DE10046400A1 - Neuronal exprimiertes Protein und seine Verwendung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue spezifisch exprimierte Proteine, Nukleinsäuresequenzen, rekombinante Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend die Nukleinsäuresequenzen oder Vektoren enthaltende die Nukleinsäuresequenzen oder die rekombinanten Nukleinsäurekonstrukte, die für die Proteine kodieren. DOLLAR A Die Erfindung betrifft außerdem transgene Organismen, enthaltend die Nukleinsäuresequenzen, die rekombinanten Nukleinsäurekonstrukte oder die oben genannten Vektoren sowie mono- oder polyklonale Antikörper, die gegen die isolierten Proteine gerichtet sind. DOLLAR A Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die mit spezifischer Bindungsaffinität an die erfindungsgemäßen Proteine binden, ein Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der erfindungsgemäßen Proteine. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der Nukleinsäuresequenzen und Proteine.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue spezifisch exprimierte Proteine, Nukleinsäuresequenzen, rekombinante Nukleinsäure­ konstrukte enthaltend die Nukleinsäuresequenzen oder Vektoren enthaltende die Nukleinsäuresequenzen oder die rekombinanten Nukleinsäurekonstrukte, die für die Proteine kodieren.

Die Erfindung betrifft ausserdem transgene Organismen, enthaltend die Nukleinsäuresequenzen, die rekombinanten Nukleinsäurekon­ strukte oder die oben genannten Vektoren sowie mono- oder poly­ klonale Antikörper, die gegen die isolierten Proteine gerichtet sind.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die mit spezifischer Bindungsaffinität an die erfindungsgemäßen Proteine binden, ein Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäure­ sequenzen oder der erfindungsgemäßen Proteine. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der Nukleinsäuresequenzen und Proteine.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können der Genfamilie des sogenannten Immediate Early Genes (= IEG) zugeordnet werden.

Viele der bisher beschriebenen klonierten IEG-Gene werden neuro­ nal exprimiert [Brakeman et al., (1997), Nature 386: 284-288; Kaufmann et al., (1994), Int. J. Dev. Neurosci. 12: 263-271; Kato et al., (1998), J. Biol. Chem. 273: 23969-23975; Lyford et al., (1995) Neuron 14: 433-445; Tsui et al., (1996) J. Neurosci. 16: 2463-2478; Kaufmann et al., (1997), Brain Dev. 19 : 25-34; Wallace et al., (1998) J. Neurosci. 18: 26-35; Steward et al., (1998), Neuron 21: 741-751; O'Brien et al., (1999), Neuron 23: 309-323].

Ihre Expression wird rasch durch einen Stimulus erhöht. Für das IEG Homer 1A konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass es sich dabei um eine trunkierte Variante eines Mitglieds einer grösseren Genfamilie handelt und dass die Induktion dieser Variante zur (dominant-negativen) Unterbrechung der Signalweiterleitung führt, die von den anderen Mitgliedern der Genfamilie zwischen extra­ zellulären Rezeptoren und internen Kalziumspeichern vermittelt wird [Tu et al., (1998), Neuron 21: 717-726; 73; Xiao et al., (1998), Neuron 21: 707-716; Yuguchi et al., (1997), J. Cereb. Blood Flow Metab. 17: 745-752]. Somit führt ein externer Stimulus (z. B. Krampfanfall) zu direkten Veränderungen wichtiger Second Messenger Systeme.

Ein weiteres Beispiel für die wichtige Rolle der neuronal exprimierten IEGs im Hippocampus ist das sogenannte Arc. Dieses Gen wird ebenfalls nach Auslösung eines Krampfanfalles in Pyramidenzellen der hippocampalen Subregionen CA1 und CA3 in seiner mRNA-Expression induziert. Es wurde gezeigt, dass die Arc mRNA Expression im CA1 Areal durch blosses Verbringen der Ratte in eine neue Umgebung induziert wird. Da das Muster der induzierten Neuronen spezifisch für die jeweilige Umgebung war, in der sich die Ratte befand, konnte man nachweisen, dass die Induktion der Arc mRNA-Expression mit Vorgängen der neuronalen Informationsspeicherung im Hippocampus korreliert [Guzowski et al., (1999), Nat. Neurosci. 2: 1120-1124]. Diese sogenannten IEGs scheinen wichtige intrazelluläre Regulationspunkte darzustellen. Immediate Early Genes sind in Neuronen funktionell bei Lern­ vorgängen, Gedächtnis, synptischer Transmission und neuronaler Plastizität beteiligt. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Organismen sowie bei pathologischen Prozessen innerhalb der Organismen bzw. innerhalb der einzelnen Zelle.

Es bestand daher die Aufgabe weitere IEGs zur Verfügung zu stellen, die als Interventionspunkte bei der Behandlung von Krankheiten verwendet werden können. Diese Aufgabe wurde durch eine isolierte Nukleinsäuresequenz gelöst, die für ein Polypeptid mit Ischämie-Aktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

• a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz,
• b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerier­ ten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
• c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dar­ gestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 80% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die bio­ logische Aktivität der Polypeptide wesentlich reduziert ist.

Diese Nukleinsäuren lassen sich in eukaryontischen und prokaryon­ tischen Organismen vorteilhaft Mammalia wie Homo sapiens, Rattus, norvegicus oder Mus musculus finden. Diese Nukleinsäuren codieren für die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 2 (Rattus norvegicus), SEQ ID NO: 3 (Homo sapiens) und SEQ ID NO: 6 (Mus muscculus).

Diese Sequenzen werden im folgenden als A013 und ihre Homologen bezeichnet.

Aus der Ratte konnten erste ESTs der erfindungsgemäßen Genfamilie isoliert werden (WO 99/40225). Ausgehend von den erfindungs­ gemäßen Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 wurde eine Blastsuche [BLASTN 2.0.11 (Jan-20-2000), Altschul et al., (1997), Nucleic Acid Res., 25: 3389-3402] in verschiedenen Nukleinsäuresequenzbanken nach EST-Sequenzen durch­ geführt. Dabei wurden folgende Sequenzen in den Datenbanken gefunden (EMBL-Sequenzen):
AL040793, AI690694, AA037130, AW772348, AI686729, BE566297, D60079, AI561122, AA732090, AA804265, AI271547, AA506917, N31290, AI708828, AA836462, AW911853, BE291413, W04319, BE468249, AW971136, Z25893, AA513198, AA252731, D60078, H41838, H44472, W01559, AI479592, H44437, AA546741, AA793756, AA553209, C83289, C82433, AI504185, AA413858, AA623894, AA545549, W94400, AW911370, AA178092, AI230853, AI071972, AI071845, AJ398081, AW143903, BE668874, AI642135, BE332281, BE624374, AA863852, AI891661, AI253650, AW640340, AW910593, AW908935, BE377851, BE448032, BE447423, AA756298, AA124781, AI219242, AA153095, AI608739, BE289228, AA611931, AI171487, AW520380, BB326627, BB333116, AW918372, BB326609, AA919108, BB325861, AA544628, AI669854, AA746924, BE326645, AI882080, AW902885, BB184452, BE623010, AA647619, AI094097, AA672920, AI709420, BB299489, AA624080, W96882, AI122063, BB326104, AW195521, AI071029, BB184240, N71129, AA710743, AA968104, N22902, AW639920, AI230853, AI071972, BE238020, AL157791, AL049875, AQ193141, AQ411184, AJ250095, AJ250092, AP002379, AQ111941, AC018570, AQ185196, AQ748929.

Bei den vorgenannten EST-Sequenzen handelt es sich um Sequenzen, die eine gewisse Homologie zu Teilen der erfindungsgemäßen Sequenzen besitzen, deren Funktion aber unbekannt ist.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen konnten aufgrund bei­ spielsweise der Eigenschaften der Ratten-A013 mRNA, die 6 AUUUA Motive hat, den Immediate Early Genes (= IEG) zugeordnet werden.

Ein Gen wird als IEG bezeichnet, wenn es drei Bedingungen erfüllt:

• a) seine mRNA muss in ruhenden bzw. nicht stimulierten Zellen niedrig exprimiert werden,
• b) seine mRNA Expression kann auch unter Abwesenheit von de novo Proteinsynthese erfolgen
• c) nach geeigneter Stimulierung wird die Transkription des Gens aktiviert.

Basierend auf der Kinetik der mRNA Akkumulation werden IEGs häufig in 3 Klassen eingeteilt.

• a) IEGs der Klasse I sind oft in ruhenden bzw. nicht stimulierten Zellen kaum detektierbar. Die maximale mRNA Konzentration wird etwa 30 bis 60 Minuten nach Stimulation erreicht. Nach etwa 1,5 bis 2 Stunden geht die mRNA Konzentration wieder auf die basalen Werte zurück (Bei­ spiele sind c-fos, c-jun, zif268).
• b) IEGs der Klasse II erreichen maximale mRNA Konzentrationen 2 Stunden nach Stimulation. Die basalen Werte werden wieder nach etwa 8 Stunden (Beispiele hierfür sind Narp, c-myc, GLUT1) erreicht.
• c) Gene der Klasse 3 werden sehr schnell induziert, ihre mRNAs akkumulieren über viele Stunden. Diese mRNAs zeigen eine lange Halbwertszeit (z. B. Fibronectin).

Basierend auf diesen Kriterien können die erfindungsgemäßen Proteine und die für die Proteine kodierenden Nukleinsäuren von A013 und deren Homologe als IEGs der Klasse I klassifiziert werden.

So konnte für das Gen A013 konnte gezeigt werden, dass es gemäß eines IEG der Klasse I in Ratten nach einem wiederholten maximalen elektroconvulsiven Krampf im Hippocampus induziert wird (WO 99/40225).

Unter den erfindungsgemäßen isolierten Proteinen sind Proteine zu verstehen, die eine in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz enthalten, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigen­ schaften des in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Proteins erhalten bleibt. Dabei können beispiels­ weise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physiko­ chemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizi­ tät etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste ge­ gen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparagin­ säurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge ver­ tauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden. Die solchermassen gegenüber der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 ver­ änderten Proteine besitzen wenigstens 60%, bevorzugt wenigstens 70% und besonders bevorzugt wenigstens 90% Sequenzidentität zu den Sequenzen in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 berechnet nach dem Algorithmus von Altschul et al. [1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410, BLAST-Programm (Version BLASTP 2.0a19-WashU; 05-Feb-1998) über die gesamte Länge der Proteinsequenzen].

Unter funktionellen Äquivalenten der genannten Sequenzen sind Nukleinsäuren zu verstehen, die für Proteine kodieren, die die biologische Aktivität von A013 aufweisen und mindestens 50% der Aktivität der unter SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 genannten Sequenzen aufweisen. Diese funktionellen Äquivalente interagieren vorteilhafterweise mit anderen Proteinen, mit denen sie sogenannte Proteinkomplexe (Proteinheteromere) bilden.

Unter den wesentlichen biologischen Eigenschaften der erfindungs­ gemäßen Proteine sind weiterhin beispielsweise die N-terminale Arginin-reiche Domäne (Aminosäuren 1 bis 56), die F-Box Domäne (Aminosäuren 70 bis 111), die Leucin-Zipper-Domäne (= putative Transmembran-Domäne) (Aminosäuren 172 bis 196), die Kern­ lokalisationsdomäne (Aminosäuren 230 bis 236) sowie die Leucin­ reiche C-terminale Domäne zu verstehen (Aminosäuren 172 bis 534). Diese Proteinbereiche ermöglichen die spezielle biologische Wirkung der erfindungsgemäßen Proteine. Eine wesentliche bio­ logische Eigenschaft der erfindungsgemäßen Proteine ist die Fähigkeit mit Skp1 über die F-Box-Domäne interagieren zu können, sowie die Fähigkeit über die Substratbindungsdomäne Zielproteine zu binden, die durch den Ubiquitin-abhängigen Proteinabbau degradiert werden sollen. Typische Substrat-Bindungsdomänen von F-Box Proteinen sind sogenannte Leucine rich repeats und WD-Domänen, sie finden sich in über 50% der bekannten F-Box Proteine als Interaktionsdomänen. Darüber hinaus fungieren auch Leucin-Zipper-Domänen, Ring-Finger Domänen, Helix-Loop-Helix Domänen, SH2 Domänen sowie beim Cyclin F eine Cyclin-Box als Substrat-Bindungsdomäne (Cenciarelli et al., 1999, Curr. Biol., 9: 1177-1179; Winston et al., 1999, Curr. Biol., 9: 1180-1182).

Vorteilhaft gehört zu den wesentlichen biologischen Eigenschaften außerdem die spezifische Bindung von synthetische oder natürli­ cher Agonisten und Antagonisten an die erfindungsgemäßen Proteine mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 darge­ stellten Aminosäuresequenzen oder deren funktionelle Äquivalente, deren biologischen Eigenschaften dadurch verändert oder moduliert wird.

Die erfindungsgemäßen Proteine und seine funktionellen Varianten lassen sich vorteilhafterweise aus dem Gehirn, der Placenta, der Niere, der Lunge oder dem Herzen von Mammalia wie Homo sapiens, Mus musculus, oder Rattus norvegicus isolieren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Nukleinsäure­ sequenzen, die für die oben beschriebenen Proteine kodieren, insbesondere für solche mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Primärstruktur. Die Nukleinsäure­ sequenz aus Rattus norvegicus ist in SEQ ID NO: 1 und aus Homo sapiens in SEQ ID NO: 3 und aus Mus musculus in SEQ ID NO: 5 dargestellt.

Nach Isolierung und Sequenzierung sind die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder deren funktionelle Äquivalente wie z. B. Allelvarianten erhält­ lich. Unter Allelvarianten sind SEQ ID NO: 1-; SEQ ID NO: 3- oder SEQ ID NO: 5-Varianten zu verstehen, die 60 bis 100% Homologie auf Aminosäureebene (= Identität), bevorzugt 70 bis 100%, ganz besonders bevorzugt 90 bis 100% aufweisen. Allel­ varianten umfassen insbesondere solche funktionellen Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften erhalten bleibt. Bei SEQ ID No: 5 handelt es sich um eine unvollständige Sequenz, die nur ein Exon (1) enhält.

Homologe oder sequenzverwandte Nukleinsäuresequenzen können aus allen Säugerspezies einschließlich Mensch nach gängigen Verfahren zum Beispiel mittels Homologiescreening durch Hybridisierung mit einer Probe der erfindungsgemäßen Nuklein­ säuresequenzen oder Teilen davon isoliert werden.

Unter funktionellen Äquivalenten sind auch Homologe von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5, beispiels­ weise ihre Homologen aus anderen Mammalia, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu verstehen. Homologe der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 besitzen auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, besonders bevorzugt mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 95% über den gesamten in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 angegebenen Bereich.

Außerdem sind unter Homologen der Sequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 5 Derivate wie beispiels­ weise Promotorvarianten zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen gemeinsam oder einzeln vorgeschaltet sind, können durch ein oder mehrere Nukleotid­ austausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) ver­ ändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht bzw. erniedrigt werden oder auch komplett durch andere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Unter Derivaten sind auch vorteilhaft Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich -1 bis -10000 vor dem Start­ kodon oder in anderen regulatorischen cis-flankierenden Elementen so verändert wurde, dass die Genexpression und/oder die Protein­ expression verändert, bevorzugt erhöht wird. Weiterhin sind unter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die am 3'-Ende verändert wurden.

Solche funktionellen Äquivalente lassen sich ausgehend von den in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 beschriebenen DNA-Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Vertebraten wie Mammalia isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonu­ kleotide konservierter Bereiche beispielsweise der F-Box-Domäne oder des C-Terminus verwendet. Es können aber auch längere Frag­ mente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet wird, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelz­ temperaturen für DNA:DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nuklein­ säure Temperaturen zwischen 42°C und 58°C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätz­ lich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungs­ bedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al. [(eds.), 1989. Molecular cloning: A Laboratory Manual. CSH Laboratory Press, New York] beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. [(eds.), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York]; Hames and Higgins [1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford]; Brown [(ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford]. Wie dem Fachmann bekannt ist, unterliegen die Hybridisierungsergebnisse gewissen Schwankungen, d. h. durch beispielsweise kürzere oder längere Expositionszeiten können Unterschiede im Bandenmuster bei der Hybridisierung auftreten.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder deren Fragmente lassen sich darüber hinaus auch zur Isolierung genomischer Sequenzen über Homologiescreening unter Verwendung der oben genannten Hybridisierungsbedingungen einsetzen.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend der im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Die "codon usage" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Weiterhin ist es von Vorteil die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren funktionell mit mindestens einem genetischen Regulationselement zu den erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäurekonstrukten (= Expressionskassette, Genkonstrukt) zu verknüpfen. Dazu werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen üblicher­ weise mit genetischen Regulationselementen wie Transkriptions- und Translationssignalen funktionell verknüpft. Diese Ver­ knüpfung kann je nach gewünschter Anwendung zu einer Erhöhung oder Erniedrigung der Genexpression führen.

Mit den solchermaßen hergestellten erfindungsgemäßen rekombi­ nanten Expressionskassetten werden anschließend die gewünschten Wirtsorganismen transformiert. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen, können natürliche Regulationselemente dieser Sequenzen, die vor den eigentlichen Strukturgenen liegen, noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wird. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die kodierenden Sequenzen inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht ent­ fernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Auch am 3'-Ende der Nukleinsäure-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte regulatorische Elemente inseriert werden. Die Nukleinsäuresequenzen für die Sequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 können in einer oder in mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver­ fahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, l-PR- oder im l-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispiels­ weise in den Promotoren gram-positiver Bakterien wie amy und SPO2, in den Hefepromotoren wie ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH TEF, rp28, ADH zu finden. In diesem Zusammenhang sind auch die besonders vorteilhaften Mammaliapromotoren wie zum Beispiel die Promotoren von CMV, RSV, SV40, EF-1a, CAM-Kinase II, Nestin, BDNF, NGF, MBP, NSE, β-Globin, GFAP, Tyrosine Hydroxylase oder Kainat-Rezeptor Untereinheit 1 zu nennen.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit, ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs­ weise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafter­ weise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Trans­ kriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Unter "Enhancer" sind beispielsweise DNA-Sequenzen zu ver­ stehen, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA eine erhöhte Expression bewirken. Als weitere Regulationssequenzen seien beispielhaft die locus control regions, silencer oder jeweilige Teilsequenzen davon genannt. Diese Sequenzen können vorteilhaft für eine gewebespezifische Expression verwendet werden.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist die Verknüpfung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit einem Promotor, wobei der Promotor 5' up stream zu liegen kommt. Es kann sich dabei um einen natürlichen oder um einen synthetischen Promotoren handeln. Der natürliche vor den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen vorhandene Promotor kann dabei noch zusätzlich zu den eingefügten Promotoren vorhanden sein oder aber durch diese neuen Promotoren ersetzt werden. Auch ist eine gezielte genetische Veränderung des natürlich vor den Sequenzen vorhandenen Promotors vorteilhaft. Weitere Regulationssignale wie 3' gelegene Terminatoren oder Polyadenylierungassignale oder Enhancer können funktionell in dem Nukleinsäurekonstrukt Anwendung finden.

Unter dem Begriff der erfindungsgemäßen "Expressionskassette bzw. des rekombinanten Nukleinsäurekonstrukts bzw. Genkonstrukts" sind auch komplette Vektorkonstrukte zu verstehen. Diese Vektor­ konstrukte oder Vektoren werden zur Expression in einem geeig­ neten Wirtsorganismus verwendet. Vorteilhafterweise werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in einen wirtsspezifischen Vektor inseriert, der eine optimale Expression der Gene im ausgesuchten Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise Pouwels et al. [Cloning Vectors: Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0444904018] entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, BACs, YACs, Mammalia-(Mini-)Chromo­ somen-Vektoren, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Für die chromosomale Integration in Mammalia wird vorteilhaft lineare DNA verwendet.

Die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen bzw. des rekombinanten Nukleinsäurekonstrukts kann vorteilhaft durch Erhöhen der Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die Genexpression positiv beein­ flussen, erhöht werden. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale wie Promotoren und Enhancer verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert, oder die Ableseeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird beispielsweise in dem die Ribosomenbin­ dungsstelle im 3'-Bereich vor den erfindungsgemäßen Nukleinsäure­ sequenzen verändert wird.

Zur Erhöhung der Genkopienzahl können die Nukleinsäuresequenzen oder homologe Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält. Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken.

Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren auch in Form therapeutisch oder diagnostisch geeigneter Fragmente exprimiert werden. Zur Generierung des rekombinanten Proteins können Vektor­ systeme oder Oligonukleotide verwendet werden, die die Nuklein­ säuren oder das Nukleinsäurekonstrukt um bestimmte Nukleotid­ sequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide kodieren, die einer einfacheren Reinigung dienen. Als solche "Tags" sind in der Literatur z. B. Hexa-Histidin-Anker bekannt oder Epitope, die als Antigene verschiedener Antikörper erkannt werden können (Studier et al., 1990 und Ausubel et al. [(eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York]).

Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer Homologen, funktionellen Äquivalente oder Derivate, des rekombinante Nukleinsäurekonstrukt oder der Vektoren, ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispiels­ weise eukaryontische oder prokaryontische Wirtsorganismen wie Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien wie Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Mensch oder Tier, beispielsweise HEK293, COS1, COS7, CHO, PC12, oder SF9-Zellen. Diese transgenen oder rekombinanten Organismen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie entweder die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihre Allel­ varianten, ihre Homologen, funktionellen Äquivalente oder Derivate, das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt oder die Vektoren natürlicherweise nicht enthalten oder nicht an dieser Stelle im Genom oder in der Zelle enthalten oder aber das der natürliche Promotor der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen so genetisch manipuliert wurde, dass die entsprechenden Gene je nachdem stärker oder schwächer exprimiert werden.

Die prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtsorganismen können mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder mindestens eine Nukleinsäurekonstrukt oder mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten.

Gewünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organismen wie transgenen Tieren z. B. Mäusen, Ratten, Schafen, Rindern oder Schweinen zur Expression gebracht werden. Auch transgene Pflanzen sind im Prinzip denkbar. Bei den transgenen Organismen kann es sich auch um sogenannte Knock-Out Tiere handeln.

Dabei können die transgenen Tiere eine funktionelle oder nicht funktionelle erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt enthalten.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung der oben beschriebenen transgenen Tiere sind transgene Tiere, in dessen Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen; oder in dessen Keimzellen und der Gesamt­ heit oder einem Teil der somatischen Zellen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz durch gentechnische Verfahren verändert oder durch Einfügen von DNA-Elementen unterbrochen wurden.

Die Kombination aus den Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren wie Plasmide, Viren oder Phagen wie beispiels­ weise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter System, die Phagen λ, Mu oder andere temperänte Phagen oder Transposons und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen bilden ein Expressionssystem. Bevorzugt sind unter dem Begriff Expressions­ systeme beispielsweise die Kombination aus Säugetierzellen wie Zellen neuronalen Ursprungs und Vektoren wie pcDNA3-Vektoren oder CMV-Vektoren, die für Säugetierzellen geeignet sind, zu verstehen.

Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der erfindungs­ gemäßen Nukleinsäuren oder Teilen davon zur Gentherapie in Säuge­ tieren, z. B. Mensch. Auch zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Teilen davon komplementäre Sequenzen können zur Gentherapie verwendet werden. Gentherapie umfasst dabei alle Therapieformen, die entweder Sequenzen nach Anspruch 1 oder 2 in den Körper oder Teile davon einbringen, oder die Expression von Sequenzen nach Anspruch 1 und 2 beeinflussen. Dazu können Oligonukleotide, z. B. Antisense- oder Hybrid-RNA-DNA Oligonukleotide, mit beliebigen Modifikationen, die Teile der Sequenzen gemäß Anspruch 1 und 2 enthalten, benutzt werden. Ebenfalls können virale Konstrukte, enthaltend eine Sequenz nach Anspruch 1 und 2 oder Teile davon benutzt werden. Ebenso kann nackte DNA, enthaltend eine Sequenz nach Anspruch 1 und 2 oder Teile davon, benutzt werden. Ebenso können Nukleinsäurestücke mit enzymatischer Aktivität (z. B. Ribozyme) für gentherapeutische Zwecke benutzt werden. Beispiels­ weise können so Sequenzpolymorphismen, die mit Prädispositionen für humane Erkrankungen korrelieren, nachgewiesen werden. Vor­ teilhaft können so Erbkrankheiten nachgewiesen werden, die durch hypoxische bzw. ischämische Zellen oder Gewebe charakterisiert sind.

Eine weitere Möglichkeit des Einsatzes der Nukleotidsequenz oder Teilen davon ist die Erzeugung transgener oder knock-out- oder konditioneller oder regionenspezifischer knock-out. Tiere oder spezifischer Mutationen in gentechnisch veränderten Tieren [Ausubel et al. (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, (New York); Torres et al., 1997, Laboratory protocols for conditional gene targeting, Oxford University Press, (Oxford)]. Über transgene Überexpression oder genetische Mutation (Nullmutation oder spezifische Deletionen, Insertionen oder Veränderungen) durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen kann man Tiermodelle erzeugen, die wert­ volle weitere Informationen über die (Patho-)Physiologie der erfindungsgemäßen Sequenzen liefern. Eine bevorzugte Ausführung besteht in der Einbringung der in menschlichen Erbkrankheiten bzw. polygen vererbten Krankheiten gefundenen Mutationen des A013 Gens in die Keimbahn von transgenen Tieren. Solchermaßen hergestellte Tiermodelle können essentielle Testsysteme zur Evaluierung neuartiger Therapeutika darstellen, die die Funktion von A013 beeinflussen.

Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte oder der entsprechenden Proteine können Proteine identifiziert werden, die zum erfindungsgemäßen Protein spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen, oder zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Proteine kodieren, die zum Protein spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen. Vor­ teilhafterweise werden hierzu das Two-Hybrid System oder andere biochemische Verfahren allein oder in Kombination verwendet. Es lassen sich so Interaktionsdomänen des erfindungsgemäßen Proteins und damit pharmakotherapeutische Interventionspunkte bestimmen.

Daher ist ein Gegenstand der Erfindung die Verwendung des Two-Hybrid Systems oder biochemischer Verfahren allein oder in Kombination zur Identifizierung der Interaktionsdomänen von A013 und die Verwendung zur pharmakotherapeutischen Intervention.

Ein weiterer besonders vorteilhafter Erfindungsgegenstand sind Proteinkomplexe aus dem A013- Protein und mindestens einem weiteren mit A013 interagierenden Protein wie beispielsweise Skp1.

Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das A013-Gen als Klasse I IEG im uninduzierten Zustand nur äußerst niedrig exprimiert wird. Eine sehr geringe basale A013 mRNA Expression lässt sich beim Menschen für Hirn, Plazenta, Niere und Herz nachweisen (Fig. 3). Die Größe der detektierten A013 mRNA war in allen Organen etwa 4,0 kb. Normalisiert wurde bei den Experimenten auf S26, einem ribosomalen Protein der kleinen Untereinheit.

Eine Reihe von Stimuli kann die A013 mRNA Expression im Hippo­ campus stimulieren. Dazu gehören akute Krampfanfälle, ausgelöst durch systemische Applikation von Kainat oder durch maximalen elektrokonvulsiven Schock (= MECS) (WO 99/40225: Worley et al., 1999). In situ Hybridisierungen an Hirnschnitten von Ratten nach Applikation von Kainat haben gezeigt, dass die Induktion der A013 mRNA Expression dabei überwiegend im Bereich der Zellkörper des Gyrus dentatus erfolgt und darüberhinaus in schwächerem Maße in der CA1 Region des Hippocampus. Die Applikation von Pentylen­ tetrazol (= PTZ) zeigte eine vergleichsweise schwache Induktion des A013 mRNA Expressionslevels im Bereich des Gyrus dentatus sowie den CA1 und CA3 Regionen des Hippocampus.

Gemäß der Erfindung konnte in einem Tiermodell für globale Ischämie (einem validen Tiermodell für humane cerebrale Hypoxien, wie z. B. intranatale Asphyxien, intraoperative Hypoxien, cere­ brale Hypoxien nach Herzstillstand) gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen Sequenzen eine Rolle bei der globalen Ischämie spielen, so läßt sich die A013 mRNA Expression in diesem Tier­ modell induzieren (Fig. 11, Beispiel 5). Zur Herbeiführung der globalen cerebralen Ischämie wurden dabei die Carotis interna beidseitig abgeklemmt und gleichzeitig für eine Dauer von 3 bis 5 Minuten eine Hypotonie herbeigeführt. Es werden dadurch besonders in bestimmten Hirnregionen wie dem Hippocampus neuronale Schädi­ gungen über einen längeren Zeitverlauf ausgelöst. Die Regulation der Genexpression spielt bei der cerebralen Ischämie eine ent­ scheidende Rolle für den Ablauf und das Ausmass des Neuronen­ schadens (Koistinaho and Hokfelt, 1997, Neuroreport 8: i-viii; Schneider et al., 1999, Nat. Med. 5: 554-9, Atkins et al., 1996, Stroke 27: 1682-1687, Nogawa et al., 1997, J. Neurosci. 17: 2746-275; Yamagata et al., 1993, Neuron 11: 371-86). Das Modell der sogenannten Präkonditionierung wurde für die globale Ischämie beschrieben. Dabei wird ein bestimmter Stimulus, z. B. 3-Nitro-Propionsäure (3-NPA) längere Zeit (24 h) vor der globalen Ischämie appliziert. Dies führt zu einer Protektion von Nerven­ zellen in Bezug auf den nachfolgenden Schaden. Es wird vermutet, dass für diese Prozesse ebenfalls Veränderungen der Genexpression entscheidend sind (Baron et al., 1998, Stroke 29: 1937-1951; Nakase et al., 1997, J Cereb Blood Flow Metab 17 (Suppl1), S211). Es konnte in den erfindungsgemäßen Arbeiten gezeigt werden, dass A013 durch globale Ischämie induziert wird. Diese Induktion ist nach Präkonditionierung mit 3-NPA deutlich ver­ stärkt. Dies kann als Hinweis auf eine mögliche neuroprotektive Funktion von A013 gewertet werden.

Mittels Immunfluoreszenz-Studien nach heterologer Expression von rA013-myc (= Ratten-A013 mit C-terminalem c-Myc Tag) in COS-1 Zellen konnte gezeigt werden, dass A013 im wesentlichen im Nukleus lokalisiert ist (Fig. 5).

Two-Hybrid Studien in Hefe dokumentieren eine Interaktion von A013 mit dem Protein Skp1 (S-phase-kinase-associated protein 1, Bai et al., 1996, Cell, 86: 263-274). Als Interaktionsdomäne konnte dabei eine sogenannte F-Box Domäne im A013 identifiziert werden (Aminosäure 73-114; Fig. 7). Diese experimentellen Daten erlauben die Zuordnung von A013 in die Familie der sogenannten F-Box Proteine (Skowyra et al., (1997), Cell 91: 209-219).

Skp1 und diese sogenannten F-Box Proteine sind Bestandteil eines Multi-Protein Komplexes, der an der Ubiquitin-abhängigen Protein­ degradation beteiligt ist (Hochstrasser, 1995, Curr. Opin. Cell Biol., 7: 215-223). Dieser Komplex wird als SCF-Komplex (Skp1-Cullin1-F-Box Protein) bezeichnet und ist ein Bestandteil des Ubiquitin-Ligase-Komplexes (E3) [Bai et al., (1996), Cell, 86: 263-274; Skowyra et al., (1997), Cell 91: 209-219; Deshaies R. J., (1999), Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15: 435-67]. A013 scheint ein weiterer Vertreter der F-Box Proteine zu sein.

Beim Ubiquitin-abhängigen Proteinabbau werden Ubiquitin Moleküle in einer mehrstufigen Reaktion (E1-E3) auf ein Proteinsubstrat übertragen (Fig. 8). Der Abbau ubiquitinierter Proteinsubstrate erfolgt anschließend an 26S Proteasomen, welche sich sowohl im Zellkern wie im Cytoplasma befinden können [Ciechanover A. (1994), Cell, 79: 13-21; Jentsch S., (1992), Annu. Rev. Genet., 26: 179-207].

Der oben beschriebene Degradationsprozess muss sowohl hoch selektiv erfolgen, sowie streng regulierbar sein, damit die Viel­ zahl individueller Proteine entsprechend ihrer Halbwertszeiten, die im Bereich von einigen Minuten bis zu mehreren Tagen liegen können, in der erforderlichen Weise abgebaut werden können.

Mittels der Ubiquitin-abhängigen Proteindegradation wird die zelluläre Konzentration einer Vielzahl wichtiger Regulator­ proteine gesteuert. Diesen Proteinen kommt eine Schlüssel­ funktion in Prozessen wie der Zellzykluskontrolle, der Zell­ differenzierung, bei DNA Reparaturmechanismen und in der Kontrolle diverser Signaltransduktionskaskaden zu. Darüber hinaus werden auch denaturierte und aggregierte Proteine über diesen Stoffwechselweg abgebaut [Krek W., 1998, Curr. Opin. Genet. Dev. 8: 36-42; Verma et al., 1997, Science 278: 455-460; Ciechanover A., 1994, Cell, 79: 13-21].

Im einzelnen erfordert die Bildung von Ubiquitin-Protein-Konjugaten die folgenden Ubiquitin-Transfer-Reaktionen (Fig. 8):

• 1. Ubiquitin, ein Protein bestehend aus 76 Aminosäuren, wird zunächst durch ein Ubiquitin aktivierendes Enzym (E1) in einer ATP-abhängigen Reaktion aktiviert.
• 2. Das aktivierte Ubiquitin wird als Thioester auf ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym (E2) übertragen.
• 3. Vom E2 wird Ubiquitin entweder direkt auf einen Lysin-Rest im Target Protein oder auf eine weiteren Komplex mit Ubiquitin-Ligase Aktivität (E3) übertragen. Am E3-Komplex können auch mehrfach Ubiquitinreste auf das Proteinsubstrat übertragen werden, was zu einer Polyubiquitinierung des Target Proteins führt.
• 4. Die ubiquitinierten Proteinsubstrate werden vom 26S Proteasome erkannt und abgebaut.

Den F-Box Proteinen kommt bei der Ubiquitinierung von Ziel­ proteinen eine Schlüsselfunktion zu. Als variable Komponente des Ubiquitin-Ligase Komplexes (E3) vermitteln sie die Substrat­ spezifität und haben die Aufgabe, spezifische Proteinsubstrate für die Degradation zu rekrutieren.

Bisher sind etwa hundertfünfzig verschiedene F-Box Proteine bekannt, darunter allerdings nur wenige humane Formen. Eine Neuronen-spezifische Expression wurde bisher nur für das F-Box Protein NFB42 beschrieben (Erhardt et al., 1998, J. Biol. Chem., 273: 35222-35227). NFB42 (Neuronal F-Box Protein of 42 kDa) wird im Gegensatz zu A013 konstitutiv in weiten Bereichen des Gehirns neuronal exprimiert.

A013 ist bisher das einzig bekannte IEG, das als F-Box Protein die Degradation spezifischer Zielproteine durch Ubiquitin-abhängigen Proteinabbau steuert. Die Proteine, die durch Inter­ aktion mit A013 zum E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex rekrutiert werden, sind noch unbekannt. Auf Grund der nukleären Lokalisation des A013 wären Transkriptionsfaktoren oder andere nukleäre Regulatorproteine als Interaktionspartner denkbar, die nach zellulärem Stress, wie er durch Krampfzustände oder ischämische bzw. hypoxische Zustände induziert wird, aus dem Zellstoffwechsel entfernt werden sollen.

Bisher sind nur wenige Proteinsubstrate von F-Box Proteinen bekannt und exemplarisch näher untersucht worden (u. a. Cln1, Cln2, Sic1, IKB, β-Catenin). Für alle diese Substrate gilt, dass eine Erkennung durch das zugehörige F-Box Protein, nur nach Phosphorylierung des Proteinsubstrates möglich ist [Skowyra et al., (1997), Cell 91: 209-219; Hatakeyama et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 3859-3863; Read et al., (2000), Mol. Cell Biol., 20: 2326-2333].

F-Box Proteine besitzen generell eine hohe medizinische Relevanz. Das Fehlen eines F-Box-Proteins oder ein nicht funktionelles F-Box-Protein kann, auf Grund der resultierenden Akkumulation der zugehörigen Proteinsubstrate, mit pathologischen Veränderungen assoziiert sein. Es sind eine Reihe von Krankheitsbildern bekannt, die durch Mutationen im Ubiquitin konjugierenden System hervorgerufen werden (oder mit einer gestörten Protein­ degradation am 26S Proteasom einhergehen).

Beim Angelman-Syndrom liegt ein Defekt im Gen der Ubiquitin Protein Ligase 3A Gen (UBE3A) vor (auch als E6AP bezeichnet) [Kishino et al., 1997, Nature Genet. 15: 70-73; Matsuura et al., 1997, Nature Genet., 15: 74-77]. UBE3A ist ein 100 kDa Protein, das mit dem E6 Protein des Humanen Papillomavirus vom Typ 16 und 18 interagiert. Der UBE3A-E6 Komplex rekrutiert den Tumor-Suppressor p53 zum E3 Ubiquitin-Ligase Komplex. Das Angelmann-Syndrom ist gekennzeichnet durch mentale Retardation, epileptische Anfälle, Tremor und Ataxia.

Das Liddle-Syndrom ist eine erblichen Form von arteriellem Blut­ hochdruck, die durch sehr geringe Aldosteron, Renin und Angio­ tensin Serumspiegel charakterisiert ist. (Liddle et al., (1963), Trans. Assoc. Am. Phys., 76 : 199-213). Bei Patienten mit Liddle-Syndrom ist die Menge an sogenannten epithelialen Na⁺-Ionenkanälen (ENaC) stark erhöht. Dieser Ionenkanal spielt eine essentielle Rolle für die Natrium- und Flüssigkeitsresorption in Niere, Lunge und Dickdarm. Ursächlich für diese Erkrankung können dabei Muta­ tionen im Bereich der multiplen NW-Domänen des Nedd4-Gens sein (Staub et al., 2000, Kidney Int.; 57: 809-815). Nedd4 ist eine Ubiquitin-Ligase, die die Degradation des epithelialen Na+-Ionenkanals steuert (Anan et al., 1998; Genes Cells, 3 : 751-763; Staub et al., 1996, EMBO J. 15 : 2371-2380). Die Interaktion mit dem sogenannten Prolin-Tyrosin Motiv (PYXY) des epithelialen Na⁺-Ionenkanals erfolgt dabei über die WW-Domänen des Nedd4 (Staub et al., 1996, EMBO J. 15: 2371-2380). Eine herabgesetzte Bindungs­ fähigkeit, hervorgerufen durch Mutationen in der NW-Domäne des Nedd4 oder aber im Bereich des PYXY-Motivs des Na⁺-Ionenkanals, resultieren dementsprechend in einem stark verminderten Turnover des epithelialen Na⁺-Ionenkanals.

Das von Hippel-Lindau Syndrom ist gekennzeichnet durch die Prädisposition für renale Zellkarzinome und weitere vaskuläre Tumoren, verursacht durch eine Mutation bzw. Inaktivierung des von Hippel-Lindau Proteins (pVHL), einem Tumor Suppressor Protein (Iliopoulos und Kaelin Jr., 1997, Mol. Med. 3: 289-93; Maher und Kaelin Jr., 1997, Medicine 76: 381-391). pVHL ist. Bestandteil eines E3 Ligase Komplexes und besitzt die Aufgabe, die alpha Untereinheit von Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktoren (HIF-1; HIF-2) zum E3 Ligase Komplex zu rekrutieren (Ohh et al., 2000, Nat. Cell Biol. 2: 423-427); W. Krek 2000, Nat. Cell Biol. 2: E121-E123. Damit erfüllt pVHL eine Funktion analog zu F-Box Proteinen. Die konstitutive Expression, der durch HIFs regulierten Gene sowie die Expression des Vascular Endothelial Growth Factors (VEGF), bedingt die Hypervaskularisierung und Proliferation des umliegenden Gewebes (Kaelin und Maher, 1998, Trends Genet. 14: 423-426; Pause et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 993-998).

Eine selektive Modulation der Ubiquitin-abhängigen Protein­ degradation wäre daher ein möglicher Ansatz, um erfolgreich Krankheiten zu therapieren, die mit einem gestörten Proteinabbau assoziiert sind. Hierzu zählen im Falle der erfindungsgemäßen Proteine im besonderen Anfallserkrankungen (Epilepsien) und neurodegenerative Erkrankungen wie cerebrale Ischämie, Morbus Parkinson, M. Huntington, M. Alzheimer oder ZNS Traumen.

Mutationen, die die Funktionsfähigkeit des A013 beeinträchtigen, können verschiedener Natur sein. Es kann sich dabei entweder um Mutationen größerer Bereiche oder um kleinere Veränderungen der Nukleinsäuresequenz handeln. Beispiele für beide Möglich­ keiten sind dem Fachmann vertraut und beinhalten unter anderem Deletionen, Insertionen, Inversionen, Rearrangements, die die Nukleinsäuresequenz von A013 betreffen, aber auch Basenaustau­ sche/Punktmutationen. Die Mutationen können den für die Protein­ sequenz kodierenden Bereich von A013 verändern. Dadurch kann es zu Veränderungen der Proteinsequenz (Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten) und damit zu neuen Eigenschaften des veränderten Proteines (Gain-of-function Mutation) kommen. Alternativ können Mutationen vorliegen, die die Regulation der Genexpression (Transkription, Translation, posttranslationelle Modifikationen) von A013 ver­ ändern. Diese Mutationen können den 5'- oder 3'-untranslatierten Bereich des A013 Genes betreffen, (flankierende) regulatorische Sequenzen (z. B. Promotoren, Intronische Sequenzen, Spleiss­ sequenzen, Enhancer, Silencer, Locus control regions, matrix attachment regions u. a.) verändern bzw. deletieren. Dysregulation der Expression kann auch zu hypomorphen Allelen von A013 führen. Es kann zu kompletter oder teilweiser Deletion, Insertion oder Rearrangement vom A013 Locus kommen, was zu einem Funktions­ verlust des Genes (Loss-of-function) führen würde. Weiterhin möglich sind Mutationen, die eine Benutzung von im Wildtyp-Allel nicht genutzten offenen Leserastern zur Folge haben. Chromosomale Mutationen können auch zur Rekombination neuer funktionaler Einheiten führen. Dabei kann ein Fusionstranskript aus Teilen von A013, rekombiniert mit einem zweiten Gen, entstehen. Dieses Fusionsgen kann für ein Protein mit neuen Eigenschaften kodieren. Alternativ kann die kodierende Sequenz des einen Fusionspartners (z. B. ohne selbst in der Sequenz verändert zu sein) unter die Kontrolle von regulatorischen Elementen des zweiten Partners geraten.

Es ist, mit dem Fachmann geläufigen Methoden, ohne weiteres möglich, Mutation im A013 Gen-Locus zu identifizieren und zu charakterisieren. Dabei wird man üblicherweise genomische DNA von den zu untersuchenden Patienten gewinnen. Die DNA von betroffenen Individuen wird dann auf Mutationen im A013 Locus untersucht, die in Proben gesunder Kontrollpersonen nicht (oder nicht in der Häufigkeit) vorkommen. Dazu wird die zu untersuchende genomische Region entweder in geeignete Vektoren kloniert, isoliert und anschliessend analysiert oder aber mittels PCR direkt ampli­ fiziert und analysiert. Gängige Analysemethoden sind beispiels­ weise Detection of Single Stranded Conformation Polymorphismus (= SSCP) oder die direkte Sequenzierung von amplifizierten PCR-Produkten.

Mit Methoden, die dem Fachmann geläufig sind (s. o.), ist es ohne weitere Voraussetzungen möglich, die Mutationen im A013 Gen, welches sich auf Chromosom 14 befindet (A013 Exon 1 enthalten in AL049875: BAC R-111A21 of RPCI-11 library from chromosome 14 of Homo sapiens), zu identifizieren.

Über Strukturanalysen des(r) erfindungsgemäßen Proteins(e) lassen sich gezielt Substanzen finden, die eine spezifische Bindungs­ affinität aufweisen.

Die beschriebenen Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und/oder SEQ ID NO: 5 ermöglichen, mit Hilfe des Two-Hybrid Systems oder anderen Assays, die für die Interaktion verantwortlichen Amino­ säuren einzugrenzen und Substanzen zu finden, mit denen die Interaktion zwischen den beiden Proteinen beeinflusst werden kann.

Dies ermöglicht ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität zum erfindungsgemäßen Protein­ heteromer bzw. Protein, das folgende Schritte umfasst:

• a) Herstellung eines Proteins mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz oder eines Proteinkomplexes enthaltend das Protein mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, der Expressionskassette oder des Vektors in einem eukaryontischen oder prokaryontischen Organismus.
• b) Inkubation des oder der Proteine mit der zu tastenden Substanz.
• c) Detektion der Bindung der zu testenden Substanz an das Protein.

Die Detektion der Bindung erfolgt durch Messen der Antagonisierung oder Agonisierung der A013-Aktivität oder durch Messen der physiologischen Wirkung von A013.

Substanzen, die nach dem oben genannten Verfahren gefunden werden, sind Gegenstand der Erfindung.

Weitere Ausgestaltungsformen der Erfindung sind ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Interaktion von Liganden mit dem erfindungsgemäßen Proteinheteromer oder den erfindungs­ gemäßen Proteinen hemmen oder verstärken oder ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Interaktion der erfindungs­ gemäßen Proteine mit Proteinen wie beispielsweise Skp1 oder anderen Interaktionspartnern hemmen oder verstärken. Die Inter­ aktion von Proteinen mit den erfindungsgemäßen Aminosäuren lässt sich zum Beispiel mit Hilfe des Two-Hybrid Systems oder durch biochemische Verfahren wie zum Beispiel durch Ko-Immun­ präzipitation detektieren.

Weiterhin lassen sich die Verfahren durch Expression der Proteine in eukaryontischen Zellen und Verknüpfung mit einem Reporter- Assay für die Aktivierung des A013-Proteins durchführen.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Proteinen mit der erfindungs­ gemäßen Aminosäuresequenz unter Benutzung von spezifischen Agonisten oder Antagonisten. Dabei wird die A013-Ligandenbindung zur Detektion ausgenutzt.

Über Antikörper kann die Proteinaktivität oder Menge der erfindungsgemäßen Proteine bestimmt werden. Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Quanti­ fizierung der Proteinaktivität oder Menge des erfindungsgemäßen Proteins mit den Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 und/oder SEQ ID NO: 6 oder seiner funktionellen Äquivalente oder Homo­ logen.

Die regulatorischen Sequenzen der erfindungsgemäßen Nuklein­ säuren, insbesondere der Promotor, die Enhancer, Locus Control Regions und Silencer oder jeweilige Teilsequenzen davon können für die gewebespezifische Expression von A013 und weiteren Genen verwendet werden. Damit ergibt sich die Möglichkeit, eine Genexpression von Nukleinsäurekonstrukten unter Verwendung des A013-Promotors im Gyrus Dentatus durchzuführen.

Um ein DNA-Fragment zu isolieren, das die Bereiche enthält, die die Transkription der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen regulieren, wird zunächst der Bereich vor dem Transkriptionsstart mit einem Reportergen wie z. B. (β-Galactosidase oder GFP (Green Fluorescent Protein)) verknüpft und in Zellen oder in transgenen Tieren wie z. B. Mäusen daraufhin getestet, ob er zu dem für Sequenz SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 spezifischen Expressionsmuster führt (Ausubel et all., (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York). Da sich cis-regulatorische Sequenzen u. a. auch in sehr großer Entfernung von der Startstelle der Transkription befinden können, ist es vorteilhaft, wenn man sehr große genomische Bereiche in die Analyse einschließt. Zur Klonierung kann es vor­ teilhaft sein, Vektorsysteme mit sehr hoher Klonierungskapazität, wie z. B. BACs oder YACs (Bacterial artificial chromosome, yeast artificial chromosome) zu benutzen. Dabei kann das Reportergen über homologe Rekombination in den Vektor inseriert werden und auf seine Expression hin untersucht werden (siehe z. B. Hiemisch et al., 1997, EMBO J. 16: 3995-4006). Mittels geeigneter Deletionen im Konstrukt und anschliessender Untersuchung der Auswirkungen auf die Expression des Reportergenes können wichtige regulatorische Elemente identifiziert werden (siehe z. B. Montoliu et al., 1996, EMBO J. 15: 6026-6034). Die regulatorischen Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, insbesondere der Promotor, die Enhancer, locus control regions und silencer oder jeweilige Teilsequenzen davon können für die gewebespezifische Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und weiteren Genen verwendet werden. Damit ergibt sich die Möglichkeit, eine vorwiegende Genexpression im Gyrus dentatus von Nukleinsäure­ konstrukten durchzuführen. Das Konstrukt mit den regulatorischen Sequenzen kann mit anderen cDNAs verknüpft werden, um Tier­ modelle zu erstellen, in denen die jeweilige cDNA regionen­ spezifisch exprimiert wird (siehe beispielsweise J. Oberdick et al., 1990, Science 248: 223-226). Dabei kann es sich auch um die Expression von Sequenz-spezifischen DNA-Rekombinasen wie CRE-Rekombinase, FLP-Rekombinase oder deren Derivate handeln.

Ausgehend von den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6, ihre funktionellen Äquivalenten oder Homologen können synthetische Peptide generiert werden, die als Antigene für die Produktion von Antikörpern ein­ gesetzt werden. Es ist auch möglich, das Polypeptid oder Bruch­ stücke davon zur Generierung von Antikörpern einzusetzen. Mit Antikörpern sind sowohl polyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper oder Fragmente davon, single chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper ge­ meint. Unter erfindungsgemäßen Antikörpern oder deren Fragmente sind prinzipiell alle Immunoglobulinklassen wie IgM, IgG, IgD, IgE, IgA oder ihre Subklassen wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen zu verstehen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgG₁, IgG₂, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃ oder IgG_M. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgG₁/κ oder IgG_2b/κ. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei dem Antigen komplemen­ tären Bindungsstellen, wie Antikörperteile mit einer den Anti­ körper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂-Fragmente oder Einzel­ strangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrang­ fragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂. Diese Fragmente können beispielsweise auf enzymatischem Wege durch Abspaltung des Fc-Teils der Antikörper mit Enzymen wie Papain oder Pepsin, durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden. Auch genmanipulierte nicht- verkürzte Fragmente können vorteilhaft verwendet werden. Die Antikörper oder Fragmente können allein oder in Mischungen verwendet werden.

Die Antikörpergene für die gentechnischen Manipulationen lassen sich in einer dem Fachmann bekannten Weise beispielsweise aus den Hybridomzellen isolieren [Ausubel et al. (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, (New York); Harlow and Lane (eds), 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (New York)]. Dazu werden Antikörper- produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zell-Lyse mit Guanidinium­ thiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopropanol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannter Weise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Reversen Transkriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die synthetisierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation beispielsweise durch "site directed mutagenesis", Einführung von Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustausche in geeignete tierische, pilz­ liche, bakterielle oder virale Vektoren inseriert und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimiert werden. Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu-Vektoren zur Klonierung der Gene und die Expression in Bakterien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisiae.

Spezifische Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Proteine können sich sowohl als diagnostische Reagenzien als auch als Therapeutika bei Krankheitsbildern, die u. a. durch Veränderungen an Neuronen des Gyrus dentatus charakterisiert sind, eignen.

Weiterhin können die cDNA, die genomische DNA, die regulatori­ schen Elemente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, als auch das Polypeptid, sowie Teilfragmente davon in rekombinanter oder nichtrekombinanter Form zur Ausarbeitung eines Testsystems verwendet werden. Dieses Testsystem ist geeignet, die Aktivität des Promotors oder des Proteins in Anwesenheit der Testsubstanz zu messen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um einfache Mess­ methoden (kolorimetrische, luminometrische, auf Fluoreszenz beruhende oder radioaktive), die die schnelle Messung einer Vielzahl von Testsubstanzen erlauben (Böhm et al., 1996, "Wirk­ stoffdesign", Spektrum Verlag, Heidelberg). Die beschriebenen Testsysteme erlauben das Durchsuchen von chemischen oder bio­ logischen Bibliotheken nach Substanzen, die agonistische oder antagonistische Wirkungen auf die erfindungsgemäßen Proteine oder auf einen Komplex, bestehend aus mindestens einem der erfindungs­ gemäßen Proteine und einem weiteren Protein (z. B. Skp1) haben.

Ein alternativer Weg zur Entwicklung von Wirkstoffen, die an A013 angreifen, besteht im rationalen Drug Design (Böhm et al., 1996, "Wirkstoffdesign", Spektrum Verlag, Heidelberg). Hierbei wird die Struktur oder eine Teilstruktur der in Anspruch 1 dargestellten Proteine, soweit sie vorliegt, oder ein von Computern erstelltes Strukturmodell, benutzt, um mit Unterstützung von Molecular Modelling Programmen Strukturen zu finden, für die sich eine hohe Affinität an A013 vorhersagen lässt. Diese Substanzen werden dann synthetisiert und getestet. Hochaffine, selektive Substanzen werden auf ihre Verwendung als Medikamente gegen Erkrankungen wie Epilepsien, Ischämie, Morbus (= M.) Alzheimer und verwandte Dementia, M. Parkinson, Amyotrophe Lateral Sklerose, M. Huntington, Multiple Sklerose und andere neuro­ degenerative Erkrankungen getestet werden.

Die Bestimmung von Menge, Aktivität und Verteilung von den erfindungsgemäßen Proteinen, seinen funktionellen Äquivalenten oder Homologen oder der zugrundeliegenden mRNA im menschlichen Körper kann zur Diagnose, Erfassung der Prädisposition und zum Monitoring bei bestimmten Erkrankungen dienen. Desgleichen können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen sowie der genomischen DNA zu Aussagen über genetische Ursachen und Prädispositionen bestimmter Erkrankungen herangezogen werden. Dazu können sowohl DNA/RNA-Proben als auch Antikörper verschiedenster Art benutzt werden. Dabei dient die beschriebene Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 oder Teile davon in Form geeigneter Proben zur Aufdeckung von Punktmutationen oder Deletionen/Insertionen/Rearrangements.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und/oder SEQ ID NO: 5, ihre funktionellen Äquivalente, Homologe oder Derivate, die von ihren kodierten Proteinen mit den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen oder das erfindungsgemäße Proteinheteromer (Proteinkomplex) mit einem der in Beispiel 1, 2 oder 2 dargestellten Proteine sowie davon abgeleitete Reagenzien (Oligonukleotide, Antikörper, Peptide) können zur Diagnose und Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen verwendet werden.

Weiterhin kann ein Monitoring der Behandlung von Erkrankungen durchgeführt werden. Dies betrifft z. B. die Verlaufsbeurteilung von Krankheiten, die Beurteilung von Therapieerfolgen und die Graduierung einer Krankheit.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfasst:

• a) Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge an erfindungsgemäßer Nukleinsäure oder einer bekannten Menge an Oligonukleotiden, die als Primer für eine Amplifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure geeignet sind,
• b) Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäure durch spezifische Hybridisierung oder PCR-Amplifikation,
• c) Vergleich der Menge an hybridisierender Nukleinsäure oder an durch PCR Amplifikation gewonnener Nukleinsäure mit einem Mengenstandard.

Ausserdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis eines erfindungsgemäßen Protein­ heteromers oder eines erfindungsgemäßen Proteins in einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfasst:

• a) Inkubation einer biologischen Probe mit einem Antikörper, der spezifisch gegen das Proteinheteromer oder gegen das erfindungsgemäße Protein gerichtet ist,
• b) Nachweis des Antikörper/Antigenkomplexes,
• c) Vergleich der Mengen des Antikörper/Antigenkomplexes mit einem Mengenstandard.

Als Standard wird üblicherweise eine biologische Probe aus einem gesunden Organismus entnommen.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren, das einen oder mehrere der unten genannten Schritte zum Auffinden von Substanzen umfasst, die spezifisch an ein Protein mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz binden oder an einen Proteinkomplex, der min­ destens ein erfindungsgemäßes Protein und mindestens ein weiteres Protein enthält, das mit dem erfindungsgemäßen Protein inter­ agiert:

• a) Herstellung eines Proteins mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz oder eines erfindungsgemäßen Protein­ komplexes durch Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, einer Expressionskassette oder eines Vektors in einem eukaryontischen oder prokaryontischen Organismus,
• b) Inkubation des erfindungsgemäßen Proteins oder des Protein­ komplexes mit der zu testenden Substanz oder den zu testenden Substanzen,
• c) Detektion der Bindung der zu testenden Substanz an das Protein mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz oder an den Proteinkomplex bzw. eines Effektes auf die Rezeptor­ funktion.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an das erfindungsgemäße Protein oder den Proteinkomplex binden und dadurch hemmende oder aktivierende funktionelle Effekte auf die Funktion des A013 bevorzugt in Neuronen hervorrufen.

In Situationen, in denen ein Mangel an der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins oder des Proteinkomplexes herrscht, können mehrere Methoden zur Substituierung eingesetzt werden. Zum einen kann das Protein, natürlich oder rekombinant direkt, oder durch geeignete Massnahmen in Form seiner kodierenden Nukleinsäure (d. h. DNA oder RNA) appliziert werden. Dazu können sowohl virale, als auch nichtvirale Vehikel zum Einsatz kommen. Ein weiterer Weg bietet sich durch die Stimulation des endogenen, körpereigenen Gens durch geeignete Substanzen. Solche Substanzen lassen sich beispielsweise auffinden, indem man ihre Wirkung auf die Transkriptionselemente des A013-Gens ermittelt.

In Situationen, in denen ein Überschuss an Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins oder Proteinkomplexes herrscht, können spezifische, synthetische oder natürliche, kompetitive und nicht- kompetitive Antagonisten gegen das Protein, oder Antikörper oder Antikörperfragmente gegen das Protein oder gegen das Protein­ heteromer eingesetzt werden. Des weiteren kann sowohl durch Anti­ sense Moleküle oder Ribozyme oder Oligonukleotide als auch durch niedermolekulare Verbindungen eine Inhibition der A013-Aktivität bzw. der Aktivität des Proteins erreicht werden. Als Antisense Moleküle werden vorteilhaft kurze Nukleinsäurefragmente von 15 bis 100 Nukleotide, bevorzugt von 15 bis 40 Nukleotide, besonders bevorzugt von 15 bis 25 Nukleotide verwendet.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder daraus abgeleitete komplementäre Nukleinsäuresequenzen können zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen vorteilhaft von Ischämie, die durch Modulation der Genexpression von A013 positiv beeinflusst werden können, verwendet werden. Ebenso verwendet werden können erfindungsgemäße Proteine, Proteinfragmente oder Peptide oder Teile davon. Die Erfindung betrifft ebenso die Ver­ wendung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten oder Antikör­ pergemischen gegen das erfindungsgemäße Protein oder gegen das Proteinheteromer zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Modulation der Aktivität oder Menge von A013 Protein positiv beeinflusst werden können. Substanzen, die spezifisch an das erfindungsgemäße Protein, bzw. die erfindungsgemäßen Proteine bzw. den Proteinkomplex binden, können zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Modulation der Aktivität oder Menge von A013 Protein positiv beeinflusst werden können, verwendet werden. Bei den genannten Erkrankungen kann es sich im weitesten Sinne um neurodegenerative Erkrankungen wie Epilepsien, Ischämie, Demenz, M. Parkinson, M. Huntington, M. Alzheimer oder ZNS Traumen. Bevorzugt handelt es sich um Krankheiten wie Epilepsien, cerebrale Ischämie, M. Alzheimer oder ZNS Traumen.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen auch in Form therapeutisch oder diagnostisch geeigneter Fragmente exprimiert werden. Zur Isolierung des rekombinanten Proteins können vorteilhaft Vektorsysteme oder Oligonukleotide verwendet werden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide kodieren, die einer einfach­ eren Reinigung dienen. Als solche Anker sind beispielsweise sogenannte Tags in der Literatur bekannt (z. B. der Hexa-Histidin-Anker) oder Epitope, die als Antigene verschiedener Antikörper erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow & Lane (eds), 1988, Antibodies: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger wie an einer polymeren Matrix, die bei­ spielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einen sonstigen Träger verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem üblich Marker wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmarker, die nach der Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktions­ produkt bilden, oder ein radioaktiver Marker allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auch als Marker für humane oder tierische Erbkrankheiten oder zur Gentherapie verwendet werden.

Die Bestimmung von Menge, Aktivität und Verteilung des erfindungsgemäßen Proteins oder seiner zugrundeliegenden mRNA im menschlichen Körper kann zur Diagnose, Prädisposition und zum Monitoring bei bestimmten Erkrankungen diene. Desgleichen kann die Sequenz der cDNA sowie der genomischen Sequenz zu Aus­ sagen über genetische Ursachen und Prädispositionen bestimmter Erkrankungen herangezogen werden. Dazu können sowohl DNA/RNA-Proben, sowie unnatürliche DNA/RNA-Proben, als auch Antikörper verschiedenster Art benutzt werden. Dabei dient die beschriebene Nukleotidsequenz oder Teile davon in Form geeigneter Proben zur Aufdeckung von Punktmutationen oder Deletionen/Insertionen.

Beschrieben werden in den folgenden Beispielen die A013 cDNA Sequenz der Ratte (SEQ ID NO: 1), die humane Form (SEQ ID NO: 3), sowie Teile der genomischen Sequenz der Maus (SEQ ID NO: 5). Die korrespondierenden A013 Aminosäuresequenzen der Ratte, des Menschen und der Maus sind unter SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 bzw. SEQ ID NO: 6 aufgeführt.

Beispiele

Soweit nicht anders angegeben wurde bei der experimentellen Durchführung entsprechend den Vorschriften in "Ausubel et al. (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York" und "Sambrook et al. (eds.), 1989, Molecular cloning: A laboratory manual. CSH Laboratory Press, New York" verfahren.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 Entwicklungsspezifische Expression bei der Ratte (in situ Hybridisierung)
Sagittalschnitte eines Rattenembryos und von Ratten­ hirnen (Tag: P4 und P7)
Links sind die in situ Hybridisierungen mit einer rA013-Antisense Sonde und rechts die entsprechende Färbung mit Kresylviolett dargestellt (Amy: Amygdala; Cere: Cerebellum; Ent: Entorhinaler Cortex; Hi: Hippocampus; Olf: Bulbus Olfactorius; Pir: Cortex Piriformis; Tha: Thalamus).

Fig. 2 Northern-Blot Analyse: Gewebespezifische Expression bei der Ratte
Northern Blot Analyse verschiedener Rattengewebe
Die stärkste rA013 Expression zeigt sich im Gehirn.
Es wurde mit S26 (ribosomales Protein der kleinen Untereinheit) normalisiert (mm: mus musculus).

Fig. 3 Northern Blot Analyse: Gewebespezifische Expression beim Menschen
Northern-Blot Analyse verschiedener humaner Gewebe
Die stärkste A013-mRNA Expression findet sich nach Normalisierung mit S26 (Protein der kleinen ribosomalen Untereinheit) in Placenta und Hirn.

Fig. 4 In situ Hybridisierung: Hirnschnitte (nach Kainatgabe)
In situ Hybridisierungen mit rA013-Antisense Sonde an adulten Rattenhirnschnitten (Ctx: Cortex; GD: Gyrus dentatus; Hi: Hippocampus; CA1, 2: CA1 und CA2 Felder des Hippocampus).

Fig. 5 Subzelluläre Lokalisation (Immunfluoreszenz-Analyse von COS-1 Zellen)
Nukleäre Lokalisation von A013: A013-myc-His wurde mit einem anti-myc Antikörper sowie einem Cy3-konjugierten Sekundär-Antikörper detektiert.

Fig. 6 Schematische Darstellung der A013 Domänenstruktur.

Fig. 7 Homologievergleich: A013 F-Box Domäne mit F-Box Motif (aus PFAM Datenbank)
Eine Pfam Datenbank Recherche ergab eine Homologie von A013 zu F-Box Proteinen. Stark konservierte Aminosäuren dieses Motivs sind grau unterlegt. In A013 und im F-Box Motiv übereinstimmende Aminosäuren sind durch (:) und ähnliche Aminosäuren durch (.) gekennzeichnet.

Fig. 8 Ubiquitinierungspathway (schematisch)
Die Komponenten des E3 Ligase Komplexes sind hellgrau unterlegt (E1: Ubiquitin aktivierendes Enzym; E2: Ubiquitin konjugierendes Enzym; E3: Ubiquitin-Ligase (dunkelgrau dargestellt); Hier bestehend aus: SCF-Komplex: Skp1-Cullin1 - F-Box Protein. Skp1: S-phase kinase associated Protein 1; Cull1: Cullin 1; Ub: Ubiquitin).

Fig. 9 Western Blot Analyse: A013 Antikörper
Gegen den Bereich von Aminosäure 95-184 des rA013 wurden polyklonale Antikörper hergestellt und mittels Western Blot Analyse getestet. Es wurden Zellextrakte von A013-myc-His transfizierten Zellen und der ent­ sprechenden Vektorkontrolle verwendet. Gezeigt sind die Signale für einen käuflichen anti-myc Antikörper, das Präimmunserum und das erhaltene A013-Immunserum. Das A013-Immunserum zeigt eine spezifische Bande der erwarteten Größe von ca. 60 kDa.

Fig. 10 A013 Knock out Konstrukt (schematisch)
Dargestellt ist die Klonierungsstrategie zur Her­ stellung von A013 Knock-Out Mäusen. Ala Homologiearme wurden die genomischen Fragmente entsprechend der Position 1-1148 und 1760 bis 7425 der SEQ ID NO: 3 in den Vektor pHM2 kloniert. Mittels homologer Rekombination wird das Exon 1 des A013 Gens durch das lacZ-Reportergen ersetzt.

Fig. 11 Induktion der A013 mRNA Expression durch globale Ischämie in Verbindung mit einer Präkonditionierung durch 3-NPA
Induktion der A013 mRNA Expression im Hippocampus nach globaler Ischämie hervorgerufen durch beid­ seitige Okklusion der Carotis interna. Die für globale Ischämie und nach vorheriger Präkonditionierung mit NPA erhaltenen A013 mRNA Expressionslevel wurden auf Sham operierte Tiere normalisiert. (V: Vehikel (0,9% NaCl); I: Ischämie; NPA: 3-Nitro-Propionsäure).

Sequenzanalysen Beispiel 1 Ermittlung der A013 cDNA Sequenz der Ratte

In einem Screening auf neuronal exprimierte IEGs wurden 10 neue IEGs identifiziert (beschrieben in der Patentschrift WO 99/40225: Worley et al., 1999). In diesem Screening wurde auch der EST-Klon A013 identifiziert und die Sequenzinformation von 611 bp aus dem 3' untranslatierten Bereich erhalten.

Zum Erhalt der Sequenzinformation des offenen Leserasters wurde eine Hippocampus gen Bibliothek (von Ratten nach MECS- Stimulation und Gabe von Cycloheximid; oligo(dT) deprimed, in UniZAP, Stratagene) mit dem oben genannten A013 cDNA Fragment als Sonde unter Standardbedingungen durchmustert. Die in der Hybridisierung positiven Klone wurden vereinzelt, subkloniert und einer Sequenzanalyse unterzogen. Hierbei wurde die Nukleinsäure­ sequenz SEQ ID NO: 1 für das A013 der Ratte erhalten. Der ORF kodiert für ein Protein von 563 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2).

Beispiel 2 Ermittlung der humanen A013 cDNA Sequenz

Mit SEQ ID NO: 1 wurden mittels BLAST [BLASTN 2.0.11, Atschul et al., (1997), Nucleic Acid Res, 25, 3389-3402] verwandte ESTs in Ratte und Mensch ermittelt. Aus dem humanen EST AI608739 wurde der 3'-Primer 5'-ACAATAGAGCAGCCAGGTCTC-3' abgeleitet. Als 5'-Primer wurde der Sequenzabschnitt 5'-CTGCATGCACCTGTTTCACTG-3' aus dem kodierenden Bereich der Ratten-cDNA als Primer ver­ wendet. Mit den genannten Pimern wurde mittels PCR mit humaner Hippocampus cDNA als Template ein 2,4 kb großes PCR-Fragment amplifiziert. Mit diesem Fragment als Sonde wurde eine humane Hippocampus cDNA Bibliothek (oligodT und random geprimed, in Lambda ZAP, Stratagene) unter Standardbedingungen durchsucht. Die in der Hybridisierung positiven Klone wurden vereinzelt, subkloniert und einer Sequenzanalyse unterzogen. Hierbei wurde die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 3 für das humane A013 erhalten. Der ORF kodiert für ein Protein von 555 Aminosäuren (SEQ ID NO: 4).

Beispiel 3 Ermittlung genomischer A013 Sequenzen der Maus

Aus dem murinen A013 cDNA-Klon (A013/17; enthält die vollständige cDNA Sequenz der Ratte) wurde mit Hilfe des Restriktionsenzyms XhoI ein 2,5 kb langes Fragment isoliert, dass den Hauptteil des kodierenden A013-Bereich enthält. Dieses Fragment wurde radio­ aktiv markiert und zur Hybridisierung einer genomischen Cosmid-Bibliothek der Maus (129/Ola, RZPD, Berlin) eingesetzt. Mit Hilfe eines Southernblot konnten sechs positive Klone ermittelt werden (A3, B5, B6, C3, C6, D1). Durch Hybridisierung mit einem ein 600 bp langes NotI/XhoI-Fragment aus dem murinen A013 cDNA Klon (A013/17) konnte festgestellt werden, dass zwei der sechs Cosmid-Klone auch das 5'-Ende des A013 Gens enthalten. Diese Klone wurden mittels verschiedener Restriktionsschnitte und Hybridisierungen mit A013-Sonden verifiziert.

Aus dem A013-Cosmid C3 (MPMGc121B13681Q2) wurde ein 10 kb langes Fragment in einen Plasmidvektor subkloniert und mittels eines Transposon-Insertionsverfahrens (GPS-1, New England Biolabs, Beverly, MA; USA) sequenziert, und die Sequenzen mit dem Programm SeqMan (Lasergene, Madison, WI, USA) verglichen. Durch Sequenz­ vergleich mit der murinen A013 cDNA Sequenz wurde festgestellt, dass nur das erste Exon der A013 cDNA auf dem genomischen Fragment lokalisiert ist. Die erhaltene genomische Sequenz von A013 der Maus sind in SEQ ID NO: 5 dargestellt. Die korrespondierende Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO: 6 wiedergegeben.

Expressionsanalysen Beispiel 4 Gewebe- und Entwicklungsspezifische Expression von A013

Als Template für in situ Hybridisierungen wurde ein Konstrukt verwendet, das die rA013 cDNA über EcoRI und XhoI-Linker in dem Vektor pBlueSkript (pBS) enthielt. Zur Herstellung der Anti-Sense-Sonde wurde das Plasmid mit AccI linearisiert, wodurch bei der Transkription ein 1585 bp grosses A013 cRNA Fragment entstand. Für die Synthese der Sense-Sonde wurde das Plasmid mit StyI linearisiert, dies führte zu einem 1107 bp langen rA013-cRNA-Fragment. Von diesen Templates wurden A013-spezifische Sense und Antisense cRNA Proben mit Hilfe von T3 RNA Polymerase und T7 RNA Polymerase, Digoxigenin-markierten UTP und Standard NTPs hergestellt. Von tiefgefrorenen Rattenhirnen und Embryos wurden bei -20°C in 15 µm dicke Schnitte am Cryostat (Leica GmbH) angefertigt, mit 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert, in 0,2% Triton-X 100 permeabilisiert und mit Antisense und Sense A013 cRNA Proben bei 65°C über Nacht in 50% Formamid, 5 × SSC hybridisiert. Die Schnitte wurden mit 0,2 × SSC bei ver­ schiedenen Temperaturen gewaschen und das Dioxigeninlabel mit einem spezifischen Antikörper detektiert (Kuner et al., 1999, Science, 283: 74-77).

In situ Hybridisierungen (Embryo-Tag 19; Fig. 1) und Northern Blot Analysen von Rattenhirnen verschiedener Altersstufen (Embryo-Tag 9.5 bis adult; nicht abgebildet) zeigten, dass rA013 sowohl embryonal wie auch im adulten Stadium (nicht abgebildet) kaum exprimiert ist. Wohingegen A013 während der postnatalen Ent­ wicklung (In situ Hybridisierungen von Tag 4 und Tag 7) im Hippo­ campus, im Cerebellum, im temporalen, paritalen und entorhinalen Cortex, in der Amygdala, im Striatum, im Bulbus olfactorius sowie im Hirnstamm nachweisbar ist.

Northern-Blot Analysen verschiedener Gewebe von adulten Ratten (Gehirn, Leber, Lunge, Herz, Niere, Skelettmuskel, Intestinum, Testis) zeigten keine signifikante Expression der A013 mRNA.

Die A013 mRNA war nur in sehr geringem Masse für Gehirn, Lunge, Niere und Intestinum nachweisbar. Die Größe der detektierten A013 mRNA war in allen Organen etwa 4,0 kb (Fig. 2).

Darüber hinaus wurde das A013 mRNA Expressionsmuster in humanen Geweben analysiert. Dafür wurde ein Blot mit poly(A)+ RNA von 12 verschiedenen Organen (Clontech) mit radioaktiven Sonden für rA013 und S26, einem ribosomalen Protein der kleinen Unter­ einheit, nach Standardverfahren hybridisiert. Auch hier wurden insgesamt nur Signale von sehr schwacher Signalstärke für Gehirn, Placenta, Niere und Herz erhalten. Die Größe der detektierten humanen A013 mRNA betrug ebenfalls etwa 4,0 kb (Fig. 3).

Beispiel 5 Expressionsanalyse von A013 nach Applikation von Kainat, PTZ und nach globaler Ischämie

Die Expression der A013 mRNA wird nach krampfauslösenden Stimuli wie multipler MECS unter Gabe von Cycloheximid sowie nach Gabe von konvulsiven Dosen von Kainat stark induziert [Cole et al., 1990, J. Neurochem. 55 : 1920-1927; Worley et al., 1993, J. Neurosci 13: 4776-4786; Lanahan and Worley, 1998, Neurobiol. Learn. Mem. 70: 37-43; WO 99/40225: Worley et al., 1999]. In diesem Experiment wurde untersucht, ob die A013 mRNA Expression auch bei anderen neurodegenerativen Prozessen, wie beispielsweise nach globaler Ischämie, induziert wird.

Zur Durchführung des globalen Ischämie Modells wurde die Methode von Brambrinck et al. verwendet (1999, J. Neurosci, Methods 92: 111-122). Dabei wird über bilaterale Ligation der A. coarotis interna und gleichzeitige systemische Hypotonie mit Hilfe einer Vakuumkammer eine cerebrale Ischämie für eine Dauer von 3 bis 5 Min. herbeigeführt. Eine Präkonditionierung wird hierbei durch den Einsatz von 3-NPA erzielt. Dabei werden 20 mg/kg 3-NPA intraperitoneal appliziert (24 h vor Herbeiführung der globalen Ischämie). Dies führt zu einer relativen Protektion von Neuronen in der CA1-Region des Hippocampus. RNA-Aufreinigung und cDNA-Herstellung erfolgten nach Standardmethoden (siehe Brambrinck et al., 2000, J. Cereb Blood Flow Metab, in press). Zur Quanti­ fizierung des A013-mRNA-Levels wurde eine quantitative PCR- Methode verwendet (Lightcycler, Roche Diagnostics). Dabei wird die Amplicon-Anreicherung (Bez. für die generierten PCR-Produkte) durch die Einlagerung von SYBR-Green in doppelsträngige DNA nach­ gewiesen, und kann online gemessen werden. Zur Amplifikation der A013-mRNA wurden die folgenden Primer verwendet:
rA013-5'-pos.851: CTGCATGCACCTGTTTCACTG
rA013-3'-pos.1215: ACAATAGAGCAGCCAGGTCTC.

Zur Standardisierung der cDNA-Proben wurden 3 verschiedene House-Keeping Gene verwendet (GAPDH, Cyclophilin, S20). Der A013 mRNA-Gehalt wurde bei allen Bestimmungen aus mindestens 3 seriellen Verdünnungen ermittelt. Hierbei zeigte sich eine ca. 2-fache Induktion von A013 durch globale Ischämie (3 h post Ischämie) im Vergleich zu Sham-operierten Ratten. In Tieren, die zusätzlich vor der Ischämie mit 3-NPA behandelt wurden, zeigte sich eine ca. 5-fache Induktion gegenüber Sham-behandelten Tieren. Eine Kontrollversuch an Sham-operierten Tieren, bei dem ausschließlich 3-NPA appliziert wurde, zeigte ebenfalls eine ca. 3-fachen Anstieg des A013 mRNA Levels im Vergleich zu Sham-Ratten. 3-NPA führt eine geringgradige zelluläre Hypoxie durch Inhibierung der Succinat-Dehydrogenase herbei. Möglicherweise induziert 3-NPA daher über eine indirekte Generierung von reaktiven Sauerstoff­ spezies die Transkription des A013 Gens.

Es wurde darüberhinaus mittels in situ Hybridisierungen unter­ sucht, in welchen Hirnregionen bei neuronaler Übererregung eine Induktion der A013 mRNA Expression erfolgt. Eine Applikation von Kainat (gilt als Tiermodell für Temporallappen-Epilepsie) führte innerhalb von 90 Minuten zu einer massiven Induktion der A013 mRNA Expression in den Zellkörpern des Gyrus dentatus. Darüber hinaus war eine schwach erhöhte Expression in den Pyramidalzellen des CA1 Bereiches und im Cortex nachweisbar (Fig. 4). Nach Injektion von Pentylentetrazol (PTZ) war innerhalb von 20 Minuten ebenfalls eine schwache Induktion der A013 mRNA Expression im Hippocampus in den Regionen des Gyrus dentatus sowie im CA1 und CA2 Bereich nachweisbar (Fig. 4). Die A013 mRNA Expression war überwiegend auf diese Hirnregion beschränkt, die eine wichtige Rolle für Lernvorgänge, Gedächtnis, synaptische Transmission und neuronale Plastizität spielt.

Protein-Expressionsstudien Beispiel 6 Subzelluläre Lokalisation von A013 in Säugetierzellen

Für subzelluläre Lokalisationsstudien wurde rA013 mit einem carboxyterminalen c-Myc-Tag versehen, heterolog in Säugetier­ zellen exprimiert und anschliessend durch Immunfluoreszenz Analyse die Lokalisation des überexprimierten Proteins ermittelt.

Der kodierende Bereich der rA013 cDNA wurde in den Vektor pcDNA3.1/Myc-His A (Invitrogen) kloniert, welcher erlaubt, das gewünschte Genprodukt carboxyterminal mit einem c-myc-6xHis-Tag zu versehen. Dazu wurde ein mit den Primern rA013-5'-NotI-ATG und rA013-3'-HindIII-558 generiertes PCR-Fragment, das für die Aminosäuren 1-558 kodiert, sowie ein Oligonukleotid-Linker ver­ wendet, der für die restlichen 5 Aminosäuren kodiert und beide in den oben genannten Vektor kloniert.

PCR-Primer

rA013-5'-NotI-ATG: 5'-AGCTTCAGCGAAGACCATTT-3'
rA013-3'-HindIII-558: 5'-CTAGAAATGTCTTCGCTGA-3'.

Oligonukleotid-Linker

5'-AGCTTCAGCGAAGACATTT
AGTCGCTTCTGTAAAGATC-3'.

Für die Immunfluoreszenzstudien wurden COS-1 Zellen in High Glucose-DMEM Medium (Sigma Immunochemicals), 10% fötalem Kälber­ serum (Sigma Immunochemicals) auf 37°C, 8% CO₂ und 95%iger Luft­ feuchte kultiviert und gemäß der DEAE/Dextran-DNA-Transfektions­ methode mit pcDNA3.1-Myc/His-rA013 transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion der Zellen mit rA013-myc oder dem pcDNA3.1/Myc-His A Vektor wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit 3% Paraformaldehyd in PBS (Sigma Chemicals) zweimal für 15 min fixiert. Die Fixierung wurde durch zwei 15-minütige Inkubationen mit 50 mM NH₄Cl-PBS gestoppt. Die Zellen wurden 7 min mit 0,2% Triton-X-100 in PBS (Sigma Chemicals) permeabilisiert und anschließend mit 1% BSA in TBS (20 mM Tris-HCl; 20 mM NaCl; 0,5 mM KCl; 1 mM MgCl₂; 0,02% NaN₃; pH 9,0) für 30 min geblockt. Nach 1,5stündiger Inkubation mit einem monoklonalen anti-c-Myc Antikörper (Invitrogen) in 1% Blocking-Lösung bei Raumtemperatur wurden die Zellen dreimal je 5 min mit TBS gewaschen und für eine Stunde mit Cy3-markiertem anti-Maus Antikörper (Jackson Laboratories Inc.; 15 µg/ml in Blocking-Lösung) inkubiert.

Die Zellen wurden dreimal je 10 min mit TBS und dreimal mit 10 mM Tris-HCl, pH 7.6 gewaschen. Die Coverslips wurden anschließend mit wässrigem Mounting Medium (Sigma Chemicals) versiegelt. Die Präparate wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axiophot) mit einem Standardfilterset analysiert. Das rA013-myc wies eine nukleäre Lokalisation auf (Fig. 5). Das leere Kontrollplasmid zeigte keine spezifischen Signale (Fig. 5). Diese. Beobachtung steht im Einklang mit der Anwesenheit eines Kernlokalisations­ signals (PDGKKIK) in Aminosäureposition 238 bis 294 (Fig. 6) des rA013.

Beispiel 7 Identifizierung von A013 interagierenden Proteinen mittels Yeast Two-Hybrid Analyse (Y2H)

rA013 besitzt aminoterminal eine stark basische, Arginin-reiche Domäne (1-61 AS; Arg-Gehalt 35%; 51% basische AS), gefolgt von einer putativen F-Box-Domäne (AS 73-114) (Fig. 6). Von Aminosäure 177 bis 204 erstreckt sich ein putativer Leucin-Zipper, an den sich der hydrophobe Leucin-reiche C-Terminus des Proteins anschließt (Fig. 6). Weiterhin ist ein potentielles Kernlokalisationssignal (Aminosäuren 238-244) nachweisbar, das für den Transport von A013 in den Zellen verantwortlich sein könnte.

Yeast-Two-Hybrid Suche mit der putativen F-Box Domäne (AS 70 bis 114) des rA013

Das Two-Hybrid Screening wurde mit dem ProQuest™ Two Hybrid System von Gibco BRL durchgeführt. Dazu wurde die für die F-Box-Domäne des A013 Gens kodierende cDNA Fragment (SEQ ID NO: 1, Aminosäuren 70-114, SEQ ID NO: 2) mit den spezifischen A013 Primern A013-5'-Y2H-70 (5'-AGATGTCGACCGGCGCCGCGTCGCTGCCC-3') und A013-3'Y2H-114 (5'-ACTTTAGCGGCCGCTTAGAGCTGGGGCCACAGGGC-3') in einer PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) amplifiziert, und nach Restriktionsverdau mit den Enzymen NotI und SalI in den Vektor pDBleu (Gibco BRL) kloniert. Das hieraus entstandene Konstrukt pDBLeu-rA013(70-114 AS) kodiert für ein Fusionsprotein aus der GAL4-Bindungsdomäne, die C-terminal mit der F-Box Domäne des rA013 fusioniert ist.

Das erhaltene Konstrukt pDBLeu-rA013(70-114 AS) wurde in den Hefestamm Y190 transformiert. Für den transformierten Hefestamm wurde die Konzentration an 3-Aminotriazol (3AT) ermittelt, die zur Inhibition der basalen Expression des HIS3-Gens erforderlich ist. HIS3 kodiert für die Imidazol Glycerol Phosphat Dehydratase, ein Enzym der Histidin-Biosynthese. In Gegenwart von 3AT in der ermittelten Grenzkonzentration wird das Wachstum von Hefezellen, die keine Two-Hybrid Interaktionen aufweisen, unterdrückt.

Der pDBLeu-rA013(70-114 AS)-Hefestamm wurde mit einer Ratten- Hippocampus/Cortex cDNA Bibliothek von MECS stimulierten Ratten transformiert (siehe WO 99/40225: Worley et al., 1999). Als Vektorsystem für die cDNA Bank wurde der Vektor pPC86 (Gibco BRL) verwendet, dies ermöglicht die Expression als Fusionsprotein mit der GAL4-DNA-Aktivierungsdomäne.

Es wurden 5.10⁶ Transformanden auf Tryptophan/Leucin/Histidin-Mangelmedium mit entsprechender 3-AT Konzentration (20 mM 3AT) plattiert. Nach 3, 4 und 5 Tagen Wachstum bei 30°C wurden die Kolonien vereinzelt und einer X-GAL-Färbung unterzogen.

Insgesamt 25 Kolonien erwiesen sich als His3 und lacZ positiv. Aus den positiven Hefekolonien wurde die pPC86-Plasmid-DNA auf­ gereinigt und zur Amplifikation in den E. Coli Stamm XL1-Blue transformiert. Die pPC86-Plasmid-DNA der erhaltenen positiven Kolonien wurde mit verschiedenen pDBleu-Konstrukten in den Hefe­ stamm Y190 kotransformiert.

Nur in Kombination mit dem Konstrukt pDBLeu-rA013(70-114 AS) konnte eine Aktivierung der Reportergene His3 und lacZ bei allen 25 Kolonien festgestellt werden. Die positiven cDNAs aus dem Vektor pPC86 wurden mit den vektorspezifischen Primern pP 06512 00070 552 001000280000000200012000285910640100040 0002010046400 00004 06393C86a (5'-GTATAACGCGTTTGGAATCAC-3') und pPC86b (5'-GTAAATTTCTGGCAAGGTAGAC-3') amplifiziert und das erhaltene PCR-Fragment sequenziert.

In allen Fällen wurde Skp1 (S-phase-kinase-associated protein) (Bai et al., 1996, Cell, 86: 263-274) als Y2H-Interaktionspart ner des Ratten A013-Proteinfragments Aminosäuren (70-114) identifiziert.

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die putative F-Box-Domäne (Fig. 7) des A013 tatsächlich mit Skp1, dem Bindungspartner von F-Box-Proteinen im E3 Ubiquitin-Ligase-Komplex, interagiert (Fig. 8). Diese Ergebnisse lassen auf eine Funktion von A013 beim Ubiquitin-abhängigen Proteinabbau schließen, wobei A013 als F-Box Protein die Aufgabe zukommt, spezifische Proteinsubstrate zum E3-Ubiquitin-Ligase Komplex zu rekrutieren, die nach zellulärem Stress, wie er durch Krampfzustände, oder ischämische bzw. hypoxische Zustände ausgelöst wird, aus dem Zellstoffwechsel entfernt werden sollen.

Beispiel 8 Polyklonale Antikörper gegen A013 Protein

Zur Herstellung polyklonaler Antikörper gegen das A013 Protein der Ratte wurde ein 6x-His-A013 Fusionsprotein eingesetzt. Hierzu ein PCR-Fragment unter der Verwendung der Primer 5'-N-BamHI (5'-GCGGATCCTCGGCCTCCTGCTCGCACTGG-3') und 3'-N-HindIII (5'-CCCAAGCTTGGAGGAGTTGCAGGGC-3') generiert, das für die Aminosäuren 95 bis 184 kodiert und in den Expressionsvektor pQE30 (Qiagen) kloniert. Die Expression des A013-Fusionsproteins in E. coli wurde mit 200 µM IPTG für 5 Stunden bei 37°C induziert. Die Zellen wurden anschließend lysiert und das 6x-His-rA013(95-184 AS) mit einer 6 M Harnstofflösung extrahiert und mittels Nickel-Chelat-Affinitätschromatographie zur Homo­ genität aufgereinigt. Das Fusionsprotein wurde Kaninchen zur Antikörperproduktion injiziert (durchgeführt von der Firma Eurogentec). Das erhaltene Immunserum wurde mittels Western Blot Analyse auf eine spezifische Reaktion mit heterolog exprimiertem rA013 Protein getestet. Dazu wurden HEK293 Zellen mit einem rA013 Expressionskonstrukt, bestehend aus dem offenen Leseraster von rA013 fusioniert mit einem C-terminalen c-myc/His Tag, transient transfiziert. Die Zellen wurden nach 48 Stunden geerntet, lysiert und das Proteinextrakt in Triplikaten auf einem denaturierenden Proteingel aufgetrennt und geblottet. Eine Western Blot Analyse mit dem Immunserum ergab im Vergleich zum Präimmunserum ein spezifisches Signal der erwarteten Größe von ca. 60 kDa. (Fig. 9). In einer Kontrollreaktion, durchgeführt mit einem anti-myc Antikörper (Invitrogen), wurde eine Bande der gleichen Größe erhalten.

Beispiel 9 Herstellung von A013-transgenen Tieren

Die erhaltenen genomischen Sequenzen von A013 der Maus sind in Fig. 3 dargestellt. Durch die zielgerichtete Mutation des A013 Genes in der Keimbahn der Maus und die Analyse des resultierenden Phänotyps kann man wichtige weitere Informationen über die (patho)-physiologischen Mechanismen gewinnen, in denen das A013 Gen beteiligt ist. Zur Herstellung einer sogenannten Knock Out Maus, d. h. einer Maus ohne funktionelles A013 Protein, wurde zunächst ein sogenanntes Targeting-Konstrukt hergestellt.

Dabei wurden zwei den kodierenden Bereich von A013 flankierende genomische Fragmente (entsprechend Positionen 1 bp bis 1148 bp und 1760 bp bis 7425 bp) in der erfindungsgemäßen Sequenz (SEQ ID NO: 3) als Homologiearme für die homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen (Es) in den Vektor pHM2 (Kaestner et al., 1994, Gene 148: 67-70) kloniert. Dieser Vektor trägt eine Neomycin-Resistenzkassette und erlaubt das Einsetzen eines Reportergenes in das zu mutierende Allel. Dafür wurde das lacZ-Reportergen des Vektors mit dem 5'-untranslatierten Bereich von A013 fusioniert und war somit unter der Kontrolle des endogenen A013 Promoters. Die lacZ Kassette ersetzt dabei das Exon 1 von A013 (Fig. 10). Nach Linearisierung des Targeting-Konstruktes lässt sich die DNA, in dem Fachmann bekannter Weise, in embryonale Stammzellen elektroporieren und auf G418-resistente Klone selektionieren. Von diesen Klonen lässt sich genomische DNA isolieren und mittels sogenannter Nested PCR auf homologe Rekombination zwischen Targeting-Konstrukt und endogenem A013 Allel testen. Fig. 10 zeigt die genomische Struktur von A013, die gewählten Homologiearme für die homologe Rekombination, sowie mögliche Primer für den PCR-Nachweis der homologen Rekombination. Hierbei kann nur ein PCR-Produkt nach erfolgter homologer Rekombination des A013 Targeting-Konstruktes entstehen.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (32)

1. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Ischämie-Aktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

• a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz,
• b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nuklein­ säuresequenz ableiten,
• c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 80% Homologie auf Aminosäureebene auf­ weisen, ohne daß die biologische Aktivität der Poly­ peptide wesentlich reduziert ist.

2. Aminosäuresequenz codiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1.

3. Aminosäuresequenz nach Anspruch 2, codiert durch die in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellte Sequenz.

4. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nuklein­ säuresequenz gemäß Anspruch 1 oder Teile dieser Nukleinsäure­ sequenz, wobei die Nukleinsäuresequenz in Antisense- oder Sense-Richtung mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.

5. Vektor enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder eine Expressionskassette gemäß Anspruch 4.

6. Rekombinanter prokaryontischer oder eukaryontischer Wirts­ organismus enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder mindestens ein Expressionskassette gemäß Anspruch 4 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 5.

7. Rekombinanter prokaryontischer oder eukaryontischer Wirts­ organismus nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Organismus um einen Mikroorganismus oder ein Tier handelt.

8. Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 2 oder Peptid­ fragmenten davon als Antigen zur Erzeugung von spezifischen poly- oder monoklonalen Antikörpern oder Antikörpergemischen gerichtet gegen Proteine gemäß Anspruch 2.

9. Polyklonale oder monoklonale Antikörper oder Antikörper­ gemische, die spezifisch Proteine nach Anspruch 2 erkennen.

10. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, eines Nukleinsäurekonstruktes gemäß Anspruch 4 oder einer Amino­ säuresequenz gemäß Anspruch 2 zur Identifizierung/Auffindung von Proteinen, die zu einem Protein, das durch die Amino­ säuresequenz gemäß Anspruch 2 codiert wird, spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen, oder zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Proteine kodieren, die zu einer Amino­ säuresequenz gemäß Anspruch 2 spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Two-Hybrid-System verwendet wird.

12. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder eines Fragmentes davon zur Isolierung einer genomischen Sequenz über Homologiescreening.

13. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 als Marker für humane Erbkrankheiten.

14. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, eines Nukleinsäurekonstrukts gemäß Anspruch 4 oder eines Fragments von diesen zur Gentherapie.

15. Proteinkomplex aus mindestens einem Protein mit einer Amino­ säuresequenz gemäß Anspruch 2 und mindestens einem weiteren Protein.

16. Proteinkomplex nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass im Proteinkomplex als weiteres Protein Skp1, Cullin 1, Rbx1 oder Ubiquitin Conjugating Enzyme (E2) enthalten ist.

17. Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an ein Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 oder an einen Proteinkomplex gemäß Anspruch 15 binden, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfasst:

• a) Herstellung eines Proteins mit einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 oder eines Proteinkomplexes nach Anspruch 15 durch Expression einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, eines Nukleinsäurekonstrukts gemäß Anspruch 4 oder eines Vektors gemäß Anspruch 5 in einem eukaryon­ tischen oder prokaryontischen Organismus,
• b) Inkubation des Proteins gemäß Anspruch 2 oder des Proteinkomplexes gemäß Anspruch 15 mit der zu testenden Substanz oder den zu testenden Substanzen,
• c) Detektion der Bindung der zu testenden Substanz an das Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 oder an den Proteinkomplex gemäß Anspruch 15.

18. Substanzen gefunden nach einem Verfahren gemäß Anspruch 17.

19. Substanzen, die die Interaktion eines Proteins mit der Amino­ säuresequenz gemäß Anspruch 2 mit assoziierten Proteinen hemmen oder verstärken.

20. Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 2 oder Peptid­ fragmenten davon als Antigen zur Erzeugung von spezifischen poly- oder monoklonalen Antikörpern oder Antikörpergemischen gerichtet gegen Proteine gemäß Anspruch 2.

21. Poly- oder monoklonalen Antikörper oder Antikörpergemische, die spezifisch Proteine nach Anspruch 2 erkennen.

22. Transgene Tiere enthaltend eine funktionelle oder nicht funktionelle Nukleinsäuresequenz gemäß den Ansprüchen 1, ein Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4 oder einen Vektor gemäß Anspruch 5, die eine funktionelle oder nicht funktionelle Nukleinsäuresequenz gemäß den Ansprüchen 1 enthalten.

23. Transgene Tiere, in deren Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen, oder in deren Keimzellen und der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen die Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 durch gentechnische Verfahren verändert oder durch Einfügen von DNA-Elementen unterbrochen wurde.

24. Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 in einer biologischen Probe, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfasst:

• a) Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge an Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder einer bekannten Menge an Oligonukleotiden, die als Primer für eine Amplifikation der Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 geeignet sind oder Mischungen davon,
• b) Nachweis der Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 durch spezifische Hybridisierung oder PCR-Amplifikation,
• c) Vergleich der Menge an hybridisierender Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder an durch PCR Amplifikation gewonnener Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 mit einem Standard.

25. Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis eines Proteins gemäß Anspruch 2 oder eines Proteinkomplexes gemäß Anspruch 15 in einer biologischen Probe, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfasst:

• a) Inkubation einer biologischen Probe mit einem Antikörper gemäß Anspruch 9, der spezifisch gegen Proteine gemäß Anspruch 2 oder Proteinkomplexes gemäß Anspruch 15 gerichtet ist,
• b) Nachweis des Antikörper/Antigenkomplexes,
• c) Vergleich der Mengen des Antikörper/Antigenkomplexes mit einem Mengenstandard.

26. Verfahren nach den Ansprüchen 17, 24 und 25, wobei das Verfahren zur Diagnostik von hypoxischen oder ischämischen Zuständen von Zellen oder Gewebe verwendet wird.

27. Verfahren zur Quantifizierung der Proteinaktivität eines Proteins gemäß Anspruch 2 über Antikörper gemäß Anspruch 9.

28. Verwendung von Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1 oder daraus abgeleiteter komplementärer Nukleinsäuresequenzen zur Her­ stellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Modulation der Genexpression von A013 positiv beeinflusst werden können.

29. Verwendung von Proteinen, Proteinfragmenten oder Peptiden gemäß Anspruch 2 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Modulation der Aktivität oder Menge von A013 Protein positiv beeinflusst werden können.

30. Verwendung von Antikörpern gemäß Anspruch 9 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Modulation der Aktivität oder Menge von A013 Protein positiv beeinflusst werden können.

31. Verwendung von Substanzen gemäß Anspruch 18 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Modulation der Aktivität oder Menge von A013 Protein positiv beeinflusst werden können.

32. Verwendungen nach den Ansprüchen 28 bis 31 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, wobei es sich um neurologische Erkrankungen wie Epilepsien, cerebrale Ischämie, Demenz, Morbus Parkinson, Morbus Huntington, Morbus Alzheimer oder ZNS Traumen handelt.