WO2001061001A9

WO2001061001A9 - Neues zentralnervöses protein, das k+-ströme moduliert

Info

Publication number: WO2001061001A9
Application number: PCT/EP2001/001730
Authority: WO
Inventors: Daniela Spielvogel; Hans-Christian Kornau; Rohini Kuner; Gisela Eisenhardt; Annette Trutzel
Original assignee: Basf Lynx Bioscience Ag; Daniela Spielvogel; Hans-Christian Kornau; Rohini Kuner; Gisela Eisenhardt; Annette Trutzel
Priority date: 2000-02-18
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2002-08-08
Also published as: EP1255836A2; WO2001061001A2; AU2001250322A1; WO2001061001A3; DE10007468A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen und isolierte Proteine, die neue Interaktionspartner von einwärts rektifizierenden Kaliumkanälen (Kirs), insbesondere G-Protein-gekoppelte einwärts rektifizierenden Kaliumkanälen (GIRKs) sind. Diese Interaktionspartner bilden zusammen mit Kirs bzw. GIRKs Proteinkomplexe. Die Erfindung betrifft weiterhin eine geladene Domäne der erfindugsgemässen Interaktionspartner, die an den komplexen intrazellulären Bereich von Kirs bindet und die Aktivität von Kirs allgemein, oder von GIRKs insbesondere, beeinflusst. Ausserdem betrifft die Erfindung Proteinkomplexe aus Interaktionspartnern und einwärts rektifizierenden Kaliumkanälen, Nukleinsäuresequenzen oder rekombinante Nukleinsäurekonstrukte, die für solche Proteine bzw. Domänen kodieren, sowie deren Verwendungen. Ausserdem betrifft die Erfindung auch Proteinkomplexe aus dem erfindungsgemässen Protein mit weiteren Proteinen. Die Erfindung betrifft auch wirtsorganismen speziell transgene Tiere, die die erfindungsgemässen Nukleinsäuresequenzen oder die rekombinante Nukleinsäurekonstrukte enthalten, sowie mono- oder polyklonale Antikörper, die gegen die isolierten Proteine gerichtet sind. Zusätzlich betrifft die Erfindung Verfahren zum Auffinden von Partnern, das heisst von niedermolekularen oder hochmolekularen Substanzen, die spezifisch an die erfindungsgemässen Interaktionspartner binden.

Description

Neues zentralnervöses Protein, das K⁺-Ströme moduliert

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsauresequenzen und isolierte Proteine, die neue Interaktionspartner von einwärts rektifizierenden Kaliumkanalen (Kirs) , insbesondere G-Protein-gekoppelte einwärts rektifizierenden Kaliumkanälen (GIRKs) sind. Diese Interaktionspartner bilden zusammen mit Kirs bzw. GIRKs Proteinkomplexe. Die Erfindung betrifft weiterhin eine geladene Domäne der erfindungsgemäßen Interaktionspartner, die an den komplexen intrazellulären Bereich von Kirs bindet und die Aktivität von Kirs allgemein, oder von GIRKs insbesondere, beeinflusst. Außer- dem betrifft die Erfindung Proteinkomplexe aus Interaktionspartnern und einwärts rektifizierenden Kaliumkanälen, Nukleinsauresequenzen oder rekombinante Nukleinsäurekonstrukte, die für solche Proteine bzw. Domänen kodieren, sowie deren Verwendungen. Außerdem betrifft die Erfindung auch Proteinekomplexe aus dem erfindungsgemäßen Protein mit weiteren Proteinen.Die Erfindung betrifft auch Wirtsorganismen speziell transgene Tiere, die die erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen oder die rekombinante Nukleinsäurekonstrukte enthalten, sowie mono- oder polyklonale Antikörper, die gegen die isolierten Proteine gerichtet sind. Zu- sätzlich betrifft die Erfindung Verfahren zum Auffinden von Partnern das heißt von niedermolekularen oder hochmolekularen Substanzen, die spezifisch an die erfindungsgemäßen Interaktionspartner binden.

Im zentralen Nervensystem von Wirbeltieren sind G-protein- gekoppelte einwärts rektifizierende Kaliumkanäle (GIRKs) an der Regulation ' der Erregbarkeit von Neuronen beteiligt, indem sie die Kalium-Leitfähigkeit der Zellmembran erhöhen. Die erste Klonierung einer GIRK-Untereinheit (GIRKl) gelang 1993 (Kubo et al., Nature, 364, 1993: 802 - 806; Dascal et al., Proc. Natl . Acad. Sei., USA, 90, 1993: 10235 - 10239). Bisher wurden 4 Sequenzverwandte GIRK-TJntereinheiten beschrieben (GIRK2-5) , die mit GIRKl heteromere, tetra ere Kanäle im Verhältnis 2:2 bilden (Ko- fuji et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 92, 1995: 6542 - 6546; Yang et al., Neuron Dec, 15, 6, 1995: 1441 - 1447; Tucker et al., J. Biol., Che ., 274, 47, 1996: 33393 - 33397); die Expression der Kanäle konnte neben Neuronen auch in Herzvorhof- und endokrinen Zellen nachgewiesen werden (Karschin et al., FEBS Lett., 348, 2, 1994: 139 - 144) . Im zentralen Nervensystem triggern Gi/Go-gekoppelte Rezeptoren die Aktivität von GIRK-Kanälen. In Gegenwart eines Agonisten katalysieren sie die Freisetzung der ß,γ-Untereinheit trimerer G-Proteine; die ß,γ-Untereinheit bindet direkt an den GIRK- Komplex, wodurch die Interaktion mit Phosphatidylinositol-4, 5- bisphosphat stabilisiert wird, was in einer verstärkten Aktivierung des G RK-Kanals resultiert (Huang et al., Nature, 391, 1998: 803 - 806). Verschiedene Neurotrans itter (z.B. Adenosin, GABA oder Serotonin) triggern auf diese Weise GIRK-Ströme, um direkt die elektrischen Eigenschaften von Dendriten zu modulieren (Taki- gawa und Alzheimer; J. Physiol. [Lond] , 517, Pt2, 1999: 385 - 390) . GABA_B-Rezeptoren zählen zu der Gruppe von Rezeptoren, die ihre Wirkung über GIRKs entfalten. Sie sind an Änderungen der synaptischen Effizienz beteiligt, die Lern- und Gedächtnisvorgän- gen zugrunde liegt. GABA_ß-Rezeptor-Agonisten zeigen positive Wirkung in Tiermodellen für chronische Schmerzen sowie Kokainabhängigkeit. Antagonisten wirken sich positiv in Modellen von "Ab- sence-Epilepsie" aus (Bettler et al., Curr. Opin. Neurobiol., 1998: 345 - 350). Aktivierung von GABA_B-Rezeptoren dämpft überer- regte neuronale Verknüpfungen, indem sie die Öffnung der GIRK-Ka- näle veranlassen. Molekulare Targets mittels derer sich die GIRK- Ströme beeinflussen lassen, eignen sich für die Behandlung von Epilepsie, Schlaganfall, kognitiven Verlusten, chronischen Schmerzen und weiteren neurologischen Erkrankungen sowie für die Behandlung von psychischen Krankheiten wie Angst, depressiven Erkrankungen, Schizophränie, Migräne und anderen. Hinweise, daß solche Targets auch effektive Angriffspunkte für die Therapie von Alkoholabhängigen sind, zeigt die Tatsache, daß Ethanol die Funktion von GIRKs, die an GABA_B-Rezeptoren gekoppelt sind, in Körner- zellen des Kleinhirns verstärkt (Lewohl et al., Nat. neurosci. 2, 12, 1999: 1084 - 1090; Kobayashi et al., 1999, Nat. Neurosci., 2, 12, 1999: 1091 - 1096) .

In Tiermodellen wurde der Zusammenhang von GIRK-Kanälen mit Krämpfen, wie sie in epileptischen Anfällen vorkommen, bereits hergestellt: Null-Mutationen für eine GIRK-Untereinheit (GIRK2) in transgenen Mäusen führt zu spontanen Krämpfen, einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber pharmakologisch induzierten Anfällen, sowie zu einer herabgesetzten Menge mRNA für die GIRKl-Unter- einheit (Signorini et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 94, 3, 1997: 923 927). In einem tierexperimentellen Krampfmodell, bei dem durch elektrische Stimulation des Gehirns motorische Anfälle induziert werden, lassen sich ebenfalls Änderungen im Expressionsmuster von GIRKl und 2 in Zellen des Gyrus dentatus fest- stellen (Pei et al . , Neuroscience, 90, 2, 1999: 621 - 627). GIRK- Ströme spielen offensichtlich in vielen physiologischen Zusammenhängen eine entscheidende Rolle. Die Regulation der Anzahl der GIRK-Proteine in der Membran und die Modulation der Ströme durch einen GIRK-Kanal ist dabei von großer Bedeutung.

Interaktionspartner von GIRKs, die einen Einfluß auf die 5 K+-Ströme haben, sind demzufolge potentielle Targets für die Behandlung von neurologischen Erkrankungen wie Epilepsie. GIRKl ist alleine nur schwach aktiv, unterscheidet sich jedoch von den übrigen GIRK-Untereinheiten dadurch, das es mit anderen Familienmitgliedern (GIRK2-4) assoziieren kann und so deren Aktivität

10 verstärken und deren Einzelkanalcharakteristik verändern kann

(Chan et al . , J. Biol. Chem., 272, 10, 1996: 6548 - 6555). GIRKl hebt sich so von den übrigen GIRK-Untereinheiten ab. Proteine, die mit GIRKl interagieren, könnten direkten Einfluß auf die Leitfähigkeit oder die Öffnungsdauer der Kanäle oder auf die An-

15 zahl funktionsfähiger Kanäle in der Membran haben.

GIRKs werden auch im Herzen exprimiert. Ihre Funktion dort ist die K⁺-Leitfähigkeit von Herzvorhofzellen zu aktivieren und so die Herzfrequenz herabzusetzen (Kobo et al., Nature, 364, 1993: 802 - 20 806) .

Da GIRKs eine zentrale Rolle bei verschiedenen pathologischen Prozessen des zentralen Nervensystems und des Herzens spielen bzw. an derartigen Prozessen beteiligt sind, sind sie und ihre 25 Interaktionspartner mit oder ohne regulatorische Funktionen gesuchte Targets für die Entwicklung neuer Pharmaka.

Es bestand daher die Aufgabe neue Proteine, die mit den GIRKs interagieren, zu identifizieren und zu charakterisieren, und die 30 Entwicklung molekularer Testsysteme zu ermöglichen, mit denen man viele Tausend verschiedene Verbindungen nach hochaffinen Substanzen in kurzer Zeit durchsuchen kann.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird 35 durch den Gegenstand der hierin beschriebenen Ansprüche gelöst.

Diese Aufgabe wurde folglich gelöst mit den erfindungsgemäßen, isolierten Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe:

40 a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenz,

b) Nukleinsauresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ; 45 SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten, c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 60 % Homologie auf Aminosäureebene auf- weisen, ohne daß die biologische Aktivität der Polypeptide wesentlich reduziert ist

d) Äquivalente der unter (a) bis (c) genannten Sequenzen, die noch eine biologische Aktivität aufweisen.

Es wurde gefunden, das durch die erfindungsgemäße Nukleotid- sequenz kodierte Proteine mit GIRKl interagieren.

Folglich handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Proteinen mit den in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenzen und deren funktioneile Derivate, Analoge und Äquivalente um neue Interaktionspartner von Kirs speziell von GIRKs. Diese Interaktionspartner werden im folgenden als sogenannte Mogli-Pro- teine oder kurz als Mogli bezeichnet .

Die erfindungsgemäßen Proteine sind in der Lage mit funktioneilen GIRK-Kanälen Komplexe zu bilden und dabei beispielsweise die K⁺- Ströme durch die GIRK-Kanäle zu verändern. Dieses deutet darauf hin, daß es sich bei den neuen Proteinen um Modulatoren der GIRK- vermittelten Ströme handelt.

Die In-situ Hybridisierung mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäu- re-Sequenz oder Teilen davon ergab eine starke Expression der für das erfindungsgemäße Protein codierenden rnRNA in Hippokampus, Cortex, Cerebellum, insbesondere auch Purkinje-Zellen sowie eine niedrigere Expression in thalamischen Kernen, Striatu sowie den Kernen von Mittelhirn und Stammhirn (siehe Figur 2 und Beispiel 4) .

Weiterhin wurde gefunden, daß in öffentlichen Datenbanken eine cDNA (AB002372) enthalten ist, deren Nukleotidsequenz zu 60 % über eine Länge von 1400 nt (= Nukleotiden) identisch zu der erfindungsgemäßen Sequenz SEQ ID NO: 3 ist. Diese Sequenz ging aus einem Ansatz hervor, in dem hundert möglichst große cDNA- Fragmente aus Gehirn in vitro translatiert wurden und bei Erhalt von Proteinen größer 60 kDa wurde die zugehörige cDNA sequenziert (KiAA0374 Nagase et al.; DNA Res . 4:141-150,1997). Der Schrift ist eine sehr schwache Expression dieser verwandten rnRNA im Gehirn zu entnehmen. Eine weitere funktioneile Beschreibung dieser rnRNA oder eines durch die mRNA codierten Proteins ist der Veröffentlichung nicht zu entnehmen. Die Sequenz ist auf Aminosäureebene zu 43 % identisch zu SEQ ID NO: 4 über eine Länge von 473 Aminosäuren. Man kann daher annehmen, daß es sich in diesem Fall um ein verwandtes Molekül handelt .

Dem unter AB002372 bzw. AF187733 in der EMBL-Datenbank abgelegten Protein (KIAA0374) wurde kürzlich eine regulatorische Funktion während der Transmitterausschüttung zugeschrieben (Lao et al., Neuron, 25 2000:191-201). Das Syntaphilin genannte Protein bindet über eine geladene Domäne ("coiled-coil" oder "cc") ari Synta- xin-1, einen essentiellen Bestandteil des SNARE-Komplexes , ge- nauer gesagt des Core-Komplexes bestehend aus Syntaxin-1, SNAP-25 und VAMP, dessen Ausbildung für die vesikuläre Ausschüttung von Transmittern notwendig ist. Dadurch wird die Ausbildung des Core- Komplexes inhibiert und die Transmitterausschüttung reduziert (Lao et al., Neuron, 25 2000:191-201). Die Menge an aktivem, syn- aptischen Syntaphilin reguliert somit die Effizienz der Vesikel- Exozytose, eine für viele neurologische Erkrankungen wichtige Größe. Im Vergleich zu Syntaxin-1 ist Syntaphilin recht schwach exprimiert, so daß es nur die Ausbildung eines begrenzten Teils der gesamten SNARE-Komplexe inhibieren kann. Unter dem Begriff SNARE-Komplex werden auch solche Proteine verstanden, die mit dem Core-Komplex interagieren, insbesondere diese regulieren, wie z.B. die weiter unten aufgezählten Proteine. Die erfindungsgemäßen Proteine könnten daher ebenfalls an der Regulation der Transmitterausschüttung beteiligt sein. Diese Funktion läßt sich z.B. von der Ähnlichkeit der (SEQ ID No.8) des erfindungsgemäßen Proteins zur ("cc") Domäne von Syntaphilin ableiten. Syntaphilin wird in Cortex, Hippocampus, Riechkolben, Striatum, Mittelhirn und Pons . (Balken), somit anders als Mogli, exprimiert.

In einem Yeast-two-hybrid-System wurden unter Verwendung des N- Terminus des erfindungsgemäßen Proteins (siehe Beispiele 7) weitere Interaktionspartner von Mogli gefunden. Dabei handelt es sich vorzugsweise um Proteine, die von den mit KIAA0622 (AB014522) und KIAA0627 (AB014527) codiert werden, oder um Pro- teine der EB-Familie. Die Bindung dieser weiteren Interaktionspartner kann in Abhängigkeit der vorherigen Bindung von Proteinen an Mogli stehen oder unabhängig von dieser Bindung erfolgen oder aber durch die vorherige Bindung von Proteinen an Mogli blockiert oder aber gefördert werden. Über diese Interaktion können andere als die oben beispielhaft genannten Funktionen vermittelt werden, wie z.B. durch eine Interaktion mit dem Protein EB3 (AB025186) ein Eingriff in die Regulation des Zellzyklus möglich ist (Naka- gawa et al., Oncogene, 2000, 13; 19(2); 210-216; Nakagawa et al . , Cancer Res., 2000, 1; 60 (1): 101-105). Im folgenden sollen unter dem Begriff "Proteinkomplex oder Komplex" die Proteinkomplexe aus mindestens einem erfindungsgemäßen Protein und mindestens einem weiteren Protein, wie dem GIRK-Kom- plex, dem SNARE-Komplex oder anderen Komplexen verstanden werden.

Unter dem Begriff "biologische Aktivität" ist erfindungsgemäß zu verstehen, daß ein Protein mindestens eine, vorzugsweise mehrere der biologischen Aktivitäten umfasst, die ein Protein hat, das durch die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz codiert wird. Folglich kann als eine wesentliche biologische Aktivität verstanden werden, das ein erfindungsgemäßes Protein mit einem GIRK-Protein interagiert, insbesondere in einem Two-Hybrid-Screen. Ein beispielhaftes Verfahren mit dem die Interaktion bestimmt werden kann, ist in den Beispielen dargestellt. Es wurde so gefunden, daß insbesondere die Domänen, die in SEQ-ID No. 6 und 8 (Ratte/ Mensch) gezeigt werden, eine wesentliche Rolle bei der Interaktion mit GIRK spielen.

Unter biologischer Aktivität wird folglich auch verstanden, daß das Protein mit einem der unten beschriebenen Antikörper spezifisch wechselwirkt, d.h. daß es Epitope besitzt, die von Antikörpern, die spezifisch an einem von SEQ ID No. 1, 3, 6 oder 8 co- dierenten Protein oder Proteinfragment binden. Unter "spezifisch" wird insbesondere verstanden, daß diese Antikörper nicht oder nur sehr schwach mit Syntaphilin interagieren. Dem Fachmann sind Verfahren und Test bekannt, mit denen solche Antikörper hergestellt und getestet werden können (s.u.) .

Vorzugsweise interagiert das erfindungsgemäße Protein mit GIRKl und/oder Proteinen, die an der Transmitterausschüttung beteiligt sind, insbesondere SNARE-Komplexen und assoziierten Proteinen sowie den vorgenannten weiteren Proteinkomplexen. Durch die Wechselwirkung mit GIRKl oder anderen KIR kann das erfindungsgemäße Protein die Ionenleitfähigkeit, speziell die K⁺-Leitfähigkeit von erfindungsgemäßen Proteinkomplexen beeinflussen.

Unter "biologischer Aktivität" wird erfindungsgemäß auch verstanden, daß das Protein an der Regulation der Transmitterausschüttung beteiligt sein kann. Ein Verfahren, um diese Regulation zu testen, ist z.B. in Lao et al., Neuron, 25, 2000:191-201, beschrieben. Folglich wird unter biologischer Aktivität auch umfasst, daß das erfindungsgemäße Protein mit einem Protein des SNARE-Komplexes bindet oder mit einem damit assoziierten Protein. Dadurch kann die Ausbildung des SNARE-Komplexes inhibiert oder aktiviert werden. Mit SNARE-Komplex interagierende Proteine sind z.B. MUNC18, N-Secl, rbSecl, Complexin, Doc2, Tomosyn, NSF, Sna- pin Septin CDCrel-1, und SNAPs .

Unter der wesentlichen biologischen Eigenschaft der erfindungsge- mäßen Proteine (= Mogli) , insbesondere dessen geladener Domäne, die die Bindung an GIRKl vermittelt, bzw. der erfindungsgemäßen Proteinkomplexe sind die Eigenschaften der oder des transmembra- nen Bereichs, des -urtinoterminalen Bereichs und des carboxytermi- nalen Bereichs des Proteins allein oder im Proteinkomplex zu ver- stehen. Diese Proteihbereiche ermöglichen die spezielle biologische Wirkung der Proteine bzw. Proteinkomplexe. Diese wesentlichen biologischen Eigenschaften beinhalten außerdem die hochaffine Bindung (Kd<10nM) spezifischer synthetischer oder natürlicher Moleküle an die erfindungsgemäßen Proteine mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz sowie die Interaktion mit den oben genannten, bekannten Proteinen, z.B. zu den erfindungsgemäßen Proteinkomplexen. Durch die Interaktion werden, als eine wesentliche biologische Eigenschaft die Ionenleitfähigkeit speziell die K⁺-Leitfähigkeit der Komplexe oder die Regulation der Transmitterausschüttung bzw. die Aktivität der SNARE-Komplexe beeinflußt .

Unter den erfindungsgemäßen isolierten Proteinen sind Proteine zu verstehen, die eine in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 darge- stellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz enthalten, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften des in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Proteins erhalten bleibt. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Ba- sizität, Hydrophobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucin- reste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausge- tauscht. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden. Die solchermaßen gegenüber der SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 veränderten Proteine besitzen wenigstens 60%, bevorzugt we- nigstens 70%, 80, und besonders bevorzugt wenigstens 90%, 95 oder mehr Sequenzidentität über die gesamte Länge der Sequenz zu den Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 berechnet nach dem Algorithmus von "Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990". Die Identität gegenüber SEQ ID NO: 6 oder 8 beträgt wenigstens 75 %, bevorzugt 80 %, besonders bevorzugt 85 %, ganz besonders bevorzugt 90 %, 95 oder mehr. Diese durch die oben genannten Nukleinsäuren kodierten Proteine sind in den erfindungsgemäßen Proteinkomplexen enthalten. Die erfindungsgemäßen Proteinkomplexe enthalten mindestens ein Protein, wie beispielsweise ein Kir- oder ein SNARE-Komplex-Protein, und 5 mindestens ein erfindungsgemäßes Protein mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften

10 des in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Proteins oder des Proteinkomplexes erhalten bleibt . In diesen Proteinkomplexen beeinflußt das durch die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz kodierte Protein z.B. die K⁺-Leitfähigkeit . Es moduliet also z.B. vorteilhaft die K⁺-Leitfähigkeit des Proteins bzw. des Komplexes.

15 Bei den Kir-Proteinen handelt es sich vorteilhafterweise um sogenannte GIRK-Proteine. Vorteilhafterweise moduliert es die Transmitterausschüttung.

Unter den erfindungsgemäßen Proteinkomplexen sind Kir-Kanäle, 20 vorteilhaft GIRK-Kanäle, die eine GIRKl-Untereinheit enthalten, und mindestens ein Protein mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz zu verstehen. Im Artikel "Primary structure and functional expression of a rat G-Protein-coupled muscarinic potassium Channel" (Kubo et al.; 25 Nature 26 Aug 1993, Vol. 364, S. 802-806) werden geeignete GIRKl- Untereinheiten, die vorteilhaft in den Proteinkomplexen enthalten sein können, erstmals beschrieben. Der beschriebene Klon wurde als GIRKl bezeichnet (Datenbankeintrag: 15-OCT-1993; ID: RNGIRK1A; AC : L25264) . Die Sequenz des humanen Homologs wurde am 30 10-APR-1994 in die öffentlichen Datenbanken eingetragen (ID: HS07918; AC: U07918).

Eine Analyse der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz mit "PROSITE pattern search" ergab eine Reihe von möglichen Phosphorylierungs-

35 stellen des Proteins. So wurden z.B. mögliche Phosphorylierungs- stellen für eine cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinase, eine Proteinkinase C oder eine Caseinkinase II gefunden. Es ist anzunehmen, daß das Protein der Regulation von Phosphatasen oder Ki- nasen unterliegt. Insbesondere Phosphorylierungsstellen, die im

40 Bereich der konservierten, geladenen Domäne liegen (siehe SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8), haben möglicherweise nach (De-)phosphorylierung direkten Einfluß auf die Wechselwirkung von Mogli mit anderen Proteinen, z.B. mit GIRKl oder mit Proteinen, die bei der Transmitterausschüttung beteiligt sind, z.B. SNARE-

45 Komplexen. Die Interaktion wird mit GIRKl durch drei Domänen vermittelt: dem intrazellulären A ino- und Carboxyter inus von GIRKl, sowie einer geladenen, α-helicalen (aufgrund von Sekundärstrukturvorhersagen) Domäne im erfindungsgemäßen Protein. 5

Ein erfindungsgemäßer Gegenstand ist der Komplex aus diesen in- teragierenden Domänen bzw. die Mogli-Domäne, die an der Interaktion beteiligt ist.

10 Die Domänen, die für die Interaktion im Proteinkomplex verantwortlich sind, wurden durch Deletionskonstrukte und nachfolgende Analyse im two-hybrid System analysiert (Fields et al., TIgS Vol. 10, 8, 1994: 286 - 292 und Nature, Vol. 340, 1989: 245 - 246, Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 88, 1991, 9578 -

15 9582) . In SEQ ID NO: 5 wird die Rattendomäne und in SEQ ID NO: 7 die humane Domäne beschrieben. Die Sequenzen SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 geben die entsprechenden Proteinsequenzen wieder.

Das isolierte Protein und seine funktioneilen Varianten lassen 20 sich vorteilhafterweise aus dem Gehirn von Mammalia wie Homo sapiens oder Rattus norvegicus isolieren. Auch Homologe aus anderen Mammalia sind unter funktioneilen Varianten zu verstehen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Nukleinsauresequenzen,

25 die für die oben beschriebenen Proteine kodieren, insbesondere für solche mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten PrimärStruktur . Die Nukleinsäuresequenz aus Rattus norvegicus oder Homo sapiens ist in SEQ ID NO: 1 bzw. in SEQ ID NO: 3 dargestellt.

30

Nach Isolierung und Sequenzierung sind die erfindungsgemäßen Nu- kleotidsequenzen SEQ ID No: 1 und SEQ ID No: 3 oder- deren funktioneile Äquivalente wie z. B. Allelvarianten erhältlich. Unter AIlelVarianten sind SEQ ID No: 1- oder SEQ ID No: 3-Varianten zu

35 verstehen, die 70 bis 100 % Homologie auf Aminosäureebene, bevorzugt 80 bis 100 %, ganz besonders bevorzugt 90 bis 100 % aufweisen. Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft höher liegen..Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen SEQ ID No: 1 und SEQ ID No: 3 oder deren funktionelle Äquivalente

40 weisen auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 65 %, bevorzugt von mindestens 75 %, besonders bevorzugt von mindestens 85 %, ganz besonders bevorzugt von mindestens 90 % über den gesamten in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 angegebenen DNA-Bereich auf.

45 Allelvarianten umfassen insbesondere solche funktioneilen Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleo- tiden aus der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei wenigstens noch eine der wesentli- chen biologischen Eigenschaften erhalten bleibt. Unter erfindungsgemäßen Proteinen, bei denen noch eine wesentliche biologische Eigenschaft vorhanden ist, sind vorteilhaft Proteine zu verstehen, die noch mindestens 20 %, bevorzugt 50 %, besonders bevorzugt 75 %, ganz besonders bevorzugt 90 % der biologischen Ak- tivität beispielsweise in bezug auf die Erhöhung der ^-Leitfähigkeit im Vergleich zum Ausgangsprotein aufweisen. Homologe oder sequenzverwandte Nukleinsauresequenzen können aus allen Säugerspezies einschließlich Mensch nach gängigen Verfahren durch Homo- logiescreening durch Hybridisierung mit einer Probe der erfin- dungsgemäßen Nukleinsauresequenzen oder Teilen davon isoliert werden.

Unter funktionellen Äquivalenten sind auch Homologe von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 beispielsweise ihre Homologen aus anderen Mammalia, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu verstehen.

Solche funktioneilen Äquivalente lassen sich ausgehend von den in SEQ ID No: 1 oder SEQ ID No: 3 beschriebenen DNA-Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisie- rungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Vertebraten wie Mammalia isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybri- sierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservier- ten Bereiche vorteilhaft der interagierenden Domäne beispielsweise aus den geladenen Bereichen oder aus dem carboxyterminalen Bereich, die über Vergleiche mit anderen Proteinen j.n dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäu- ren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure Oligonukleo- tid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10 °C niedriger als die von DNA: NA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58 °C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42 °C in 5 x SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisie- rungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 °C bis 45 °C, bevorzugt zwischen etwa 30 °C bis 45 °C. Für DNA: NA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingun- gen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30 °C bis 55 °C, bevorzugt zwischen etwa 45 °C bis 55 °C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al . , "Molecular Cloning" , Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Ge- halt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds) , 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridiza- tion: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed) , 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Außerdem sind unter Homologe der Sequenzen SEQ ID No: 1 und SEQ ID No: 3 Derivate wie beispielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen gemeinsam oder einzeln vorgeschaltet sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Dele- tion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfaßt auch Fragmente der Sequenzen SEQ ID No: 1 und 3, insbesondere werden Nukleinsauresequenzen umfaßt, die ein Fragment der SEQ ID No. 1 oder 3 enthalten und die für ein Polypeptid mit mindestens einer der oben beschriebenen biologischen Aktivitäten codieren. Vorzugsweise besitzt ein solches Fragment die Sequenz der SEQ ID No. 7 oder 9 oder eines Homologs davon, daß mindestens 70 % identisch zu SEQ ID No. 7 oder 9 ist. Vorzugsweise ist die Sequenz mehr als 80 %, 90 % und mehr bevorzugt mehr als 95 % identisch. Die codierte Sequenz kann verantwortlich sein für die Interaktion des erfindungsgemäßen Proteins mit einem anderen Protein, z.B. einem KIR-Protein, insbesondere GIRK-Proteinen, z.B. GIRKl, oder mit einem an der Transmitterausschüttung beteiligten Protein, z.B. mit Proteinen des SNARE-Komplexes. Unter Derivaten sind auch vorteilhaft Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich -1 bis -1000 vor dem Startkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird. Weiterhin sind un- ter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die am 3 ' -Ende verändert wurden. Diese am 3 ' -Ende vorteilhaft vorgenommenen Änderungen betreffen beispielsweise Terminatoren oder Sequenzen, die die Translation und/oder Transkription positiv beeinflussen.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsauresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Weiterhin ist es von Vorteil die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren SEQ ID No: 1 oder SEQ ID No: 3 allein oder die Nukleinsäuren SEQ ID No: 1 oder SEQ ID No: 3 und eine oder mehr Sequenzen, die z.B. für Komplexe wie GIRK- oder Kir-Proteine oder für Proteine, die an der Transmitterausschüttung beteiligt sind, z.B. SNARE-Kom- plexe oder mit diesen Komplexen interagierende Proteinen, kodieren, funktionell mit mindestens einem genetischen Regulationselement zu den erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäurekonstruk- ten zu verknüpfen.

Dazu werden die erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen üblicherweise mit genetischen Regulationselementen wie Transkriptionsund Translationssignalen funktioneil verknüpft. Diese Verknüpfung kann je nach gewünschter Anwendung zu einer Erhöhung oder Ernied- rigung der Genexpression führen. Mit den solchermaßen hergestellten rekombinanten Nukleinsäurekonstrukten werden anschließend Wirtsorganismen transformiert. Zusätzlich zu diesen- neuen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gege- benenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenzen inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regu- lation wird nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Auch am 3 ' -Ende der Nu- kleinsäure-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte regulatorische Elemente inseriert werden. Die Nukleinsauresequenzen für die Sequenzen SEQ ID No: 1 oder SEQ ID No: 3 können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein, oder auf getrennten Genkonstrukten lokalisiert sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver- fahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, Ipp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR- oder im 1-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispiels- weise in den gram-positiven Promotoren wie ay und SP02, in den Hefepromotoren wie ADC1, MFa , AC, P-60, CYC1, GAPDH oder in Mammaliapromotoren wie CaM-Kinasell , CMV, Nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, ß-Globin, GFAP, GAP43 , Tyrosin Hydroxylase, Kainat- Rezeptor-Untereinheit 1, Glutamat-Rezeptor-Untereinheit B ent- halten.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten verwendet werden. Darüber- hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsauresequenzen und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimie t wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorisehen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer". verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der rnRNA verbessert wird.

Unter "Enhancer" sind beispielsweise DNA-Sequenzen zu verstehen, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA eine erhöhte Expression bewirken. Als weitere Regulati- onssequenzen seien beispielhaft die locus control regions, silen- cer oder jeweilige Teilsequenzen davon genannt. Diese Sequenzen können vorteilhaft für eine gewebespezifische Expression verwendet werden.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist die Verknüpfung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit einem Promotor, wobei der Promotor 5 ' up stream zu liegen kommt . Weitere Regulationssignale wie 3 'gelegene Terminatoren oder Polyadenylierungssignale oder Enhancer können funktionell in dem Nukleinsäurekonstrukt Anwendung finden und damit seine Expression beeinflussen.

Unter dem Begriff des erfindungsgemäßen "rekombinanten Nukleinsäurekonstrukts bzw. Genkonstrukts" sind auch komplette Vektor- konstrukte zu verstehen. Diese Vektorkonstrukte oder Vektoren werden zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus verwendet. Vorteilhafterweise werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäu- ren und/oder die Gene, die für z.B Mogli, oder Komplexe wie

SNARE-Komplex-Proteine und/oder GIRKs codieren, in einen wirtsspezifischen Vektor inseriert, der eine optimale Expression der Gene im ausgesuchten Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vec- tors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Ox- ford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculo- virus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Für die Integration in Mammalia wird vorteilhaft lineare DNA verwendet.

Die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen bzw. des rekombinanten Nukleinsäurekonstrukts kann vorteilhaft durch Erhöhen der Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die Genexpression positiv beeinflussen, erhöht werden. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale wie Promotoren und Enhancer verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der rnRNA verbessert, oder die Ableseeffizienz dieser rnRNA an den Ribosomen erhöht wird.

Zur Erhöhung der Genkopienzahl können die Nukleinsauresequenzen oder homologe Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält . Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen können zusammen mit den für die GIRKs kodierenden Sequenzen oder Sequenzen, die für Proteine kodieren, die in SNARE-Komplexen enthalten sind oder mit ihnen assoziiert sind, wie z.B. die oben aufgezählten, oder die regulatorische Funktionen haben, in einen einzelnen Vektor klo- niert werden und anschließend in dem gewünschten Organismus exprimiert werden. Alternativ kann auch jede der beschriebenen Nu- kleinsäuresequenzen und die für die genannten Proteine, z.B. die GIRK-Proteine kodierenden Sequenzen in je einen einzelnen Vektor gebracht und diese getrennt in den jeweiligen Organismus über übliche Methoden wie Transformation, Transfektion, Transduktion, Elektroporation oder Partikel-Gun verbracht werden.

Darüberhinaus kann das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren auch in Form therapeutisch oder diagnostisch geeigneter Fragmente exprimiert werden. Zur Generierung des rekombinanten Proteins können Vektorsysteme oder Oligonukleotide verwendet werden, die die Nukleinsäuren oder das Nukleinsäurekonstrukt um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide kodieren, die einer einfacheren Reinigung dienen. Als solche "Tags" sind in der Literatur z. B. Hexa-Histidin-Anker bekannt oder Epitope, die als An- tigene verschiedener Antikörper erkannt werden können (Studier et al., Meth. Enzymol., 185, 1990: 60 - 89 und Ausubel et al. [eds.]m 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) .

Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate oder des rekombinanten Nukleinsäurekonstrukt allein oder zusammen mit einer Sequenz, die für eines der oben genannten Proteine, insbesondere einem Komplexpartner zur Bildung von Komplexen wie GIRK- oder SNARE-Protein kodiert, ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen,, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien wie Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseu- domonas, eukaryotische Mikroorganismen wie Saccharomyces cerevi- siae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Mensch oder Tier, beispielsweise COS-, Heia-, HEK293-, Sf9-, CHO-, PC12-Zel- len oder primäre neuronale Zellkulturen.

Gewünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organismen wie transgenen Tieren z.B. Mäusen, Ratten, Schafen, Rindern oder Schweinen zur Expression gebracht werden. Auch transgene Pflanzen sind im Prinzip denkbar. Bei den transgenen Organismen kann es sich auch um sogenannte Knock-Out Tiere handeln. Dabei können die transgenen Tiere eine funktionelle oder nicht funktioneile erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein funk- tionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt allein oder in Kombination mit einer funktionellen oder nicht funktio- 5 nellen Sequenz, die für Mogli oder funktionelle Äquivalente oder Derivate kodiert, enthalten.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung der oben beschriebenen transgenen Tiere sind transgene Tiere, in deren Keimzellen 0 oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen; oder in dessen Keimzellen und der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz durch gentechnische Verfahren verändert oder durch Einfügen von DNA-Elementen unterbrochen wurden. 5

Die Kombination aus den WirtsOrganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren wie Plasmide, Viren oder Phagen wie beispielsweise Plasmide mit dem RNA-Polyerase/Promoter System, die Phagen λ, Mu oder andere temperänte Phagen oder Transposons und/oder wei- 0 teren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen bilden ein Expressionssystem. Bevorzugt sind unter dem Begriff Expressionssysteme beispielsweise die Kombination aus Säugetierzellen wie CHO-Zellen und Vektoren wie pcDNA3neo-Vektor oder HEK293-Zellen und CMV-Vektor, die für Säugetierzellen geeignet sind, zu verstehen. 5

Die In-situ Hybridisierung mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäu- re-Sequenz oder Teilen davon ergab eine starke Expression in Hip- pokampus, Cortex, Cerebellum, insbesondere auch Purkinje-Zellen 0 sowie eine niedrigere Expression in thalamischen Kernen, Striatum sowie den Kernen von Mittelhirn und Stammhirn (siehe Figur 2 und Beispiel 4) . Figur 1 und 2 geben die Expressionsanalyse der zu SEQ ID NO: 1 korrespondierenden rnRNA wieder. 1 zeigt den Northern blot, 2 die in situ-Hybridisierung (siehe Beispiel 3 und 4) . 5

Das Expressionsmuster von SEQ ID NO: 1 überlappt mit dem von GIRKl und deutet auf eine wichtige zentralnervöse Funktion des in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Proteins hin. Die für SEQ ID NO: 2 sowie GIRKl kodierenden mRNAs werden in den meisten . hippokampalen Neuronen koexprimiert . Zusätzlich wird SEQ ID NO: 1, aber nur sehr wenig GIRKl, in inhibitorischen Interneuronen des Gyrus dentatus exprimiert . SEQ ID NO : 1 könnte die Erregbarkeit wichtiger hippokampaler Neuronen, beispielsweise der Pyramidenzellen, sowohl über die Interaktion mit GIRKl als auch über _S andere bislang unbekannte Mechanismen im Gleichgewicht halten. Der Hippokampus ist die entscheidende Hirnstruktur für die Speicherung neuer Gedächtnisinhalte. Ein Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 ist damit ein interessantes Target für das Verständnis in Bezug auf Lernen und Gedächtnis und für die Entwicklung neuer kognitiver Enhancer. Als Teil des limbischen Systems beeinflußt der Hippokampus auch Stimmungen und Gefühle. Gegen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 und ihre funktionellen Äquivalente, Homologe oder Derivate gerichtete Pharmaka stellen damit potentielle Anti- depressiva oder Anxiolytika dar und können bei kognitiven Erkran- kungen verwendet werden. Schließlich ist der Hippokampus stark in Temporallappenepilepsien involviert, was ein Protein mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 zu einem attraktiven Target für neue Medikamente gegen diese häufige Erkrankung macht. Im Cortex befinden sich Regionen, die sensorische Informationen integrieren, verar- beiten und in geeignete Reaktionen umwandeln. Diese sensorischen und motorischen Zentren sind oft auch Ausgangspunkte für epileptische Anfälle. Eine gezielte Beeinflussung der erfindungsgemäßen Proteine oder des erfindungsgemäßen Proteinkomplexes könnte die KrampfWahrscheinlichkeit bei Epilepsiepatienten senken. Die tha- lamischen Kerne sind dem Cortex vorgeschaltet, integrieren die über die Sinnesorgane aufgenommenen Wahrnehmungen und leiten sie an corticale Strukturen weiter. Sie sind häufig der Ausgangspunkt für generalisierte Krampfanfälle. Die starke Expression der erfindungsgemäßen Proteine in den thalamischen Kernen deutet darauf hin, daß seine Aktivierung oder seine Inhibition zur Linderung von Krampfanfällen in Epilepsiepatienten beitragen kann.

Im Gegensatz zu GIRKl ist SEQ ID NO: 1 stark in den Purkinje-Zel- len des Kleinhirns exprimiert . Durch eine Modulation des Erre- gungszustandes dieser Zellen könnte SEQ ID NO: 2 effektiv die Gesamtaktivität des Kleinhirns beeinflussen. Die cerebellären Verknüpfungen sind maßgeblich für die Feinkoordination- der Bewegungen verantwortlich. Ataxien und andere motorische Erkrankungen wie z.B. Dystonie könnten auf einer Deregulation eines Proteins mit der erfindungsgemäßen Sequenz beruhen.

Die Basalganglien einschließlich des Striatums sind für die Vorbereitung, Programmierung, Auslösung und Beendigung von Bewegungsabläufen von Bedeutung. Störungen im Muskeltonus haben ihre Ursache vor allem in einer veränderten Aktivität des Striatums.

Die erfindungsgemäßen Proteinkomplexe oder Proteine stellen damit interessante Targets für die Entwicklung neuer Substanzen dar, die zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankhei- ten wie neurologische Erkrankungen wie Epilepsie, Schlaganfall, psychische Erkrankungen wie Angst, manisch-depressive Erkrankungen, Migräne, kognitive Verluste oder Bewegungserkrankungen wie Hypokinesie, Hyperkinesie, Dystonie, Morbus Parkinson und anderen Störungen im Muskeltonus dienen können.

Das erfindungsgemäße Protein zeigt ein ähnliches aber nicht iden- tisches Expressionsmuster wie das nächste bekannte Homolog

(Lao et al., 2000). Mogli wird, wie oben schon erwähnt, stark im Gehirn exprimiert, vornehmlich ab dem E12-Stadium bei Ratten schwach, ab dem E15 stark und bis zum adulten Stadium zunehmend. Mogli wird besonders stark in Purkinjezellen und in Körnerzellen des Kleinhirns exprimiert, stark ebenfalls in Cortex und im Hippokampus, schwächer in verschiedenen thalamisehen Kernen, im Striatum und im Mittelhirn. So zeigt es in Verteilung und Stärke eine ähnliche aber keinesfalls identische Expression wie Syntaphilin (Lao et al., 2000). Da es vermutlich eine Rolle bei der Transmitterausschüttung spielen kann, kommen daher dem erfindungsgemäßen Protein eine wichtige Rolle als Angriffspunkt für Medikamente gegen neurologische Erkrankungen wie insbesondere Epilepsie, Dystonie, Schlaganfall, kognitiven Verlusten, chronischen Schmerzen und anderen sowie die Behandlung von psychischen Krankheiten wie insbesondere Angst, depressiven Erkrankungen, Schizophrenie, Migräne und anderen in Frage. Als Regulatoren der synaptischen Transmitterausschüttung stellen die erfindungsgemäßen Proteine besonders attraktive Angriffspunkte für einen effektiven pharmako-therapeutischen Eingriff dar.

Datenbanksuchen ergaben, daß das Gen für das erfindungsgemäße Protein in Fragmenten auf einem BAC (BAC clone: KB1171G1; DT: 13-SEP-1999 ID: AP000427) kodiert ist, dessen Nukleinsäurese- quenzdaten keinerlei Proteinsequenz entnommen werden kann. Dieser BAC wurde im humanen Genom lokalisiert und befindet sich in der Nähe des chromosomalen Locus, der mit der adulten, myoclonischen Epilepsie assoziiert ist (Mikami et al., 1999). Diese Korrelation könnte außerdem ein neues Diagnoseverfahren für diese Epilepsieform ermöglichen. Die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 kann dazu verwendet werden, Gene für mRNAs, die für diese Nukleinsäuren oder deren funktionellen Äquivalente, Homologe oder Derivate kodieren, im murinen und im menschlichen Genom mit gängigen Methoden durch Homologiescreening zu isolieren und zu kartieren und mit Markern für humane Erbkrankheiten zu korrelieren. Dies ermöglicht die Identifizierung des Gens als Ursache für bestimmte Erbkrankheiten, was ihre Diagnose erheblich vereinfacht und neue Therapieansätze ermöglicht. Mit Hilfe der Nukleinsäuren als Marker lassen sich damit Erbkrankheiten diagnostizieren. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Teilen davon zur Gentherapie. Auch zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Teilen davon komplementäre Sequenzen können zur Gentherapie verwendet werden.

Eine weitere Möglichkeit des Einsatzes der Nukleotidsequenz oder Teilen davon ist die Erzeugung transgener oder knock-out- oder konditioneiler oder regionenspezifischer knock-out Tiere oder spezifischer Mutationen in gentechnisch veränderten Tieren (Aus- übel et al . [eds]. 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York und Torres et al., [eds.Jm 1997, La- boratory protocols for conditional gene targeting, Oxford University Press, Oxford) . Über transgene Überexpression oder genetische Mutation (Nullmutation oder spezifische Deletionen, Inser- tionen oder Veränderungen) durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen kann man Tiermodelle erzeugen, die wertvolle weitere Informationen über die (Patho-) Physiologie der erfindungsgemäßen Sequenzen allein oder in Komplex beispielsweise mit den GIRKs oder SNARE-Proteinen, liefern. Solchermaßen herge- stellte Tiermodelle können essentielle Testsysteme zur Evaluierung neuartiger Therapeutika darstellen, die die Erregbarkeit von Neuronen speziell beeinflussen.

Die Interaktion des bekannten GIRKl mit dem neuen erfindungsgemä- ßen, beschriebenen Protein, das mit dem two-hybrid System entdeckt wurde, spielt möglicherweise eine wichtige physiologische Rolle. Dieser überraschende Befund ermöglicht neue außerordentliche Behandlungsmöglichkeiten im Hinblick auf die oben genannten neurologischen und psychischen Erkrankungen, die mit GIRKs im Zu- sammenhang stehen. Niedermolekulare Effektoren oder Peptide, die diese Interaktion positiv oder negativ beeinflussen, sind Wirkstoffe, die in die K⁺-Leitfähigkeit von Membranen eingreifen und damit als neue Klasse von Pharmaka zum Einsatz kommen können. Bislang sind keine Substanzen beschrieben, die die Interaktion zwischen Dom nen von Mogli und Kir- oder G RK-Proteinen beeinflussen und dadurch die Eigenschaften dieser Proteine modulieren. Ebenso können niedermolekulare Effektoren oder Peptide die Wechselwirkung von Mogli mit an der Transmitterausschüttung beteiligten Proteine beeinflussen und somit die Exocytose regulieren. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Proteinkomplexes oder der erfindungsgemäßen Proteine ermöglicht damit die Entwicklung neuer Wirkstoffe bzw. Wirkstoffklassen, die ein neues Wirkprinzip haben.

Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, des Nukleinsäurekonstrukts, eines erfindungsgemäßen Proteinkomplexes oder des Proteins können Proteine identifiziert werden, die z.B. zum GIRK oder SNARE-Proteinkomplex spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen, oder zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Proteine kodieren, die z.B. zum GIRK oder SNARE-Proteinkomplex oder zum Protein spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen. Vorteilhafterweise werden hierzu das two-hybrid System oder andere biochemische Verfahren allein oder in Kombination verwendet. Es lassen sich so intramolekulare Interaktionsdomänen von GIRKs und intermolekulare Interaktionsdomänen von Komplexen wie GIRKs oder SNARE-Komplexen und Mogli. und damit pharmakotherapeutische Interventionspunkte bestimmen.

Daher ist ein Gegenstand der Erfindung die Verwendung des two-hybrid Systems oder biochemischer Verfahren zur Identifizierung der Interaktionsdomänen von Moglis und dessen Interaktionspartner und die Verwendung zur pharmakotherapeutischen Intervention.

Über Strukturanalysen des Proteinkomplexes oder des erfindungsgemäßen Proteins lassen sich gezielt Substanzen finden, die eine spezifische Bindungsaffinität aufweisen.

Die beschriebenen Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 ermöglichen, mit Hilfe des two-hybrid Systems oder anderen Assays, die für die Interaktion verantwortlichen Aminosäuren einzugrenzen und Substanzen zu finden, mit denen insbesondere die Interaktion zwi- sehen Mogli und GIRKs beeinflusst werden kann.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Substanzen, die spezifisch die natürliche Interaktion des GIRKlN- mit dem GIRK1C- Terminus oder GIRKl mit dem Protein gemäß SEQ ID NO: 2 oder 4 re- duzieren oder verhindern.

Solche Substanzen binden bevorzugt an folgende Sequenzbereiche:

(i) an die Aminosäuresequenz des GIRKl oder

(ii) an die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder

(iii) an die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 oder

(iv) an die Interaktionsbereiche, die von den interagierenden Domänen von GIRK und SEQ ID NO: 2 oder von GIRK und SEQ ID NO: 4 gebildet werden, oder

(v) an die Interaktionsdomäne von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4, die in SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 wiedergegeben werden. Neben Substanzen, die an diese Sequenzen binden, sind auch diese Polypeptide selbst und Teile dieser Polypeptide als Substanzen geeignet, die die Interaktion stören oder verhindern, insbesondere Polypeptide, die eine Sequenz von mindestens 5 Amino- säuren einer dieser Sequenzen (i) , (ii) und (iii) aufweisen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität zum erfindungsgemäßen Proteinkomplex bzw. Protein, das folgende Schritte umfaßt.

a) Inkubation des oder der Proteine mit der zu testenden Substanz .

b) Detektion der Bindung der zu testenden Substanz an das Protein.

Die Detektion der Bindung erfolgt beispielsweise durch Messen der Aktivität von GIRKs, Änderung des Membranpotentials, der K⁺-Leit- fähigkeit, oder Messung der Transmitterausschüttung.

Systeme zur Detektion von Änderungen der Eigenschaften von Kaliumkanälen können wie folgt aufgebaut sein:

a) Ionensensitive Elektroden können verwendet werden, um spezifisch Änderungen der Kaliumkonzentration in der Umgebung oder in den Zellen selbst, hervorgerufen durch veränderte ^-Leitfähigkeit der Membran, zu messen (Uhlig et al . , Anal. Chem. , 69, 19, 1997: 4032 - 4308)

b) Änderungen des Membranprotentials können durch spezifisches Einbauen von Fluorophoren in K⁺-Kanäle direkt detektiert werden, da diese bei Spannungsanderungen eine Konformationsänderung erfahren (Mannuzzu et al . , 271, , 5246, 1996: 213 - 216).

c) Spannungsänderungen an Einzelzellen lassen sich durch geeignete Fluoreszensfarbstoffe nachweisen. Solche Meßsysteme können auf einem einzelnen Fluorophor-Indikator oder auf einem Zwei-Komponenten Sensor beruhen, der sich auf einen FRET- (= fluorescence resonance energy transfer) Effekt gründet (Gonzalez und Tsien, Chem. Biol., 4, 1997: 269 - 277).

Systeme zur Detektion der Änderung von Transmitterausschüttung können wie folgt aufgebaut sein: Eine Kultivierung von Neuronen nach Bekkers et al. (Proc. Natl. Acad. Sei USA, 88, 1991: 7843-7838) ermöglicht die Messung autap- tischer Antwort auf eine elektrische Stimulation. Mittels trans- ienter Expression von Proteinen gemäß Seq ID NO: 2, 4, 6 oder 8 durch virale Systeme (wie z.B. beschrieben in Park et al.,

J. Neurosci, 17, 23, 1997: 8975-8983) können Änderungen der Antwort an Autapsen hervorgerufen durch das überexprimierte Protein gemessen werden und damit auf die Transmitterausschüttung rückgeschlossen werden (Lao et al., Neuron, 25, 2000: 191-201).

Weitere Ausgestaltungsformen der Erfindung sind ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Interaktion von Proteinen mit Aminosäuresequenzen, wie sie in SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 4 dargestellt werden, mit Komplexen wie GIRKs oder SNARE-Komplexen hemmen oder verstärken. Die Interaktion von Proteinen mit den erfindungsgemäßen Aminosäuren läßt sich z.B. mit Hilfe des Two-hybrid Systems detektieren, insbesondere für GIRKl. Weiter lassen sich die Verfahren durch Expression der Proteine in eukaryoti- schen Zellen und Verknüpfung mit einem Reporter-Assay für die Ak- tivierung der GIRKs oder der Ausbildung von SNARE-Komplexen durchführen. Dabei wird beispielsweise die Änderung des Membranpotentials, die K⁺-Leitfähigkeit oder der Transmitterausschüttung detektiert .

Über Antikörper kann die Proteinaktivität der Proteine mit den Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 bestimmt werden. Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Quantifizierung der Proteinaktivität eines Proteins mit den Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4.

Die regulatorischen Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, insbesondere der Promotor, die Enhancer, locus. control regions und silencer oder jeweilige Teilsequenzen davon können für die gewebespezifische Expression von diesem und weiteren Genen verwendet werden. Damit ergibt sich die Möglichkeit, gehirnspezifische Genexpression von Nukleinsäurekonstrukten, speziell im Herz, Hippokampus, Cortex, Cerebellum, in thalamischen Kernen, im Striatum oder den Kernen von Mittel- und Stammhirn durchzuführen.

Um ein DNA-Fragment zu isolieren, das die Bereiche enthält, die die Transkription der Sequenzen SEQ ID N0:1 oder SEQ ID NO: 3 regulieren, wird zunächst eine genomische Bank mit einer möglichst weit 5' -positionierten cDNA-Probe durchsucht. Dazu wird eine dem Fachmann geläufige Homologiesuche durchgeführt (Aus bel et al. [eds.], 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) . Auf dem isolierten DNA-Fragment wird dann der Transkriptionsstart identifiziert. Der Bereich vor dem Transkrip- tionsstart wird anschließend mit einem Reportergen wie ß-Galacto- sidase oder GFP (= green fluorescent protein) verknüpft und in Zellen oder in transgenen Tieren wie Mäusen daraufhin getestet, ob er zu dem für SEQ ID N0:1 oder SEQ ID NO: 3 spezifischen Ex- pressionsmuster führt (Ausubel et al. siehe oben). Das Reportergen kann anschließend mit anderen cDNAs verknüpft werden, um Tiermodelle zu erstellen, in denen die jeweilige cDNA regionspezifisch exprimiert wird (siehe beispielsweise Oberdick et al., Science, 248, 1990: 223 - 226)..

Ausgehend von den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 können synthetische Peptide generiert werden, die als Anti- gene für die Produktion von Antikörpern eingesetzt werden. Es ist auch möglich, das Polypeptid oder Bruchstücke davon zur Generie- rung von Antikörpern einzusetzen. Mit Antikörpern sind sowohl po- lyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper oder Fragmente davon, Single chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper gemeint . Unter erfindungsgemäßen Antikörpern oder deren Fragmente sind prinzipiell alle Immu- noglobulinklassen wie IgM, IgG, IgD, IgE, IgA oder ihre Subklassen wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen zu verstehen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgGχ, IgG₂, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃ oder IgG_M- Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgGι/κ oder IgG_2b/κ. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei dem Antigen-komplementären Bindungsstellen, wie Antikörper- teile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F (ab' ) -Fragmente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂. Diese Fragmente können beispielsweise auf enzymatischem Wege durch Abspaltung des Fc-Teils der Antikörper mit Enzymen wie Papain oder Pepsin, durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden. Auch gen a- nipulierte nichtverkürzte Fragmente können vorteilhaft verwendet werden. Insbesondere können Antikörper auch für Fragmente der genannten Sequenzen generiert werden, z.B. von SEQ ID No. 6 oder 8.

Die Antikörper oder Fragmente können allein oder in Mischungen verwendet werden.

Die Antikörpergene für die gentechnischen Manipulationen lassen sich in dem Fachmann bekannter Weise beispielsweise aus den Hy- bridomzellen isolieren (Harlow, E. and Lane, D. 1988, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; Ausubel et al., [eds], 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) . Dazu werden Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die rnRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zellyse mit Guanidiniumthiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopropanol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen 5 in bekannter Weise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Reversen Transcriptase cDNA aus der rnRNA synthetisiert. Die synthetisierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation beispielsweise durch "site directed mutagenesis", Einführung von In- sertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustauscher in ge-

10 eignete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren inseriert und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimiert werden. Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu-Vektoren zur Klo- nierung der Gene und die Expression in Bakterien wie E. coli bzw.

-_je in der Hefe wie Saccharomyces cerevisiae .

Spezifische Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Proteine eignen sich sowohl als diagnostische Reagenzien als auch als Thera- peutika bei neurologischen oder psychiatrischen Krankheitsbil¬

20 dern.

Weiterhin können die cDNA, die genomische DNA, die regulatorischen Elemente der findungsgemäßen Nukleinsauresequenzen, als auch das Polypeptid, sowie Teilfragmente davon in rekombinanter oder nichtrekombinanter Form zur Ausarbeitung eines Testsystems

25 verwendet werden. Dieses Testsystem ist geeignet, die Aktivität des Promotors oder des Proteins in Anwesenheit der Testsubstanz zu messen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um einfache Meßmethoden (kolorimetrische, luminometrische, auf Fluoreszenz beruhende oder radioaktive) , die die schnelle Messung einer Vielzahl

30 von Testsubstanzen erlauben (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg) . Die beschriebenen Testsysteme erlauben das Durchsuchen von chemischen- Bibliotheken nach Substanzen, die meßbare Wirkungen auf SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 oder den neuen GIRK-Komplex, bestehend aus dem bereits

35 beschriebenen GIRKl und dem in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 beschriebenen Protein, oder auf die Komplexe zwischen dem erfindungsgemäßen Protein und beispielsweise an der Transmitterausschüttung beteiligten Proteinen haben. Die Identifizierung solcher Substanzen stellt den ersten Schritt auf dem Weg zur

40 Identifizierung neuartiger Medikamente dar, die spezifisch auf die K⁺-Leitfähigkeit oder Transmitterausschüttung wirken.

Ein alternativer Weg zur Entwicklung von Wirkstoffen, die am neuen Komplex wie GIRK-Protein-Komplex oder SNARE-Protein-Komplex

45 angreifen, besteht im rationalen Drug Design (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg) . Hier wird die Struktur oder eine Teilstruktur von dem in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Protein, soweit sie vorliegt, oder ein von Computern erstelltes Modell der Struktur, benutzt, um mit Unterstützung von Molecular Modelling Programmen Strukturen zu finden, für die sich eine hohe Affinität an Mogli vorher- sagen läßt . Diese Substanzen werden dann synthetisiert und getestet . Hochaffine, selektive Substanzen werden auf ihre Verwendung als Medikamente gegen Epilepsie, Sσhlaganfall und andere neurologische Erkrankungen getestet.

Die Bestimmung von Menge, Aktivität und Verteilung des erfindungsgemäßen Proteins, z.B. in einem erfindungsgemäßen Komplex wie SNARE- oder neuen GIRK-Protein-Komplex, insbesondere von dem in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Protein oder seiner zugrundeliegenden mRNA im menschlichen Körper kann zur Dia- gnose, Erfassung der Prädisposition und zum Monitoring bei bestimmten Erkrankungen dienen. Desgleichen kann die Sequenz der cDNA der Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 sowie der genomischen DNA zu Aussagen über genetische Ursachen und Prädispositionen bestimmter Erkrankungen herangezogen werden. Dazu können sowohl DN /RNA-Proben als auch Antikörper verschiedenster Art benutzt werden. Dabei dient die beschriebene Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder Teile davon in Form geeigneter Proben zur Aufdeckung von Punktmutationen oder Deletionen/Inser- tionen/Rearrangements .

Die vorliegende Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, ihre funktioneilen Äquivalente, Homologe oder Derivate, das von ihr kodierte Protein (SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4) oder der erfindungsgemäße Proteinkomplex sowie davon abgeleitete Reagenzien (Oligonukleotide, Antikörper, Peptide) können zur Diagnose und Therapie von neurologischen Erkrankungen eingesetzt werden. Außerdem wird die Diagnose und Behandlung vpn genetischen Prädispositionen für bestimmte neurologische Erkrankungen wie Epilepsie, Ataxien, Dystonie, Schlaganfall, psychische Erkrankun- gen wie Angst, manisch-depressive Erkrankungen, Migräne, kognitive Verluste und weitere neurologische Erkrankungen möglich. Weiterhin kann ein Monitoring der Behandlung oben angegebener Erkrankungen durchgeführt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis einer erfindungsgemäßen Nu- kleinsäure in einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfaßt: a) Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge an erfindungsgemäßer Nukleinsäure oder einer bekannten Menge an Oligonukleotiden, die als Primer für eine Amplifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure geeignet sind,

b) Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäure durch spezifische Hybridisierung oder PCR-Amplifikation,

c) Vergleich der Menge an hybridisierender Nukleinsäure oder an durch PCR Amplifikation gewonnener Nukleinsäure mit einem

Mengenstandard.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis des erfindungsgemäßen Proteinkomplexes oder eines erfindungsgemäßen Proteins in einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfaßt:

a) Inkubation einer biologischen Probe mit einem Antikörper, der spezifisch gegen den Proteinkomplex oder gegen das erfin- dungsgemäße Protein gerichtet ist,

b) Nachweis des Antikörper/Antigenkomplexes,

c) Vergleich der Mengen des Antikörper/Antigenkomplexes mit ei- nem Mengenstandard.

Als Standard wird üblicherweise eine biologische Probe aus einem gesunden Organismus entnommen.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 binden, das eipen oder mehrere der folgenden Schritte umfaßt:

a) Expression des Proteins in eukaryotisehen oder prokaryoti- schen Zellen.

b) Inkubation des Proteins mit den zu testenden Substanzen.

c) Nachweis der Bindung einer Substanz an Mogli oder die für die intramolekulare Wechselwirkung verantwortlichen Domänen in GIRKl beziehungsweise eines Effektes auf den K+-Strom oder einer Veränderung der Transmitterausschüttung.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an ein Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 bzw. an eine Nuklein- Säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 binden und dadurch hemmende oder aktivierende funktionelle Effekte auf die K⁺- Leitfähigkeit in zentralnervösen Neuronen bzw. bei der Transmitterausschüttung hervorrufen.

In Situationen, in denen ein Mangel an der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins oder des mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 komplettierten GIRKl/Mogli-Komplexes herrscht, können mehrere Methoden zur Substituierung eingesetzt werden. Zum einen kann das Protein, natürlich oder rekombinant direkt, oder durch geeignete Maßnahmen in Form seiner kodierenden Nukleinsäure (d.h. DNA oder RNA) appliziert werden. Dazu können sowohl virale, als auch nichtvirale Vehikel zum Einsatz kommen. Ein weiterer Weg bietet sich durch die Stimulation des endogenen, körpereigenen Genes durch geeignete Substanzen. Solche Substanzen lassen sich beispielsweise auffinden, indem man ihre Wirkung auf die Transkriptionselemente des neuen Mogli-Genes ermittelt .

In Situationen, in denen ein Überschuß an Aktivität des ein Pro- tein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 beinhaltenden GIRK-Protein-Komplexes oder von einem Protein mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 allein herrscht, können spezifische, synthetische oder natürliche, kompetitive und nicht-kompetitive Antagoni- sten gegen das Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 oder Antikörper oder Antikörperfragmente gegen das Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 oder gegen den Proteinkomplex eingesetzt werden. Desweiteren kann sowohl durch antisense Moleküle oder Ribozyme oder Oligonukleotide als auch durch niedermolekulare Verbindungen eine Änderung der GIRK-Ströme bzw. der Aktivität des Proteins mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 erreicht werden.

Verfahren wie die genannten, können bei Mangel oder Überschuß an Komplexen zwischen dem erfindungsgemäßen Protein und Proteinen, die an der Transmitterausschüttung beteiligt sind, eingesetzt werden.

In den erfindungsgemäßen Verfahren ist das interagierende Protein vorzugsweise ein SNARE-Komplex-Protein oder ein daran assoziier- tes Protein oder ein Kir-Protein, das Verfahren kann auch die Schritte der oben genannten Verfahren umfassen.

Ebenfalls umfaßt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Substanzen die Transmitterausschüttung verstärken oder schwächen. Die Transmitterausschüttung kann wie unten beschrieben, getestet werden. Die Erfindung betrifft insbesondere auch Arzneimittel, die die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, das erfindungsgemäße Protein, den erfindungsgemäßen Antikörpern, oder den Proteinkomplexen, ein Antisensemoleküle der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- sequenz oder eine Substanz, die nach einem der vorhergehenden Verfahren aufgefunden wurde, und optional, einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält .

Ebenso betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Detektion einer Erkrankung das die Schritte des Verfahrens umfaßt, wobei der Standard so gewählt wurde, daß er die Expression eines gesunden Organismus repräsentiert .

Weiterhin ist ein Mittel zur Diagnose von Genotypen umfaßt, das die genannte Nukleinsäure, eine Fragment davon, oder ein Anti- sense-Nukleinsäuremolekül davon enthält.

Folglich betrifft die Erfindung auch Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, das die Schritte eines der erfindungsgemäßen Verfahren umfaßt und zudem die Formulierung der aufgefundenen Substanz mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger beinhaltet . Allgemeine Verfahren sind dem Fachmann hinreichend bekannt .

Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung der Nuklein- säuresequenz, des Proteins, des Antikörpers oder einer Antisense- moleküls wie sie oben beschrieben wurden oder einer der nach der vorhergehenden Verfahren aufgefundenen Substanzen, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung neurologischer Erkrankungen. Insbesondere können damit die obengenannten Erkrankungen aufgrund erhöhter oder erniedrigter Transmitterausschüttung behandelt werden. Ebenso können die durch die Modulation von GIRK- Proteinen beeinflußbaren Krankheiten behandelt werden, wie sie oben aufgezählt wurden.

Beispiele

Die molekulare Charakterisierung von Interaktionspartnern der GIRKl-Untereinheit ermöglicht die physiologische und pharmakolo- gische Vielfalt der GIRK-Kanäle besser zu verstehen, sowie neue konkrete Angriffspunkte für pharmakotherapeutische Interventionen zu erhalten. Aus einer cDNA Rattengehirn-Bibliothek wurden GIRKl-Interaktionspartner über ein Screening mit dem Yeast-Two- Hybrid-System gefunden. Es wurden zwei überlappende Fragmente einer unbekannten cDNA isoliert. Mit Hilfe dieser Fragmente wurde aus einer cDNA-Bibliothek aus Rattenhippokampus und -cortex zwei etwa 3kb lange cDNAs durch Homologiescreening isoliert und anschließend sequenziert. Die so gewonnene cDNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 enthält den kompletten kodierenden Bereich für die Sequenz SEQ ID NO: 2.

Die Sequenzanalyse des durch die vorliegende cDNA (= SEQ ID NO:l) kodierten Polypeptids sagt eine Vielzahl potentieller Phosphory- lierungsstellen, eine stark geladene Domäne und im carboxytermi- nalen Bereich zwei hydrophobe Domänen voraus. Letztere durchspannen möglicherweise die Plasmamembran, so daß es sich wahrscheinlich um ein Membranprotein handelt . Mehrere potentielle Phospho- rylierungsstellen deuten darauf hin, daß das Protein selbst einer Regulation durch Phosphatasen und/oder Kinasen unterworfen ist.

Die geladene Domäne, für die eine α-helikale Struktur vorhergesagt wird, wurde in Hefe-Kotransformationsstudien als der mit GIRKl interagierende Bereich identifiziert.

Sequenzvergleiche (Altschul et al., 1990) der Basensequenz (SEQ ID NO: 1) mit öffentlichen Nukleotiddatenbanken (embl) mit Hilfe des BLAST-Programmes (Version BLASTP 2.0al9-WashU [05-Feb-1998] ) zeigten Ähnlichkeit mit einer bekannten cDNA-Se- quenz ("KIAA0374"; accession no: AB002372) . Auf Aminosäureebene ist die Ähnlichkeit besonders hoch in der geladenen Domäne, erstreckt sich aber nicht über den aminoterminalen Bereich.

Bei den in SEQ ID NO: 2 beziehungsweise SEQ ID NO: 4 beschriebenen Proteinen handelt es sich um neue Proteine, die mit der GIRKl-Untereinheit interagieren können und Einfluß auf die Eigenschaften dieser Kanäle haben.

Die Verteilung der rnRNA, von der die cDNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 stammte, wurde mittels Northern Blot und mittels in situ-Hybridi- sierung auf Rattenhirnschnitten untersucht. Die Analyse von 10 verschiedenen Rattengeweben ergab eine gehirnspezifische Expression einer 3kb großen rnRNA. Die in situ-Hybridisierung ergab eine starke Expression in Cortex, Cerebellum und Hippokampus sowie eine schwächere Expression in weiteren Hirnregionen.

Das Expressionsmuster der SEQ ID NO: 1 überlappt mit dem der GIRKl-Untereinheit und deutet auf eine wichtige zentralnervöse Funktion des in SEQ ID NO: 2 dargestellten Proteins hin.

Soweit nicht anders angegeben wurde bei der experimentellen Durchführung entsprechend den Vorschriften in "Ausubel et al., (eds.), 1998. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley&Sons, New York" verfahren. Beispiel 1

Two-hybrid Suche mit dem Amino- und Carboxyterminus der GIRKl-Untereinheit

Die für den Carboxy- und Aminoter inus der GIRKl-Untereinheit kodierenden cDNAs (accession no.: U09243, EMBL-Datenbank) wurden in zwei unabhängigen Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) mit den folgenden spezifischen Primern: ,

GIRKl-NC-s (5 -ACAGTCGACTATGTCTGCACTCCGAAGGAA-3 ' ) und GIRKl-NC-Las ( 5 ^v -ACCGCTGGAGCCCGAAGAGATAAAGAGGTTCCAAC-3 ^% )

beziehungsweise GIRKl-NC-Ls ( 5 -TCTTCGGGCTCCAGCGGTATCAAGATGTCCCAGCCC-3 ^x ) und GIRKl-NC-as ( 5 * -GTCACTAGTGGTGTTTTGCTATGTGAAGCG-3 ^λ )

von Rattenhirn-cDNA amplifiziert. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden in einer weiteren PCR-Reaktion fusioniert, indem fünf Re- aktionszyklen mit dem Enzym/Puffergemisch und den PCR-Produkten wurden, wie dem Fachmann bekannt ist, durchgeführt. In dieser Reaktion dienten die an die Primer GIRKl-NC-Las und GIRKl-NC-Ls angehängten Linkersequenzen als Primer für den Gegenstrang. Für die folgenden zwanzig Reaktionszyklen wurden die Primer GIRKl-NC-s und GIRKl-NC-as zupipettiert. Das erhaltene Konstrukt wurde mit den Restriktionsenzymen Sall und Spei verdaut und danach über die überhängenden Enden in einen mit Sall und Spei vorgeschnittenen Vektor pDBLeu (Firma LifeTechnologies) kloniert. Das so entstandene DNA-Konstrukt ( "GIRKl-NC-bait" ) kodiert für ein Protein, in dem die GAL4-DNA-Bindungsdomäne mit dem N-Terminus der GIRKl-Untereinheit, einer Linkersequenz (NH-GSSGSS-C00H) und mit dem C- Terminus von GIRKl fusioniert ist. Mit diesem Konstrukt wurde der Hefestamm Y190 (Firma LifeTechnologies) transformiert. Der resultierende Hefestamm wurde mit einer Rattenhirn-cDNA Bank im Vektor pPC86 (Firma LifeTechnologies) transformiert und 5,27mio Transformanden auf Tryptophan/Leucin/Histidin-Mangelmedien, die mit 20mM 3-Amino-l,2, 4-Triazole (3AT, Firma SIGMA) versehen waren, plattiert. Nach 3, 4 und 5 Tagen Wachstum bei 30°C wurden elf Kolonien mit einem Durchmesser von 1mm und mehr vereinzelt (G RKINC-preys 1-11) und einer X-Gal-Färbung unterzogen. Insgesamt sechs Kolonien erwiesen sich als His3- und LacZ-positiv. Aus diesen wurden die Bankplasmide isoliert und die cDNA mit den vektorspezifischen Primern pPC86a (S'-GTATAACGCGTTTGGAATCAC-S " ) und pPC86b (5^,-GTAAA TTC GGCAAGGTAGAC-3^,) sequenziert. Die Sequenzanalyse ergab 2 verschiedene, überlappende Fragmente ( "GIRKlNCprey3" : Nukleotide 500-1193 und "GIRKlNCprey2": Nukleotide 1011-1349 der SEQ ID NO: 1) einer unbekannten cDNA.

Die aufgereinigte pPC86-Plasmid-DNA wurde mit verschiedenen pDBLeu-Konstrukten in den Hefestamm Y190 kotransformiert . Nur in Kombination mit dem Konstrukt GIRKINC-bait konnte eine Aktivierung der Reportergene His3 und LacZ festgestellt werden.

Beispiel 2

Klonierung der cDNA für den neuen GIRKl-Interaktionspartner Mogli

Ein aus der two-hybrid Suche gewonnenes cDNA-Fragment gemäß Beispiel 1 (Nukleotide 500-1193 in Sequenz SEQ ID NO: 1) wurde mit dem rando primed labelling kit (Firma BOEHRINGER MANNHEIM) entsprechend den Herstellerangaben mit α-³²P-dCTP radioaktiv markiert. Die durch Erhitzen denaturierte, radioaktive Sonde wurde auf 20 Nitrozellulosefilter, auf die je 24000 Plaques einer cDNA-Bank aus Rattenhippokampus und -cortex im Bakteriophagen λ transferiert worden waren, 16 Stunden lang hybridisiert (42°C, 5XSSC/50% Formamid) und daraufhin mehrfach mit 0,2xSSC bei 55° beziehungsweise 60°C gewaschen. Von 20 positiven λ-Klonen wurden neun vereinzelt, Phagen-DNA isoliert und kartiert. Die cDNA-Fragmente der Klone 8 und 11 wurden vollständig sequenziert. Sie enthalten ein offenes Leseraster für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2. Die Sequenzanalyse dieser beiden λ-cDNA-Klone ergab einen Unterschied in der kodierenden Sequenz, eine stille Mutation (Nukleotid 1815: C zu T) . Eine Analyse der übrigen Phagenklone ergab, daß in Position 1815 die Base T in acht von neun untersuchten Fällen auftritt. SEQ ID NO: 1 schließt damit Sequenzen ein, die an Position 1815 ein T oder ein C enthalten (in SEQ ID NO: 1 mit "Y" gekennzeichnet) . Es handelt sich also um eine Stille Mutation,- die die Aminosäuresequenz des Proteins nicht beeinflußt. Es handelt sich in beiden Fällen um die Aminosäure Prolin (siehe Xaa in den Sequen- zen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2) .

Beispiel 3

Expression der rnRNA für den neuen GIRKl-Interaktionspartner Mogli in Rattengeweben

Ein aus der two-hybrid Suche gewonnenes cDNA-Fragment gemäß Beispiel 1 (Nukleotide 500-1193 in Sequenz SEQ ID NO: 1) wurde mit dem random primed labelling kit (Firma BOEHRINGER MANNHEIM) entspre- chend den Herstellerangaben mit -³²P-dCTP radioaktiv markiert. Die durch Erhitzen denaturierte, radioaktive Sonde wurde mit einem Multiple Tissue Northern Blot (je 10μg total RNA von Ratten- gehirn, -leber, -lunge, -herz, -niere, -skelettmuskel , -dünndarm und -testis; isoliert nach "Chomzinsky und Sacci, Anal. Biochem. , 162, 156-159, 1987") in QuickHyb-Lösung (Firma STRATAGENE) für eine Stunde bei 68°C inkubiert und daraufhin bei 55°C und 0,lxSSC/ 0,1%SDS gewaschen. Nach 3 Tagen Exposition wurde ein starkes Hy- bridisierungssignal auf Gehirn-RNA bei etwa 3kb und kein Signal in allen anderen untersuchten Geweben festgestellt (siehe Figur 1, A) . Figur 1 A: Abbildung des Multiple Tissue Northern, der wie oben beschrieben hergestellt wurde. Angegeben sind die Laufweiten des verwendeten RNA-Größenstandards (in Kilobasen) und die Herkunftsorgane der RNA-Proben, die in den verschiedenen Spuren aufgetragen wurden.

Dieselbe Sonde wurde mit einem Northern Blot verschiedener Ent- wicklungsstadien (je lOμg total RNA von Rattengehirn der Stadien embyonal (E) 9, E12, E15, E18, postnatal (P) 0, P14, P21 und "Adult" ; isoliert nach Chomzinsky und Sacci (s.o.)) in QuickHyb- Lösung (Firma STRATAGENE) für eine Stunde bei 68°C inkubiert und daraufhin bei 55°C und 0,1XSSC/ 0,1%SDS gewaschen. Nach 3 Tagen Ex- position wurde kein Hybridisierungssignal im Stadium E9; ein schwaches Hybridisierungssignal im Stadium E12 und ein deutliches Signal ab E15, das bis zum Adultstadium leicht zunimmt, detek- tiert (siehe Figur 1, B) . Figur 1 B: Abbildung des Northern Blots verschiedener Entwicklungsstadien, der wie oben beschrieben hergestellt wurde. Angegeben sind die Laufweiten des verwendeten RNA-Größenstandards (in Kilobasen) und das Alter der Ratten, deren Gehirn-RNA-Proben in den verschiedenen Spruren aufgetragen wurden.

Beispiel 4

Expression der rnRNA für den neuen GIRKl-Interaktionspartner Mogli im Rattengehirn

Die Verteilung der rnRNA für SEQ ID NO: 1 im Rattengehirn• wurde durch in-situ Hybridisierung unter Verwendung von RNA-Proben ermittelt, die von SEQ ID NO: 1 abgeleitet wurden. Mit geeigneten RNA-Polymerasen T7 und T3 und Digoxigenin-markierten Nukleotiden (UTP) wurden von einem mit Xhol oder Notl linearisierten pBS-Vek- tor, der die SEQ ID NO: 1 enthielt, sense- und antisense-Proben hergestellt. Etwa 15 um dicke horizontale Gehirnschnitte wurden fixiert, permeabilisiert, azetyliert und über Nacht bei 65°C in 5XSSC, 50%Formamid mit den Proben hybridisiert. Die Schnitte wurden bei 20°C zweimal für 10 Minuten mit 2XSSC, dann bei 65° für 10 Minuten mit 0,2XSSC und schließlich bei 20°C für 5 Minuten mit 0,2xSSC gewaschen. Anschließend wurde einzelsträngige KNA durch Behandlung mit RNAseA (50 μg/ l) (Firma SIGMA) bei 37°C für 30 Mi- nuten abgebaut. Entsprechend den Angaben des Herstellers wurden die Schnitte mit Alkalischer Phosphatase markierten anti-Digoxi- genin Antikörpern (BOEHRINGER MANNHEIM) inkubiert, gewaschen und de- tektiert .

Das stärkste Signal wurde in Purkinjezellen und Körnerzellen des Kleinhirns detektiert. Ebenfalls starke Signale wurden im Cortex und im Hippokampus, schwächere in verschiedenen thalamischen Kernen, im Striatum und im Mittelhirn gefunden (siehe Figur 2) . Fi- gur 2: In-situ Hybridisierung für SEQ ID NO: 1,

Figur 2 A: Horizontaler Schnitt durch adultes Rattengehirn. Hy- bridisierungssignale von SEQ ID NO: 1 treten aufgrund der inver- sen Darstellung hell hervor. Figur 2 B - D: Vergrößerte Ausschnitte eines horizontalen Schnit- tes durch ein adultes Rattengehirn. Vergleich der Hybridisieungs- muster von SEQ ID NO: 1 und GIRKl im Cerebellum und Hippokampus . Hybridisierungssignale hier dunkel dargestellt (Abkürzungen in der Figur: CA1-3: Felder CA1-3 des Hippokampus; Ctx.- Cortex; Dg: Gyrus dentatus; Gr: granuläre Schicht/Körnerzellen; Hi: Hip- pokampus; Pu: Purkinje Zellen) .

Beispiel 5

Klonierung und Sequenzierung der cDNA für die humane Form des neuen GIRKl-Interaktionspartners Mogli ("hsMogli")

Ein aus der two-hybrid Suche gewonnenes cDNA-Fragment gemäß Beispiel 1 (Nukleotide 500-1193 in Sequenz SEQ ID NO: 1) wurde mit dem random primed labelling kit (Firma BOEHRINGER MANNHEIM) entspre- chend den Herstellerangaben mit α-³²P-dCTP radioaktiv markiert. Die durch Erhitzen denaturierte, radioaktive Sonde wurde auf 18 Nitrozellulosefilter, auf die je -30000 Plaques einer cDNA-Bank aus humanem Hippokampus im Bakteriophagen λ transferiert worden waren, 16 Stunden lang hybridisiert (42°C, 5XSSC, 50% Formamid) und daraufhin bei 20°C für 15 Minuten mit IxSSC sowie zweimal bei 50°C für jeweils 10 Minuten mit 0,5xSSC gewaschen. Vier positive λ-Klone wurden vereinzelt, Phagen-DNA isoliert und kartiert. Die cDNA-Fragmente der beiden längsten Klone (1 und 2) wurden vollständig sequenziert. Sie enthielten die hsMogli-Sequenz entspre- chend Nukleotiden 751-1992 bzw. 707-1992 in SEQ ID NO: 3. Keiner der isolierten Klone enthielt weiter stromaufwärts gelegene Sequenzen. Um das offene Leseraster für hsMogli zu vervollständigen, wurde humane hippokampale RNA mit Reverser Transkriptase (Firma LIFETECHNOLOGIES) in cDNA umgeschrieben. Ausgehend von dieser cDNA wurden mit Primer-Oligonukleotiden, die von der Rattensequenz SEQ ID NO: 1 bzw. von öffentlichen humanen Datenbanksequenzen (ESTs) abgeleitet wurden, verschiedene PCR-Reaktionen mit KlenTaq DNA Polymerase (Firma CONTECH) entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Eine dieser Reaktionen, hsMogli8s (5 ' -TCGCACAGCTGATAGGATTAGG-3 ' ) / hsMoglillas(5'- CCTCATGATGGGGCTACAGTCG -3'), ergab ein verkürztes Produkt, dessen Sequenz aber die Synthese von spezifischen Primern für hsMogli ermöglichte. Die Primer-Kombinationen hsMoglil2s (5 ' -TTTGTCAGCCCTGATTGAGCC-3 ' ) / hsMoglil4as (5 ' -GAGCTGCTGGGGTTGAACTCTC-3 ' ) ,

hsMoglil3s (5 ' -GAGAGTTCAACCCCAGCAGCTC-3 ' ) / hsMoglillas ( 5 ' -CCTCATGATGGGGCTACAGTCG-3 ' ) sowie hsMogli23s (5 ' -GAGAGCAAGGAGCACAGA-3 ' ) / hsMoglillas (5 ' -CCTCATGATGGGGCTACAGTCG-3 ' )

ergaben schließlich die gewünschte Bandengrößen. Die Amplikons wurden mit den PCR-Primern und mit internen Primern direkt sequenziert. Die resultierende Sequenz wurde mit der Sequenz aus den λ-Klonen 1 und 2 fusioniert. Sie ergab ein offenes Leseraster, das in SEQ ID NO: 3 dargestellt ist.

Beispiel 6

Kotransformationsstudien zur genaueren Bestimmung der interagie- renden Domänen von GIRKl und dem GIRKl-Interaktionspartner Mogli

Die für den Carboxy- beziehungsweise den Aminoterminus der GIRKl-Untereinheit kodierende DNA (accession no. : U09243, EMBL- Datenbank) wurde ausgehend von dem Plasmid "GIRKINC-bait" unter Verwendung der Primer GGIRKl-4s (5 ^λ-TAGGTCGACCATGTTTAGCGAG- CATGCGGTT-3 ) und GG RKl-as (5 * -GTCACTAGTTGGGGTGTTTTGCTATGT- GAAG-3 beziehungsweise GIRKl-NC-s (5 -ACAGTCGACTATGTCTGCACTC- CGAAGGAA-3 ) und GIRKl-N-as (5 ^x-GTCACTAGTGATAAAGAGGTTCCAAC-3 ) mittels PCR amplifiziert und in den Vektor pDBLeu kloniert. Jedes der Plasmide wurde mit dem pPC86-Plasmid GIRKlNCprey2 (SEQ ID NO: 1, Nukleotide 1011-1349) oder mit dem Plasmid GIRKlNCprey3 (SEQ ID NO: 1, Nukleotide 500-1193) in den Hefestamm Y190 kotransfor- miert. Die Kotransformation des N- oder C-Terminus von GIRKl mit einem der prey-Plamide führte in keinem Fall zu einer Aktivierung der Reportergene des Hefestammes Y190. Offensichtlich findet die Interaktion mit Mogli nur in Gegenwart beider intrazellulärer Anteile von GIRKl statt.

Der Bereich der SEQ ID NO: 1 Nukleotid 1011-1193 ist in den bei- den Plasmiden GIRKlNCprey2 und GIRKlNCprey3 enthalten. Um zu kontrollieren, ob dieser Bereich eine Interaktion mit GIRKl vermitteln kann, wurde er unter Verwendung der Primer lNCprey23o-s (5 -ACAGTCGACGGAGTCTGAGCGCCGA-3 ' ) und lNCprey23o-as (5 *-GTCGCGGCCGCCTGCTCCTCATAGTCTC-3 ' )

in das Plasmid pPC86 kloniert. Dieses Konstrukt wurde mit dem Klon GRKl-NC-bait in den Hefestamm Y190 kotransformiert und die Aktivierung der Reportergene überprüft. Auch hier fand keine Aktivierung statt, was darauf hindeutet, daß ein größeres Element des Proteins Mogli für eine funktionelle Interaktion verantwort- lieh sein muß.

In den öffentlichen Datenbanken ist eine humane Sequenz enthalten ("KIAA0374"; accession no . : AB002372), die für ein Protein kodiert, das im Bereich der Aminosäuren 85-243 Ähnlichkeit zu den Aminosäuren 237-395 in SEQ ID NO: 2 (enthaltend SEQ ID NO: 6) beziehungsweise zu den Aminosäuren 233-391 in SEQ ID NO: 4 (enthaltend SEQ ID NO: 8) aufweist. Diese Bereiche zeichnen sich in den drei Proteinen durch eine Vielzahl geladener Aminosäuren aus und Strukturvorhersageprogramme gaben eine α-helikale Struktur für diesen Bereich an. Die DNA für die geladenen Domänen SEQ ID NO: 6 und Aminosäure 85-243 in KIAA0374 wurden unter Verwendung spezifischer Primer amplifiziert, mit den Restriktionsenzymen Sall/ Notl verdaut und in einen gleichermaßen verdauten Vektor pPC86 kloniert (MOGLI-charged-s : 5 ' -GACGTCGACAGGCTCCTACAAAGGAAGCGAC-3 ^x und MOGLI-charged-as : 5 ^λ -GAGCGGCCGCTCAGTCTAGACACAGTTCATCCCTC-3 ^x ; MOGLI2-charged-s : 5 ^» -GACGTCGACAGGCTCCTACAAGGGCAGTGAC-3 ^λ und MOGLI2-charged-as : 5 ^x -GAGCGGCCGCTCACTCCCCAGTGCCATCCTCCTT-3 ^λ ) . Diese Konstrukte wurden mit der GIRKl-NC-bait in den Hefestamm Y190 kotransformiert . Nur in der Kombination der GIRKlNC-bait mit dem Konstrukt des geladenen Teils von Mogli konnte eine Aktivierung der Reportergene His3 und LacZ festgestellt werden. Die geladene Domäne des Proteins Mogli war demzufolge in der Lage, mit GIRKl zu interagieren; das Ergebnis unterstreicht die Spezifität der GIRKl-Mogli Interaktion, da für die geladene Domäne des von KIAA0374 kodierten Proteins, trotz starker Ähnlichkeit zur geladenen Domäne von Mogli, keine Wechselwirkung mit GIRKl nachgewiesen werden konnte .

Beispiel 7

Two-hybrid Suche mit dem Aminoterminus der SEQ ID N0:1

Die für den Aminoterminus der SEQ ID N0:1 kodierende cDNA wurden in einer Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) mit den spezifischen Primern GIP-N-s (5 ' CGGAATTCGCAGGCAACGACGAGATG-3 ' ) und GIP-N-as (5 ' -CGCGTCGACGTCTAGACACATGTCATCC-3 ' ) vom cDNA Fragment des λ8 (Beispiel 2) amplifiziert. Das erhaltene Konstrukt wurde mit den Restriktionsenzymen Sall und EcoRI verdaut und danach über die überhängenden Enden in einen mit Sall und EcoRI vorgeschnittenen Vektor pGBTIO (Firma CLONTECH) kloniert. Das so entstandene DNA- Konstrukt ("MogliN-bait") kodiert für ein Protein, in dem die GAL4-DNA-Bindungsdomäne mit dem N-Terminus der SEQ ID NO: 2 fusioniert ist. Mit diesem Konstrukt wurde der Hefestamm HF7c (Firma CLONTECH) transformiert. Der resultierende Hefestamm wurde mit einer Rattenhirn-cDNA Bank im Vektor pACT2 (Firma CLONTECH) transformiert und 1,25 mio Transformanden auf Tryptophan/Leucin/ Histidin-Mangelmedien plattiert. Nach 3, 4 und 5 Tagen Wachstum bei 2100C wurden Kolonien mit einem Durchmesser von 1 mm und mehr vereinzelt (MogliN-preys 1-210) und einer X-Gal-Färbung unterzogen. Insgesamt 54 Kolonien erwiesen sich als His3- und LacZ-posi- tiv. Aus diesen wurden die Bankplasmide isoliert und die cDNA mit den vektorspezifischen Primern pACT2s (5 ' -CTATTCGATGATGAAGATAC- CCCACCAAACCC-3 ' ) und pACT2as (5 ' -GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATC- TACGA-3 ' ) sequenziert. Die Sequenzanalyse ergab folgendes:

a) 11 unabhängige Klone enthielten die cDNA-Sequenz , die für das Ratten-Homolog der Datenbankeinträge von Mus musculus EB2

(accession No: U51204) bzw. Homo sapiens EB3 (accession No: AB025186) codierten

b) 3 unabhängige Klone enthielten die cDNA-Sequenz , die für das Ratten-Homolog des Datenbankeintrags von Homo sapiens

KIAA0627 (accession No: AB014527) codierten

c) 2 unabhängige Klone enthielten die cDNA-Sequenz , die für das Ratten-Homolog des Datenbankeintrags von Homo sapiens KIAA0622 (accession No: AB014522) codierten.

Die aufgereinigten pACT2-Plasmid-DNAs wurden mit verschiedenen pGBTlO-Konstrukten in den Hefestamm HF7c kotransformiert . Nur in Kombination mit dem Konstrukt MogliN-bait konnte eine Aktivierung der Reportergene His3 und LacZ festgestellt werden.

Claims

Patentansprüche

1. Isolierte Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1,

SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenz,

b) Nukleinsauresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,

c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 60 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die biologische Akti- vität der Polypeptide wesentlich reduziert ist

2. Protein kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1.

3. Proteinkomplexe, enthaltend mindestens ein Protein gemäß Anspruch 2 und mindestens ein weiteres Protein wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften des in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Proteins oder des Proteinkomplexes erhalten bleibt .

4. Proteinkomplex nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem wei- teren Protein um ein GIRK-Protein handelt .

5. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 und eine Sequenz, die für ein weiteresPro- tein kodiert, funktionell verknüpft mit mindestens einem genetischen Regulationselement .

6. Wirtsorganismus, transformiert mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder einem rekombinanten Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 5.

7. Transgene Tiere enthaltend eine funktionelle oder nicht funktionelle Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder ein funk- tionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 5.

8. Transgene Tiere, in deren Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen, oder in dessen Keimzellen und der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen die Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 durch gentechnische Verfahren verändert oder durch Einfügen von DNA-Elementen unterbro- chen wurde .

9. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, eines Nukleinsäurekonstrukts gemäß Anspruch 5, eines Proteinkomplexes gemäß Anspruch 3 oder Proteins gemäß Anspruch 2 zur Iden- tifizierung von Proteinen, die zu einem Proteinkomplex gemäß Anspruch 3 oder einem Protein gemäß Anspruch 2 spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen, oder zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Proteine kodieren, die zu einem Proteinkomplex gemäß Anspruch 3 oder einem Protein gemäß An- spruch 2 spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen.

10. Verwendung des two-hybrid Systems oder biochemischer Verfahren zur Identifizierung der Interaktionsdomänen von Kirs, GIRKs mit Proteinen gemäß Anspruch 2 und Verwendung zur phar- makotherapeutisehen Intervention.

11. Verwendung der aus einer Strukturaufklärung eines Proteinkomplexes gemäß Anspruch 3 oder eines Proteins gemäß Anspruch 2 resultierenden Information zum gezielten Auffinden oder zur gezielten Herstellung von Substanzen mit spezifischer Bindungsaktivität zu einem Proteinkomplex gemäß Anspruch 3 oder einem Protein gemäß Anspruch 2.

12. Verwendung eines Proteinkomplexes gemäß Anspruch 3 oder eines Proteins gemäß Anspruch 2 oder Peptidfragmenten davon als An- tigen zur Erzeugung von spezifischen mono- oder polyklonalen Antikörpern oder Antikörpergemischen gerichtet gegen Proteine gemäß Anspruch 2 oder gegen Proteinkomplex gemäß Anspruch 3.

13. Mono- oder polyklonale Antikörper oder Antikörpergemische, die spezifisch Proteine nach Anspruch 2 oder Proteinkomplexe nach Anspruch 3 erkennen.

5 14. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder eines Fragmentes davon zur Isolierung einer genomischen Sequenz über Homologiescreening, als Marker für humane Erbkrankheiten oder zur Gentherapie.

10 15. Verfahren zum Auffinden von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität zu einem Protein nach Anspruch 2, das folgende Schritte umfaßt.

a) Inkubation des Proteins gemäß Anspruch 2 mit der zu te- 15 stenden Substanz.

b) Detektion der Bindung der zu testenden Substanz an das Protein.

20 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion der Bindung durch Messen der K+-Leitfähigkeit von GIRK-Proteinen bzw. der Transmitterausschüttung erfolgt.

17. Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis einer 25 Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 in einer biologischen Probe, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfaßt:

a) Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge an Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder einer bekann-

30 ten Menge an Oligonukleotiden, die als Primer für eine

Amplifikation der Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 geeignet sind oder Mischungen davon,

b) Nachweis der Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 durch spezifi- 35 sehe Hybridisierung oder PCR-Amplifikation,

c) Vergleich der Menge an hybridisierender Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder an durch PCR Amplifikation gewonnener Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 mit einem Standard.

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18. Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis eines Proteins gemäß Anspruch 2 oder eines Proteinkomplexes gemäß Anspruch 3 in einer biologischen Probe, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfaßt:

45 a) Inkubation einer biologischen Probe mit einem Antikörper gemäß Anspruch 13, der spezifisch gegen Proteine gemäß Anspruch 2 oder einen Proteinkomplexes gemäß Anspruch 3 gerichtet ist,

b) Nachweis des Antikörper/Antigenkomplexes ,

c ) Vergleich der Mengen des Antikörper/Antigenkomplexes mit einem Mengenstandard.

19. Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an ein Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 binden, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfaßt :

a) Expression des Proteins in eukaryotischen oder prokaryo- tischen Zellen.

b) Inkubation des Proteins mit den zu testenden Substanzen.

c) Nachweis der Bindung einer Substanz an das Protein.

20. Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Interaktion von Proteinen mit Aminosäuresequenzen gemäß Anspruch 2 mit interagierenden Proteinen hemmen oder verstärken.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das interagierende Protein ein Kir-Protein ist.

22. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das interagierende Protein ein SNARE-Komplex-Protein oder ein daran assoziiertes Protein ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei das Verfahren auch die Schritte des Verfahrens nach Anspruch 15, 16 und/oder 19 umfaßt.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 20, 22 und 23, wobei die Substanzen die Transmitterausschüttung verstärken oder schwächen.

25. Arzneimittel, das die Nukleinsäuresequenz, das Protein, des Antikörpers, den Proteinkomplex, eines der vorhergehenden Ansprüche , ein Antisensemoleküle zu der Nukleinsäuresequenz von Anspruch 1, oder eine' Substanz, die nach einem der vor- hergehenden Ansprüche aufgefunden wurde und, optional, einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.

26. Verfahren zur Detektion einer Erkrankung umfassend die Schritte des Verfahrens nach Anspruch 17 oder 18, wobei der Standard so gewählt wurde, daß er die Expression eines gesunden Organismus repräsentiert.

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27. Mittel zur Diagnose von Genotypen, umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 1, eines Fragments davon, oder eines Antisense- Nukleinsäuremoleküls davon.

10 28. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, umfassend die Schritte eines der Verfahren nach Anspruch 15, 16 oder 17, und Formulierung der aufgefundenen Substanz mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

15 29. Verwendung der Nukleinsäuresequenz, des Proteins, des Antikörpers nach einem der vorhergehenden Ansprüche oder einer Antisensemoleküls gegen die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder einer der nach der vorhergehenden Verfahren aufgefundenen Substanzen, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Be-

20 handlung neurologischer Erkrankungen.

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