WO2001096535A2

WO2001096535A2 - Nukleinsäure codierend eine bindungsstelle einer protein kinase der mitogenen signalisierungskaskade für ein die glykolyse katalysierendes enzym

Info

Publication number: WO2001096535A2
Application number: PCT/DE2001/002246
Authority: WO
Inventors: Ulf R. Rapp; Erich Eigenbrodt
Original assignee: Schebo Biotech Ag
Priority date: 2000-06-14
Filing date: 2001-06-14
Publication date: 2001-12-20
Also published as: EP1290189A2; AU7234301A; DE10029131A1; WO2001096535A3; US20040115631A1

Abstract

Die Erfindung lehrt eine Nukleinsäure codierend für zumindest eine Teilsequenz einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade, wobei die Teilsequenz für eine Bindungsstelle für ein die Glykolyse katalysierendes Enzym codiert, oder stille Mutation einer solchen Nukleinsäure oder mit einer solchen Nukleinsäure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleinsäure.

Description

Niederlande, 1988, Seiten 115 - 154, verwiesen. Während c-raf-1 im menschlichen Organismus praktisch ubiquitär ist, kommt A-raf natürlicherweise im wesentlichen in Geweben des Urogenitaltraktes und B-raf überwiegend im Cerebru und Testis vor. Für weiterführende Informationen und Literaturangaben hierzu wird im einzelnen auf das Dokument US-5,869,308 verwiesen.

Klassische biochemische Untersuchungen an Tumoren haben bereits vor längerer Zeit belegt, daß Tumore einem veränderten Metabolismus unterliegen. Wenn auch dieser veränderte Metabolismus nicht die fundamentale Ursache von Tumorerkrankungen ist, so hat er doch beachtlichen Einfluß auf das Verhalten eines dreidimensionalen Tumorgewebes. Typischerweise weist solches Tumorgewebe eine ausgeprägte Hypoxie, i.e. Mangel an Sauerstoff, auf aufgrund des in der Regel desorganisierten Wachstums von Blutgefäßen in dem Tumorgewebe. Dies macht deutlich, daß ein Anpassung an hypoxische Bedingungen ein wesentlicher Schritt im Tumorwachstum ist. Der anaerobe Umsatz von Glukose zwecks Energieerzeugung durch Glykolyse ist daher ein gemeinsames Merkmal der meisten Tumorgewebeaggregate. Bezüglich allgemeiner weiterführender Literatur hierzu wird auf die Literaturstelle C.V. Dang et al., TIBS 24:68-72, 1999, verwiesen. Pyruvatkinasen (PK) sind Schlüsselenzyme der Glykolyse und katalysieren die Umwandlung von Phosphoenolpyruvat in Pyruvat, die letzte Reaktion der Reaktionsfolge der Umwandlung von Glukose in Pyruvat, und spielen folglich eine wichtige Rolle in der Bildung von ATP aus ADP. Vier gewebespezifische Isoformen sind bekannt, PK Typ L, R, Ml und M2 (siehe E. Eigenbrodt et al . , Critical Reviews in Oncogenesis, Vol. 3, M. Perucho, Ed., CRC-Press, Boca Raton, Florida, Seiten 91 - 115, 1992) . M2-PK ist die embryonale Form und ersetzt alle anderen Formen in proliferier- enden Zellen und Tumorzellen (siehe G.E.J Staal et al . , Bioche ical and Molecular Aspects of Selected Cancers, T.G. Pretlow et al . , Eds . , Academic Press Inc., San Diego, 1, Seiten 313 - 337, 1991, sowie U. Brinck et al . , Virchows Archiv 424, Seiten 177 - 185, 1994) . M2-PK Protein der Ratte besteht aus 530 Aminosäuren und unterscheidet sich nur in einem Rest von humanem M2-PK (siehe T. Noguchi et al . , J. Biol. Chem., 261, Seiten 13807 - 13812, 1986, sowie K. Tani et al, Gene, 73, Seiten 509 - 516, 1988) . M2-PK ist ein glykolytisch.es E zym, welches in einer aktiven tetrameren und einer inaktiven dimeren Form vorliegt. Der Übergang zwischen beiden Formen reguliert letztendlich den glykolytischen Umsatz in Tumorzellen (siehe W. Zwerschke et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96, Seiten 1291 - 1296, 1999, sowie S. Mazurek et al . , J. Bioeneg. Biomenibr., 29, Seiten 315 v- 330, 1997) . Die Aktivität von M2-PK kontrolliert also den Transit des glykolytischen Pfades und bestimmt somit den relativen Anteil an Glukose, welche in den Synthe- seprozeß gechannelt oder für glykolytische Energieerzeugung verwendet wird. Die Überexpression von M2-PK erlaubt Zellen das Überleben unter Bedingungen mit niedrigem Sauerstofflevel, da oxidative Phospho- rylisierung für die Produktion von ATP durch PK nicht benötigt wird. Generell wird in bösartigen Tumoren und in dem Blut von Tumorpatienten eine erhöhte Menge an M2-PK gefunden. Bekannt ist eine Bindung von A-raf an H-ras, MEK und CK2ß (siehe A.B. Vojtek et al . , Cell, 74, Seiten 205 - 214, 1993, und X. Wu et al . , J. Biol . Chem. , 271, Seiten 3265 - 3271, 1996, und B. Boldyreff et al . , FEBS Lett., 403, Seiten 197 - 199, 1997, sowie C. Hagemann et al . , FEBS Lett., 403, Seiten 200 - 202, 1997) . Ebenso bekannt ist eine Bindung von B-raf und c-raf-1 an Mitglieder der 14-3-3 Familie (siehe B. Yamamori et al., J. Biol. Che ., 270, Seiten 11723 - 11726, 1995, und C. Papin et al., Oncogene, 12, Seiten 2213 - 2221, 1996, und E. Freed et al . , Science, 265, Seiten 1713 - 1716, 1994, sowie K. Irie et al, Science, 265, Seiten 1716 - 1719, 1994) . Es ist auch vermutet worden, daß 14-3-3 Proteine ebenso an A-raf binden, da die Bindungsstellen in allen raf-Isoformen hoch konserviert sind (siehe G. Daum et al., Trends Bioche . Sei., 19, Seiten 474 - 480, 1994). Eine direkte Bindung von A-raf oder anderen Elementen der mitogenen Signalisierungskaskade an Faktoren der me- tabolischen Regulation ist dagegen unbekannt.

Technisches Problem

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, einen Ansatz zur Hemmung des anaeroben Stoffwechsels in Tumorzellenverbänden zu finden, und daran anschließend Wirkstoffe zu finden, die das Wachstum von Tumorzeil erbänden zumindest verlangsamen bzw. Apoptose in solchen Tumorzellverbänden aufgrund von unzureichender Energieerzeugung in Tumorzellen fördern. Der Erfindung zugrundeliegende Erkenntnis.

Mittels eines Two-Hybrid Systems und unter Verwendung von A-raf als bait ("Köder") wurde eine PC12 cDNA- library gescreent. Unter anderem wurde dabei M2-PK als ein Bindungspartner für A-raf gefunden. Mit weiteren Experimenten wurde gefunden, daß die Kooperation zwischen A-raf und M2-PK zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen der dimeren und der tetrameren M2-PK Formen zu Gunsten der tetrameren, also aktiven Form, führt. Somit ist A-raf Teil des glykolytischen Enzym Komplexes. Transformation von NIH 3T3 Zellen durch A-raf führt zu einer Zunahme im Phosphoserin Gehalt des M2-PK Proteins im Zusammenhang mit der Verschiebung des genannten Gleichgewichts.

Es wurde damit zu ersten Mal demonstriert, daß ein Onkogen der mitogenen Signalisierungskaskade zudem auch direkt auf ein die (anaerobe) Glykolyse katalysierendes Enzym wirkt, und zwar verstärkend und somit tumorwachstumsfördernd. Ein solcher Synergismus ist überraschend und es steht zu erwarten, daß durch Hemmer der Wechselwirkung gleich mehrere positive Ef- fekte im Rahmen einer Tumortherapie erzielt werden können.

Zwar sind Wechselwirkungen von Oncoproteinen, aufweisend völlig andere physiologischen Mechanismen, mit M2-PK bekannt, so beispielsweise pp60^v"src Kinase oder HPV 16 Oncoprotein E7, welche zu einer Verschiebung des tetramer/dimer-Verhältnisses führen. Diese haben aber eine Verschiebung in Richtung auf Di er und folglich reduzierender Aktivität zur Folge, im Gegensatz zu A-raf.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft zunächst eine Nukleinsaure codierend für zumindest eine Teilsequenz einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade, wobei die Teilsequenz für eine Bindungsstelle für ein die Glykolyse katalysierendes Enzym codiert, oder stille Mutation einer solchen Nukleinsaure oder mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleinsaure. Der Begriff der Nukleinsaure umfaßt insbesondere DNA, RNA und PNA. Ebenfalls subsumiert unter den Begriff sind doppelsträngige Nukleinsäuren sowie einzelsträngige Nukleinsaure und folglich auch zueinander komplementäre Nukleinsäuren. Stille Mutationen meint Varianten in der Sequenz, die zu keinem funktionalen Unterschied, bezogen auf die

Bindungsstelle für ein die Glykolyse katalysierendes Enzym, der Variante gegenüber der natürlichen, nicht mutierten Sequenz führen. Stille Mutationen können Allele oder künstliche Mutationen sein. Derivate fallen ebenfalls unter die Erfindung. Derivate sind nicht-natürliche chemische Modifikationen.

Mittels solchen Nukleinsäuren kann beispielsweise nach Kooperationspartnern der Protein Kinase der mitogenen Singnalisierungskaskade im Bereich der die Glykolyse katalysierenden Enzyme gesucht werden. Gleichfalls kann nach Inhibitoren für den Bindungsstellen gesucht 7

werden. Erfindungsgemäße Nukleinsäuren sind daher letztendlich insbesondere als Sreening Tool brauchbar.

Bevorzugt ist eine Nukleins ure codierend für ein Pro- tein oder Peptid enthaltend die Sequenz A-raf

(587-606) oder stille Mutation einer solchen Nukleinsaure oder mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleinsaure. Bevorzugterweise handelt es sich im Rahmen der Erfindung um human A-raf. Zu Forschungszwecken kann es sich aber auch um A-raf von nicht menschlichen Säugetieren handeln. Die Sequenz 587-606, insbesondere 602 - 603, wurde als Bereich identifiziert, wo die Bindungsstelle für die Glykolyse katalysierenden Enzyme liegt. Eine erfindungsgemäße Nukleinsaure kann gegenüber der vollen Sequenz von A-raf verkürzt sein, und zwar insbesondere am N-terminalen Ende. Sie codiert dann für ein Protein oder Peptid bestehend aus der Sequenz A-raf (255 bis 587 - 606) oder stille Mutation einer solchen Nukleinsaure oder mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleins ure. Mit anderen Worten ausgedrückt, die Sequenz kann in dem Bereich liegen, der begrenzt wird durch die Sequenzen (255 - 606) und (587 - 606) .

Weiterhin lehrt die Erfindung eine cDNA des vorstehenden Aufbaus sowie einen isolierten rekombinanten Vektor enthaltend eine Nukleinsaure des vorstehenden Aufbaus bzw. ein Expressionsplasmid mit dieser Nuk- leinsäure. Hierbei kann zwecks stabiler Expression ein für ein geeignetes virales Protein codierendes DNA Fragment, beispielsweise gag, mit eingesetzt sein (Fusion gag mit beispielsweise A-raf bzw. A-raf Fragment) . Mittels des Expressionsplasmids läßt sich eine Transfor ante bilden, welche wiederum zur Herstellung des durch die Nukleinsaure codierten Proteins bzw. Peptids verwendet werden kann. Hierzu wird die Transformante nach üblichen Methoden auf geeignete Weise kultiviert.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine antisense Nukleinsaure oder Ribozym bindend an eine beispiel- sweise oncogene Nukleinsaure, insbesondere RNA, codierend für eine Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade. Mittels einer solchen Substanz kann die Expression von beispielsweise A-raf unterdrückt werden mit der Folge einer Hemmung der (anaero- ben) Glykolyse in dem Tumorgewebe. Prinzipiell gleiches kann erreicht werden mit einer Substanz mit einer Bindungsstelle für ein durch eine erfindungsgemäße Nukleinsaure codiertes Protein oder Peptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) deak- tivierte, die Glykolyse katalysierende Enzme, b) inaktive Proteine oder Peptide und c) Aptamere.

Im Falle eines Ribozyms kann es sich beispielsweise um ein Hammerhead Ribozym handeln, welches innerhalb der Kinasedomäne einer raf Isoform m-RNA beispielsweise bei einer GTC Stelle angreift. Dabei kann das Hammerhead auch vor out of frame ATG Startcodons angreifen, der Kinasedomäne angreifen. Diese lassen Translation einer aktiven Kinasedomäne aus der erzeugten fragmen- tären RNA extrem unwahrscheinlich werden.

Dies kann insbesondere eine Kinase-inaktiven Form von M2-PK sein, vorzugsweise von human M2-PK. In diesem Fall kann die Kinase-inaktive Form durch eine Mutation im Bereich der ADP-Bindungsstelle und/oder der ATP- Bindungsstelle, gebildet sein, insbesondere ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "M2-PK K366M, R119C, T340M, Q377K, K161M, K165M und mehrere dieser Mutationen" . Der Ausdruck der Kinase-inaktiven Form umfaßt auch in der Kinase Aktivität gegenüber normaler M2-PK lediglich reduzierte Formen. Inaktive Mutanten eignen sich generell deshalb zur Auslösung von Apoptose der Tumorzellen, weil damit ein Abfall der ATP- und ADP- Spiegel erreicht wird. Als natürliche Mutante kommt auch Ml-PK in Frage. Ml-PK wird in allen nicht prolif- erierenden Zellen exprimiert. In M2-PK exprimierenden Zellen trit bei zusätzlicher Expression von Ml-PK durch konkurriernde Reaktionen eine Hemmung der Zell- proliferation ein. Ml-PK und M2-PK sind unterschiedliche Splicing-Produkte, wobei nur ein Exon mit 51 Aminosäuren ausgetauscht ist. Ml-PK und M2-PK unterscheiden sich in insgesamt nur 21 Aminosäuren. Ml-PK wird nicht phosphoryliert . Hiermit können durch Sequenzvergleich mit M2-PK Phosphorylierungsstellen abgeleitet werden. Im Ergebnis werden jedenfalls nicht phosphorylierbare M2-PK-Mutanten als tumorsupprimerend und proliferationshemmend wirken. Solche Mutanten er- geben sich unmttelbar aus dem folgenden Sequenzvergleich, in welchem potentielle Phosphorylierungsstellen angegeben sind. Folglich sind insbesondere solche M2-PK Mutanten einsetzbar, welche zumindest an zumindest einer der markierten Stellen entsprechend dem Sequenzvergleich mutiert ist. Alternativ oder zusätzlich können an Stellen anderer Abweichungen in dem Sequenzvergleich eine oder mehrere Mutationen (in beliebigen Permutationen) eingerichtet sein. 10

M2 : ³⁸⁰Ile-Ala-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-Ala-Ile-Tyr-His-Leu-Gln- eu-Phe-Glu-Glu

P

Ml : Ile-Ala-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-Ala-Val-Phe-His-Arg-Leu-Leu-Phe-Gl -Glu

M2 : Leu-Arg-Arg-Leu-Ala-Pro-Ile-Thr-Ser-Asp-Pro-Thr-Glu-Ala-Ala-Ala-Val

P P

Ml : Leu-Ala-Arg-Ala-Ser-Ser-Gln-Ser-Thr-Asp-Pro-Leu-Glu-Ala-Met-Ala-Met

414

M2 : Gly-Ala-Val-Glu-Ala-Ser-Phe- ys-Cys-Cys-Ser-Gly-Ala-Ile-Ile-Val-Leu Ml : Gly-Ser-Val-Glu-Ala-Ser-Tyr- ys-Cys-Leu-Ala-Ala-Ala-Leu-Ile-Val-Leu

431

M2 : Thr- ys-Ser

Ml : ⁴³¹Thr-Glu-Ser

Im Falle der Aptamere empfiehlt es sich, diese gegen nukleinsäurespaltende Enzyme zu stabilisieren. Im

Falle der Proteine bzw. Peptide handelt es sich um für die Bindungsstelle des durch die erfindungsgemäße Nukleinsaure codierten Proteins bzw. Peptids "geschneiderte" hochspezifische synthethische Moleküle.

Wegen der die Glykolyse hemmenden Wirkung der vorstehenden Substanzen ist Teil der Erfindung auch deren Verwendung zur Blockierung der Kooperation bzw. Bindung zwischen einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade und einem die Glykolyse katalysierenden Enzym, insbesondere der A-raf/M2-PK Kooperation, sowie deren Verwendung zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung von Krebser- krankungen, beispielsweise des Urogenitaltraktes. Mit einer solchen Blockierung wird vermutlich gleichzeitig die mitogene Signalisierungskaskade blockiert und somit ein synergistischer Effekt erzielt. 11

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsaure oder eines hierdurch kodierten Proteins oder Peptids in einem screen- ing Verfahren zur Ermittelung eines mit einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskette kooperierenden, die Glykolyse katalysierenden Enzyms. Hierzu werden zunächst bekannte oder unbekannte die Glykolyse katalysierende Enzyme identifiziert und ggf. isoliert und charakterisiert. Diese werden dann Versuchen beispielsweise gemäß der Ausführungsbeispiele unterworfen, wobei eine Wechselwirkung mit einer oder mehrerer raf Isoformen untersucht wird. Wird eine Wechselwirkung detektiert, so wird dieses Enzym selek- tiert. Ggf. kann aus dem selektierten Enzym ein inaktives Enyzm geschaffen werden (inaktiv = geringere oder keine die Glykolyse katalysierende Wirkung im Vergleich zum unmodifizierten Enzym) . Auch kann des weiteren die Bindungsstelle des die Glykolyse kata- lysierenden Enzyms bestimmt werden und ein Peptid oder eine Mi ikrisubstanz hierfür geschaffen werden, welches an gleicher Stelle der raf Isoform bindet. Es lehrt die Erfindung schließlich die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsaure oder eines hierdurch kodierten Proteins oder Peptids in einem screening Verfahren zur Ermittelung einer an einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskette bindenden, jedoch nicht, die Glykolyse katalysierenden Stoffes. Hierbei werden Stoffe mit prospektiven Bindungsstellen für die raf Isoform Bindungsstelle mit einem die Glykolyse katalysierenden Enzym einem Bindungstest, beispielsweise gemäß der Ausführungsbeispiele unterworfen und jene Substanzen selektiert, die binden. Es 12

ist möglich, hieran anschließend oder zuvor die Inak- tivität der prospektiven Substanzen hinsichtlich der die Glykolyse katalysierenden Wirkung zu testen.

In der erstgenannten Verwendung können weitere

Bindungspartner in gesundem oder krankem Gewebe gefunden werden. In der letztgenannten Verwendung können Inhibitoren der normalerweise in gesundem oder krankem Gewebe stattfindenden Bindungsprozesse gefunden werden.

Die Erläuterungen für eine Anspruchskategorie der Erfindung gelten entsprechend für andere Anspruchskategorien. Die Erfindung betrifft letztendlich auch Heilverfahren, beispielsweise klassisch durch geeignete Verabreichung von pharmazeutischen Präparaten aber auch gentherapeutisch, mittels welcher eine oder mehrere Substanzen gemäß der Ansprüche 6 bis 9 in eine Zielzelle eingebracht oder in der Zielzelle erzeugt werden.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich Ausführungsbeispiele darstellenden Figuren und Experimenten näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1: spezifische Wechselwirkung von A-raf und M2-PK in einem Two-Hybrid binding assay,

Fig. 2: Isoelektrische Fokussierung von M2-PK in Kon- trollzellen und in A-raf transformierten NIH 3T3 Zellen, 13

Fig. 3: Isoelektrische Fokussierung des glycolytischen Enzym Komplexes in A-raf transformierten NIH 3T3 Zellen,

Fig. 4: Inhibierung der Transformation von NIH 3T3

Zellen mittels Kinase inaktivem M2-PK K336A.

Fig. 5: Sequenzen von raf Isoformen im Vergleich, mit Markierung des Starts der Kinasedomäne, einer ersten GTC für einen Hammerhead Angriff, sowie von ATG Startcodons, sowie Darstellung eines für die mRNA geeigneten Hammerheads.

Beil. 1: DNA Sequenz von Ratten Ml-PK und M2-PK,

Beil. 2: DNA Sequenz von human v-raf,

1 : Methoden

1.1: Plasmid Konstruktion

Die Two-Hybrid Vektoren pPC86 und pPC97 wurden von D. Nathans zur Verfügung gestellt (siehe auch: P.M. Chevrey & D. Nathans, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, Seiten 5789 - 5793, 1992) . Vollängen A-raf, B-raf und c-raf-1 cDNA wurden in Fusion mit der Gal4 DNA Bindungsdomäne in pPC97 subkloniert. Die PC12 cDNA library wurde in Fusion mit der Gal4 Aktivierungs- domäne in pPC97 subkloniert. Die Klonierung der A-raf Deletionskonstrukte ist in C. Hagemann et al . , FEBS Lett., 403, Seiten 200 - 202, 1997, ausführlich beschrieben worden. A-raf (554 - 606) wurde unter 14

Verwendung der Primer 5' -CTC AAG TTG TCG ACG GAG GAG CGG CCC CTC TTC-3' (upstream, unter Einführung einer SalL site) und 5'-GTG GCT TGG CGG CCG CCT AAG GCA CAA G-3' (downstream, unter Einführung einer Notl site).

Das HA-tag und das untranslatierte 5' Ende des "geangelten" M2-PK (Klon 71) wurden dadurch entfernt, daß ein neues Sall site mittels des site-gerichteten Mutagenesis Kits von Stratagene erzeugt wurde, und daß die resultierende pPC86-M2-PK mit Sall verdaut wurde und Plas id-Religation. Dies resultierte im Plasmid pPC86-PK. Für die Expression in E. coli und in Säugetierzellen wurde M2-PK cDNA als EcoRI Fragment aus pPC86 (Klon 71) isoliert, zu pGEX-2T ligiert sowie pcDNA3 verdaut mit EcoRI. Die untranslatierte Region wurde durch Einführung einer BamHI site (Mutagenesis Kit Stratagene) und Entfernung des BamHI Fragments aus diesem Konstrukt entfernt. Das 3' Ende der codierenden Region der M2-PK cDNA wurde mittels PCR aus der PC12 library isoliert unter Verwendung der Primer 5'-GCC CGG TAC CGC CCA AGG GCT C-3' (sense) und 5'-CCA GGG CTG GGA ATT CTC TGG-3' (antisense) . Vollängen M2-PK wurde durch Subklonierung des PCR Produkts Kpnl/EcoRI in pGEX-M2-PKΔBam und pcDNA-M2-PKΔBam, respektive, erzeugt, resultierend in Plasmiden pGEX-M2-PK und pcDNA3-M2-PK.

pPC97-A-raf AA602/603RP, pcDNA3-M2-PK K366M und pGEX-2T-M2-PK K366M wurden mittels des Mutagenesis Kits von Stratagene hergestellt.

1.2: Two-Hybrid library screening 15

Hefekulturen wurden bei 30°C unter Standardbedingungen in flüssigem oder festem Medium basierend auf entweder YPD oder minimal SD Medium gezogen.

Die Hefe Linie HF7c wurde sequenziell transformiert mit zunächst dem "Köder"-Plasmid und dann der cDNA library. Transformanten wurden gezogen auf SD Medium unter Fehlen der Aminosäuren Leucin, Tryptophan und Histidin. Nach 4 Tagen wurden die wachsenden Klone auf Aktivierung des lacZ reporter Gens in einem ß-Gal Fil- terassay getestet. Positive Klone wurden weiter untersucht durch Retransformierung des isolierten library-Plasmids zusammen mit verschiedenen "Köder"- Plasmiden in HF7c. Klone, welche nur in der Gegenwart von raf einen ß-Gal positiven Phenotyp zeigten, wurden als positiv bewertet und weiter untersucht durch Sequenzierung und Kolonie-Hybridisierung. Für direkte Wechselwirkungstests wurde die Hefelinie HF7c mit A- raf Deletionskonstrukten und pPC86-M2-PKΔSal cotransformiert .

Allgemeine Informationen zum Two-Hybrid Vektorsystem bzw. Varianten hierzu könen der Literaturstelle Bio- spektrum, 3/95, S. 12-14, sowie der dort genannten Literatur entnommen werden.

1.3: Zellkulturen

Die NIH 3T3 Zellen wurden unter Standardbedingungen (37°C, 5% C0₂) in DMEM (Life Technologies, Inc.), sup- plementiert mit 10% hitzeinaktiviertem fetal bovine 16

serum (Hyclone) , 168 mM L-Glutamin (Life Technologies, Inc.) und 100 units/ml Streptomycin und Penicillin (Life Technologies, Inc.) gezogen.

1.4: Focus Formierung und colony yield assay

7 x 10⁴ NIH 3T3 Zellen und 1,5 x 10⁵ NIH 6A-leuk Zellen (stabil gag-A-raf expri ierend, siehe M. Huleihel, Mol. Cell. Biol., 6, Seiten 2655 - 2662, 1986) wurden in 90 mm Gewebekultur Schalen einen Tag vor der Trans- fektion gesäht. Die Transfektionen wurden mittels der Lipofecta in Methode (Life Technologies, Inc.) und entsprechend der Herstelleranweisungen ausgeführt. Focus Formierung wurde 10 Tage später gescored. Trans- fizierte Kulturen wurden zwecks besserer Visualisierung der transformierten Foci mittels 0,4% Kristallviolett gefärbt. Für das colony yield assay wurden Zellen wie oben beschrieben gesäht und für 10 Tage in selektivem Medium enthaltend 450 μg/ml G418 (Geneticin; GIBC0 BRL siehe auch U.R. Rapp, Oncogene, 9, Seiten 3493 - 3498, 1994) kultiviert.

1.5: Isoelektrische Fokussierung glykolytischer Enzyme.

Kontrollzellen NIH 3T3 und A-raf transformierte NIH 3T3 Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von 3,5 x 10⁵ Zellen/Schale kultiviert. Für jedes Fokussierungs- experiment wurden 26 x 10⁶ Zellen in 3 ml Lysispuffer mit einer niedrigen Salzkonzentration (lOmM Tris, ImM NaF, ImM EDTA-Na₂ und ImM Mercaptoethanol, pH 7,4) 17

extrahiert zwecks Erhalt des glykolytischen Enzym Komplexes und dann für 20 min. bei 40.000 g zentrifugiert zur Entfernung von Zellfeststoffen. Homogenate wurden der isoelektrischen Fokussierung unterworfen und Enzym Aktivitäten wurden, wie vorbeschrieben (siehe S. Mazurek, J. Cell. Physiol., 167, Seiten 238 - 250, 1996), in individuellen Fraktionen bestimmt.

1.6: Gelfiltration-Analyse von M2-PK.

Extrakte von Kontrollzellen NIH 3T3 und stabil gag-A- raf exprimierenden NIH 3T36A Zellen wurden wie in W. Zwerschke, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96, Seiten 1291 - 1296, 1999, beschrieben hergestellt.

1.7: Immunologische Detektion von M2-PK, A-raf, c-raf, MEK1, Phosphoserin und Phosphothreonin.

Die individuellen Fraktionen der Fokussierungsexperi- mente oder Gelfiltrationsexperimente wurden 1:10 mit sample Puffer verdünnt. Nach Trennung auf einem 10% SDS Polyacrylamid Gel wurden die Proteine auf eine Nitrocellulose Membran mittels Electroblotting tran- ferriert. Zur Detektion der verschiedenen Antigene wurden die folgenden Antikörper benutzt: M2-PK: onok- lonale Antikörper DF4 (ScheBo Tech, Giessen, Deutschland) ; A-raf: polyklonale Antikörper, welche gegen 12 C-terminale Reste von A-raf representierende synthetische Peptide gezogen wurden (siehe C. Hagemann et al., FEBS Lett. 403, Seiten 200 - 202, 1997); gag- A-raf : Ziegenserum erzeugt gegen p30^gag (siehe M. Huleihel, Mol. Cell. Biol., 6, Seiten 2655 - 2662, 1986) ; c-raf : monoklonale Antikörper (Dianova, Hamburg, Deutschland; MEK und ERK: monoklonale Antikörper (Transduction Laboratories) ; p-Serin, p-Threonin und p-Tyrosin: monoklonale biotinylierte Antikörper (Sig a, Deisenhofen, Deutschland) .

1.8: Bestimmung der Metabolitkonzentrationen.

Fructose 1, 6-bisphosphat, Pyruvat und Phosphoenolpyru- vat Konzentrationen wurden in Perchlorsäure-Extraten der Zellen bestimmt, wie in S. Mazurek et al . , J. Biol. Chem. 272, Seiten 4941 - 4952, 1997, beschrie- ben. Gemäß dieser Literaturstelle wurden auch die Konzentrationen von Glucose, Glutamin, Glutamat und Lactat in den Zeilüberständen bestimmt zwecks Bestimmung der Flußraten.

2. Identifizierung Charakterisierung der Wechselwirkung A-raf mit M2-PK mittels des Two Hybrid binding assay.

Mittels des Two-Hybrid Systems wurden 3,3 x 10⁷ Klone einer Ratten Pheochromocytoma PC12 cDNA library unter Verwendung von A-raf als "Köder" gescreent. 73 Klone zeigten einen Histidin und LacZ positiven Phenotypus . Diese Klone wurden weiter untersucht durch colony- hybridization und Sequenzierung. Sie codieren H-ras (1 Klon), MEK-2 (3 Klone), 14-3-3ß (5 Klone), 14-3-3ζ (15 Klone), 14-3-3ε/η (11 Klone), 14-3-3Θ (7 Klone), CK2ß (26 Klone) und M2-PK (1 Klon) . Vier verbleibende Klone 19

sind noch zu untersuchen. Mit Ausnahme von M2-PK sind die vorstehenden Wechselwirkungen bekannt und dienen insofern als Beleg für die Funktionsfähigkeit des verwendeten Systems (Expression und Faltung) . Die erstma- 5 lig festgestellte Wechselwirkung von A-raf mit einem die Glykolyse katalysierenden Enzym, nämlich M2-PK, bildet die Grundlage der Erfindung.

Der isolierte Klon representiert eine Teilsequenz, 10 welche einen Teil der untranslatierten Region vor dem N-Terminus enthält und dem 29 Aminosäuren am C.Terminus fehlen (M2-PK (1 - 501)).

Bei Versuchen mit c-raf-1 und B-raf als "Köder" waren

15 keine M2-PK Klone isolierbar, was eine A-raf isozym- spezifische Wechselwirkung belegt. Mittels deletion mapping konnte gezeigt werden, daß die Wechselwirkung innerhalb einer sehr C-terminalen Domäne von A-raf erfolgt, da Wechselwirkung von M2-PK mit A-raf (255 -

20 606) und A-raf (554 - 606) festgestellt werden konnte, nicht jedoch mit A-raf (255 - 587) . Hierzu wird im Einzelnen auf die Figur 1 a verwiesen. Die festgestellte wechselwirkende variable Region ist nicht konserviert zwischen verschiedenen raf-Isoformen der

25 Säugetiere, was in Übereinstimmung mit der beobachteten isozymspezifischen Bindung von M2-PK in den Two Hybrid Tests ist und auch eine Erklärung hierfür bieten könnte. Um die Exakte Bindungsdomäne zu bestimmen wurde der Mutant A-raf AA602/603RP generiert, in

30 welchem die vermuteten Bindungstellen durch die entsprechenden c-raf-1 Aminosäuren ausgetauscht wurden, und dann einem direkten Two Hybrid Test unterworfen. In der Fig. 1 b erkennt man, daß mit dieser Mutation 20

jegliche Wechselwirkung verschwunden war, was belegt, daß die A-raf spezifischen Bindungsstellen verantwortlich sind für die Spezifität der Wechselwirkung mit M2-PK.

3: Untersuchung des Effekts der Wechselwirkung A-raf mit M2-PK auf die metabolische Regulation.

Der Übergang der inaktiven dimeren in die aktive te- tramere Form von M2-PK bestimmt den glykolytischen Fluß in Tumorzellen. Zwecks Untersuchung eines eventuellen Effekts der Wechselwirkung A-raf mit M2-PK hierauf in vivo wurden isoelektrische Fokussierungsex- perimente durchgeführt. Zwei Peaks konnten getrennt werden für die tetramere Form (Fraktionen 35 - 42) und die di ere Form (Fraktionen 43 - 47) , wie in der Figur 2 ersichtlich. Im Gegensatz zur dimeren Form hat die tetramere Form eine hohe Affinität zu seinem Substrat Phosphoenolpyruvat (PEP) . In Übereinstimmung mit den differentiellen Substrataffinitäten wurde gefunden, daß die tetramere Form gleich aktiv ist bei hohen (2 itiM) und niedrigen (0,2 mM) PEP Konzentrationen, während die dimere Form weniger aktiv ist bei niedri- gen Konzentrationen (Fig. 2) .

In der Figur 2 sieht man im einzelnen die Bestimmung der M2-PK Aktivität in der Gegenwart von 2 mM und 0,2 mM PEP in den verschiedenen Fraktionen (oberer Teil) sowie die Bestimmung von M2-PK, p-Serin und p-Threonin durch direktes Immunoblotting nach SDS Gelelektrophorese der verschiedenen Fraktionen. 21

Transformation von NIH 3T3 Zellen durch stabile Expression einer Fusion zwischen der A-raf-Kinase Domäne mit viralem gag-Protein (gag-A-raf; siehe M. Huleihel et al., Mol. Cell. Biol., 6, Seiten 2655 - 2662, 1986) führte zu selektivem Anstieg der tetrameren Form (Menge der Tetrameren in Kontrollzellen: 69%; nach A-raf Transformation: 76%) , wozu auf die Figur 2 verwiesen wird.

Die Figur 3 zeigt im oberen Teil die Bestimmung der Aktivitäten von Pyruvat Kinase (Kreise) und Phospho- glyceromutase in den verschiedenen Fraktionen, pl Werte für einige Fraktionen sind als Bezug angegeben. Im unteren Teil ist die Detektion von A-raf, gag-A- raf, M2-PK und MEK 1 durch direktes Immunoblotting nach SDS Gelelektrophorese der verschiedenen Fraktionen. Man entnimmt zunächst, daß die tetramere Form von M2-PK mit Enolase, Glyceraldehyd 3-phosphatde- hydrogenase (nicht gezeigt) und einem Teil von Phos- phoglyceromutase Typ B cofokussiert. A-raf und c-raf fukussieren in dem glykolytischen Enzym Komplex in Fraktionen 35 - 37 und gag-A-raf in Fraktionen 40 - 44. Eine proteolytisch modifizierte Form von gag-A-raf mit einem Molekulargewicht zwischen 45 und 50 kDa fokussierte in den Fraktionen 39 - 42 (nicht dargestellt) . MEK 1 und MEK 2 , die Substrate der raf Kinasen fokussierten beide in den gleichen Fraktionen 34 - 45 des glykolytischen Enzym Komplexes. Der Großteil von ERK 1 und ERK 2, die Substrate von MEK, fokussierten außerhalb des glykolytischen Enzym Komplexes in den Fraktionen 32 - 35 (nicht gezeigt) . 22

M2-PK, A-raf, gag-A-raf, c-raf, MEK und ERK wurden mit den unter Methoden angegebenen Antikörpern detektiert.

Die immunologisch detektierbare Menge von M2-PK Pro- tein und die Mengen von Phosphoserin und Phos- phothreonin an dem M2-PK Protein wurden densitrometrisc mittels des Scion Image Programms (Beta 3B-Version, Scion Corporation) bestimmt. Im Vergleich zu Kontrollzellen nahm der Gesamtgehalt an M2-PK Protein 1,3-fach in A-raf transformierten Zellen zu, während der Phosphoserin Gehalt des M2-PK Proteins 2,6-fach und jener des Phosphothreonin 1,2-fach zunahm. Das Verhältnis zwischen Phosphoserin und M2-PK Protein nahm von 0,7 in Kontrollzellen auf 1,3 in A- raf transformierten Zellen zu. Das Verhältnis für Phosphothreonin war dagegen unverändert. Der höchste Phosphorylisierungsgrad wurde in den Fraktionen 35 - 38 gefunden, in welchen auch A-raf und c-raf lagen. Hieraus folgt, daß A-raf Transformation selektiv den Phosphoserin Gehlat des M2-PK Proteins erhöht. Der gleiche Anstieg im Phosphorylisierungsgrad und Gehalt an M2-PK Protein wurde auch in andern Tumor Zellinien, wie pp60^v_src transformierten NIH 3T3 Zellen und Glioma Zellinien, gefunden.

In einem weiteren Experiment wurde der glykolytische Komplex durch Extraktionen der Zellen mit hohen Phosphatkonzentrationen und wurde das Verhältnis zwischen der tetrameren und der dimeren Form von M2-PK direkt mittels Gelpermeation bestimmt. In Übereinstimmung mit den Daten der isoelektrischen Fokussierung zeigte die Gelpermeation auch eine Verschiebung der dimeren Form zur tetrameren Form in A-raf transformierten Zellen 23

(tetramere Form in Kontrollzellen: 77%; in A-raf transformierten Zellen: 87%) . In A-raf transformierten Zellen war die Intensität der Phosphoserin-Färbung von tetramerem M2-PK stärker als in Kontrollzellen.

In völliger Übereinstimmung mit den Veränderungen der M2-PK Aktivität wurde gefunden, daß A-raf Transformation die glycolytische Flußrate erhöht (siehe Tab. 1) . Gleichzeitig wurde eine Abnahme der Fructose 1, 6-bisphosphat Niveaus von 63,8 + 13,1 (4) nmol/mg Protein in Kontrollzellen auf 39,5 + 13,6 (5) nmol/mg Protein (x + SD, p<0,050) gefunden. Pyruvat Niveaus nahmen von 6,9 + 0,9 (4) nmol/mg Protein in Kontrollzellen auf 9,3 + 2,7 (5) nmol/mg Protein in A-raf transformierten Zellen zu (x + SD, p<0,054) . Phosphoenolpyruvat Konzentrationen wurden nicht signifikant geändert .

Ob die metabolischen Änderungen essentiell für die Transformation und Proliferation der Zellen war, wurde in Überexpressionsexperimenten untersucht. NIH 3T3 Zellen wurden mit gag-A-raf und M2-PK cDNA trans- fiziert und die Fokusbildung nach 10 Tagen Kultivierung untersucht (Tabelle 2) . Während A-raf Transfektion nur zur Bildung von 2 Foci je 1 μg trans- fizierter DNA führte, ergab die Cotransfektion eine Zunahme der Anzahl auf 6 Foci je 1 μg DNA, was für einen kooperativen Effekt von A-raf und M2-PK in der Zelltransformation spricht. Um zu prüfen, ob eine ho- cheffiziente Transformation durch A-raf M2-PK erfordert, wurde eine Kinase-inaktive Form von M2-PK, M2-PK K366M, mutiert an der vermuteten ADP Bindungsstelle, eingesetzt, in der Hoffnung damit einen inhibierenden 24

Mutanten zu erhalten, welcher die A-raf M2-PK Kooperation bzw. Bindung hemmt. Dieser Mutant hat tatsächlich die Eigenschaft die Focusformation in NIH 3T3 Zellen vollständig zu unterdrücken. In einem colony yield assay ergab sich, daß der M2-PK K366M Mutant die Bildung von Kolonien stabil A-raf exprimierender NIH 6A-leuk Zellen reduziert, so daß unter G418 Selektion nur 18 Kolonien je 1 μg transfizierter DNA wuchsen, während wildtype M2-PK Expression im Wachstum von 75 Kolonien je 1 μg DNA resultierte (Tabelle 1) . Weiterhin war Wachstum unter wildtype M2-PK in der Lage die transformierte Morphologie von NIH 3T3 Zellen zu fördern, während M2-PK K366M dies nicht zeigt, sondern faktisch die morphologische Transformation durch A-raf antagonisierte. Die Zellen zeigten nämlich einen eher flachen, weniger refraktilen Phenotypus, wie in der Figur 4 zu erkennen (Leervektor: pcDNA3) . Protein Expression (M2-PK und A-raf) wurde in allen Experimenten mittels Western-blots kontrolliert (Daten nicht gezeigt) .

Tabelle 1

Metabolit Kontrolle A-raf Sign,

Glucose Verbr. 24,0.1,2(9) 57,5.1,2(9) p<0, 01 Lactat Prod. 52,5.1,0(10) 79,4.1,0(10) p<0, 001 Pyruvat Prod. 1,7.1,0(10) 4,2.1,0(10) p<0,001 Glutamin Verbr, 4,4.1,2(10) 11,5.1,2(10) p<0,01

x+SD 25

Glutamat Konvers 0,7+0,02 -1,1+0,02 p<0,001

Für die Kalkulation der Metabolit Konversion mußte die Abhängigkeit von der Zelldichte berücksichtigt werden. Für die Konversion von Glucose, Lactat, Glutamin und Pyruvat wurde eine logarithmische Transformation der Daten verwendet, da die Daten nach rechts verzerrt waren. x-.DF¹¹ ist die delogarithmisierte Form des arith- metischen Mittels und der Standardabweichung der zuvor logarithmisch transformierten Daten. Für die statistische Analyse wurde eine Einweg Analyse der Covarianz mit der Zelldichte als Covariable durchgeführt. Im Falle von Glutamat bedeuten positive Werte mittlere Produktion und negative Werte Verbrauch.

Tabelle 2

Metabolit Kontrolle A-raf Sign. Fructose 1, 6-bis- phosphat 63,8+13,1(4) 39,5+13,6(5) p<0,05

Pyruvat 6,9+ 0,9(4) 9,3+ 2,7 (5) p<0, 05

Phosphoenolpyruvat 0,3+ 0,3 (4) 0,9+ 0,8 (5)

ATP/ADP 3,1+ 0,9(4) 8,3+ 3,1 (4) p<0,05 AMP 7,6+ 2,1 (4) 1,8+ 1,5(4) p<0,01

IMP 4,2+ 2,3(4) 0,4+ 0,2 (4) p<0,05

Inosin 3,8+ 1,3 (4) 0,8+ 0,5(4) p<0, 01

Tabelle 3

Foci/μg DNA Kolonien/μg DNA 26

A-raf + Vektor 2 597+30

A-raf + PK-M2 6 576+30

A-raf + PK-M2 K366M 0 156+15

NIH 3T3 Zellen wurden mit A-raf, M2-PK und M2-PK K366M transfiziert in den angegebenen Kombinationen. Focus Bildung wurde nach 10 Tagen Wachstum bestimmt (linke Spalte) . Stbail gag-A-raf exprimierende NIH 6A-leuk Zellen wurden mit M2-PK und M2-PK K366M transfiziert. Kolonien überlebender Zellen wurden nach 10 Tagen G418 Selektion gezählt (rechte Spalte) . Vector = Leervector pcDNA3.

4.: Sequenzvergleich im Bereich Start der raf Kinase- domäne und Hammerhead.

Die Figur 5 zeigt ein erstes GTC für einen Angriff des dargestellten Hammerheads an der korrespondierenden mRNA. Selbstverständlich ist auch eine andere Ziel- sequenz für den Hammerhead Angriff möglich, ebenso wie andere Positionen gleicher Zielsequenzen. Das Hammerhead läßt sich hieran durch den Fachmann unschwer anpassen. Wesentlich ist lediglich, daß die Translation einer aktiven Kinasedomäne reduz- iert oder unterdrückt wird.

Claims

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Patentansprüche :

1) Nukleinsaure codierend für zumindest eine Teilsequenz einer Protein Kinase der mitogenen Signalis- ierungskaskade, wobei die Teilsequenz für eine

Bindungsstelle für ein die Glykolyse katalysierendes Enzym codiert, oder stille Mutation einer solchen Nukleinsaure oder mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisier- ende Nukleinsaure.

2) Nukleinsaure nach Anspruch 1 codierend für ein Protein oder Peptid enthaltend die Sequenz A-raf (587-606), insbesondere (602 - 603); oder stille

Mutation einer solchen Nukleinsaure oder mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleins ure.

3) Nukleinsaure nach Anspruch 1 oder 2 codierend für ein Protein oder Peptid bestehend aus der Sequenz A-raf (255 bis 587 - 606) oder stille Mutation einer solchen Nukleinsaure oder mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleins ure.

4) cDNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

5) Isolierter rekombinanter Vektor enthaltend eine Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 4. 28

6) Antisense Nukleinsaure oder Ribozym bindend an eine Nukleinsaure, insbesondere RNA, nach einem der An- Sprüche 1 bis 3.

7) Substanz mit einer Bindungsstelle für ein durch eine Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiertes Protein oder Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) deaktivierte, die Glykolyse katalysierende Enzme, b) inaktive Proteine oder Peptide, c) Aptamere.

8) Substanz nach Anspruch 7 in Form von einer Kinase- inaktiven Form von M2-PK.

9) Substanz nach Anspruch 8, wobei die Kinase-inaktive Form durch eine Mutation im Bereich der ADP- Bindungsstelle und/oder der ATP-Bindungsstelle, gebildet ist, insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "M2-PK K366M, R119C, T340M, Q377K, Kl6IM, K165M und mehrere dieser Mutationen" oder ausgewählt ist aus einer oder mehrerer Muta- tionen entsprechend korrespondierenden aber von M2-PK abweichenden Aminosäuren gemäß Ml-PK. 29

10) Verwendung einer Substanz nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Blockierung der Kooperation zwischen einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade und einem die Glykolyse katalysierenden Enzym, insbesondere der A-raf/M2-PK Kooperation.

11) Verwendung einer Substanz nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung von Krebserkrankungen.

12) Verwendung einer Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines hierdurch kodierten Proteins oder Peptids in einem screening Verfahren zur Ermittelung eines mit einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskette kooperierenden, die Glykolyse katalysierenden Enzyms.

13) Verwendung einer Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines hierdurch kodierten Proteins oder Peptids in einem screening Verfahren zur Ermittelung einer an einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskette bindenden, jedoch nicht die Glykolyse katalysierenden Stoffes.