DE10007468A1

DE10007468A1 - Neues zentralnervöses Protein, das K·+·-Ströme moduliert

Info

Publication number: DE10007468A1
Application number: DE2000107468
Authority: DE
Inventors: Daniela Spielvogel; Hans-Christian Kornau; Rohini Kuner; Gisela Eisenhardt; Annette Trutzel
Original assignee: BASF Lynx Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 2000-02-18
Filing date: 2000-02-18
Publication date: 2001-08-23
Also published as: AU2001250322A1; EP1255836A2; WO2001061001A9; WO2001061001A2; WO2001061001A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Proteine, die neue Interaktionspartner von einwärts rektifizierenden Kaliumkanälen (Kirs), insbesondere G-proteingekoppelten, einwärts rektifizierenden Kaliumkanälen (GIRKs), sind. Diese Interaktionspartner bilden zusammen mit Kirs bzw. GIRKs Proteinkomplexe. Die Erfindung betrifft weiterhin eine geladene Domäne der erfindungsgemäßen Interaktionspartner, die an den komplexen intrazellulären Bereich von Kirs bindet und die Aktivität von Kirs allgemein, oder von GIRKs insbesondere, beeinflusst. Außerdem betrifft die Erfindung Proteinkomplexe aus Interaktionspartnern und rektifizierenden Kaliumkanälen, Nukleinsäuresequenzen oder rekombinante Nukleinsäurekonstrukte, die für solche Proteine bzw. Domänen kodieren, sowie deren Verwendungen. DOLLAR A Die Erfindung betrifft auch Wirtsorganismen, speziell transgene Tiere, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder die rekombinanten Nukleinsäurekonstrukte enthalten, sowie mono- oder polyklonale Antikörper, die gegen die isolierten Proteine gerichtet sind. Zusätzlich betrifft die Erfindung Verfahren zum Auffinden von Partnern, das heißt von niedermolekularen oder hochmolekularen Substanzen, die spezifisch an die erfindungsgemäßen Interaktionspartner binden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Proteine, die neue Interaktionspartner von einwärts rektifizierenden Kaliumkanälen (Kirs), insbesondere G-Protein-gekoppelte einwärts rektifizie renden Kaliumkanälen (GIRKs) sind. Diese Interaktionspartner bil den zusammen mit Kirs bzw. GIRKs Proteinkomplexe. Die Erfindung betrifft weiterhin eine geladene Domäne der erfindungsgemäßen In teraktionspartner, die an den komplexen intrazellulären Bereich von Kirs bindet und die Aktivität von Kirs allgemein, oder von GIRKs insbesondere, beeinflusst. Außerdem betrifft die Erfindung Proteinkomplexe aus Interaktionspartnern und einwärts rektifizie renden Kaliumkanälen, Nukleinsäuresequenzen oder rekombinante Nu kleinsäurekonstrukte, die für solche Proteine bzw. Domänen kodie ren, sowie deren Verwendungen.

Die Erfindung betrifft auch Wirtsorganismen speziell transgene Tiere, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder die rekombinante Nukleinsäurekonstrukte enthalten, sowie mono- oder polyklonale Antikörper, die gegen die isolierten Proteine gerich tet sind. Zusätzlich betrifft die Erfindung Verfahren zum Auffin den von Partnern das heißt von niedermolekularen oder hochmoleku laren Substanzen, die spezifisch an die erfindungsgemäßen Inter aktionspartner binden.

Im zentralen Nervensystem von Wirbeltieren sind G-protein gekoppelte einwärts rektifizierende Kaliumkanäle (GIRKs) an der Regulation der Erregbarkeit von Neuronen beteiligt, indem sie die Kalium-Leitfähigkeit der Zellmembran erhöhen. Die erste Klonierung einer GIRK-Untereinheit (GIRK1) gelang 1993 (Kubo et al., Nature, 364, 1993: 802-806; Dascal et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90, 1993: 10235-10239). Bisher wurden 4 Se quenzverwandte GIRK-Untereinheiten beschrieben (GIRK2-5), die mit GIRR1 heteromere, tetramere Kanäle im Verhältnis 2 : 2 bilden (Ko fuji et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92, 1995: 6542-6546; Yang et al., Neuron Dec., 15, 6, 1995: 1441-1447; Tucker et al., J. Biol., Chem., 274, 47, 1996: 33393-33397); die Expres sion der Kanäle konnte neben Neuronen auch in Herzvorhof- und en dokrinen Zellen nachgewiesen werden (Karschin et al., FEBS Lett., 348, 2, 1994: 139-144).

Im zentralen Nervensystem triggern Gi/Go-gekoppelte Rezeptoren die Aktivität von GIRK-Kanälen. In Gegenwart eines Agonisten katalysieren sie die Freisetzung dar β,γ-Untereinheit trimerer G-Proteine; die β,γ-Untereinheit bindet direkt an den GIRK- Komplex, wodurch die Interaktion mit Phosphatidylinositol-4,5- bisphosphat stabilisiert wird, was in einer verstärkten Aktivie rung des GIRK-Kanals resultiert (Huang et al., Nature, 391, 1998: 803-806). Verschiedene Neurotransmitter (z. B. Adenosin, GABA oder Serotonin) triggern auf diese Weise GIRK-Ströme, um direkt die elektrischen Eigenschaften von Dendriten zu modulieren (Taki gawa und Alzheimer; J. Physiol.[Lond], 517, Pt2, 1999: 385- 390). GABA_B-Rezeptoren zählen zu der Gruppe von Rezeptoren, die ihre Wirkung über GIRKs entfalten. Sie sind an Änderungen der synaptischen Effizienz beteiligt, die Lern- und Gedächtnisvorgän gen zugrunde liegt. GABA_B-Rezeptor-Agonisten zeigen positive Wir kung in Tiermodellen für chronische Schmerzen sowie Kokainabhän gigkeit. Antagonisten wirken sich positiv in Modellen von "Ab sence-Epilepsie" aus (Bettler et al., Curr. Opin. Neurobiol., 1998: 345-350). Aktivierung von GABA_B-Rezeptoren dämpft überer regte neuronale Verknüpfungen, indem sie die Öffnung der GIRK-Ka näle veranlassen. Molekulare Targets mittels derer sich die GIRK- Ströme beeinflussen lassen, eignen sich für die Behandlung von Epilepsie, Schlaganfall, kognitiven Verlusten, chronischen Schmerzen und weiteren neurologischen Erkrankungen sowie für die Behandlung von psychischen Krankheiten wie Angst, depressiven Er krankungen, Schizophränie, Migräne und anderen. Hinweise, daß solche Targets auch effektive Angriffspunkte für die Therapie von Alkoholabhängigen sind, zeigt die Tatsache, daß Ethanol die Funk tion von GIRKs, die an GABA_B-Rezeptoren gekoppelt sind, in Körner zellen des Kleinhirns verstärkt (Lewohl et al., Nat. neurosci. 2, 12, 1999: 1084-1090; Kobayashi et al., 1999, Nat. Neurosci., 2, 12, 1999: 1091-1096).

In Tiermodellen wurde der Zusammenhang von GIRK-Kanälen mit Krämpfen, wie sie in epileptischen Anfällen vorkommen, bereits hergestellt: Null-Mutationen für eine GIRK-Untereinheit (GIRK2) in transgenen Mäusen führt zu spontanen Krämpfen, einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber pharmakologisch induzierten Anfällen, sowie zu einer herabgesetzten Menge mRNA für die GIRK1-Unter einheit (Signorini et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94, 3, 1997: 923-927). In einem tierexperimentellen Krampfmodell, bei dem durch elektrische Stimulation des Gehirns motorische Anfälle induziert werden, lassen sich ebenfalls Änderungen im Expres sionsmuster von GIRK1 und 2 in Zellen des Gyrus dentatus fest stellen (Pei et al., Neuroscience, 90, 2, 1999: 621-627). GIRK- Ströme spielen offensichtlich in vielen physiologischen Zusammen hängen eine entscheidende Rolle. Die Regulation der Anzahl der GIRK-Proteine in der Membran und die Modulation der Ströme durch einen GIRK-Kanal ist dabei von großer Bedeutung.

Interaktionspartner von GIRKs, die einen Einfluß auf die K⁺-Ströme haben, sind demzufolge potentielle Targets für die Behandlung von neurologischen Erkrankungen wie Epilepsie. GIRK1 ist alleine nur schwach aktiv, unterscheidet sich jedoch von den übrigen GIRK-Untereinheiten dadurch, das es mit anderen Familien mitgliedern (GIRK2-4) assoziieren kann und so deren Aktivität verstärken und deren Einzelkanalcharakteristik verändern kann (Chan et al., J. Biol. Chem., 272, 10, 1996: 6548-6555). GIRK1 hebt sich so von den übrigen GIRK-Untereinheiten ab. Proteine, die mit GIRK1 interagieren, könnten direkten Einfluß auf die Leitfähigkeit oder die Öffnungsdauer der Kanäle oder auf die An zahl funktionsfähiger Kanäle in der Membran haben.

GIRKs werden auch im Herzen exprimiert. Ihre Funktion dort ist die K⁺-Leitfähigkeit von Herzvorhofzellen zu aktivieren und so die Herzfrequenz herabzusetzen (Kobo et al., Nature, 364, 1993: 802- 806).

Da GIRKs eine zentrale Rolle bei verschiedenen pathologischen Prozessen des zentralen Nervensystems und des Herzens spielen bzw. an derartigen Prozessen beteiligt sind, sind sie und ihre Interaktionspartner mit oder ohne regulatorische Funktionen ge suchte Targets für die Entwicklung neuer Pharmaka.

Es bestand daher die Aufgabe neue Proteine, die mit den GIRRs in teragieren, zu identifizieren und zu charakterisieren, und die Entwicklung molekularer Testsysteme zu ermöglichen, mit denen man viele Tausend verschiedene Verbindungen nach hochaffinen Substan zen in kurzer Zeit durchsuchen kann.

Diese Aufgabe wurde mit den erfindungsgemäßen, isolierten Nu kleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerier ten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsäurese quenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenzen co dieren und mindestens 60% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die biologische Aktivität der Polypeptide wesentlich reduziert ist
d) Äquivalente der unter (a) bis (c) genannten Sequenzen, die noch eine biologische Aktivität aufweisen.

Diese durch die oben genannten Nukleinsäuren kodierten Proteine sind in den erfindungsgemäßen Proteinkomplexen enthalten. Die er findungsgemäßen Proteinkomplexe enthaltend mindestens ein Kir- Protein und mindestens ein erfindungsgemäßes Protein mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften des in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Proteins oder des Proteinkomplexes erhalten bleibt. In diesen Proteinkomplexen beeinflußt das durch die erfindungsgemäße Nu kleinsäuresequenz kodierte Protein die K⁺-Leitfähigkeit. Es modu liet also vorteilhaft die K⁺-Leitfähigkeit des Proteins bzw. des Komplexes. Bei den Kir-Proteinen handelt es sich vorteilhafter weise um sogenannte GIRK-Proteine.

Unter den erfindungsgemäßen isolierten Proteinen sind Proteine zu verstehen, die eine in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 darge stellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Amino säureresten erhältliche Sequenz enthalten, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften des in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Proteins erhalten bleibt. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Ba sizität, Hydrophobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucin reste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausge tauscht. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ih rer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden. Die solchermaßen gegenüber der SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 veränderten Proteine besitzen wenigstens 60%, bevorzugt we nigstens 70% und besonders bevorzugt wenigstens 90% Sequenziden tität über die gesamte Länge der Sequenz zu den Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 berechnet nach dem Algorithmus von "Alt schul et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990". Die Identität gegenüber SEQ ID NO: 6 oder 8 beträgt wenigstens 75%, bevorzugt 80%, besonders bevorzugt 85%, ganz besonders bevorzugt 90%.

Bei den erfindungsgemäßen Proteinen mit den in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenzen und deren funktio nelle Derivate, Analoge und Äquivalente handelt es sich um neue Interaktionspartner von Kirs speziell von GIRKs. Diese Interak tionspartner werden im folgenden als sogenannte Mogli-Proteine oder kurz als Mogli bezeichnet.

Unter der wesentlichen biologischen Eigenschaft der erfindungsge mäßen Proteine (= Mogli), insbesondere dessen geladener Domäne, die die Bindung an GIRK1 vermittelt, bzw. der erfindungsgemäßen Proteinkomplexe sind der oder die transmembranen Bereiche, der aminoterminale Bereich und der carboxyterminale Bereich des Pro teins allein oder im Proteinkomoplex zu verstehen. Diese Protein bereiche ermöglichen die spezielle biologische Wirkung der Pro teine bzw. Proteinkomplexe. Diese wesentlichen biologischen Ei genschaften beinhalten außerdem die hochaffine Bindung (Kd < 10 nM) spezifischer synthetischer oder natürlicher Moleküle an die er findungsgemäßen Proteine mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz sowie die Interaktion mit den oben genannten, bekannten GIRKs. Durch die Interaktion werden, als wesentliche biologische Eigenschaft die Ionenleitfähigkeit speziell die K⁺-Leitfähigkeit der Komplexe beeinflußt.

Unter den erfindungsgemäßen Proteinkomplexen sind Kir-Kanäle, vorteilhaft GIRK-Ranäle, die eine GIRK1-Untereinheit enthalten, und mindestens ein Protein mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz zu verstehen. Im Artikel "Primary structure and functional expression of a rat G-Protein-coupled muscarinic potassium channel" (Kubo et al.; Nature 26 Aug 1993, Vol. 364, S. 802-806) werden geeignete GIRK1- Untereinheiten, die vorteilhaft in den Proteinkomplexen enthalten sein können, erstmals beschrieben. Der beschriebene Klon wurde als GIRK1 bezeichnet (Datenbankeintrag: 15-OCT-1993; ID: RNGIRK1A; AC: L25264). Die Sequenz des humanen Homologs wurde am 10-APR-1994 in die öffentlichen Datenbanken eingetragen (ID: HSO7918; AC: U07918). Ebenfalls in öffentlichen Datenbanken enthalten ist eine cDNA (AB002372), deren Nukleotidsequenz zu 60% über eine Länge von 1400 nt (= Nukleotiden) identisch zu der erfindungsgemäßen Sequenz SEQ ID NO: 3 ist. Diese Sequenz ging aus einem Ansatz hervor, in dem hundert möglichst große cDNA- Fragmente aus Gehirn in vitro translatiert wurden und bei Erhalt von Proteinen größer 60 kDa wurde die zugehörige cDNA sequenziert (Nagase et al.; DNA Res. 4: 141-150, 1997). Der Schrift ist eine sehr schwache Expression dieser mRNA im Gehirn zu entnehmen, an ders, als für das neue Protein, das im Gehirn stark exprimiert ist. Eine weitere funktionelle Beschreibung ist der Veröffentli chung nicht zu entnehmen. Die Sequenz ist auf Aminosäureebene zu 43% identisch zu SEQ ID NO: 4. Man kann daher annehmen, daß es sich in diesem Fall um ein verwandtes Molekül handelt. Eine An gabe über die Funktion oder die Interaktion mit anderen Molekülen ist der Literatur nicht zu entnehmen.

Die erfindungsgemäßen Proteine sind in der Lage mit funktionellen GIRK-Kanälen Komplexe zu bilden und die K⁺-Ströme durch die GIRK- Kanäle zu verändern. Dieses deutet darauf hin, daß es sich bei den neuen Proteinen um Modulatoren der GIRK-Ströme handelt.

Eine Analyse der Aminosäuresequenz mit "PROSITE pattern search" ergab eine Reihe von möglichen Phosphorylierungsstellen des Pro teins. So wurden z. B. mögliche Phosphorylierungsstellen für eine cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinase, eine Proteinkinase C oder eine Caseinkinase II gefunden. Es ist anzunehmen, daß das Protein der Regulation von Phosphatasen oder Kinasen unterliegt. Ins besondere Phosphorylierungsstellen, die im Bereich der konser vierten, geladenen Domäne liegen (siehe SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8), haben möglicherweise nach (De-)phosphorylierung direkten Einfluß auf die Wechselwirkung von Mogli mit GIRK1.

Die Interaktion wird durch drei Domänen vermittelt: dem intra zellulären Amino- und Carboxyterminus von GIRK1, sowie einer geladenen, α-helicalen (aufgrund von Sekundärstrukturvorhersagen) Domäne im erfindungsgemäßen Protein.

Ein erfindungsgemäßer Gegenstand ist der Komplex aus diesen in teragierenden Domänen bzw. die Mogli-Domäne, die an der Interak tion beteiligt ist.

Die Domänen, die für die Interaktion im Proteinkomplex verant wortlich sind, wurden durch Deletionskonstrukte und nachfolgende Analyse im two-hybrid System analysiert (Fields et al., TIgS Vol. 10, 8, 1994: 286-292 und Nature, Vol. 340, 1989: 245-246, Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, 1991, 9578- 9582). In SEQ ID NO: 5 wird die Rattendomäne und in SEQ ID NO: 7 die humane Domäne beschrieben. Die Sequenzen SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 geben die entsprechenden Proteinsequenzen wieder.

Das isolierte Protein und seine funktionellen Varianten lassen sich vorteilhafterweise aus dem Gehirn von Mammalia wie Homo sa piens oder Rattus norvegzcus isolieren. Auch Homologe aus anderen Mammalia sind unter funktionellen Varianten zu verstehen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Nukleinsäuresequenzen, die für die oben beschriebenen Proteine kodieren, insbesondere für solche mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Primärstruktur. Die Nukleinsäuresequenz aus Rattus norvegicus oder Homo sapiens ist in SEQ ID NO: 1 bzw. in SEQ ID NO: 3 darge stellt.

Nach Isolierung und Sequenzierung sind die erfindungsgemäßen Nu kleotidsequenzen SEQ ID No: 1 und SEQ ID No: 3 oder deren funk tionelle Äquivalente wie z. B. Allelvarianten erhältlich. Unter Allelvarianten sind SEQ ID No: 1- oder SEQ ID No: 3-Varianten zu verstehen, die 70 bis 100% Homologie auf Aminosäureebene, bevor zugt 80 bis 100%, ganz besonders bevorzugt 90 bis 100% aufwei sen. Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vor teilhaft höher liegen. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen SEQ ID No: 1 und SEQ ID No: 3 oder deren funktionelle Äquivalente weisen auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 65%, bevor zugt von mindestens 75%, besonders bevorzugt von mindestens 85%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 90% über den ge samten in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 angegebenen DNA-Bereich auf.

Allelvarianten umfassen insbesondere solche funktionellen Varian ten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleo tiden aus der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 dargestellten Se quenz erhältlich sind, wobei wenigstens noch eine der wesentli chen biologischen Eigenschaften erhalten bleibt. Unter erfin dungsgemäßen Proteinen, bei denen noch eine wesentliche biologi sche Eigenschaft vorhanden ist, sind vorteilhaft Proteine zu ver stehen, die noch mindestens 20%, bevorzugt 50%, besonders be vorzugt 75%, ganz besonders bevorzugt 90% der biologischen Ak tivität beispielsweise in bezug auf die Erhöhung der K⁺-Leitfähig keit im Vergleich zum Ausgangsprotein aufweisen. Homologe oder sequenzverwandte Nukleinsäuresequenzen können aus allen Säuger spezies einschließlich Mensch nach gängigen Verfahren durch Homo logiescreening durch Hybridisierung mit einer Probe der erfin dungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon isoliert werden.

Unter funktionellen Äquivalenten sind auch Homologe von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 beispielsweise ihre Homologen aus anderen Mammalia, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu verstehen.

Solche funktionellen Äquivalente lassen sich ausgehend von den in SEQ ID No: 1 oder SEQ ID No: 3 beschriebenen DNA-Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisie rungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Vertebraten wie Mammalia isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Stan dardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservier ten Bereiche vorteilhaft der interagierenden Domäne beispiels weise aus den geladenen Bereichen oder aus dem carboxyterminalen Bereich, die über Vergleiche mit anderen Proteinen in dem Fach mann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es kön nen aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäu ren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung ver wendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure Oligonukleo tid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung ver wendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10 °C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäu re Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlö sung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Ge genwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisie rungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperatu ren zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingun gen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angege benen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kal kulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Ge halt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridiza tion: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practi cal Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Außerdem sind unter Homologe der Sequenzen SEQ ID No: 1 und SEQ ID No: 3 Derivate wie beispielsweise Promotorvarianten zu verste hen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen ge meinsam oder einzeln vorgeschaltet sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Dele tion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren kön nen die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirk samkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Unter Derivaten sind auch vorteilhaft Varianten zu verstehen, de ren Nukleotidsequenz im Bereich -1 bis -1000 vor dem Startkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Protei nexpression verändert, bevorzugt erhöht wird. Weiterhin sind un ter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die am 3'-Ende verän dert wurden. Diese am 3'-Ende vorteilhaft vorgenommenen Änderun gen betreffen beispielsweise Terminatoren oder Sequenzen, die die Translation und/oder Transkription positiv beeinflussen.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Or ganismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Weiterhin ist es von Vorteil die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren SEQ ID No: 1 oder SEQ ID No: 3 allein oder die Nukleinsäuren SEQ ID No: 1 oder SEQ ID No: 3 und eine Sequenz, die für ein GIRK- oder Kir-protein kodiert, funktionell mit mindestens einem gene tischen Regulationselement zu den erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäurekonstrukten zu verknüpfen.

Dazu werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen üblicher weise mit genetischen Regulationselementen wie Transkriptions- und Translationssignalen funktionell verknüpft. Diese Verknüpfung kann je nach gewünschter Anwendung zu einer Erhöhung oder Ernied rigung der Genexpression führen. Mit den solchermaßen hergestell ten rekombinanten Nukleinsäurekonstrukten werden anschließend Wirtsorganismen transformiert. Zusätzlich zu diesen neuen Regula tionssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gege benenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenzen inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regu lation wird nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Re gulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Auch am 3'-Ende der Nu kleinsäure-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte regulatori sche Elemente inseriert werden. Die Nukleinsäuresequenzen für die Sequenzen SEQ ID No: 1 oder SEQ ID No: 3 können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein, oder auf getrenn ten Genkonstrukten lokalisiert sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver fahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR- oder im 1-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung fin den. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispiels weise in den gram-positiven Promotoren wie amy und SPO2, in den Hefepromotoren wie ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder in Mammaliapromotoren wie CaM-KinaseII, CMV, Nestin, L7, BDNF, NF, MHP, NSE, β-Globin, GFAP, GAP43, Tyrosin Hydroxylase, Kainat- Rezeptor-Untereinheit 1, Glutamat-Rezeptor-Untereinheit B ent halten.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regula tionssequenzen wie die oben genannten verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs weise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafter weise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Trans kriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Unter "Enhancer" sind beispielsweise DNA-Sequenzen zu verstehen, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA eine erhöhte Expression bewirken. Als weitere Regulati onssequenzen seien beispielhaft die locus control regions, silen cer oder jeweilige Teilsequenzen davon genannt. Diese Sequenzen können vorteilhaft für eine gewebespezifische Expression verwen det werden.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist die Verknüpfung der erfin dungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit einem Promotor, wobei der Promotor 5' up stream zu liegen kommt. Weitere Regulationssignale wie 3' gelegene Terminatoren oder Polyadenylierungssignale oder Enhancer können funktionell in dem Nukleinsäurekonstrukt Anwen dung finden und damit seine Expression beeinflussen.

Unter dem Begriff des erfindungsgemäßen "rekombinanten Nuklein säurekonstrukts bzw. Genkonstrukts" sind auch komplette Vektor konstrukte zu verstehen. Diese Vektorkonstrukte oder Vektoren werden zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus verwen det. Vorteilhafterweise werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäu ren und/oder die Gene für die GIRKs in einen wirtsspezifischen Vektor inseriert, der eine optimale Expression der Gene im ausge suchten Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pou wels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmi den auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie bei spielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Für die Integration in Mammalia wird vorteilhaft lineare DNA ver wendet.

Die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen bzw. des rekombinanten Nukleinsäurekonstrukts kann vorteilhaft durch Erhöhen der Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatori scher Faktoren, die die Genexpression positiv beeinflussen, er höht werden. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale wie Promotoren und Enhancer verwendet wer den. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation mög lich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert, oder die Ableseeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird.

Zur Erhöhung der Genkopienzahl können die Nukleinsäuresequenzen oder homologe Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält. Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können zusammen mit den für die GIRKs kodierenden Sequenzen in einen einzelnen Vektor kloniert werden und anschließend in dem gewünschten Organismus exprimiert werden. Alternativ kann auch jede der beschriebenen Nukleinsäuresequenzen und die für die GIRK-Proteine kodierenden Sequenzen in je einen einzelnen Vektor gebracht und diese ge trennt in den jeweiligen Organismus über übliche Methoden wie Transformation, Transfektion, Transduktion, Elektroporation oder Partikel-Gun verbracht werden.

Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren auch in Form therapeu tisch oder diagnostisch geeigneter Fragmente exprimiert werden. Zur Generierung des rekombinanten Proteins können Vektorsysteme oder Oligonukleotide verwendet werden, die die Nukleinsäuren oder das Nukleinsäurekonstrukt um bestimmte Nukleotidsequenzen verlän gern und damit für veränderte Polypeptide kodieren, die einer einfacheren Reinigung dienen. Als solche "Tags" sind in der Lite ratur z. B. Hexa-Histidin-Anker bekannt oder Epitope, die als An tigene verschiedener Antikörper erkannt werden können (Studier et al., Meth. Enzymol., 185, 1990: 60-89 und Ausubel et al. [eds.]m 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).

Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate oder des rekombinanten Nukleinsäurekonstrukt allein oder zusammen mit einer Sequenz, die für GIRKs kodiert, ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Orga nismen sind Bakterien wie Escherichia coli, Streptomyces, Bacil lus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen wie Saccharo myces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Mensch oder Tier, beispielsweise COS-, Hela-, HER293-, Sf9-, CHO-, PC12-Zellen oder primäre neuronale Zellkulturen.

Gewünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organis men wie transgenen Tieren z. B. Mäusen, Ratten, Schafen, Rindern oder Schweinen zur Expression gebracht werden. Auch transgene Pflanzen sind im Prinzip denkbar. Bei den transgenen Organismen kann es sich auch um sogenannte Knock-Out Tiere handeln.

Dabei können die transgenen Tiere eine funktionelle oder nicht funktionelle erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein funk tionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt allein oder in Kombination mit einer funktionellen oder nicht funktio nellen Sequenz, die für Mogli oder funktionelle Äquivalente oder Derivate kodiert, enthalten.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung der oben beschriebe nen transgenen Tiere sind transgene Tiere, in deren Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen; oder in dessen Keimzellen und der Gesamtheit oder einem Teil der soma tischen Zellen die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz durch gen technische Verfahren verändert oder durch Einfügen von DNA-Ele menten unterbrochen wurden.

Die Kombination aus den Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren wie Plasmide, Viren oder Phagen wie beispiels weise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter System, die Phagen λ, Mu oder andere temperänte Phagen oder Transposons und/oder wei teren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen bilden ein Expres sionssystem. Bevorzugt sind unter dem Begriff Expressionssysteme beispielsweise die Kombination aus Säugetierzellen wie CHO-Zellen und Vektoren wie pcDNA3neo-Vektor oder HEK293-Zellen und CMV-Vek tor, die für Säugetierzellen geeignet sind, zu verstehen.

Die In-situ Hybridisierung mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder Tei len davon ergab eine starke Expression in Hippokampus, Cortex, Cerebellum sowie eine niedrigere Expression in thalamischen Ker nen, Striatum sowie den Kernen von Mittelhirn und Stammhirn (siehe Fig. 2 und Beispiel 4). Fig. 1 und 2 geben die Expres sionsanalyse der zu SEQ ID NO: 1 korrespondierenden mRNA wieder. 1 zeigt den Northern blot, 2 die in situ-Hybridisierung (siehe Beispiel 3 und 4).

Das Expressionsmuster von SEQ ID NO: 1 überlappt mit dem von GIRK1 und deutet auf eine wichtige zentralnervöse Funktion des in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Proteins hin. Die für SEQ ID NO: 2 sowie GIRK1 kodierenden mRNAs werden in den meisten hippokampalen Neuronen koexprimiert. Zusätzlich wird SEQ ID NO: 1, aber nur sehr wenig GIRK1, in inhibitorischen Interneuronen des Gyrus dentatus exprimiert. SEQ ID NO: 1 könnte die Erregbar keit wichtiger hippokampaler Neuronen, beispielsweise der Pyrami denzellen, sowohl über die Interaktion mit GIRK1 als auch über andere bislang unbekannte Mechanismen im Gleichgewicht halten.

Der Hippokampus ist die entscheidende Hirnstruktur die Spei cherung neuer Gedächtnisinhalte. Ein Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 ist damit ein interessantes Target für das Verständnis in Bezug auf Lernen und Gedächtnis und für die Entwicklung neuer kognitiver Enhancer. Als Teil des limbischen Systems beeinflußt der Hippokampus auch Stimmungen und Gefühle. Gegen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 und ihre funktionellen Äquivalente, Homologe oder Derivate gerichtete Pharmaka stellen damit potentielle Antidepressiva oder Anxiolytika dar und können bei kognitiven Erkran kungen verwendet werden. Schließlich ist der Hippokampus stark in Temporallappenepilepsien involviert, was ein Protein mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 zu einem attraktiven Target für neue Medi kamente gegen diese häufige Erkrankung macht. Im Cortex befinden sich Regionen, die sensorische Informationen integrieren, verar beiten und in geeignete Reaktionen umwandeln. Diese sensorischen und motorischen Zentren sind oft auch Ausgangspunkte für epilep tische Anfälle. Eine gezielte Beeinflussung der erfindungsgemäßen Proteine oder des erfindungsgemäßen Proteinkomplexes könnte die Krampfwahrscheinlichkeit bei Epilepsiepatienten senken. Die tha lamischen Kerne sind dem Cortex vorgeschaltet, integrieren die über die Sinnesorgane aufgenommenen Wahrnehmungen und leiten sie an corticale Strukturen weiter. Sie sind häufig der Ausgangspunkt für generalisierte Krampfanfälle. Die starke Expression der er findungsgemäßen Proteine in den thalamischen Kernen deutet darauf hin, daß seine Aktivierung oder seine Inhibition zur Linderung von Krampfanfällen in Epilepsiepatienten beitragen kann.

Im Gegensatz zu GIRK1 ist SEQ ID NO: 1 stark in den Purkinje-Zel len des Kleinhirns exprimiert. Durch eine Modulation des Erre gungszustandes dieser Zellen könnte SEQ ID NO: 2 effektiv die Ge samtaktivität des Kleinhirns beeinflussen. Die cerebellären Ver knüpfungen sind maßgeblich für die Feinkoordination der Bewegun gen verantwortlich. Ataxien und andere motorische Erkrankungen könnten auf einer Deregulation eines Proteins mit der erfindungs gemäßen Sequenz beruhen.

Die Basalganglien einschließlich des Striatums sind für die Vor bereitung, Programmierung, Auslösung und Beendigung von Bewe gungsabläufen von Bedeutung. Störungen im Muskeltonus haben ihre Ursache vor allem in einer veränderten Aktivität des Striatums.

Die erfindungsgemäßen Proteinkomplexe oder Proteine stellen damit interessante Targets für die Entwicklung neuer Substanzen dar, die zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankhei ten wie neurologische Erkrankungen wie Epilepsie, Schlaganfall, psychische Erkrankungen wie Angst, manisch-depressive Erkrankun gen, Migräne, kognitive Verluste oder Bewegungserkrankungen wie Hypokinesie, Hyperkinesie, Dystonie, Morbus Parkinson und anderen Störungen im Muskeltonus dienen können.

Datenbanksuchen ergaben, daß das Gen für das erfindungsgemäße Protein in Fragmenten auf einem HAC (BAC clone: KB1171G1; DT: 13-SEP-1999 ID: AP000427) kodiert ist, dessen Nukleinsäurese quenzdaten keinerlei Proteinsequenz entnommen werden kann. Dieser BAC wurde im humanen Genom lokalisiert und befindet sich in der Nähe des chromosomalen Locus, der mit der adulten, myoclonischen Epilepsie assoziiert ist (Mikami et al., 1999). Diese Korrelation könnte außerdem ein neues Diagnoseverfahren für diese Epilepsie form ermöglichen. Die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 kann dazu verwendet werden, Gene für mRNAs, die für diese Nukleinsäuren oder deren funktionellen Äquivalente, Homologe oder Derivate kodieren, im murinen und im menschlichen Genom mit gän gigen Methoden durch Homologiescreening zu isolieren und zu kar tieren und mit Markern für humane Erbkrankheiten zu korrelieren. Dies ermöglicht die Identifizierung des Gens als Ursache für be stimmte Erbkrankheiten, was ihre Diagnose erheblich vereinfacht und neue Therapieansätze ermöglicht. Mit Hilfe der Nukleinsäuren als Marker lassen sich damit Erbkrankheiten diagnostizieren.

Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der erfindungsge mäßen Nukleinsäuren oder Teilen davon zur Gentherapie. Auch zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Teilen davon komplemen täre Sequenzen können zur Gentherapie verwendet werden.

Eine weitere Möglichkeit des Einsatzes der Nukleotidsequenz oder Teilen davon ist die Erzeugung transgener oder knock-out- oder konditioneller oder regionenspezifischer knock-out Tiere oder spezifischer Mutationen in gentechnisch veränderten Tieren (Aus ubel et al. [eds]. 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York und Torres et al., [eds.]m 1997, La boratory protocols for conditional gene targeting, Oxford Univer sity Press, Oxford). Über transgene Überexpression oder geneti sche Mutation (Nullmutation oder spezifische Deletionen, Inser tionen oder Veränderungen) durch homologe Rekombination in em bryonalen Stammzellen kann man Tiermodelle erzeugen, die wert volle weitere Informationen über die (Patho-)Physiologie der er findungsgemäßen Sequenzen allein oder in Komplex mit den GIRKs liefern. Solchermaßen hergestellte Tiermodelle können essentielle Testsysteme zur Evaluierung neuartiger Therapeutika darstellen, die die Erregbarkeit von Neuronen speziell beeinflussen.

Die Interaktion des bekannten GIRK1 mit dem neuen erfindungsge mäßen, beschriebenen Protein, das mit dem two-hybrid System ent deckt wurde, spielt eine wichtige physiologische Rolle. Dieser überraschende Befund ermöglicht neue außerordentliche Behand lungsmöglichkeiten im Hinblick auf die oben genannten neurologi schen und psychischen Erkrankungen, die mit GIRKs im Zusammenhang stehen. Niedermolekulare Effektoren oder Peptide, die diese In teraktion positiv oder negativ beeinflussen, sind Wirkstoffe, die in die K⁺-Leitfähigkeit von Membranen eingreifen und damit als neue Klasse von Pharmaka zum Einsatz kommen können. Bislang sind keine Substanzen beschrieben, die die Interaktion zwischen Dömanen von Mogli und Kir- oder GIRK-Proteinen beeinflussen und da durch die Eigenschaften dieser Proteine modulieren. Die Verwen dung des erfindungsgemäßen Proteinkomplexes oder der erfindungs gemäßen Proteine ermöglicht damit die Entwicklung neuer Wirk stoffe bzw. Wirkstoffklassen, die ein neues Wirkprinzip haben.

Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, des Nukleinsäurekonstrukts, eines erfindungsgemäßen Proteinkomplexes oder des Proteins können Proteine identifiziert werden, die zum GIRK-Proteinkomplex spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen, oder zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Proteine ko dieren, die zum GIRK-Proteinkomplex oder zum Protein spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen. Vorteilhafterweise werden hierzu das two-hybrid System oder andere biochemische Verfahren allein oder in Kombination verwendet. Es lassen sich so intramolekulare Interaktionsdomänen von GIRKs und intermolekulare Interaktionsdo mänen von GIRKs und Mogli und damit pharmakotherapeutische Inter ventionspunkte bestimmen.

Daher ist ein Gegenstand der Erfindung die Verwendung des two-hy brid Systems oder biochemischer Verfahren zur Identifizierung der Interaktionsdomänen von GIRKs oder Moglis und die Verwendung zur pharmakotherapeutischen Intervention.

Über Strukturanalysen des Proteinkomplexes oder des erfindungsge mäßen Proteins lassen sich gezielt Substanzen finden, die eine spezifische Bindungsaffinität aufweisen.

Die beschriebenen Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 ermög lichen, mit Hilfe des two-hybrid Systems oder anderen Assays, die für die Interaktion verantwortlichen Aminosäuren einzugrenzen und Substanzen zu finden, mit denen die Interaktion zwischen Mogli und GIRKs beeinflusst werden kann.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Substanzen, die spezifisch die natürliche Interaktion des GIRK1N- mit dem GIRK1C- Terminus oder GIRK1 mit dem Protein gemäß SEQ ID NO: 2 oder 4 re duzieren oder verhindern.

Solche Substanzen binden bevorzugt an folgende Sequenzbereiche:

a) an die Aminosäuresequenz des GIRK1 oder
b) an die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder
c) an die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 oder
d) an die Interaktionsbereiche, die von den interagierenden Domänen von GIRK und SEQ ID NO: 2 oder von GIRK und SEQ ID NO: 4 gebildet werden, oder
e) an die Interaktionsdomäne von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4, die in SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 wie dergegeben werden.

Neben Substanzen, die an diese Sequenzen binden, sind auch diese Polypeptide selbst und Teile dieser Polypeptide als Substanzen geeignet, die die Interaktion stören oder verhindern, ins besondere Polypeptide, die eine Sequenz von mindestens 5 Amino säuren einer dieser Sequenzen (i), (ii) und (iii) aufweisen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Auf finden von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität zum er findungsgemäßen Proteinkomplex bzw. Protein, das folgende Schritte umfaßt.

a) Inkubation des oder der Proteine mit der zu testenden Sub stanz.
b) Detektion der Hindung der zu testenden Substanz an das Pro tein.

Die Detektion der Bindung erfolgt beispielsweise durch Messen der Aktivität von GIRKs, Änderung des Membranpotentials oder der K⁺- Leitfähigkeit.

Systeme zur Detektion von Änderungen der Eigenschaften von Kali umkanälen können wie folgt aufgebaut sein:

a) Ionensensitive Elektroden können verwendet werden, um spezi fisch Änderungen der Kaliumkonzentration in der Umgebung oder in den Zellen selbst, hervorgerufen durch veränderte K⁺-Leit fähigkeit der Membran, zu messen (Uhlig et al., Anal. Chem., 69, 19, 1997: 4032-4308)
b) Änderungen des Membranprotentials können durch spezifisches Einbauen von Fluorophoren in K⁺-Kanäle direkt detektiert wer den, da diese bei Spannungsänderungen eine Konformationsände rung erfahren (Mannuzzu et al., 271,, 5246, 1996: 213- 216).
c) Spannungsänderungen an Einzelzellen lassen sich durch geeig nete Fluoreszensfarbstoffe nachweisen. Solche Meßsysteme kön nen auf einem einzelnen Fluorophor-Indikator oder auf einem Zwei-Komponenten Sensor beruhen, der sich auf einen FRET- (= fluorescence resonance energy transfer) Effekt gründet (Gon zalez und Tsien, Chem. Biol., 4, 1997: 269-277).

Weitere Ausgestaltungsformen der Erfindung sind ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Interaktion von Proteinen mit Aminosäuresequenzen, wie sie in SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 4 dargestellt werden, mit GIRKs hemmen oder verstärken. Die Inter aktion von Proteinen mit den erfindungsgemäßen Aminosäuren läßt sich mit Hilfe des Two-hybrid Systems detektieren. Weiter lassen sich die Verfahren durch Expression der Proteine in eukaryoti schen Zellen und Verknüpfung mit einem Reporter-Assay für die Ak tivierung der GIRKs durchführen. Dabei wird beispielsweise die Änderung des Membranpotentials oder die K⁺-Leitfähigkeit detek tiert.

Über Antikörper kann die Proteinaktivität der Proteine mit den Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 bestimmt werden. Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Quan tifizierung der Proteinaktivität eines Proteins mit den Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4.

Die regulatorischen Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäu ren, insbesondere der Promotor, die Enhancer, locus control re gions und silencer oder jeweilige Teilsequenzen davon können für die gewebespezifische Expression von diesem und weiteren Genen verwendet werden. Damit ergibt sich die Möglichkeit, gehirnspezi fische Genexpression von Nukleinsäurekonstrukten, speziell im Herz, Hippokampus, Cortex, Cerebellum, in thalamischen Kernen, im Striatum oder den Kernen von Mittel- und Stammhirn durchzuführen.

Um ein DNA-Fragment zu isolieren, das die Bereiche enthält, die die Transkription der Sequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 re gulieren, wird zunächst eine genomische Bank mit einer möglichst weit 5'-positionierten cDNA-Probe durchsucht. Dazu wird eine dem Fachmann geläufige Homologiesuche durchgeführt (Ausubel et al. [eds.], 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Auf dem isolierten DNA-Fragment wird dann der Transkriptionsstart identifiziert. Der Bereich vor dem Transkrip tionsstart wird anschließend mit einem Reportergen wie β-Galacto sidase oder GFP (= green fluorescent protein) verknüpft und in Zellen oder in transgenen Tieren wie Mäusen daraufhin getestet, ob er zu dem für SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 spezifischen Ex pressionsmuster führt (Ausubel et al. siehe oben). Das Reporter gen kann anschließend mit anderen cDNAs verknüpft werden, um Tiermodelle zu erstellen, in denen die jeweilige cDNA regionspezifisch exprimiert wird (siehe beispielsweise Oberdick et al., Science, 248, 1990: 223-226).

Ausgehend von den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 können synthetische Peptide generiert werden, die als Anti gene für die Produktion von Antikörpern eingesetzt werden. Es ist auch möglich, das Polypeptid oder Bruchstücke davon zur Generie rung von Antikörpern einzusetzen. Mit Antikörpern sind sowohl po lyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombi nante Antikörper oder Fragmente davon, single chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper gemeint. Unter erfindungsgemä ßen Antikörpern oder deren Fragmente sind prinzipiell alle Immu noglobulinklassen wie IgM, IgG, IgD, IgE, IgA oder ihre Subklas sen wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen zu verste hen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 oder IgGM. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgG₁/κ oder IgG_2b/κ. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei dem Antigen-komplementären Bindungsstellen, wie Antikörper teile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂-Fragmente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂. Diese Fragmente können beispielsweise auf enzymatischem Wege durch Abspaltung des Fc-Teils der Antikörper mit Enzymen wie Pa pain oder Pepsin, durch chemische Oxidation oder durch gentechni sche Manipulation der Antikörpergene erhalten werden. Auch genma nipulierte nichtverkürzte Fragmente können vorteilhaft verwendet werden.

Die Antikörper oder Fragmente können allein oder in Mischungen verwendet werden.

Die Antikörpergene für die gentechnischen Manipulationen lassen sich in dem Fachmann bekannter Weise beispielsweise aus den Hy bridomzellen isolieren (Harlow, E. and Lane, D. 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.; Ausubel et al., [eds], 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Dazu werden Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zellyse mit Guanidiniumthiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopropanol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannter Weise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Re versen Transcriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die synthe tisierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation bei spielsweise durch "site directed mutagenesis", Einführung von Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustauscher in ge eignete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren inseriert und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimiert werden. Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu-Vektoren zur Klo nierung der Gene und die Expression in Bakterien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisiae.

Spezifische Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Proteine eig nen sich sowohl als diagnostische Reagenzien als auch als Thera peutika bei neurologischen oder psychiatrischen Krankheitsbil dern.

Weiterhin können die cDNA, die genomische DNA, die regulatori schen Elemente der findungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, als auch das Polypeptid, sowie Teilfragmente davon in rekombinanter oder nichtrekombinanter Form zur Ausarbeitung eines Testsystems verwendet werden. Dieses Testsystem ist geeignet, die Aktivität des Promotors oder des Proteins in Anwesenheit der Testsubstanz zu messen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um einfache Meßme thoden (kolorimetrische, luminometrische, auf Fluoreszenz beru hende oder radioaktive), die die schnelle Messung einer Vielzahl von Testsubstanzen erlauben (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirk stoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg). Die beschriebenen Testsysteme erlauben das Durchsuchen von chemischen Bibliotheken nach Substanzen, die meßbare Wirkungen auf SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 oder den neuen GIRK-Komplex, bestehend aus dem bereits beschriebenen GIRK1 und dem in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 be schriebenen Protein, haben. Die Identifizierung solcher Substan zen stellt den ersten Schritt auf dem Weg zur Identifizierung neuartiger Medikamente dar, die spezifisch auf die K⁺-Leitfähig keit wirken.

Ein alternativer Weg zur Entwicklung von Wirkstoffen, die am neuen GIRK-Protein-Komplex angreifen, besteht im rationalen Drug Design (Höhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum- Verlag, Heidelberg). Hier wird die Struktur oder eine Teilstruk tur von dem in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Pro tein, soweit sie vorliegt, oder ein von Computern erstelltes Mo dell der Struktur, benutzt, um mit Unterstützung von Molecular Modelling Programmen Strukturen zu finden, für die sich eine hohe Affinität an Mogli vorhersagen läßt. Diese Substanzen werden dann synthetisiert und getestet. Hochaffine, selektive Substanzen wer den auf ihre Verwendung als Medikamente gegen Epilepsie, Schlag anfall und andere neurologische Erkrankungen getestet.

Die Bestimmung von Menge, Aktivität und Verteilung des neuen GIRK-Protein-Komplexes oder von dem in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Protein oder seiner zugrundeliegenden mRNA im menschlichen Körper kann zur Diagnose, Erfassung der Prädisposi tion und zum Monitoring bei bestimmten Erkrankungen dienen. Des gleichen kann die Sequenz der cDNA der Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 sowie der genomischen DNA zu Aussagen über ge netische Ursachen und Prädispositionen bestimmter Erkrankungen herangezogen werden. Dazu können sowohl DNA/RNA-Proben als auch Antikörper verschiedenster Art benutzt werden. Dabei dient die beschriebene Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder Teile davon in Form geeigneter Proben zur Aufdeckung von Punkt mutationen oder Deletionen/Insertionen/Rearrangements.

Die vorliegende Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, ihre funktionellen Äquivalente, Homologe oder Derivate, das von ihr kodierte Protein (SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4) oder der erfindungsgemäße Proteinkomplex sowie davon abgeleitete Reagenzien (Oligonukleotide, Antikörper, Peptide) können zur Dia gnose und Therapie von neurologischen Erkrankungen eingesetzt werden. Außerdem wird die Diagnose und Behandlung von genetischen Prädispositionen für bestimmte neurologische Erkrankungen wie Epilepsie, Schlaganfall, psychische Erkrankungen wie Angst, ma nisch-depressive Erkrankungen, Migräne, kognitive Verluste und weitere neurologische Erkrankungen möglich. Weiterhin kann ein Monitoring der Behandlung oben angegebener Erkrankungen durchge führt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum qua litativen und quantitativen Nachweis einer erfindungsgemäßen Nu kleinsäure in einer biologischen Probe, das folgende Schritte um faßt:

a) Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge an erfindungsgemäßer Nukleinsäure oder einer bekannten Menge an Oligonukleotiden, die als Primer für eine Amplifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure geeignet sind,
b) Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäure durch spezifische Hybridisierung oder PCR-Amplifikation,
c) Vergleich der Menge an hybridisierender Nukleinsäure oder an durch PCR Amplifikation gewonnener Nukleinsäure mit einem Mengenstandard.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis des erfindungsgemäßen Proteinkomplexes oder eines erfindungsgemäßen Proteins in einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfaßt:

a) Inkubation einer biologischen Probe mit einem Antikörper, der spezifisch gegen den Proteinkomplex oder gegen das erfin dungsgemäße Protein gerichtet ist,
b) Nachweis des Antikörper/Antigenkomplexes,
c) Vergleich der Mengen des Antikörper/Antigenkomplexes mit ei nem Mengenstandard.

Als Standard wird üblicherweise eine biologische Probe aus einem gesunden Organismus entnommen.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an ein Protein mit der Aminosäurese quenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 binden, das einen oder meh rere der folgenden Schritte umfaßt:

a) Expression des Proteins in eukaryotischen oder prokaryoti schen Zellen.
b) Inkubation des Proteins mit den zu testenden Substanzen.
c) Nachweis der Bindung einer Substanz an Mogli oder die für die intramolekulare Wechselwirkung verantwortlichen Domänen in GIRK1 beziehungsweise eines Effektes auf den K+-Strom.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an ein Protein mit einer Aminosäurese quenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 bzw. an eine Nuklein säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 binden und da durch hemmende oder aktivierende funktionelle Effekte auf die K⁺- Leitfähigkeit in zentralnervösen Neuronen hervorrufen.

In Situationen, in denen ein Mangel an der Aktivität des erfin dungsgemäßen Proteins oder des mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 komplettierten GIRK1/Mogli-Komplexes herrscht, können mehrere Me thoden zur Substituierung eingesetzt werden. Zum einen kann das Protein, natürlich oder rekombinant direkt, oder durch geeignete Maßnahmen in Form seiner kodierenden Nukleinsäure (d. h. DNA oder RNA) appliziert werden. Dazu können sowohl virale, als auch nichtvirale Vehikel zum Einsatz kommen. Ein weiterer Weg bietet sich durch die Stimulation des endogenen, körpereigenen Genes durch geeignete Substanzen. Solche Substanzen lassen sich bei spielsweise auffinden, indem man ihre Wirkung auf die Transkrip tionselemente des neuen Mogli-Genes ermittelt.

In Situationen, in denen ein Überschuß an Aktivität des ein Pro tein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 beinhaltenden GIRK-Protein-Komplexes oder von einem Protein mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 allein herrscht, können spezifische, syntheti sche oder natürliche, kompetitive und nicht-kompetitive Antagoni sten gegen das Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 oder Antikörper oder Antikörperfragmente gegen das Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 oder gegen den Proteinkomplex eingesetzt werden. Desweiteren kann sowohl durch antisense Moleküle oder Ribozyme oder Oligonukleotide als auch 1 durch niedermolekulare Verbindungen eine Änderung der GIRK-Ströme bzw. der Aktivität des Proteins mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 erreicht werden.

Beispiele

Die molekulare Charakterisierung von Interaktionspartnern der GIRK1-Untereinheit ermöglicht die physiologische und pharmakolo gische Vielfalt der GIRK-Ranäle besser zu verstehen, sowie neue konkrete Angriffspunkte für pharmakotherapeutische Interventionen zu erhalten. Aus einer cDNA Rattengehirn-Bibliothek wurden GIRK1-Interaktionspartner überein Screening mit dem Yeast-Two- Hybrid-System gefunden. Es wurden zwei überlappende Fragmente ei ner unbekannten cDNA isoliert. Mit Hilfe dieser Fragmente wurde aus einer cDNA-Bibliothek aus Rattenhippokampus und -cortex zwei etwa 3 kb lange cDNAs durch Homologiescreening isoliert und an schließend sequenziert. Die so gewonnene cDNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 enthält den kompletten kodierenden Bereich für die Sequenz SEQ ID NO: 2.

Die Sequenzanalyse des durch die vorliegende cDNA (= SEQ ID NO: 1) kodierten Polypeptids sagt eine Vielzahl potentieller Phosphory lierungsstellen, eine stark geladene Domäne und im carboxytermi nalen Bereich zwei hydrophobe Domänen voraus. Letztere durchspan nen möglicherweise die Plasmamembran, so daß es sich wahrschein lich um ein Membranprotein handelt. Mehrere potentielle Phospho rylierungsstellen deuten darauf hin, daß das Protein selbst einer Regulation durch Phosphatasen und/oder Kinasen unterworfen ist.

Die geladene Domäne, für die eine α-helikale Struktur vorherge sagt wird, wurde in Hefe-Kotransformationsstudien als der mit GIRK1 interagierende Bereich identifiziert.

Sequenzvergleiche (Altschul et al., 1990) der Basensequenz (SEg ID NO: 1) mit öffentlichen Nukleotiddatenbanken (embl) mit Hilfe des BLAST-Programmes (Version BLASTP 2.0a19-WashU [05-Feb-1998]) zeigten Ähnlichkeit mit einer bekannten cDNA-Se quenz ("KIAA0374"; accession no: AB002372). Auf Aminosäureebene ist die Ähnlichkeit besonders hoch in der geladenen Domäne, er streckt sich aber nicht über den aminoterminalen Bereich.

Bei den in SEQ ID NO: 2 beziehungsweise SEQ ID NO: 4 beschriebe nen Proteinen handelt es sich um neue Proteine, die mit der GIRK1-Untereinheit interagieren können und Einfluß auf die Eigen schaften dieser Kanäle haben.

Die Verteilung der mRNA, von der die cDNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 stammte, wurde mittels Northern Blot und mittels in situ-Hybridi sierung auf Rattenhirnschnitten untersucht. Die Analyse von 10 verschiedenen Rattengeweben ergab eine gehirnspezifische Expres sion einer 3 kb großen mRNA. Die in situ-Hybridisierung ergab eine starke Expression in Cortex, Cerebellum und Hippokampus sowie eine schwächere Expression in weiteren Hirnregionen.

Das Expressionsmuster der SEQ ID NO: 1 überlappt mit dem der GIRK1-Untereinheit und deutet auf eine wichtige zentralnervöse Funktion des in SEQ ID NO: 2 dargestellten Proteins hin. Soweit nicht anders angegeben wurde bei der experimentellen Durchführung entsprechend den Vorschriften in "Ausubel et al., (eds.), 1998. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York" verfahren.

Beispiel 1 Two-hybrid Suche mit dem Amino- und Carboxyterminus der GIRK1-Un tereinheit

Die für den Carboxy- und Aminoterminus der GIRR1-Untereinheit ko dierenden cDNAs (accession no.: U09243, EMBL-Datenbank) wurden in zwei unabhängigen Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) mit den fol genden spezifischen Primern:
GIRK1-NC-s (5'-ACAGTCGACTATGTCTGCACTCCGAAGGAA-3') und
GIRK1-NC-Las (5'-ACCGCTGGAGCCCGAAGAGATAAAGAGGTTCCAAC-3')
beziehungsweise
GIRK1-NC-Ls (5'-TCTTCGGGCTCCAGCGGTATCAAGATGTCCCAGCCC-3') und
GIRK1-NC-as (5'-GTCACTAGTGGTGTTTTGCTATGTGAAGCG-3')
von Rattenhirn-cDNA amplifiziert. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden in einer weiteren PCR-Reaktion fusioniert, indem fünf Re aktionszyklen mit dem Enzym/Puffergemisch und den PCR-Produkten wurden, wie dem Fachmann bekannt ist, durchgeführt. In dieser Re aktion dienten die an die Primer GIRK1-NC-Las und GIRK1-NC-Ls an gehängten Linkersequenzen als Primer für den Gegenstrang. Für die folgenden zwanzig Reaktionszyklen wurden die Primer GIRR1-NC-s und GIRK1-NC-as zupipettiert. Das erhaltene Konstrukt wurde mit den Restriktionsenzymen SalI und SpeI verdaut und danach über die überhängenden Enden in einen mit SalI und SpeI vorgeschnittenen Vektor pDBLeu (Firma LifeTechnologies) kloniert. Das so entstan dene DNA-Konstrukt ("GIRK1-NC-bait") kodiert für ein Protein, in dem die GAL4-DNA-Bindungsdomäne mit dem N-Terminus der GIRR1-Un tereinheit, einer Linkersequenz (NH₂-GSSGSS-COOH) und mit dem C- Terminus von GIRK1 fusioniert ist. Mit diesem Konstrukt wurde der Hefestamm Y190 (Firma LifeTechnologies) transformiert. Der resul tierende Hefestamm wurde mit einer Rattenhirn-cDNA Bank im Vektor pPC86 (Firma LifeTechnologies) transformiert und 5,27 mio Trans formanden auf Tryptophan/Leucin/Histidin-Mangelmedien, die mit 20 mM 3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT, Firma SIGMA) versehen waren, plattiert. Nach 3, 4 und 5 Tagen Wachstum bei 30°C wurden elf Ko lonien mit einem Durchmesser von lznm und mehr vereinzelt (GIRK1NC-preys 1-11) und einer X-Gal-Färbung unterzogen. Insge samt sechs Kolonien erwiesen sich als His3- und LacZ-positiv. Aus diesen wurden die Bankplasmide isoliert und die cDNA mit den vek torspezifischen Primern
pPC86a (5'-GTATAACGCGTTTGGAATCAC-3') und
pPC86b (5'-GTAAATTTCTGGCAAGGTAGAC-3')
sequenziert. Die Sequenzanalyse ergab 2 verschiedene, überlap pende Fragmente ("GIRK1NCprey3": Nukleotide 500-1193 und "GIRK1NCprey2": Nukleotide 1011-1349 der SEQ ID NO: 1) einer un bekannten cDNA.

Die aufgereinigte pPC86-Plasmid-DNA wurde mit verschiedenen pDBLeu-Konstrukten in den Hefestamm Y190 kotransformiert. Nur in Kombination mit dem Konstrukt GIRRINC-bait konnte eine Aktivie rung der Reportergene His3 und LacZ festgestellt werden.

Beispiel 2 Klonierung der cDNA für den neuen GIRK1-Interaktionspartner Mogli

Ein aus der two-hybrid Suche gewonnenes cDNA-Fragment gemäß Bei spiel 1 (Nukleotide 500-1193 in Sequenz SEQ ID NO: 1) wurde mit dem random primed labelling kit (Firma BOEHRINGER MANNHEIM) entspre chend den Herstellerangaben mit α-³²P-dCTP radioaktiv markiert. Die durch Erhitzen denaturierte, radioaktive Sonde wurde auf 20 Nitrozellulosefilter, auf die je 24000 Plaques einer cDNA-Bank aus Rattenhippokampus und -cortex im Bakteriophagen X transferiert worden waren, 16 Stunden lang hybridisiert (42°C, 5 × SSC/50% Forma mid) und daraufhin mehrfach mit 0,2 × SSC bei 55° beziehungsweise 60°C gewaschen. Von 20 positiven λ-Klonen wurden neun vereinzelt, Phagen-DNA isoliert und kartiert. Die cDNA-Fragmente der Klone 8 und 11 wurden vollständig sequenziert. Sie enthalten ein offenes Leseraster für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2. Die Sequenza nalyse dieser beiden λ-cDNA-Klone ergab einen Unterschied in der kodierenden Sequenz, eine stille Mutation (Nukleotid 1815: C zu T). Eine Analyse der übrigen Phagenklone ergab, daß in Position 1815 die Base T in acht von neun untersuchten Fällen auftritt. SEQ ID NO: 1 schließt damit Sequenzen ein, die an Position 1815 ein T oder ein C enthalten (in SEQ ID NO: 1 mit "Y" gekennzeich net). Es handelt sich also um eine Stille Mutation, die die Ami nosäuresequenz des Proteins nicht beeinflußt. Es handelt sich in beiden Fällen um die Aminosäure Prolin (siehe Xaa in den Sequen zen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2).

Beispiel 3 Expression der mRNA für den neuen GIRK1-Interaktionspartner Mogli in Rattengeweben

Ein aus der two-hybrid Suche gewonnenes cDNA-Fragment gemäß Bei spiel 1 (Nukleotide 500-1193 in Sequenz SEQ ID NO: 1) wurde mit dem random primed labelling kit (Firma BOEHRINGER MANNHEIM) entspre chend den Herstellerangaben mit α-³²P-dCTP radioaktiv markiert. Die durch Erhitzen denaturierte, radioaktive Sonde wurde mit ei nem Multiple Tissue Northern Blot (je 10 µg total RNA von Ratten gehirn, -leber, -lunge, -herz, -niere, -skelettmuskel, -dünndarm und -testis; isoliert nach "Chomzinsky und Sacci, Anal. Biochem., 162, 156-159, 1987") in QuickHyb-Lösung (Firma STRATAGENE) für eine Stunde bei 68°C inkubiert und daraufhin bei 55°C und 0,1 × SSC/ 0,1% SDS gewaschen. Nach 3 Tagen Exposition wurde ein starkes Hy bridisierungssignal auf Gehirn-RNA bei etwa 3 kb und kein Signal in allen anderen untersuchten Geweben festgestellt (siehe Fig. 1, A). Fig. 1A: Abbildung des Multiple Tissue Northern, der wie oben beschrieben hergestellt wurde. Angegeben sind die Laufweiten des verwendeten RNA-Größenstandards (in Kilobasen) und die Herkunftsorgane der RNA-Proben, die in den verschiedenen Spu ren aufgetragen wurden.

Dieselbe Sonde wurde mit einem Northern Blot verschiedener Ent wicklungsstadien (je 10 µg total RNA von Rattengehirn der Stadien embyonal (E) 9, E12, E15, E18, postnatal (P) 0, P14, P21 und "Adult"; isoliert nach Chomzinsky und Sacci (s. o.)) in QuickHyb- Lösung (Firma STRATAGENE) für eine Stunde bei 68°C inkubiert und daraufhin bei 55°C und 0,1 × SSC/0,1% SDS gewaschen. Nach 3 Tagen Ex position wurde kein Hybridisierungssignal im Stadium E9; ein schwaches Hybridisierungssignal im Stadium E12 und ein deutliches Signal ab E15, das bis zum Adultstadium leicht zunimmt, detek tiert (siehe Fig. 1, B). Fig. 1B: Abbildung des Northern Blots verschiedener Entwicklungsstadien, der wie oben beschrieben hergestellt wurde. Angegeben sind die Laufweiten des verwendeten RNA-Größenstandards (in Kilobasen) und das Alter der Ratten, de ren Gehirn-RNA-Proben in den verschiedenen Spruren aufgetragen wurden.

Beispiel 4 Expression der mRNA für den neuen GIRK1-Interaktionspartner Mogli im Rattengehirn

Die Verteilung der mRNA für SEQ ID NO: 1 im Rattengehirn wurde durch in-situ Hybridisierung unter Verwendung von RNA-Proben er mittelt, die von SEQ ID NO: 1 abgeleitet wurden. Mit geeigneten RNA-Polymerasen T7 und T3 und Digoxigenin-markierten Nukleotiden (UTP) wurden von einem mit XhoI oder NotI linearisierten pBS-Vek tor, der die SEQ ID NO: 1 enthielt, sense- und antisense-Proben hergestellt. Etwa 15 µm dicke horizontale Gehirnschnitte wurden fixiert, permeabilisiert, azetyliert und über Nacht bei 65°C in 5 × SSC, 50%Formamid mit den Proben hybridisiert. Die Schnitte wur den bei 20°C zweimal für 10 Minuten mit 2 × SSC, dann bei 65° für 10 Minuten mit 0,2 × SSC und schließlich bei 20°C für 5 Minuten mit 0,2 × SSC gewaschen. Anschließend wurde einzelsträngige RNA durch Behandlung mit RNAseA (50 µg/ml) (Firma SIGMA) bei 37°C für 30 Mi nuten abgebaut. Entsprechend den Angaben des Herstellers wurden die Schnitte mit Alkalischer Phosphatase markierten anti-Digoxi genin Antikörpern (BOEHRINGER MANNHEIM) inkubiert, gewaschen und de tektiert.

Das stärkste Signal wurde in Purkinjezellen und Körnerzellen des Kleinhirns detektiert. Ebenfalls starke Signale wurden im Cortex und im Hippokampus, schwächere in verschiedenen thalamischen Ker nen, im Striatum und im Mittelhirn gefunden (siehe Fig. 2). Fig. 2: In-situ Hybridisierung für SEQ ID NO: 1,

Fig. 2A: Horizontaler Schnitt durch adultes Rattengehirn. Hy bridisierungssignale von SEQ ID NO: 1 treten aufgrund der inver sen Darstellung hell hervor.

Fig. 2B-D: Vergrößerte Ausschnitte eines horizontalen Schnit tes durch ein adultes Rattengehirn. Vergleich der Hybridisieungs muster von SEQ ID NO: 1 und GIRK1 im Cerebellum und Hippokampus. Hybridisierungssignale hier dunkel dargestellt (Abkürzungen in der Figur: CA1-3: Felder CA1-3 des Hippokampus; Ctx: Cortex; Dg: Gyrus dentatus; Gr: granuläre Schicht/Körnerzellen; Hi: Hip pokampus; Pu: Purkinje Zellen).

Beispiel 5 Klonierung und Sequenzierung der cDNA für die humane Form des neuen GIRK1-Interaktionspartners Mogli ("hsMogli")

Ein aus der two-hybrid Suche gewonnenes cDNA-Fragment gemäß Bei spiel 1 (Nukleotide 500-1193 in Sequenz SEQ ID NO: 1) wurde mit dem random primed labelling kit (Firma BOEHRINGER MANNHEIM) entspre chend den Herstellerangaben mit α-³²P-dCTP radioaktiv markiert. Die durch Erhitzen denaturierte, radioaktive Sonde wurde auf 18 Nitrozellulosefilter, auf die je 30000 Plaques einer cDNA-Bank aus humanem Hippokampus im Bakteriophagen λ transferiert worden waren, 16 Stunden lang hybridisiert (42°C, 5 × SSC, 50% Formamid) und daraufhin bei 20°C für 15 Minuten mit 1 × SSC sowie zweimal bei 50°C für jeweils 10 Minuten mit 0,5 × SSC gewaschen. Vier positive λ-Klone wurden vereinzelt, Phagen-DNA isoliert und kartiert. Die cDNA-Fragmente der beiden längsten Klone (1 und 2) wurden voll ständig sequenziert. Sie enthielten die hsMogli-Sequenz entspre chend Nukleotiden 751-1992 bzw. 707-1992 in SEQ ID NO: 3. Keiner der isolierten Klone enthielt weiter stromaufwärts gelegene Se quenzen. Um das offene Leseraster für hsMogli zu vervollständi gen, wurde humane hippokampale RNA mit Reverser Transkriptase (Firma LIFE TECHNOLOGIES) in cDNA umgeschrieben. Ausgehend von dieser cDNA wurden mit Primer-Oligonukleotiden, die von der Rattense quenz SEQ ID NO: 1 bzw. von öffentlichen humanen Datenbanksequen zen (ESTs) abgeleitet wurden, verschiedene PCR-Reaktionen mit KlenTaq DNA Polymerase (Firma CLONTECH) entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Eine dieser Reaktionen,
hsMogli8s(5'-TCGCACAGCTGATAGGATTAGG-3')/
hsMogli11as(5'- CCTCATGATGGGGCTACAGTCG-3'),
ergab ein verkürztes Produkt, dessen Sequenz aber die Synthese von spezifischen Primern für hsMogli ermöglichte. Die Primer-Kom binationen
hsMogli12s(5'-TTTGTCAGCCCTGATTGAGCC-3')/
hsMogli14as(5'-GAGCTGCTGGGGTTGAACTCTC-3'),
hsMogli13s(5'-GAGAGTTCAACCCCAGCAGCTC-3')/
hsMogli11as(5'-CCTCATGATGGGGCTACAGTCG-3') sowie
hsMogli23s(5'-GAGAGCAAGGAGCACAGA-3')/
hsMogli11as(5'-CCTCATGATGGGGCTACAGTCG-3')
ergaben schließlich die gewünschte Bandengrößen. Die Amplikons wurden mit den PCR-Primern und mit internen Primern direkt se quenziert. Die resultierende Sequenz wurde mit der Sequenz aus den λ-Klonen 1 und 2 fusioniert. Sie ergab ein offenes Leseraster, das in SEQ ID NO: 3 dargestellt ist.

Beispiel 6 Kotransformationsstudien zur genaueren Bestimmung der interagie renden Domänen von GIRK1 und dem GIRK1-Interaktionspartner Mogli

Die für den Carboxy- beziehungsweise den Aminoterminus der GIRK1-Untereinheit kodierende DNA (accession no.: U09243, EMBL- Datenbank) wurde ausgehend von dem Plasmid "GIRKINC-bait" unter Verwendung der Primer GGIRK1-4s (5'-TAGGTCGACCATGTTTAGCGAG CATGCGGTT-3') und GGIRK1-as (5'-GTCACTAGTTGGGGTGTTTTGCTATGT GAAG-3') beziehungsweise GIRK1-NC-s (5'-ACAGTCGACTATGTCTGCACTC CGAAGGAA-3') und GIRK1-N-as (5'-GTCACTAGTGATAAAGAGGTTCCAAC-3') mittels PCR amplifiziert und in den Vektor pDBLeu kloniert. Jedes der Plasmide wurde mit dem pPC86-Plasmid GIRKINCprey2 (SEQ ID NO: 1, Nukleotide 1011-1349) oder mit dem Plasmid GIRKINCprey3 (SEQ ID NO: 1, Nukleotide 500-1193) in den Hefestamm Y190 kotransfor miert. Die Kotransformation des N- oder C-Terminus von GIRK1 mit einem der prey-Plamide führte in keinem Fall zu einer Aktivierung der Reportergene des Hefestammes Y190. Offensichtlich findet die Interaktion mit Mogli nur in Gegenwart beider intrazellulärer An teile von GIRK1 statt.

Der Bereich der SEQ ID NO: 1 Nukleotid 1011-1193 ist in den bei den Plasmiden GIRK1NCprey2 und GIRK1NCprey3 enthalten. Um zu kon trollieren, ob dieser Bereich eine Interaktion mit GIRK1 vermit teln kann, wurde er unter Verwendung der Primer
1NCprey23o-s (5'-ACAGTCGACGGAGTCTGAGCGCCGA-3') und
1NCprey23o-as (5'-GTCGCGGCCGCCTGCTCCTCATAGTCTC-3')
in das Plasmid pPC86 kloniert. Dieses Konstrukt wurde mit dem Klon GIRK1-NC-bait in den Hefestamm Y190 kotransformiert und die Aktivierung der Reportergene überprüft. Auch hier fand keine Ak tivierung statt, was darauf hindeutet, daß ein größeres Element des Proteins Mogli für eine funktionelle Interaktion verantwort lich sein muß.

In den öffentlichen Datenbanken ist eine humane Sequenz enthalten ("KIAA0374"; accession no.: AB002372), die für ein Protein ko diert, das im Bereich der Aminosäuren 85-243 Ähnlichkeit zu den Aminosäuren 237-395 in SEQ ID NO: 2 (enthaltend SEQ ID NO: 6) be ziehungsweise zu den Aminosäuren 233-391 in SEQ ID NO: 4 (enthal tend SEQ ID NO: 8) aufweist. Diese Bereiche zeichnen sich in den drei Proteinen durch eine Vielzahl geladener Aminosäuren aus und Strukturvorhersageprogramme gaben eine α-helikale Struktur für diesen Bereich an. Die DNA für die geladenen Domänen SEQ ID NO: 6 und Aminosäure 85-243 in KIAA0374 wurden unter Verwendung spezi fischer Primer amplifiziert, mit den Restriktionsenzymen SalI/ NotI verdaut und in einen gleichermaßen verdauten Vektor pPC86 kloniert (MOGLI-charged-s: 5'-GACGTCGACAGGCTCCTACAAAGGAAGCGAC-3' und MOGLI-charged-as: 5'-GAGCGGCCGCTCAGTCTAGACACAGTTCATCCCTC-3'; MOGLI2-eharged-s: 5'-GACGTCGACAGGCTCCTACAAGGGCAGTGAC-3' und MOGLI2-charged-as: 5'-GAGCGGCCGCTCACTCCCCAGTGCCATCCTCCTT-3'). Diese Konstrukte wurden mit der GIRK1-NC-bait in den Hefestamm Y190 kotransformiert. Nur in der Kombination der GIRKINC-bait mit dem Konstrukt des geladenen Teils von Mogli konnte eine Aktivie rung der Reportergene His3 und LacZ festgestellt werden. Die ge ladene Domäne des Proteins Mogli war demzufolge in der Lage, mit GIRK1 zu interagieren; das Ergebnis unterstreicht die Spezifität der GIRK1-Mogli Interaktion, da für die geladene Domäne des von KIAA0374 kodierten Proteins, trotz starker Ähnlichkeit zur gela denen Domäne von Mogli, keine Wechselwirkung mit GIRK1 nachgewie sen werden konnte.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Isolierte Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestell ten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degene rierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestell ten Nukleinsäuresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 darge stellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäu resequenzen codieren und mindestens 60% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die biologische Akti vität der Polypeptide wesentlich reduziert ist
d) Äquivalente der unter (a) bis (c) genannten Sequenzen, die noch eine biologische Aktivität aufweisen.

2. Protein kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß An spruch 1.

3. Proteinkomplexe, enthaltend mindestens ein Kir-Protein und mindestens ein Protein gemäß Anspruch 2, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften des in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Proteins oder des Proteinkomplexes erhalten bleibt.

4. Proteinkomplex nach Anspruch 3 wobei es sich bei dem Kir-Pro tein um ein GIRK-Protein handelt.

5. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend eine Nuklein säuresequenz gemäß Anspruch 1 oder eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 und eine Sequenz, die für ein Kir-Protein kodiert, funktionell verknüpft mit mindestens einem geneti schen Regulationselement.

6. Wirtsorganismus, transformiert mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder einem rekombinanten Nukleinsäurekon strukt gemäß Anspruch 5.

7. Transgene Tiere enthaltend eine funktionelle oder nicht funk tionelle Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder ein funk tionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt ge mäß Anspruch 5.

8. Transgene Tiere, in deren Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen, oder in dessen Keimzellen und der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen die Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 durch gentechnische Verfah ren verändert oder durch Einfügen von DNA-Elementen unterbro chen wurde.

9. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, eines Nukleinsäurekonstrukts gemäß Anspruch 5, eines Proteinkomple xes gemäß Anspruch 3 oder Proteins gemäß Anspruch 2 zur Iden tifizierung von Proteinen, die zu einem Proteinkomplex gemäß Anspruch 3 oder einem Protein gemäß Anspruch 2 spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen, oder zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Proteine kodieren, die zu einem Pro teinkomplex gemäß Anspruch 3 oder einem Protein gemäß An spruch 2 spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen.

10. Verwendung des two-hybrid Systems oder biochemischer Verfah ren zur Identifizierung der Interaktionsdomänen von Kirs, GIRKs mit Proteinen gemäß Anspruch 2 und Verwendung zur phar makotherapeutischen Intervention.

11. Verwendung der aus einer Strukturaufklärung eines Proteinkom plexes gemäß Anspruch 3 oder eines Proteins gemäß Anspruch 2 resultierenden Information zum gezielten Auffinden oder zur gezielten Herstellung von Substanzen mit spezifischer Bin dungsaktivität zu einem Proteinkomplex gemäß Anspruch 3 oder einem Protein gemäß Anspruch 2.

12. Verwendung eines Proteinkomplexes gemäß Anspruch 3 oder eines Proteins gemäß Anspruch 2 oder Peptidfragmenten davon als An tigen zur Erzeugung von spezifischen mono- oder polyklonalen Antikörpern oder Antikörpergemischen gerichtet gegen Proteine gemäß Anspruch 2 oder gegen Proteinkomplex gemäß Anspruch 3.

13. Mono- oder polyklonale Antikörper oder Antikörpergemische, die spezifisch Proteine nach Anspruch 2 oder Proteinkomplexe nach Anspruch 3 erkennen.

14. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder eines Fragmentes davon zur Isolierung einer genomischen Se quenz über Homologiescreening, als Marker für humane Erb krankheiten oder zur Gentherapie.

15. Verfahren zum Auffinden von Substanzen mit spezifischer Bin dungsaffinität zu einem Protein nach Anspruch 2, das folgende Schritte umfaßt.

a) Inkubation des Proteins gemäß Anspruch 2 mit der zu te stenden Substanz.
b) Detektion der Bindung der zu testenden Substanz an das Protein.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion der Bindung durch Messen der K⁺-Leitfähigkeit von GIRK-Proteinen erfolgt.

17. Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 in einer biologischen Probe, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfaßt:

a) Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge an Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder einer bekann ten Menge an Oligonukleotiden, die als Primer für eine Amplifikation der Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 geeignet sind oder Mischungen davon,
b) Nachweis der Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 durch spezifi sche Hybridisierung oder PCR-Amplifikation,
c) Vergleich der Menge an hybridisierender Nukleinsäure ge mäß Anspruch 1 oder an durch PCR Amplifikation gewonnener Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 mit einem Standard.

18. Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis eines Proteins gemäß Anspruch 2 oder eines Proteinkomplexes gemäß Anspruch 3 in einer biologischen Probe, das einen oder meh rere der folgenden Schritte umfaßt:

a) Inkubation einer biologischen Probe mit einem Antikörper gemäß Anspruch 13, der spezifisch gegen Proteine gemäß Anspruch 2 oder einen Proteinkomplexes gemäß Anspruch 3 gerichtet ist,
b) Nachweis des Antikörper/Antigenkomplexes,
c) Vergleich der Mengen des Antikörper/Antigenkomplexes mit einem Mengenstandard.

19. Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an ein Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 binden, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfaßt:

a) Expression des Proteins in eukaryotischen oder prokaryo tischen Zellen.
b) Inkubation des Proteins mit den zu testenden Substanzen.
c) Nachweis der Bindung einer Substanz an das Protein.

20. Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Interaktion von Proteinen mit Aminosäuresequenzen gemäß Anspruch 2 mit Kir-Proteinen hemmen oder verstärken.