DE69433309T2

DE69433309T2 - Verbeugende oder therapeutische Mittel für die Alzheimer-Krankheit, eine Siebtest-Methode, und die menschliche Tau-Protein-Kinase

Info

Publication number: DE69433309T2
Application number: DE69433309T
Authority: DE
Inventors: Akihiko Machida-shi Takashima; Toshimitsu Machida-shi Hoshino; Kazutomo Meguro-ku Imahori; Ken-ichi Kawasaki-shi Saito; Akiko Sagamihara-shi Shiratsuchi; Showbu Machida-shi Sato
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1993-03-02
Filing date: 1994-03-01
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2014-03-02
Also published as: EP0616032B2; ATE254172T1; DE69433309T3; CA2116460A1; EP0616032A3; EP0616032A2; DE69433309D1; EP0616032B1

Description

Die Erfindung betrifft ein präventives oder therapeutisches mittel gegen die Alzheimer-Krankheit, ein Verfahren zum Screenen nach der Alzheimer-Krankheit und tau-Proteinkinase I, die vom Menschen abstammt. Insbesondere betrifft sie ein präventives oder therapeutisches Mittel gegen die Alzheimer-Krankheit unter Verwendung eines tau-Proteinkinase I-Inhibitors; ein Verfahren zum Screenen nach einem präventiven oder therapeutischen Mittel gegen die Alzheimer-Krankheit unter Verwendung eines amyloiden beta-Proteins, einer tau-Proteinkinase I, die tau-Protein phosphoryliert; ein Gen, das die Kinase kodiert und ein Verfahren zur Herstellung desselben.
Die Alzheimer-Erkrankung ist eine progressive Demenz, die sich im späten mittleren Alter (45 bis 65 Jahre) entwickelt, und ihre etiologischen Änderungen sind die Schrumpfung der Großhirnrinde aufgrund von neuronalem Zellverlust und Degeneration von Neuronen, während aus pathologischer Sicht viele senile Plaques und neurofibrilläre Verschlingungen im Gehirn zu verzeichnen sind. Es besteht kein pathologisch wesentlicher Unterschied zwischen der Krankheit und Altersdemenz, die durch die sogenannte natürliche Alterung verursacht wird und die sich ab dem Alter von 65 Jahren entwickelt und senile Altersdemenz vom Alzheimer-Typ bezeichnet wird.
Die Anzahl von Patienten mit dieser Krankheit erhöht sich mit dem Bevölkerungsanstieg älterer Leute und die Krankheit wird von der Gesellschaft als ernsthaft angesehen. Es gibt verschiedene Theorien über die Ursache dieser Erkrankung aber die Ursache ist immer noch zweifelhaft und folglich besteht ein Verlangen nach unverzüglicher Klarstellung.
Es ist bekannt, dass die Mengen die bei den beiden pathologischen Änderungen auftreten, die für die Alzheimer-Krankheit und die Altersdemenz vom Alzheimer-Typ charakteristisch sind, sehr gut mit dem Ausmaß der Beeinträchtigung der Wahrnehmung korreliert sind. Demzufolge wurden Untersuchungen zum Klarstellen der Ursache dieser Erkrankungen seit der ersten Hälfte der 80er Jahre durchgeführt, in den auf Molekularebene die angehäuften unlöslichen Substanzen, die zu diesen beiden pathologischen Änderungen führen, geklärt wurden.
Es wurde bereits geklärt, dass eine Hauptkomponente der senilen Plaques, die eine dieser pathologischen Änderungen darstellen, Amyloid-beta-Protein (hiernach mit "AβP" abgekürzt) ist [Annu. Rev. Neurosci., 12, 463–490 (1989)]. Die neurofibrilläre Struktur, die eine weitere pathologische Änderung darstellt, ist in den Neuronen auf eine Anhäufung einer doppelsträngigen fibrösen Substanz, die PHF (als Paar vorhandenes helikales Filament – paired helical Filament) genannt wird, zurückzuführen und kürzlich wurden dessen Komponenten als Ubiquitin und tau-Protein, eines der Microtubule-assoziierten Proteine, die für das Gehirn kennzeichnend sind, identifiziert [J. Biochem., 99, 1807– 1810 (1986); Proc. natl. Acad. Sci. USA, 83, 4913–4917 (1986)].
Es wird nun angenommen, dass sich bei der Alzheimer-Krankheit das Amyloid-beta-Protein stark in den Neuronen angehäuft und dass als Folge seiner Korrelierung mit dem gebildeten PHF die Neuronen absterben.
Es ist bekannt, dass das tau-Protein (hiernach kann das Protein mit "tau" abgekürzt sein) gewöhnlich eine Reihe von verwandten Proteinen darstellt, die mehrere Banden mit Molekulargewichten von 48 bis 65 kDa auf einem SDS Polyacrylamid-Elektrophoresegel bilden und dass es die Bildung von Microtubula fördert.
Es ist durch die Verwendung von polyklonalem Antikörper gegen PHF [anti-ptau: J. Biolchem. 99, 1807–1810 (1986)] und ebenfalls von monoklonalem Antikörper [tau-1 antibody; Proc. Natl. Acad. Asic. USA, 83, 4913–4917 (1986)] bewiesen worden, dass das tau, das in das PHF des Gehirns bei der Alzheimer-Krankheit eingeführt wird, im Vergleich zu dem normalem stark phosphoryliert ist.
Die Erfinder haben ein Enzym isoliert, das eine solche anormale Phosphorylierung katalysiert, und es "tau-Proteinkinase I" (hiernach kann es mit "TPK-I" abgekürzt sein) genannt und dessen biochemische Eigenschaften aufgeklärt [Seikagaku, Bd. 64, Nr. 5, S. 308 (1992)]. Die Erfinder haben außerdem die cDNA von Ratten-TPK-I aus der cDNA-Bibliothek der Gehirnrinde von Ratten auf Basis der Aminosäurenteilsequenz von TPK-I kloniert, wodurch die Basensequenz bestimmt worden ist und die Aminosäurensequenz vorgeschlagen wurde (SEQ. ID NO. 2 der Sequenzliste; japanische Patentanmeldung 177241/92, FEBS Lett., 325, 167– 172 (1993)).
Als Folge wurde bestätigt, dass die Primärstruktur des TPK-I der Ratten identisch mit dem Enzym ist, das als Ratten GSK-3β (Glycogensynthasekinase 3β) bekannt ist [EMBO J., 9, 2431– 2438 (1990)].
Beim Auffinden von Medikamenten, die zur Prävention oder Therapie von Erkrankungen des Menschen wirksam sind, unterscheidet sich die Primärstruktur, die ein Ziel des Medikaments ist, gewöhnlich in Abhängigkeit von der Tierart. Daher kann es Fälle geben, bei denen die Wechselwirkung zwischen dem Medikament und dem Protein (mit anderen Worten, die Empfindlichkeit und Wirksamkeit des Medikaments) sich abhängig von der Tierart stark unterscheidet [z. B. Nature, 360, 161 (1992)]. Folglich zum Auffinden von Medikamenten, die tatsächlich beim Menschen wirksam sind, ist es wünschenswert, dass die Untersuchung unter Verwendung von Proteinen durchgeführt wird, die vom Menschen stammen. Insbesondere beim Auffinden von Medikamenten die bei Krankheiten wirksam sind, die nicht in Tieren festgestellt wurden, sondern nur beim Menschen, wie der Alzheimer-Erkrankung, wird es als wesentlich angesehen, Proteine zu verwenden, die vom Menschen abstammen. Es gibt jedoch keinen Bericht über die Trennung und Reinigung von TPK-I (oder GSK-3β) aus menschlichem Gewebe und darüber hinaus ist nicht über ein Gen (cDNA) berichtet worden, das humanes TPK-I (oder GSK-3β) kodiert.
Eine erfindungsgemäße Aufgabe ist es, den Zusammenhang zwischen dem Tod von Neuronen und der Anhäufung von PHF und Amyloid-beta-Protein, das im Gehirn bei der Alzheimer-Krankheit festgestellt wird, zu klären und außerdem den Zusammenhang bei der Klärung der Ursache der Alzheimer-Krankheit einzusetzen und darüber hinaus bei der Untersuchung von präventiven oder therapeutischen Mitteln einzusetzen.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist es, die Struktur von vom Menschen-abstammenden TPK-I (das für den Verlauf der Untersuchungen solcher Medikamente wesentlich ist) auf molekular-biologischer Basis zu klären und ein Verfahren zum Herstellen desselben durch Gentechnikverfahren bereitzustellen.
Seitens der Erfinder wurden Untersuchungen durchgeführt, um die obigen Aufgaben zu erfüllen und sie haben bestätigt, dass wenn Amyloid-beta-Protein auf die Neuronen im Gehirn wirkt, sich die Aktivität von TPK-I signifikant erhöht, was zu dem stark phosphorylierten tau-Protein im PHF der Gehirne von Alzheimer-Erkrankten und darüber hinaus zum Neutronentod führt und dass der oben erwähnte Anstieg der TPK-I-Aktivität und des neuronalen Zelltods im Gehirn durch die Behandlung mit den Antisinn-Oligonukleotid von TPK-I inhibiert wird.
Angesichts dessen, dass bei der Alzheimer-Erkrankung die Anhäufung von PHF zur Degeneration von Neuronen im Gehirn führt und schließlich den Tod induziert, haben die Erfinder erstmals das Gen (das vom Menschen abstammende TPK-I kodiert und von dem angenommen wird, dass es ein Schlüsselenzym bei der PHF-Bildung ist) aus der cDNA-Bibliothek von humanem Fötusgehirn kloniert, wodurch deren Primärstruktur bestimmt und ein Verfahren zur konstanten Lieferung (oder Herstellung) des vom Menschen abstammende TPK-I etabliert wurde.
Die Erfindung wurde als Ergebnis der oben angefügten Feststellungen, gefolgt von weiteren Untersuchungen, erreicht und ihre kennzeichnenden Merkmale sind wie folgt:

(1) ein präventives oder therapeutisches Mittel bei der Alzheimer-Erkrankung, das als wirksame Komponente ein Antisinn-Oligonukleotid umfasst, das mit der mRNA oder DNA der tau-Proteinkinase I hybridisieren kann;
(2) eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Prävention oder Therapie der Alzheimer Krankheit, die ein Antisinn-Oligonukleotid umfasst, das mit mRNA oder DNA der tau-Proteinkinase I hybridisieren kann;
(3) ein Verfahren zum Screenen nach einem präventiven oder therapeutischen Mittel der Alzheimer-Krankheit, wobei, wenn ein Amyloid-beta-Protein, Nervenzellen und ein Medikament von dem angenommen wird, dass es als präventives oder therapeutisches Mittel gegen die Alzheimer-Krankheit wirksam ist, inkubiert werden und wenn der Tod der Nervenzellen gehemmt wird, dieses Mittel als ein präventives oder therapeutisches Mittel gegen die Alzheimer Krankheit angesehen wird.
(4) ein Verfahren zum Hemmen des Neuronentods im Gehirn, dadurch gekennzeichnet, dass eine Substanz, die eine inhibierende Wirkung der tau-Proteinkinase I auf das Neuron im Gehirn hat, eingesetzt wird;
(5) ein Verfahren zum Hemmen des Tods von Neuronen im Gehirn, dadurch gekennzeichnet, dass ein Antisinn-Oligonukleotid, das mit mRNA oder DNA der tau-Proteinkinase I hybridisieren kann, bei kranialen Nervenzellen eingesetzt wird;
(6) tau-Proteinkinase I, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch eine Aminosäuresequenz, die in der SEQ. ID NO. 1 der Sequenzliste aufgeführt ist oder einer Teilsequenz davon, dargestellt wird;
(7) Gen, das tau-Proteinkinase I, die durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ. ID NO. 1 der beigefügten Sequenzliste oder einer Teilsequenz davon aufgeführt ist, dargestellt ist, kodiert;
(8) rekombinante tau-Proteinkinase I menschlichen Ursprungs;
(9) rekombinanter Vektor, der die rekombinante tau-Proteinkinase I menschlichen Ursprungs exprimieren kann;
(10) Transformant, der durch Transformation der Wirtszellen mit einem rekombinanten Vektor, der rekombinante tau-p-Proteinkinase I menschlichen Ursprungs exprimieren kann, erhältlich ist; und
(11) Verfahren zur Herstellung rekombinanter tau-Proteinkinase I menschlichen Ursprungs, dadurch gekennzeichnet, dass ein Transformant, der durch Transformation von Wirtszellen mit einem rekombinanten Vektor, der die rekombinante tau-Proteinkinase I menschlichen Ursprungs exprimieren kann, erhältlich ist, inkubiert wird und danach die rekombinante tau-Proteinkinase I menschlichen Ursprungs gesammelt wird.

Die Erfindung wird hiernach weiter veranschaulicht.
Erfindungsgemäß wird ein Antisinn-Oligonukleotid (hiernach kann es als "TPK-I-Antisinn-Oligonukleotid" bezeichnet sein), das mit mRNA oder DNA von TPK-I hybridisieren kann, zur Prävention oder Therapie der Alzheimer-Krankheit verwendet.
Ein Antisinn-Oligonukleotid kann die Proteinsynthese auf dem Genlevel inhibieren und demzufolge bekam es auf medizinischem Gebiet als synthetischer Inhibitor von Proteinen, die die Krankheit verursachen, Aufmerksamkeit. Das Prinzip ist, dass wenn die Antisinn-RNA oder die Antisinn-DNA ein Basenpaar mit mRNA in einer Sinnsequenz bildet, die Übertragung der Geninformation gestört und die Proteinsynthese, die das Endprodukt ist, gehemmt wird [Igaku no Ayumi, Bd. 162, Nr. 13, 909–911 (1992)].
Hinsichtlich des in die Erfindung eingesetzten TPK-I-Antisinn-Oligonukleotids kann jedes bereitgestellt werden, das mit mRNA oder DNA von TPK-I hybridisieren kann, und dass eine Sequenz hat, die die Synthese von TPK-I durch z. B. Inhibierung der Transkription, Inhibierung des Splicens der pre-mRNA, Inhibierung der mRNA-Septrum-Transmission, Inhibierung der Translation, usw. hemmt. Gewöhnlich wird eines, das 15 bis 30 Nukleotide umfasst, verwendet.
Darüber hinaus können Antisinn-Oligonukleotide vom Phosphorthioat-Typ eingesetzt werden, bei denen ein Sauerstoffatom, das über eine Doppelbindung mit einem Phosphoratom an der Phosphordiesterbindung, die die Deoxyribonukleoside verbindet, durch ein Schwefelatom ersetzt ist; vom Methylphosphat-Typ, bei denen die Methylgruppe anstatt des Schwefelatoms eingeführt ist; vom Phosphonat-Typ ohne Substitution; und vom alpha-Oligonukleotid-Typ [Anticancer Drug Des. 6 (66), 606–646 (1991); Anticancer Research, 10, 1169–1182 (1990)]. Darüber hinaus ist es erfindungsgemäß nicht immer notwendig, einen Nukleotidtyp zu verwenden, bei dem ein Nukleosidderivat gebunden wird, vorausgesetzt, dass die Substanz ein Hybrid mit der angestrebten Sequenz bilden kann. Die Antisinn-Verbindungen, die in Antisense Research and Development, 1, 65–113 (1991) beschrieben sind, können ebenfalls verwendet werden.
Spezifische Beispiele der TPK-I-Antisinn-Oligonukleotide, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind die TPK-I-Antisinn-Oligonukleotidkette 5'-TCTCGGTCGCCCCGACAT-3' (SEQ. ID NO. 5 der Sequenzliste), die komplementär mit der TPK-I-Sinn-Oligonukleotidkette 5'-ATGTCGGGGCGACCGAGA-3' (SEQ. ID NO. 4 der Sequenzliste) ist und den ersten sechs Aminosäureresten Met Ser Gly Arg Pro Arg in der Translationsanfangsdomäne von TPK-I in der Primärstruktur von Ratten-GSK-3β entspricht [die gleiche Primärstruktur der Ratten TPK-I (SEQ. ID NO. 2 der Sequenzliste), die im zuvor genannten EMBO J., 9, 2431–2438 (1990) beschrieben ist]; die TPK-I-Antisinn-Oligonukleotidkette 5'-TCTGGGCCGCCCTGACAT-3' (SEQ. ID NO. 7 der Sequenzliste), die komplementär mit der TPK-I-Sinn-Oligonukleotidkette 5'-ATGTCAGGGCGGGCCCAGA-3' (SEQ. ID NO. 6 der Sequenzliste) ist, die den ersten sechs Aminosäureresten Met Ser Gly Arg Pro Arg in der Translationsanfangsdomäne von TPK-I der Primärstruktur von humanem TPK-I (SEQ. ID NO. 1 der Sequenzliste; unter Bezugnahme auf die später aufgeführten Beispiele) entspricht und dergl.
Das oben erwähnte TPK-I-Sinn-Oligonukleotid und TPK-I-Antisinn-Oligonukleotid kann einfach durch im Handel erhältliche automatische DNA-Synthetisierer synthetisiert werden, wie einem DNA-Synthetisierer, der von Applied Biosystems hergestellt wird, der von MilliGen hergestellt wird, usw.
Wie zuvor erwähnt, sind die erfindungsgemäßen TPK-I-Antisinn-Oligonukleotide nicht auf solche beschränkt, die die oben angegebenen Sequenzen aufweisen, vorausgesetzt, dass sie mit mRNA oder DNA von TPK-I hybridisieren können und solange die Hybrid-bildende Fähigkeit nicht beeinträchtigt ist, und ein Teil der Sequenz kann mit jeder Base substituiert sein. Darüber hinaus sind auch Antisinn-Oligonukleotide erfindungsgemäß eingeschlossen, die geändert oder modifiziert wurden, um die Blut-Hirn-Schranke zu passieren, wie in Science, 259, 373–377 (1993) beschrieben.
Wenn die TPK-I-Antisinn-Oligonukleotide oder die Substanzen mit inhibierender Wirkung gegenüber TPK-I, wie oben erwähnt, als präventive oder therapeutische Mittel gegen die Alzheimer-Krankheit verwendet werden, können sie zusammen mit gewöhnlichen Trägern als Präparationen bereitgestellt werden, die den gewünschten Verabreichungsweg ermöglichen. Z. B. im Fall der oralen Verabreichung werden Präparationen in der Form von Tabletten, Kapseln, Körnchen, verdünnten Pulvern, Flüssigkeit, usw. hergestellt.
Bei dem Herstellen von festen Präparaten zur oralen Anwendung können gewöhnlich verwendete Füllstoffe, Bindemittel und Gleitstoffe, sowie Farbstoffe, desintegrierende Mittel, usw. verwendet werden. Beispiele von Füllstoffen sind Laktose, Stärke, Talk, Magnesiumstearat, kristalline Zellulose, Methylzellulose, Carboxymethylzellulose, Glycerin, Natriumaliginat, Gummiarabikum, usw. Beispiele von Bindemitteln sind Polyvinylalkohol, Polyvinylether, Ethylzellulose, Gummiarabikum, Schallec, weißer Zucker, usw. Beispiele von Gleitmitteln sind Magnesiumstearat, Talk, usw. Abgesehen von denen können gewöhnlich verwendete als Farbstoffe, Aufschlussmitteln, usw. ebenfalls verwendet werden. Tabletten können durch bekannte Verfahren beschichtet sein. Flüssige Präparate können wässrige oder ölige Suspensionen, Lösungen, Sirupe, Elixiers und dergl. sein und können durch gewöhnlich verwendete Verfahren hergestellt werden. Bei dem Herstellen von Injektionen können pH-einstellende Mittel, Puffer, Stabilisatoren, isotonische Mittel, lokale Anästhetika, usw. zu den TPK-I-Antisinn-Oligonukleotiden gegeben werden und subkutane intramuskuläre oder intravenöse Injektionen können durch gewöhnliche Verfahren hergestellt werden. Hinsichtlich der Herstellung von Zäpfchen, können ölige, wie Kakaobutter, Polyethylenglycol, Witepsol (eingetragener Handelsname von Dynamite Nobel) verwendet werden.
Dosierungen der so hergestellten Präparate sind nicht immer die gleichen, sondern hängen von den Symptomen, dem Körpergewicht, dem Alter, usw. der Patienten ab. Gewöhnlich reicht jedoch die Menge aus, die ungefähr 1 bis 1.000 mg/kg des Medikaments pro Tag pro Erwachsenen entspricht, und es ist bevorzugt die Verabreichung auf 1- bis 4mal täglich zu teilen. In einigen Fällen kann die Verabreichung einmal täglich bis zu alle paar Tage bis zu größeren Abständen von Tagen erfolgen.
Beispiele der erfindungsgemäß verwendeten Nervenzellen sind Neuronen, die vom Gehirn von Säugern gesammelt werden und neuronale Zelllinien, bei denen die Nervenprojektionen durch die Induktion von Wachstumsfaktoren ausgedehnt wurden, wie durch NGF (Nervenwachstumsfaktor; neurotrophischer Faktor), IFG (Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor), usw. Ein Beispiel des letzteren ist eine Kultur, hergestellt durch Inkubierung des Gewebes vom Hippocampus von Säugern (wie der Ratte) in einem vollständigen Kulturmedium. Beispiele des letzteren sind PC 12-Zellen, die durch NGF, FGF (Fibroblastenwachstumsfaktor), EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) Interleukin 6, usw. induziert werden [Ann. Rev. Pharma col. Toxicol., 31, 205–228 (1991)]; SH-Sy5Y-Zellen, die durch IGF [The Journal von Cell Biology, 102, 1949–1954 (1986)] induziert werden und solche die offenbart sind in Cell Culture in the Neurosciences, New York, Plenum Presse, S. 95–123 (1955) wie NGF-induzierte MJB-Zellen, NNB-Zellen, SK-N-SH-SX5Y-Zellen, LAN-1-Zellen, KA-9-Zellen, IMR-32-Zellen und 5 Bromdeoxyuridin-induzierte IMR-32-Zellen, NMB-Zellen, NGP-Zellen, usw.
Amyloid-beta-Protein ist eine Hauptkomponente seniler Plaques bei der Alzheimer-Krankheit und es ist bekannt, dass die Substanz sich aus einem Peptid zusammensetzt, das die folgenden 43 Aminosäurereste umfasst [Science, 250, 279–282 (1990) und Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9020–9023 (1990).
Aminosäuresequenz von Amyloid-beta-Protein (SEQ. ID NO. 3 der Sequenzliste): Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Aer Gly Tyr Alu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr
Die Erfindung wird hiernach weiter veranschaulicht, und zwar durch ein Beispiel über das Verhalten von Hippocampus-Zellen von Ratten und der Phosphorylierungsaktivität von TPK-I, wenn die Hippocampuszellen mit einer bestimmten AβP-Menge und außerdem mit dem TPK-I-Sinn-Oligonukleotid (hiernach als "TPKI-Sinn" bezeichnet) und dem TPKI-Antisinn-Oligonukleotid (hiernach als "TPKI-Antisinn" bezeichnet) als Kontrolle unter bestimmten Bedingungen behandelt wurden. Beim erfindungsgemäßen Screening-Verfahren nach einem präventiven oder therapeutischen Mittel gegen die Alzheimer-Krankheit werden Hippocampus-Zellen der Ratte als Neuronen verwendet und als Mittel, von dem angenommen wird, dass es als präventives oder therapeutisches Mittel gegen die Alzheimer-Krankheit wirksam ist, wird TPK I-Sinn oder TPK I-Antisinn verwendet.
Bestimmte Mengen von TPKI-Antisinn wurden bei einer bestimmten Temperatur zu der Kultur der Hippocampus-Zellen gegeben, woraufhin eine bestimmte AβP-Menge zugegeben wurde, die Mischung wurde bei der bestimmten Temperatur gehalten und die Lebendzellzahlen wurden über die verstrichene Zeit durch ein Verfahren gemessen, das in den später aufgeführten Beispielen beschrieben ist. Zum Vergleich wurden Lebendzellzahlen bei dem Fall gemessen, bei dem nur AβP zugegeben wurde, gefolgt von den gleichen Behandlungen und dem Fall, bei dem TPK I-Antisinn und AβP zugegeben wurden, gefolgt von den gleichen Behandlungen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Anzahl an lebenden Zellen signifikant mehr war, wenn TPK I-Antisinn und AβP zugegeben wurde als wenn nur AβP und wenn TPK I-Sinn und AβP zugegeben wurden und dass TPK I-Antisinn hemmend auf den Tod der Zellen durch AβP wirkt.
Die Ergebnisse von Probenbeobachtungen von Proben, die ein Phasen-Kontrastmikroskop (Vergrößerungsstärke: 400) verwenden, zeigen, dass bei Zugabe von TPK I-Antisinn und AβP zu der Zellkultur, gefolgt von 24-stndigem Stehen lassen, bei Zugabe von AβP, gefolgt vom Stehen lassen über den gleichen Zeitraum, und bei Zugabe von TPK I-Sinn und AβP, gefolgt vom Stehen lassen über den gleichen Zeitraum, die Zelltoxizität durch AβP gering und ähnlich zu den Kontrollen war, wenn nur TPK I-Antisinn wirkte.
Darüber hinaus wurden die Phosphorylierungsaktivitäten von tau-Protein durch TPK I nach 24 Stunden durch das in den Beispielen angeführte Verfahren gemessen, und zwar wenn nur AβP zugegeben und stehen gelassen wurde und wenn TPK I-Antisinn und AβP zugegeben und stehen gelassen wurden, wie oben beschrieben. Das Ergebnis war, dass, wie in den später aufgeführten Beispielen gezeigt, die Phosphorylierungsaktivität von TPK-I, wenn TPK I-Antisinn und AβP zugegeben wurden, ungefähr die Hälfte von der war, wenn nur AβP zugegeben wurde und dass TPK I-Antisinn eine Aktivität entfaltet, die Phosphorylierungsaktivität von TPK-I zu inhibieren.
Aus den obigen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass bei dem erfindungsgemäßen Durchführen des Verfahrens zum Screenen nach einem präventiven und therapeutischen Mittel gegen die Alzheimer-Krankheit TPK I-Antisinn als das präventive und therapeutische Mittel wirksam ist. Die Wirksamkeit von Mitteln außer dem TPK I-Antisinn-Oligonukleotid kann in ähnlicher Weise ebenfalls beurteilt werden.
Das Verfahren zum Erhalt von TPK-I menschlichen Ursprungs und das Verfahren zur Herstellung desselben wird hiernach erläutert.
Das erfindungsgemäße vom Menschen abstammende TPK-I kann z. B. wie folgt hergestellt werden. Microtubulus-Fraktionen wurden unmittelbar nach dem Tod durch temperaturabhängige Polymerisierung und Depolymerisierung aus humanem Hirnextrakt erhalten und anschließend wurden Vorgänge, wie Phosphorzellulose-Säulenchromatographie, Gelfiltrierung, Hydroxyapatit-Säulenchromatographie, S-Sepharose-Säulenchromatographie, Heparin-Säulenchromatographie, usw. gemäß einem Verfahren von Uchida, et al. [Seikagaku, Bd. 64, Nr. 5, S. 208 (1992)) kombiniert, wobei reines Protein erhalten wurde. Die primäre (Teil-) Struktur eines solch reinen Proteins kann durch Durchführen einer herkömmlichen Aminosäureanalyse bestimmt werden. Es ist nicht leicht, das humane Hirngewebe in großen Mengen zu erhalten und es schwierig humanes TPK-I zu reinigen und daher ist es auch möglich, dass das Gen zuvor durch ein Verfahren, das später beschrieben wird, kloniert wird und die Aminosäuresequenz davon abgeleitet wird, wobei die Primärstruktur bestimmt wird.
Die derart hergestellte erfindungsgemäße humane TPK-I ist ein Protein, bei dem die Primärstruktur durch die in SEQ. ID NO. 1 der Sequenzliste aufgeführten Aminosäuren, die (420 Aminosäurereste; Molekulargewicht: 46.719; isoelektrischer Punkt: 9,21) dargestellt ist und Änderungen, wie Entfernung, Substitution, Modifizierung oder Addition einiger Aminosäuren kann in einem solchen Maß durchgeführt werden, dass die Funktionen (Wirkung, Substratspezifität, usw.) nicht verschlechtert ist.
Das Gen (cDNA), das die obige TPK-I kodiert, kann durch Verfahren kloniert werden, bei denen das entsprechende Protein aus natürlichem Material gereinigt, dessen Teilaminosäuresequenz bestimmt und die DNA-Sonde, die dieser entspricht, verwendet wird, bei dem die Homologie mit dem Protein der gleichen Gattung oder das entsprechende Protein einer anderen Tiergattung verwendet wird; bei dem ein Antikörper, der spezifisch zu dem entsprechenden Protein ist, verwendet wird, bei dem der Nachweis der spezifischen Funktion des Proteins eingesetzt wird, usw. Die Erfinder haben zuvor TPK-I aus Hirnextrakt der Ratte oder des Rindes gereinigt und in Abhängigkeit der Information der Teilaminosäuresequenzen davon haben sie die Ratten-TPK-I cDNA aus der cDNA-Hirnbibliothek der Ratte kloniert (SEQ. ID NO. 2 der Sequenzliste; japanische Patentanmeldung Nr. 177241/92, FEBS Lett., 325, 167–172 (1993)).
Die Homologie der Primärstrukturen der Ratten mit Menschen hinsichtlich des gleichen Proteins, ist in den meisten Fällen gewöhnlich ungefähr 90% oder mehr und daher ist es möglich, humane TPK-I cDNA aus Ratten-TPK-I cDNA zu klonieren, wobei diese Homologie eingesetzt wird. Ein lamda-Phage wird gewöhnlich in Escherichia coli durch ein Verfahren von Tomizawa, et al. ["Experiments in Bacteriophage" (Iwanami Shoten), S. 99–174 (1970)] infiziert, wobei eine cDNA-Bibliothek, die das Gen, das humanes TPK-I kodiert, enthält eingesetzt wird, wie die humane cDNA-Bibliothek des Gehirns vom Fötus, gefolgt von dem Kultivieren. Die dadurch gebildeten Plaques wurden durch ein Plaque-Hybridisierungsverfahren ["Molecular Cloning" Cold Spring Harbor Laboratory, S. 320–328 (1982)] unter Verwendung einer Ratten-TPK-I cDNA oder von DNA-Fragmenten mit einer Teilstruktur davon als Sonde selektiert. Der Phage wird aus positiven Plaques durch ein Verfahren von Tomizawa, et al., promulgiert, anschließend wird DNA durch ein Verfahren von T. Maniatis et al. hergestellt ["Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, S. 85 (1982)] oder nach dem ein Subklonierungsschritt, wenn notwendig, durchgeführt wurde, mit einem geeigneten Restriktionsenzym, wie EcoRI gespalten und in ein Plasmid, wie pUC18 oder pUC19 kloniert. Die cDNA der humanen TPK-I wird hergestellt und ihre Aminosäuresequenz kann z. B. durch ein Didesoxyverfahren von Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] bestimmt werden.
Ein Beispiel des oben erwähnten Gens (cDNA), das TPK-I menschlichen Ursprungs kodiert, ist eines, das eine Basensequenz aufweist, die in der SEQ. ID NO. 1 der Sequenzliste aufgeführt ist.
Bei der erfindungsgemäßen humanen TPK-I waren 5 Aminosäurereste unterschiedlich zu den 420 Aminosäureresten der Aminosäuresequenz der Ratten-TPK-I und in der Translationsdomäne betrug die Basenhomologie 92,5%.
Die oben hergestellte humane TPK-I oder ihre Teilpeptide können exprimiert und mittels Genrekombination erzeugt werden. Das 5'-Ende der humanen TPK-I cDNA oder eines Fragments wird modifiziert oder es wird ein Vorläufergen zugegeben, es wird stromabwärts vom Promotor des exprimierenden Vektors eingeführt und anschließend wird der Vektor in Wirtszellen, wie Bakterien, Hefen, Insektenzellen, Tierzellen, usw. eingeführt. Die transformierten Wirtszellen werden unter geeigneten Bedingungen kultiviert, wobei eine humane TPK-I-Rekombinante innerhalb oder außerhalb der Zellen hergestellt wird.
Beispiele von tranformierbaren Wirtszellen sind Bakterien (prokaryontische Zellen), wie Escherichia coli (K-12-Stamm), Bacillus subtitlis, usw.; Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae; Insektenzellen, wie von den Eierstöcken abstammende Zellen von Spodoptera spp. (Sf9-Zellstamm); und (Säuger-) Tierzellen, wie von den Eierstöcken abstammende Zellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), Mäuse-C127-Zellen, von den Nieren des African green monkey abstammende Zellen (COS-Zellen), Mäuse-L-Zellen, Mäuse-FM3A-Zellen, von den Nieren abstammende Zellen des menschlichen Fötus (HEK-Zellen, 293 Zellen), usw.
Der Expressionsvektor, der sich eignet, ist einer der einen Promotor an der Position enthält, an der ein Gen (cDNA), das humane TPK-I oder ein DNA-Fragment davon kodiert, transkribiert werden kann. Z. B., wenn Zellen als Wirt verwendet werden, ist es bevorzugt, dass sich der Expressionsvektor aus Promotor, Ribosom-bindender (SD)-Sequenz, humanem TPK-I-kondierenden Gen oder einem Fragment davon, Transkriptions-Terminations-Faktor und Promotorsteuerndes Gen zusammensetzt. Selbst wenn eukaryontische Zellen, wie (Säuger-) Tierzellen, Insektenzellen, Hefen, usw. als Wirtszellen verwendet werden, ist die Fundamentaleinheit, die den Expressionsvektor umfasst, die gleiche wie im Fall der oben erwähnten Bakterien.
Promotorbeispiele, wenn Bakterien als Wirtszellen verwendet werden, sind solche, die von Escherichia coli, Phage, usw. abstammen, wie das Lactoseoperon (lac), das Tryptophansynthetisierende Enzym (trp), lamda-Phage P_L, E. coli T7-Polymersasepromotor und tac (Hybridpromotor, der aus trp und lac W5 abstammt). Beispiele im Fall von Hefen sind Promotoren von Genen von Enzymen, wie Phosphoglycerinsäurekinase (PGK), Glyceraldehyd-3-phosphorsäuredehydrogenase (GPD), repenierbare saure Phosphatase (PHO5) und Alkoholdehydrogenase 1 (ADH1). Beispiele im Fall der Verwendung von Insektenzellen als Wirt sind der Promotor des Polyhedrons von Baculovirus, usw. Beispiele im Fall von (Säuger-) Tierzellen sind der SV40-Anfangspromotor, der SV40-Spätpromotor, der Apolipoprotein-E-Genpromotor, usw.
Beispiele der ribosomen Bindungssequenz sind solche, die von E. coli, Phage, usw. abstammen und solche die zum Teil komplementär mit der Basensequenz der 3'-terminalen Domäne der 16S Ribosomen RNA sind.
Obgleich der Transkriptions-Terminations-Faktor nicht immer notwendig ist, ist es bevorzugt einen zu haben der rhoρunabhängig ist, wie der Lipoproteinterminator, der trp-Operonterminator, usw.
Hinsichtlich der Sequenz dieser Faktoren, die zur Expression auf einem Expressionsplasmid (Vektor) sind, ist es gewünscht, dass sie in der Reihenfolge Promotor, SD-Sequenz, humanes TPK-I-kodierendes Gen oder Fragment davon und Transkriptions-Terminations-Faktor von der 5'-stromaufwärts liegenden Seite platziert werden.
Im Fall der Verwendung von Bakterien als Wirt, sind spezifische Beispiele der Expressionsvektoren, die diese Erfordernisse erfüllen, pKK233-2 (von Farmacia hergestellt) und pET3C [Gene, 56, 125 (1987)]. Die ExpressionsvektorpGEX-Reihe (Farmacia), die als Fusionsprotein exprimiert werden, können auf die gleiche Weise verwendet werden. Bei der Verwendung von Hefen als Wirt, eignet es sich einen Vektor zu verwenden, bei dem der oben erwähnte Promotor (und darüber hinaus das Gen, das die auxotrophe Mutante als selektierten Marker komplementiert, wie trp1 und leu2) in den Yep-Vektor mit einem Replikationsursprung von 2 Mikron DNA eingeführt wird. Im Fall von Insektenzellen ist ein Beispiel Maxbac (Handelsname), das ein Baculovirus-Expressionssystem ist (Version 1.4 von Invitrogen). Im Fall von Tierzellen eignen sich solche mit dem oben erwähnten Promotor und einem selektiven Markergen, wie dem Neomycin-Resistenz-Gen (Neo) und dem Dihydrofolsäure-Reduktasegen (DHFR). Bei der Verwendung von eukaryontischen Zellen als Wirt kann auch ein Shuttle-Vektor für E. coli verwendet werden.
Die Transformation von Wirtszellen kann auf herkömmliche Weise durchgeführt werden.
Die Kultivierung der Transformanten kann mit einem Verfahren durchgeführt werden, das von einem Verfahren von T. Maniatis et al., beschrieben in "Molecular Cloning" Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 abhängt. Obgleich die Kulturtemperatur nicht immer die gleiche ist, wobei sie von den Bedingungen, wie den Wirtszellen abhängt, eignet sich eine Temperatur von ungefähr 25 bis 40°C.
Die humane TPK-I, die durch solche Wirts-Vektor-Systeme hergestellt wird, kann durch eine Reihe von Reinigungsschritten gereinigt werden, die dem Wirt, den Kulturbedingungen entsprechen, wie durch Extraktion aus dem Wirt, Aussalzen und Chromatographie unter Verwendung verschiedener Säulen. Im Fall der Säulenchromatographie sind diejenigen die sich eignen Phosphorzellulose-Säulenchromatographie, Hydroxyapatit-Säulenchromatographie, S-Sepharose-Säulenchromatographie, Heparin-Säulenchromatographie, blaue Sepharose-Säulenchromatorgraphie, usw.
Die derart hergestellte rekombinante humane TPK-I kann Proteine phosphorylieren, wie tau-Protein, Glycogen- synthetisierendes Enzym, Protooncogenprodukt c-jun, usw. und Teilpeptide davon und das Phosphorylierungsverfahren kann z. B. wie unten aufgeführt, bestätigt werden. Die erfindungsgemäße rekombinante humane TPK-I wird zusammen mit einer geeigneten Menge des Substratproteins zu einem Puffer, der 0,2 bis 4,0 mM Magnesiumacetat und 0,2 bis 4,0 mM Adenosintriphosphat enthält, einen pH von 5,0 bis 8,0 aufweist, zugegeben. Die Mischung bei Raumtemperatur bis 40°C inkubiert und die Phosphorylierung des Substratproteins wird untersucht und durch Radio-chemische, Protein-chemische oder Immun-chemische Verfahren bestimmt. Beim Zugeben eines Mittels zu diesem Reaktionssystem und dem Untersuchen der resultierenden Förderung oder Inhibierung der Phosphorylierungsreaktion ist es folglich möglich das Mittel zu finden, das eine physiologisch wichtige Bedeutung hat, wobei es möglich ist, zu untersuchen, ob ein Mittel zur Prävention oder Therapie dieser humanen Erkrankung wirksam ist.
BEISPIELE
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert, obgleich die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist. Die Beurteilung der Cytotoxizität, Messung der Phosphorylierung von tau-Protein und Immunhistochemie durch den Antikörper Alz-50 wurde gemäß der folgenden Verfahren durchgeführt. Bei jedem der folgenden Beispiele wurden mindestens drei unabhängige Untersuchungen durchgeführt und die Daten werden als Durchschnittswerte aufgeführt.
Beurteilung der Cytotoxizität:
Die Zahl vieler normaler und gesunder Zellen wurde durch ein Phasenkontrastmikroskop als Index der lebenden Zellen nach der Behandlung berechnet. Normale Zellen sind solche, die morphologisch einen flachen Umfang und viele Nervenzellprojektionen haben, während die degenerierten Zellen untersucht wurden, indem die irreguläre Form, die Degeneration der neuralen Projektionen, usw. beurteilt wurde. Die Zahl der lebenden Zellen wurden in einer Vertiefung gemessen. In der Standardkulturflüssigkeit betrugen die Zellzahlen nicht weniger als 400 pro Vertiefung. Das Ergebnis wurde durch ein immunhistochemisches Verfahren bestätigt.
Messung des Phosphorylierungsgrades von tau-Protein:
Hippocampus-Zellen wurden durch dreimaliges Waschen mit einem eiskalten Phosphatpuffer aus dem Kulturmedium gesammelt. Die Zellen wurden in einem Puffer A (pH: 6,8), der 1 mM EGTA, 0,5 mM Magnesiumacetat und 20 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, enthaltend einen Phosphataseinhibitor (1 mM Okadainsäure, hergestellt von Seikagaku Kogyo) und einen Proteaseinhibitor (1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und jeweils 1 μg/ml Leupeptin, Pepstatin und Aprotinin) enthält, suspendiert, homogenisiert und bei 14.000 UPM 1 Stunde zentrifugiert und die Überstandsflüssigkeit wurde vor Prüfung der Phosphorylierung verwendet.
Das tau-Protein der Ratte, das in E. coli BL21 durch eine Genrekombination exprimiert wird, wurde durch ein Verfahren gereinigt, das in J. Biol. Chem., 267, 10897–10901 (1992) beschrieben ist.
Das Hippocampus-Extrakt (1 μl) wurde zu einer Lösung des Ratten-tau-Proteins (400 μg/ml), das in Puffer A, enthaltend 1 mM [τ-³²P]ATP (10–20 Ci/mmol) aufgelöst ist, zugegeben und anschließend wurden 10 μmol Okadainsäure zugegeben, um ein Endvolumen von 10 μl zu erhalten. Dieses wurde bei 37°C 3 Stunden inkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe eines Puffers für die Elektrophorese beendet. Nach der Durchführung einer 10%igen Polyacrylamidgelelektrophorese wurde das ³²P in dem tau-Protein durch einen Laserbildanalysator (Fuji BAS 2000) festgestellt.
Immunhistochemie durch den Antikörper Alz-50:
Das kultivierte Medium der Hippocampus-Zellen wurde in einem Phosphatpuffer 10 Minuten unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd fixiert. Die fixierte Kulturflüssigkeit wurde 30 Minuten in einem Tris-Puffer, enthaltend 0,2% Triton X-100 inkubiert, so dass die Zellen durchlässig gemacht wurden.
Anschließend wurde das Kulturmedium einer Immunmarkierung unter Verwendung eines 1-verdünnten Alz-50-monoklonalen Antikörpers der Maus [Science, 232, 648–650 (1986)], Vectastain ABC Avidin-Biotin-Enzym-Peroxidnachweiskit (hergestellt von Vector Laboratory) und Diaminobenzidintetrahydrochlorid als Farbstoff unterworfen.
BEISPIEL 1
HERSTELLUNG DES ZELLKULTURMEDIUMS:
Das primäre Kulturmedium des Hippocampus der Ratten wurde gemäß einem Verfahren hergestellt das in Brain Res., 126, 397–425 (1977) beschrieben ist. Das Hippocampusgewebe wurde folglich aus dem Embryo der Ratten 18 Tage nach der Befruchtung gesammelt und in Papain (Protease) (10 E/ml) bei 37°C 20 Minuten verdaut. Die resultierenden Zellen wurden zu einem Dulbecco's-modifizierten Eagle's-Medium, das mit 5 Rinderfötusserum, 5% Pferdeserum, 10 μg/ml Insulin, 0,1 mg/ml Transferrin, 1 μg/ml Aprotinin, 1 mM Natriumpyrovat und 84 μg/ml Gentamycin ergänzt worden war, zugegeben. Dies wurde zur Gewebekultivierung in eine Vertiefung, die mit Poly-L-Lysin überzogen war, in einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/cm² gegeben, 3 Tage kultiviert und mit 1 μmol Cytosin-beta-Arabinofuranosid 24 Stunden behandelt und die Zellen vom fünften Kulturtag wurden verwendet.
AβP-HERSTELLUNG:
AβP-Peptid (SEQ. ID NO. 3 der Sequenzliste), umfassend die zuvor erwähnten 43 Aminosäurereste, wurde durch ein Verfahren synthetisiert, das in Science 250, 279–282 (1990) und Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9020–9023 (1990) beschrieben wurde, und nach der Reinigung in 35 Acetonitril aufgelöst, um eine 2 M Stammlösung herzustellen.
HERSTELLEN VON TPKI-SINN UND TPKI-Antisinn.
GSK-3β der Ratte [EMBO J., 9, 2431–2438 (1990)], d. h. TPKI-Sinn, umfassend die folgenden 18 Basen, die der Translationsanfangsdomäne der Primärstruktur von Ratte-TPK-I (FEBS Lett., 325, 167–172 (1993) entsprechen, und TPKI-Antisinn, das damit komplementär ist, wurden unter Verwendung eines der automatischen DNA-Synthetisierers (MilliGen) synthetisiert, aus einem 20%igen Acrylamidharnstoffgel gewonnen und durch ein Ethanolausfällungsverfahren gereinigt und der Niederschlag wurde in Wasser gelöst, um die Konzentration auf 1 μmol einzustellen.
TPKI-Sinn: 5'-ATGTCGGGGCGACCGAGA-3' (SEQ. ID NO. 4 der Sequenzliste)
TPKI-Antisinn: 5'-TCTCGGTCGCCCCGACAT-3' (SEQ. ID NO. 5 der Sequenzliste)
DIE WIRKUNG DER INHIBIERUNG AUF DEN TOD VON KRANIALEN NERVENZELLEN:
Das Kulturmedium des Hippocampus, das durch das oben erwähnte Verfahren hergestellt wurde, wurde den folgenden Behandlungen (b) bis (d) unterworfen, wobei die Zahl der lebenden Zellen mit dem Verstreichen der Zeit gezählt wurde und das Ergebnis ist in der Tabelle 1 aufgeführt.

(a) Nicht behandeltes Kulturmedium (Kontrolle):
(b) TPKI-Antisinn (1 μmol) wurde zu 1 ml des Kulturmediums gegeben und nach 5 Minuten wurden 20 μmol AβP zugegeben, gefolgt von einem 24-stündigen Stehen lassen bei 37°C.
(c) AβP (20 μmol) wurde zu 1 ml Zellkulturmedium gegeben, gefolgt von einem 24-stündigen Stehen lassen bei 37°C.
(d) TPKI-Sinn (1 μmol) wurde zu 1 ml des Zellkulturmediums gegeben und nach 5 Minuten wurden 20 μmol AβP zugegeben, gefolgt von einem 24-stündigen Stehen lassen bei 37°C.

TABELLE 1
Tabelle 1 zeigt die Zahl der lebenden Zellen über die Zeit nach den oben erwähnten Behandlungen (b), (c) und (d) und die Zahlen sind in Bezug auf den Prozentanteil zur Kontrolle angegeben.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, waren die Zahlen von lebenden Zellen nach 6 und 21 Stunden nach der Behandlung der Hippocampus-Zellen mit TPKI-Antisinn und AβP (b) signifikant höher als bei solchen die nur mit AβP (c) und mit TPKI-Sinn und AβP (d) behandelt worden waren. Diese Tatsache zeigt deutlich, das TPKI-Antisinn signifikant den Tod der Zellen durch AβP inhibiert.
Darüber hinaus wurde durch die Beobachtungen bei den oben erwähnten Fällen (b) bis (d) nach 24 Stunden unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops (Vergrößerungsleistung: 400) geklärt, dass nur im Fall von (b), in dem TPKI-Antisinn und AβP auf die Hippocampuszellen wirkten, die Cytotoxizität durch AβP gering und ähnlich wie im Fall der Kontrolle war.
PHOSPHORYLIERUNG DES tau-PROTEINS
Die Phosphorylierungsaktivität der TPK-I wurde durch das oben erwähnte Verfahren bei den Proben ermittelt: (1) unbehandeltes Zellkulturmedium (Kontrolle); (2) eine Probe, bei der 1 μmol TPKI-Antisinn zu 1 ml Zellkulturmedium gegeben wurde, gefolgt von der Zugabe von 20 μmol AβP nach 5 Stunden; und (3) eine Probe, bei der 20 μmol AβP zu 1 ml Zellkulturmedium gegeben wurden, und das Ergebnis ist in Tabelle 2 aufgeführt. Die Phosphorylierungsaktivität von TPK-I ist in Tabelle 2 als (Einheiten/mg Protein) in der Überstandsflüssigkeit angegeben, wobei eine Einheit äquivalent zu der Intensität der Radioaktivität ist, die durch einen Laserbildanalysator (BAS 2000; Fuji) gemessen wurde.
TABELLE 2
Wie in Tabelle 2 gezeigt, betrug die Phosphorylierungsaktivität im Fall (2), bei dem TPKI-Antisinn und AβP auf das Zellkulturmedium wirkten, nur ungefähr die Hälfte von ungefähr dem Fall (1) bei dem nur AβP wirkte. Folglich ist klar, dass TPKI-Antisinn signifikant die Phosphorylierungsaktivität von TPK-I durch AβP inhibiert.
BEISPIEL 2
KLONIERUNG DER HUMANEN TPK-IcDNA:
Eine im Handel erhältliche humane cDNA-Bibliothek des Hirns vom Fötus (hergestellt durch Einführen einer 1 : 1-Mischung aus cDNA, die aus mRNA des humanen Fötusgehirns unter Verwendung von Oligo-dT und zufälligem Primer synthetisiert worden war, und lamda-ZAPII, hergestellt von Strategen) wurde in den Wirt, E. coli XL1-blau [W. O. Bullock et al.; Biotechnique, 5, 376–379 (1987)] infiziert, um Plaques zu bilden. Die Plaques (Zahl: 450.000) wurden unter Verwendung einer Sonde gescreent, die aus einem Teil der Transaktionsdomäne (170 Basenpaare von der 1137ten HindIII-Stelle bis zu dem 1306ten A; SEQ. ID NO. 8 der Sequenzliste) der Ratten-TPK-I cDNA (SEQ. ID NO. 2 der Sequenzliste) hergestellt wurde, wobei 19 positive Klone erhalten wurden. Unter diesen wurden zwei Klone unter Bluescript SK (Strategen) subkloniert und anschließend wurden EcoRI-Fragmente, die mit der obigen Sonde hybridisieren, in den Vektor pUC19 subkloniert [C. Yanisch-Perrou et al; Gene, 33, 103 (1985)]. Die Restriktionsenzymkarte der EcoRI-Fragmente der beiden so hergestellten Klone ist in 1 angegeben.
Die Basensequenz der gesamten Domänen des Klons '1 wurde durch ein Dideoxyverfahren bestimmt und dem Klon fehlte der N-terminale Teil des humanen TPK-I-Proteins. Die Gesamtlänge des Klons '2 betrug 2,2 Kilobasen und durch Vergleich mit der Restriktionsenzymkarte wurde angenommen, dass er wahrscheinlich den Klon #1 enthält. Die Basensequenzen, die der 5'-nicht-translatierten Domäne und der N-terminalen Domäne, entsprechen und die am meisten des humanes TPK-I-Protein umfassen, wurden durch ein Dideoxyverfahren von Sauger et al. bestimmt. Die Basensequenz der cDNA dieser beiden Ergebnisse und die Aminosäuresequenz von TPK-I, die daraus angenommen wird, sind in SEQ. ID NO. 1 der Sequenzliste, gezeigt.
Darüber hinaus ist ein Vergleich mit der Aminosäuresequenz von Ratten-TPK-I in 2 aufgeführt.
BEISPIEL 3
EXPRESSION VON HUMANER TPK-I DURCH INSEKTENZELLEN:
NruI-EcoRI-Fragmente, die die gesamte Länge der Translationsdomäne der humanen TPK-IcDNA enthalten, wurden in einen SmaI-EcoRI-Teil des Übertragungsvektors PVL1392 [Invitrogen; N. R. Webb und M. D. Summers: Technique, 173– 188 (1990)] eingeführt, der durch Einfügung der vom Virus abstammenden DNA-Fragmente, die das Baculovirus (nuklearer Polyhedrosvirus) Polyhedron und dessen Promotor enthalten, in den Vektor PUC8 (E. coli-Plasmidvektor) hergestellt, wobei ein Expressionsvektor PVL-TPKI hergestellt wurde.
Der Zellstamm Sf9, der von Ovaliumzellen von Spodoptera spp. abstammt, wurde in einem Medium für Insektenzellen FNM-FH kultiviert [Diese wurde wie folgt hergestellt; 0,35 mg/l Natriumbicarbonat (hergestellt von Wako Pure Chemical), 3,3 mg/ml TC-Lactalbuminhydrolysat (hergestellt von Difco) und 3,3 mg/ml TC-Hefe wurden folglich zu einem Insektenmedium von Grace (Sigma), das auf einen pH 6,2 eingestellt worden war, gegeben, sterilisiert und anschließend wurde ein wärmebehandeltes 10%iges Rinderfötusserum, 50 μg/ml Gentamycinsulfat und 2,5 μg/ml Amphotericin B zugegeben] und mit DNA von Wild-Baculovirus und Vektor-DNA infiziert, woraufhin zu einem gewissen Grad eine homogene Rekombination zwischen ihm auftrat und als Folge rekombinanter Virus mit einem TPK-I-exprimierenden System hergestellt wurde.
Die Selektion der mit Wild-Virus infizierten Zellen und der mit rekombinanten Virus infizierten Zellen erfolgte visuell und als Folge von dreimaligen Selektionswiederholungen wurden die rekombinanten Virus-infizierten Zellen getrennt. Die Virus-enthaltende Flüssigkeit mit hoher Infektiösität, die aus dem Überstand der Zellen erhalten wurde, wurde in Sf9-Zellen infiziert und 72 Stunden zur Gewinnung von 5 × 10⁸-Zellen kultiviert. Diese wurden suspendiert in 30 ml Puffer A [umfassend 10 mM Natriumphosphat (pH: 7,05), 1mM Ethylendiamintetraessigsäure, 5 mM Ethylenglycol-bis(2-amino-ethylether)tetraacetat, 2 mM Dithiothreitol, 10 mM Magnesiumchlorid, 0,1 mM Natriumorthovanadat, 40 μg/ml Phenylmethansulfonylfluorid, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin und 1 μg/ml Antipain] suspendiert, homogenisiert und bei 105 G zentrifugiert, um die Überstandsflüssigkeit zu gewinnen. Anschließend wurde der Überstand einer Phosphorzellulose-Säulenchromatographie (mit P-11 gefüllt; Whatman) unterworfen und mit einem Puffer B [umfassend 25 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (pH: 7,5), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 1 mM Dithiotreitol, 0,1 beta-Mercaptoethanol, 5% Glycerin und 50 mM Natriumchlorid] mit einem Gradienten von Natriumchloridkonzentrationen mit 50 mM bis 250 mM fraktioniert. Jede Fraktion des Eluats wurde durch Elektrophorese und eine Immunoblot-Technik untersucht und eine positive Anti-TPK-I-Antikörperfraktion, die mit einem Anti-Ratten-TPK-I-aminoterminalen Antikörper [Kaninchenantiserum, erhalten als Antigen durch Exprimieren der Amino-terminalen 36 Reste von Ratten-TPK-I (SEQ. ID NO. 9 der Sequenzliste) als Fusionsprotein mit beta-Galactosidase in einem Vektorsystem mit E. coli als Wirt] kreuzreagiert, wurde zusammengefügt. Diese wurde durch Ultrafiltrierung konzentriert, einer blauen Sepharose-Säulenchromatographie (gefüllt mit blauer Sepharose CL-6B von Farmacia) unterworfen und durch einen Puffer C [umfassend 20 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (pH: 7,5), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 0,1 mM Dithiothreitol und 5 Glycerin] mit einem Natriumchlorid-Konzentrationsgradienten von 0 bis 1 M fraktioniert. Die positive Anti-TPK-I-Antikörperfraktion wurde durch Immunoblotting und Elektrophorese jeder Fraktion zusammengefügt, einer Ultrafiltrierung unterworfen und gegen einen Puffer D [umfassend 100 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (pH: 6,5), 0,5 mM Magnesiumacetat, 1 mM Ethylenglycolbis(2-aminoethylether)tetraacetat, 10% Glycerin, 0,02 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween 20), 0,1 mM Phenylmethansulfonylfluorid, 1 μg/ml Pepstatin, 1 μmg/ml Antipain, 1 μg/ml Leupeptin und 5 mM beta-Mercaptoethanol] dialysiert unter Erhalt einer Enzymflüssigkeit von 1 ml. Die erhaltene Gesamtproteinmenge betrug 0,4 mg.
Der Phosphorylierungsverlauf wurde unter Verwendung dieser Enzymlösung durch die folgenden zwei Verfahren geprüft.
(PHOSPHORYLIERUNGSVERFAHREN I)
tau-Protein, das aus Rinderhirn extrahiert und gereinigt (2 μl; 1,5 mg/ml Konzentration) wurde und 1 μl der oben erhaltenen gereinigten Enzymlösung wurden gemischt. Zu der Mischung wurde eine Lösung, enthaltend 2 mM Adenosintriphosphat und 2 mM Magnesiumacetat und [gamma-32P]Adenosintriphosphat gegeben, so dass die Phosphorylierung des tau-Proteins bei Raumtemperatur 20 Stunden durchgeführt wurde, wobei die Menge der in das tau-Protein eingeführten Phosphorsäure beurteilt wurde.
(PHOSPHORYLIERUNGSVERFAHREN II)
Die Phosphorylierungsreaktion, die die gleiche wie die des Verfahrens I war, wurde durchgeführt, außer dass kein [gamma-32P]Adenosintriphosphat enthalten war, gefolgt von einer SDS-Elektrophorese, um auf Nitrocellulose zu blottieren. Das blottierte tau-Protein wurde einem Immunfärben mit Anti-tau-Antikörper (Kaninchen-Antiserum gegen Hühnerfötushirn-abstammenden tau-Proteins) und Anti-p-tau-Antikörper [Ihara et al., J. Biochem., 99, 1807–1910 (1986)] unterworfen.
Die Ergebnisse des Verfahrens I bestätigen die Einführung der Phosphorsäure in das tau-Protein, während das Ergebnis des Verfahrens II war, dass:

1) die Mobilität des tau-Proteins nach der Reaktion geringer war als die des tau-Proteins das nicht phosphoryliert wurde; und
2) tau-Protein, das nicht phosphoryliert wurde, reagierte nicht mit Anti-p-tau-Antikörper, während tau-Protein nach der Reaktion mit Anti-p-tau-Antikörper reagiert.

Diese Ergebnisse zeigen, dass das Resultat das gleiche war wie bei der Phosphorylierung von tau-Protein unter Verwendung von aus Tierhirn gereinigtem TPK-I.
BEISPIEL 4
PHOSPHORYLIERUNG DES PEPTIDS DURCH REKOMBINANTE HUMANE TPK-I
Das Peptid (hiernach mit "K2" abgekürzt), das durch die Aminosäuresequenz die in SEQ. ID NO. 10 in der Sequenzliste beschrieben ist, wurde synthetisiert. Dieses Peptid wurde auf die gleiche Weise wie im Phosphorylierungsverfahren II in Beispiel 3 phosphoryliert, außer dass tau-Proteinkinase II (TPK-II), gereinigt aus Rinderhirn-Mikrotubule, anstatt von TPK-I verwendet wurde, wodurch das phosphorylierte Peptid (hiernach als "p-K2" abgekürzt) erhalten wurde.
Die Phosphorylierungen von K2 und p-K2 wurden gemäß dem Phosphorylierungsverfahren I von Beispiel 3 unter Verwendung des vom Menschen abstammenden teilgereinigtem TPK-I, hergestellt in Beispiel 3, durchgeführt, wobei der Phosphorylierungsverlauf von p-K2 deutlich zu bemerken war, wohingegen die Phosphorylierung von K2 langsam war und ihre Anfangsgeschwindigkeit ungefähr ein Zehntel von der von p-K2 entsprach.
Die Ergebnisse zeigen, dass das Resultat das gleiche war wie bei der Phosphorylierung von K2 und p-K2 unter Verwendung von aus Tierhirn-gereinigtem TPK-I.
BEISPIEL 5
EXPRESSION VON REKOMBINANTEM HUMANEN TPK-I DURCH ESCHERICHIA COLI
Das SacI-EcoRI-Fragment des humanen TPK-IcDNA-Klons #2, das in Beispiel 2 erhalten wurde, wurde in einen SacI-EcoRI-Teil des Vektors PUC19 [C. Yanisch-Perrou, et al.: Gene, 33, 103 (1985)] eingeführt, um pUSE2 herzustellen. Zur Herstellung einer NdeI-Stelle in dem Oligonukleotid vom 598sten bis zum 629sten Mitglied der cDNA, die durch die Basensequenz dargestellt ist, die in der SEQ. ID NO. 1 der Sequenzliste beschrieben ist, wurden ein Oligonukleotid mit einem Plus-Strang (SEQ. ID NO. 11 der Sequenzliste), wobei CAT zwischen dem 613ten und dem 615ten Mitglied eingeführt wurde, und ein Oligonukleotid mit einem Minus-Strang (SEQ. ID NO. 12 der Sequenzliste) aus den Mitgliedern von 1076 bis 1047 synthetisiert, und ein cDNA-Fragment (SEQ. ID NO. 13 der Sequenzliste), das vom 598sten bis zum 1076sten Mitglied reicht und eine NdeI-Stelle aufweist, die mit dem Anfangskodon dupliziert wird (duplicating with the initiation codon) wurde durch ein PCR-Verfahren erhalten [Saiki et al.: Nature, 324, 126 (1986)].
Die Fragmente, die von einem 5'-terminalen cDNA-Fragment, das durch ein PCR-Verfahren erhalten wurde, bis zu einem SacI-Teil reichten, wurden in das SmaI-SacI-Teil von pUSE2 eingeführt. Das NdeI-EcoRI-Fragment des Plasmidvektors wurde in den NdeI-BamHI-Teil von pET3C [A. H. Rosenberg, et al.: Gene, 56, 125 (1987)] eingeführt, der einer der Vektoren mit einem E. coli T7-Polymerasepromotor ist, um pET3C/TPKI herzustellen.
pET3C/TPKI wurde durch herkömmliche Verfahren unter Verwendung von E. coli-BL21 (DE3) [F. W. Studier und B. A. Moffatt: J. Mol. Biol. 189, 113 (1986)] transformiert, um eine Rekombinante herzustellen. Die resultierende E. coli-Rekombinante wurde bei 37°C bis zum mittleren Stadium der logarithmischen Wachstumsphase kultiviert, bei 21°C gehalten, 0,3 mM (Endkonzentration) IPTG (Isopropyl-beta-D(–)-thiogalactopyranosid) wurden zugegeben und es wurde 4 weitere Stunden kultiviert. Die lebenden Zellen (5 g) wurden in 50 ml Puffer E [umfassend 20 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (pH: 6,5), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 5 mM beta-Mercaptoethanol und 50 mM Natriumchlorid] suspendiert, durch Ultraschallwellen zerstört und bei 100.000 g 1 Stunde zentrifugiert. Der Überstand wurde einer Phosphorcellulose-Säulenchromatographie (mit P-11 gefüllt; Whatman) unterworfen, die mit einem Puffer E äquilibriert worden war, und anschließend einer Gradienteneluierung mit Natriumchloridkonzentrationen von 50 bis 500 mM unterworfen, wobei die Fraktion die gegen Anti-TPK-I-Antikörper positiv war, zusammengefügt und konzentriert wurde. Diese wurde gegen einen Puffer F [umfassend 20 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ehtansulfonsäure (pH: 7,2), 1 mM Ethandiamintetraessigsäure und 5 mM beta-Mercaptoethanol] dialysiert, einer blauen Sepharose-Säulenchromatographie (gefüllt mit Blau-Sepharose CL-6B von Farmacia) ausgesetzt und mit einem Konzentrationsgradienten von 0 bis 1 M Natriumchlorid eluiert. Die Anti-TPK-I-positiven Antikörperfraktionen wurden gesammelt und gegen einen Puffer D dialysiert.
Die Phosphorylierung von tau-Protein wurde durch die Phosphorylierungsverfahren I und II auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 unter Verwendung der resultierten teilgereinigten TPK-I durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass beim Phosphorylierungsverfahren I 1,2 mol der Phosphorsäure in 1 tau-Proteinmolekül eingeführt wurden, wobei bei dem Phosphorylierungsverfahren II die Mobilität der Elektrophorese des tau-Proteins nach der Reaktion gering wurde und die Reaktion mit Anti-p-tau-Antikörper positiv wurde.
Bei der Verwendung der teilgereinigten TPK-I zur Phosphorylierung der Peptide K2 und p-K2 auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4, fand die Phosphorylierung von p-K2 statt während die von K2 kaum stattfand. Diese Ergebnisse zeigen, dass die rekombinante TPK-I, die in diesem Beispiel hergestellt wurde, die gleiche Eigenschaft hat wie die TPK-I, die aus Tierhirn gereinigt wurde und wie die rekombinante TPK-I, die in Beispiel 3 hergestellt wurde.
(BEITRAG DER ERFINDUNG)
Mit dem erfindungsgemäßen präventiven und therapeutischen Mittel gegen die Alzheimer-Krankheit wurde die Phosphorylierungsaktivierung der tau-Proteinkinase I durch das Amyloid-beta-Protein inhibiert, wobei der Tod der Neuronen im Gehirn inhibiert werden konnte. Außerdem ist es möglich, ein Screening nach einem präventiven oder therapeutischen Mittel gegen Alzheimer-Krankheit, unter Verwendung des obigen Mechanismus, durchzuführen.
Der erfindungsgemäße TPK-I menschlichen Ursprungs ist ein Enzym, das spezifisch auf tau-Protein wirkt, von dem angenommen wird, dass es mit der Alzheimer-Krankheit und außerdem mit seniler Demenz vom Typ der Alzheimer-Krankheit in Verbindung steht und daher kann ihre Anwendung zur Klärung der Ursache dieser Erkrankungen führen und Untersuchungen von Mitteln zur Prävention oder Therapie sind zu erwarten.
KURZE ERÖRTERUNG DER ABBILDUNGEN:
1 eine Abbildung die die Restriktionsenzymkarte humaner TPK-I zeigt.
2 ist eine Abbildung, die den Vergleich der Aminosäuresequenzen humaner TPK-I und Ratten-TPK-I zeigt. In dieser Abbildung ist jede Aminosäure durch einen einzelnen Buchstaben dargestellt.
SEQUENZLISTE

Claims

Präventives oder therapeutisches Mittel gegen die Alzheimer-Krankheit, das ein Antisinn-Oligonukleotid umfasst, das mit mRNA oder DNA der tau-Proteinkinase I hybridisieren kann.
Präventives oder therapeutisches Mittel gegen die Alzheimer-Krankheit nach Anspruch 1, wobei die Primärstruktur der tau-Proteinkinase I durch die Aminosäuresequenz dargestellt ist, die in SEQ ID NO. 1 oder 2 der beigelegten Sequenzliste beschrieben ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Prävention oder Therapie der Alzheimer-Krankheit, die ein Antisinn-Oligonukleotid, das mit mRNA oder DNA der tau-Proteinkinase I hybridisieren kann, umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Primärstruktur der tau-Proteinkinase I durch die Aminosäuresequenz dargestellt ist, die in SEQ ID NO. 1 oder 2 der beigelegten Sequenzliste beschrieben ist.
Verfahren zum Screenen eines Mittels, das zur Prävention oder Therapie der Alzheimer-Krankheit nützlich ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Amyloid-β-Protein, Nervenzellen und ein Mittel, von dem angenommen wird, dass es als präventives oder therapeutisches Mittel gegen die Alzheimer-Krankheit wirksam ist, inkubiert werden und wenn der Tod der Nervenzellen gehemmt wird, dieses Mittel als ein präventives oder therapeutisches Mittel gegen die Alzheimer-Krankheit angesehen wird.
Verwendung eines Antisinn-Oligonukleotids, das mit mRNA oder DNA der tau-Proteinkinase I hybridisieren kann, zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung des neuronalen Zelltods im Gehirn, dadurch gekennzeichnet, dass das Antisinn-Oligonukleotid auf Neuronen im Gehirn angewendet wird.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Primärstruktur der tau-Proteinkinase I durch die Aminosäuresequenz dargestellt ist, die in SEQ ID NO. 1 oder 2 der beigefügten Sequenzliste beschrieben ist.
tau-Proteinkinase I, gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO. 1 der beigefügten Sequenzliste beschrieben ist.
Gen, das die in Anspruch 8 beschriebene tau-Proteinkinase I codiert.
Gen nach Anspruch 9, wobei das Gen durch die Basensequenz dargestellt ist, die in SEQ ID NO. 1 der beigefügten Sequenzliste beschrieben ist.
Rekombinante tau-Proteinkinase I mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO. 1 der Sequenzliste gezeigt ist.
Rekombinanter Vektor, der rekombinante tau-Proteinkinase I, umfassend die in SEQ ID NO. 1 der Sequenzliste gezeigte Basensequenz, exprimieren kann.
Transformant, der erhältlich ist, indem Wirtszellen der Transformation unter Verwendung des rekombinanten Vektors von Anspruch 12 unterworfen werden.
Verfahren zur Herstellung rekombinanter tau-Proteinkinase I menschlichen Ursprungs, dadurch gekennzeichnet, dass der Transformant von Anspruch 13 inkubiert und die rekombinante tau-Proteinkinase I aus seiner Kultur gesammelt wird.