EP1290189A2 - Nukleinsäure codierend eine bindungsstelle einer protein kinase der mitogenen signalisierungskaskade für ein die glykolyse katalysierendes enzym - Google Patents

Nukleinsäure codierend eine bindungsstelle einer protein kinase der mitogenen signalisierungskaskade für ein die glykolyse katalysierendes enzym

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Publication number
EP1290189A2
EP1290189A2 EP01951397A EP01951397A EP1290189A2 EP 1290189 A2 EP1290189 A2 EP 1290189A2 EP 01951397 A EP01951397 A EP 01951397A EP 01951397 A EP01951397 A EP 01951397A EP 1290189 A2 EP1290189 A2 EP 1290189A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
raf
protein
glycolysis
silent mutation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01951397A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ulf R. Rapp
Erich Eigenbrodt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ScheBo Biotech AG
Original Assignee
ScheBo Biotech AG
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1290189A2 publication Critical patent/EP1290189A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/0104—Pyruvate kinase (2.7.1.40)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • PK Pyruvate kinases
  • M2-PK is the embryonic form and replaces all other forms in proliferating cells and tumor cells (see GEJ Staal et al., Biochical and Molecular Aspects of Selected Cancers, TG Pretlow et al., Eds., Academic Press Inc., San Diego, 1, pages 313 - 337, 1991, and U. Brinck et al., Virchows Archiv 424, pages 177 - 185, 1994).
  • Rat M2-PK protein consists of 530 amino acids and differs only in one residue from human M2-PK (see T. Noguchi et al., J. Biol. Chem., 261, pages 13807-13812, 1986, and K.
  • M2-PK is a glycolytic enzyme which is present in an active tetrameric and an inactive dimeric form. The transition between the two forms ultimately regulates the glycolytic conversion in tumor cells (see W. Zwerschke et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96, pages 1291-1296, 1999, and S. Mazurek et al., J. Bioeneg. Biomenibr., 29, pages 315v-330, 1997). The activity of M2-PK thus controls the transit of the glycolytic path and thus determines the relative proportion of glucose which is channeled into the synthesis process or used for glycolytic energy generation.
  • M2-PK allows cells to survive under conditions with low oxygen levels, since oxidative phosphorylation is not required for the production of ATP by PK.
  • an increased amount of M2-PK is found in malignant tumors and in the blood of tumor patients.
  • A-raf is known to bind to H-ras, MEK and CK2ß (see AB Vojtek et al., Cell, 74, pages 205-214, 1993, and X. Wu et al., J. Biol. Chem., 271, pages 3265 - 3271, 1996, and B. Boldyreff et al., FEBS Lett., 403, pages 197 - 199, 1997, and C.
  • the invention is based on the technical problem of finding an approach for inhibiting the anaerobic metabolism in tumor cell groups and subsequently finding active substances which at least slow down the growth of tumor cells or promote apoptosis in such tumor cell groups due to insufficient energy generation in tumor cells. Knowledge underlying the invention.
  • a PC12 cDNA library was screened using a two-hybrid system and using A-raf as bait ("bait").
  • A-raf was found as a binding partner for A-raf.
  • A-raf is therefore part of the glycolytic enzyme complex. Transformation of NIH 3T3 cells by A-raf leads to an increase in the phosphoserine content of the M2-PK protein in connection with the shift in said balance.
  • an oncogene in the mitogenic signaling cascade also has a direct effect on an enzyme that catalyzes (anaerobic) glycolysis, namely to reinforce and thus promote tumor growth.
  • the invention first relates to a nucleic acid coding for at least one partial sequence of a protein kinase of the mitogenic signaling cascade, the partial sequence coding for a binding site for an enzyme catalyzing glycolysis, or silent mutation of such a nucleic acid or nucleic acid hybridizing with such a nucleic acid or its silent mutation.
  • nucleic acid includes in particular DNA, RNA and PNA. Also subsumed under the term are double-stranded nucleic acids and single-stranded nucleic acid and consequently also nucleic acids complementary to each other.
  • Silent mutations means variants in the sequence that have no functional difference, based on the
  • silica Binding site for an enzyme catalyzing the glycolysis, the variant compared to the natural, non-mutated sequence.
  • Silent mutations can be alleles or artificial mutations.
  • Derivatives also fall under the invention. Derivatives are non-natural chemical modifications.
  • nucleic acids can be used, for example, to search for cooperation partners of the protein kinase of the mitogenic signaling cascade in the area of the enzymes catalyzing glycolysis. It is also possible to search for inhibitors for the binding sites 7
  • nucleic acids according to the invention can therefore be used in particular as a screening tool.
  • a nucleic acid is preferably coding for a protein or peptide containing the sequence A-raf
  • nucleic acid or nucleic acid hybridizing with such a nucleic acid or its silent mutation.
  • it is preferably human A-raf.
  • Sequence 587-606, particularly 602-603, was identified as the region where the binding site for the enzymes catalyzing glycolysis is located.
  • a nucleic acid according to the invention can be shortened compared to the full sequence of A-raf, in particular at the N-terminal end.
  • sequence A-raf 255 to 587-606 or silent mutation of such a nucleic acid or nucleic acid hybridizing with such a nucleic acid or its silent mutation.
  • sequence can be in the range delimited by the sequences (255-606) and (587-606).
  • the invention further teaches a cDNA of the above structure and an isolated recombinant vector containing a nucleic acid of the above structure or an expression plasmid with this nucleic acid.
  • a DNA fragment coding for a suitable viral protein for example gag
  • gag fusion gag with, for example, A-raf or A-raf Fragment
  • a transfor ante can be formed by means of the expression plasmid, which in turn can be used to produce the protein or peptide encoded by the nucleic acid.
  • the transformant is cultivated in a suitable manner using customary methods.
  • Another aspect of the invention is an antisense nucleic acid or ribozyme which binds to, for example, an oncogenic nucleic acid, in particular RNA, coding for a protein kinase of the mitogenic signaling cascade.
  • an oncogenic nucleic acid in particular RNA
  • RNA coding for a protein kinase of the mitogenic signaling cascade.
  • A-raf can be suppressed by means of such a substance, with the result that the (anaerobic) glycolysis in the tumor tissue is inhibited.
  • a substance with a binding site for a protein or peptide encoded by a nucleic acid according to the invention selected from the group consisting of a) deactivated enzymes that catalyze glycolysis, b) inactive proteins or peptides and c) aptamers.
  • a ribozyme in the case of a ribozyme, it can be, for example, a hammerhead ribozyme which attacks within the kinase domain of a raf isoform m-RNA, for example at a GTC site.
  • the hammerhead can also attack ATG start codons that attack the kinase domain before out of frame. These make translation of an active kinase domain from the generated fragmentary RNA extremely unlikely.
  • the kinase-inactive form can be formed by a mutation in the region of the ADP binding site and / or the ATP binding site, in particular selected from the group consisting of "M2-PK K366M, R119C, T340M, Q377K, K161M, K165M and several of these mutations ".
  • the expression of the kinase-inactive form also includes only reduced forms in the kinase activity compared to normal M2-PK. Inactive mutants are generally suitable for triggering apoptosis of the tumor cells because a decrease in the ATP and ADP levels is thereby achieved.
  • ML-PK can also be considered as a natural mutant.
  • MI-PK is expressed in all non-proliferating cells.
  • M2-PK inhibition of cell proliferation occurs when Ml-PK is additionally expressed by competing reactions.
  • Ml-PK and M2-PK are different splicing products, whereby only one exon with 51 amino acids is exchanged.
  • Ml-PK and M2-PK differ in a total of only 21 amino acids.
  • Ml-PK is not phosphorylated.
  • phosphorylation sites can be derived by sequence comparison with M2-PK.
  • non-phosphorylable M2-PK mutants will act as tumor suppressor and proliferation inhibitor. Such mutants result directly from the following sequence comparison, in which potential phosphorylation sites are indicated.
  • M2-PK mutants which are mutated at least in at least one of the marked locations in accordance with the sequence comparison.
  • one or more mutations can be set up in the place of other deviations in the sequence comparison.
  • M2 Gly-Ala-Val-Glu-Ala-Ser-Phe-ys-Cys-Cys-Ser-Gly-Ala-Ile-Ile-Val-Leu Ml: Gly-Ser-Val-Glu-Ala-Ser-Tyr - ys-Cys-Leu-Ala-Ala-Ala-Leu-Ile-Val-Leu
  • proteins or peptides they are highly tailored synthetic molecules for the binding site of the protein or peptide encoded by the nucleic acid according to the invention.
  • part of the invention is also their use for blocking the cooperation or binding between a protein kinase of the mitogenic signaling cascade and an enzyme catalyzing the glycolysis, in particular the A-raf / M2-PK cooperation, and their Use for the production of a pharmaceutical preparation for the treatment of cancer, for example the urogenital tract.
  • a protein kinase of the mitogenic signaling cascade and an enzyme catalyzing the glycolysis, in particular the A-raf / M2-PK cooperation
  • the mitogenic signaling cascade is probably blocked at the same time and a synergistic effect is thus achieved.
  • Another aspect of the invention is the use of a nucleic acid according to the invention or a protein or peptide encoded thereby in a screening method for determining an enzyme which cooperates with a protein kinase of the mitogenic signaling chain and catalyzes the glycolysis.
  • the binding site of the enzyme catalysing glycolysis can also be determined and a peptide or a micris substance can be created for this which binds to the raf isoform at the same site.
  • the invention teaches the use of a nucleic acid according to the invention or a protein or peptide encoded thereby in a screening method for determining a substance which binds to a protein kinase of the mitogenic signaling chain but does not catalyze the glycolysis.
  • substances with prospective binding sites for the raf isoform binding site with an enzyme catalyzing glycolysis are subjected to a binding test, for example according to the exemplary embodiments, and those substances which bind are selected. It 12
  • Binding partners can be found in healthy or diseased tissue. In the latter use, inhibitors of the binding processes normally taking place in healthy or diseased tissue can be found.
  • the invention also relates to healing methods, for example traditionally by suitable administration of pharmaceutical preparations but also gene therapy, by means of which one or more substances according to claims 6 to 9 are introduced into a target cell or generated in the target cell.
  • Ax. 1 DNA sequence of rats Ml-PK and M2-PK,
  • Ax. 2 DNA sequence from human v-raf,
  • the two-hybrid vectors pPC86 and pPC97 were provided by D. Nathans (see also: PM Chevrey & D. Nathans, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, pages 5789-5793, 1992).
  • Full-length A-raf, B-raf and c-raf-1 cDNA were subcloned into pPC97 in fusion with the Gal4 DNA binding domain.
  • the PC12 cDNA library was subcloned into pPC97 in fusion with the Gal4 activation domain.
  • the cloning of the A-raf deletion constructs is described in C. Hagemann et al. , FEBS Lett., 403, pages 200-202, 1997.
  • A-raf (554-606) was under 14
  • M2-PK cDNA was isolated as an EcoRI fragment from pPC86 (clone 71), ligated to pGEX-2T and pcDNA3 digested with EcoRI.
  • the untranslated region was removed by introducing a BamHI site (Mutagenesis Kit Stratagene) and removing the BamHI fragment from this construct.
  • the 3 'end of the coding region of the M2-PK cDNA was isolated by PCR from the PC12 library using the primers 5'-GCC CGG TAC CGC CCA AGG GCT C-3' (sense) and 5'-CCA GGG CTG GGA ATT CTC TGG-3 '(antisense).
  • Full length M2-PK was generated by subcloning the PCR product Kpnl / EcoRI in pGEX-M2-PK ⁇ Bam and pcDNA-M2-PK ⁇ Bam, respectively, resulting in plasmids pGEX-M2-PK and pcDNA3-M2-PK.
  • pPC97-A-raf AA602 / 603RP, pcDNA3-M2-PK K366M and pGEX-2T-M2-PK K366M were made using the Stratagene Mutagenesis Kit.
  • Yeast cultures were grown at 30 ° C under standard conditions in liquid or solid media based on either YPD or minimal SD media.
  • the HF7c yeast line was transformed sequentially with first the "bait" plasmid and then the cDNA library. Transformants were drawn on SD medium in the absence of the amino acids leucine, tryptophan and histidine. After 4 days, the growing clones were tested for activation of the lacZ reporter gene in a ⁇ -Gal filter assay. Positive clones were further examined by retransforming the isolated library plasmid together with various "bait" plasmids in HF7c. Clones which only showed a ⁇ -Gal positive phenotype in the presence of raf were assessed as positive and were further investigated by sequencing and colony hybridization. For direct interaction tests, the yeast line HF7c was co-transformed with Araf deletion constructs and pPC86-M2-PK ⁇ Sal.
  • the NIH 3T3 cells were supplemented under standard conditions (37 ° C., 5% CO 2 ) in DMEM (Life Technologies, Inc.), with 10% heat-inactivated fetal bovine 16
  • Control cells NIH 3T3 and A-raf transformed NIH 3T3 cells were cultivated up to a cell density of 3.5 x 10 5 cells / dish.
  • 26 x 10 6 cells in 3 ml lysis buffer with a low salt concentration (10mM Tris, ImM NaF, ImM EDTA-Na 2 and ImM Mercaptoethanol, pH 7.4) were 17
  • Extracts of NIH 3T3 control cells and NIH 3T36A cells expressing stably gag-A-raf were prepared as described in W. Zwerschke, Proc. Natl. Acad. Be. USA, 96, pages 1291-1296, 1999.
  • the individual fractions of the focusing experiments or gel filtration experiments were diluted 1:10 with sample buffer. After separation on a 10% SDS polyacrylamide gel, the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane using electroblotting.
  • the following antibodies were used to detect the various antigens: M2-PK: onoclonal antibodies DF4 (ScheBo Tech, Giessen, Germany); A-raf: polyclonal antibodies which were raised against 12 C-terminal residues of A-raf representing synthetic peptides (see C. Hagemann et al., FEBS Lett. 403, pages 200-202, 1997); gag-A-raf: goat serum generated against p30 gag (see M. Huleihel, Mol. Cell.
  • Fructose 1, 6-bisphosphate, pyruvate and phosphoenol pyruvate concentrations were determined in perchloric acid extracts of the cells, as described in S. Mazurek et al. , J. Biol. Chem. 272, pages 4941-4952, 1997. According to this reference, the concentrations of glucose, glutamine, glutamate and lactate in the cell supernatants were also determined in order to determine the flow rates.
  • M2-PK the above interactions are known and thus serve as evidence of the functionality of the system used (expression and folding).
  • M2-PK an enzyme that catalyzes glycolysis
  • the isolated clone represents a partial sequence 10 which contains a part of the untranslated region in front of the N-terminus and which lacks 29 amino acids at the C. terminus (M2-PK (1-501)).
  • FIG. 2 shows in detail the determination of the M2-PK activity in the presence of 2 mM and 0.2 mM PEP in the different fractions (upper part) and the determination of M2-PK, p-serine and p-threonine by direct immunoblotting after SDS gel electrophoresis of the different fractions.
  • Transformation of NIH 3T3 cells by stable expression of a fusion between the A-raf kinase domain with viral gag protein led to a selective increase in the tetrameric form (amount of tetramers in control cells: 69%; after A-raf transformation: 76%), for which reference is made to FIG. 2.
  • FIG. 3 shows in the upper part the determination of the activities of pyruvate kinase (circles) and phosphoglyceromutase in the different fractions, pI values for some fractions are given as a reference.
  • the lower part shows the detection of A-raf, gag-A-raf, M2-PK and MEK 1 by direct immunoblotting after SDS gel electrophoresis of the different fractions. It is first seen that the tetrameric form of M2-PK co-focuses with enolase, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (not shown) and part of phosphoglyceromutase type B.
  • A-raf and c-raf focus in the glycolytic enzyme complex in fractions 35-37 and gag-A-raf in fractions 40-44.
  • MEK 1 and MEK 2 the substrates of the raf kinases, both focused in the same fractions 34-45 of the glycolytic enzyme complex.
  • the majority of ERK 1 and ERK 2 the substrates of MEK, focused outside of the glycolytic enzyme complex in fractions 32-35 (not shown). 22
  • M2-PK, A-raf, gag-A-raf, c-raf, MEK and ERK were detected with the antibodies specified under Methods.
  • the immunologically detectable amount of M2-PK protein and the amounts of phosphoserine and phosphothronone on the M2-PK protein were determined densitrometrically using the Scion Image Program (Beta 3B version, Scion Corporation).
  • Scion Image Program Beta 3B version, Scion Corporation.
  • the total content of M2-PK protein increased 1.3-fold in A-raf transformed cells, while the phosphoserine content of M2-PK protein increased 2.6-fold and that of phosphothreonine 1.2-fold.
  • the ratio between phosphoserine and M2-PK protein increased from 0.7 in control cells to 1.3 cells transformed in Araf. The ratio for phosphothreonine, however, was unchanged.
  • the glycolytic complex was extracted by extracting the cells with high phosphate concentrations and the ratio between the tetrameric and the dimeric form of M2-PK was determined directly by means of gel permeation.
  • gel permeation also showed a shift from the dimeric form to the tetrameric form in A-raf transformed cells 23
  • NIH 3T3 cells were transfected with gag-A-raf and M2-PK cDNA and the focus formation after 10 days of cultivation was examined (Table 2). While A-raf transfection only led to the formation of 2 foci per 1 ⁇ g of transfected DNA, cotransfection resulted in an increase in the number to 6 foci per 1 ⁇ g DNA, which is a cooperative effect of A-raf and M2-PK in the Cell transformation speaks.
  • M2-PK K366M did not show this, but actually antagonized the morphological transformation by A-raf.
  • the cells showed a rather flat, less refractile phenotype, as can be seen in FIG. 4 (empty vector: pcDNA3).
  • Protein expression was controlled by Western blots in all experiments (data not shown).
  • x-.DF 11 is the delogarithmic form of the arithmetic mean and the standard deviation of the previously logarithmically transformed data.
  • a one-way analysis of the covariance with the cell density as a covariable was carried out for the statistical analysis. In the case of glutamate, positive values mean medium production and negative values consumption.
  • NIH 3T3 cells were transfected with A-raf, M2-PK and M2-PK K366M in the specified combinations. Focus formation was determined after 10 days of growth (left column).
  • NIH 6A leuk cells expressing Stbail gag-A-raf were transfected with M2-PK and M2-PK K366M. Colonies of surviving cells were counted after 10 days of G418 selection (right column).
  • Vector empty vector pcDNA3.
  • FIG. 5 shows a first GTC for an attack by the hammerhead shown on the corresponding mRNA.
  • a different target sequence for the hammerhead attack is also possible, as are other positions of the same target sequences.
  • the hammerhead can easily be adapted to this by a specialist. It is only essential that the translation of an active kinase domain is reduced or suppressed.

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Abstract

Die Erfindung lehrt eine Nukleinsäure codierend für zumindest eine Teilsequenz einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade, wobei die Teilsequenz für eine Bindungsstelle für ein die Glykolyse katalysierendes Enzym codiert, oder stille Mutation einer solchen Nukleinsäure oder mit einer solchen Nukleinsäure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleinsäure.

Description

Niederlande, 1988, Seiten 115 - 154, verwiesen. Während c-raf-1 im menschlichen Organismus praktisch ubiquitär ist, kommt A-raf natürlicherweise im wesentlichen in Geweben des Urogenitaltraktes und B-raf überwiegend im Cerebru und Testis vor. Für weiterführende Informationen und Literaturangaben hierzu wird im einzelnen auf das Dokument US-5,869,308 verwiesen.
Klassische biochemische Untersuchungen an Tumoren haben bereits vor längerer Zeit belegt, daß Tumore einem veränderten Metabolismus unterliegen. Wenn auch dieser veränderte Metabolismus nicht die fundamentale Ursache von Tumorerkrankungen ist, so hat er doch beachtlichen Einfluß auf das Verhalten eines dreidimensionalen Tumorgewebes. Typischerweise weist solches Tumorgewebe eine ausgeprägte Hypoxie, i.e. Mangel an Sauerstoff, auf aufgrund des in der Regel desorganisierten Wachstums von Blutgefäßen in dem Tumorgewebe. Dies macht deutlich, daß ein Anpassung an hypoxische Bedingungen ein wesentlicher Schritt im Tumorwachstum ist. Der anaerobe Umsatz von Glukose zwecks Energieerzeugung durch Glykolyse ist daher ein gemeinsames Merkmal der meisten Tumorgewebeaggregate. Bezüglich allgemeiner weiterführender Literatur hierzu wird auf die Literaturstelle C.V. Dang et al., TIBS 24:68-72, 1999, verwiesen. Pyruvatkinasen (PK) sind Schlüsselenzyme der Glykolyse und katalysieren die Umwandlung von Phosphoenolpyruvat in Pyruvat, die letzte Reaktion der Reaktionsfolge der Umwandlung von Glukose in Pyruvat, und spielen folglich eine wichtige Rolle in der Bildung von ATP aus ADP. Vier gewebespezifische Isoformen sind bekannt, PK Typ L, R, Ml und M2 (siehe E. Eigenbrodt et al . , Critical Reviews in Oncogenesis, Vol. 3, M. Perucho, Ed., CRC-Press, Boca Raton, Florida, Seiten 91 - 115, 1992) . M2-PK ist die embryonale Form und ersetzt alle anderen Formen in proliferier- enden Zellen und Tumorzellen (siehe G.E.J Staal et al . , Bioche ical and Molecular Aspects of Selected Cancers, T.G. Pretlow et al . , Eds . , Academic Press Inc., San Diego, 1, Seiten 313 - 337, 1991, sowie U. Brinck et al . , Virchows Archiv 424, Seiten 177 - 185, 1994) . M2-PK Protein der Ratte besteht aus 530 Aminosäuren und unterscheidet sich nur in einem Rest von humanem M2-PK (siehe T. Noguchi et al . , J. Biol. Chem., 261, Seiten 13807 - 13812, 1986, sowie K. Tani et al, Gene, 73, Seiten 509 - 516, 1988) . M2-PK ist ein glykolytisch.es E zym, welches in einer aktiven tetrameren und einer inaktiven dimeren Form vorliegt. Der Übergang zwischen beiden Formen reguliert letztendlich den glykolytischen Umsatz in Tumorzellen (siehe W. Zwerschke et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96, Seiten 1291 - 1296, 1999, sowie S. Mazurek et al . , J. Bioeneg. Biomenibr., 29, Seiten 315 v- 330, 1997) . Die Aktivität von M2-PK kontrolliert also den Transit des glykolytischen Pfades und bestimmt somit den relativen Anteil an Glukose, welche in den Synthe- seprozeß gechannelt oder für glykolytische Energieerzeugung verwendet wird. Die Überexpression von M2-PK erlaubt Zellen das Überleben unter Bedingungen mit niedrigem Sauerstofflevel, da oxidative Phospho- rylisierung für die Produktion von ATP durch PK nicht benötigt wird. Generell wird in bösartigen Tumoren und in dem Blut von Tumorpatienten eine erhöhte Menge an M2-PK gefunden. Bekannt ist eine Bindung von A-raf an H-ras, MEK und CK2ß (siehe A.B. Vojtek et al . , Cell, 74, Seiten 205 - 214, 1993, und X. Wu et al . , J. Biol . Chem. , 271, Seiten 3265 - 3271, 1996, und B. Boldyreff et al . , FEBS Lett., 403, Seiten 197 - 199, 1997, sowie C. Hagemann et al . , FEBS Lett., 403, Seiten 200 - 202, 1997) . Ebenso bekannt ist eine Bindung von B-raf und c-raf-1 an Mitglieder der 14-3-3 Familie (siehe B. Yamamori et al., J. Biol. Che ., 270, Seiten 11723 - 11726, 1995, und C. Papin et al., Oncogene, 12, Seiten 2213 - 2221, 1996, und E. Freed et al . , Science, 265, Seiten 1713 - 1716, 1994, sowie K. Irie et al, Science, 265, Seiten 1716 - 1719, 1994) . Es ist auch vermutet worden, daß 14-3-3 Proteine ebenso an A-raf binden, da die Bindungsstellen in allen raf-Isoformen hoch konserviert sind (siehe G. Daum et al., Trends Bioche . Sei., 19, Seiten 474 - 480, 1994). Eine direkte Bindung von A-raf oder anderen Elementen der mitogenen Signalisierungskaskade an Faktoren der me- tabolischen Regulation ist dagegen unbekannt.
Technisches Problem
Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, einen Ansatz zur Hemmung des anaeroben Stoffwechsels in Tumorzellenverbänden zu finden, und daran anschließend Wirkstoffe zu finden, die das Wachstum von Tumorzeil erbänden zumindest verlangsamen bzw. Apoptose in solchen Tumorzellverbänden aufgrund von unzureichender Energieerzeugung in Tumorzellen fördern. Der Erfindung zugrundeliegende Erkenntnis.
Mittels eines Two-Hybrid Systems und unter Verwendung von A-raf als bait ("Köder") wurde eine PC12 cDNA- library gescreent. Unter anderem wurde dabei M2-PK als ein Bindungspartner für A-raf gefunden. Mit weiteren Experimenten wurde gefunden, daß die Kooperation zwischen A-raf und M2-PK zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen der dimeren und der tetrameren M2-PK Formen zu Gunsten der tetrameren, also aktiven Form, führt. Somit ist A-raf Teil des glykolytischen Enzym Komplexes. Transformation von NIH 3T3 Zellen durch A-raf führt zu einer Zunahme im Phosphoserin Gehalt des M2-PK Proteins im Zusammenhang mit der Verschiebung des genannten Gleichgewichts.
Es wurde damit zu ersten Mal demonstriert, daß ein Onkogen der mitogenen Signalisierungskaskade zudem auch direkt auf ein die (anaerobe) Glykolyse katalysierendes Enzym wirkt, und zwar verstärkend und somit tumorwachstumsfördernd. Ein solcher Synergismus ist überraschend und es steht zu erwarten, daß durch Hemmer der Wechselwirkung gleich mehrere positive Ef- fekte im Rahmen einer Tumortherapie erzielt werden können.
Zwar sind Wechselwirkungen von Oncoproteinen, aufweisend völlig andere physiologischen Mechanismen, mit M2-PK bekannt, so beispielsweise pp60v"src Kinase oder HPV 16 Oncoprotein E7, welche zu einer Verschiebung des tetramer/dimer-Verhältnisses führen. Diese haben aber eine Verschiebung in Richtung auf Di er und folglich reduzierender Aktivität zur Folge, im Gegensatz zu A-raf.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft zunächst eine Nukleinsaure codierend für zumindest eine Teilsequenz einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade, wobei die Teilsequenz für eine Bindungsstelle für ein die Glykolyse katalysierendes Enzym codiert, oder stille Mutation einer solchen Nukleinsaure oder mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleinsaure. Der Begriff der Nukleinsaure umfaßt insbesondere DNA, RNA und PNA. Ebenfalls subsumiert unter den Begriff sind doppelsträngige Nukleinsäuren sowie einzelsträngige Nukleinsaure und folglich auch zueinander komplementäre Nukleinsäuren. Stille Mutationen meint Varianten in der Sequenz, die zu keinem funktionalen Unterschied, bezogen auf die
Bindungsstelle für ein die Glykolyse katalysierendes Enzym, der Variante gegenüber der natürlichen, nicht mutierten Sequenz führen. Stille Mutationen können Allele oder künstliche Mutationen sein. Derivate fallen ebenfalls unter die Erfindung. Derivate sind nicht-natürliche chemische Modifikationen.
Mittels solchen Nukleinsäuren kann beispielsweise nach Kooperationspartnern der Protein Kinase der mitogenen Singnalisierungskaskade im Bereich der die Glykolyse katalysierenden Enzyme gesucht werden. Gleichfalls kann nach Inhibitoren für den Bindungsstellen gesucht 7
werden. Erfindungsgemäße Nukleinsäuren sind daher letztendlich insbesondere als Sreening Tool brauchbar.
Bevorzugt ist eine Nukleins ure codierend für ein Pro- tein oder Peptid enthaltend die Sequenz A-raf
(587-606) oder stille Mutation einer solchen Nukleinsaure oder mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleinsaure. Bevorzugterweise handelt es sich im Rahmen der Erfindung um human A-raf. Zu Forschungszwecken kann es sich aber auch um A-raf von nicht menschlichen Säugetieren handeln. Die Sequenz 587-606, insbesondere 602 - 603, wurde als Bereich identifiziert, wo die Bindungsstelle für die Glykolyse katalysierenden Enzyme liegt. Eine erfindungsgemäße Nukleinsaure kann gegenüber der vollen Sequenz von A-raf verkürzt sein, und zwar insbesondere am N-terminalen Ende. Sie codiert dann für ein Protein oder Peptid bestehend aus der Sequenz A-raf (255 bis 587 - 606) oder stille Mutation einer solchen Nukleinsaure oder mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleins ure. Mit anderen Worten ausgedrückt, die Sequenz kann in dem Bereich liegen, der begrenzt wird durch die Sequenzen (255 - 606) und (587 - 606) .
Weiterhin lehrt die Erfindung eine cDNA des vorstehenden Aufbaus sowie einen isolierten rekombinanten Vektor enthaltend eine Nukleinsaure des vorstehenden Aufbaus bzw. ein Expressionsplasmid mit dieser Nuk- leinsäure. Hierbei kann zwecks stabiler Expression ein für ein geeignetes virales Protein codierendes DNA Fragment, beispielsweise gag, mit eingesetzt sein (Fusion gag mit beispielsweise A-raf bzw. A-raf Fragment) . Mittels des Expressionsplasmids läßt sich eine Transfor ante bilden, welche wiederum zur Herstellung des durch die Nukleinsaure codierten Proteins bzw. Peptids verwendet werden kann. Hierzu wird die Transformante nach üblichen Methoden auf geeignete Weise kultiviert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine antisense Nukleinsaure oder Ribozym bindend an eine beispiel- sweise oncogene Nukleinsaure, insbesondere RNA, codierend für eine Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade. Mittels einer solchen Substanz kann die Expression von beispielsweise A-raf unterdrückt werden mit der Folge einer Hemmung der (anaero- ben) Glykolyse in dem Tumorgewebe. Prinzipiell gleiches kann erreicht werden mit einer Substanz mit einer Bindungsstelle für ein durch eine erfindungsgemäße Nukleinsaure codiertes Protein oder Peptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) deak- tivierte, die Glykolyse katalysierende Enzme, b) inaktive Proteine oder Peptide und c) Aptamere.
Im Falle eines Ribozyms kann es sich beispielsweise um ein Hammerhead Ribozym handeln, welches innerhalb der Kinasedomäne einer raf Isoform m-RNA beispielsweise bei einer GTC Stelle angreift. Dabei kann das Hammerhead auch vor out of frame ATG Startcodons angreifen, der Kinasedomäne angreifen. Diese lassen Translation einer aktiven Kinasedomäne aus der erzeugten fragmen- tären RNA extrem unwahrscheinlich werden.
Dies kann insbesondere eine Kinase-inaktiven Form von M2-PK sein, vorzugsweise von human M2-PK. In diesem Fall kann die Kinase-inaktive Form durch eine Mutation im Bereich der ADP-Bindungsstelle und/oder der ATP- Bindungsstelle, gebildet sein, insbesondere ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "M2-PK K366M, R119C, T340M, Q377K, K161M, K165M und mehrere dieser Mutationen" . Der Ausdruck der Kinase-inaktiven Form umfaßt auch in der Kinase Aktivität gegenüber normaler M2-PK lediglich reduzierte Formen. Inaktive Mutanten eignen sich generell deshalb zur Auslösung von Apoptose der Tumorzellen, weil damit ein Abfall der ATP- und ADP- Spiegel erreicht wird. Als natürliche Mutante kommt auch Ml-PK in Frage. Ml-PK wird in allen nicht prolif- erierenden Zellen exprimiert. In M2-PK exprimierenden Zellen trit bei zusätzlicher Expression von Ml-PK durch konkurriernde Reaktionen eine Hemmung der Zell- proliferation ein. Ml-PK und M2-PK sind unterschiedliche Splicing-Produkte, wobei nur ein Exon mit 51 Aminosäuren ausgetauscht ist. Ml-PK und M2-PK unterscheiden sich in insgesamt nur 21 Aminosäuren. Ml-PK wird nicht phosphoryliert . Hiermit können durch Sequenzvergleich mit M2-PK Phosphorylierungsstellen abgeleitet werden. Im Ergebnis werden jedenfalls nicht phosphorylierbare M2-PK-Mutanten als tumorsupprimerend und proliferationshemmend wirken. Solche Mutanten er- geben sich unmttelbar aus dem folgenden Sequenzvergleich, in welchem potentielle Phosphorylierungsstellen angegeben sind. Folglich sind insbesondere solche M2-PK Mutanten einsetzbar, welche zumindest an zumindest einer der markierten Stellen entsprechend dem Sequenzvergleich mutiert ist. Alternativ oder zusätzlich können an Stellen anderer Abweichungen in dem Sequenzvergleich eine oder mehrere Mutationen (in beliebigen Permutationen) eingerichtet sein. 10
M2 : 380Ile-Ala-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-Ala-Ile-Tyr-His-Leu-Gln- eu-Phe-Glu-Glu
P
Ml : Ile-Ala-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-Ala-Val-Phe-His-Arg-Leu-Leu-Phe-Gl -Glu
M2 : Leu-Arg-Arg-Leu-Ala-Pro-Ile-Thr-Ser-Asp-Pro-Thr-Glu-Ala-Ala-Ala-Val
P P
Ml : Leu-Ala-Arg-Ala-Ser-Ser-Gln-Ser-Thr-Asp-Pro-Leu-Glu-Ala-Met-Ala-Met
414
M2 : Gly-Ala-Val-Glu-Ala-Ser-Phe- ys-Cys-Cys-Ser-Gly-Ala-Ile-Ile-Val-Leu Ml : Gly-Ser-Val-Glu-Ala-Ser-Tyr- ys-Cys-Leu-Ala-Ala-Ala-Leu-Ile-Val-Leu
431
M2 : Thr- ys-Ser
Ml : 431Thr-Glu-Ser
Im Falle der Aptamere empfiehlt es sich, diese gegen nukleinsäurespaltende Enzyme zu stabilisieren. Im
Falle der Proteine bzw. Peptide handelt es sich um für die Bindungsstelle des durch die erfindungsgemäße Nukleinsaure codierten Proteins bzw. Peptids "geschneiderte" hochspezifische synthethische Moleküle.
Wegen der die Glykolyse hemmenden Wirkung der vorstehenden Substanzen ist Teil der Erfindung auch deren Verwendung zur Blockierung der Kooperation bzw. Bindung zwischen einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade und einem die Glykolyse katalysierenden Enzym, insbesondere der A-raf/M2-PK Kooperation, sowie deren Verwendung zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung von Krebser- krankungen, beispielsweise des Urogenitaltraktes. Mit einer solchen Blockierung wird vermutlich gleichzeitig die mitogene Signalisierungskaskade blockiert und somit ein synergistischer Effekt erzielt. 11
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsaure oder eines hierdurch kodierten Proteins oder Peptids in einem screen- ing Verfahren zur Ermittelung eines mit einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskette kooperierenden, die Glykolyse katalysierenden Enzyms. Hierzu werden zunächst bekannte oder unbekannte die Glykolyse katalysierende Enzyme identifiziert und ggf. isoliert und charakterisiert. Diese werden dann Versuchen beispielsweise gemäß der Ausführungsbeispiele unterworfen, wobei eine Wechselwirkung mit einer oder mehrerer raf Isoformen untersucht wird. Wird eine Wechselwirkung detektiert, so wird dieses Enzym selek- tiert. Ggf. kann aus dem selektierten Enzym ein inaktives Enyzm geschaffen werden (inaktiv = geringere oder keine die Glykolyse katalysierende Wirkung im Vergleich zum unmodifizierten Enzym) . Auch kann des weiteren die Bindungsstelle des die Glykolyse kata- lysierenden Enzyms bestimmt werden und ein Peptid oder eine Mi ikrisubstanz hierfür geschaffen werden, welches an gleicher Stelle der raf Isoform bindet. Es lehrt die Erfindung schließlich die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsaure oder eines hierdurch kodierten Proteins oder Peptids in einem screening Verfahren zur Ermittelung einer an einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskette bindenden, jedoch nicht, die Glykolyse katalysierenden Stoffes. Hierbei werden Stoffe mit prospektiven Bindungsstellen für die raf Isoform Bindungsstelle mit einem die Glykolyse katalysierenden Enzym einem Bindungstest, beispielsweise gemäß der Ausführungsbeispiele unterworfen und jene Substanzen selektiert, die binden. Es 12
ist möglich, hieran anschließend oder zuvor die Inak- tivität der prospektiven Substanzen hinsichtlich der die Glykolyse katalysierenden Wirkung zu testen.
In der erstgenannten Verwendung können weitere
Bindungspartner in gesundem oder krankem Gewebe gefunden werden. In der letztgenannten Verwendung können Inhibitoren der normalerweise in gesundem oder krankem Gewebe stattfindenden Bindungsprozesse gefunden werden.
Die Erläuterungen für eine Anspruchskategorie der Erfindung gelten entsprechend für andere Anspruchskategorien. Die Erfindung betrifft letztendlich auch Heilverfahren, beispielsweise klassisch durch geeignete Verabreichung von pharmazeutischen Präparaten aber auch gentherapeutisch, mittels welcher eine oder mehrere Substanzen gemäß der Ansprüche 6 bis 9 in eine Zielzelle eingebracht oder in der Zielzelle erzeugt werden.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich Ausführungsbeispiele darstellenden Figuren und Experimenten näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1: spezifische Wechselwirkung von A-raf und M2-PK in einem Two-Hybrid binding assay,
Fig. 2: Isoelektrische Fokussierung von M2-PK in Kon- trollzellen und in A-raf transformierten NIH 3T3 Zellen, 13
Fig. 3: Isoelektrische Fokussierung des glycolytischen Enzym Komplexes in A-raf transformierten NIH 3T3 Zellen,
Fig. 4: Inhibierung der Transformation von NIH 3T3
Zellen mittels Kinase inaktivem M2-PK K336A.
Fig. 5: Sequenzen von raf Isoformen im Vergleich, mit Markierung des Starts der Kinasedomäne, einer ersten GTC für einen Hammerhead Angriff, sowie von ATG Startcodons, sowie Darstellung eines für die mRNA geeigneten Hammerheads.
Beil. 1: DNA Sequenz von Ratten Ml-PK und M2-PK,
Beil. 2: DNA Sequenz von human v-raf,
1 : Methoden
1.1: Plasmid Konstruktion
Die Two-Hybrid Vektoren pPC86 und pPC97 wurden von D. Nathans zur Verfügung gestellt (siehe auch: P.M. Chevrey & D. Nathans, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, Seiten 5789 - 5793, 1992) . Vollängen A-raf, B-raf und c-raf-1 cDNA wurden in Fusion mit der Gal4 DNA Bindungsdomäne in pPC97 subkloniert. Die PC12 cDNA library wurde in Fusion mit der Gal4 Aktivierungs- domäne in pPC97 subkloniert. Die Klonierung der A-raf Deletionskonstrukte ist in C. Hagemann et al . , FEBS Lett., 403, Seiten 200 - 202, 1997, ausführlich beschrieben worden. A-raf (554 - 606) wurde unter 14
Verwendung der Primer 5' -CTC AAG TTG TCG ACG GAG GAG CGG CCC CTC TTC-3' (upstream, unter Einführung einer SalL site) und 5'-GTG GCT TGG CGG CCG CCT AAG GCA CAA G-3' (downstream, unter Einführung einer Notl site).
Das HA-tag und das untranslatierte 5' Ende des "geangelten" M2-PK (Klon 71) wurden dadurch entfernt, daß ein neues Sall site mittels des site-gerichteten Mutagenesis Kits von Stratagene erzeugt wurde, und daß die resultierende pPC86-M2-PK mit Sall verdaut wurde und Plas id-Religation. Dies resultierte im Plasmid pPC86-PK. Für die Expression in E. coli und in Säugetierzellen wurde M2-PK cDNA als EcoRI Fragment aus pPC86 (Klon 71) isoliert, zu pGEX-2T ligiert sowie pcDNA3 verdaut mit EcoRI. Die untranslatierte Region wurde durch Einführung einer BamHI site (Mutagenesis Kit Stratagene) und Entfernung des BamHI Fragments aus diesem Konstrukt entfernt. Das 3' Ende der codierenden Region der M2-PK cDNA wurde mittels PCR aus der PC12 library isoliert unter Verwendung der Primer 5'-GCC CGG TAC CGC CCA AGG GCT C-3' (sense) und 5'-CCA GGG CTG GGA ATT CTC TGG-3' (antisense) . Vollängen M2-PK wurde durch Subklonierung des PCR Produkts Kpnl/EcoRI in pGEX-M2-PKΔBam und pcDNA-M2-PKΔBam, respektive, erzeugt, resultierend in Plasmiden pGEX-M2-PK und pcDNA3-M2-PK.
pPC97-A-raf AA602/603RP, pcDNA3-M2-PK K366M und pGEX-2T-M2-PK K366M wurden mittels des Mutagenesis Kits von Stratagene hergestellt.
1.2: Two-Hybrid library screening 15
Hefekulturen wurden bei 30°C unter Standardbedingungen in flüssigem oder festem Medium basierend auf entweder YPD oder minimal SD Medium gezogen.
Die Hefe Linie HF7c wurde sequenziell transformiert mit zunächst dem "Köder"-Plasmid und dann der cDNA library. Transformanten wurden gezogen auf SD Medium unter Fehlen der Aminosäuren Leucin, Tryptophan und Histidin. Nach 4 Tagen wurden die wachsenden Klone auf Aktivierung des lacZ reporter Gens in einem ß-Gal Fil- terassay getestet. Positive Klone wurden weiter untersucht durch Retransformierung des isolierten library-Plasmids zusammen mit verschiedenen "Köder"- Plasmiden in HF7c. Klone, welche nur in der Gegenwart von raf einen ß-Gal positiven Phenotyp zeigten, wurden als positiv bewertet und weiter untersucht durch Sequenzierung und Kolonie-Hybridisierung. Für direkte Wechselwirkungstests wurde die Hefelinie HF7c mit A- raf Deletionskonstrukten und pPC86-M2-PKΔSal cotransformiert .
Allgemeine Informationen zum Two-Hybrid Vektorsystem bzw. Varianten hierzu könen der Literaturstelle Bio- spektrum, 3/95, S. 12-14, sowie der dort genannten Literatur entnommen werden.
1.3: Zellkulturen
Die NIH 3T3 Zellen wurden unter Standardbedingungen (37°C, 5% C02) in DMEM (Life Technologies, Inc.), sup- plementiert mit 10% hitzeinaktiviertem fetal bovine 16
serum (Hyclone) , 168 mM L-Glutamin (Life Technologies, Inc.) und 100 units/ml Streptomycin und Penicillin (Life Technologies, Inc.) gezogen.
1.4: Focus Formierung und colony yield assay
7 x 104 NIH 3T3 Zellen und 1,5 x 105 NIH 6A-leuk Zellen (stabil gag-A-raf expri ierend, siehe M. Huleihel, Mol. Cell. Biol., 6, Seiten 2655 - 2662, 1986) wurden in 90 mm Gewebekultur Schalen einen Tag vor der Trans- fektion gesäht. Die Transfektionen wurden mittels der Lipofecta in Methode (Life Technologies, Inc.) und entsprechend der Herstelleranweisungen ausgeführt. Focus Formierung wurde 10 Tage später gescored. Trans- fizierte Kulturen wurden zwecks besserer Visualisierung der transformierten Foci mittels 0,4% Kristallviolett gefärbt. Für das colony yield assay wurden Zellen wie oben beschrieben gesäht und für 10 Tage in selektivem Medium enthaltend 450 μg/ml G418 (Geneticin; GIBC0 BRL siehe auch U.R. Rapp, Oncogene, 9, Seiten 3493 - 3498, 1994) kultiviert.
1.5: Isoelektrische Fokussierung glykolytischer Enzyme.
Kontrollzellen NIH 3T3 und A-raf transformierte NIH 3T3 Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von 3,5 x 105 Zellen/Schale kultiviert. Für jedes Fokussierungs- experiment wurden 26 x 106 Zellen in 3 ml Lysispuffer mit einer niedrigen Salzkonzentration (lOmM Tris, ImM NaF, ImM EDTA-Na2 und ImM Mercaptoethanol, pH 7,4) 17
extrahiert zwecks Erhalt des glykolytischen Enzym Komplexes und dann für 20 min. bei 40.000 g zentrifugiert zur Entfernung von Zellfeststoffen. Homogenate wurden der isoelektrischen Fokussierung unterworfen und Enzym Aktivitäten wurden, wie vorbeschrieben (siehe S. Mazurek, J. Cell. Physiol., 167, Seiten 238 - 250, 1996), in individuellen Fraktionen bestimmt.
1.6: Gelfiltration-Analyse von M2-PK.
Extrakte von Kontrollzellen NIH 3T3 und stabil gag-A- raf exprimierenden NIH 3T36A Zellen wurden wie in W. Zwerschke, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96, Seiten 1291 - 1296, 1999, beschrieben hergestellt.
1.7: Immunologische Detektion von M2-PK, A-raf, c-raf, MEK1, Phosphoserin und Phosphothreonin.
Die individuellen Fraktionen der Fokussierungsexperi- mente oder Gelfiltrationsexperimente wurden 1:10 mit sample Puffer verdünnt. Nach Trennung auf einem 10% SDS Polyacrylamid Gel wurden die Proteine auf eine Nitrocellulose Membran mittels Electroblotting tran- ferriert. Zur Detektion der verschiedenen Antigene wurden die folgenden Antikörper benutzt: M2-PK: onok- lonale Antikörper DF4 (ScheBo Tech, Giessen, Deutschland) ; A-raf: polyklonale Antikörper, welche gegen 12 C-terminale Reste von A-raf representierende synthetische Peptide gezogen wurden (siehe C. Hagemann et al., FEBS Lett. 403, Seiten 200 - 202, 1997); gag- A-raf : Ziegenserum erzeugt gegen p30gag (siehe M. Huleihel, Mol. Cell. Biol., 6, Seiten 2655 - 2662, 1986) ; c-raf : monoklonale Antikörper (Dianova, Hamburg, Deutschland; MEK und ERK: monoklonale Antikörper (Transduction Laboratories) ; p-Serin, p-Threonin und p-Tyrosin: monoklonale biotinylierte Antikörper (Sig a, Deisenhofen, Deutschland) .
1.8: Bestimmung der Metabolitkonzentrationen.
Fructose 1, 6-bisphosphat, Pyruvat und Phosphoenolpyru- vat Konzentrationen wurden in Perchlorsäure-Extraten der Zellen bestimmt, wie in S. Mazurek et al . , J. Biol. Chem. 272, Seiten 4941 - 4952, 1997, beschrie- ben. Gemäß dieser Literaturstelle wurden auch die Konzentrationen von Glucose, Glutamin, Glutamat und Lactat in den Zeilüberständen bestimmt zwecks Bestimmung der Flußraten.
2. Identifizierung Charakterisierung der Wechselwirkung A-raf mit M2-PK mittels des Two Hybrid binding assay.
Mittels des Two-Hybrid Systems wurden 3,3 x 107 Klone einer Ratten Pheochromocytoma PC12 cDNA library unter Verwendung von A-raf als "Köder" gescreent. 73 Klone zeigten einen Histidin und LacZ positiven Phenotypus . Diese Klone wurden weiter untersucht durch colony- hybridization und Sequenzierung. Sie codieren H-ras (1 Klon), MEK-2 (3 Klone), 14-3-3ß (5 Klone), 14-3-3ζ (15 Klone), 14-3-3ε/η (11 Klone), 14-3-3Θ (7 Klone), CK2ß (26 Klone) und M2-PK (1 Klon) . Vier verbleibende Klone 19
sind noch zu untersuchen. Mit Ausnahme von M2-PK sind die vorstehenden Wechselwirkungen bekannt und dienen insofern als Beleg für die Funktionsfähigkeit des verwendeten Systems (Expression und Faltung) . Die erstma- 5 lig festgestellte Wechselwirkung von A-raf mit einem die Glykolyse katalysierenden Enzym, nämlich M2-PK, bildet die Grundlage der Erfindung.
Der isolierte Klon representiert eine Teilsequenz, 10 welche einen Teil der untranslatierten Region vor dem N-Terminus enthält und dem 29 Aminosäuren am C.Terminus fehlen (M2-PK (1 - 501)).
Bei Versuchen mit c-raf-1 und B-raf als "Köder" waren
15 keine M2-PK Klone isolierbar, was eine A-raf isozym- spezifische Wechselwirkung belegt. Mittels deletion mapping konnte gezeigt werden, daß die Wechselwirkung innerhalb einer sehr C-terminalen Domäne von A-raf erfolgt, da Wechselwirkung von M2-PK mit A-raf (255 -
20 606) und A-raf (554 - 606) festgestellt werden konnte, nicht jedoch mit A-raf (255 - 587) . Hierzu wird im Einzelnen auf die Figur 1 a verwiesen. Die festgestellte wechselwirkende variable Region ist nicht konserviert zwischen verschiedenen raf-Isoformen der
25 Säugetiere, was in Übereinstimmung mit der beobachteten isozymspezifischen Bindung von M2-PK in den Two Hybrid Tests ist und auch eine Erklärung hierfür bieten könnte. Um die Exakte Bindungsdomäne zu bestimmen wurde der Mutant A-raf AA602/603RP generiert, in
30 welchem die vermuteten Bindungstellen durch die entsprechenden c-raf-1 Aminosäuren ausgetauscht wurden, und dann einem direkten Two Hybrid Test unterworfen. In der Fig. 1 b erkennt man, daß mit dieser Mutation 20
jegliche Wechselwirkung verschwunden war, was belegt, daß die A-raf spezifischen Bindungsstellen verantwortlich sind für die Spezifität der Wechselwirkung mit M2-PK.
3: Untersuchung des Effekts der Wechselwirkung A-raf mit M2-PK auf die metabolische Regulation.
Der Übergang der inaktiven dimeren in die aktive te- tramere Form von M2-PK bestimmt den glykolytischen Fluß in Tumorzellen. Zwecks Untersuchung eines eventuellen Effekts der Wechselwirkung A-raf mit M2-PK hierauf in vivo wurden isoelektrische Fokussierungsex- perimente durchgeführt. Zwei Peaks konnten getrennt werden für die tetramere Form (Fraktionen 35 - 42) und die di ere Form (Fraktionen 43 - 47) , wie in der Figur 2 ersichtlich. Im Gegensatz zur dimeren Form hat die tetramere Form eine hohe Affinität zu seinem Substrat Phosphoenolpyruvat (PEP) . In Übereinstimmung mit den differentiellen Substrataffinitäten wurde gefunden, daß die tetramere Form gleich aktiv ist bei hohen (2 itiM) und niedrigen (0,2 mM) PEP Konzentrationen, während die dimere Form weniger aktiv ist bei niedri- gen Konzentrationen (Fig. 2) .
In der Figur 2 sieht man im einzelnen die Bestimmung der M2-PK Aktivität in der Gegenwart von 2 mM und 0,2 mM PEP in den verschiedenen Fraktionen (oberer Teil) sowie die Bestimmung von M2-PK, p-Serin und p-Threonin durch direktes Immunoblotting nach SDS Gelelektrophorese der verschiedenen Fraktionen. 21
Transformation von NIH 3T3 Zellen durch stabile Expression einer Fusion zwischen der A-raf-Kinase Domäne mit viralem gag-Protein (gag-A-raf; siehe M. Huleihel et al., Mol. Cell. Biol., 6, Seiten 2655 - 2662, 1986) führte zu selektivem Anstieg der tetrameren Form (Menge der Tetrameren in Kontrollzellen: 69%; nach A-raf Transformation: 76%) , wozu auf die Figur 2 verwiesen wird.
Die Figur 3 zeigt im oberen Teil die Bestimmung der Aktivitäten von Pyruvat Kinase (Kreise) und Phospho- glyceromutase in den verschiedenen Fraktionen, pl Werte für einige Fraktionen sind als Bezug angegeben. Im unteren Teil ist die Detektion von A-raf, gag-A- raf, M2-PK und MEK 1 durch direktes Immunoblotting nach SDS Gelelektrophorese der verschiedenen Fraktionen. Man entnimmt zunächst, daß die tetramere Form von M2-PK mit Enolase, Glyceraldehyd 3-phosphatde- hydrogenase (nicht gezeigt) und einem Teil von Phos- phoglyceromutase Typ B cofokussiert. A-raf und c-raf fukussieren in dem glykolytischen Enzym Komplex in Fraktionen 35 - 37 und gag-A-raf in Fraktionen 40 - 44. Eine proteolytisch modifizierte Form von gag-A-raf mit einem Molekulargewicht zwischen 45 und 50 kDa fokussierte in den Fraktionen 39 - 42 (nicht dargestellt) . MEK 1 und MEK 2 , die Substrate der raf Kinasen fokussierten beide in den gleichen Fraktionen 34 - 45 des glykolytischen Enzym Komplexes. Der Großteil von ERK 1 und ERK 2, die Substrate von MEK, fokussierten außerhalb des glykolytischen Enzym Komplexes in den Fraktionen 32 - 35 (nicht gezeigt) . 22
M2-PK, A-raf, gag-A-raf, c-raf, MEK und ERK wurden mit den unter Methoden angegebenen Antikörpern detektiert.
Die immunologisch detektierbare Menge von M2-PK Pro- tein und die Mengen von Phosphoserin und Phos- phothreonin an dem M2-PK Protein wurden densitrometrisc mittels des Scion Image Programms (Beta 3B-Version, Scion Corporation) bestimmt. Im Vergleich zu Kontrollzellen nahm der Gesamtgehalt an M2-PK Protein 1,3-fach in A-raf transformierten Zellen zu, während der Phosphoserin Gehalt des M2-PK Proteins 2,6-fach und jener des Phosphothreonin 1,2-fach zunahm. Das Verhältnis zwischen Phosphoserin und M2-PK Protein nahm von 0,7 in Kontrollzellen auf 1,3 in A- raf transformierten Zellen zu. Das Verhältnis für Phosphothreonin war dagegen unverändert. Der höchste Phosphorylisierungsgrad wurde in den Fraktionen 35 - 38 gefunden, in welchen auch A-raf und c-raf lagen. Hieraus folgt, daß A-raf Transformation selektiv den Phosphoserin Gehlat des M2-PK Proteins erhöht. Der gleiche Anstieg im Phosphorylisierungsgrad und Gehalt an M2-PK Protein wurde auch in andern Tumor Zellinien, wie pp60v_src transformierten NIH 3T3 Zellen und Glioma Zellinien, gefunden.
In einem weiteren Experiment wurde der glykolytische Komplex durch Extraktionen der Zellen mit hohen Phosphatkonzentrationen und wurde das Verhältnis zwischen der tetrameren und der dimeren Form von M2-PK direkt mittels Gelpermeation bestimmt. In Übereinstimmung mit den Daten der isoelektrischen Fokussierung zeigte die Gelpermeation auch eine Verschiebung der dimeren Form zur tetrameren Form in A-raf transformierten Zellen 23
(tetramere Form in Kontrollzellen: 77%; in A-raf transformierten Zellen: 87%) . In A-raf transformierten Zellen war die Intensität der Phosphoserin-Färbung von tetramerem M2-PK stärker als in Kontrollzellen.
In völliger Übereinstimmung mit den Veränderungen der M2-PK Aktivität wurde gefunden, daß A-raf Transformation die glycolytische Flußrate erhöht (siehe Tab. 1) . Gleichzeitig wurde eine Abnahme der Fructose 1, 6-bisphosphat Niveaus von 63,8 + 13,1 (4) nmol/mg Protein in Kontrollzellen auf 39,5 + 13,6 (5) nmol/mg Protein (x + SD, p<0,050) gefunden. Pyruvat Niveaus nahmen von 6,9 + 0,9 (4) nmol/mg Protein in Kontrollzellen auf 9,3 + 2,7 (5) nmol/mg Protein in A-raf transformierten Zellen zu (x + SD, p<0,054) . Phosphoenolpyruvat Konzentrationen wurden nicht signifikant geändert .
Ob die metabolischen Änderungen essentiell für die Transformation und Proliferation der Zellen war, wurde in Überexpressionsexperimenten untersucht. NIH 3T3 Zellen wurden mit gag-A-raf und M2-PK cDNA trans- fiziert und die Fokusbildung nach 10 Tagen Kultivierung untersucht (Tabelle 2) . Während A-raf Transfektion nur zur Bildung von 2 Foci je 1 μg trans- fizierter DNA führte, ergab die Cotransfektion eine Zunahme der Anzahl auf 6 Foci je 1 μg DNA, was für einen kooperativen Effekt von A-raf und M2-PK in der Zelltransformation spricht. Um zu prüfen, ob eine ho- cheffiziente Transformation durch A-raf M2-PK erfordert, wurde eine Kinase-inaktive Form von M2-PK, M2-PK K366M, mutiert an der vermuteten ADP Bindungsstelle, eingesetzt, in der Hoffnung damit einen inhibierenden 24
Mutanten zu erhalten, welcher die A-raf M2-PK Kooperation bzw. Bindung hemmt. Dieser Mutant hat tatsächlich die Eigenschaft die Focusformation in NIH 3T3 Zellen vollständig zu unterdrücken. In einem colony yield assay ergab sich, daß der M2-PK K366M Mutant die Bildung von Kolonien stabil A-raf exprimierender NIH 6A-leuk Zellen reduziert, so daß unter G418 Selektion nur 18 Kolonien je 1 μg transfizierter DNA wuchsen, während wildtype M2-PK Expression im Wachstum von 75 Kolonien je 1 μg DNA resultierte (Tabelle 1) . Weiterhin war Wachstum unter wildtype M2-PK in der Lage die transformierte Morphologie von NIH 3T3 Zellen zu fördern, während M2-PK K366M dies nicht zeigt, sondern faktisch die morphologische Transformation durch A-raf antagonisierte. Die Zellen zeigten nämlich einen eher flachen, weniger refraktilen Phenotypus, wie in der Figur 4 zu erkennen (Leervektor: pcDNA3) . Protein Expression (M2-PK und A-raf) wurde in allen Experimenten mittels Western-blots kontrolliert (Daten nicht gezeigt) .
Tabelle 1
Metabolit Kontrolle A-raf Sign,
Glucose Verbr. 24,0.1,2(9) 57,5.1,2(9) p<0, 01 Lactat Prod. 52,5.1,0(10) 79,4.1,0(10) p<0, 001 Pyruvat Prod. 1,7.1,0(10) 4,2.1,0(10) p<0,001 Glutamin Verbr, 4,4.1,2(10) 11,5.1,2(10) p<0,01
x+SD 25
Glutamat Konvers 0,7+0,02 -1,1+0,02 p<0,001
Für die Kalkulation der Metabolit Konversion mußte die Abhängigkeit von der Zelldichte berücksichtigt werden. Für die Konversion von Glucose, Lactat, Glutamin und Pyruvat wurde eine logarithmische Transformation der Daten verwendet, da die Daten nach rechts verzerrt waren. x-.DF11 ist die delogarithmisierte Form des arith- metischen Mittels und der Standardabweichung der zuvor logarithmisch transformierten Daten. Für die statistische Analyse wurde eine Einweg Analyse der Covarianz mit der Zelldichte als Covariable durchgeführt. Im Falle von Glutamat bedeuten positive Werte mittlere Produktion und negative Werte Verbrauch.
Tabelle 2
Metabolit Kontrolle A-raf Sign. Fructose 1, 6-bis- phosphat 63,8+13,1(4) 39,5+13,6(5) p<0,05
Pyruvat 6,9+ 0,9(4) 9,3+ 2,7 (5) p<0, 05
Phosphoenolpyruvat 0,3+ 0,3 (4) 0,9+ 0,8 (5)
ATP/ADP 3,1+ 0,9(4) 8,3+ 3,1 (4) p<0,05 AMP 7,6+ 2,1 (4) 1,8+ 1,5(4) p<0,01
IMP 4,2+ 2,3(4) 0,4+ 0,2 (4) p<0,05
Inosin 3,8+ 1,3 (4) 0,8+ 0,5(4) p<0, 01
Tabelle 3
Foci/μg DNA Kolonien/μg DNA 26
A-raf + Vektor 2 597+30
A-raf + PK-M2 6 576+30
A-raf + PK-M2 K366M 0 156+15
NIH 3T3 Zellen wurden mit A-raf, M2-PK und M2-PK K366M transfiziert in den angegebenen Kombinationen. Focus Bildung wurde nach 10 Tagen Wachstum bestimmt (linke Spalte) . Stbail gag-A-raf exprimierende NIH 6A-leuk Zellen wurden mit M2-PK und M2-PK K366M transfiziert. Kolonien überlebender Zellen wurden nach 10 Tagen G418 Selektion gezählt (rechte Spalte) . Vector = Leervector pcDNA3.
4.: Sequenzvergleich im Bereich Start der raf Kinase- domäne und Hammerhead.
Die Figur 5 zeigt ein erstes GTC für einen Angriff des dargestellten Hammerheads an der korrespondierenden mRNA. Selbstverständlich ist auch eine andere Ziel- sequenz für den Hammerhead Angriff möglich, ebenso wie andere Positionen gleicher Zielsequenzen. Das Hammerhead läßt sich hieran durch den Fachmann unschwer anpassen. Wesentlich ist lediglich, daß die Translation einer aktiven Kinasedomäne reduz- iert oder unterdrückt wird.

Claims

27
Patentansprüche :
1) Nukleinsaure codierend für zumindest eine Teilsequenz einer Protein Kinase der mitogenen Signalis- ierungskaskade, wobei die Teilsequenz für eine
Bindungsstelle für ein die Glykolyse katalysierendes Enzym codiert, oder stille Mutation einer solchen Nukleinsaure oder mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisier- ende Nukleinsaure.
2) Nukleinsaure nach Anspruch 1 codierend für ein Protein oder Peptid enthaltend die Sequenz A-raf (587-606), insbesondere (602 - 603); oder stille
Mutation einer solchen Nukleinsaure oder mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleins ure.
3) Nukleinsaure nach Anspruch 1 oder 2 codierend für ein Protein oder Peptid bestehend aus der Sequenz A-raf (255 bis 587 - 606) oder stille Mutation einer solchen Nukleinsaure oder mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleins ure.
4) cDNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
5) Isolierter rekombinanter Vektor enthaltend eine Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 4. 28
6) Antisense Nukleinsaure oder Ribozym bindend an eine Nukleinsaure, insbesondere RNA, nach einem der An- Sprüche 1 bis 3.
7) Substanz mit einer Bindungsstelle für ein durch eine Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiertes Protein oder Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) deaktivierte, die Glykolyse katalysierende Enzme, b) inaktive Proteine oder Peptide, c) Aptamere.
8) Substanz nach Anspruch 7 in Form von einer Kinase- inaktiven Form von M2-PK.
9) Substanz nach Anspruch 8, wobei die Kinase-inaktive Form durch eine Mutation im Bereich der ADP- Bindungsstelle und/oder der ATP-Bindungsstelle, gebildet ist, insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "M2-PK K366M, R119C, T340M, Q377K, Kl6IM, K165M und mehrere dieser Mutationen" oder ausgewählt ist aus einer oder mehrerer Muta- tionen entsprechend korrespondierenden aber von M2-PK abweichenden Aminosäuren gemäß Ml-PK. 29
10) Verwendung einer Substanz nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Blockierung der Kooperation zwischen einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade und einem die Glykolyse katalysierenden Enzym, insbesondere der A-raf/M2-PK Kooperation.
11) Verwendung einer Substanz nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung von Krebserkrankungen.
12) Verwendung einer Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines hierdurch kodierten Proteins oder Peptids in einem screening Verfahren zur Ermittelung eines mit einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskette kooperierenden, die Glykolyse katalysierenden Enzyms.
13) Verwendung einer Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines hierdurch kodierten Proteins oder Peptids in einem screening Verfahren zur Ermittelung einer an einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskette bindenden, jedoch nicht die Glykolyse katalysierenden Stoffes.
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