WO2003042242A1 - Mch-rezeptor interagierendes zinkfinger-protein - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, humanes, multifunktionelles Protein, das mit dem Melanin-konzentrierenden-Hormon-Rezeptor (MCH-R) interagiert, einschliesslich Derivate, Homologe und Fragmente desselben. Ferner betrifft die Erfindung ein Polynukleotid, das für das vorgenannte Protein oder Polypeptid kodiert.

Description

MCH-Rezeptor interaqierendes Zinkfinger-Protein

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, humanes, multifunk- tionelles Protein, das mit dem Melanin-konzentrierenden-Hormon- Rezeptor (MCH-R) interagiert, einschließlich Derivate, Homologe und Fragmente desselben. Ferner betrifft die Erfindung ein Polynukleotid, das für das vorgenannte Protein oder Polypeptid kodiert .

An der Regulation des Energiehaushaltes und Appetitverhaltens sind eine Reihe von Peptidhormonen wie z.B. Leptin, Neuropeptid

Y (NPY) oder α-MSH mit unterschiedlichen Funktionen beteiligt

(vgl. Fig. 1) . So führt z.B. Energiemangel zu einer Abnahme der

Expression des Sättigungssignals Leptin im Fettgewebe (siehe Ref.

1-3) . Über die Blutbahn und die Blut-Hirnschranke erreicht weniger Leptin den Nucleus Arcuatus des Hypothala us . Als Antwort steigt im Nucleus Arcuatus die Expressionsrate des orexigenen

(orexis = appetitanregend) NPY an, während die des anorexigenen

(anorexis = appetithemmend) α-MSH abnimmt. Projektionen der NPY und α-MSH exprimierenden Neuronen erreichen im lateralen hypothalamisehen Areal MCH-exprimierende Neuronen. Dort wirkt NPY stimulierend, oi-MSE dagegen hemmend auf die Expressionsrate des orexigenen Neuropeptids MCH. Die Leptin-Abnahme führt somit über die NPY-Zunahme und -MSH-Abnahme zu einer Steigerung der Expressionsrate von MCH. MCH-exprimierende Neurone projizieren in viele Areale des Gehirns (Cortex, Hippokampus, Olfaktorische Areale, Cerebellum u.a.) und aktivieren dort über den MCH-R verschiedene Verhaltensmuster, die zur Steigerung der Nahrungsaufnahme führen.

Nach ausreichender Nahrungsaufnahme steigt die Leptinkonzen- tration und damit die α-MSH-Expression an - gleichzeitig nimmt die NPY-Expression ab; dadurch wird weniger MCH exprimiert, was dem Körper wiederum signalisiert, die Nahrungsaufnahme zu reduzieren (siehe Ref. 1-3) . Hungernde Ratten oder fettsüchtige, Leptin-defiziente Mäuse ( ob/ob) (Ref. 4, 7) weisen folglich eine erhöhte MCH-Expression auf. Gleiches wurde auch für den MCH-R beobachtet, dessen Expression bei hungernden und Leptin-de izien- ten Mäusen stark erhöht ist (Ref. 5); der zugrunde liegende Mechanismus der Leptin-abhängigen Regulation der MCH-R-Expression ist bislang unbekannt, ebenso, wie MCH-R sein empfangenes Signal intrazellulär weiterleitet und auf welcher Stufe diese Signalkette moduliert werden könnte. Ein Mangel an MCH, wie er bei der Maus durch eine experimentell erzeugte Nullmutation des MCH-Gens erzeugt wurde, führt zu einem Anorexie-ähnlichen Phänotyp (Ref. 6). Umgekehrt führt eine erhöhte Konzentration von MCH, z.B. durch intracerebroventrikuläre Injektion des Peptids bei Ratten oder durch die Überexpression in transgenen Mäusen, zur Zunahme des Fressverhaltens und zu einem Fettsucht-ähnlichen Phänotyp (Ref. 7-9) .

Da zum einen dem MCH/MCH-R System eine signifikante Bedeutung in der Regulation des Appetitverhaltens und damit des endogenen Energiehaushaltes zukommt, zum anderen jedoch wenig über die MCH- vermittelte Signaltransduktionskette bekannt ist, besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Identifizierung von Interaktionspartnern des MCH-R. Die Identifizierung eines solchen Proteins und seine mögliche Regulation stellt erhebliches pharmakologisch.es Interesse dar, um neue Ansätze zur Beein- flussung des Appetitverhaltens zu verfolgen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein neues, humanes, multifunktionelles Protein gelöst, bei dem_.es sich um ein MCH-Rezeptor interagierendes Zinkfinger-Protein handelt.

Die isolierte humane cDNA-Sequenz besteht aus 1,377 kb, die. einen offenen Leserahmen von 227 Aminosäuren aufweist (vgl. SEQ ID NO:l; "SEQ ID NO" entspricht der Sequenzkennzahl "400" nach IPO Standard ST.25.) . Das humane MIZIP-Protein besitzt am C-Terminus eine aus 44^' Aminosäure-bestehende Zinkfingerdomäne vom MYND-Typus

(Myeloid, Nevy, DEAF) (Zit. 13, 14 + 21), ein konserviertes

Protein-Protein-Interaktionsmotif, das in Proteinen von Hefe bis

Mensch vorkommt; ansonsten bestehen keine strukturellen Ähn- lichkeiten zu anderen bekannten Proteinen. Mit Hilfe von EST- Datenbankrecherchen und RT-PCR konnte das murine MIZIP (MIZIPl; vgl. SEQ ID NO: 3) sowie eine Spleißvariante MIZIP2 (MIZIP2; vgl. SEQ ID NO: ) isoliert werden. Die Nukleotidsequenz des murinen MIZIP1 ist zu 90%, das vorhergesagte Protein zu 100% identisch mit dem humanen MIZIP. Die murine Spleißvariante MIZIP2 ist am N-Terminus um 39 Aminosäuren kürzer als murines MIZIPl, ansonsten ist sie in der Aminosäuresequenz identisch mit MIZIPl.

Das humane MIZIP-Gen befindet sich auf Chromosom 9q34.3, das murine MZIP-Gen auf Chromosom 2. Das humane und murine MIZIP-Gen bestehen aus je 6 Exons und 5 Introns, die hoch konserviert sind.

In der murinen MIZIP-Spleißform ist das erste Exon durch ein anderes, weiter stromabwärts liegendes Exon ersetzt, das die 5'- untranslatierte Region kodiert. Eine humane Spleißvariante konnte bislang nicht festgestellt werden. Orthologe Gene liegen bei

Xenopus und Zebrafisch vor, dagegen nur entfernt verwandte Gene bei Drosophila oder der Hefe .

Wie im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt wurde ist MIZIP ein multifunktionelles Genprodukt, das in vielen Organen von Mensch, Maus und anderen Vertebraten exprimiert wird. An folgenden Funktionen bzw. Regulationsprozessen ist MIZIP beteiligt :

Steuerung des Energiehaushaltes und Appetitverhaltens : Humanes MIZIP wird in Gehirnregionen wie Thalamus, Sub- stantia Nigra, Hippokampus, Corpus Callosum, Amygdala, aber auch in peripheren Organen wie Leber, Magen, Niere, Skelettmuskel, Haut, Herz, Speicheldrüse, Schilddrüse, Testis oder Placenta exprimiert. Im Hippokampus und Cerebellum liegen MIZIP und MCH-R co-exprimiert vor. In verschiedenen Geweben, vor allem in Testis und Gehirn, Leptin-defizienter Fettsucht-Mäuse (B6.V-Lep° , Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA) konnte durch Northern-Hybridisierungsexperimente eine erhöhte MIZIP-mRNA-Expression nachgewiesen werden. Dies zeigt, dass MIZIP ebenso wie MCH und MCH-R als Marker für Fettsucht, zumindest für durch Leptin-Fehlfunktionen verursachte Fettsucht, eingesetzt werden kann. Humanes MIZIP interagiert mit dem C-Terminus vom MCH-R im Hefe-Interaktionstest, im "overlay assay" und im "pull-down assay" . In mit MIZIP transfizierten HEK293-Zellen (menschliche em- bryonale Nierenzellen) ist MIZIP cytoplasmatisch lokalisiert; in transfizierten C0S7-Zellen auch im Zellkern. Co- Transfektion von MIZIP und MCH-R in HEK293-Zellen führt zur Co-Lokalisation der beiden Proteine an der Zellmembran. Auch nach Zugabe des Agonisten MCH verbleiben beide Proteine an der Zellmembran co-lokalisiert . Danach moduliert MIZIP die Internalisierung bzw. das Recycling von MCH-R. MIZIP kommt damit eine wichtige Rolle bei der Regulation des Energiehaushaltes und Appetitverhaltens zu.

- Entwicklung des Cerebellums:

Das auf Chromosom 9q34.3 kartierte MIZIP liegt in unmittelbarer Nachbarschaft zu dem autosomal rezessiv vererbten Joubert Syndrom (Cerebelloparenchymale Erkrankung (CPDIV) , OMIM 213300) , für das noch kein molekulares Korrelat bekannt ist. Patienten mit Joubert Syndrom sind psychomotorisch ^• gestört und mental retardiert. Aufgrund seiner genomischen Lokalisation ist MIZIP ein Kandidatengen für das Joubert Syndrom .

Regulation der Gen-Replikation und -Expression: Das Vorkommen von MIZIP in zahlreichen Geweben sowie die immuncytochemische Lokalisation im Zellkern von COS7- ellen zeigen, daß MIZIP weitere Funktionen z.B. bei Transkriptionsvorgängen haben kann.

MIZIP-Expression im Pankreas : insulinotropher Effekt - Auswirkungen beim Kohlenhydrat- Stoffwechsel bzw. Diabetes mellitus: Dot-Blot Analysen zeigen, dass MIZIP auch im Pankreas exprimiert wird. Da MCH- R ebenfalls in pankreatisehen Zellen exprimiert wird, ferner MCH-Zugabe die Insulinsekretion stimuliert, ist MIZIP als eine Komponente bei der Insulinsekretion im Kohlenhydrat- stoff echsel bzw. beim Diabetes mellitus anzusehen.

Reproduktionsprozesse:

Northern Blot- bzw. Dot-Blot-Analysen zeigen starke Ex- pression in humanem Testis- bzw. Placentagewebe, was auf eine Beteiligung von MIZIP bei Reproduktionsvorgängen hinweist .

Tumor-/Leukämieentstehung: Dot-Blot-Analysen ergeben eine signifikante MIZIP-Expression in Tumor- und Leukämie-Zellen des Menschen. Die Bedeutung von MIZIP kann vielschichtig sein. So kann das Protein z.B. an der Leukämie-Entstehung beteiligt sein, wodurch es als früher Leukämiemarker dienen könnte . ,.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein isoliertes Polynukleotid, das ein mit dem Melanin-konzentrierenden-Hormon- Rezeptor (MCH-R) interagierendes Protein kodiert, das

a) ein Polynukleotid ist, das ein mit dem MCH-R interagierendes Protein mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz oder mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens etwa 90% zu der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz identisch ist, kodiert,

b) ein Polynukleotid mit der in SEQ ID NO:l, 3 oder 4 gezeigten Sequenz ist,

c) ein Polynukleotid ist, das unter stringenten Bedingungen (Puffer mit 5xSSC / 50% Formamid bei 60 °C) mit einem in (a) oder (b) genannten Polynukleotid hybri- disiert,

d) ein Polynukleotid mit einer Sequenz ist, die von den in (a) bis (c) genannten Polynukleotidsequenzen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes abweicht, oder

e) ein Polynukleotid ist, das ein Fragment, ein Derivat oder eine allelische Variation eines in (a) bis (d) genannten Polynukleotids ist.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform ist das Polynukleotid ein Polynukleotid, das regulatorische genomische Sequenzen (Promotor) des humanen bzw. murinen MIZIP Gens enthält oder ein Polypeptid, das unter stringenten Bedingungen spezifisch zwischen den murinen Splice-Varianten MIZIPl und MIZIP2 unterscheiden kann.

Unter einem Fragment werden vorliegend Nukleinsäuresequenzen mit 19 bis 1000 Basen, vorzugsweise 20 bis 250 Basen verstanden. Der Begriff Derivat schließt Varianten ein, in denen einzelne Nukleinsäurebausteine durch dem Fachmann bekannte, modifizierte Nukleotide ersetzt sind.

Erfindungsgemäß kommen folgende cDNA-Fragmente in Frage, die insbesondere zur spezifischen Detektion der mRNA der Splice- Varianten des murinen MIZIP dienen:

a) ein cDNA-Fragment des murinen MIZIPl bestehend aus den Nukleotiden 1-205 der cDNA des murinen MIZIPl zur spezifi- sehen Detektion von MIZIPl (vgl. Abb. 5) . b) ein c-DNA-Fragment des murinen MIZIP2 bestehend aus den Nukleotiden 1-263 der cDNA des murinen MIZIP2 zur spezifischen Detektion von MIZIP2 (vgl. Abb. 5) . Genomische DNA-Fragmente des humanen und murinen MIZIP-Gens. a) Regulatorischen genomischen Sequenzen (Promotorregionen) des humanen und murinen MIZIP, insbesondere 702 Nukleotide 5' des Transskriptionsstartpunktes des humanen MIZIP

(gi:15297410, Basen 41408-40706 (reverse) ; SEQ ID NO: 17), sowie 717 Nukleotide 5' des Translationsstartpunktes des murinen MIZIP-1 (Whitehead mouse assembly contig_514358, Nukleotide 3-719; SEQ ID NO: 18) zur Isolation spezifischer Transkriptionsregulatoren des humanen und murinen MIZIP, insbesondere zur ^' Isolation spezifischer Transskriptions- inhibitoren. b) die genomische Sequenz des murinen MIZIP (generiert aus den Datenbankeinträgen der Whitehead mouse assembly con- tig_514358 (Exon 1-2), contig_408870 (Exon 3,4), con- tig_384443 (Exon 6) und dem Sanger center mouse assembly contig RPCI-23-407O13. F (Exon 5)) zur gentechnischen Generierung von Mutationen, insbesondere Deletionsmutatio- nen, in Mäusen durch homologe Rekombination oder Insertio- nen.

Die Erfindung betrifft ferner einen Expressionsvektor, der ein vorgenanntes Polynukleotid enthält sowie eine Wirtszelle, die einen solchen Expressionsvektor enthält.

Gegenstand der Erfindung ist ferner das durch eines der vor- genannten Polynukleotide kodierte, Protein, insbesondere ein Protein, das mit dem MCH-R interagiert und die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist. Ferner ist ein Protein eingeschlossen, das ein Homologes oder ein Fragment des vorgenannten Proteins ist, dessen Aminosäuresequenz einen Homologie- grad von mindestens 85% zu dem entsprechenden Abschnitt der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz aufweist und das im wesentlichen die gleiche biologische Aktivität, physiologische Wirksamkeit und/oder Immunogenität besitzt.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform ist insbesondere die MYND- Domäne (Nukleotide 735-866, bzw. Aminosäuren 169-212. Vgl. Fig. 2) als Protein-Protein-Interaktionsdomäne für die Funktion des Proteins von Bedeutung. Hierbei ist insbesondere die Lokalisat^'ion der stark konservierten Aminosäuren der MYND-Domäne, wie zum Beispiel die Abstände zwischen den Cysteinresten (vgl. Fig. 3) , entscheidend. Von großer Bedeutung für die Generierung von spezifischen Antikörpern ist der freie C-Terminus des MIZIP, insbesondere die Aminosäuren 211-227.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines mit MCH-R interagierenden Proteins, bei dem man

a) die oben genannte Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, die für die Expression des Proteins geeignet sind und man

b) das Protein aus der Wirtszellkultur isoliert.

Zur Untersuchung der gewebespezifischen Expression dient ein

Verfahren zum Nachweis eines Polynukleotids, das für ein mit dem

MCH-R interagierendes Protein kodiert, in einer biologischen Probe, vorzugsweise einer humanen biologischen Probe, bei dem man

a) ein oben genanntes Polynukleotid mit einem Nukleinsäu- rematerial einer biologischen Probe unter Bildung eines Hybridisierungskomplexes hybridisiert und man

b) den Hybridisierungskomplex nachweist.

Der Nachweis des Hybridisierungskomplexes kann duch vorherige, entsprechende Markierung des Polynukleotids, z.B. mit Farbstoffen oder radioaktiven Markierungen, erfolgen.

Um die Expression zu quantifizieren, ist jedoch der Nachweis des Expressionsproduktes, d.h. des Proteins als solchem, bevorzugt. Zu diesem Zweck empfiehlt es sich, Antikörper zu verwenden, um das exprimierte Protein nachzuweisen und/oder zu quantifizieren. Die vorliegende Erfindung betrifft daher ferner ein Verfahren zum Herstellen von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern gegen das vorgenannte Protein, einschließlich Antikörpern gegen dessen Homologes oder dessen Fragment, bei dem man nicht-menschliche Säuger mit einem Protein, einem Homologen oder einem Fragment des oben genannten Proteins oder Polypeptids immunisiert und man die Antikörper aus einer biologischen Probe des nicht-menschlichen Säugers isoliert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem nicht-menschlichen Säuger um Meerschweinchen oder Kaninchen. Gegenstand der Erfindung sind ferner polyklonale und monoklonale Antikörper, die durch ein vorgenanntes und dem Fachmann gut bekanntes Immunisierungsverfahren erhältlich sind.

Zur Produktion spezifischer Antiseren kommen insbesondere folgende Fragmente in Betracht :

a) Die Peptidsequenz C-KRPFQHELEPER (Cystein + Aminosäuren 216-227 des MIZIP) .

b) Fragmente des MIZIP, insbesondere die Aminosäuren 1-168 zur Generierung des Antiserum GST-N-MIZIP und spezifischer monoklonaler Antikörper (N-MIZIP) bzw. die Aminosäuren 154-227 zur Generierung des Antiserum GST-MYND-MIZIP und spezifischer monoklonaler Antikörper (C-MIZIP) .

Die Antikörper werden gemäß einer Ausführungsform der Erfindung zur in vitro-Untersuchung der. Expression des erfindungsgemäßen Proteins verwendet, bei dem man eine humane biologische Probe mit den Antikörpern unter zur Bindung des Antikörpers an das Protein geeigneten Bedingungen in Kontakt bringt und man die Bindung der Antikörper an das Protein nachweist.

Für den Fachmann ist es in Anbetracht der vorangegangenen Ausführungen selbstverständlich, daß die Erfindung ferner ein Verfahren zum Nachweis eines genannten Polynukleotids oder eines erfindungsgemäßen Proteins, einschließlich seiner Homologen und Fragmente, umfaßt, bei dem man eine biologische Probe, vorzugsweise eine humane biologische Probe, mit einem Reagens in Kontakt bringt, das spezifisch mit dem Polynukleotid oder dem Protein, dem Homologen oder dem Fragment interagiert . Bei dem mit dem Protein, Homologen oder Fragment interagierenden Reagens handelt es sich vorzugsweise um einen vorgenannten Antikörper.

Selbstverständlich betrifft die Erfindung ferner ein Diagnosekit zur Durchführung des Polynukleotid-Protein- bzw. Polypeptid- NachweisVerfahrens, das geeignete Reagenzien zur Aufbereitung der biologischen Probe und zur Durchführung des Nachweises erforder- liehe Reagenzien enthält. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung enthält das Diagnosekit vorgenannte Antikörper.

Aufgrund der Tatsache, daß im Rahmen der vorliegenden Erfindung das mit dem MCH-R interagierende Protein isoliert und charak- terisiert wurde, ist es nunmehr möglich, therapeutisch wirksame Substanzen zu identifizieren, die die Aktivität des mit dem MCH-R interagierenden Proteins regulieren, insbesondere erhöhen oder vermindern. Die Erfindung betrifft daher ferner Verfahren zum Screening nach Substanzen, die die Aktivität eines mit dem MCH-R interagierenden Proteins vermindern, bei dem man eine zu testende Verbindung mit einem durch ein oben genanntes Polynukleotid kodierten Protein in Kontakt bringt und man die Bindung der zu testenden Verbindung an das Protein nachweist, wobei man eine Verbindung, die an das Protein bindet, als mögliches therapeuti- sches Agens zur Verminderung der Aktivität des Proteins identifiziert.

Ferner eingeschlossen ist ein Verfahren zum Screening nach Substanzen, die die Aktivität eines mit dem MCH-R interagierenden Proteins regulieren, bei dem man eine zu testende Verbindung mit einem von einem erfindungsgemäßen Polynukleotid kodierten Protein in Kontakt bringt und man die Aktivität des Proteins, mit dem MCH-R zu interagieren, nachweist, wobei man eine Verbindung, die die Aktivität des Proteins, mit dem MCH-R zu interagieren, erhöht, als mögliches therapeutisches Agens zur Erhöhung der Aktivität der Interaktion von MCH-R und Proteinen identifiziert, und wobei man eine Verbindung, die die Aktivität des Proteins, mit dem MCH-R zu interagieren, vermindert, als mögliches therapeutisches Agens zur Verminderung der Aktivität der Interaktion von MCH-R und Proteinen identifiziert.

Schließlich wird ein Verfahren zum Screening nach Substanzen zur Verfügung gestellt, die die Aktivität eines Proteins, mit dem MCH-R zu interagieren, vermindern, bei dem man eine zu testende Verbindung mit einem Polynukleotid nach Anspruch 1 in Kontakt bringt und man die Bindung der zu testenden Verbindung an das Polynukleotid nachweist, wobei man eine Verbindung, die an das Polynukleotid bindet, als mögliches therapeutisches Agens zur Verminderung der Aktivität des Proteins, mit dem MCH-R zu interagieren, identifiziert.

Ferner ist er indungsgemäß die Verwendung der oben genannten regulatorischen genomischen Sequenzen des humanen oder murinen MIZIP zum Screenen nach Substanzen, die die Transkription des MIZIP vermindern oder erhöhen, eingeschlossen.

Zur weiteren Untersuchung der physiologischen Zusammenhänge bei der Regelung des Appetitverhaltens und des Energiestoffwechsels wird ferner ein transgener nicht-menschlicher Säuger bereitgestellt, der das Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 (murines MIZIP) nicht funktioneil exprimiert. Dies kann dadurch erzielt werden, indem man das Gen, das für das mit dem

Melanin-konzentrierenden-Hormon-Rezeptor (MCH-R) interagierende Protein kodiert, ganz oder teilweise deletiert oder man ein Fragment des Gens, das für das mit dem Melanin-konzentrierenden- Hormon-Rezeptor (MCH-R) interagierende Protein kodiert, durch ein LacZ-Gen und ein Neomycin-Resistenzgen austauscht oder durch Insertionsmutationen verändert. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung exprimiert der transgene nicht- menschliche Säuger anstelle des murinen MIZIP ein Fusionsprotein aus dem 44 Aminosäuren langen N-terminalen Fragment und ß- Galaktosidase. Für den Fachmann versteht es sich, daß die Erzeugung verschiedener nicht-menschlicher Säuger möglich ist, soweit diese ein zu dem murinen oder humanen MIZIP homologes Protein exprimieren. Bei dem transgenen nicht-menschlichen Säuger handelt es sich vorzugsweise um einen Nager, der insbesondere eine Maus ist (sogenannte Knock-out Maus,- ko-Maus) . Die Erzeugung eines transgenen ko-Tieres ist in nach dem Fachmann bekannten Methoden durchführbar.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers, bei dem man das Gen, das für das mit dem Melanin-konzentrierenden-Hormon-Rezeptor (MCH-R) interagierende Protein kodiert, ganz oder teilweise deletiert oder man ein Fragment des Gens, das für das mit dem Melanin-kon- zentrierenden-Hormon-Rezeptor (MCH-R) interagierende Protein kodiert, durch ein LacZ-Gen und ein Neomycin-Resistenzgen austauscht. Bei dem genannten Fragment handelt es sich Vorzugs- weise um einen Teil des Exons 2, das Exon 3 und das Exon 4.

Erfindungsgemäß eignet sich der nicht-menschliche Säugers zur Forschung und Entwicklung von diagnostischen Markern zum Nachweis von Störungen in der Regulation des Appetitverhaltens oder von Wirkstoffen zur Regulation des Appetitverhaltens.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen, Figuren und einem Sequenzprotokoll erläutert . Beispiele

1. Hefe-Interaktionsklonierung

Durch eine PCR-Reaktion mit den Primern slc-1-fln (Ncol; CGGCCATGGGCTTGGGCTATGCTAACAG) und slc-l-rs (BamHI; GCGGATCCT- CAGGTGCCTTTGCTTTCT) und der klonierten Ratten-cDNA des MCH-R (11) als template wurde ein cDNA-Fragment (Basen 915-1085; kodierend für die 55 C-terminalen Aminosäuren des Ratten MCH-R inklusive der letzten 17 Aminosäuren der TM-7; s. Fig. 2) amplifiziert und über die Ncol/BamHI-Schnittstellen in den Vektor pAS2 (Clonteeh, Heidelberg) kloniert .

Nach Transformation dieses Köderplasmids in den Hefe-Reporter- stamm CG1945 (His^", Trp^", Leu^"; Clonteeh) (lithium acetate/single- stranded carrier DNA/PEG Methode nach Gietz et al . , Ref. 10) wurde eine humane Gehirn cDNA-Bibliothek im Vektor pACT2 (Matchmaker, Clonteeh, Heidelberg) nach Hefe-Zwei-Hybrid- Protokoll (Ref. 10; Clonteeh, Heidelberg) auf Interaktionspartner durchsucht. (4 paralelle Ansätze, je lxlO⁹ Zellen mit 50 μg cDNA- library; auf je 5 SD-Agarplatten (His^", Trp^", Leu^", 30 mM 3AT) ausplattiert). Insgesamt wurden 2,7 x 10 Transformanden untersucht und 33 Kolonien von SD-Agarplatten (His^", Trp^", Leu^", 30 mM 3AT) isoliert. Nach Kontrolle der Interaktion durch X-Gal- Färbung und Cycloheximidselektion verblieben 20 positive Klone, deren cDNA nach Standardprotokollen isoliert und sequenziert wurden (Ref. 11; siehe Tab. 1) .

A. 896 TTGTACAACGCGGCCATCAGCTTGGGCTATGCTAACAGCTGCCTGAACCCCTTTGTGTAC

L Y N A A I S L G Y A N S C L N P F V Y 311

956 ATAGTGCTCTGTGAGACCTTTCGAAAACGCTTGGTGTTGTCAGTGAAGCCTGCAGCCCAG

I V L C E T F R K R L V L S V K P A A Q 331

1016 GGGCAGCTCCGCACGGTCAGCAACGCTCAGACAGCTGATGAGGAGAGGACAGAAAGCAAA

G Q L R T V S N A Q T A D E E R T E S K 351

1076 GGCACCTGA

G T *

C.

Tab. 1. Hefe-Interaktionsklonierung mit dem C-Terminus des Ratten- CH-R unter Verwendung einer menschlichen Gehirn-cDNA-Bibliothek.

A. Die C-terminale Aminosäure- und Nukleotidsequenz des MCH-R der Ratte . Die fettgedruckte Nukleotidsequenz diente als Köder; der einzige Aminosäureaustausch zwischen Ratte und Mensch ist durch ein T (Threonin, fett) markiert.

B. Zusammenfassung der Hefe-Interaktionsklonierungen mit dem C- Terminus des MCH-R.

Köder: Ratten-SLC-1 C-Terminus in pAS2 (Trp⁺) ; cDNA-Biblio- thek: Matchmaker human brain in pACT2 (Leu⁺) ; kotransfiziert in CG-1945 Hefen (His^"/Trp^"/Leu^", cyh^r) ; Selektion mit His^" /Trp^"/Leu^~ -Platten mit 30 M 3-AT, X-Gal: LaeZ-Reporterassay (starke Interaktion = blaue Kolonie) ; cyh: Selektion auf pACT2-Plasmid, Kolonien sollten X-Gal-negativ werden

(restliche falsch positiv) .

3-AT, 3-Amino-l, 2, 4-Triazol; cyh, Cycloheximid; X-Gal, 5- Brom-4-Chlor-3-Indolyl-ß-D-Galaktopyranosid (vgl. Matchmaker Gal4 two-hybrid user manual (Clonteeh) ) .

Ergebnis der Sequenzierungen. X, Y, nicht näher charakterisierte Proteine. 5 weitere Klone enthielten Sequenzen im falschen Leserahmen oder genomische DNA Fragmente

2. In vi ro-Interaktionsuntersuchungen

Für die in vitro-Interaktionsuntersuchungen wurde MIZIP als GST- Fusionsprotein (53 kDA) , der C-Terminus des MCH-R als 6xHIS-DHFR- Fusionsprotein (30 kDa) , hergestellt. Dazu wurde ein cDNA- Fragment kodierend für das gesamte humane MIZIP in den Vektor pGEX-4T2 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) kloniert, sowie ein cDNA-Fragment kodierend für die 56 C-terminalen Aminosäuren des Ratten-MCH-R in den Vektor pQE40 (Qiagen, Hilden) kloniert. Die Klonierungen wurden wie folgt mit Hilfe der PCR durchgeführt: MIZIP aus Klon L9 mit den Primern L9-FAgex (BamHI; CAG- GATCCGCCATGACCGACTTCAAATTG) und L9-RSgex (Xhol; CCCTCGAGCGT- CATCGCTCTGGCTCAAGC) nach Verdau mit BamHl/XhoI kloniert in BamHl/XhoI verdauten pGEX-4T2; MCH-R aus Ratten SLC-1 mit den Primern SLC-pQEFl (BamHI; CGGGATCCAGCTTGGGCTATGCTAACAG) und SLC- pQERl (HinDIII; CTAAGCTTTCAGGTGCCTTTGCTTTCT) nach Verdau mit BamHI/HinDIII in BamHl/HinDIII verdauten pQE40.

Die Fusionsproteine wurden in E. coli BL21 exprimiert, die GST- Fusionsproteine mittels Glutathion Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) , sowie die 6xHIS-Fusionsproteine mittels Ni-NTA Agarose (Qiagen) nach Vorschrift der Hersteller isoliert. Dabei wurden die GST-Fusionsproteine nativ (STE- Puffer) , die 6xHIS-Fusionsproteine hingegen denaturierend mit einem Harnstoff-Puffer (6 M) aufgereinigt . Zur Renaturierung wurden die 6xHIS-Fusionsproteine über Nacht gegen PBS dialysiert. Die isolierten Fusionsproteine wurden bei 4°C gelagert.

2.1. Overlay Assay

Je 2 μg GST-Kontrollprotein und MIZIP-GST-Fusionsprotein wurden mit SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembran geblottet. Als Ladekontrolle wurde die Membran für 10 min mit 1% Ponceau-S gefärbt, kurz gewässert und dokumentiert. Nach dem Entfärben wurde die Membran für den Overlay Assay 3 h bei 4°C in 10% Magermilchpulver in TBS-T blockiert und über Nacht bei 4°C mit 2μg/ml 6xHIS-MCH-R Fusionsprotein in TBS-T, 5% Magermilchpulver inkubiert . Die Membran wurde 5 x für 5 min bei Raumtemperatur mit

TBS-T gewaschen und über Nacht bei 4°C mit Anti-MCH-R 1:1000 in

TBS-T, 5% Magermilchpulver inkubiert. Nach Waschen (5 x für 5 min bei Raumtemperatur mit TBS-T) wurde die Membran mit einem an alkalische Phosphatase gekoppelten Anti-Kaninchen-Antikörper

(1:3000 in TBS-T, 5% Magermilchpulver) für 2 h bei 4°C inkubiert und gewaschen (5 x für 5 min bei Raumtemperatur mit TBS-T) . Der

Nachweis erfolgte mit AP-Substratlösung (0,4 mM NBT; 0,38 mM BCIP in 100 mM Tris/HCl, pH 9,5; 100 mM NaCl; 50 mM MgCl₂) für 10 min.

2.2. GST-Pulldown Assay

Je 10-20 μg GST-Kontrolle bzw. GST-MIZIP-Fusionsprotein wurden an Glutathion-Agarose gekoppelt, 2 x je 5 min bei 4°C auf dem Schüttler mit Puffer 1 (50 mM Tris/HCl pH 7,5; 0,1% Triton X100; Proteinase-Inhibitorcocktail) gewaschen und nach dem Abzen- trifugieren (für 2 min bei 4°C und 1000 x g) mit ca. 2 μg 6xHIS- MCH-R Fusionsprotein in 1 ml Puffer 1 für 3 h bei 4°C unter Schütteln inkubiert . Danach wurde 5 x mit Puffer 1 gewaschen (s.o.) . Das Pellet nach der letzten Waschung, sowie ein Aliquot des Überstands wurden in Lämmli-Puffer aufgenommen und die darin enthaltenen Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocel- lulosemembran geblottet . Durch GST-MIZIP-präzipitiertes 6xHIS- MCH-R Fusionsprotein wurde durch einen Immunblot mit einem murinen Anti-HIS-Antikörper (1:5000 in TBS-T, 5% Milchpulver) und anschließender Inkubation mit Peroxidase-gekoppeltem Anti-Maus Antikörper und ECL-Detektion (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) nachgewiesen.

3. Isolierung des Maus-MIZIP

Der Vergleich der cDNA-Sequenz des humanen MIZIP mit der murinen

EST-Datenbank (NCBI-BLAST) ergab mehrere murine ESTs (GI110434, AL362430, AA536891, AV205600) , die mit überlappenden Sequenzen den überwiegenden Teil der humanen MIZIP-cDNA, inklusive der

, kompletten codierenden Region, abdeckten. Von diesen Sequenzen ausgehend wurden PCR-Primer konstruiert und damit die cDNA des murinen MIZIPl aus muriner embryonaler cDNA (13,5 dpc gesamter Mausembryo, 19,5 dpc Mausembryokopf) kloniert. Zudem wurden zwei murine ESTs mit partiell homologer Sequenz (AI56418, AA54553) in ^*" der murinen EST-Datenbank gefunden. Ausgehend von diesen EST- Sequenzen wurde ein zusätzlicher Forward-Primer konstruiert und damit die Spleißvariante MIZIP2 durch PCR aus muriner embryonaler cDNA kloniert .

4. Northern- und Dot-Blot Hybridisierung

Northern-Blots (human-12-lane MTN blot, human brain MTN blot IV, mouse brain MTN blot) und der multiple tissue array dot Blot human MTE der Fa. Clonteeh, Heidelberg, wurden nach Angaben des Herstellers (Clonteeh, Heidelberg) für 1 h bei 65°C mit 10 ml ExpressHyb-Lösung im Hybridisierungsofen prähybridisiert und danach mit frisch denaturierten Sonden (50 ng cDNA-Sonden des humanen bzw. murinen MIZIP (gesamte codierende Region kloniert in pTOPO, Insert isoliert nach EcoRI Verdau und Gelauftrennung durch Ultrafree-DA DNA-Extraktionssäulchen (Millipore) markiert mit a- P-dCTP mittels Prime-It II random prime labeling kit, Stratagene (spezifische Aktivität > 1x10 dpm/μg DNA) in 5 ml ExpressHyb-Lösung (Clonteeh) bei 68°C für 2 h (der human MTE über Nacht bei 65°C) im Hybridisierungsofen inkubiert. Nach 3 x 10 min waschen bei Raumtemperatur (der human MTE bei 65°C) in 2xSSC, 0,05% SDS und 4 x 10 min bei 50°C in 0,lxSSC, 0,1% SDS wurden die. Blots in Plastikfolie eingepackt und auf Röntgenfilm mit Verstärkerfolien 1-3 (der human MTE 7) Tage bei -70°C exponiert.

5. Genomische Kartierung und Aufklärung der Exon-Intron Struktur

Die Exon-Intron Struktur des humanen MIZIP wurde durch den Vergleich der isolierten cDNA des humanen MIZIP mit der humanen Genom-Datenbank durch das Programm human genome BLAST (NCBI) aufgeklärt. Da die orientierte genomische DNA-Sequenz der Maus noch nicht öffentlich zugänglich ist, wurde die murine cDNA- Sequenz beider Spleißvarianten gegen die TRACE-Datenbank der nicht-sortierten (non-aligned) Rohdaten des murinen Genomprojektes mit Hilfe des SSAHA-Servers (Ensembl Genome Server, EBI) verglichen. Dabei konnten genomische Sequenzen für beide Splice-Varianten identifiziert und mit Hilfe der Megaline- Software (DNA-Star) die Exon-Intron-Grenzen des murinen MIZIP aufgeklärt werden.

6. Immunhistochemie und Internalisierungsstudien

HEK293 und COS7 Zellen wurden in Kulturmedium (DMEM, 10% FCS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin) bei 37°C in feuchter Atmosphäre mit 5% C0₂ inkubiert und bei Konfluenz (alle 3-4 Tage) passagiert. Zur Analyse der Lokalisation in eukaryontisehen Zellen wurde ein cDNA-Fragment mit der kompletten codierenden Region des MCH-R in den Vektor pcDNAIII-N-T7-tag kloniert, so daß ein Fusionsprotein mit einem N-terminalen T7-Tag exprimiert wird. Ein cDNA-Fragment mit der kompletten codierenden Region des murinen MIZIP wurde in den Vektor pcDNA6 mye-his kloniert, so daß ein Fusionsprotein mit einem C-terminalen mye-his Tag exprimiert wird. HEK293 bzw. COS7 Zellen wurden nach der Kalzium-Posphat- Präzipitationsmethode transient transfiziert (Ref. 12). Um die Transformationseffizienz zu erhöhen, wurden die C0S7-Zellen 3 Stunden nach Transfektion mit einem Glycerinsehoek (15% Glycerin in HBSP, pH 7,5) behandelt. Nach Inkubation über' Nacht bei 37°C, 5% C0₂, wurden die Zellen auf Poly-D-Lysin beschichtete Deckgläschen umgesetzt und für weitere 24 Stunden inkubiert. Zur Analyse der ligandenabhängigen Internalisierung wurden die transfizierten HEK293-Zellen für 30 min mit MCH (10^~6 M) in Kulturmedium inkubiert . MCH-behandelte und unbehandelte Zellen wurden 2 5 min mit 3% Paraformaldehyd in PBS fixiert, 3 x mit PBS-T (PBS + 0,1% Triton X100) gewaschen und mit 2% FCS in PBS-T blockiert. Zum immunhistochemisehen Nachweis wurden die Deckgläschen über Nacht bei 4°C mit Anti-MCH-R-Antikörper (polyklonal aus Kaninchen, überlassen von G. Hervieu, SmithKline Beecham, Brentford) 1:1000 und monoklonalem Anti-mye-Antikörper (Sigma, Klon 9E10) 1:3000 in PBS-T, 2% FCS, inkubiert. Nach dem Waschen (5 x 10 min bei Raumtemperatur mit PBS-T) wurden die Deckgläschen für 2 h- bei Raumtemperatur mit den Zweitantikörpern Ziege-Anti-Kaninchen-Cy2- Konjugat und Ziege-Anti-Maus-Cy2-Ko jugat, je 1:1000 in PBS-T, 2% FCS inkubiert. Nach 5 x 10 min waschen bei Raumtemperatur mit PBS-T wurden die Deckgläschen in Glyceringelatine eingedeckt, mit einem Leica Aristoplan Fluoreszenzmikroskop untersucht und mit einer Hamamatsu ORCA CCD-Kamera mit der Openlab Software (Improvision) dokumentiert.

7. Generierung polyklonaler MIZIP-Antiseren

Zur Immunisierung von Meerschweinchen und Kaninchen mit humanem MIZIP werden folgende 3 GST-MIZIP-Fusionsproteine hergestellt:

7.1. Herstellung der Fusionsproteine

7.1.1. GST-Gesamt-MIZIP (Aminosäuren 1-227):

Dazu wird ein cDNA-Fragment (Nukleotide: 228-916) kodierend für das gesamte humane MIZIP in den Vektor pGEX-4T2 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) kloniert. Der Vektor und das mit Hilfe der PCR-Primer (forward primer: L9-FAgex CAGGATCCGCCAT- GACCGACTTCAAATTG; reverse primer: L9-RSgex CCCTCGAGCGT- CATCGCTCTGGCTCAAGC) erstellte Amplifikat werden nach Verdau mit BamHl/XhoI in die erhaltene Restriktionsschnittstellen ein- kloniert.

7.1.2. GST-N-MIZ P (Aminosäuren 1-168):

Dazu wird ein cDNA-Fragment (Nukleotide: 228-734) kodierend für den N-terminalen, 168 Aminosäuren-umfassenden humanen MIZIP- Bereich in den Vektor pGEX-4T2 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) wie unter 7.1.1. kloniert jedoch unter Verwendung folgender PCR-Primer (forward primer L9-FAgex, CAGGATCCGCCAT- GACCGACTTCAAATTG; reverse primer: L9-R2gex, CTCGAGCTCATAG- TAGGTGCAAGAGTT) . 7.1.3. GST-MYND-MIZ P (Aminosäuren 154-227):

Dazu wird ein cDNA-Fragment (Nukleotide: 691-916) kodierend für den C-terminalen, die MYND-Domäne-umfassenden humanen MIZIP- Bereich in den Vektor pGEX-4T2 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) wie unter 7.1.1. kloniert jedoch unter Verwendung folgender PCR-Primer (forward primer: L9-FA2gex TGGGATCCGGGATGTAGTGGAAGAGGAGG; reverse primer L9-RSgex CCCTCGAGCGTCATCGCTCTGGCTCAAGC) .

7.2. Expression und Reinigung der Fusionsproteine

E. coli BL21 werden mit den hergestellten Vektor-cDNA-Konstrukten transfiziert, mittels IPTG wird die Expression des jeweiligen GST-Fusionsproteins induziert und nach Lyse der Bakterienzellen die Fusionsproteine mittels Glutathion Sepharose 4B nach Vorschrift des Herstellers (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) isoliert. Die isolierten Fusionsproteine werden bei 4°C gelagert.

7.3. Immunisierung

Die Immunisierung der Kaninchen bzw. Meerschweinchen erfolgt nach einem Standard-Immunisierungsprotokoll (Fa Pineda, Berlin) : Zur Primärimmunisierung wird jeweils 100 μg Fusionsprotein in PBS in einer Emulsion 1:1 mit komplettem Freudschen Adjuvans intradermal injiziert; die 1. Verstärkungsimmunisierung erfolgt nach 20 Tagen mittels subcutaner Injektion von 50 μg Fusionsprotein in PBS in einer Emulsion 1:1 mit inkomplettem Freudschen Adjuvans; nach jeweils weiteren 10 Tagen erfolgen analog zur 1. die 2. und 3. Verstärkungsimmunisierungen; am 61. Tag erfolgt die 1. Blutentnahme zur Kontrolle der Antiseren sowie die 4. Verstärkungsimmunisierung; nach weiteren 15 Tagen die 5. Verstärkungsimmunisierung; am 90. Tag kann aufgrund des festgestellten Titers den Tieren das komplette Blut entnommen werden. 7.4. Kontrolle der Antiseren

Die zellulären Bestandteile des Blutes werden abzentrifugiert (5 min. bei RT und 2000 x g) , der Serumüberstand wird abgenommen, aliquotiert und bei -20° C gelagert. Die Spezifität und der Titer der Immunseren werden durch einen indirekten ELISA Test bestimmt . Dazu wird in die Vertiefungen spezieller Mikrotiterplatten (Falcon Micro-Test III Flexible Assay Plate) 500 ng Antigen (des jeweiligen GST-MIZIP-Fusionsproteins) bzw. 500 ng GST-Kontroll- protein vorgelegt und über Nacht bei 4° C an die Plattenoberfläche gebunden. Die Vertiefungen werden zweimal mit TBS-T gewaschen, anschließend die Oberfläche für 2 h mit je 200 μl 1% BSA in TBS-T bei RT blockiert und 50 μl der in PBS verdünnten Antiseren (1:1000 - 1: 10000) in die Vertiefungen gegeben. Nach 2 h Inkubation bei RT werden die Vertiefungen 6 5 min mit TBS-T bei RT gewaschen und die gebundenen Antikörper durch einen spezifischen Peroxidase-gekoppelten 2. Antikörper und anschließender Farbreaktion werden wie folgt nachgewiesen: Inkubation der Vertiefungen mit 50 μl Peroxidase-gekoppeltem Ziege Anti- Kaninchen- bzw. Ziege Anti-Meerschweinchen-IgG, 1:5000 in TBS-T für 1 h bei RT, 6 x 5 min waschen mit TBS-T bei RT, enzymatische

Detektion in 100 μl Peroxidasepuffer mit ortho-Phenylendiamin

(OPD; 0,4 mg/ml) und H₂0₂ (0,012%) als Substrate, 30 min bei RT,

Beendigung der Reaktion durch Zugabe von 25 μl 3 M H₂S0₄ und Auswertung im ELISA- eader durch Messung der Absorption bei 492 nm.

Die erhaltenen MIZIP-Antiseren dienen

1. zur Bestimmung und Lokalisation von humanem und murinem MIZIP in Liquor, Blut und Geweben einschließlich Tumorzellen

(Gesamt-MIZIP-, MYND-MIZIP- und N-MIZIP-spezifisches

Antiserum) ,

2. zur Inhibierung der Interaktion zwischen der MYND-Domäne und interagierender Proteine wie z.B. MCH-R (MYND-MIZIP-spezifi- sches Antiserum) und

3. zur Inhibierung der Interaktion zwischen dem N-terminalen MIZIP-Bereich und interagierender Proteine wie z.B. MCH-R (N-MIZIP-spezifisches Antiserum) .

8. Generierung monoklonaler Antikörper

Zur Gewinnung von gegen MIZIP gerichteten monoklonalen Antikörpern werden etwa 6 Wochen alte Balb/c-Mäuse wie folgt immunisiert: Je 2-5 mg gereinigtes MIZIP-Protein bzw. MlZIP-Protein- fragmente (vgl. polyklonale Antiseren) in PBS wurden den Mäusen intraperitoneal injiziert. Wiederholte Injektionen finden nach 4 und 6 Wochen statt, wobei die erste Immunisierung unter Zusatz von Freund's komplettem Adjuvans, die folgenden Immunisierungen jeweils mit Freund' s inkompletten Adjuvans als Zusatz erfolgen. Eine Woche nach der letzten Injektion wird den Tieren Blut abgenommen, und der Antikörpertiter des daraus gewonnenen Serums mittels ELISA (15) überprüft. Mäusen mit hohem Titer werden 3 Tage vor der Fusion 2 mg MIZIP in PBS ohne Adjuvans injiziert. Die Herstellung monoklonaler Antikörper erfolgt nach Standardprotokollen (16) . Die immunisierten Mäuse werden durch Cervikal- dislokation getötet und die Milz präpariert. Nach sorgfältigem Zerkleinern der Milz in 5 ml PGP-Lösung (140 mM NaCl, 5,2 mM KCl, 5 mM NaH₂P0₄, 10 mM Na₂HP0₄, 10 mM Glukose, 5 mg/1 Phenolrot) , nach Sedimentation und Verwerfen gröberer Gewebestücke und mehrmaligem Waschen der Milzzellen in PGP-Lösung werden die Milzzellen im Verhältnis 1:2 mit Zellen der Myelom-Linie P3X63 Ag8.653 (17) in PGP-Lösung gemischt und für 6 min. bei 800 Upm und 37°C zusammenzentrifugiert . Nach Absaugen des Überstandes wird das Zellpellet vorsichtig aufgewirbelt, und anschließend 1 ml Fusionsmedium (1 g PEG 4000 in 1 ml PGP-Medium, 0,1 ml DMSO) unter vorsichtigem Schütteln langsam hinzugefügt. Nach Inkubation für 90 s bei 37°C unter leichtem Schütteln wird zum Abstoppen der Fusion 25 ml PGP-Lösung in 3 min. unter Mischen zugetropft. Nach Zugabe weiterer 25 ml PGP-Lösung werden die Zellen abzentrifu- giert und din 25 ml HAT-Medium (0,1 mM Hypoxanthin, 0,4 Aminopte- rin, 1,6 mM Thymidin in RPM1, (Gibco/BRL) , 15 μg/ml Oxalacetat, 5 μg/ml Natriumpyruvat, 0,2 U/ml Rinderinsulin, 100 ü/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin, 20 % FKS (Gibco/BRL)) aufgenommen, anschließend auf 5 96-Loch Zellkulturplatten, in denen sich Maus-Peritonealmakrophagen in je 200 ml HAT-Medium/Loch befinden, verteilt. Die Makrophagen werden am Tag zuvor präpariert. Nach 3 Tagen wird jeweils die Hälfte des Volumens des Mediums erneuert . Nach 2 Wochen werden die Überstände der einzelnen Löcher im ELISA auf Antigenerkennung getestet, und die immunpositiven Klone in mehreren Schritten subkloniert. Es werden so viele Subklonierungsstufen durchgeführt, bis jeweils nur noch Einzelzellklone vorliegen.

Die Aufzucht und Expandierung der gewonnenen subklonierten Hybri- domzellen erfolgt in RPMI-Medium mit dem Zusatz von 10 % FKS . Zur Konditionierung des Mediums werden, soweit erforderlich, Peritonealmakrophagen zugesetzt, die durch Spülen der Bauchhöhle von Balb/c-Mäusen mit einer 0,34 M Saccharoselösung erhalten werden.

Die Proteine aus den Zellkulturüberständen werden mit Ammoniumsulfat gefällt (50 % Sättigung) , gegen PBS dialysiert, und die monoklonalen Antikörper mittels Immunaffinitätschromatographie am mAK-HB-58 (gegen K-Kette von Maus-IgG's gerichtet, ATCC, Rockville, Maryland, USA) isoliert. Die Reinheit der Antikörper wird mittels SDS-PAGE überprüft.

9. Generierung von MIZIP-spezifischen cDNA-Sonden

Für die Analysen der RNA-Expression in verschiedenen Organen mittels Northern- und Dot-Blot Hybridisierungen werden folgende cDNA-Sonden für das humane und murine MIZIP generiert:

9.1. Humane cDNA-Sonde:

Ein cDNA-Fragment des humanen MIZIP (Nukleotide 103 - 916) wird mittels einer PCR-Reaktion ( forward primer : L9-F

C C CGC CTGGCTGCTAC C C CGAC ; reve r s e p r i me r : L 9 - RS CGTCCTCGCTCTGGCCTCAAG) amplifiziert und mit Hilfe des TOPO- cloning Kits (Clonteeh) in den Vektor pCRII-TOPO kloniert . Durch Verdau mit EcoRI wird aus diesem Klon das Insert isoliert und nach Gelauftrennung durch Ultrafree-DA DNA-Extraktionssäulchen

(Millipore) extrahiert. Als Hybridisierungssonde wird 50 ng cDNA-

Insert mittels Prime-It II random prime labeling Kit (Stratagene) mit α-³ P-dCTP markiert (spezifische Aktivität > lxlO³ dpm/μg DNA) .

9.2. Murine cDNA-Sonde :

In analoger Vorgehensweise wird ein cDNA-Fragment des murinen MIZIPl (Nukleotide 149-835) mittels PCR aus einer murinen embryonalen cDNA (13.5 dpc Embryo) mit den Primern mL9-FA2

(forward primer: GCCTGGCCATGACCGACTTTA) und mL9-RS (reverse primer: CTCTGGCTCAAGCTCATGCTG) amplifiziert und in pCRII-TOPO kloniert. Das Insert wird, wie oben beschrieben, durch EcoRI- Verdau isoliert und durch Gelextraktion aufgereinigt . Als

Hybridisierungssonde wird 50 ng cDNA-Insert mittels Prime-It II random prime labeling Kit (Stratagene) mit a- P-dCTP markiert

(spezifische Aktivität > lxlO⁹ dpm/μg DNA) .

9.3. Blot-Analysen:

Northern-Blots (human 12-lane MTN blot, human brain MTN blot IV, mouse brain MTN blot) und der multiple tissue array dot Blot human MTE der Fa. Clonteeh, Heidelberg, werden nach Angaben des Herstellers (Clonteeh, Heidelberg) für 1 h bei 65°C mit 10 ml ExpressHyb-Lösung im Hybridisierungsofen prähybridisiert und danach mit frisch denaturierten Sonden in 5 ml ExpressHyb-Lösung (Clonteeh) bei 68°C für 2 h (der human MTE über Nacht bei 65°C) im Hybridisierungsofen inkubiert. Nach 3 x 10 min waschen bei RT (der human MTE bei 65°C) in 2 x SSC, 0,05% SDS und 4 x 10 min bei 50°C in 0,1 x SSC, 0,1% SDS werden die Blots in Plastikfolie verpackt und auf Röntgenfilm mit Verstärkerfolien 1-3 Tage bzw. 7 Tage für human MTE bei -70°C exponiert (s. Abb. 9) . 10. Generierung einer MIZIP-defizienten Mauslinie

Als Tiermodell zur Untersuchung der Funktionen von MIZIP wird ein Fragment des murinen MIZIP-Gens, welches einen Teil des Exon 2, sowie die Exone 3 und 4 enthält, gegen ein DNA-Fragment ausgetauscht, welches ein LacZ-Gen und eine Neomycin-Kassette enthält. Nach homologer Rekombination führt dies zur Synthese eines Fusionsproteins aus einem verkürzten, nichtfunktioneilen MIZIP- Fragment (44 N-terminale AS) und der ß-Galaktosidase, sowie zur Resistenz gegen G418.

Die Herstellung des Targeting-Vektor erfolgt wie zuvor beschrieben (18) . In den Vektor pPNT wird zwischen das Herpes- Simplex-Virus ^'Thymidm-Kinase Gen (zur negativen Selektion) und die Neo-Kassette ein 2,4 kb großes EcoRV-Clal-Fragment aus der 5' Region des MIZIP-Gens (einschließlich der Exone la und lb und einer Teilsequenz des Exon 2) mit anschließendem LacZ-Gen im Leseraster des MIZIP, kloniert. An die neo-Kassette anschließend wird ein 3,5 kb EcoRI/EcoRV-Fragment der 3 ' -Region des MIZIP- Gens, einschließlich des Exon 5, kloniert (Fig. 10) .

Die Transfektion der ES-Zelllinie Jl, die Selektion und Detektion der homologen Rekombination durch Southern-Blot-Hybridisierung, sowie die Injektion der ES-Zellen in Blastozysten und die Generierung homozygoter Mutanten erfolgt durch Standardmethoden (19, 20) . Nach Selektion mit Gancyklovir (negative Selektion gegen zufällig inserierte Vektoren) und G418 (positive Selektion auf Neomycin-resistente Klone) werden individuelle ES-Zell-Klone isoliert, expandiert und analysiert. Eine erfolgreiche homologe Rekombination wird durch Southern-Blot nachgewiesen. Dazu wird die genomische DNA der ES-Zellen mit Xbal und Clal verdaut, durch Gelelektrophorese aufgetrennt und auf Nylonmembranen geblottet. Da durch die homologe Rekombination eine Xbal-Schnittstelle im mutierten MIZIP-Gen verloren geht, detektiert die Sonde E6 (450 bp cDNA-Sonde generiert von Exon6, vgl. Abb. 10) im wild-Typ MIZIP ein 6,8 kB großes, im mutierten MIZIP ein 9 kB großes Xbal/Clal-Fragment. Zur Generierung von MIZIP-ko Mäusen werden positiv getestete ES-Zell-Klone in Blastocysten von C57BL/6- Mäusen injiziert und diese anschließend in pseudoschwangere C57BL/6-Mäuse implantiert. Die so erzeugten Chimären Mäuse werden mit C57BL/6-Mäusen verpaart und ihre Nachkommen durch Southern- Blot mit der Sonde E5 auf das Vorhandensein des mutierten MIZIP untersucht. Durch Rückkreuzung werden homozygot MIZIP-mutante Mäuse hergestellt .

Figuren-Legenden:

Fig. 1: Regulation des Energiehaushaltes und Appetitverhaltens . Pfeilspitzen bedeuten eine stimulierende, Querbalken eine hemmende Wirkung, nach oben bzw. unten gerichtete

Pfeile bedeuten Zu- bzw. Abnahme der Expression. ARC, Nucleus Arcuratus; BGS, Blut-Gehirnsehranke; LHA, Laterales hypothalamisches Areal; MCH, melanine concen- trang hormone; MCH-R, MCH-Rezeptor, MIZIP, MCH-Rezep- torinteragierendes Zinkfinger Protein; α-MSH, c-melano- cyten-stimulierendes Hormon; NPY, neuropeptide Y; ZNS, zentrales Nervensystem.

Fig. 2: cDNA- und Aminosäure-Sequenz des humanen MIZIP. Die Aminosäuren sind im Ein-Buchstaben-Code angegeben.

Rechts, Zahl der Aminosäuren; links, Zahl der Nukleotide. Unterstrichen ist die MYND-Domäne, der Stern markiert das Stopcodon. Zwischen den invertierten Nukleotidpaaren wird die Sequenz durch Intronbereiche (insgesamt 5) unterbrochen (s. auch Fig. 4).

Fig. 3: Proteinsequenz des humanen MIZIP (A) und Vergleich der

MIZIP-MYND-Domäne mit MYND-Domänen anderer Proteine

(B) . A. Putative Sequenzmotive des MIZIP (PFAM un PredictProtein-Programme) . B. Vergleich der MYND-Domäne des MIZIP mit MYND-Domänen bisher bekannter Proteine.

Identische Aminosäuren sind invertiert dargestellt.

Deafl, deformed epithelial autoregulatory factor

(Ref. 13); MTG8, myeloid translocation gene on chromo- some 8 (Ref. 14) . Blu stellt ein nicht näher charakterisiertes humanes Gen dar. F1N21.16 entspricht einem Klon aus dem Arabi dopsis thaliana Genomprojekt.

Fig.4: Genomische Lokalisation und Genstruktur des humanen MIZIP.

Durch Vergleich der cDNA-Sequenz des humanen MIZIP mit der humanen Genomsequent (NCBI-Genom BLAST) wurde das MIZIP Gen auf Chromosom 9q34.3 lokalisiert. Genstruktur des humanen MIZIP. Schwarze Boxen kennzeichnen die Exon-Sequenzen, die zu der isolierten cDNA-Sequenz gespleißt werden, in grau ist der kodierende Bereich markiert. In Klammern ist die Anzahl der Basenpaare für das jeweilige Exon angegeben. ORF, open reading frame. C. Die Exon-Intron-Übergänge sind in den Exon-Bereichen fett markiert.

Fig. 5: Vergleich der murinen Splice-Varianten von MIZIP. Fett hervorgehoben sind die Sequenzen der Exone la (MIZIP2) und lb (MIZIPl) , die MYND-Domäne ist durch einen Rahmen markiert, die Stop-Codons in der 5 ' -untranslatierten Region sind unterstrichen. Für weitere Angaben s. Fig. 2.

Fig. 6: Genstruktur des murinen MIZIP. Durch den Vergleich der cDNA-Sequenzen der murinen Spleißvarianten 1 (MIZIPl) und 2 (MIZIP2) mit der Datenbank des murinen Genom- Projekts (SSAHA-Servers, Ensembl Genome Server, EBI) konnte die Genstruktur des murinen MIZIP dargestellt werden. Die Markierungen wurden analog zur Fig. 4 vorgenommen.

Fig. 7: In vi tro-Interaktionsassays mit rekombinantenm MIZIP und MCH-R.

A. Overlay Assay: GST-Kontrollproteine und GST-MIZIP- Fusionsproteine wurden mit SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrocellulosefilter geblottet und mit Pon- ceau-Rot gefärbt. Nach overlay mit MCH-R-C-Termi- nus ist ein spezifisches Signal bei MIZIP sichtbar (Pfeilspitzen) , (IB mit Kaninchen Anti-MCH-R-AK) .

B. GST pull -down Assay: der MCH-R-C-Terminus (Fusionsprotein mit 6xHIS-N-tag) ist nur durch GST- MIZIP präzipitierbar .

AK, Antikörper; GST, Glutathion-S-Transferase; HIS, Histidin; IB, Immunblot; US, Überstand; M, Marker- proteine; SDS-PAGE, Natriumdodecylsulfat-Polyacryla- midgelelektrophorese .

Fig. 8: Expression von MIZIP und MCH-R in transfizierten HEK293- und COS7-Zellen.

A. Mit MCH-R-cDNA transfizierte HEK Zellen wurden für 0 (a) , 10 (b) oder 30 (c, d) min. mit MCH behandelt; in d wurde die Behandlung in Gegenwart von 0,45M Sucrose durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen fixiert und der Rezeptor durch Immunfluoreszenz lokalisiert.

B. Gezeigt sind fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von MIZIP- (a, e) , bzw. MIZIP- und MCH-R- (b-d, f-h) transfizierten HEK293 -Zellen nach immunhisto- chemischer Detektion von MIZIP (über C-terminalen

MYC-tag, Anti-MYC/Anti-Maus-Cy3) und MCH-R (über Anti-MCH-R/Anti-Kaninchen-Cy2) . Kolokalisation beider Proteine ist in der Überlagerung dargestellt (d, h) . Die Zellen in (e-h) wurden 30 min. mit 10^"6 M MCH inkubiert, a, MIZIP ist in HEK293-

Zellen cytoplasmatisch exprimiert, auch nach Stimulation mit MCH (e) . b-d, wird MIZIP mit MCH-R koexprimiert, sind beide Interaktionspartner an der Zellmembran kolokalisiert . f-h, Stimulation mit MCH führt in Zellen, die nur MCH-R exprimieren

(interne Kontrolle durch Zelle mit gestrichelt angedeuteter Zellmembran in f-h) , zur Internali- sierung von MCH-R, in Zellen, die MIZIP und MCH-R koexprimieren, verbleibt ein Teil der Interak- tionspartner an der Zellmembran (Pfeile) , zudem sind beide in Aggregaten an der Zellmembran kolokalisiert (Pfeilspitzen) .

C. In COS7-Zellen ist MIZIP auch im Kern lokalisiert. Die COS7-Zellen wurden wie für die HEK293-Zellen beschrieben mit MIZIP und MCH-R kotransfiziert und die Lokalisation der transfizierten Proteine immunhistochemisch dargestellt. Balken, 10 μm. Fig. 9: Expression von MIZIP in humanen und murinen Geweben.

A. Hybridisierung der human multiple- tissue-Northem- blots MTN-Hum 12 und MTN-B4 (Clonteeh) mit einer humanen MIZIP-Sonde zeigt die Expression einer ca. 1,5 kb mRNA in verschiedenen Geweben, v.a.^' in

Gehirn, Herz, Skelettmuskulatur, Leber und Niere. Im Gehirn ist MIZIP in allen untersuchten Regionen exprimiert .

B. Hybridisierung des murinen mul tiple- issue-Nort- hern-Blots MTN-Maus (Clonteeh) mit einer murinen

MIZIP-Sonde (Gesamt-MIZIPl) zeigt die Expression von 4 unterschiedlich großen' (1,5 kb; 3,5 kb, 4 kb und 7 kb) mRNAs in Testis, Leber, Gehirn und Herz, schwächer in Milz und Niere. C. Hybridisierung des 'multiple tissue array dot blot human MTE' (Clonteeh) mit einer humanen MIZIP- Sonde zeigt die Expression v.a. in Cerebellum, Magen, Plazenta, Testis und Tumorzelllinien, wie HeLa S3 und den Leukämiezelllinien HL- 60 und K-562. Daneben ist MIZIP in allen untersuchten

Bereichen des Gehirns (Putamen, Hippokampus, Hypophyse, Cortex) , im Herz, v.a. im Apex, im Duodenum, in Speicheldrüsen, in der Leber, Niere, Nebenniere, Lunge, Schilddrüse sowie in fetalen Geweben, exprimiert; kb, Kilobasen der Marker

(A, B) .

Fig. 10: Schematische Darstellung der genomischen Struktur des murinen wild-Typ-MIZIP-Gens (wT-MIZIP) , des Targeting- Vektors für die homologe Rekombination (TV) und der genomischen Struktur nach homologer Rekombination (mut-

MIZIP) .

Die schwarzen Blöcke kennzeichnen die Exon-Bereiche (1-6) des murinen MIZIP-Gens, darüber sind die Schnittstellen der Restriktionsenzyme Clal (C) , EcoRI (E) , EcoRV (V) und Xbal (X) angezeigt. Die DNA-Sonde E6 (Exon 6) ermöglicht die spezifische Unterscheidung von wild-Typ (wT) - und ko-MIZIP Xbal/Clal-Fragmenten (Xbal- Restriktionsstelle im Intron 3 nach homologer Rekombination nicht mehr vorhanden) im Southern-Blot (MIZIP- wT, 6,8 kB; MIZIP-mut, 9 kB). HSV-tk, Herpes Simplex Virus Thymidin-Kinase, LacZ-Pneo, DNA-Fragment mit LacZ-Gen und neo-Kassette.

Literaturverzeichnis

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Claims

Patentansprüche :

1. Isoliertes Polynukleotid, das ein mit dem Melanin-konzen- trierenden-Hormon-Rezeptor (MCH-R) interagierendes Protein kodiert, das

a) ein Polynukleotid ist, das ein mit dem MCH-R interagierendes Protein mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Amino- säuresequenz oder mit einer Aminosäuresequenz , die mindestens etwa 90% zu der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz identisch ist, kodiert,

b) ein Polynukleotid mit der in SEQ ID NO:l, 3„ oder 4 gezeigten Sequenz ist,

c) ein Polynukleotid ist, das unter stringenten Bedingungen mit einem in (a) oder (b) genannten Polynukleotid hybridisiert,

d) ein Polynukleotid mit einer Sequenz ist, die von den in (a) bis (c) genannten Polynukleotidse uenzen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes abweicht, oder

e) ein Polynukleotid ist, das ein Fragment, ein Derivat oder eine allelische Variation eines in (a) bis (d) genannten Polynukleotids ist.

2. Expressionsvektor, der ein Polynukleotid nach Anspruch 1 enthält .

3. Wirtszelle, die einen Expressionsvektor nach Anspruch 2 enthält .

. Protein, das durch ein Polynukleotid nach Anspruch 1 kodiert wird.

5. Protein, das mit dem Melanin-konzentrierenden-Hormon-Rezep- tor (MCH-R) interagiert, dadurch gekennzeichnet, daß es die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

6. Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Homologes oder ein Fragment des Proteins nach Anspruch 5 ist, dessen Aminosäuresequenz einen Homologiegrad von mindestens 85% zu dem entsprechenden Abschnitt der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz aufweist, und das im wesentlichen die gleiche biologische Aktivität besitzt.

7. Verfahren zur Herstellung eines mit MCH-R interagierenden Proteins, bei dem man

a) die Wirtszelle nach Anspruch 3 unter Bedingungen kultiviert, die für die Expression des Proteins geeignet sind und man

b) das Protein aus der Wirtszellkultur isoliert.

8. Verfahren zum Nachweis eines Polynukleotids, das für ein mit dem MCH-R interagierendes Protein kodiert, in einer biologischen Probe, bei dem man

a) ein Polynukleotid nach Anspruch 1 mit einem Nukleinsäu- rematerial einer biologischen Probe unter Bildung eines Hybridisierungskomplexes hybridisiert und man

b) den Hybridisierungskomplex nachweist.

9. Verfahren zum Herstellen von Antikörpern gegen das Protein, das Homologe oder das Fragment nach Anspruch 4, 5 oder 6, bei dem man nicht-menschliche Säuger mit einem Protein, einem Homologen oder einem Fragment nach Anspruch 4, 5 oder 6 immunisiert und man die Antikörper aus einer biologischen ^l Probe des nicht-menschlichen Säugers isoliert.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der nicht-menschliche Säuger ein Meerschweinchen oder ein Kaninchen ist .

11. Antikörper, erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 9 oder 10.

12. Antikörper nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper ist .

13. Verfahren zum Nachweis eines Polynukleotids nach Anspruch 1 oder eines Proteins, eines Homologen oder Fragments nach Anspruch 4, 5 oder 6, bei dem man eine biologische Probe mit einem Reagens in Kontakt bringt, das spezifisch mit dem Polynukleotid oder dem Protein, dem Homologen oder Fragment interagiert .

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das mit dem Protein, dem Homologen oder Fragment interagierende Reagens ein Antikörper nach Anspruch 11 oder 12 ist.

15. Diagnosekit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 13 oder 14.

16. Verfahren zum Screening nach Substanzen, die die Aktivität eines mit dem MCH-R interagierenden Proteins vermindern, bei dem man eine zu testende Verbindung mit einem durch ein Polynukleotid nach Anspruch 1 kodierten Protein in Kontakt bringt und man die Bindung der zu testenden Verbindung an das Protein nachweist, wobei man eine Verbindung, die an das Protein bindet, als mögliches therapeutisches Agens zur Verminderung der Aktivität des Proteins identifiziert.

17. Verfahren zum Screening nach Substanzen, die die Aktivität eines mit dem MCH-R interagierenden Proteins regulieren, bei dem man eine zu testende Verbindung mit einem von einem Polynukleotid nach Anspruch 1 kodierten Protein in Kontakt bringt und man die Aktivität des Proteins, mit dem MCH-R zu interagieren, nachweist, wobei man eine Verbindung, die die Aktivität des Proteins, mit dem MCH-R zu interagieren, erhöht, als mögliches therapeutisches Agens zur Erhöhung der Aktivität der Interaktion von MCH-R und Proteinen identifiziert, und wobei man eine Verbindung, die die Aktivität des Proteins, mit dem MCH-R zu interagieren, vermindert, als mögliches therapeutisches Agens zur Verminderung der Aktivität der Interaktion von MCH-R und Proteinen identifiziert.

18. Verfahren zum Screening nach Substanzen, die die Aktivität eines Proteins, mit dem MCH-R zu interagieren, vermindern, bei dem man eine zu testende Verbindung mit einem Polynukleotid nach Anspruch 1 in Kontakt bringt und man die Bindung der zu testenden Verbindung an das Polynukleotid nachweist, wobei man eine Verbindung, die an das Polynukleotid bindet, als mögliches therapeutisches Agens zur Verminderung der Aktivität des Proteins, mit dem MCH-R zu interagieren, identifiziert .

19. Verwendung von Antikörpern nach Anspruch 11 oder 12 zur in vitro-Untersuchung der Expression des Proteins nach Anspruch 5, bei dem man eine humane biologische Probe mit den Antikörpern unter zur Bindung des Antikörpers an das Protein geeigneten Bedingungen in Kontakt bringt und man die Bindung der Antikörper an das Protein nachweist .

20. Transgener nicht-menschlicher Säuger, dadurch gekennzeichnet, daß er das Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 nicht funktioneil exprimiert.

21. Transgener nicht-menschlicher Säuger nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen, das für das mit dem Melanin-konzentrierenden-Hormon-Rezeptor (MCH-R) interagierende Protein kodiert, ganz oder teilweise deletiert ist.

22. Transgener nicht-menschlicher Säuger nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß ein Fragments des Gens, das für das mit dem Melanin-konzentrierenden-Hormon-Rezeptor (MCH-R) interagierende Protein kodiert, durch ein LacZ-Gen und ein Neomycin-Resistenzgen ausgetauscht ist.

23. Transgener nicht-menschlicher Säuger nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß er anstelle des Proteins ein Fusionsprotein aus dem 44 Aminosäuren langen N-terminalen Fragment und ß-Galaktosidase exprimiert.

24. Transgener nicht-menschlicher Säuger nach den Ansprüchen 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Nager ist.

25. Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers nach Anspruch 20 oder 21, bei dem man das Gen, das für das mit dem Melanin-konzentrierenden-Hormon-Rezeptor (MCH-R) interagierende Protein kodiert, ganz oder teilweise deletiert.

26. Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers nach Anspruch 20 oder 21, bei dem man ein Fragments des Gens, das für das mit dem Melanin-konzentrierenden- Hormon-Rezeptor (MCH-R) interagierende Protein kodiert, durch ein LacZ-Gen und ein Neomycin-Resistenzgen austauscht.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment einen Teil des Exons 2, das Exon 3 und das Exon 4 umfaßt .

28. Verfahren nach den Ansprüchen 20 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß der nicht-menschliche Säuger ein Nager ist.

29. Verwendung eines nicht-menschlichen Säugers nach den Ansprüchen 20 bis 24 zur Forschung und Entwicklung von diagnostischen Markern zum Nachweis von Störungen in der Regulation des Appetitverhaltens.

0. Verwendung eines nicht-menschlichen Säugers nach den Ansprüchen 20 bis 24 zur Forschung und Entwicklung von Wirkstoffen zur Regulation des Appetitverhaltens .