werden. Mit ,aufgereinigt' ist gemeint, wenn auf eine Peptid- oder DNA- oder RNA-Sequenz bezogen, dass das angedeutete Molekül vorhanden ist, wenn andere biologische Makromoleküle wie andere Proteine (im besonderen FK506-Bindungsproteine so wie andere kontaminierende Proteine) im Wesentlichen nicht vorhanden sind. Der Ausdruck ,ausgereinigt', wie hierin verwendet, bedeutet, daß vorzugsweise mindestens 80% nach Trockengewicht, mehr bevorzugt im Bereich von 95–99% nach Gewicht und am meisten bevorzugt mindestens 99% nach Gewicht von biologischen Makromolekülen des gleichen Typs vorhanden sind (aber Wasser, Puffer und andere kleine Moleküle, besonders Moleküle, die eine Molekulargewicht von weniger als 5000 haben, können vorhanden sein). Der Ausdruck ,rein', wie hierin verwendet, hat vorzugsweise die gleichen nummerischen Grenzen wie ,aufgereinigt' unmittelbar oberhalb. ,Isoliert' und ,aufgereinigt' umfassen weder natürliche Materialien in ihrem nativen Zustand noch natürliche Materialien, die in Bestandteile aufgetrennt wurden (z. B. in einem Acrylamid-Gel), aber weder als reine (z. B. ohne kontaminierende Proteine oder Chromatographie-Reagenzien wie denaturierende Agenzien und Polymere, z. B. Acrylamid oder Agarose) Stoffe noch Lösungen erhalten wurden.
  • Darüber hinaus können isolierte Peptidyl-Teile der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine auch durch Durchmusterung auf Peptide erhalten werden, die rekombinant von dem entsprechenden Fragment der Nucleinsäure, die solche Peptide codiert, hergestellt werden. Zusätzlich können Fragmente chemisch unter Verwendung von Verfahren, die in dem Fachgebiet bekannt sind, wie konventionelle Merrifield-Festphasen-f-Moc- oder t-Boc-Chemie synthetisiert werden. Zum Beispiel kann ein RAP-Bindungsprotein der vorliegenden Erfindung beliebig in Fragmente von gewünschter Länge ohne Überlappung der Fragmente geteilt werden, oder vorzugsweise in überlappende Fragmente einer gewünschten Länge geteilt werden. Die Fragmente können hergestellt (rekombinant oder durch chemische Synthese) und getestet werden, um jene Peptidyl-Fragmente zu identifizieren, die entweder als Agonisten oder Antagonisten einer RAP-Bindungsprotein-Aktivität wirken, wie durch Mikroinjektionstests oder in vitro-Protein-Bindungstests. In einer veranschaulichenden Ausführungsform können Peptidyl-Teile eines RAP-Bindungsproteins wie RAPT1 oder rapUBC auf FKBP/Rapamycin-Bindungs-Aktivität getestet werden.
  • Es wird auch möglich sein, die Struktur eines RAP-Bindungsproteins für solche Zwecke wie Verstärken der therapeutischen oder prophylaktischen Wirksamkeit oder Stabilität (z. B. ex vivo-Haltbarkeit und Resistenz gegen proteolytischen Abbau in vivo) zu modifizieren. Solche modifizierten Peptide, wenn sie entworfen werden, um mindestens eine Aktivität der natürlich vorkommenden Form des Proteins beizubehalten, werden als funktionelle Äquivalenten des RAP-Bindungsproteins, das hierin detaillierter beschrieben ist, angesehen. Solch ein modifiziertes Peptid kann zum Beispiel durch Aminosäure-Substitution, -Deletion oder -Addition hergestellt werden.
  • Zum Beispiel ist es angemessen, zu erwarten, dass ein isolierter Austausch eines Leucins mit einem Isoleucin oder Valin, eines Aspartats mit einem Glutamat, eines Threonins mit einem Serin oder ein ähnlicher Austausch einer Aminosäure mit einer strukturell verwandten Aminosäure (d. h. konservative Mutationen) keinen gravierenden Effekt auf die Faltung des Proteins haben wird, und einen großen Effekt auf die biologische Aktivität des resultierenden Moleküls haben kann oder nicht. Konservative Austausche sind jene, die innerhalb einer Familie von Aminosäuren stattfinden, die in ihren Seitenketten verwandt sind. Genetisch codierte Aminosäuren können in vier Familien unterteilt werden: (1) saure = Aspartat, Glutamat; (2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin; (3) nicht-polar = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladen polar = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden manchmal gemeinsam als aromatische Aminosäuren klassifiziert. In ähnlicher Weise kann das Aminosäure-Repertoir gruppiert werden als (1) sauer = Aspartat, Glutamat; 2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin; (3) aliphatisch = Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, wobei Serin und Threonin gegebenenfalls getrennt gruppiert werden als aliphatisch-hydroxyl; (4) aromatisch = Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan; (5) Amid = Asparagin, Glutamin; und (6) Schwefel-enthaltend = Cystein und Methionin (siehe zum Beispiel Biochemistry, 2. Aufl., Hrsg. durch L. Stryer, WH Freeman und Co.: 1981). Alternativ kann Aminosäure-Austausch auf sterischen Kriterien basieren, z. B. isosterische Austausche, ohne auf Polarität oder Ladung von Aminosäure-Seitenketten Bezug zu nehmen. Ob eine Ladung in der Aminosäuresequenz eines Peptids in einem funktionellen RAP-BP-Homolog resultiert (z. B. funktionell in dem Sinn, dass es wirkt, um die Wild-Typ-Form zu imitieren oder antagonisieren), kann leicht festgestellt werden durch Bestimmung der Fähigkeit des varianten Peptids, eine Antwort in Zellen in einer Weise hervorzurufen, die ähnlich ist zu dem Wildtyp-RAP-BP, oder eine solche Antwort kompetitiv zu inhibieren. Peptide, in denen mehr als ein Austausch stattgefunden hat, können einfach in der gleichen Weise getestet werden.
  • In der Folge ist ein Verfahren zur Herstellung von Sätzen von kombinatorischen Mutanten von RAP-Bindungsproteinen beschrieben, z. B. von RAPT1-Proteinen und/oder rap/UBC-Enzymen so wie Kürzungs-Mutanten davon, und es ist besonders nützlich zur Identifizierung von varianten Sequenzen (z. B. RAP-BP-Homologe), die wirksam sind in der Regulierung von Rapamycin-vermittelten Effekten so wie anderen Aspekten von Zell-Wachstum und -Differenzierung. In ähnlicher Weise können RAP-BP-Homologe durch die vorliegenden kombinatorischen Vorgehensweise hergestellt werden, die dadurch Antagonisten sind, dass sie fähig sind, normale zelluläre Funktionen von authentischen Formen des Proteins zu beeinträchtigen.
  • Ein Zweck der Durchmusterung nach solchen kombinatorischen Genbanken ist zum Beispiel, um neue RAP-BP-Homologe von der Genbank zu isolieren, die in der Kapazität als entweder Agonisten oder ein Antagonist der biologischen Aktivitäten des Wildtyp (,autentischen')-Proteins wirken oder die alternativ völlig neue biologische Aktivitäten besitzen. Zur Veranschaulichung können RAPT1-Homologe durch das vorliegende Verfahren konstruiert werden, um Homologe zu liefern, die unfähig sind, an den FKBP/Rapamycin-Komplex zu binden, aber noch mindestens einen Teil der normalen zellulären Aktivität in Verbindung mit autentischem RAPT1 beibehalten. Daher können kombinatorisch erhaltene Homologe hergestellt werden, um Rapamycin-Resistenz zu liefern. Solche Proteine, wenn sie von rekombinanten DNA-Konstrukten exprimiert werden, können in Gentherapie-Protokollen verwendet werden.
  • In ähnlicher Weise kann Mutagenese RAP-BP-Homologe hervorrufen, die intrazelluläre Halbwertszeiten haben, die sich dramatisch von dem entsprechenden Wildtyp-Protein unterscheiden. Zum Beispiel kann das veränderte Protein entweder stabiler oder weniger stabil gegen proteolytischen Abbau oder andere zelluläre Vorgänge gemacht werden, was in Zerstörung oder andernfalls Inaktivierung des authentischen RAP-Bindungsproteins resultiert. Solche Homologe und die Gene, die diese codieren, können angewendet werden, um die Bedingungen für die Expression eines speziellen RAP-BP durch Modulierung der Halbwertszeit des Proteins zu verändern. Zum Beispiel kann eine kurze Halbwertszeit transientere biologische RAPT1-Effekte hervorrufen, und, wenn sie ein Teil eines induzierbaren Expressions-Systems ist, kann sie eine strengere Kontrolle der rekombinanten RAPT1-Mengen innerhalb der Zelle ermöglichen. Wie oben können solche Proteine und im besonderen deren rekombinante Nucleinsäure-Konstrukte in Gentherapie-Protokollen verwendet werden.
  • Zum Beispiel werden die Aminosäure-Sequenzen für eine Population von RAP-BP-Homologen oder anderen verwandten Proteinen aneinander ausgerichtet, vorzugsweise um die höchst-mögliche Homologie zu fördern. Solch eine Population von Varianten kann zum Beispiel RAPT1-Homologe von einer oder mehreren Spezies einschließen, z. B. eine Sequenz-Ausrichtung der Maus- und menschlichen RAPT1-Proteine, dargestellt in SEQ ID Nos: 2 und 12, oder unterschiedliche RAP- BP-Isoforme der gleichen Spezies, z. B. unterschiedliche menschliche RAPT1-Isoforme. Aminosäuren, die an jeder Position der Sequenz-Ausrichtung auftreten, können ausgewählt werden, um einen degenerierten Satz von kombinatorischen Sequenzen zu bilden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die kombinatorische RAP-BP-Genbank durch eine degenerierte Genbank von Genen hergestellt, die eine Bank von Polypeptiden codieren, wobei jedes mindestens einen Teil von potenziellen RAP-BP-Sequenzen einschließt, z. B. den Teil von RAPT1, dargestellt in SEQ ID No: 2 oder 12, oder den Teil von rap-UBC, dargestellt in SEQ ID No: 24. Ein Gemisch von synthetischen Oligonucleotiden kann enzymatisch in Gen-Sequenzen ligiert werden, so dass der degenerierte Satz von protenziellen RAP-BP-Sequenzen exprimierbar ist als individuelle Polypeptide, oder alternativ als ein Satz von größeren Fusionsproteinen (z. B. für Phagen-Display), darin enhaltend die RAP-BP-Sequenz-Genbank.
  • Es gibt viele Wege, durch die die Genbank von RAP-BP-Homologen aus einer degenerierten Oligonucleotid-Sequenz hergestellt werden kann. Zum Beispiel kann chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz in einem automatisierten DNA-Synthegeräten ausgeführt werden, und die synthetischen Gene können dann in ein geeignetes Gen für Expression ligiert werden. Der Zweck eines degenerierten Satzes von RAP-BP-Genen ist, alle der Sequenzen, codierend den erwünschten Satz von potenziellen RAP-BP-Sequenzen, in einem Gemisch zu liefern. Die Synthese von degenerierten Oligonucleotiden ist in dem Fachbereich wohlbekannt (siehe zum Beispiel Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, Hrsg. AG Walton, Amsterdam: Elsevier S. 273–289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477. Solche Verfahren wurden in der direkten Entwicklung von anderen Proteinen angewendet (siehe zum Beispiel Scott et al. (1990) Science 249: 386–390; Roberts et al. (1992) PNAS 89: 2429–2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404–406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378–6382; so wie US-Patent Nr. 5,223,409, 5,198,346 und 5,096,815).
  • Alternativ können andere Formen von Mutagenese verwendet werden, um eine kombinatorische Genbank herzustellen. Zum Beispiel können RAP-BP-Homologe (sowohl Agonist- als auch Antagonist-Formen) hergestellt und aus einer Genbank isoliert werden, die hergestellt wurde unter Verwendung von zum Beispiel Alanin-Scanning-Mutagenese und dergleichen (Ruf et al. (1994) Biochemistry 33: 1565–1572; Wang et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 3095–3099; Balint et al. (1993) Gene 137: 109–118; Grodberg et al. (1993) Eur. J. Biochem. 218: 597–601; Nagashima et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 2888–2892; Lowman et al. (1991) Biochemistry 30: 10832–10838; und Cunningham et al. (1989) Science 244: 1081–1085), durch Linker-Scanning-Mutagenese (Gustin et al. (1993) Virology 193: 653–660; Brown et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12: 2644–2652; McKnight et al. (1982) Science 232: 316); durch Sättigungs-Mutagenese (Meyers et al. (1986) Science 232: 613); durch PCR-Mutagenese (Leung et al. (1989) Method Cell Mol Biol 1: 11–19); oder durch zufällige Mutagenese (Miller et al. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press Cold Spring Harbor, NY; und Greener at al. (1994) Strategies in Mol Biol 7: 32–34).
  • Ein weites Angebot von Verfahren zur Durchmusterung auf Gen-Produkte von vielfältigen Genbanken, hergestellt durch kombinatorische Mutagenese, im besonderen zur Identifizierung von individuellen Gen-Produkten, die eine besondere Eigenschaft aufweisen, sind in dem Fachbereich bekannt. Solche Verfahren werden allgemein anpassbar sein für schnelles Durchmustern der Genbanken, hergestellt durch die kombinatorische Mutagenese von zum Beispiel RAPT1-Homologen. Die am weitesten verwendeten Verfahren zur Durchmusterung großer Genbanken umfassen typischerweise die Clonierung der Genbank in replizierbare Expressions-Vektoren, Transformieren geeigneter Zellen mit der resultierenden Genbank von Vektoren und Expression der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis einer erwünschten Aktivität eine relativ einfache Isolation des Vektors ermöglicht, der das Gen codiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde. Mit jedem der unten beschriebenen veranschaulichenden Tests kann eine Analyse mit hohen Durchgangs-Zahlen durchgeführt werden, wenn es nötig ist, große Zahlen von degenerierten RAP-BP-Sequenzen, erzeugt durch kombinatorische Mutagenese-Verfahren, zu durchmustern.
  • In einem Durchmusterungstest werden die Kandidaten-RAP-BP-Genprodukte auf der Oberfläche einer Zelle oder eines viralen Partikels gezeigt, und die Fähigkeit der bestimmten Zellen oder viralen Partikel, den FKBP12/Rapamycin-Komplex via dieses Genprodukt zu binden, wird in einem Panningtest nachgewiesen. Zum Beispiel kann die degenerierte RAP-BP-Genbank in das Gen für ein Oberflächenmembran-Protein einer bakteriellen Zelle cloniert werden, und das resultierende Fusionsprotein durch Panning-Protokolle nachgewiesen werden (siehe zum Beispiel Ladner et al., WO 88/06630; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370–1371; und Goward et al. (1992) TIBS 18: 136–140). In ähnlicher Weise können fluoreszierend-markierte Moleküle, die das RAP-Bindungsprotein binden, wie fluoreszierend-markiertes Rapamycin oder FKBP12/Rapamycin-Komplexe, verwendet werden, um potenziell funktionelle RAP-BP-Homologe zu erhalten. Zellen können visuell untersucht und unter einem Fluoreszenzmikroskop getrennt werden, oder, wo es die Morphologie der Zelle erlaubt, durch einen Fluoreszenz-aktivierten Zell-Sortierer getrennt werden.
  • Alternativ wird die Genbank als ein Fusionsprotein auf der Oberfläche eines viralen Partikels exprimiert. Zum Beispiel können in dem filamentösen Phagen-System fremde Peptid-Sequenzen auf der Oberfläche eines infektiösen Phagen exprimiert werden, wobei zwei signifikante Vorteile verliehen werden. Erstens, da diese Phagen auf Affinitäts-Matrizen in sehr hohen Konzentrationen angewendet werden können, kann eine große Anzahl Phagen zu einer Zeit durchmustert werden. Zweitens, da jeder infektiöse Phage das kombinatorische Genprodukt auf seiner Oberfläche zeigt kann, wenn ein bestimmter Phage von einer Affinitäts-Matrix in niedriger Menge gewonnen wird, der Phage durch eine weitere Runde von Infektion amplifiziert werden. Die Gruppe von fast identischen filamentösen Phagen M13, fd und f1 von E. coli wird äußerst häufig in Phagen-Display-Genbanken verwendet, da jedes der Phagen-gIII- oder -gVIII-Mantel-Proteine verwendet werden kann, um Fusionsproteine ohne Beeinträchtigung der endgültigen Verpackung der viralen Partikel herzustellen (Ladner et al. PCT-Publikation WO 90/02909; Garrard et al., PCT-Publikation WO 92/09690; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 16007–16010; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725–734; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624–628; und Barbas et al. (1992) PNAS 89: 4457–4461). In einer veranschaulichenden Ausführungsform kann das rekombinante Phagen-Antikörper-System (RPAS, Pharmacia Katalog-Nummer 27-9400-01) einfach für die Verwendung zur Expression und Durchmusterung von kombinatorischen RAP-BP-Genbanken modifiziert werden, und die RAP-BP-Phagen-Genbank kann auf Gluthation-immobilisierte FKBP-GST/Rapamycin-Komplexe dem Panningverfahren unterzogen werden. Aufeinander folgende Runden von Reinfektion, Phagen-Amplifikation und Panning werden Homologe außerordentlich anreichern, die FKBP/Rapamycin-Bindung beibehalten, und die in der Folge durchmustert werden können nach weiteren biologischen Aktivitäten, um zwischen Agonisten und Antagonisten zu unterscheiden.
  • Homologe der menschlichen und Maus-RAP-Bindungsproteine können auch durch die Verwendung von Interaktions-Einfangtests hergestellt werden, um auf kombinatorische Genbanken von RAP-BP-Mutanten zu durchmustern. Wie unten in Beispiel 10 beschrieben, kann der gleiche Zwei-Hybridtest, der verwendet wurde, um cDNA-Genbanken nach Proteinen zu durchmustern, die mit FK506-Bindungsproteinen in einer Arzneistoff-abhängigen Weise interagieren, auch verwendet werden, um innerhalb von kombinatorischen Genbanken von zum Beispiel RAPT1-Mutanten zu sortieren, um sowohl agonistische als auch antagonistische Formen zu finden. Durch Kontrolle der Empfindlichkeit des Tests für Interaktionen, z. B. durch die Manipulation der Stärke der Promotor-Sequenz, die verwendet wird, um Expression des Reporter-Konstrukts zu steuern, kann der Test hergestellt werden, um agonistische Formen von RAPT1 mit engeren Bindungs-Affinitäten für Rapamycin als die authentische Form des Proteins zu begünstigen. Alternativ kann der Test, wie in Beispiel 10 beschrieben, verwendet werden, um RAPT1-Homologe zu selektieren, die jetzt unfähig sind, Rapamycin-Komplexe zu binden, und daher Versionen des RAPT1-Proteins sind, die eine Zell unempfindlich gegen Behandlung mit diesem Makrolid machen können.
  • Hierin sind auch Verfahren zur Reduktion der Rapamycin-Bindungs-Domänen der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine beschrieben, um Nachahmungen herzustellen, z. B. Peptid- oder Nicht-Peptid-Agenzien, die fähig sind, die Bindung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit einem FKBP/Rapamycin-Komplex zu zerstören. Daher sind solche mutagenen Verfahren, wie oben beschrieben, auch nützlich, um die Determinanten von RAP-Bindungsproteinen zu kartieren, die an Interaktionen teilnehmen, die zum Beispiel an der Bindung an einen FKBP/Rapamycin-Komplex involviert sind. Um dies zu veranschaulichen, können die kritischen Reste eines RAP-Bindungsproteins, die an der molekularen Erkennung von FKBP/Rapamycin involviert sind, nachgewiesen und verwendet werden, um RAP-BP-abstammende Peptidomimetika herzustellen, die kompetitiv die Bindung des RAP-BP an Rapamycin-Komplexe inhibieren. Durch Anwendung von zum Beispiel Scanning-Mutagenese, um die Aminosäure-Reste eines bestimmten RAP-Bindungsproteins zu kartieren, das an der Bindung von FKBP/Rapamycin-Komplexen involviert ist, können peptidomimetische Verbindungen hergestellt werden, die diese Reste in der Bindung an den Rapamycin-Komplex nachahmen und die durch Inhibition der Bindung des RAP-BP an FKBP/Rapamycin die Funktion von Rapamycin im Zellzyklus-Arrest behindern können. Zum Beispiel können nicht-hydrolisierbare Peptid-Analoge von solchen Resten hergestellt werden unter Verwendung von retro-inversen Peptiden (z. B. siehe US-Patente 5,116,947 und 5,218,089; und Pallai et al. (1983) Int J Pept Protein Res 21: 84–92), Benzodiazepin (z. B. siehe Freidinger et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall Hrsg., ESCOM Publisher: Leiden, Niederlande, 1988), Azepin (z. B. siehe Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall Hrsg., ESCOM Publisher: Leiden, Niederlande, 1988), substituierte gama-Lactam-Ringe (Garvey et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall Hrsg., ESCOM Publisher: Leiden, Niederlande, 1988), Keto-Methylen-Pseudopeptide (Ewenson et al. (1986) J Med Chem 29: 295; und Ewenson et al. in Peptides: Structure and Function (Proceedings des 9. Amerikanischen Peptid-Symposiums) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), Dipeptid-Kerne mit β-Schleife (Nagai et al. (1985) Tetrahedron Lett 26: 647; und Sato et al. (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1: 1231), und β-Aminoalkohole (Gordon et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126: 419; und Dann et al. (1986) Biochem Biophys Res Commun 134: 71). Peptidomimetika können, Seite-an-Seite-Tests nutzend, gestaltet werden, um spezifisch die Interaktion von menschlichem RAPT1 (oder anderen Säuger-Homologen) mit dem FKBP12/Rapamycin-Komplex in Säuger-Zellen zu inhibieren, was aber die Interaktion des Hefe-Proteins TOR1 oder TOR2 mit dem FKB1/Rapamycin-Komplex nicht wesentlich beeinflusst. Solch ein Peptid-Analog kann in Verbindung mit Rapamycin-Behandlung von mykotischen Infektionen verwendet werden, um den Wirts-Säuger vor Rapamycin-Nebeneffekten wie Immunsuppression zu schützen, ohne wesentliche Reduzierung der Wirksamkeit von Rapamycin als ein antifungales Mittel.
  • Auch in Betracht gezogen wird ein Antikörper, der spezifisch mit einem oder mehreren der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine reagiert. Zum Beispiel können durch Verwendung von Immunogenen, abstammend von einem RAP-Bindungsprotein, anti-Protein-/anti-Peptid-Antiseren oder monoclonale Antikörper durch Standard-Protokolle hergestellt werden (siehe zum Beispiel Antibodies: A Laboratory Manual Hrsg. Harlow und Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Ein Säuger wie eine Maus, ein Hamster oder Kaninchen kann mit einer immunogenen Form des Peptids immunisiert werden (z. B, ein Voll-Längen-RAP-Bindungsprotein oder ein antigenes Fragment, das fähig ist, eine Antikörper-Antwort hervorzurufen). Verfahren zur Übertragung von Immunogenität auf ein Protein oder Peptid schießen Konjugieren an Träger oder andere Verfahren ein, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Ein immunogener Teil des erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteins kann in der Anwesenheit von Adjuvans verabreicht werden. Der Vorgang der Immunisierung kann durch Nachweis von Antikörper-Titern in Plasma oder Serum überwacht werden. Standart-ELISA oder andere Immunotests können mit dem Immunogen als Antigen verwendet werden, um die Mengen der Antikörper zu beurteilen. Die erfindungsgemäßen Antikörper können immunspezifisch für antigene Determinanten der RAP-Bindungsproteine der vorliegenden Erfindung sein, z. B. antigene Determinanten eines Proteins, dargestellt in einer der SEQ ID Nos: 2, 12, oder ein nahe verwandtes menschliches oder nicht-menschliches Säuger-Homolog davon. Zum Beispiel kreuzreagiert ein bevorzugter anti-RAP-BP-Antikörper der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich (d. h. reagiert spezifisch) mit einem Protein, das weniger als 90 Prozent homolog ist zu einer der SEQ ID Nos: 2 oder 12 ist; obwohl Antikörper besonders in Betracht gezogen werden, die nicht wesentlich kreuzreagieren mit einem Protein, das weniger als 95 Prozent homolog ist mit einer der SEQ ID Nos: 2, 12 oder 24 oder noch weniger als 98–99 Prozent homolog mit einer der SEQ ID Nos: 2 oder 12. Mit ,nicht wesentlich kreuzreagieren' wird gemeint, dass der Antikörper eine Bindungs-Affinität für ein nicht-homologes Protein hat (z. B. ein Hefe-TOR1- oder -TOR2-Protein), die weniger als 10 Prozent ist, mehr bevorzugt weniger als 5 Prozent und noch mehr bevorzugt weniger als 1 Prozent der Bindungs-Affinität für ein Säuger-RAPT1-Protein, z. B. wie dargestellt durch eine der SEQ ID Nos: 2 oder 12.
  • Nach der Immunisierung kann anti-RAP-BP-Antiserum erhalten werden, und gegebenenfalls können polyclonale anti-RAP-BP-Antikörper aus dem Serum isoliert werden. Um monoclonale Antikörper herzustellen, können Antikörper-produzierende Zellen (Lymphocyten) von einem immunisierten Tier geerntet werden und durch somatische-Zellfusions-Standard-Verfahren mit immortalisierten Zellen wie Myelom-Zellen fusioniert werden, um Hybridom-Zellen zu erhalten. Solche Verfahren sind in dem Fachgebiet wohlbekannt und schließen zum Beispiel ein das Hybridom-Verfahren (ursprünglich entwickelt von Köhler und Milstein, (1975) Nature, 256: 495–497), das menschliche B-Zell-Hybridom-Verfahren (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72) und das EBV-Hybridom-Verfahren, um menschliche monoclonale Antikörper herzustellen (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. S. 77–96). Hybridom-Zellen können immunochemisch auf Produktion von Antikörpern, die spezifisch reagieren mit einem RAP-Bindungsprotein der vorliegenden Erfindung, und monoclonale Antikörper, isoliert aus einer Kultur, umfassend solche Hybridom-Zellen, durchmustert werden.
  • Eine Antikörper-Herstellung, hergestellt aus einem Polypeptid, wie oben beschrieben, kann in trockener Form vorliegen, wie sie durch Lyophilisierung erhalten wird. Die Antikörper werden jedoch normal verwendet und in einer wässrigen Füssig-Zusammensetzung in Serum oder einem geeigneten Puffer wie PBS geliefert werden.
  • Der Ausdruck Antikörper, wie hierin verwendet, soll Fragmente davon einschließen, die auch spezifisch reaktiv sind mit einem des erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteins. Antikörper können unter Verwendung von konventionellen Verfahren fragmentiert, einschließlich rekombinante Technik, und die Fragmente auf Nützlichkeit in der gleichen Weise, wie oben für ganze Antikörper beschrieben, durchmustert werden. Zum Beispiel können F(ab')2-Fragmente durch Behandlung des Antikörpers mit Pepsin hergestellt werden. Das resultierende F(ab')2-Fragment kann behandelt werden, um Disulfid-Brücken zu reduzieren, um Fab'-Fragmente herzustellen. Der Antikörper soll im weiteren bispezifische und chimäre Moleküle einschließen, die einen anti-RAP-BP-Teil haben.
  • Sowohl monoclonale als auch polyclonale Antikörper (Ab), gerichtet gegen ein RAP-Bindungsprotein, können verwendet werden, um die Wirkung dieses Proteins zu blockieren und die Untersuchung der Rolle eines bestimmten RAP-Bindungsproteins in zum Beispiel Zell-Zyklus-Regulierung allgemein oder in der Äthiologie von proliferativen und/oder Differenzierungs-Störungen im speziellen, oder im Mechanismus der Wirkung von Rapamycin, z. B. durch Mikroinjektion von anti-RAP-BP-Antikörpern in Zellen, zu ermöglichen.
  • Antikörper, die spezifisch RAP-BP-Epitope binden, können auch in immun-histochemischer Färbung von Gewebe-Proben verwendet werden, um die Menge und das Muster der Expression von jedem der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine zu bewerten. Anti-RAP-BP-Antikörper können diagnostisch in Immunpräzipitation und Immunblotting als Teil eines klinischen Test-Verfahrens verwendet werden, um RAP-BP-Mengen in Gewebe oder Körperflüssigkeit nachzuweisen und zu bewerten. Zum Beispiel können solche Messungen wie die Menge von freiem RAP-BP zu RAP-BP/FKBP/Arzneistoff-Komplexen für vorhersagende Bewertungen der Wirksamkeit eines bestimmten Rapamycin-Analogs nützlich sein, und können die Bestimmung der Wirksamkeit eines gegebenen Behandlungsschemas für ein Individuum erlauben. Die Menge an RAP-Bindungsprotein kann in Zellen, die in Körperflüssigkeit gefunden werden, wie in Zellen von Blutproben, gemessen werden, oder kann in Gewebe wie Biopsiegewebe gemessen werden.
  • Eine andere Anwendung der erfindungsgemäßen Antikörper liegt in der immunologischen Durchmusterung von cDNA-Genbanken, errichtet in Expressions-Vektoren wie λgt11, λgt18-23, λZAP und λORF8. Boten-Genbanken von diesem Typ, die codierende Sequenzen, die im korrekten Leserahmen und in der korrekten Orientierung inseriert wurden, aufweisen, können Fusionsproteine herstellen. Zum Beispiel wird λgt11 Fusionsproteine herstellen, deren Amino-Termini aus β-Galactosidase-Aminosäure-Sequenzen bestehen und deren Carboxy-Termini aus einem fremden Polypeptid bestehen. Antigene Epitope eines RAP-Bindungsproteins können dann mit Antikörpern nachgewiesen werden, wie zum Beispiel Reaktion von Nitrocellulose-Filtern, die von infizierten Platten abgezogen wurden, mit anti-RAP-BP-Antikörpern. Ein Phage, erhalten durch diesen Test, kann dann von der infizierten Platte isoliert werden. Daher kann die Anwesenheit von RAP-BP-Homologen nachgewiesen und sie können von anderen Tieren cloniert werden, und alternative Isoforme (einschließlich Spleiß-Varianten) können nachgewiesen und von menschlichen Quellen cloniert werden.
  • Darüber hinaus wird die Nucleotidsequenz, nachgewiesen aus der Clonierung der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine aus einer menschlichen Zell-Linie, weiter die Herstellung von Sonden ermöglichen, die gestaltet sind für die Verwendung zur Identifizierung von Homologen in anderen menschlichen Zell-Typen so wie RAP-BP-Homologen (z. B. Orthologe) von anderen Säugetieren. Zum Beispiel wird es möglich sein, durch Identifizierung von hoch-konservierten Nucleotid-Sequenzen durch Vergleich der Säuger-RAPT1-Gene mit den Hefe-TOR-Genen, degenerierte Primer zur Isolierung von RAPT1-Homologen von nahezu jeder eukaryontischen Zeile zu gestalten. Zum Beispiel haben wir durch Ausrichtung der Maus-RAPT1-Gensequenz und der Hefe-DRR-1- und TOR2-Sequenzen nachgewiesen, dass optimale Primer für die Isolierung von RAPT1-Homologen von anderen Säuger-Homologen so wie von pathogenen Pilzen die Primer GRGAYTTRAWBGABGCHYAMGAWTGG; CAAGCBTGGGAYMTYMTYTAYTATMAYGTBTTCAG und GAYYBGARTTGGCTGTBCCHGG einschließen.
  • Dementsprechend wird auch eine Sonde/ein Primer beschrieben, umfassend ein im wesentlichen aufgereinigtes Oligonucleotid, wobei das Oligonucleotid eine Region der Nucleotidsequenz umfasst, die unter stringenten Bedingungen an mindestens 10 aufeinanderfolgende Nucleotide der Sense- oder Antisense-Sequenz von einer der SEQ ID Nos: 1 oder 11 oder natürlich vorkommenden Mutanten davon hybridisiert. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Sonde/der Primer weiter eine Markierungs-Gruppe, die daran angeheftet und fähig ist, nachgewiesen zu werden, z. B. wird die Markierungs-Gruppe selektiert aus der Gruppe, bestehend aus Radioisotopen, fluoreszierenden Verbindungen, Enzymen und Enzym-Co-Faktoren. Solche Sonden können auch als ein Teil eines diagnostischen Test-Kits zur Identifizierung transformierter Zellen verwendet werden, wie zum Messen einer Menge einer RAP-BP-Nucleinsäure in einer Probe von Zellen eines Patienten; z. B. Nachweis von mRNA, codierend eine RAP-BP-mRNA-Menge, z. B. Nachweis, ob ein genomisches RAP-BP-Gen mutiert oder deletiert wurde.
  • Zusätzlich können Nucleotid-Sonden hergestellt werden, die histologische Durchmusterung von intaktem Gewebe und Gewebeproben auf die Anwesenheit einer RAP-BP-mRNA ermöglichen. Ähnlich zu den diagnostischen Anwendungen von anti-RAP-BP-Antikörpern kann die Verwendung von Sonden, gerichtet gegen RAP-BP-mRNAs oder gegen genomische RAP-BP-Sequenzen, sowohl für vorhersagende als auch therapeutische Bewertung von allelischen Mutationen verwendet werden, die manifest sein könnten in zum Beispiel neoplastischen oder hyperplastischen Störungen (z. B. unerwünschtes Zell-Wachstum) oder abnormaler Differenzierung von Gewebe. Verwendet in Verbindung mit einem Antikörper-Immuntest können Nucleotid-Sonden helfen, den Nachweis der molekularen Basis für eine Entwicklungs-Störung zu ermöglichen, die eine gewisse Abormalität, assoziiert mit Expression (oder Fehlen davon) eines RAP-Bindungsproteins, einbeziehen kann. Zum Beispiel kann Variation in der Synthese eines RAP-Bindungsproteins von einer Mutation in der codierenden Sequenz des Gens unterschieden werden.
  • Daher wird ein Verfahren zum Nachweis beschrieben, ob ein Individuum ein Risiko für eine Störung, charakterisiert durch ungewünschte Zell-Proliferation oder anormale Kontrolle der Differenzierung, aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann allgemein charakterisiert werden als umfassend den Nachweis in einer Gewebeprobe des Individuums (z. B. einem menschlichen Patienten) der Anwesenheit oder Abwesenheit einer genetischen Läsion, charakterisiert durch mindestens eines von (i) einer Mutation eines Gens, codierend eines der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine oder (ii) der Fehl-Expression eines RAP-BP-Gens. Um das zu veranschaulichen, können solche genetischen Läsionen nachgewiesen werden durch Sicherstellen des Vorkommens von mindestens (i) einer Deletion von einem oder mehreren Nucleotiden eines RAP-BP-Gens, (ii) einer Addition von einem oder mehreren Nucleotiden zu solch einem RAP-BP-Gen, (iii) einer Substitution von einem oder mehreren Nucleotiden eines RAP-BP-Gens, (iv) einer gravierenden chromosomalen Umordnung von einem der RAP-BP-Gene, (v) einer gravierenden Änderung in der Menge eines Boten-RNA-Transkripts eines RAP-BP-Gens, (vi) der Anwesenheit eines nicht-Wildtyp-Spleiß-Musters eines Boten-RNA-Transkripts eines RAP-BP-Gens und (vii) einer nicht-Wildtyp-Menge eines RAP-Bindungsproteins. In einem Aspekt der Erfindung wird eine Sonde/ein Primer geliefert, umfassend ein Oligonucleotid, das eine Region einer Nucleotidsequenz enthält, die fähig ist zur Hybridisierung an eine Sense- oder Antisense-Sequenz von einem der SEQ ID Nos: 1 oder 11 oder natürlich vorkommende Mutanten davon oder flankierende 5'- oder 3'- Sequenzen oder intronische Sequenzen, die natürlich assoziiert sind mit den erfindungsgemäßen RAP-BP-Genen. Die Sonde wird einer Nucleinsäure einer Gewebeprobe ausgesetzt: und die Hybridisierung der Sonde an die Proben-Nucleinsäure wird nachgewiesen. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Nachweis der Läsion die Anwendung der Sonde/des Primers in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (siehe z. B. US-Patent Nr: 4,683,195 und 4,683,202) oder alternativ in einer Ligierungs-Kettenreaktion (LCR) (siehe z. B. Landegran et al. (1988) Science, 241: 1077–1080; und NaKazawa et al. (1944) PNAS 91: 360–364), die zweitere davon kann besonders nützlich sein zum Nachweis von Punktmutationen in dem RAP-BP-Gen. Alternativ können Immuntests angewendet werden, um die Menge von RAP-Bindungsprotein und/oder seine Teilnahme an Protein-Komplexen nachzuweisen, im besonderen Transkriptionsregulations-Komplexen, wie jene, die FKBP/Rapamycin einbeziehen.
  • Durch Inhibition von endogener Produktion eines speziellen RAP-Bindungsproteins können auch Antisense-Verfahren (z. B. Mikroinjektion von Antisense-Molekülen oder Transfektion mit Plasmiden, deren Transkripte anti-sense sind in Bezug auf eine RAP-BP-mRNA oder -Gen-Sequenz) verwendet werden, um die Rolle eines jeden der erfindungsgemäßen RAP-BP in Wachstums- und Differenzierungs-Vorgängen zu untersuchen, wie jene, die Wilms Tumor auslösen, so wie normale zelluläre Funktionen jedes der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine, z. B. bei der Regulierung der Transkription. Solche Verfahren können angewendet werden in Zell-Kultur, aber können auch verwendet werden für die Bildung von transgenen Tieren.
  • Darüber hinaus werden Tests beschrieben, die verwendet werden können, um nach Arzneistoffen zu durchmustern, die entweder Agonisten oder Antagonisten von der zellulären Funktion von jedem der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine oder von deren Rolle in der Pathogenese von proliferativen und Differenzierungs-Störungen sind. Zum Beispiel kann ein Test erstellt werden, der die Fähigkeit einer Verbindung, Bindung zwischen einem RAP-Bindungsprotein und einem FK506-Protein zu modulieren, bewertet. Im speziellen können solche Tests verwendet werden, um neue Rapamycin-Analoge zu gestalten und zu durchmustern so wie völlig unverwandte Verbindungen auf deren Fähigkeit Bildung von FKBP/RAP-BP-Komplexen zu vermitteln, zu testen. Solche Tests können verwendet werden, um wirksamere, anti-proliferative Stoffe herzustellen, die einen ähnlichen Wirkungsmechanismus haben wie Rapamycin, z. B. Rapamycin-Analoge. Eine Vielzahl von Testausführungen wird ausreichen und wird im Lichte der vorliegenden Erfindung von einem Fachmann in Betracht gezogen werden.
  • Ein Aspekt, der die Herstellung von Arzneistoff-Durchmusterungstests ermöglicht, besonders die unten beschriebenen Tests mit hohen-Durchgangszahlen, ist die Identifizierung der Rapamycin-bindenden Domäne von RAPT1-ähnlichen Proteinen. Zum Beispiel liefert die vorliegende Erfindung Teile der RAPT1-ähnlichen Proteine, die leichter zu manipulieren sind als das Voll-Längen-Protein. Das Voll-Längen-Protein ist auf Grund seiner Größe schwerer zu exprimieren als ein rekombinantes Protein oder ein Fusionsprotein, das Rapamycin-Bindungs-Aktivität beibehalten würde, und kann sehr wohl unlöslich sein. Dementsprechend liefert die vorliegende Erfindung lösliche Polypeptide, die einen löslichen Teil eines RAPT1-ähnlichen Polypeptids einschließen, der an besagten FKBP/Rapamycin-Komplex bindet, wie die Rapamycin-Bindungs-Domäne, dargestellt durch eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Val26-Tyr160 von SEQ ID No. 2, Val2012-Tyr2144 von SEQ ID No. 12, Val41-Tyr173 von SEQ ID No. 14, Val1-Tyr133 von SEQ ID No. 16 und Val1-Arg133 von SEQ ID No. 18.
  • Zum Beispiel können RAPT1-Polypeptide, die nützlich sind in den erfindungsgemäßen Durchmusterungstests, dargestellt werden durch die allgemeine Formel X-Y-Z; Y stellt eine Aminosäuresequenz einer Rapamycin-Bindungs-Domäne innerhalb der Reste 2012 bis 2144 von SEQ ID No. 12 dar, X ist nicht anwesend oder repräsentiert die ganze oder einen C-terminalen Teil der Aminosäuresequenz zwischen etwa den Resten 1700 und 2144 von SEQ ID No. 12, die nicht dargestellt sind durch Y, Z ist nicht anwesend oder repräsentiert die ganze oder einen N-terminalen Teil der Aminosäuresequenz zwischen den Resten 2012 und 2549 von SEQ ID No. 12, die nicht dargestellt sind durch Y. Vorzugsweise schließt das Polypeptid nur etwa 50 bis 200 Reste der RAPT1-Protein-Sequenz ein, wobei dieser Teil eine Rapamycin-Bindungs-Domäne einschließt. Ähnliche Polypeptide können für andere RAPT1-ähnliche Proteine hergestellt werden.
  • Alternativ kann die gleiche Formel auch verwendet werden, um ein bioaktives Fragment des erfindungsgemäßen RAPT1-Proteins zu bestimmen, worin Y eine Rapamycin-Bindungs-Domäne innerhalb der Reste 2012 bis 2144 von SEQ ID No. 12 darstellt, X abwesend ist oder ein Polypeptid von 1 bis etwa 500 Aminosäureresten von SEQ ID No. 12, unmittelbar N-terminal zu der Rapamycin-Bindungs-Domäne repräsentiert und Z abwesend ist oder von 1 bis etwa 365 Aminosäurereste von SEQ ID No. 2, unmittelbar C-terminal zu der selektierten Rapamycin-Bindungs-Domäne repräsentiert.
  • In vielen Arzneistoff-Durchmusterungs-Programmen, die Genbanken auf Verbindungen und natürliche Extrakte testen, sind Tests mit hohen Durchgangszahlen wünschenswert, um die Anzahl an Verbindungen, die in einem gegebenen Zeit-Abschnitt geprüft werden, zu maximieren. Tests, die in Zell-freien Systemen durchgeführt werden, wie sie mit aufgereinigten oder halb-aufgereinigten Proteinen erhalten werden können, sind oft für ,primäre' Durchmusterungen bevorzugt, da sie hergestellt werden können, um schnelle Entwicklung und relativ einfachen Nachweis einer Veränderung in einem molekularen Ziel zu ermöglichen, wenn sie mit einer Test-Verbindung in Kontakt gebracht werden. Darüber hinaus können die Effekte von zellulärer Toxizität und/oder Bio-Verfügbarkeit der Test-Verbindung im allgemeinen in dem in vitro-System ignoriert werden; statt dessen konzentriert sich der Test primär auf den Effekt des Arzneistoffes auf das molekulare Ziel, was in einer Änderung der Bindungsaffinität für andere Proteine oder Änderung der enzymatischen Eigenschaften des molekularen Ziels manifestiert sein kann. Dementsprechend wird in einem beispielhaften Durchmusterungstest der vorliegenden Erfindung die Verbindung von Interesse (der ,Arzneistoff') mit einem Gemisch in Kontakt gebracht, das aus einem isolierten und aufgereinigten RAP-Bindungsprotein wie RAPT1 oder rapUBC und einem FK506-Bindungsprotein hergestellt wurde. Nachweis und Quantifizierung der Arzneistoff-abhängigen FKBP/RAP-BP-Komplexe liefern ein Mittel zur Bestimmung der Wirksamkeit der Verbindung zum Vermitteln der Komplex-Bildung zwischen den zwei Proteinen. Die Wirksamkeit der Verbindung kann durch Herstellen von Dosis-Antwort-Kurven aus den Daten, die unter Verwendung verschiedener Konzentrationen der Test-Verbindung erhalten wurden, beurteilt werden. Darüber hinaus kann auch ein Kontrolltest durchgeführt werden, um eine Grundlinie zum Vergleich zu liefern. In dem Kontrolltest wird isoliertes und aufgereinigtes RAP-BP zu einer Zusammensetzung, enthaltend das FK506-Bindungsprotein, hinzugefügt, und die Bildung von FKBPRAP-BP-Komplexen wird in der Abwesenheit der Test-Verbindung quantifiziert.
  • Komplex-Bildung zwischen dem RAP-Bindungsprotein und einem FKBP/Arzneistoff-Komplex kann durch eine Vielzahl von Verfahren nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann eine Veränderung in der Bildung von Komplexen unter Verwendung von zum Beispiel nachweisbar markierten Proteinen (z. B. radioaktivmarkiert, fluoreszenzmarkiert oder enzymatisch markiert), durch Immuntest oder durch chromatographischen Nachweis quantifiziert werden.
  • Typischerweise wird es wünschenswert sein, entweder das FK506-Bindungsprotein oder das RAP-Bindungsprotein zu immobilisieren, um Separation von Arzneistoff-abhängigen Protein-Komplexen von nicht-Komplex-Formen von einem der Proteine zu ermöglichen so wie um Automatisierung des Tests entgegenzukommen. In einer veranschaulichenden Ausführungsform kann ein Fusionsprotein geliefert werden, das eine Domäne hinzufügt, die es dem Protein erlaubt, an eine unlösliche Matrix gebunden zu sein. Zum Beispiel können Glutathion-S-Transferase/FKBP (FKBP-GST)-Fusionsproteine auf Glutathion-Sepharose-Kugeln (Sigma Chemical, St. Louis, MO) oder Glutathion-derivatisierte Mikrotiter-Platten adsorbiert werden, die dann mit dem RAP-Bindungsprotein, z. B. einem 35S-markierten RAP-Bindungsprotein, und der Test-Verbindung kombiniert werden und unter Bedingungen inkubiert werden, die zu Komplex-Bildung leiten (siehe zum Beispiel Beispiel 9). Nach der Inkubation werden die Kugeln gewaschen, um jegliches ungebundene RAP-BP zu entfernen, und die Kugel-gebundene Radioaktiv-Markierung wird direkt (z. B. werden Kugeln in einem Szintillationszähler platziert) oder in dem Überstand nachgewiesen, nachdem die FKBP/RAP-BP-Komplexe dissoziiert wurden, z. B. wenn Mikrotiter-Platten verwendet werden. Alternativ können nach dem Wegwaschen von ungebundenem Protein die Komplexe von der Matrix losgelöst, durch SDS-PAGE-Gel aufgetrennt, und die Menge an RAP-BP, die in der Matrix-gebundenen Fraktion gefunden wird, aus dem Gel unter Verwendung von elektrophoryetischen Standardverfahren quantifiziert werden.
  • Andere Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen auf Matrizes sind auch verfügbar für die Verwendung im erfindungsgemäßen Test. Zum Beispiel kann das FK506-Bindungsprotein immobilisiert werden unter Anwendung einer Konjugation von Biotin und Streptavidin. Biotinyliertes FKBP kann von Biotin-NHS (N-Hydroxy-Succinimid) unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind (z. B. Biotinlierungskit, Pierce Chemicals, Rockford, IL), hergestellt und in den Vertiefungen von Streptavidin-beschichteten Platten mit 96 Vertiefungen (Pierce Chemical) immobilisiert werden. Alternativ können Antikörper, die reaktiv sind mit dem FKBP, in die Vertiefungen der Platte derivatisiert werden, und FKBP kann durch Antikörper-Konjugierung in den Vertiefungen gefangen werden. Wie oben werden Herstellungen eines RAP-Bindungsproteins und einer Test-Verbindung in den FKBP-präsentierenden Vertiefungen der Platte inkubiert, und die Menge an FKBP/RAP-BP-Komplex, die in der Vertiefung gefangen ist, kann quantifiziert werden. Beispielhafte Verfahren zum Nachweis solcher Komplexe, zusätzlich zu jenen, die oben für die GST-immobilisierten Komplexe beschrieben wurden, schließen Immun-Nachweis von Komplexen unter Verwendung von Antikörpern, die reaktiv sind mit dem RAP-Bindungsprotein oder die reaktiv sind mit dem FK506-Bindungsprotein und um die Bindung mit dem RAP-BP konkurrieren; so wie enzymverbundene Tests ein, die auf den Nachweis einer enzymatischen Aktivität, assoziiert mit dem RAP-Bindungsprotein, angewiesen sind. Im Falle des Zweiteren kann die enzymatische Aktivität endogen sein, wie eine Kinase-(RAPT1) oder Ubiquitin-Ligase-(rapUBC) Aktivität, oder kann eine exogene Aktivität sein, chemisch konjugiert oder als ein Fusionsprotein mit dem RAP-Bindungsprotein geliefert. Um zu veranschaulichen, kann das RAP-Bindungsprotein chemisch vernetzt sein mit alkalischer Phosphatase, und die Menge an RAP-BP, gefangen in dem Komplex, kann mit einem chromogenen Substrat des Enzyms, z. B. Paranitrophenyl-Phosphat, bewertet werden. In ähnlicher Weise kann ein Fusionsprotein, umfassend das RAP-BP und Glutathion-S-Transferase geliefert werden und Komplex-Bildung durch Nachweis der GST-Aktivität unter Verwendung von 1-Chloro-2,4-Dinitrobenzol quantifiziert werden (Habig et al. (1974) J Biol Chem 249: 7130).
  • Für Vorgänge, die auf Immun-Nachweis zur Quantifizierung von einem der Proteine, die gefangen in dem Komplex sind, angewiesen sind, "können Antikörper gegen das Protein, wie die hierin beschriebenen anti-RAP-BP-Antikörper, verwendet werden. Alternativ kann das in dem Komplex nachzuweisende Protein ,Epitop-markiert' in der Form eines Fusionsproteins sein, das zusätzlich zu der RAP-BP- oder FKBP-Sequenz ein zweites Polypeptid einschließt, für das Antikörper einfach erhältlich sind (z. B. von kommerziellen Quellen). Zum Beispiel können die oben beschriebenen GST-Fusionsproteine auch zur Quantifizierung von Bindung unter Verwendung von Antikörpern gegen den GST-Rest verwendet werden. Andere nützliche Epitop-Markierungen schließen ein myc-Epitope (z. B. siehe Ellison et al. (1991) J Biol Chem 266: 21150–21157), die eine 10-Reste-Sequenz von c-myc einschließen, so wie das pFLAG-System (International Biotechnoiogies, Inc.) oder das pEZZ-Protein A-System (Pharmacia, NJ).
  • Zusätzlich können die erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine verwendet werden, um einen Arzneistoff-abhängigen Interaktions-Einfangtest, wie in den Beispielen unten beschrieben, zum Nachweis von Stoffen herzustellen, die Komplex-Bildung zwischen einem RAP-Bindungsprotein und einem FK506-Bindungsprotein induzieren. Wie unten beschrieben, ist der Interaktions-Einfangtest angewiesen auf Wiederherstellung in vivo eines funktionellen Transkriptions-Aktivator-Proteins von zwei separaten Fusionsproteinen, von denen eines die DNA-Bindungs-Domäne eines Transkriptions-Aktivators, fusioniert an ein FK506-Bindungsprotein, umfasst (siehe auch US-Patent Nr: 5,283,317; PCT-Publikation WO94/10300; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223–232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268: 12046–12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920–924; und Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693–1696). Das zweite Fusionsprotein umfasst eine Transkriptions-Aktivierungs-Domäne (z. B. fähig, RNA-Polymerase-Transkription zu initiieren), fusioniert an eines der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine. Wenn das FKBP und RAP-Bindungsprotein in der Anwesenheit eines Stoffes wie Rapamycin interagieren, werden die zwei Domänen des Transkriptions-Aktivator-Proteins in ausreichende Nähe gebracht, um Transkription eines Reporter-Gens zu bewirken. Zusätzlich zu dem LexA-Interaktions-Einfangen, beschrieben in den Beispielen unten, umfasst eine noch andere veranschaulichende Ausführungsform Saccharomyces cerevisiae YPB2-Zellen, gleichzeitig transformiert mit einem Plasmid, codierend eine GAL4db-FKBP-Fusion (db: DNA-Bindungs-Domäne), und mit einem Plasmid, codierend die GAL4-Aktivierungs-Domäne (GAL4ad), fusioniert an ein erfindungsgemäßen RAP-BP. Darüber hinaus wird der Stamm so transformiert, dass der GAL4-ansprechende Promotor die Expression eines phänotypischen Markers steuert. Zum Beispiel kann die Fähigkeit, in der Abwesenheit von Histidin zu wachsen, abhängig sein von der Expression des HIS3-Gens. Wenn das HIS3-Gen unter die Kontrolle eines GAL4-ansprechenden Promotors gesetzt wird, weist Ablösung von diesem auxotrophen Phänotyp darauf hin, dass ein funktioneller GAL4-Aktivator durch die Arzneistoff-abhängige Interaktion von FKBP und dem RAP-BP wiederhergestellt wurde. Daher werden Stoffe, die fähig sind, RAP-BP-Interaktion mit einem FKBP zu fördern, in Hefe-Zellen resultieren, die fähig sind, in der Abwesenheit von Histidin zu wachsen. Kommerzielle Kits, die modifiziert werden können, um Zwei-Hybridtests mit den erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteinen zu entwickeln, sind derzeit erhältlich (z. B. MATCHMAKER Kit, ClonTech Katalog-Nummer K1605-1, Palo Alto, CA).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können Tests, die die erfindungsgemäße Säuger-RAP-Bindungsproteine anwenden, verwendet werden, um Rapamycin-Mimetika zu identifizieren, die therapeutische Indices haben, die günstiger sind als Rapamycin. Zum Beispiel können Rapamycin-ähnliche Arzneistoffe durch die vorliegende Erfindung identifiziert werden, die verstärkte Gewebe-Typ- oder Zell-Typ-Spezifität im Vergleich zu Rapamycin aufweisen. Um das zu veranschaulichen, können die erfindungsgemäßen Tests verwendet werden, um Verbindungen herzustellen, die vorzugsweise IL-2-vermittelte Proliferation/Aktivierung von Lymphocyten inhibieren, ohne andere Geweben, z. B. Hepatocyten, wesentlich zu beeinflussen. In ähnlicher Weise können ähnliche Tests verwendet werden, um Rapamycin-ähnliche Arzneistoffe zu identifizieren, die die Proliferation von Hefe-Zellen oder anderen niedrigeren Eukaryonten inhibieren, aber die einen wesentlich reduzierten Effekt auf Säuger-Zellen haben und dadurch den therapeutischen Index des Arzneistoffes als einen anti-mykotischen Stoff in Verhältnis zu Rapamycin verbessern.
  • Die Identifizierung von solchen Verbindungen wird durch die Verwendung von differentiellen-Durchmusterungstests möglich gemacht, die Arzneistoff-vermittelte Bildung von zwei oder mehreren unterschiedlichen Typen von FKBP/RAP-BP-Komplexen nachweisen und vergleichen. Um das zu veranschaulichen, kann der Test für Seite-an-Seite-Vergleich des Effekts einer Test-Verbindung auf die Bildung von Gewebe-Typ-spezifischen FKBP/RAPT1-Komplexen gestaltet werden. Wenn die Diversität von FKBPs und die wesentliche Wahrscheinlichkeit als gegeben angesehen wird, dass RAPT1 ein einzelnes Mitglied einer größeren Familie von verwandten Proteinen darstellt, ist es wahrscheinlich, dass unterschiedliche funktionelle FKBP/RAPT1-Komplexe existieren und unter bestimmten Umständen in bestimmten Gewebe- oder Zell-Typen lokalisiert sind. Wie in der PCT Publikation WO93/23548 mit dem Titel ,Methods of Detecting Tissue-specific FK506 Binding Protein Messenger RNAs and Uses Thereof" beschrieben, kann die Gewebe-Verteilung von FKBPs von einer Spezies des Proteins zur nächsten variieren. Daher können Test-Verbindungen auf Stoffe durchmustert werden, die fähig sind, gewebespezifische Bildung von nur eines Untersatzes des möglichen Repertoires von FKBP/RAPT1-Komplexen zu vermitteln. In einer beispielhaften Ausführungsform kann ein Interaktions-Einfangtest unter Verwendung von zwei oder mehreren unterschiedlichen Köder-Proteinen abgeleitet werden, z. B. FKBP12 (SEQ ID Nos. 5 und 6), FKBP25 (GenBank-Zulassung M90309) oder FKBP52 (GenBank-Zulassung M88279), während das Fisch-Protein konstant ist in allen Konstrukten, z. B. einem menschlichen RAPT1-Konstrukt. Durchführung der ITS Seite-an-Seite ermöglicht den Nachweis von Stoffen, die einen größeren Effekt (z. B. statistisch signifikant) auf die Bildung von einem der FKBP/RAPT1-Komplexe als auf die Bildung von den anderen FKBP-Komplexen haben.
  • In ähnlicher Weise können differentielle Durchmusterungstests verwendet werden, um den Unterschied in Arzneistoff-vermittelter Bildung von Säuger-FKBP/RAP-BP-Komplexen und Hefe-FKBP/TOR-Komplexen auszunützen, um Stoffe zu identifizieren, die einen statistisch signifikanten Anstieg der Spezifität für die Hefe-Komplexe im Verhältnis zu den Säuger-Komplexen zeigen. Daher können führende Verbindungen entwickelt werden, die spezifisch auf Pathogene wie Pilze, die an mykotischen Infektionen beteiligt sind, wirken. Veranschaulichend, können die vorliegenden Tests verwendet werden, um auf Stoffe zu durchmustern, die letztendlich nützlich sein können für die Inhibition von mindestens einem Pilz, der an solchen Mykosen wie Candidiasis, Aspergillose, Mukormykose, Blastomykose, Geotrichose, Cryptokokkose, Chromoblastomykose, Kokkidioidomykose, Konidiosporose, Histoplasmose, Maduromykose, Rhinosporidose, Nocaidiose, Para-Actinomykose, Penicilliose, Monoliasis oder Sporotrichose beteiligt ist. Zum Beispiel, wenn die mykotische Infektion, gegen die eine Behandlung erwünscht ist, Candidiasis ist, kann der vorliegende Test den Vergleich der relativen Wirksamkeit einer Test-Verbindung auf Vermittlung der Bildung eines Säuger-FKBP/RAPT1-Komplexes mit seiner Wirksamkeit gegen Vermittlung solcher Komplexe umfassen, die von aus Hefe clonierten Genen gebildet werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Candida albicans, Candida stellatoidea, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida pseudotropicalis, Candida quillermondii oder Candida rugosa. In ähnlicher Weise kann der vorliegende Test verwendet werden, um antifungale Stoffe zu identifizieren, die therapeutischen Wert in der Behandlung von Aspergillose durch Nutzbarmachen der erfindungsgemäßen Arzneistoff-abhängigen Interaktions-Einfangtests haben können, die abstammen von FKBP- und TOR-Genen, cloniert von Hefe wie Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans oder Aspergillus terreus. Wo die mykotische Infektion eine Mucormykose ist, können die Komplexe abstammen von Hefe wie Rhizopus arrhizus, Rhizopus oryzae, Absidia corymbifera, Absidia ramosa oder Mucor pusillus. Quellen für andere Rapamycin-abhängige Komplexe zum Vergleich mit einem Säuger-FKBP/RAPT1-Komplex schließen das Pathogen Pneumocystis carinii ein. Beispielhafte FK506-Bindungsproteine von menschlichen Pathogenen und anderen niedrigeren Eukaryonten werden zum Beispiel geliefert durch GenBank Zulassungs-Nummern: M84759 (Candida albicans); U01195, U01198, U01197, U01193, U01188, U01194, U01199 (Neisseria spp.); und M98428 (Streptomyces chrysomallus).
  • Der differenzielle Durchmusterungstest kann hergestellt werden unter Verwendung von mindestens der Rapamycin-Bindungs-Domäne des Candida albicans-RAPT1-Proteins (siehe Beispiel 11) und eines Candida-FK506-Bindungsproteins (wie RBP1, GenBank Nr. M84759, siehe auch Ferrara et al. (1992) Gene 113: 125–127) oder eines Hefe-FK506-Bindungsproteins (siehe Beispiel 8 und 3). Vergleich der Bildung von menschlichen RAPT1-Komplexen und Candida-RAPT1-Komplexen liefert ein Mittel zur Identifizierung von Stoffen, die selektiver sind für die Bildung von caRAPT1-Komplexen und dementsprechend wahrscheinlich spezifischer sind als anti-mykotische Stoffe relativ zu Rapamycin.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft transgene Tiere, die aus Zellen (von diesem Tier) bestehen, die ein Transgen der vorliegenden Erfindung enthalten und die vorzugsweise (aber wahlweise) ein exogenes RAP-Bindungsprotein in einer oder mehreren Zellen in dem Tier exprimieren. Das RAP-BP-Transgen kann die Wildtyp-Form des Proteins codieren oder kann Homologe davon, einschließlich sowohl Agonisten als auch Antagonisten, so wie Antisense-Konstrukte codieren, die gestaltet sind, um Expression des endogenen Gens zu inhibieren. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Expression des Transgens auf bestimmte Untergruppen von Zellen, Geweben oder Entwicklungs-Stadien durch zum Beispiel der Verwendung von cis-wirkenden Sequenzen beschränkt, die die Expression in dem gewünschten Muster kontrollieren. In der vorliegenden Erfindung kann solch eine Mosaik-Expression der erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteine essenziell sein für viele Formen von Abstammungs-Analyse und kann zusätzlich ein Mittel zur Bewertung der Effekte von Verlust-der-Funktion-Mutationen liefern, wobei dieses Defizit die Entwicklung in kleinen Stücken von Gewebe in einem sonst normalen Embryo gravierend verändern könnte. In dieser Richtung können Gewebespezifische regulierende Sequenzen und bedingte regulierende Sequenzen verwendet werden, um Expression des Transgens in bestimmten räumlichen Mustern zu kontrollieren. Darüber hinaus können zeitliche Muster von Expression durch zum Beispiel bedingte Rekombinations-Systeme oder prokaryontische Transkriptionsregulations-Sequenzen geliefert werden.
  • Genetische Verfahren, die die Expression von Transgenen ermöglichen, können durch die Orts-spezifische genetische Manipulation in vivo reguliert werden, die Fachleuten bekannt ist. Zum Beispiel sind genetische Systeme erhältlich, die regulierte Expression einer Rekombinase ermöglichen, die die genetische Rekombination einer Zielsequenz katalysiert. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck ,Zielsequenz' eine Nucleotidsequenz, die genetisch durch eine Rekombinase rekombiniert wird. Die Zielsequenz ist flankiert von Rekombinase-Erkennungs-Sequenzen und ist im allgemeinen in Zellen, die Rekombinase-Aktivität exprimieren, entweder herausgeschnitten oder invertiert. Rekombinase katalysierte Rekombinations-Vorgänge können so gestaltet werden, dass Rekombination der Zielsequenz in entweder der Aktivierung oder Repression von Expression eines erfindungsgemäßen RAP-Bindungsproteins resultiert. Zum Beispiel kann Exzision einer Zielsequenz, die die Expression eines rekombinanten RAP-BP-Gens beeinflusst, so gestaltet werden, um die Expression dieses Gens zu aktivieren. Diese Beeinflussung der Expression des Proteins kann aus einer Vielzahl von Mechanismen resultieren, wie örtliche Separation des Gens von einem Promotor-Element oder ein internes Stopp-Codon. Darüber hinaus kann das Transgen gemacht werden, worin die codierende Sequenz des Gens durch Rekombinase-Erkennungs-Sequenzen flankiert ist, und es wird zunächst in Zellen in einer 3'-zu 5'-Orientierung in Bezug auf das Promotor-Element transfiziert. In solch einem Fall wird Inversion der Zielsequenz das erfindungsgemäße Gen durch Platzierung des 5'-Endes der codierenden Sequenz in einer Orientierung in Bezug auf das Promotor-Element umorientieren, was Promotor-gesteuerte Transkriptions-Aktivierung ermöglicht.
  • Zum Beispiel können entweder das cre/loxP-Rekombinase-System von Bakteriophage P1 (Lasko et al. (1992) PNAS 89: 6232–6236; Orban et al. (1992) PNAS 89: 6861–6865) oder das FLP-Rekombinase-System von Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al. (1991) Science 251: 1351–1355; PCT Publikation WO 92/15694) verwendet werden, um in vivo Orts-spezifische genetische Rekombinations-Systeme herzustellen. Cre-Rekombinase katalysiert die Orts-spezifische Rekombination einer dazwischen liegenden Zielsequenz, die sich zwischen loxP-Sequenzen befindet. loxP-Sequenzen sind 34-Basenpaar-Nucleotid-Wiederholungs-Sequenzen, an die die Cre-Rekombinase bindet und die nötig sind für Cre-Rekombinase-vermittelte genetische Rekombination. Die Orientierung der loxP-Sequenzen bestimmt, ob die dazwischen liegende Zielsequenz ausgeschnitten oder invertiert wird, wenn Cre-Rekombinase anwesend ist (Abremski et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 1509–1514); Es erfolgt Katalyse der Exzision der Zielsequenz, wenn die loxP-Sequenzen orientiert sind wie direkte Wiederholungen, und Katalyse der Inversion der Zielsequenz, wenn loxP-Sequenzen orientiert sind wie invertierte Wiederholungen.
  • Dementsprechend ist genetische Rekombination der Zielsequenz abhängig von Expression der Cre-Rekombinase. Expression der Rekombinase kann durch Promotor-Elemente reguliert werden, die regulatorischer Kontrolle unterliegen, z. B. Gewebe-spezifisch, Entwicklungsstadium-spezifisch, induzierbar oder unterdrückbar durch extern zugefügte Stoffe. Diese regulierte Kontrolle wird in genetischer Rekombination der Zielsequenz nur in Zellen, wo Rekombinase-Expression durch das Promotor-Element vermittelt wird, resultieren. Daher kann die Aktivierungs-Expression eines RAP-Bindungsproteins durch Regulierung von Rekombinase-Expression reguliert werden.
  • Verwendung des cre/loxP-Rekombinase-Systems, um Expression eines rekombinanten RAP-Bindungsproteins wie RAPT1 oder rapUBC zu regulieren, benötigt die Bildung eines transgenen Tieres, enthaltend Transgene, die sowohl die Cre-Rekombinase als auch das erfindungsgemäße Protein codieren. Tiere, die sowohl die Cre-Rekombinase als auch die rekombinanten RAP-BP-Gene enthalten, können durch die Bildung von ,doppelt' transgenen Tieren geliefert werden. Ein praktisches Verfahren zum Bereitstellen solcher Tiere ist, zwei transgene Tiere zu verpaaren, wo jedes ein Transgen enthält, z. B. das RAP-BP-Gen in einem Tier und Rekombinase-Gen in dem anderen.
  • Ein Vorteil, abgeleitet aus anfänglicher Bildung von transgenen Tieren, enthaltend eine Transgen in einem Rekombinase-vermittelten, exprimierbaren Format, stammt von der Wahrscheinlichkeit, dass das erfindungsgemäße Protein bei Expression in dem transgenen Tier schädlich sein wird. In solch einem Fall kann eine Gründer-Population, in der das erfindungsgemäße Transgen still ist in allen Geweben, vermehrt und erhalten werden. Individuen dieser Gründer-Population können mit Tieren gekreuzt werden, die Rekombianse zum Beispiel in einem oder mehreren Geweben exprimieren. Daher wird die Bildung einer Gründer-Population, in der zum Beispiel ein antagonistisches RAP-BP-Transgen still ist, die Untersuchung von Nachkommen dieses Gründers ermöglichen, in dem Zerstörung von Zell-Zyklus-Regulierung in einem bestimmten Gewebe oder in bestimmten Entwicklungsphasen in zum Beispiel einem letalen Phänotyp resultieren würde.
  • Ähnliche bedingte Transgene können unter Verwendung von prokaryontischen Promotor-Sequenzen geliefert werden, die prokaryontische Proteine benötigen, um gleichzeitig exprimiert zu werden, um die Expression des Transgens zu ermöglichen. Beispielhafte Pomotoren und die entsprechenden trans-aktivierenden prokaryontischen Proteine sind gegeben in US-Patent Nr. 4,833,080. Darüber hinaus kann Expression der bedingten Transgene durch Gen-Therapie-ähnliche Verfahren induziert werden, worin ein Gen, codierend das trans-aktivierende Protein, z. B. eine Rekombinase oder ein prokaryontisches Protein, an das Gewebe verabreicht wird und seine Expression unter Verwendung von zum Beispiel eines der oben beschriebenen Gen-Therapie-Konstrukte bewirkt wird. Durch dieses Verfahren könnte das RAP-BP-Transgen bis ins Erwachsenenalter still bleiben und seine Expression durch das Einbringen des Trans-Aktivators ,angeschaltet' werden.
  • Als ein Beispiel werden die ,transgenen nicht-menschlichen Tiere' durch Einbringen der Transgene in die Keimbahn des nicht-menschlichen Tieres hergestellt. Embryonale Zielzellen in verschiedenen Entwicklungsstadien können verwendet werden, um Transgene einzubringen. Unterschiedliche Verfahren werden verwendet, abhängig von dem Entwicklungsstadium der embryonalen Zielzelle. Die Zygote ist das beste Ziel für Mikroinjektion. In der Maus erreicht der männliche Vorkern die Größe von ungefähr 20 Mikrometern im Durchmesser, was wiederholbare Injektionen von 1–2 pl einer DNA-Lösung ermöglicht. Die Verwendung von Zygoten als ein Ziel für Gentransfer hat einen wesentlichen Vorteil, da in den meisten Fällen die injizierte DNA in das Wirts-Gen vor der ersten Teilung inkorporiert wird (Brinster et al. (1985) PNAS 82: 4438–4442). Als eine Konsequenz davon, werden alle Zellen des transgenen nicht-menschlichen Tieres das inkorporierte Transgen tragen. Das wird sich im allgemeinen auch in der effektiven Weitergabe des Transgens an Nachkommen des Gründers widerspiegeln, da 50% der Keimzellen das Transgen beherbergen werden. Mikroinjektion von Zygoten ist das bevorzugte Verfahren zur Inkorporierung von Transgenen in der Ausübung der Erfindung.
  • Retrovirale Infektion kann auch verwendet werden, um ein RAP-BP-Transgen in ein nicht-menschliches Tier einzubringen. Der sich entwickelnde nicht-menschliche Embryo kann in vitro bis zum Blastocysten-Stadium gezüchtet werden. Während dieser Zeit können die Blastomeren Ziele für retrovirale Infektion sein (Jaenich, R. (1976) PNAS 73: 1260–1264). Effiziente Infektion der Blastomeren wird durch enzymatische Behandlung erzielt, um die Zona pellucida zu entfernen (Manipulating the Mouse Embryo, Hogan Hrsg. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986). Das virale Vektor-System, das verwendet wird, um das Transgen einzubringen, ist typischerweise ein Replikations-defizientes Retrovirus, das das Transgen trägt (Jahner et al. (1985) PNAS 82: 6927–6931; Van der Putten et al. (1985) PNAS 82: 6148–6152). Transfektion wird einfach und effizient durch Züchtung der Blastomeren auf einer einzelligen Schickt von Virus-produzierenden Zellen erzielt (Van der Putten, supra; Steward et al. (1987) EMBO J. 6: 383–388). Alternativ kann die Infektion in einem späteren Stadium durchgeführt werden. Virus oder Virus-produzierende Zellen können in das Blastocoel injiziert werden (Jahner et al. (1982) Nature 298: 623–628). Die meisten der Gründer werden Mosaike sein im Bezug auf das Transgen, da Inkorporierung nur in einer Untergruppe der Zellen erfolgt, die das transgene nicht-menschliche Tier bildeten. Ferner kann der Gründer verschiedene retrovirale Insertionen des Transgens an unterschiedlichen Positionen des Genomes enthalten, die allgemein in dem Nachkommen segregiert werden. Zusätzlich ist es auch möglich, Transgene in die Keimbahn durch intrauterine retrovirale Infektion des Embryos in der Mitte der Trächtigkeit einzubringen (Jahner et al. (1982) supra).
  • Eine dritte Art einer Zielzelle für Transgen-Einbringung ist die embryonale Stammzelle (ES). ES-Zellen werden von prä-Implantations-Embryonen erhalten, die in vitro gezüchtet und mit Embryonen fusioniert werden (Evans et al. (1981) Nature 292: 154–156; Bradley et al. (1984) Nature 309: 255–258; Gossler et al. (1986) PNAS 83: 9065–9069; und Robertson et al. (1986) Nature 322: 445–448). Transgene können effizient in die ES-Zellen durch DNA-Transfektion oder durch Retrovirus-vermittelte Transduktion eingebracht werden. Solche transformierten ES-Zellen können danach mit Blastocysten eines nicht-menschlichen Tieres kombiniert werden. Die ES-Zellen besiedeln danach den Embryo und tragen zu der Keimbahn des resultierenden chimären Tieres bei. Zur Literaturübersicht siehe Jaenisch, R. (1988) Science 240: 1468–1474.
  • Verfahren zur Erzeugung von transgenen Knock-out-Tieren oder Tieren mit Genunterbrechung sind auch allgemein bekannt. Siehe zum Beispiel Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Rekombinase-abhängige Knock-outs können auch hergestellt werden, z. B. durch homologe Rekombination, um Rekombinase-Zielsequenzen einzubringen, so dass Gewebe-spezifische und/oder zeitliche Kontrolle der Inaktivierung eines RAP-BP-Gens wie oben kontrolliert werden können.
  • Hierin ist auch ein neues in vivo-Verfahren zur Isolierung von Genen beschrieben, die Proteine codieren, die physikalisch mit einem ,Köder'-Protein/Arzneistoff-Komplex interagieren. Das Verfahren ist angewiesen auf Nachweis der Rekonstitution eines Transkriptions-Aktivators in der Anwesenheit des Arzneistoffes, besonders wenn der Arzneistoff ein kleines, organisches nicht-Peptidyl-Molekül ist (z. B. < 2500K), z. B. ein Makrolid, z. B. Rapamycin, FK506 oder Cyclosporin. Im speziellen nützt das Verfahren chimäre Gene, die Hybrid-Proteine exprimieren. Das erste Hybrid umfasst die DNA-bindende Domäne eines Transkriptions-Aktivators, fusioniert an das Köder-Protein. Das zweite Hybrid-Proteine enthält eine Transkriptions-Aktivierungs-Domäne, fusioniert an ein ,Fisch'-Protein, z. B. ein Test-Protein, abgeleitet von einer cDNA-Genbank. Wenn die Fisch- und Köder-Proteine fähig sind, in einer Arzneistoff-abhängigen Weise zu interagieren, bringen sie die zwei Domänen des Transkriptions-Aktivators in enge Nähe. Diese Nähe ist ausreichend, um Transkription eines Reporter-Gens zu bewirken, das funktionell verknüpft ist mit einer Transkriptionsregulations-Stelle, die auf den Transkriptions-Aktivator reagiert, und die Expression des Marker-Gens kann nachgewiesen und verwendet werden, um die Interaktion des Köder-Protein/Arzneistoff-Komplexes mit einem anderen Protein zu bewerten.
  • Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass eine Vielzahl von Proteinen gleichzeitig getestet werden kann, um festzustellen, ob irgendeines mit dem Arzneistoff/Protein-Komplex interagiert. Zum Beispiel kann ein DNA-Fragment, codierend die DNA-Bindungs-Domäne, an ein DNA-Fragment fusioniert werden, das das Köder-Protein codiert, um ein Hybrid zu liefern. Dieses Hybrid wird in die Zellen eingebracht, die das Marker-Gen tragen, und die Zellen werden mit einem Arzneistoff in Kontakt gebracht, von dem bekannt ist, dass er das Köder-Protein bindet. Für das zweite Hybrid kann eine Genbank von Plasmiden gebildet werden, die zum Beispiel komplette Säuger-Komplementär-DNA (cDNA) enthalten kann, fusioniert an die DNA-Sequenz, die die Aktivierungs-Domäne codiert. Diese Genbank wird in die Zellen eingebracht, die das erste Hybrid tragen. Wenn irgendein individuelles Plasmid aus der Test-Genbank ein Protein codiert, das fähig ist zur Interaktion mit dem Arzneistoff/Protein-Komplex, kann ein positives Signal durch Nachweis der Expression des Reporter-Gens erhalten werden. Zusätzlich, wenn die Interaktion zwischen dem Arzneistoff-Komplex und einem neuen Protein auftritt, ist das Gen für das neu-identifizierte Protein einfach erhältlich.
  • Wie hierin veranschaulicht, ist das vorliegende Interaktions-Einfang-System ein wertvolles Mittel für die Identifizierung von neuen Genen, codierend Proteine, die an einem Punkt in einem gegebenen Signal-Transduktions-Signalweg wirken, der direkt vorgeschaltet oder nachgeschaltet von einem bestimmten Protein/Arzneistoff-Komplex ist. Zum Beispiel kann der erfindungsgemäße Test verwendet werden, um die unmittelbar nachgeschalteten Ziele eines FKBP/Rapamycin-Komplexes oder eines FKBP/FK506-Komplexes oder eines Cyclophilin/Cyclosporin-Komplexes zu identifizieren. Proteine, die in einer Arzneistoff-abhängigen Weise mit einem von solchen Komplexen interagieren, können identifiziert werden, und diese Proteine können von sowohl diagnostischem als auch therapeutischem Wert sein.
  • Ein erstes chimäres Gen wird geliefert, das fähig ist, in der Wirts-Zelle exprimiert zu werden, vorzugsweise eine Hefe-Zelle, mehr bevorzugt Saccharomyces cerevisiae oder Schizosaccharomyces pombe. Die Wirts-Zelle enthält ein nachweisbares Gen, das eine Bindungs-Stelle für die DNA-Bindungs-Domäne des Transkriptions-Aktivators aufweist, so dass das Gen ein Marker-Protein exprimiert, wenn das Marker-Gen transkriptionell aktiviert wird. Eine solche Aktivierung erfolgt, wenn die Transkriptions-Aktivierungs-Domäne eines Transkriptions-Aktivators in ausreichende Nähe zu der DNA-Bindungs-Domäne des Transkriptions-Aktivators gebracht wird. Das erste chimäre Gen kann in einem Chromosom der Wirts-Zelle vorhanden sein. Das Gen codiert ein chimäres Protein, das eine DNA-Bindungs-Domäne umfasst, die die Bindungs-Stelle auf dem Marker-Gen in der Wirts-Zelle erkennt, und ein Köder-Protein, das auf Arzneistoff-vermittelte Interaktion mit einem zweiten Test-Protein oder -Protein-Fragment getestet werden soll.
  • Ein zweites chimäres Gen wird geliefert, das fähig ist, in der Wirts-Zelle exprimiert zu werden. In einer Ausführungsform werden sowohl die ersten als auch zweiten chimären Gene in die Wirts-Zelle in der Form von Plasmiden eingebracht. Vorzugsweise ist jedoch das erste chimäre Gen in einem Chromosom der Wirts-Zelle vorhanden, und das zweite chimäre Gen wird in die Ziel-Zelle als Teil eines Plasmids eingebracht. Das zweite chimäre Gen enthält eine DNA-Sequenz, die ein zweites Hybrid-Protein codiert. Das zweite Hybrid-Protein enthält eine Transkriptions-Aktivierungs-Domäne. Das zweite Hybrid-Protein enthält auch ein zweites Test-Protein oder ein -Protein-Fragment, das auf Interaktion mit dem ersten Test-Protein oder -Protein-Fragment gestestet werden soll. Vorzugsweise stammen die DNA-Bindungs-Domäne des ersten Hybrid-Proteins und die Transkriptions-Aktivierungs-Domäne des zweiten Hybrid-Proteins von Transkriptions-Aktivatoren ab, die separate DNA-Bindungs- und Transkriptions-Aktivierungs-Domänen aufweisen. Von diesen separaten DNA-Bindungs- und Transkriptions-Aktivierungs-Domänen ist auch bekannt, dass sie in dem Hefe-GAL4-Protein gefunden werden, und es ist auch bekannt, dass sie in den Hefe-GCN4- und -ADR1-Proteinen gefunden werden. Viele andere Proteine, involviert in Transkription, haben auch trennbare Bindungs- und Transkriptions-Aktivierungs-Domänen, was sie nützlich für die vorliegende Erfindung macht. In einer anderen Ausführungsform können die DNA-Bindungs-Domäne und die Transkriptions-Aktivierungs-Domäne von unterschiedlichen Transkriptions-Aktivatoren stammen. Das zweite Hybrid-Protein wird vorzugsweise von einer Genbank von Plasmiden codiert, die genomische, cDNA oder synthetisch hergestellte DNA-Sequenzen, fusioniert an die DNA-Sequenz, die die Transkriptions-Aktivierungs-Domäne codiert, enthält.
  • Die Arzneistoff-vermittelte Interaktion zwischen dem ersten Test-Protein und dem zweiten Test-Protein in der Wirts-Zelle bewirkt daher, dass die Transkriptions-Aktivierungs-Domäne die Transkription des nachweisbaren Gens aktiviert. Das Verfahren wird durch Einbringen des ersten chimären Gens und des zweiten chimären Gens in die Wirts-Zelle, und Inkontaktbringen der Zelle mit dem Arzneistoff von Interesse durchgeführt. Die Wirts-Zelle wird Bedingungen unterworfen, unter denen das erste Hybrid-Protein und das zweite Hybrid-Protein in ausreichender Menge für das nachweisbare Gen exprimiert werden, um aktiviert zu werden. Die Zellen werden dann auf Arzneistoff-abhängige Expression des nachweisbaren Gens getestet.
  • Daher können Interaktionen zwischen einem ersten Test-Protein und einer Genbank von Proteinen in der Anwesenheit des Arzneistoffes von Interesse getestet werden, um festzustellen, welche Mitglieder der Genbank involviert sind in die Bildung von Arzneistoff-abhängigen Komplexen zwischen dem ersten und zweiten Protein. Zum Beispiel kann das Köder-Protein ein Protein sein, das FK506, Rapamycin oder Cyclosporin bindet, z. B. kann es ein FKBP oder Cyclophilin sein. Das zweite Test-Protein kann aus einer cDNA-Genbank abgeleitet werden.
  • Erläuterung
  • Da die Erfindung jetzt allgemein beschrieben wurde, wird sie einfacher verstanden werden durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die lediglich eingeschlossen sind, zum Zweck der Veranschaulichung bestimmter Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, und nicht gedacht sind, die Erfindung zu limitieren.
  • Beispiel 1
  • Bildung des Köder-Plasmids für die 2-Hybrid-Durchmusterung
  • A. LexA-FKBP12-Köder
  • Die Köder-Protein- und Fisch-Protein-Konstrukte, die in dem vorliegenden Arzneistoff-abhängigen Interaktions-Einfangverfahren verwendet werden, sind im wesentlichen die gleichen wie Konstrukte, die für andere 2-Hybridtest verwendet werden (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223–232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268: 12046–12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920–924; und Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693–1696). Unter Verwendung der folgenden Oligonucleotide: Codierender Strang
    Figure 00790001
    Nicht-codierender Strang
    Figure 00790002
    wurde PCR-Amplifikation aus einer Lymphocyten-cDNA-Genbank durchgeführt, um die codierende Sequenz für das FKBP12-Protein zu isolieren. Die Sequenz des clonierten menschlichen FKBP12 wurde bestätigt als:
  • Figure 00790003
  • Das resultierende PCR-Produkt, enthaltend die menschlichen FKBP12-codierenden Sequenzen, wurde dann mit EcoRI und BamHI verdaut und in die EcoRI + BamHI-Stellen von pBTM116 cloniert, bildend eine in-Rahmen-Fusion zwischen LexA und FKBP12. Das resultierende Plasmid wird unten als plC504 bezeichnet.
  • B. LexA-(gly)6-FKBP12-Köder
  • Um eine in-Rahmen-Fusion zwischen LexA und FKBP12 herzustellen, getrennt durch sechs Glycin-Reste, wurde die codierende Sequenz von menschlichem FKBP12 durch PCR wie oben cloniert, mit der Ausnahme, dass das Sense-Oligonucleotid zusätzliche 18 Nucleotide lieferte, die 6 Glycine in den offenen Leserahmen des Fusionsproteins inserierten. Die für PCR verwendeten Oligos waren:
  • Codierender Strang
    Figure 00800001
  • Nicht-codierender Strang
    Figure 00800002
  • Das PCR-Produkt, enthaltend die menschlichen FKBP12-codierenden Sequenzen, wurde dann mit EcoRI und BamHI verdaut und in die EcoRI + BamHI-Stellen von pBTM116 wie oben cloniert. Das resultierende Plasmid wird unten als plC506 bezeichnet.
  • Beispiel 2
  • Bildung des FKBP12-Deletions-Stranges
  • Ein genomisches 1,8 kb-HindIII-EcoRI-Hefe-Fragment, enthaltend FKB1 (das S. Cerevisiae-Homolog von FKBP12), wurde in die HindIII- + EcoRI-Stellen von pSP72 (Promega) cloniert.
  • Eine Ein-Schritt-RCR-Strategie wurde verwendet, um eine präzise Deletion der codierenden FKB1-Sequenzen zu bilden, die sich von dem ATG-Start-Codon zu dem TAG-Stopp-Codon erstrecken. Gleichzeitig wurde eine einmalige BamHI-Stelle an Stelle von den codierenden FKB1-Sequenzen eingebracht. Die Oligos, die verwendet wurden, um die FKB1-Deletion und Einbringen der einmaligen BamHI-Stelle herzustellen, waren:
  • Figure 00800003
  • Das Hefe-ADE2-Gen auf einem 3,6-kb-BamHI-Fragment wurde dann in die einmalige BamHI-Stelle des oben beschriebenen Plasmids cloniert, um das Plasmid pVB172 herzustellen. Flankierend zu dem ADE2-Unterbrechungsmarker von pVB172 in der nichtcodierenden 5'- und 3'-Sequenz von FKB1 sind XhoI-Stellen. pVB172 wurde mit XhoI verdaut, um ein lineares Fragment, enthaltend ADE2, flankiert durch nicht-codierende FKB1-Sequenzen, freizugeben. Dieses lineare Fragment wurde verwendet, um Hefe-Stamm-L40 (Mat a his3 Δ200 trpl-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::lexAop)4-HIS3 URA3::(lexAop)8-lacZ GAL4 gal80) zu transformieren, selektierend auf Adenin-Prototrophy.
  • ADE+-Hefe-Transformanten wurden auf Rapamycin-Resistenz getestet, um zu bestätigen, dass das Wildtyp-FKB1-Allel durch ADE2 ersetzt wurde. Dieses Unterbrechungsallel von FKB1 wird als L40-fkb1-2 festgesetzt.
  • Beispiel 3
  • Clonierung von Säuger Rapamycin-Ziel-Genen
  • Wir haben das in Beispiel 1, oben, beschriebene Arzneistoff-abhängige Interaktions-Einfangverfahren mit den LexA-Bindungs-Domänen-Fusions-Konstrukten als Köder verwendet, um Interaktion mit Clonen von cDNA-Genbanken, enthaltend VP16-Aktivierungs-Domänen-Fusionen, nachzuweisen. Die Reporter, die als ,Anzeiger', die Interaktion in diesem System signalisieren, sind die S. cerevisiae-HIS3- und die E. coli-LacZ-Gene. Der Hefe-Stamm L40, das Köder-Vektor-Plasmid pBTM116 und die embryonale Maus-PCR-Genbank im Vektor pVP16 wurden verwendet, um die cDNA-Fusionsprotein-Genbank zu konstruieren.
  • Der oben in Beispiel 2 beschriebene Stamm L40-fkb1-2 wurde mit jedem der zwei Köder-Plasmide, plC504, codierend das LexA-FKBP12-Fusionsprotein, oder plC506, codierend das LexA-(gly)6-FKBP12-Fusionsprotein, transformiert. Die Transformanten, L40-fkb1-2plC504 (genannt ICY99) und L40-fkb1-2/plC506 (genannt ICY101) wurden in Hefe-Medium erhalten, dem Tryptophan fehlte, das auf Zellen selektiert, die das Köder-Plasmid enthalten.
  • Eine Maus-Embryo-PCR-Genbank in pVP16 (bezeichnet mit pSH10,5), die durch Standard-Protokolle unter Verwendung von zufallsgeprimter Synthese von CD1-polyA+-RNA von Maus-Embryo 10,5 Tage post-Koitum hergestellt und auf Inserts zwischen 350 bp und 700 bp Länge größenselektiert wurde, wurde verwendet, um das Hefe-ICY99 und -ICY101 zu transformieren. Die transformierten Hefe-Zellen wurden auf Medium, dem Tryptophan und Leucin fehlte, plattiert. Ungefähr 107 Transformanten von jedem Stamm wurden vereinigt, gründlich gemischt und in Aliquots in 50% Glycerin bei –80°C gefroren gelagert.
  • Vor der Durchmusterung wurden Zellen aufgetaut, für 5 Stunden in flüssigem Medium gezüchtet und auf selektives Medium plattiert. Ungefähr 1,5 × 107 ICY99/pSH10,5-Zellen wurden auf Phosphat-gepuffertes (pH-Wert 7), synthetisches Agar-Medium, enthaltend (i) alle Aminosäuren, außer Tryptophan, Leucin und Histidin, (ii) Rapamycin in 125 ng/ml, (iii) das chromogene Substrat X-Gal in 100 ng/ml und (iv) 2% Glucose als Kohlenstoff-Quelle, in einer Plattierungs-Dichte von ungefähr 106 pro 15-cm Platte ausplattiert. Ein identisches Protokoll wurde für die Durchmusterung von ICY101/pSH10,5-Transformanten verwendet, außer dass eine niedrigere Konzentration von Rapamycin von 15,6 ng/ml verwendet wurde.
  • Kolonien, die sowohl auf dem selektiven Medium wuchsen als auch blau waren, wurden für weitere Testung entnommen. Diese repräsentieren Zellen, die kein Histidin für Wachstum benötigen und die den β-Galactosidase-Reporter exprimieren. Kandidaten-Kolonien erschienen zwischen 4–11 Tage nach Plattierung, und die blaue Farbe reicht von sehr hellem Blau zu tiefblau. Sie wurden dann den folgenden Tests unterzogen.
  • i) Rapamycin-Abhängigkeit
  • Jeder Kandidat wurde auf Medium ausgestrichen, dem Histidin fehlte und das entweder 125 ng/ml (für ICY99/pSH10,5-Kandidaten) oder 15,6 ng/ml (für ICY101/pSH10,5-Kandidaten) Rapamycin oder kein Rapamycin (für beide) enthielt. Kandidaten-Clone, die in der Anwesenheit von Rapamycin wuchsen und die auf Medium ohne Rapamycin nicht wuchsen, wurden für den nächsten Test gewählt.
  • Für die ICY99/pSH10,5-Durchmusterung waren von 107 His+ und LacZ+ durchmusterten Kandidaten 24 Rapamycin-abhängig auf Wachstum in Medium, dem Histidin fehlte. Für die ICY101/pSH10,5-Durchmusterung waren 20 von 101 durchmusterten His+- und LacZ+-Kandidaten Rapamycin-abhängig.
  • ii) Plasmid-Bindung
  • Um falsch-Positive, verursacht durch chromosomale Mutationen, zu eliminieren, wurde jeder Kandidat in nicht-selektivem Medium (YPD) gezüchtet, um Verlust der Köder (Trp+)- und der cDNA (Leu+)-Plasmide zu ermöglichen. Zellen, die das Köder-Plasmid (Trp–), das cDNA-Plasmid (Leu–) oder beide Plasmide (Trp– und Leu–) verloren haben, so wie jene, die beide Plasmide beibehalten haben (Trp+ und Leu+), wurden auf Medium, enthaltend Rapamycin, aber dem Histidin fehlte, ausgestrichen. Jene Kandidaten, für die nur die Derivate, enthaltend beide Plasmide (Trp+ und Leu+), wuchsen, während die anderen drei Derivate es nicht taten, wurden für weitere Analyse gewählt.
  • Für die ICY99/pSH10,5-Durchmusterung durchliefen 23 von 24 den Test. Für die ICY101/pSH10,5-Durchmusterung durchliefen alle 20 den Test.
  • iii) Positive und negative Interaktion mit Kontroll-Ködern
  • Während sich in den vorhergehenden Tests die Frage stellte, ob die Interaktion verschwindet, wenn ein oder beide Mitglieder der Interaktion (Köder- und Fisch-Konstrukte) verloren gehen, stellt sich in dem vorliegenden Test die Frage, ob das Kandidaten-cDNA-Plasmid (Leu+) Interaktion verleihen kann, wenn es in Hefe-Stämme mit verschiedenen Ködern transformiert wird. DNA-Proben wurden von jedem Kandidaten erstellt und verwendet, um E. coli-Stamm B290 (auxotroph für Tryptophan und Leucin) zu transformieren. Da die Hefe-TRP1- beziehungsweise -LEU2-Gene die bakteriellen Auxotrophien ergänzen können, sind B290-Zellen, enthaltend das Köder-Plasmid, Trp+ und können auf Medium, dem Tryptophan fehlt, wachsen, während B290-Zellen, enthaltend das cDNA-Plasmid, Leu+ sind und auf Medium, dem Leucin fehlt, wachsen können. Plasmid-DNA-Proben enthielten jeweils einen unterschiedlichen Köder: i) ICY99, der ursprüngliche Stamm, der für die Durchmusterung verwendet wurde, enthaltend die LexA::FKBP12-Köder-Fusion; ii) ICY101, enthaltend die LexA::(gly)6::FKBP12-Köder-Fusion und iii) ICY102, enthaltend einen LexA-Fusions-Köder, der irrelevant ist für die vorliegende Untersuchung, und der als eine Negativ-Kontroll dient. Der ideale Kandidaten-Clon sollte His+ und LacZ+ an ICY99 und ICY101 in einer Rapamycin-abhängigen Weise verleihen, nicht aber an ICY102.
  • Für die ICY99/pSH10,5-Durchmusterung erfüllten 11 der 23 Kandidaten die obigen Kriterien. Für die ICY101/pSH10,5-Durchmusterung erfüllten 10 der 20 Kandidaten die obigen Kriterien.
  • Die cDNA-Inserte dieser Kandidaten-Clone wurden in beiden Strängen unter Verwendung des ABI-Fluoreszenz-Sequenzierungs-Systems sequenziert. Alle 11 Kandidaten der ICY99/pSH10,5-Durchmusterung und mindestens 4 der 10 Kandidaten der ICY101/pSH10,5-Durchmusterung enthalten überlappende Fragmente einer identischen Sequenz. Die 14 Clone repräsentieren mindestens 5 unabhängige Clonierungs-Vorgänge der Genbank, bewertet durch die Insert/Vektor-Grenzen jedes Clons. Die längsten und die kürzesten Inserts unterschieden sich durch ungefähr 70 bp am Amino-Terminus und etwa 10 bp am Amino-Terminus. Die Teil-Nucleotid-Sequenz und entsprechende Aminosäure-Sequenz, isoliert von dem Maus-Rapamycin/FKBP12-Bindungsprotein (RAPT1), ist in SEQ ID No: 1 beziehungsweise SEQ ID No: 2 angegeben.
  • Überraschenderweise enthüllte eine Suche der GenBank-Datenbank unter Verwendung des BLAST-Programmes, dass das Peptid, codiert durch die obige Sequenz, einige Homologie, obwohl weniger als 60% absolute Homologie, mit den S. cerevisiae-TOR1 (und DRR1)- und -TOR2-Genprodukten, die kürzlich aus Hefe isoliert wurden, teilt.
  • Beispiel 4
  • Clonierung von menschlichen Homologen von Rapamycin-Ziel-Genen
  • Nach der Isolierung einer Teil-Sequenz für das Gen, codierend ein Rapamycin-Ziel-Protein aus einer Maus-Genbank, fuhren wir fort, das menschliche Gen unter Verwendung der Maus-Sequenz als eine Sonde zu isolieren. Der Plasmid-Clon plC99.1.5, enthaltend das längste Insert des RAPT1-Clons, wurde als Sonde für Hybridisierung ausgewählt. Das Insert (500 bp) wurde von Plasmid-DNA durch Verdauung mit Not I-Restriktions-Endonuclease, gefolgt von Agarose-Gel-Elektrophorese und Fragment-Aufreinigung, abgetrennt. Das Fragment wurde mit αP32-markiertem dCTP durch zufällige Inkorporation mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase radioaktiv markiert. Die radioaktiv-markierte DNA-Sonde wurde weg von freien Nucleotiden durch eine G50-Säule isoliert, alkalidenaturiert und zu dem Hybridisierungs-Gemisch zu 2 × 106 CpM/ml hinzugefügt.
  • Ungefähr 3 × 106 Phagen einer menschlichen B-Zell-cDNA-Genbank in λ-pACT (1) wurden durch Filter-Hybridisierung unter Verwendung der oben beschriebenen Sonde in 30% Formamid, 5 × SSC, 5 × Denhardt, 20 μg/ml denaturierte Lachs-Sperma-DNA und 1% SDS bei 37°C durchmustert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter in 0,5 × SSC und 0,1% SDS bei 50°C gewaschen. Diese stellen Bedingungen einer Medium-Stringenz dar, die geeignet sind für Maus-zu-Mensch Kreuz-Spezies-Hybridisierungen. Eine Anzahl von positiven Plaques wurde erhalten, und einige wurden analysiert. Es stellte sich heraus, dass eine Anzahl der isolierten Clone verschiedene 3'-Fragmente des gleichen Gens oder sehr nahe-verwandte Gene waren, was nach Sequenzierungs-Analyse als menschliches RAPT1-Gen nachgewiesen wurde. Der Clon, enthaltend das längste codierende Sequenz-Fragment, umfassend was angenommen wurde, ungefähr die Hälfte des Voll-Längen-Proteins (C-Terminus) zu sein, und einschließend die FKBP/Rapamycin-Bindungsstelle und die mutmaßliche PI-Kinase-Aktivität, wird als Plasmid plC524 bezeichnet. Eine Hinterlegung der pACT-Plasmid-Form von plC524 wurde bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD) am 27. Mai, 1994 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags durchgeführt. ATCC-Zulassungs-Nummer 75787 wurde der Hinterlegung zugewiesen.
  • 1 ist eine Karte des menschlichen RAPT1-Clons von plC524 (inseriert an der XhoI-Stelle). Das Insert ist ungefähr 3,74 kb lang, und die Nucleotid-RAPT1-codierende Sequenz des Inserts wurde erhalten und ist dargestellt durch Nucleotid-Einheiten 4717–7746 von SEQ ID No. 11. Die entsprechende Aminosäure-Sequenz wird dargestellt durch Einheiten His1541-Trp2549 von SEQ ID No. 12. Die Region des menschlichen RAPT1-Clons, entsprechend dem Maus-RAPT1-Fragment, ist mehr als 95% homolog im Aminosäure-Bereich und 90% homolog im Nucleotid-Bereich. Zusätzlich zu dem plC524-Clon wurde eine weitere 5'-Sequenz des menschlichen RAPT1-Gens von anderen überlappenden Clonen erhalten, mit der zusätzlichen Sequenz des 3'-Endes des ~5,4 kb-Teil-Gens, gegeben in SEQ ID. No. 11. Darüber hinaus liefert SEQ ID No. 19 zusätzliche nicht-codierende 3'-Sequenz (erhalten von einem anderen Clon), die die RAPT1-codierende Sequenz flankiert.
  • Es wird offensichtlich sein für einen Fachmann, gegeben die vorliegende Sequenz-Information, dass PCR-Primer gestaltet werden können, um die gesamte oder bestimmte Fragmente der RAPT1-Gen-Sequenz, bereitgestellt in plC524, zu amplifizieren. Zum Beispiel entsprechen die Primer TGAAGATACCCCACCAAACCC (SEQ ID No: 21) und TGCACAGTTGAAGTGAAC (SEQ ID No. 22) pACT-Sequenzen, flankierend die XhoI-Stelle, und können verwendet werden, um die ganze RAPT1-Sequenz von plC524 durch PCR zu amplifizieren. Alternativ können Primer, basierend auf der Nucleinsäure-Sequenz von SEQ ID No. 11, verwendet werden, um Fragmente des RAPT1-Gens in plC524 zu amplifizieren. Die PCR-Primer können in der Folge in Expressions-Vektoren subcloniert werden, und verwendet werden, um rekombinante Formen des erfindungsgemäßen RAPT1-Proteins herzustellen. Daher liefert die vorliegende Erfindung rekombinante RAPT1-Proteine, codiert durch rekombinante Gene, umfassend RAPT1-Nucleotid-Sequenzen von ATCC-Hinterlegungs-Nummer 75787. Darüber hinaus ist es klar, dass einfach durch Bereitstellen von RCP-Primern, basierend auf den bekannten Sequenzen, Primer/Sonden erstellt werden können, die sogar jenen Teil von plC524 einschließen, der noch nicht sequenziert wurde.
  • Darüber hinaus weisen unsere vorläufigen Daten darauf hin, dass andere Proteine, die verwandt sind mit RAPT1, z. B. RAPT1-Homologe, auch durch den vorliegenden Test erhalten wurden, was nahe legt, dass RAPT1 ein Mitglied einer größeren Familie von verwandten Proteinen ist.
  • Vergleichendes Beispiel 5
  • Clonierung eines neuen menschlichen Ubiquitin-konjugierenden Enzyms
  • Konstrukte, ähnlich jenen, die oben beschrieben wurden, für den Arzneistoff-abhängigen Interaktions-Einfangtest wurden verwendet, um eine WI38 (gemischte G0- und sich teilende Fibroblasten)-cDNA-Genbank (Clonetech, Palo Alto CA) in pGADGH (XhoI-Insert, Clonetech) zu durchmustern. Kurz, der Zwei-Hybridtest wurde wie oben unter Verwendung von GAL4-Konstrukten an Stelle von LexA und in einer HF7C-Hefe-Zelle (Clonetech) durchgeführt, in der das FKB1-Gen unterbrochen worden war (siehe Beispiel 1). Von den isolierten Clonen wurde ein neues menschliches Ubiquitin-konjugierendes Enzym (rap-UBC) identifiziert. Eine Hinterlegung des pGADGH-Plasmids (Clon ,SMR4-15') wurde bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD) am 27. Mai, 1994 unter den Bedingungen des Budapester Vertrages durchgeführt. ATCC-Zulassungs-Nummer 75786 wurde der Hinterlegung zugeordnet. Das Insert ist ungefähr 1 kB.
  • Der Sequenz-UBC-codierende Teil des SMR4-15-Inserts wird durch SEQ ID No. 23 (Nucleotid) und SEQ ID No. 24 (Aminosäure) gegeben. Die Sequenz des 3'-Teiles des Clons wird durch SEQ ID No. 25 geliefert. Wie oben beschrieben, können Primer, basierend auf der Nucleinsäure-Sequenz von SEQ ID No. 23 (und 25) verwendet werden, um Fragmente des rap-UBC-Gens von SMR4-15 zu amplifizieren. Die PCR-Primer können in der Folge in Expressions-Vektoren subcloniert und verwendet werden, um rekombinante Formen des erfindungsgemäßen Enzyms herzustellen. Daher liefert die vorliegende Erfindung rekombinante rap-UBC-Proteine, codiert durch rekombinante Gene, umfassend rap-UBC-Nucleotid-Sequenzen von ATCC-Hinterlegungs-Nummer 75786.
  • Beispiel 6
  • Konstruktion der Serin-zu-Arginin-RAPT1-Mutation
  • Der kleinste mRAPT1-Clon, der mit dem FKBP12/Rapamycin-Komplex interagiert, war 399 bp, definierend eine Rapamycin-Bindungs-Domäne. Die RAPT1-Bindungs-Domäne entspricht mit einer Region in Hefe-TOR1/TOR2, unmittelbar sttromaufwärts lokalisiert, aber außerhalb der Lipid-Kinase-Konsensus-Sequenz. Diese Region enthält die Serin-Einheit, die, wenn in Hefe-TOR1 mutiert, Resistenz gegen Rapamycin überträgt (Cafferkey et al. (1993) Mol Cell Biol 13: 6012–6023). Sowohl eine Maus- als auch eine menschliche RAPT1-Serin-zu-Arginin-Mutation wurde durch Oligonucleotid-Mutagenese konstruiert. Im Falle der mRAPT1-Mutante waren codierende und nicht-codierende Strang-Oligonucleotide, die die Mutationen enthielten: GAAGAGGCAAGACGCTTGTAC (SEQ ID No: 26) und GTACAAGCGTCTTGCCTCTTC (SEQ ID No: 27). PCR-Reaktionen wurden durchgeführt unter Verwendung dieser Oligonucleotide in Kombination mit dem Oligonucleotid GAGTTTGAGCAGATGTTTA (SEQ ID No: 28) und dem M13-Universal-Primer, welche Sequenzen im pVP16-Vektor 5' beziehungsweise 3' des mRAPT1-Inserts sind. pVP16, enthaltend mRAPT1, wurde als die Matrize für PCR verwendet. Das PCR-Produkt, verdaut mit BamHI und EcoRI, wurde in die BamHI- und EcoRI-Stellen in pVP16 cloniert. Der resultierende Clon wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass der Clon die Serin-zu-Arginin-Mutation und keine anderen enthielt.
  • Der kleinste mRAPT1-Clon, der mit dem FKBP12/Rapamycin-Komplex interagiert, war 399 bp, definierend die RAPT1-Bindungs-Domäne. Die RAPT1-Bindungs-Domäne entspricht einer Region in Hefe-TOR, unmittelbar stromaufwärts lokalisiert, aber außerhalb der Lipid-Kinase-Konsensus-Sequenz. Diese Region enthält die Serin-Einheit, die, wenn mutiert in Hefe-TOR1 (auch DRR1 genannt), Resistenz gegen Rapamycin überträgt (Cafferkey et al. (1993) Mol. Cell Biol. 13: 6012–6023; Helliwell et al. (1994) Mol. Cell Biol. 5: 105–118). Die entsprechende Mutation wurde in mRAPT1 konstruiert. Die Serin-zu-Arginin-Mutation hebt die Interaktion von mRAPT1 mit dem FKBP12/Rapamycin-Komplex auf (siehe 3), wobei weder HIS3- noch lacZ-Expression beim Zwei-Hybridtest aktiviert wird, was darauf hinweist, dass das Serin an der Assoziation des FKBP12/Rapamycin-Komplexes mit mRAPT1 involviert ist.
  • Beispiel 7
  • Northern-Analyse
  • Northern-Blots für mehrere Gewebe (enthaltend 2 μg von menschlicher RNA pro Spur) wurden von Clonetech Labs., Inc. erhalten. Hybridisierungen waren bei 42°C in 5 × SSPE, 5 × Denhardt, 30% Formamid, 1% SDS und 200 μg/ml denaturierter Lachs-Sperma-DNA. Gewaschen wurde in 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C. Der Blot wurde 5 Tage vor der Autoradiographie exponiert. Die Mengen von RNA, die in jeder Spur aufgetragen waren, wurden unabhängig durch Hybridisierung der gleichen Blots mit einer menschlichen G3PDH-Sonde überwacht, und als ähnlich in allen Spuren befunden, mit der Ausnahme von Skelettmuskel, der ungefähr das 2–3fache Signal aufwies.
  • RAPT1 spezifiziert ein einzelnes Transkript von ungefähr 9 kb, das in allen untersuchten Geweben vorhanden ist, wobei sich die höchste Mengen in Hoden zeigten. Das Transkript ist ausreichend, um ein Protein zu codieren, das äquivalent zu der Größe von Hefe-TOR ist, das 284 kDa ist. Unter der Annahme, dass RAPT1 von ähnlicher Größe ist, wurde ein kleines Fragment von 133 Aminosäuren vom Inneren eines großen Proteins cloniert, wobei dieses Fragment jedoch ausreichend ist, um FKBP12/Rapamycin-Komplex zu binden.
  • Beispiel 8
  • Test mit hohen Durchgangszahlen, basierend auf dem Zwei-Hybrid-System für die Indentifizierung von neuen Rapamycin-Analogen
  • Um eine Durchmusterung mit hohen Durchgangszahlen, basierend auf dem Zwei-Hybrid-System, zu entwickeln, entwarfen wir einen Vorgang, um Protein-Protein-Interaktion, vermittelt durch ein kleines Molekül, zu quantifizieren. Da Protein-Protein-Interaktion in dem Zwei-Hybrid-System die Transkription des lacZ-Reporter-Gens stimuliert, wendet der Test ein Substrat von β-Galactosidase an (das lacZ-Gen-Produkt), das, wenn gespalten, ein chemiluminiszentes Signal produziert, das quantifiziert werden kann. Dieser Test kann in Mikrotiter-Platten durchgeführt werden, was ermöglicht, Tausende von Verbindungen pro Woche zu durchmustern. Der Test schießt die folgenden Schritte ein:
    • 1. Beimpfen von Hefe-Zellen einer einzelnen Kolonie in 50 ml synthetisches, komplettes Wachstums-Medium ohne Leucin und Tryptophan (Sherman, F. (1991) Methods Enzymol. 194: 3–20). Inkubieren der Flasche über Nacht bei 30°C mit Schütteln (200 UpM).
    • 2. Verdünnen der Übernacht-Kultur zu einer endgültigen A600 von 0,02 in Wachstums-Medium und Inkubieren über Nacht, wie in Schritt 1 beschrieben.
    • 3. Verdünnen der zweiten Übernacht-Kultur zu einer endgültigen A600 von 0,5 in Wachstums-Medium. Verwenden eines Quadra-96-Pipettors (TomTec, Inc.), Verteilen von 135 μl-Aliquots der Zell-Suspension in Vertiefungen einer Rund-Boden-Mikrotiter-Platte, die mit 15 μl/Vertiefung der zu testenden Verbindung in unterschiedlichen Konzentrationen vorbeladen wurde. (Die Verbindungen sind gelöst in 5% Dimethylsulfoxid, so dass die endgültige DMSO-Konzentration, die zu den Zellen hinzugefügt wird, 0,5% ist, was das Hefe-Zell-Wachstum nicht stört.) Bedecken der Mikrotiter-Platten und Inkubieren bei 30°C für 4 Std. mit Schütteln bei 300 UpM.
    • 4. Zentrifugieren der Mikrotiter-Platten für 10 min bei 2000 UpM. Entfernen des Überstands mit dem Quadra-96-Pipettor und Waschen mit 225 μl Phosphatgepufferter Salzlösung.
    • 5. Verteilen von 100 μl Lyse-Puffer (100 mM2 HPO4 pH-Wert 7,8; 0,2% Triton X-100; 1,0 mM Ditiothriotol) in jede Vertiefung, Bedecken und Inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur mit Schütteln bei 300 UpM.
    • 6. Verteilen von 50 μl des chemiluminiszenten Substrates, Galacton PlusTM (Tropix, Inc., Bedford, MA) in Verdünnungsmittel (100 mM Na2HPO4, 1 mM MgCl2, pH-Wert 8,0) in jede Vertiefung einer Microfluor-Platte (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA). Transferieren von 20 μl Zell-Lysat in diese Vertiefung und Inkubieren im Dunkeln für 60 min bei Raumtemperatur.
    • 7. Hinzufügen von 75 μl EmeralTM-Beschleunigungsmittel zu jeder Vertiefung. Bedecken der Platte und Zählen in einem Topcount-Scintillations-Zählgerät (Packard, Inc.) für 0,01 min/Vertiefung.
  • Die Rapamycin-Zielproteine, isoliert, wie oben beschrieben, wie auch eine Vielzahl von FKBPs wurden in den quantitativen Test einbezogen. Die FKBPs, die in die Durchmusterung eingeschlossen wurden, waren menschliches FKBP12 und das von pathogenen Pilzen, FKBP13 (Jin et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 6677) und FKBP25 (Jin et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 2942; Galat et al. (1992) Biochem. 31: 2427–2434). Hefe-Stämme, enthaltend unterschiedliche FKBP-Ziel-Paare, können gegen Genbanken von Rapamycin und FK506-Analoge getestet werden. Solch eine Durchmusterung kann unterschiedliche Klassen von Verbindungen ergeben, einschließlich (i) Ziel-spezifische Verbindungen, die Interaktion zwischen einem spezifischen Ziel und mehr als einem FKBP vermitteln, (ii) FKBP-spezifische Verbindungen, die Interaktion zwischen einem bestimmten FKBP und mehr als einem Ziel vermitteln, und am idealsten, (iii) FKBP/Ziel-spezifische Verbindungen, die Interaktion zwischen einem bestimmten FKBP und einem Ziel vermitteln. Die Protein-Interaktionen, vermittelt durch die Test-Verbindungen und gemessen in diesem Test, können mit immunsuppressiven, antifungalen, antiproliferativen und Toxizitäts-Profilen so wie deren Ki's für Inhibition von FKBP-PPIase-Aktivität in Beziehung gesetzt werden.
  • Unter Verwendung des oben beschriebenen quantitativen Chemiluminiszenztests wurde die Interaktion von menschlichem LexA-FKBP12 und VP16-RAPT1 in der Anwesenheit und Abwesenheit von Rapamycin analysiert. Interaktion zwischen FKBP12 und RAPT1 wurde als eine Funktion der Arzneistoff-Konzentration gemessen. Zugabe von Rapamycin von 0 bis 500 ng/ml erhöhte die β-Galactosidase-Aktivität um ungefähr das 1000-fache. Dieser Effekt war spezifisch für Rapamycin; FK506 über den gleichen Konzentrations-Bereich erhöhte die β-Galactosidase-Aktivität nicht signifikant über Hintergrund-Mengen. Wenn lexA-da, ein Kontroll-Konstrukt, für das lexA-FKBP12 substituiert wird, steigt die β-Galactosidase-Aktivität nicht als eine Funktion der Rapamycin-Zugabe. Die Grund-Mengen von β-Galactosidase in den Negativ-Kontrollen sind 0,1 Prozent der maximalen Mengen, nachgewiesen in dem Hefe-Stamm, enthaltend die FKBP12- und RAPT1-Konstrukte, die in Medium wuchsen, enthaltend 500 ng/ml Rapamycin. Diese Ergebnisse, veranschaulicht in 2, weisen darauf hin, dass Protein-Interaktionen, die durch ein kleines Molekül in dem Zwei-Hybrid-System vermittelt wurden, quantifiziert und in einem Mikrotiter-Format untersucht werden können, das für Durchmusterung mit hohen Durchgangs-Zahlen verwendet werden kann. Unter Anwendung verschiedener FKBPs und RAPT1-Proteine in dem Zwei-Hybrid-Format (3) wurden Rapamycin-vermittelte Interaktionen in diesem quantitativen Test gemessen.
  • Beispiel 9
  • In vitro Protein-Interaktionen, vermittelt durch Rapamycin
  • Arzneistoff-vermittelte Interaktionen von FK506-Bindungsproteinen und den RAPT1-Proteinen werden in vitro unter Verwendung von aufgereinigtem FKBP12, fusioniert an Glutathion-S-Transferase (GST), und 35S-markierten RAPT1-Proteinen, hergestellt durch in vitro-Transkription und -Translation, analysiert. Zu diesem Zweck wird FKBP12 in den Rahmen von GST in pGEX (Pharmacia, Piscataway, NJ) fusioniert. GST-FKBP12-Fusionsproteine werden exprimiert und aus E. coli gereinigt (Vojtek et al. (1993) Cell 74: 205–214). RAPT1-codierende Sequenzen werden hinter die CMV- und T7-Promotoren in den Säuger-Expressions-Vektor pX (Superti-Furga et al. (1991) J. Immunol. Meths. 151: 237–244) cloniert. RAPT1-Sequenzen werden vom T7-Promotor transkribiert und in vitro unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Reagenzien (Promega, Madison, Wi) in einer Reaktion; enthaltend 35S-Methionin, translatiert. Für in vitro-Bindung (Toyoshima et al. (1994) Cell 78: 67–74) werden 5 bis 20 μl der in vitro-Transkriptions/Translations-Reaktionen zu 200 μl Bindungspuffer (20 mM HEPES [pH-Wert 7,4], 150 mM NaCl, 10% Glycerin, 0,05% NP-40) hinzugefügt. Nach Zugabe von 10 μl GST-FKBP12, gebunden an Glutathion-Agarose-Kugeln, wird die Reaktion bei 4°C für 2 Std unter Rotation inkubiert. Verschiedene Konzentrationen von Arzneistoff werden zu den Reaktionen hinzugefügt, wie die 0,1 bis 10-fache Konzentration der von FKBP12 auf einer molaren Basis. Kein Arzneistoff wird zu Kontroll-Reaktionen hinzugefügt. Die Agarose-Kugeln werden dann präzipitiert und viermal mit Bindungspuffer gewaschen. Gebundene Proteine werden durch Kochen in Laemmli-Proben-Puffer eluiert, in 4–20% Gradienten-SDS-Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt und durch Autoradiographie visualisiert. Nachweis von 35S-markiertem RAPT1-Protein von Bindungs-Reaktionen, enthaltend Arzneistoff, zeigt eine direkte Bindung an FKBP12 als eine Funktion des Arzneistoffes.
  • Beispiel 10
  • Effekt von RAPT1-Mutationen auf Komplex-Bildung und Rapamycin-Empfindlichkeit
  • Um die Rapamycin-Bindungs-Domäne von RAPT1 genauer zu kartieren, wird die Isolation von Mutanten benötigt, die nicht, an einen FKBP/Rapamycin-Komplex binden. Wie in den Beispielen oben beschrieben, kann Assoziation mit dem FKBP/Rapamycin in dem LexA-Zwei-Hybrid-System getestet werden, in dem FKBP12 als eine Fusion an LexA exprimiert wird und RAPT1-Proteine als Fusionen an die VP16-Aktivierungs-Domäne exprimiert werden. Dementsprechend wird eine Genbank von mutanten RAPT1-Proteinen durch Mutagenisierung codierender Sequenzen durch PCR-erzeugte zufällige Mutagenese erstellt (Cadwell und Joyce (1992) PCR Methods Appl 2: 28–33). Die 5'- und 3'-Oligos für PCR enthalten BamHI- beziehungsweise EcoRI-Restriktions-Stellen, die nachfolgende Clonierung der PCR-Produkte in pVP16, bildend eine in-Rahmen-Fusion, ermöglichen. Zusätzlich enthält das 3'-Oligo eine 27 bp-HA-Epitop-Sequenz, gefolgt von einem im Rahmen befindlichen Stopp-Codon. Die Zugabe des HA-Epitop-Markers an das C-terminale Ende der Fusionsproteine ermöglicht die Charakterisierung der mutanten RAPT1-Proteine (siehe unten).
  • Nach Komplettierung der Mutagenese werden die EcoRI-BamHI-verdauten PCR-Produkte in pVP16 inseriert. Die Genbank von mutanten RAPT1-Proteinen wird durch Transformierung in E. coli amplifiziert. Um jene Mutationen, die die Fähigkeit eines RAPT1, mit einem FKBP/Rapamycin-Komplex zu interagieren, beeinträchtigen, zu identifizieren, wird die mutagenisierte RAPT1-Genbank in einen Hefe-Stamm eingebracht, der das LexA-FKBP-Köder-Protein enthält. Jede transformierte Zelle trägt ein individuelles mutiertes RAPT1, fusioniert an den Transkriptions-Aktivator VP16. Interaktion zwischen dem FKBP und Wildtyp-RAPT1 erfolgt, wenn Zellen in Medium, enthaltend Rapamycin, gezüchtet werden, induzierend lacZ-Expression und Blau-Färben der Kolonien auf X-GAL-Indikator-Platten. Kolonien, in denen die Interaktion zwischen einem FKBP/Rapamycin-Komplex und der RAPT1-Mutante beeinträchtigt ist, sind hellblau oder weiß. Zwei Klassen von Mutationen können diesen Phänotyp hervorrufen: Nonsense-Mutationen, resultierend in gekürzter Version von RAPT1, oder Sense-Mutationen, die die Bindung von RAPT1 an den FKBP/Rapamycin-Komplex beeinflussen. Um zwischen diesen zwei Typen von Mutationen zu unterscheiden, werden Gesamtprotein-Extrakte, gemacht von diesen Kolonien, einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Anti-HA-Antikörpers unterzogen. Nonsense-Mutationen, die kürzere, abgeschnittene Proteine hervorrufen, enthalten kein HA-Epitop an ihrem C-Terminus und werden daher durch den anti-HA-Antikörper nicht nachgewiesen. Umgekehrt werden Voll-Längen-Proteine mit eingebauten Sense-Mutationen mit diesem Antikörper nachgewiesen.
  • Die Genbank-Plasmide von den hellblauen oder weißen Kolonien, die Voll-Längen-RAPT1-Protein mit dem HA-Epitop exprimieren, werden durch erneute Transformation in E. coli gerettet. Die Position der Mutation wird durch Sequenz-Analyse festgestellt, und der Phänotyp durch erneute Transformation dieser Plasmide zurück in den Hefe-Stamm, enthaltend LexA-FKBP12, verifiziert.
  • Mutanten, die wieder getestet werden, können auch in den Säuger-Expressions-Vektor pX cloniert werden. pX-RAPT1 oder pX ohne RAPT1-Sequenzen werden dann in die Lymphoid (CTLL und Kit225)- und nicht-Lymphoid-Zellen (MG63 und RH30), sensitiv gegen Rapamycin, eingebracht. Der Effekt dieser Mutation auf die Rapamycin-Empfindlichkeit wird in Form von Inhibition von DNA-Synthese, überwacht durch BrdU-Einbau, gemessen. Mutanten, die Resistenz gegen Rapamycin auf Grund der Unfähigkeit, an den FKBP12/Rapamycin-Komplex zu binden, vermitteln, weisen darauf hin, welche Mutationen die Arzneistoff-Empfindlichkeit in lymphoiden- und nicht-lymphoiden-Zellen vermitteln. Von speziellem Interesse ist, ob unterschiedliche RAPT1s Arzneistoff-Empfindlichkeit in unterschiedlichen Zelltypen vermitteln.
  • Vergleichendes Beispiel 11
  • Clonierung eines RAPT1-ähnlichen Polypeptids von Candida albicans
  • Um Homologe der RAPT1-Gene vom menschlichen Pathogen Candida zu clonieren, wurden degenerierte Oligonucleotide, basierend auf den konservierten Regionen der RAPT1- und TOR-Proteine gestaltet und verwendet, um C. albicans-cDNA in λZAP (Stamm 3153A) zu amplifizieren. Die Amplifizierung bestand aus 30 Zyklen von 94°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute mit den PCR-Amplimeren GGNAARGCNCAYCCNCARGC und ATNGCNGGRTAYTGYTGDATNTC. Die PCR-Reaktionen wurden auf einem 2,5%igen niedrig-schmelzenden Agarose-Gel aufgetrennt, das ein von der Größe her auftrennbares Fragment identifizierte. Das Fragment wurde eluiert und in pCRII (TA-Clonierungssystem, Invitrogen Corporation) cloniert.
  • Die C. albicans-DNA-Sonden wurden durch Nick-Translation 32P-markiert und auf Southern-Blots verwendet, um die Spezies-Identität der Fragmente zu bestätigen und um C. albicans-cDNA-Genbanken weiter zu durchmustern. Sequenzierung von größeren cDNAs bestätigte die Identität der Clone. Die Teil-Sequenz eines C. albicans-RAPT1-ähnlichen Polypeptids, mit dem offenem Leserahmen ausgewiesen, wird durch SEQ ID Nos. 13 und 14 geliefert.
  • Alle der oben-zitierten Referenzen und Publikationen sind hierdurch durch Bezugnahme eingeschlossen.
  • Äquivalente
  • Fachleute werden erkennen oder im Stande sein, unter Verwendung von nicht mehr als Routine-Versuchen viele Äquivalente zu den spezifischen Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung zu ermitteln. Solche Äquivalente sollen durch die folgenden Ansprüche umfasst sein.
  • Sequenzprotokoll
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Claims (13)

  1. Nucleinsäure, (a) die die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 hat; (b) die die Nucleotidsequenz des RAPT-Geninserts von plC521 (ATCC-Zugangsnummer 75787) hat; (c) codierend (i) ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 hat; (ii) ein Fragment von (i) von mindestens 20 Aminosäuren, das in der Lage ist, an den FKBP/Rapamycin-Komplex zu binden; (iii) ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die zu mindestens 70% identisch mit SEQ ID NO: 2 ist und in der Lage ist, einen FKBP/Rapamycin-Komplex zu binden; oder (iv) ein Fusionsprotein, enthaltend ein Polypeptid gemäß (i) bis (iii), zusammen mit einer in Bezug darauf heterologen Polypeptidsequenz.
  2. Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäure (a) nicht mehr als 10 Kilobasen (kb) von Nucleinsäuresequenz einschließt, die sie in genomischer DNA natürlich unmittelbar flankiert, oder (b) im wesentlichen frei ist von zellulärem Material, viralem Material, Kulturmedium oder chemischen Vorstufen, die mit ihrer Herstellung in Zusammenhang stehen.
  3. Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, des weiteren umfassend eine Transkriptionsregulationssequenz, die funktionell mit der Nucleotidsequenz verbunden ist, um die Nucleotidsequenz als Expressionsvektor verwendbar zu machen.
  4. Nucleinsäure nach Anspruch 3, wobei die Transkriptionsregulationssequenz sich von der Sequenz unterscheidet, die natürlicherweise die Transkription des natürlich vorkommenden RAPT1-Proteins kontrolliert.
  5. Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Protein in einer der beiden Rollen eines Agonisten der Rapamycinregulation der Zellproliferation oder eines Antagonisten der Rapamycinregulation der Zellproliferation funktioniert.
  6. Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das RAPT1-Gen ein menschliches RAPT1-Gen ist.
  7. Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die kovalent unter Erhaltung des Leserahmens mit einer zweiten Nucleotidsequenz verbunden ist, die ein anderes Polypeptid codiert.
  8. Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz hat, die zu mindestens 90% identisch mit SEQ ID NO: 2 ist.
  9. Expressionsvektor, der in der Lage ist, zumindest entweder in einer prokaryontischen Zelle oder einer eukaryontischen Zelle zu replizieren, umfassend die Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 3 bis 8.
  10. Wirtszelle, die mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 9 transfiziert ist und das Polypeptid exprimiert.
  11. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das vom Expressionsvektor nach Anspruch 9 codiert wird, umfassend das Züchten des Wirts nach Anspruch 10 in einem Zellkulturmedium, um das Polypeptid zu exprimieren, und das Isolieren des Polypeptids aus der Zellkultur.
  12. Polypeptid codiert von der Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
  13. Polypeptid nach Anspruch 12, das ein Fusionsprotein ist.
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